NO180234B - Immunogent konjugat for behandling av septisk sjokk, forbindelser samt kovalent konjugat mellom D-glukosamin-disakkarid og et bærerprotein - Google Patents

Immunogent konjugat for behandling av septisk sjokk, forbindelser samt kovalent konjugat mellom D-glukosamin-disakkarid og et bærerprotein Download PDF

Info

Publication number
NO180234B
NO180234B NO931655A NO931655A NO180234B NO 180234 B NO180234 B NO 180234B NO 931655 A NO931655 A NO 931655A NO 931655 A NO931655 A NO 931655A NO 180234 B NO180234 B NO 180234B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
allyl
phosphate
hydrogen
deoxy
disaccharide
Prior art date
Application number
NO931655A
Other languages
English (en)
Other versions
NO931655L (no
NO931655D0 (no
NO180234C (no
Inventor
Massimo Porro
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of NO931655D0 publication Critical patent/NO931655D0/no
Publication of NO931655L publication Critical patent/NO931655L/no
Publication of NO180234B publication Critical patent/NO180234B/no
Publication of NO180234C publication Critical patent/NO180234C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
    • C07H11/04—Phosphates; Phosphites; Polyphosphates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse angår immunogent konjugat for behandling og profylakse av septisk sjokk forårsaket av bakterielt endotoksin, forbindelser samt kovalent konjugat mellom D-glukosamin-disakkarid og et bærerprotein.
A. Septisk sjokk
Septisk sjokk er en livstruende tilstand som forekommer efter infeksjoner med Gram-negative bakterier, som komplikasjoner efter operasjoner, lengre sykehusopphold, ulykker eller andre trauma-tiske hendelser. Det er velkjent at det som er ansvarlig for denne sykdom, er det bakterielle endotoksin, et glykolipid antigen som er til stede bare på overflaten av Gram-negative bakterier. Dette glykolipid er også kjent som lipo-polysakkarid (LPS) eller lipo-oligosakkarid (LOS), avhengig av størrelsen av karbohydratkjeden som er kovalent bundet til den fettsyre-rike del kalt Lipid A (LipA). Bare Lipid A er ansvarlig for de alvorlige toksiske virkninger som vises ved endotoksin (LPS). Frigjøring av dette endotoksin, som er festet på den ytre membran til bakterien i blod-strømmen, resulterer i binding til spesialiserte celler i immun-systemet så som makrofager og monocytter. Disse spesialiserte cellene aktiveres så av endotoksinet, og mange immun-mediatorer frigjøres (Interleukin-1 og Interleukin-6; a-Tumor nekrose faktor; 6-Interferon). Videre aktiverer endotoksin også komplement-kaskaden, som resulterer i celle-lysing med påfølgende frigjøring av proteolytiske enzymer som fremmer frigjøring av vasoaktive effektorer fra blodplater (f.eks. bradykinin og histamin). Endring av nivået av disse cytokiner resulterer til slutt i et kraftig fall i blodtrykket, fulgt av hjertesvikt. Det endelige resultat for pasienten er i 40-60% av tilfellene, død i løpet av 48-72 timer. Hittil har det ikke vært tilgjengelig noen spesiell kur eller terapi,-selv om bolus-injeksjoner av adrenale kortikosteroider så som met-ylprednisolon, anvendes, og i senere tidHiar anvendelse av monoklonale antistoffer gitt noen lovende resultater.
Septisk sjokk kan fremkalles av infeksjoner med en hvilken som helst bakterie som forårsaker frigjøring av LPS. Slike bakterier omfatter Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhi, Neisseria gonorrheae, Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae og lignende.
B. Lipid A og syntetiske analoger
En av hovedårsakene til mangel på effektivitet i vertens immunsystem når det gjelder å blokkere endotoksin før utløsning av de ovenfor angitte mål-cellene er at entodoksin er et dårlig antigen, særlig i strukturer som er involvert i den toksiske aktivitet, kalt Lipid A. Lipid A består av en ryggrad av ( 3-( l 6) diglukosamin med flere acylrester (fettsyrer) kovalent bundet til hydroksyl- og amino-gruppene via henholdsvis ester- og amido-bindinger. Fire molekyler 3-hydroksytetradekanoat er bundet til glukosamin-disakkaridet, og andre hydroksylgrupper er substituert med normale fettsyrer for å danne acyloksyacyl-grupper.
Forskjellige syntetiske analoger av Lipid A er blitt fremstilt for å øke den immunologiske aktiviteten til Lipid A, men eliminere dets toksisitet.
Mens andre syntetiske analoger av Lipid A er beskrevet, omfatter foreliggende oppfinnelse syntetiske Lipid A analoger i form av immunogene konjugater med kjemiske karakteristika entydig tilpasset kovalent kobling til bærer-proteiner uten å påvirke deres antigene„struktur.
C. Konjugat- vaksiner
For å øke immunogenisiteten til polysakkarider som er svake antigener, er det kjent å fremstille immunogene konjugater hvor polysakkaridet er koblet til bærerproteiner for å tilveiebringe såkalte "konjugat" vaksiner. F.eks. oppnås immunrespons hos menneskebarn overfor Haemophilus influenzae b kapsulært polysakkarid, ved kobling av det kapsulære antigenet til et bærer-protein^av difteritoksoid. Det antas at de lymfocytiske hjelpe-virkningene fremkalles av bærerproteinet og er ansvarlig for utvikling av immunitet. En tilsvarende fremgangsmåte har vært rettet mot fremstilling av pneumokokk-vaksiner. Intakte kapsulære polymerer avledet fra forskjellige bakterielle kapsulære polymerer har vært anvendt som den antigene komponent i disse vaksinene.
D. Anvendelse av bærerproteiner for fremstilling av antiserum mot haptener
Bærerproteiner kan gjøre mer enn å øke immunogenisiteten til konjugerte kapsulære polymerer; de kan også gjøre haptener immunogene. Haptener er definert som molekyler som kan binde spesifikt til et antistoff eller en lymfocytt-reseptor, men som ikke selv kan fremkalle immunrespons (dvs. de er ikke immunogene). For å fremkalle en immunrespons må generelt små/lav molekylvekt- eller lite immunogene molekyler, betegnet haptener, først kobles til et større molekyl, eller bærer, som vanligvis er et heterologt protein. Injeksjon av hapten-bærer-komplekset i et dyr vil fremkalle produksjon av antistoffer ved hjelp av B lymfocytter, som noen vil være i stand til spesifikt å bindes til det frie, ukoblede hapten-molekyl.
