KR970003056B1

KR970003056B1 - Hiv에 대한 고도면역 글로블린

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Publication number: KR970003056B1
Application number: KR1019890700616A
Authority: KR
Inventors: 엠 쿰민스 라우렌스; 알렝 쟝-피에르; 에이. 팔크 쥬니어 로렌스; 엠. 콘디 리차드; 에이치 발포어 쥬니어 헨리; 에스. 레임 프랑크
Original assignee: 존 에프. 투엔트; 리젠츠 오브 더 유니버서티 오브 미네소타; 폴 이. 로지; 애보트 래보러토리스
Priority date: 1987-08-11
Filing date: 1988-08-10
Publication date: 1997-03-14
Also published as: EP0379516A1; NO180271B; IE882455L; KR890701133A; NO900674D0; NO900674L; IE62584B1; EP0379516B1; DE3884811D1; NO180271C; DE379516T1; AU2322588A; NZ225796A; JPH02504514A; JPH0796560B2; AU618555B2; FI900670A0; DE3884811T2; DK35290D0; DK35290A

Abstract

내용없음.

Description

HIV에 대한 고도면역 글로블린

후천성 면역 결핍증 또는 AIDS는 공중보건 비상사태로 인식되어 오고 있다. 1986년 12월, 27700명 이상의 미국인이 이 질환에 걸려, 현재 약 반이 죽었고, 어느 한 사람도 이 질환으로 부터 회복되지 않았다. 아마도 1백만 내지 1백5십만의 미국인들이 AIDS를 유발시키는 사람 면역결핍증 바이러스(HIV)에 감염되어 있을 것이다. 감염된 사람의 20 내지 50% 이상은 AIDS로 진행될 것이다. 미합중국 국립보건원(Public Health Service)은 1991년 말쯤에는, 179000명 이상의 사람들이 이 질병으로 사망할 것이라고 예견하고 있다. 현재에는 유효한 치료법이 없으며 백신의 개발에는 5년 이상이 필요하다[참조; Chem. Eng. News(1986년 12월 8일) 7 내지 14 페이지].

HIV 감염의 결과는 다양하게 나타난다. AIDS 그 자체는 정상적인 면역 시스템을 가진 사람에게는 질병을 거의 일으키지 않는 미생물에 의해 유발되는 기회적 감염으로서 공지된 광범위한 질병에 의해 특징지워지는 면역 시스템의 극심한 결핍증 및 면역 결핍으로 초래되는 암이다. 바이러스에 감염된 대부분의 환자들은 다양한 기간동안 무증후성으로 지낸다. 그러나, AIDS-관련 합병증(ARC)으로서 공지된 발열, 설사및 임파절의 팽창을 특징으로 하는 상태를 나타내는 감염된 환자 수가 증가되고 있다. 현재 ARC는 불가피하게 AIDS로 진행된다고 널리 고려되어 진다.

사람의 많은 다른 바이러스 감염과 달리, HIV에 대한 항체 합성이 감염의 치유를 나타내는 것은 아니다. HIV는 많은 혈청 양성 사람들로 부터 이들의 초기 노출후 계속 분리될 수 있다. 다른 동물을 감염시키는 렌티바이러스(lentivirus)는 감염된 숙주의 일생에 걸쳐서 지속하는 감염을 유발하는 것으로 공지되어 있다. 불행하게도, HIV는 사람에게서 지속성인 일생의 감염체로 자리 잡을 수 있다. 따라서, 혈청 중 HIV에 대한 항체의 존재는 면역성의 표시가 아니라, 오히려 대부분의 경우 진행중인 감염의 지표이다. 그러나, 시험관내에서 HIV를 중화할 수 있는 항체는 HIV 감염 경로를 거친 몇몇 환자에게서 밝혀졌다. 이러한 중화 항체는 감염된 공혈자로 부터 수득한 혈청과 세포-유리 바이러스를 혼합한 후 민감성 표적 세포상에서 이 혼합물이 감염성을 평가하는 것을 포함하는 검정을 사용하여 동정하여 왔다.