Blant de tidligere haptener som ble undersøkt var azo-farvestoff-forbindelser så som anilin og o-aminobenzosyre. Landsteiner og Lampl (1918, Z. Immun. Forsch 26:293) koblet disse forbindelsene ved diazotering til serum-proteiner. Når de ble injisert med disse kunstig fremstilte azo-proteiner, utviklet kaniner presipiterende antistoffer som var spesifikke for de tilknyttede kjemiske grupper.
Andre eksempler på hapten-forbindelser er dinitrofenol som blir immunogent ved kobling som dinitrofenyl- (DNP) gruppen til bovint serum-albumin eller til bovint gamma-globulin (BGG) og lyserginsyredietylamid. Til og med formaldehyd er vist å virke som et hapten; personer som utsettes for formaldehyd-damp fra produkter eller i laboratorier er blitt "overfølsomme" overfor forbindelsen, efter formylering av deres endogene makromolekyler in vivo....
Haptenets oppførsel er ikke begrenset til små organiske molekylar, og polypeptidhormoner opp til størrel-sen til insulin, er ofte lite, om i det hele tatt, immunogene. For å oppnå høye antistoff-titere for disse hormonene er det således nødvendig å konjugere dem til et bærermolekyl (eller lage større molekyler ved å kryssbinde mange av disse polypeptidene sammen).
Innvirkning av bærermolekylet er særlig interessant fordi bæreren spiller mer rolle enn bare som transport. Ovary og
Benaceraff, 1963, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 114:723 viste dette ved å injisere kaniner med DNP-BCG. Injeksjon av mange immunogene stoffer i dyr vil gi et immunologisk "minne" av eksponeringen.
Når en andre injeksjon gis senere, fås således en meget kraftigere immunrespons. Når Ovary og Benaceraff injiserte DNP-BCG påny, ble det oppnådd en sterk, sekundær respons som førte til markert forhøyede nivåer av antistoffer mot både DNP og BCG. Når den andre injeksjonen istedet ble gjort med DNP-eggalbumin, ble en meget svakere anti-DNP antistoffrespons registrert. Forskjellen i respons skyldes det som er blitt kalt bærereffekten, og synes å involvere hjelper T-lymfocytter.
Preliminære resultater indikerer at alle proteiner ikke nødvendigvis er like effektive bærer-proteiner for et gitt hapten. Robbins et al. (Infect. Immun. 40:245-256) har gitt data for eksperimentelle protein-polysakkarid-konjugat-vaksiner hvor samme polysakkarid-hapten ble konjugert til forskjellige proteinbærere, og antistoff-respons overfor haptenet ble bestemt. Betydelige forskjeller ble registrert for mengden av anti-hapten-antistoff dannet, noe som indikerte at bæreren spilte en betydelig rolle.
E. Vaksiner inneholdende konjugater
Andre forskere har studert konjugering av kapsulære polymerer til bærerproteiner for å fremme antistoff-dannelse ved den såkalte "bærer-effekten". F.eks. beskriver Schneerson et al., Journal of Experimental Medicine 152:361-376 (1980) H. influenzae b polymer-protein-konjugater vist å gi immunitet overfor angripende syk-dommer fremkalt av H. influenzae b. Referansen dokumenterer alders-avhengig immunologisk virkning av kapsulære polymerer hos barn, og søker å overkomme denne aldersavhengighet ved konjugering av den intakte .kapsulære polymer med en rekke proteiner, innbefattet serum albumin, Limulus polyphemus hemocyanin og difteritoksin. Konjugas-jonsmetoden omfatter anvendelse av et bindemiddel så som adipinsyre-dihydrazid.
Geyer et al., Med. Microbiol. Immunol. 165:171-288 (1979), fremstilte konjugater av visse Klebsiella pneumoniae kapsulære polysakkarid-fragmenter med en nitrofenyl-etylamin-linker ved reduktiv aminering, og det derivatiserte sukker ble derefter bundet til proteinene ved azo-kobling.
US-patent 4.057.685 av Mclntire, innlevert 9. mai 1974 angår et Escherichia coli lipopolysakkarid med redusert toksisitet kovalent koblet til et protein-antigen ved omsetning med halogenacyl-halogenid.
US-patent 4.356.170 av Jennings et al, bevilget 26. oktober 1982, angår fremstilling av polysakkarid-protein-konjugater ved reduktiv aminering.
Anderson (1983, Infection and Immunity 39: 233-238) beskriver konjugater mellom oligosakkarider fra Haemophilus influenzae type b kapsulært polysakkarid og CRM197, en ikke-toksisk, men antigent identisk variant av difteri-toksin.
Snippe et al., (1983, Infection and Immunity 42:842-844) beskriver en semisyntetisk vaksine mot Streptococcus pneumoniae type 3 hvor et heksasakkarid isolert fra et partielt syrehydrolysat av kapsulært polysakkarid S3 ble koblet til stearylamin ved reduktiv aminering og derefter innført i liposomer. Den resulterende konjugat/liposom-vaksine ble observert å medføre beskyttelse overfor S. pneumoniae type 3 hos mus.
US-patent 4.663.160 av Tsay et al., bevilget 5. mai 1987 angår bakterier hvor et detoksifisert polysakkarid fra en gram-negativ bakterie er kovalent koblet til et detoksifisert protein fra samme art av gram-negativ bakterie, ved hjelp av en 4-12 karbongruppe.
US-patent 4.619.828 av .Gordon, bevilget 28. oktober 1986, angår konjugater mellom polysakkarid-molekyler fra patogene bakterier så som Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis og Eschericia coli og T-celle-avhengige antigener så som difteri- og tetanus-toksoider.