예를 들어, 엠. 로버트-구로프(M. Robert-Guroff) 및 알. 씨. 갤로(R. C. Gallo)(유럽 특허원 제193,284호)는 간접적인 면역 형광 검정을 사용하여 HIV 코어(core) 단백질 p24의 발현을 기록함으로써 HT 세포주의 H9 클론의 HIV 감염을 연구하였다. 감염후 3일만에, 건강한 정상의 공혈자 혈청으로서 예비처리된 HIV와 함께 배양시킨 H9 세포의 약 80%가, p24 발현으로 나타나는 바와 같이 감염된다. 반대로, ARC를 지닌 환자의 혈청으로 예비처리된 바이러스에 노출시킨 경우는 단지 H9 세포의 10%만이 3일째에 p24를 발현한다. 중화 항체는 성인 AIDS 환자의 60% 및 ARC를 지닌 환자의 80%에서 검측되지만, 건강한 이성대조군에 있어서는 검측되지 않는다. 그러나, 이 연구자들은 추가로 항체의 결합 특징면에 있어서 다양한 혈청을 특성화하지 않았고, 단지 중화 항체가 HlV의 주요 외막(envelope) 단백질, 예를 들면 gp41 및 gp120을 표적으로 삼을 수 있다고 추측하였다.

그러나, 이러한 감염 환자의 면역 반응이 추가의 면역학적 손상의 진행을 방지할 수 있는지는 아직 공지되지 않았다. 감염에서 발명까지의 진행동안 특이적 HIV 단백질 성분과의 혈청학적 반응성 패턴에 있어서 몇가지 변화가 일어나는 반면, 이제까지 특이한 패턴이 건강의 보존 또는 질환의 진행과 상관관계가 있는 것으로 밝혀진 바는 없다.

한가지 연구로, 제이. 고드스미트[참조; J. Goudsmit et al., J. Infect, Diseases, 155, 558(1987)]등은 HIV감염의 상이한 단계를 나타내는 공혈자의 혈청 중 이러한 단백질에 대한 항체를 검출하기 위하여 재조합 HIV 코어 및 외막 항원을 사용하였다. 이들은 시험된 모든 혈청에서 HIV 외막 항원에 대한 항체를 검출하였고, AIDS에 걸린 6명의 환자중 5명은 코어 항원에 대한 검출 가능한 항체를 지니고 있지 않았다. 그러나, 13명의 다른 대상자 중 11명은 이 단백질에 대한 검출 가능한 항체를 지녔다. HIV 항원은 또한 고체상 면역검정을 사용하여 검정되었고, 코어에 대한 항체가 존재하지 않는 모든 7개의 혈청 샘플중에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 항원은 코어에 대한 항체를 함유한 12개의 혈청 샘플중 어느 것에서도 검출되지 않는다. 고드스미트 등이 무증후성 환자에서 HIV 항원의 존재 및 코어 HIV 단백질에 대한 항체의 부재는 앞으로의 임상 질환을 예시해줄 수 있다고 추측했다해도, HIV-중화 활성에 대한 어떠한 혈청 샘플도 검정하지 않았다.

백신 개발 노력에 결정적인 면역 반응의 한가지 양태는 바이러스에 의한 감염을 방지하거나, 제한하거나 또는 제거할 수 있는 HIV에 대해 특이적인 항체 반응의 존재 가능성이다. 이러한 항체는 생체내 중화 항체로서 작용하며, 예비 백신 면역원에 대한 중요한 목표는 이러한 형태의 항체를 유출하는 것이다.

따라서, AIDS의 치료/또는 예방에 유효한 정도까지 HIV-특이적인 항체를 동정하고 수득하는 방법에 대한 필요성이 존재한다.

발명의 간단한 설명

일반적으로 모든 감염자로 부터 HIV를 분리하지 못하는 원인은 현재의 T 임파구 배양 방법에 있어서 기술적 한계 및 질병의 진행 단계에서 표적 세포의 고갈에 기인하는 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명자는 HIV가 감염자의 혈청으로 부터 배양될 수 없고 HIV 마커 항원이 사용되는 어떠한 조직 배양 및 면역검정방법에 의해 혈청 중에서 검측될 수 없는 정도까지 생체 내에서 HIV를 중화시키는데 효과적인 HIV에 대한 항체를 생성하여 온 감염된 사람들의 무증후성 서브셋(subset)이 존재함이 발견하였다. 이들 개개인에게는 이 상태가 당해분야의 숙련가들에게 쉽게 이용되는 방법에 의해 측정될 수 있는 한, 검측가능한 복제성바이러스가 결핍되어 있다고 고려할 수 있다. 따라서, 본 발명은 개개인의 동정 및 이 항체를(이후로는 HIV-고도-면역 글로블린 또는 "HIVIG"라 언급) 함유하는 혈액 분획의 분리 및 시험관 내 생체내에서 HIV 감염성을 중화시키기 위한 HIVIG의 용도를 기본으로 한다.

따라서, 본 발명은

(a) (ⅰ) 항-HIV p24 항체 역가가 약 128 이상이고,

(ⅱ) 효소 면역검정에서 HIV p24 음성이며,

(ⅲ) HIV-배양 음성인 혈장을 가지고, 임상적으로는 건강한 공혈자를 동정하며;

(b) 상기 공혈자의 혈액으로 부터 약 5중량부의 면역 글로블린 농도에서 HIV 중화 역가가 약 8000이상인 면역 글로블린을 분리함을 특징으로 하는 방법에 의해 제조된 HIV-특이적 면역 글로블린을 제공한다.

HIV에 노출된 무증후성인 사람은 검측 가능한 HIV 항원이 나타나지 않지만 HIV-p24 코어 단백질에 대한 검측 가능한 항체는 나타내는 것으로 동정되어 왔다.[J.Goudsmit 등의 상기 문헌 참조]. 그러나, 이러한 개인들 중 몇몇이 HIV 중화 역가가 매우 높은 면역 글로블린 공급원을 제공할 수 있다고 추정되지는 않았었다. HIV 중화 역가는 후술한 방법에 의한 생리학적 염수 중 5중량% 용액으로 측정할 때, 약 8000이상이고 바람직하게는 15,000 내지 20,000 정도로 높고, 더욱 바람직하게는 50,000 이상이다.

공혈자의 혈장 및 공혈자로 부터 유도된 항-HIV 면역 글로블린(IgG)은 HIV 코어 p24 단백질에 대해서 지시된 항체의 높은 역가를 나타낸다. 바람직하게는, 공혈자 혈장의 항-p24 역가는 약 128 이상, 바람직하게는 약 256, 더욱 바람직하게는 약 512이다. 공혈자 혈액으로 부터 유도된 IgG의 5중량% 용액의 항-p24역가는 약 1000 이상이고, 바람직하게는 15,000이며, 더욱 바람직하게는 약 30,000이다. 바이러스 외포단백질(gp41 및 gp120)에 있어서 IgG 성분의 항체 역가는 존재하는 IgG의 유효성에 대해 임계적이지 않으며, 이는 이러한 HIV 단백질에 대한 항체의 존재 및 역가가, AIDS 환자가 죽게될 때까지 이들에 의해서 나타나기 때문이다.

p24 및 gp41의 항체 역가는 지. 제이. 다우슨(G. J. Dawson) 등에 의해 개발되어[참조; J. P. Allain et al., Lancet, 1233-36, (1986)] 애보트 래보러토리스, 인코포레이티드사에 의해 시판되는[Abbott Laboratories, Inc., North Chicage, IL, "Abbott HTLV Ⅲ Confirmatory ELA"]경쟁적 면역검정으로써 측정한다[참조; Technical Bulletin; "Human T-Lymphotropic Virus Ⅲ Antigen(Env/Core)(Recombinant E. Coli)-ELA", (93-3704/R1 Feb. 1986), 본원에 참고문헌으로 인용됨].