US-patent 4.808.700 av Anderson og elements, bevilget
28. februar 1989 og US-patent 4.761.283 av Anderson, bevilget
2. august 1988 angår kovalent binding av kapsulære polymer-fragmente-r til bakterielle toksiner, toksoider eller binding av subenheter ved hjelp av reduktiv aminering.
US-patent 4.711.779 av Porro et al, bevilget 8. desember 1987, angår glykoprotein-konjugat-vaksiner som har trivalent immunogen aktivitet og som omfatter antigene determinanter fra kapsulære polysakkarider fra en gram-positiv bakterie og en gram-negativ bakterie, så vel som enten CRM197, tetanus-toksoid eller pertussis-toksin.
F. Metoder for fremstilling av konjuqat- vaksiner
Fremstilling av konjugat-vaksiner, i hvilke kapsulære polysakkarid-haptener er bundet til bærer-proteiner, omfatter følgende metoder: (i) kapsulært polysakkarid må fremstilles; (ii) hvis et fragment av polysakkaridet skal anvendes, må det separeres fra intakt polysakkarid; (iii) sakkaridet må aktiveres eller gjøres mottagelig for konjugasjon, dvs. enheter som kan bindes kovalent til
protein må dannes;
(iv) sakkaridet konjugeres med protein.
Forskjellige metoder er kjent innen fagområdet for å gjennom-føre disse fire trinn. For en oversikt over metodene som anvendes, se Cruse JM, Lewis RE Jr. (Ed.): Conjugate Vaccines, Contrib. Microbiol. Immunol.; Basel, Karger, 1989, vol. 10, s. 48-114.
Generelt kan koblingen være direkte eller med anvendelse av en linker- ("spacer") kjede som tjener til å adskille de to antigene komponentene med kjeder hvis lengde og fleksibilitet kan tilpasses behovet. De kjemiske reaksjonene anvendt for koblingen avhenger normalt av anvendelse eller modifikasjon av et relativt lite antall naturlig forekommende funksjonelle grupper: karboksyl-, hemiacetal-, amino/imino-, merkapto/disulfid-, hydroksyl- og fenoksygrupper. F.eks. kan glykokonjugering oppnås ved dannelse av amid-bindinger under anvendelse av et vannoppløselig karbodi-imid med eller uten et vann-oppløselig hydroksysuccinimid-derivat for å danne aktiverte karboksylat-mellomprodukter som lett kondenserer med primære aminogrupper på bærer-proteinet. En annen vanlig anvendt metode, betegnet "reduktiv aminering" anvender natriumcyanoborhydrid for selektivt å redusere mellomprodukt-imin-adduktene kjent som Schiff baser. Se US-patenter 4.356.170 og 4.808.700. For tiden anvendes denne for å fremstille en kommersiell PRP-avledet oligosakkarid-vaksine (HbOC).
En rekke koblingsteknikker som anvender linker-teknologi er kjent. En metode anvender adipinsyre-dihydrazid som linker, ved kobling med cyanogenbromid. Se US-patent 4.619.828. I US-patent 4.711.779 spaltes først oligosakkarid-haptener ved syrehydrolyse og aktiveres derefter ved innføring av primære aminogrupper i de terminale reduserende grupper (f.eks. under anvendelse av natriumcyanoborhydrid), med påfølgende omdannelse til estere (f.eks. i nærvær av adipinsyre-derivater). Det aktiverte oligosakkarid konjugeres derefter til toksoid i nærvær av et organisk oppløs-ningsmiddel så som dimetylsulfoksyd.
Foreliggende oppfinnelse angår nye syntetiske disakkarid-hapten-forbindelser som er analoger til Lipid A og immunogene konjugater fremstilt fra slike disakkarider ved kovalent kobling av disakkaridene til bærer-proteiner.
Videre angår foreliggende oppfinnelse nye mellomprodukter som er nyttige for fremstilling av immunogene konjugater og kovalente disakkarid-konjugater.
Endelig angår foreliggende oppfinnelse konjugat-vaksiner til anvendelse for behandling av septisk sjokk.
Foreliggende oppfinnelse angår således nye, syntetiske, immunogene Lipid A D-glukosamin-disakkarid-konjugater med den generelle formel:
hvor P<1> er hydrogen eller fosfat; R2 er alkyl(C1.4);
P<2> er hydrogen, propyl, allyl eller fosfat; n er—et helt tall fra 1-30 og Q er et egnet bærerprotein eller peptid valgt fra CRM197, et peptid avledet fra CRM197, difteri-toksoid, tetanus-toksoid og et peptid avledet fra difteri- eller tetanus-toksoid. I ovenstående formel angir n antall mol av disakkarid-enheter pr. mol av bærerprotein.
1. Fremstilling av D- glukosamin- disakkarider
De nye, syntetiske disakkarid-haptenene som er nyttige for fremstilling av de immunogene konjugatene ifølge oppfinnelsen er de som har formelen:
hvor R1 er hydrogen eller lavere alkanoyl; R2 er (CVJ alkyl ; R3 er CO(CH2)4COOX hvor X er en funksjonell gruppe med formelen
P<1> er hydrogen eller fosfat, og P<2> er hydrogen, propyl, allyl eller fosfat.
Disse nye Lipid A D-glukosamin-disakkarid-forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, som kan representeres ved forbindelsene 13., 32 og 35 og de nye konjugatene derav, kan fremstilles som angitt i Skjema I og Skjema II.
' I de foregående Skjema I og Skjema II er R benzyloksykarbonyl (CBZ) eller 2,2,2-trikloretyloksykarbonyl, R' er C(0) (CH2) 4C(0)0-X hvor X er
R" er propyl;
al er en allylgruppe;
Bn er benzyl;
P<*> er difenylfosfat;
TCA er en trikloracetimidat-gruppe;
P<*>* er dibenzylfosfat;
P er fosfat;
P<1> er hydrogen eller fosfat;
P<2> er propyl, allyl, fosfat eller hydrogen;
Reagensene anvendt ved ovenstående reaksjoner kan være som følger:
a. eddiksyreanhydrid/pyridin
b. tinntetraklorid
c. benzyloksykarbonylklorid
d. allylalkohol/HCl
e. dimetoksypropan/p-TSA
f. eddiksyreanhydrid/pyridin
g. 90% eddiksyre, 100°C
h. p-TSA, kloroform
i. Pd/C, etanol, cykloheksen
j. Amberlite IRA 401
m. cerium(IV)ammoniumnitrat/natriumazid
n. natriumnitritt
o. kaliumkarbonat/trikloracetonitril
p. allylalkohol/trimetylsilyltriflat
q. benzylbromid/natriumhydrid
r. 7N HC1, rt 1 time
s. benzylbromid/bariumhydroksyd/bariumoksyd
t. difenylfosforkloridat/dimetylaminpyridin
u. 1,5-cyklooktadien-bis(metyldifenylfosfin)-iridium-heksafluorfosfat/j od
v. molekylsikt/trimetylsilyltriflat
w. Pd/C, Pt20, H2 8 bar
x. butyllitium/dibenzylfosforkloridat
k. og 1. Se teksten.
Andre reagenser kan være egnet, hvilket vil være kjent for fagfolk på området.
I henhold til Skjema I oppnås syntese av propyl-6-0-[2-acetamido-2-deoksy-/3-D-glukopyranosyl ] -2-amino-2-deoksy-a-D-glukopyranosid (.13.) ved glykosidering av donor 2-metyl-(3,4,6-tri-0-acetyl-1,2-dideoksy-a-D-glukopyrano)-[2,1-d]-oksazolin (5), og det nye akseptor allyl-3-0-acetyl-2-(benzyloksykarbonyl)amino-a-D-glukopyranosid (10.) .
Donor 2-metyl-(3,4,6-tri-O-acetyl-1,2-dideoksy-a-D-gluko-pyrano) -[ 2 , 1-d] -oksazolin (5) fremstilles i to trinn som beskrevet av Srivatsava V.K. (1982). I første trinn behandles D-glukosamin-hydroklorid med eddiksyreanhydrid og pyridin for å gi pentaacetatet 4. Pentaacetatet omdannes til oksazolinet 5 ved behandling med tinntetraklorid i et egnet oppløsningsmiddel så som metylenklorid.
Den nye akseptor allyl-3-0-acetyl-2-(benzyloksykarbonyl)-amino-a-D-glukopyranosid (JLO) kan fremstilles i fem trinn ved å gå ut fra kommersielt tilgjengelig D-glukosamin-hydroklorid. D-glukosamin-hydroklorid behandles med benzyloksykarbonylklorid eller 2,2,2-trikloretylklorformiat (Bergamann and Zervas, 1932) for å gi derivatet (6). Denne omsetningen kan utføres i et egnet oppløsningsmiddel så som vann inneholdende natriumbikarbonat. Amino-D-glukopyranose-derivatet (6) omdannes derefter til allyl-2-substituert-amino-a-D-glukopyranosid (7) ved omsetning med allylalkohol-HCl. Dette mellomproduktet er beskrevet i litteraturen (S-ugawara, Tamio et al., 1989). Når forbifldelsen 7 omsettes med 2,2<1->dimetoksypropan i nærvær av P-TSA (Evans et al, 1967), oppnås allyl-2-substituert-amino-4,6-0-isopropyliden-a-D-glukopyranosid (8.) (to trinn) . Hydroksygruppen i 3-stilling i 8. forestres med eddiksyreanhydrid og pyridin (Weber and Khorana, 1972) for å gi allyl-2-substituert-amino-3-0-acetyl-4,6-0-isopropyliden-a-D-glukopyranosid (9.) . 3-0-acetyl-gruppen kan erstattes med en C1.4-alkylester ved å anvende det passende reagens istedenfor syreanhydridet. Denne forbindelsen omdannes til akseptor 10 ved sur hydrolyse (Lewbart and Schneider, 1969) av isopropyliden-gruppen.
Glykosideringen av 5 og 10 utføres i et egnet oppløsnings-middel så som kloroform under tilbakeløp, i nærvær av p-toluensulfonsyre. Denne omsetningen gir det ønskede 1—>6 /3-konfigurerte disakkarid 11 (allyl-2-deoksy-6-0-[2-deoksy-2-acetamido-3,4,6-tri-0-acetyl-/3-glukopyranosyl ] -2- (benzyloksy-karbonyl) amino-3-0-acetyl-a-D-glukopyranosid).
Strukturen til dette nye disakkarid ble bekreftet i eksperimentelle undersøkelser ved <1>H-NMR og <13>C-NMR. I <1>H-NMR er koblings-konstanten mellom H-l og H-2 av den ikke-reduserende enheten 8,9 som er karakteristisk for en /3-binding. Når 11 hydrogeneres på palladium/karbon (Bergamann and Zervas, 1932), den nitrogen-beskyttende gruppen fjernes og allyl-gruppen reduseres til propyl, tilveiebringes disakkaridet 12. 12 deacetyleres for å få det nye syntetiske disakkarid propyl-6-0-[2-acetamido-2-deoksy-/3-D-glukopyranosyl ] -2-amino-2-deoksy-a-D-glukopyranosid (il) .
Selv om den foregående beskrivelse beskriver fremstilling av de nye disakkarid-forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse i henhold til Skjema I under anvendelse av spesifikke reagenser, oppløsningsmidler og reaksjonsbetingelser, kan andre variasjoner av oppløsningsmidler, reagenser og reaksjonsbetingelser også være innenfor oppfinnelsens omfang. F.eks. omfatter egnede oppløsnings-midler for glykosiderings-reaksjonen av 5 og 10., karbontetraklorid (CC14) , diklormetan (CH2C12) , benzen og lignende. Andre variasjoner vil forstås av fagfolk på området efter foregående beskrivelse.