HIV p24 항원에 대한 검정은 문헌[참조; D. A. Paul et al., J. Cell. Biochem., 10, (Suppl. A), 224 (Abstract D 130)(1986)]에 설명되어 있고 애보트 래보러토리스, 인코포레이티드사에서, 공보물인 "Antibody to Human T-Lymphotropic Virus Type Ⅲ(Human)" (83-2100/R2, Nor. 1986)에 설명된 것과 같은 "Abbott HTLV Ⅲ Antigen ELA"로서, (본원에 참고문헌으로 인용됨) 시판되는 방법에 따라 수행한다. 공혈자 혈액 중의 HIV 검측에 관련되어 사용된 "혈액 배양물"이란 용어는 알. 씨. 갤로(R. C. Gallo) 등 [참조; Science, 224, 500-502(1984), 본원에 참고문헌으로 인용됨]에 의해 설명된 것과 같이 사용된다. 본원에 사용된 "임상적으로 건강한"이란 용어는 CDC(Centers for Disease Control, Atlanta, GA)(AIDS) 또는 CDC와 공동 연구하는 보건 AIDS 연구 그룹의 국립 연구소에 의해 만들어진 연구 정의에 의해 확립된 기준에 따라, ARC 또는 AIDS의 증후군이 없는 것을 언급하는 것이다[참조; Ebbesen et al., AIDS:a basic guide for clinicians; Copenhagen : Munksgaard, (1984) 234 페이지]. (ARC) 바람직하게는, 공혈자의 T₄임파구 수는 400개 세포/ml 혈액 이상이고, 가장 바람직하게는 약 600개 세포이다.

HIV 코어 바이러스 단백질인, p24에 대한 높은 역가의 항체를 함유하는 HIVIG를 사용하여 시험관 내에서 HIV 감염성을 중화시키는 능력은, 몇몇 원형 HIV 백신의 유효성 검정의 기초를 제공할 수 있고, 또한 예를 들어 바이러스 유전자 발현의 생성물에서 돌연변이 효과에 관한, HIV 감염 기작으로의 기본적인 연구에 유용할 것이다.

본 발명은 또한 HIV에 노출되어온 환자에게 본 HIVIG의 약제학적 단위 투여용량 형태를 투여함으로써 HIV p24에 대한 혈장 항체 역가를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명의 HIVIG는 짙병의 임상적 진행을 지체시켜 감염되고/되거나 발명된 환자의 수명을 연장시키는 예방약으로, 또는 가능하게는 바이러스의 발병력을 제거하는 작용을 할 수 있는 치료제로서의 치료학적 효능을 가지는 것으로 생각된다. HIVIG는 또한 항바이러스제, AZT(아지도티미딘), DDC(디데옥시시티딘) 또는 다른 잠재적으로 유효한 약에 대한 유효한 부가물이 될 수 있다. 상술한 바와 같이, 이제까지는 시험관 내에서 HIV를 중화시킬 수 있는 항체가 AIDS의 진행을 억제하는데 유효하다고 믿을 만한 이유가 없었다. 그러나, HIVIG 공혈자에게서 ARC 또는 AIDS의 임상적 증후군이 나타나지 않는 것은 이들의 혈정중에 바이러스 감염성 및 p24 항원의 부재와 함께, HIVIG가 생체 내에서 유효하다는 추가의 강력한 실험적 증거를 제공한다.

본 HIVIG의 공급원은 반드시 이전에 HIV에 노출되어 있었던 공혈자이어야 하는 것으로 추정된다. 그러나, 면역원성의 바이러스 단백질 또는 이의 단편으로 부터 유도된, 바람직하게는 재조합 바이러스 DNA를 통하여 유도된 백신으로 접종한 건강한 대상자들에 있어서 기본적으로 유사한 상체 프로필(profile)의 진행은 HIVIG의 더욱 조절된 공급원을 제공하는 것으로 고려된다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 IgG는 뚜렷하게 활성인 바이러스 복제가 없는 선택된 HlV-노출된 공혈자로 부터 혈장 반출법에 의해 수득한 혼주(pool)된 혈장으로 부터 분리한다. 후술한 항-HIV 항체 프로필을 계속 나타내지만, HIV 항원에 대해 음성으로 시험되는 무증후성 혈청-전환 대상자들의 풀(pool)로 부터 공혈자를 선택한다. 공혈자의 혈장은 또한 HIV-감성 세포를 감염시킬 수 없다.

혈장 풀에서 오염된 어떠한 바이러스도 알코올 분획하에 의해 불활성화 시킬 수 있다[참조; Morbidity and Mortality Weekly Report, 35, 231(April 11, 1986)]. IgG는 중성 pH(6.8 내지 7.3)에서 냉 에탄올(-10℃ 내지 0℃)의 존재하에 원심분리 분획화시켜 혈장으로 부터 유도시킨다[참조; E. J. Cohn, 미합중국 특허 제2,390,074호 및 제2,770,616호]. 목적하는 IgG는 조절된 단백질 분획화 방법[참조; G. U. Bethel and R. M. Condie, 미합중국 특허원 제36,031호 1979년 5월 4일 출원]에 의해 수득될 수 있다. 그 결과 생성된 IgG-함유 페이스트를 과량의 증류수에 현탁하고 0℃ 미만에서 동결건조시켜 잔사 에탄올을 제거한다.

IgG 생성물은 바람직하게는 생활성에 대해 분석하기 전 또는 생체내 단위 용량형으로서 투여하기 전에, 수성 IV 유액과 같이 약제학적으로 허용되는 액체 담체로 희석한다[참조; Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Mack Pub. Co., Easton, PA(16th ed, 1980) pp1488-1496, 본원에서 참조문헌으로 인용]. 생성되는 용액은 예를 들면 여과로써, 멸균한다. IgG 제제와 함께 흔히 사용되는 방부제, 예를 들어 말토즈, 글리신 또는 티메로살은 약제학적으로 허용되는 양으로 가할 수 있다.

그 결과 생성된 용액은 바람직하게는 비경구적, 예를 들어 정맥 내 주사 또는 주입으로 투여한다. IgG투여량은 광범위하게 다양하며, HIV-감염 환자의 체격 및 신체 조건에 따라 좌우된다. 이러한 요소는 반드시 실험적인 것이며, 의사에 의해, 상술된 ARC 또는 AIDS 상태 기준을 사용하여 결정될 수 있다. 몇몇 임상적인 상황에 있어서, 감염된 표적 세포로 부터 바이러스 입자가 방출될 때 이 바이러스 입자의 감염성을 중화시키기 위해, IgG 조성물의 다수 투여용량을 투여할 필요가 있을 수 있다.

본 발명은 하기 상세한 실시예를 참조로 하여 설명될 것이다.