Skjema II
Syntese av D- qlukosan- disakkarid- mono- og difosfater ( 32 og 35)
I henhold til Skjema II oppnås syntese av propyl-2-deoksy-6-[ 2-deoksy-2-acetamido-/3-D-glukopyranosyl ] -2-amino-D-glukopyranosid-4 ' - ( f osf at) (32.) og 2-deoksy-6-[ 2-deoksy-2-acetamido-/J-D-glukopyranosyl]-2-amino-a-D-glukopyranose-l,4'-bis-(fosfat) (35) ved glykosidering av det nye donor 2-deoksy-2-acetamido-3,6-di-0-benzyl-glukopyranosyl-trikloracetimidat-4-0-difenyl-fosfat ( 20) og det nye akseptor allyl-2-azido-3-0-benzyl-D-glukopyranosid (22.) . Det nye akseptor allyl-2-azido-3-0-benzyl-D-glukopyranosid (22.) syntetiseres i 8 trinn ved å starte med kommersielt tilgjengelig triacetyl-glykal (15) . Triacetylglykal underkastes azido-nitrering som beskrevet i litteraturen (Grundler and Schmidt, 1984). Denne azido-nitrering resulterer i en blanding av forbindelser, dvs. a-D-gluko-azid (19%) , /3-D-gluko-azid (30%) og a-D-manno-azid (30%) . Forholdene ble bestemt ved integralene av H-C(l) signalene i <1>H-NMR-spekteret til blandingen. Ingen forsøk ble gjort på å separere blandingene på dette tidspunkt. Azido-nitratet 16 behandles med natriumnitrat i dioksan (Grundler and Schmidt, 1984) for å gi 17, som omdannes til allyl-glykosid 18. i to trinn. Deacetylering av 18. for å gi 19. oppnås ved å behandle 18 med Amberlite IRA 401 Resin. Forbindelse 19 behandles med dimetoksypropan og p-toluensulfonsyre (Evans et al., 1967). Fra dette reaksjonsprodukt isoleres 20 ved "flash" kromatografi. 20 er en blanding av a- og jS-anomerer. Strukturen til 20 ble bekreftet ved 1H-NMR- og 13C-NMR-spektra. 20 omdannes til 22 i to trinn, først benzylering (benzylbromid/natriumhydrid, Czernecki et al., 1976) av hydroksygruppen i 3-stilling og derefter hydrolyse (Lewbart and Schneider 1969) av 4,6-0-isopropyliden-gruppen. Andre ekvivalenter til benzyl kan anvendes for beskyttelse av hydroksygruppen i 3-stilling. Aktuelle ekvivalenter omfatter substituerte benzyl-grupper hvor substituentene ikke innvirkninger på funksjonen til den beskyttende gruppen.
Det nye donor 2-deoksy-2-acetamido-3,6-di-O-benzyl-gluko-pyranosyl-trikloracetimidat-4-0-dif enylf osf at (.30) fremstilles fra kommersielt tilgjengelig N-acetyl-glukosamin (13.) i 7 trinn. 23. allyleres først, og underkastes derefter isopropylidering (Evans et al., -1967) for å gi 25. Strukturen til 25 bl-e bekreftet ved <1>H-NMR- og <13>C-NMR-spektra. 2-deoksy-2-acetamido-4,6-O-isopropyliden-a-D-glukopyranosid (2_5) underkastes benzylering i nærvær av bariumoksyd og bariumhydroksyd for å gi 2-deoksy-2-acetamido-4,6-0-isopropyliden-3-0-benzyl-a-D-glukopyranosid, som behandles med 7N HC1 for å gi 2-deoksy-2-acetamido-3-benzyl-a-D-glukopyranosid (26). 26 underkastes de samme benzylerings-betingelser som beskrevet for 25, hvilket gir 2-deoksy-2-acetamido-3 , 6-0-dibenzyl-a-D-glukopyranosid (27). Forbindelse 2_7 kan også fremstilles fra 24. under anvendelse av to ekvivalenter av benzylerings-reagens. Som angitt ovenfor for beskyttelse av hydroksygruppen i forbindelse 20, kan andre ekvivalenter til benzyl anvendes for beskyttelse av hydroksygruppen i forbindelse 27.. Fosf orylering av 27. under anvendelse av dif enylf osf orkloridat i nærvær av dimetylaminopyridin i tørr kloroform (Imoto M. et al., 1987) gir allyl-2-deoksy-2-acetamido-3,6-di-0-benzyl-a-glukopyranosid-4-O-difenylfosfat (28). Ved denne reaksjonen og den følgende glykosiderings-reaksjon for forbindelse 30, er det viktig å anvende kloroform som er fri for etanol (HPLC kvalitet kloroform inneholdende 2-metyl-2-buten ble anvendt i disse tilfeller). 28 omdannes til 29 ved fjerning av den allyl-beskyttende gruppen under anvendelse av 1,5-cyklooktadien-bis(metyldifenylfosfin)-iridium-heksafluorfosfat og jod (Imoto M. et al., 1987).
Donoren 3_0 oppnås ved å behandle 2_9 med kaliumkarbonat og trikloracetonitril (Schmidt R.R. and Grundler G., 1982). Disakkaridet 31 oppnås ved glykosidering (Schmidt R.R. Angew. Chem. Int. Ed., 198 6) av akseptoren 30 og donoren 22. i tørr kloroform under anvendelse av trimetylsilyltriflat som katalysator. Disakkaridet 3JL underkastes hydrogenering med Pd/C og Pt20 katalysatorer (Imoto M. et al., 1987) ved 8 bar trykk for å gi 32..
Det nye disakkaridet 35 kan fremstilles fra det nye disakkaridet 31 i 3 trinn, på lignende måte som angitt av Imoto M. et al., (1987) for syntese av naturlig lipid A.
3. Konjugerin<q> av disakkarid til protein
Proteiner som kan anvendes i henhold til oppfinnelsen omfatter et hvilket som helst protein eller peptid som er trygt for administrering til unge pattedyr og som kan-tjene som et immunologisk effektivt bærerprotein valgt fra CRM197, et peptid avledet fra CRM197, difteritoksoid, tetanus-toksoid og et peptid avledet fra difteri- eller tetanus-toksoid. Ved spesielle utførelsesformer kan celle-overflate-proteiner, membranproteiner, toksiner og toksoider anvendes. Kriterier for sikkerhet omfatter fravær av primær toksisitet og minimal risiko for allergiske reaksjoner. Difteri- og tetanus-toksoider oppfyller disse kriterier, dvs. at fremstilt på passende måte, er de ikke-toksiske og indikasjon på allergiske reaksjoner er akseptabelt lav. Selv om risiko for allergiske reaksjoner kan være betydelig for voksne, er den minimal for barn. Andre passende bærere kan omfatte, men er ikke begrenset til, Salmonella flagellin, Hemophilus pilin, Hemophilus 15 kDa, 28-30 kDa og 40 kDa membranproteiner, Escherichia coli varmelabilt enterotoksin LTB, kolera-toksin og virale proteiner omfattende rotavirus V07 og respiratorisk syncytial virus F- og G-proteiner.
Ved "bærereffekten" blir et svakt antigen, ved å bli bundet til et sterkere antigen som bærer (dvs. et heterologt protein), mer immunogent enn om det ble gitt alene. Hvis et dyr tidligere var immunisert med bæreren alene, kan dyret være "primet" og produsere forsterket immunrespons ikke bare overfor bærer-antigenet, men også overfor tilknyttede hapten-grupper. Barn immuniseres rutinemessig med tetanus- og difteritoksoider. De vil således være "primet" for påfølgende presentasjon av et sakkarid-antigen konjugert til hvilket som helst av disse toksoider såvel som for det difteri-kryss-reaktive protein CRM197.
Bærerproteinene som den kapsulære polymer er konjugert med, kan være naturlig toksin eller detoksifisert toksin (toksoid). Ved relativt nye mutasjonsteknikker kan man også fremstille genetisk endrede proteiner som antigenisk ligner toksinet, men som allikevel er ikke-toksiske. Disse kalles "kryssreagerende stoffer", eller CRM. CRM197 er bemerkelsesverdig eftersom det har en enkelt aminosyreendring i forhold til det naturlige difteri-toksin og immunologisk ikke kan skilles fra dette.
Konjugering av kapsulær polymer til naturlig toksin kan redusere toksisiteten, men betydelig toksisitet kan være igjen. Ytterligere detoksifisering av protein-toksiner anvender således formalin som reagerer med frie aminogrupper i pr-eteinet. Gjenværende toksisitet kan fremdeles være et problem. Spontan detoksifisering er dessuten mulig med en hvilken som helst spesiell vaksine-mengde og forblir et problem ved denne metoden.
Alternativt kan naturlig toksin detoksifiseres med formalin for å tilveiebringe konvensjonelt toksoid før konjugering med kapsulær polymer. Denne for-behandling med formalin reduserer imidlertid antallet frie aminogrupper som er tilgjengelige for reaksjon med de reduserende grupper i det kapsulære polymer-fragment. CRM har således betydelige fordeler ved at de ikke har noen iboende toksisitet, selv om ingen av deres aminogrupper er okkupert av formalinet. En ytterligere fordel er at det ikke finnes noen biorisiko ved arbeid med CRM.
Når det gjelder CRM197 som er immunologisk identisk med naturlig toksin, øker behandling med formalin (selv om det ikke er noe behov for å detoksifisere) kraftig den immunologiske respons. Det antas at dette skyldes stabilisering av molekylet mot ned-brytning ved mekanismer i kroppen og/eller aggregering ved kryss-binding (immunogenisiteten til partiklene øker med størrelsen).
Av de ovenstående grunner er tetanus- og difteri-toksoider hovedkandidater som bærerproteiner, selv om det finnes andre som også kan være egnet. Selv om disse andre kanskje ikke har samme historie når det gjelder sikkerhet som finnes for difteri og tetanus, kan det være andre tungtveiende grunner for å anvende dem. F.eks. kan de være enda mer effektive som bærere, eller produksjons-økonomien kan være av betydning. Andre bærer-kandidater omfatter toksiner av pseudomonas, staphylococcus, streptococcus, pertussis og Escherichia coli.
Ved en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen kan Lipid A analog disakkaridene være bundet til CRM197 protein som er renset som følger: CRM197, produsert av stammen Corynebacterium diphtheriae, kan separeres fra dyrkningsmediet ved å lede bakterie-kulturen gjennom en Millipore membran, utfelle proteinet fra filtratet og rense CRM197 ved ionebytter-kromatograf i. Alternativt kan i det vesentlige rent CRM197 oppnås ved en hvilken som helst metode kjent på området.
Disakkaridet kan bindes kovalent til bærerprotein i nærvær av et organisk oppløsningsmiddel og eventuelt et hv-ilket som helst annet middel (så som et kondenseringsmiddel) for å fremme binding av den frie primære aminogruppe i disakkaridet til proteinet. Disakkaridet kan bindes kovalent til bærerproteinet under anvendelse av en rekke metoder kjent innen området, for å oppnå de immunogene protein-konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Koblingsmetodene som kan anvendes omfatter de følgende:
1) Omsetning av det amino-aktiverte disakkarid med karboksylgruppene i bærerproteinet, via karbodiimid-akti-vering ved sur pH; 2) Omsetning av det amino-aktiverte disakkarid med bromid-gruppen av en bifunksjonell spacer inneholdende en aldehyd-gruppe, som videre omsettes med aminogruppene i bærer-proteinet via reduktiv aminering under anvendelse av et reduksjonsmiddel så som natriumcyanoborhydrid; 3) Omsetning av det amino-aktiverte disakkarid med aminogruppene i bærerproteinet, via en bifunksjonell spacer inneholdende to bromid-grupper; 4) Omsetning av det amino-aktiverte disakkarid med N-hydroksy-succinimidyl-esteren av en bifunksjonell spacer inneholdende en sulfhydrylgruppe som videre omsettes med sulfhydryl-gruppene i bærerproteinet, via oksydering med luft eller under anvendelse av kjente oksydasjonsmidler; 5) Omsetning av det amino-aktiverte disakkarid med N-hydroksy-succinimidyl-esteren av en bifunksjonell spacer inneholdende en N-maleimido-gruppe som videre omsettes med sulfhydryl-gruppene i bærerproteinet.