-고역가 항-p24 면역 글로블린(HIVIG)의 분리

A. 면역검정 방법론

1. HIV 항원의 검출

혈청 샘플을 일반적으로 문헌[참조; J. Goudsmit et al., Lancet, 177(1986)]에 기술된 바와 같은 고체상 면역검정(Abbott Laboratories, North Chicago, IL)으로 HIV 항원에 대해 검정한다. 200μl의 샘플을 HIV에 대한 사람 항체로 피복된 비드와 함께 실온(약 22℃)에서 밤새 배양한다. 비드를 증류수로 세척하고, HIV에 대한 토끼 IgG 항체를 가한후 45℃에서 4시간 동안 배양한다. 비드를 전술한 바와 같이 세척한 후 토끼 IgG에 대한 고추냉이 퍼옥시다제-결합된 염소 항체와 함께 45℃에서 2시간 동안 배양한다. 최종 세척후, 비드를 튜브에 옮기고 o-페닐렌 디아민을 가한다. 실온의 암실에서 30분 경과 후, 1ml의 NH₂SO₄를 각각의 튜브에 가한다. 양자 이중 파장 분광 광도계(Quantum Dual Wavelength Spectrophotomjeter; Abbott Laboratories)를 사용하여 A₄₉₂를 판독한다. 샘플의 흡광도가 정상인 혈장의 5개의 이중 시험물의 평균치를 합한 값이 0.050 이상인 경우 양성으로 추론한다. 검정은 HIV의 코어 항원, p24에 대하여 가장 민감하며, HIV-감염된 HT-9 세포 10³세포/ml의 배양 상등액 중에서 항원을 검출한다(비감염된 HT-9세포 상등액은 음성이다) 검정 특이성은 정제된 HIV 용해물의 웨스턴 블롯 또는 RIPA 공정에 사용하는 경우, p55/24(코어)를 확실하게 및 gp120/41(외막)은 단지 약하게 검측하는 토끼 항체에 의해 부분적으로 측정된다. 정제된, 재조합 코어 항원은 혈청 또는 혈장 내로 스파이킹(spike)되는 경우 50pg/ml에서 검측 가능한 반면, 정제된, 재조합 외막 항원은 약 500mg/ml에서 검측 가능하다. 샘플의 OD와 공지된 양의 정제된, HIV 용해물의 OD를 비교하여 HIV 항원을 정량한다. 대조용으로 이 항원을 사용하는 경우, 이 검정의 검출 한계는 약 0.05ng/ml이다.

2. HIV 코어 및 외막 단백질에 대한 항체의 검출

통상적으로 문헌[참조; J. P. Allain et al., Lancet, 1233-36(1986)]에 기술된 바와 같이 시판되는 경쟁적 효소 면역 검정(Abbott Laboratories, North Chicago, IL)을 사용하여 항체를 측정한다. 간략하게, 제1시스템에서, p15-및 p18-gag 유전자 생성물의 일부 및 전체의 p24 gag 유전자 생성물을 함유하는 재조합 HIV 코어 항원으로 피복된 비드를, 혈청 샘플의 20배 연속 희석액(정상인 혈장 중에 희석) 50μl 및 HIV 코어 항원에 대한 고추냉이 퍼옥시다제-결합된 사람 항체 200μl와 함께 실온에서 16 내지 22시간 동안 배양한다. 비드를 증류수로 세척하고, 색상을 항원 시험에 대하여 상술한 바와 같이 발색시킨다. 이 방법은 경쟁적 효소 면역검정이기 때문에, 형성된 색상의 강도는 샘플중의 HIV 코어 항원에 대한 항체양에 대하여 역관계이다. 임계(cut off)점은 음성 대조용 평균치(n=3) 및 양성 대조용 평균치(n=2)의 합을 2로 나눔으로써 결정된다. 항체 역가는 샘플의 A₄₉₂가 임계정 미만인 최고 희석율로서 추론된다. 외막 항원에 대한 항체 검정에 동일 방법이 적용되지만, 코어에 대한 항체 대신에 재조합 HIV 외막 항원(gp 120_env유전자 생성물로 부터의 45개의 아미노산 및 전체 p41_env유전자 생성물 함유)으로 피복된 비드, 및 HIV 외막에 대한 고추냉이 퍼옥시다제-결합된 사람 항체가 사용된다.

코어에 대한 항체 및 외막에 대한 항체 검정에 사용되는 표지된 항체는 코어 또는 외막에 대한 고 역가를 갖는 환자의 혈장으로 부터, 각각 웨스턴 블롯 상에 제조된다.

B. 공혈자의 선택

이미 HIV 항체에 대해 양성으로 시험된 25명으로 부터 혈청 샘플을 수득한다. 상기의 단락 A(2)에 기술된 애보트 래보러토리스사의 경쟁적 효소 면역검정을 사용하여 항-p24 및 항-gp41 항체의 농도를 측정한다. gp120 항체는 웨스턴 블롯으로 검측되지만 정량되지는 않는다.[참조; J. P. Allain et al., supra.]. 배양 및 상기의 단락 A(1)에 기술된 면역 검정법 둘다에 의해 HIV 항원을 시험한다. 25명 중에서, 11명은 무증후성이고 혈장 항원은 음성인 반면 상대적으로 높은 HIV 항체 역가를 나타낸다. 이들 공혈자 중 세명을 전혈 HIV 배양 음성 및 HIV 항원 음성인 혈장 공혈자로서 선택한다. 이들은 임상적으로 건강하며 T₄임파구 수가 400/ml 이상이다. 공혈자는 이들이 HIV 항체 양성인 점을 제외하고는, 혈장 공급원으로서 Code of Federal Regulations[21:C.F.R.§§640. 60-640. 63(April 1, 1986)]의 요구사항을 만족한다. 공혈자를 CFR 요구에 따라 혈장 반출시키고 혈장을 섬과 동결시킨 후 분획화할 때까지 0℃ 미만에서 저장한다[21 C.F.R. § 640. 65(April 1, 1986)]. 이들 세명의 공혈자 선택의 기준은 항-gp120의 저 역가, p24에 대한 비검측성 항체 및 gp41에 대한 적당한 역가를 나타내는 공혈자 JD; gp41및 gp120에 대한 고 역가 및 항-p24의 비검측성 역가를 나타내는 공혈자 MG; 및 p24 및 gp120에 대한고 역가 및 gp41에 대한 저 역가를 나타내는 공혈자 DE이다.

이들 HIV 항체의 특성을 하기의 표 1에 요약하였다.

공혈자 혈장에 대한 HIV 항체의 특성

[표 1]

¹가시적 정량:S-확실, M-중간, N-검측 불가능

각각의 공혈자로 부터 혈장 2단위를 혼주시켜 약 1200ml의 출발 풀을 제공한다. 각각의 풀 3개를 본 명세서에 참고로 인용된, 문헌[참조; Cohn et al., J. Clin. Invest., 23, 417(1944)]에 보고된 방법에 따라 분획화한다. 생성된 "분획 Ⅱ" IgG 페이스트를 동결건조시켜 전사 에탄올을 제거하고 분말을 0.9% 생리식염수 중에 용해시켜 이로 부터 5.0% wt/wt IgG 용액을 제조한다. 용액을 0.2μ 멸균 필터를 통하여 여과하고 이들의 중화 활성을, 시험하기에 앞서 멸균 조건하에 저장한다. 어떠한 방부제 또는 안정화제도 가하지 않는다. 시험결과, HIV에 대해 비반응성인 공혈자로 부터 분리된 IgG로 부터 대조용 분취량(5%IgG)을 제조한다.

C. 중화 활성의 측정

5% IgG 용액을 56℃에서 30분간 열 불활성화 시키고, 0.45μ 필터를 통하여 여과한 후 조직 배양배지중에 연속 희석 시킨다(페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충한 10% 태 송아지 혈청(FCS)를 함유하는 RPMI-1640). 0.5ml의 희석 샘플을 0.5ml의 HlV(100 감염 단위/ml)와 혼합하고 37℃에서 5% CO₂와 함께 2시간 동안 배양한다. 0.5ml를 버리고 4.0ml의 H9 세포(5×10⁵세포/ml)를 가한 후 배양액을 37℃에서 5% CO₂와 함께 배양한다. 5 내지 7일 경과후, 0.45ml의 배양액을 제거하고, 0.05ml의 5% 트리톤 X-100을 가하여 세포를 용해시킨다. 세포 용액물을 5 내지 7일 간격으로 3주간 HIV 항원에 대해 모니터링한다. HIV 항원 농도는 고체상 면역검정(Abbott Laboratories, North Chicago, IL)으로 측정한다. HIV 복제억제(중화)는 검정 대조용(HIV 항체에 대해 음성인 정상 사람 혈청)보다 적은 흡광도로 나타난다.