Ved en spesiell, foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen kan disakkaridet med den primære aminogruppen bindes kovalent til frie aminogrupper tilstede på bærerproteinet ved anvendelse av et bifunksjonelt molekyl, idet hver funksjonelle gruppe kan reagere med enten den terminale aminogruppen i disakkaridet eller amino-gruppene tilstede i bærerprotein-strukturen, slik at det bifunksjonelle molekyl kan binde sammen oligosakkaridet og bærerproteinet. Ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er den bifunksjonelle gruppen en diester, og er mer spesielt, en diester av adipinsyre, som er vist å være forbundet med mer effektiv glykosylering av proteiner. Ved en foretrukket, spesiell utførelsesform av oppfinnelsen omsettes disakkaridet med en succinimidyl-diester av ravsyre eller, mer foretrukket, adipinsyre, som følger: Som vist i Skjema II derivatiseres de syntetiske disakkarider 13, 32 eller 3_5 ved å omdanne den primære aminogruppen til monosuccinimidyl-esteren 14. ved omsetning med bis-succinimidyl-esteren av adipinsyre. For dette formål oppløses disakkaridet 13.
i dimetylsulfoksyd (DMSO) og omsettes med bis-succinimidyl-ester av adipinsyre (1:1 mol/mol) ved 37°C i ca. 2 timer. Mer enn 90% av aminogruppene ble derivatisert til monosuccinimidylestere ved forsøkene. Den resulterende forbindelse 14., i DMSO, omsettes til slutt med et bærerprotein så som CRM197 i 0,1M NaHC03-oppløsning,
i
et molforhold på ca. 25:1 (disakkarid:protein) ved en pH på ca. 8,0 og en temperatur på 0-50°C, fortrinnsvis ca. 37°C. Konjugatet dialyseres derefter i ca. 24 timer, mot fosfatbuffer-oppløsning (PBS, pH=7,2) inneholdende 0,01% thimerosal som konserverings-middel .
Oppfinneren fremstilte konjugater i henhold til metoden beskrevet ovenfor som beskrevet i de følgende eksempler. Karakteriseringen av konjugatet ble utført ved a) analyse av de gjenværende aminogrupper i proteinet CRM197 ( 25/ 40) , b) identifi-kasjon av glukosamin-residuet efter sur hydrolyse av konjugatet, ved høy-ytelses-kromatografi (HPLC) (aminosyre-analyse) og c) SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese) på molekylvekt-økning i forhold til naturlig CRM197.
4. Vaksine- formulering og administrering
Egnede bærere for formulering av en vaksine omfatter natrium-fosfatbufret saltoppløsning (pH 7,4) eller 0,125M aluminiumfosfat-gel suspendert i natriumfosfat-bufret saltoppløsning ved pH 6 og andre konvensjonelle medier.
Vanligvis er vaksiner som inneholder fra car 5 til ca. 100
jug, fortrinnsvis ca. 10 til 50 /jg av disakkaridet, passende for å tilveiebringe effektive nivåer av antistoff mot Lipid A-analogen hos unge, varmblodige pattedyr. Den nøyaktige dosen bestemmes selvfølgelig ved rutinemessige dose/respons-forsøk. Konsentra-sjonen av glykoprotein-konjugatene for fremstilling av vaksiner for barn ligger innenfor området på ca. 25 til 200 fig disakkarid.
Høyere doser kan administreres, avhengig av kroppsvekt. Flere mindre doser administrert sekvensielt forventes å være overlegent sammenlignet med samme mengde konjugat gitt som en enkel injeksjon.
Vaksinene ifølge oppfinnelsen kan administreres til varmblodige pattedyr av en hvilken som helst alder, og er spesielt tilpasset til å fremkalle aktiv immunisering mot septisk sjokk hos unge pattedyr, forårsaket av frigjøring av Lipid A endotoksin fri-gjort av patogenene Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Neisseria gonorrheae, Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae og lignende.
Vaksinen kan i henhold til oppfinnelsen, administreres subkutant, intravenøst, intramuskulært, intraperitonealt, oralt eller intranasalt. Vaksinen kan omfatte glykokonjugatet i opp-løselig eller mikro-partikkel-form eller inkorporert i mikrokuler eller mikrovesikler, innbefattet liposomer.
5. Anvendelighet av oligosakkarid- konjugat- vaksiner
Ved foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen anvendes glykokonjugat-vaksiner rettet mot LPS produsert av patogene bakterier for å beskytte individer mot å utvikle septisk sjokk forårsaket av disse. Spesielt mottagelige individer som ville ha nytte av en slik vaksine, omfatter små barn med uutviklet immunsystem, aspleniske individer så vel som et hvilket som helst individ med et utsatt immunsystem eller kronisk sykdom, spesielt ervervet immunsviktsyndrom (AIDS), hematopoietisk malignans, diabetes, kronisk hjertesykdom, kronisk lungesykdom og sigdcelle-anemi. Glykokonjugatene ifølge oppfinnelsen forsterker, på grunn av deres konjugering til et bærerprotein, immunogenisiteten til disakkaridene de bærer.
Glykokonjugatene ifølge oppfinnelsen kan således anvendes ved vaksinasjoner for å gi beskyttelse mot septisk s-jokk forårsaket av en hvilken som helst bakterie som produserer LPS, innbefattet Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae og Pseudomonas aeruginosa, etc.
Lipid A glykokonjugatet fremstilt som beskrevet ovenfor under anvendelse av CRM197 som bærerprotein ble undersøkt på kaniner for å bestemme IgG immunrespons overfor CRM197 og Lipid A/LPS.
Resultatene er angitt i Tabell I.
Antigen: CRM197-syntetisk analog Lipid A (PO) . Forhold karbohydrat/protein: 0,1 (vekt/vekt) eller 15 (mol/mol).
Dose: CR<M>197 1 00 /ig, aluminiumhydroksyd 1 mg/dose.
Efter studier av beskrivelse og krav vil ytterligere formål og fordeler ved oppfinnelsen være klare for fagfolk på området.
Oppfinnelsen beskrives mer detaljert i forbindelse med de følgende, ikke-begrensende eksempler.