HIV 중화역가는 검정 대조용보다 적은 흡광도 판독치를 부여하고 최고 희석율로서 나타낸다. 5%IgG 용액에 대한 중화역가를 하기의 표 2에 나타냈다.

[표 2]

D. 고찰

표 2에 요약된 데이터는, 공혈자 DE-2에서 기원한 IgG 용액만이 감지 가능한 양의 항-p24 항체를 함유하며, 단지 이 용액만이 시험관 내에서 HIV를 중화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 또한 항-p24를 제외하고는, 높은 항-gp41 및 항-gp120 항체를 함유하는 용액은 중화 활성이 약하거나 거의 없다는 것이 명확하다. 항-p24 항체의 존재하에서 안티제네미아(antigenemia)가 보이지 않는 혈청학적 프로필 데이터에 따르는 이 데이터는 항-외막 항체가 아닌 항-코어 항체가, 중화 항체를 제공할 수 있는 공혈자를 동정하기 위한 우수한 혈청학적 마커라는 것을 제시한다. 항-p24 항체의 역가 높은 무증후성 공혈자로 부터 기원한 HIVIG는 HIV 감염의 진행을 억제시키거나 ARC 또는 AIDS 환자의 치료를 위해 생체내에서 유용할 수 있다고 고려된다.

본 발명은 여러 가지 특이적이고 바람직한 양태 및 기술을 참조로 하여 기술하였다. 그러나, 많은 변화 및 변형이 본 발명의 정의 및 범주 내에서 이루어질 수 있다고 생각되어야 한다

Claims

(a) (ⅰ) 항-HIV p24 항체 역가가 약 128 이상이고, (ⅱ) 효소면역검정에서 HIV p24 음성이며, (ⅲ) HIV-배양 음성인 혈장을 가지며, 임상적으로는 건강한 사람 공혈자를 동정하고; (b) HIV의 감염성을 중화시키는데 유효한 HIV 중화역가를 지닌 상기 공혈자의 혈액으로 부터 면역 글로블린 샘플을 분리함을 특징으로 하는 방법에 의해 생성된 면역 글로블린(IgG).
제1항에 있어서, 공혈자가 혈액 ml 당 약 400개 이상의 T₄임파구를 가지는 면역 글로블린.
약제학적으로 허용되는 담체 중에 HIV의 감염성을 중화시키는데 유효한 양의 제1항에 따른 IgG로 HIV양을 처리함을 특징으로 하여, HIV를 시험관 내에서 중화시키는 방법.
약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제1항에 따른 IgG를 포함함을 특징으로 하는, 환자의 HIV p24에 대한 혈장 항체 역가를 상승시키기 위한 약제학적 조성물.
항-HIV p24 항체 역가가 128 이상이고, T₄임파구 수가 혈액 ml 당 400개 이상인 혈액 혈장으로 부터 수득된, HIV 감염성을 중화시키는데 효과적인 양의 면역 글로블린(IgG)을 포함함을 특징으로 하는, HIV의 감염성을 중화시키기 위한 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 비경구 투여용으로 적용되는 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 정맥 내 주사 또는 주입용으로 적용되는 조성물.
항-HIV p24 항체 역가가 128 이상이고, T₄임파구 수가 헐액 ml 당 400개 이상인 혈액 혈장으로 부터 수득한, HIV 감염성을 중화시키는데 유효한 치료제로서 사용하기 위한 면역 글로블린(IgG).