Eksempel 1
D- qlukosamin- pentaacetat ( 4)
Til en oppløsning av D-glukosamin-hydroklorid (30 g) i tørr pyridin (18 0 ml), ble satt eddiksyreanhydrid ved romtemperatur, og oppløsningen ble omrørt natten over. Metanol, 20 ml, ble tilsatt, og oppløsningsmidlene ble fjernet ved 50 °C. Residuet ble oppløst i EtOAc (4 00 ml). Denne oppløsningen ble vasket med M HC1, vann og saltoppløsning. Efter tørring over MgS04 ble oppløsningsmidlet fjernet for å gi urenset 4 (44 g) som ble krystallisert fra EtOH. Sm.p. = 136-37°C. Rf 0,27 (EtOAc).
<1>H-NMR: 6,08 (d, J=3,3, H-l), 5,86 (d, J=8,95, NH), 5,45 (m, 2H, H-3 og H-4), 4,38 (ddd, H-5), 4,17 (dd, J=12,5, 3,87,
Ha-6) , 3,95 (m, 2H, Hb-6, H-2) og 2,15-1,85 (4s, 5Ac) .
Eksempel 2
2- metyl-( 3, 4, 6- tri- 0- acetyl- l, 2- dideoksv- a- D- glukopyrano)- r 2, 1- d]-2- oksazolin ( DONOR, 5)
Til en oppløsning av pentaacetat 4 (13 g) i tørt metylenklorid (250 ml), ble satt tinn(IV)-tetraklorid (2,6 g, 1,15 ml) ved romtemperatur. Den resulterende oppløsning ble omrørt i 48 timer under en nitrogenatmosfære. Reaksjonsblandingen ble nøytralisert ved tilsetning av 10% NaHC03, og det resulterende bunnfall ble filtrert gjennom en celite pute. Filtratet ble vasket med vann, saltoppløsning og tørret (MgSOJ . Efter fjernelse av oppløsningsmidlet, ble produktet underkastet "flash" kromatografi (FC) (2:1:1: heksan:eter:aceton) for å gi 5 (3,2 g) og uomsatt 4_ (7 g) .
<1>H-NMR (CDC13, 300 MHZ): 5,98 (d, J=7,3, H-l): 2,1-2,09 (3s, OAc). Rf = 0,19 (benzen:eter:metanol (7:7:0,5)).
Eksempel 3
2- deoksy- 2-( benzyloksykarbonyl) amino- D- glukose ( 6) : Benzyloksykarbonylklorid (40 g, (39.3 ml), .2.36 mmol) ble satt langsomt til en avkjølt (0-4'C) oppløsning av 2-amino-2-deoksy-D-glukose-hydroklorid (34 g, 158 mmol) og natriumbikarbonat (34 g, 405 mmol) i vann (500 ml). Blandingen ble omrørt ved denne temperaturen i 2 timer og derefter ved romtemperatur natten over. Det farveløse utfelte stoff 6 ble oppsamlet ved filtrering, vasket med vann, eter og tørret ved høyvakuum (25 g, 50%).
Sm.p. 216-217°C (dekomp.).
Rf = 0,31 (MeOH:EtOAc: 1:9).
Eksempel 4
Allyl- 2- deoksy- 2-( benzyloksykarbonyl)- amino- a- D- qlukopyranosid f7) : Forbindelse 6. (35 g) ble oppvarmet under omrøring ved 100"C i allylalkohol inneholdende 2 % (vekt/volum) tørr HC1 i 0,5 time. Blandingen ble avkjølt, og oppløsningsmidlet ble avdampet i
vakuum. Residuet ble tørret ved inndampning sammen med toluen (50 ml) tre ganger. Denne forbindelsen ble anvendt i neste trinn uten ytterligere rensning. Sm.p. = 124-26°C.
Rf = 0,47 7,05 (d, J=7,8, NH), 6,0-5,8 (m, CH=), 5,4-5,25 (m, CH2=), 5,05-5,15 (bs, AB), 4,98 og 4,48 (bs, 20H), 4,78 (d, J=3,1 H(l)), 4,2-3,85 (m, CH2-allyl) 3,75-3,05 (m, 7H).
Eksempel 5
Allyl- 2- deoksy- 4, 6- 0- isopropyliden- 2( benzyloksykarbonyl)- amino- a-D- glukopyranosid ( 8): Det tørre produktet ovenfor (5 g) ble oppløst i 2,2'-dimetoksypropan (50 ml). Til denne omrørte oppløsning ble satt tørr p-toluensulfonsyre (100 mg) ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble omrørt natten over. Trietylamin (2 ml) ble satt til reaksjonsblandingen, og oppløsningsmidlet ble avdampet under redusert trykk. Residuet ble underkastet FC (Si02 = 150 g, 5:1; CH2C12:aceton inneholdende 1% TEA) for å gi 3,2 g. (571) av 8.
Sm.p. = 107-109<<>>C, Rf = 0,54 (1:1: Heks:EtOAc).
<1>H-NMR (CDC13, 300 MHz): 1,42 og 1,50 (2s, 6H, CH3) ; 2,75 (b, 1H, OH) ; 3,5-4,2 (m, 8H)) ; 4,82 (d, J=3,4, H-l); 5,1-5,3 (m, 5H, NH, CH2-benzyl, CH2=), 5,75-5,90 (m, 1H, CH=) og 7,35 (bs, 5H, arom.). <13>C-NMR: 157 (s, 0=C-0-benzyl); 136,75 (s, arom.); 133,98 (d,
CH=) ; 129,0-128,86 (d, arom.); 118,6 (t, CH2=) ; 100,5 (s, isopr.);
97,94 (d, C(l)); 75,1 og 70,96 (d); 69,1 (t, CH2-0-benzyl); 67,83 (t, 0-CH2-allyl); 64,16 (d); 62,84 (t); 59,32 (d, C(2)); 29,68 og 19,7 (q, CH3) .
Eksempel 6
Allyl- 2- deoksy- 2- ( benzyloksykarbonyl) amino- 3- 0- acetvl- o:- D-<g>lukopyranosid ( 10);
En oppløsning av 8. (9,00 g, 2 3 mmol) i tørr pyridin (60 ml), ble tilsatt eddiksyreanhydrid (15 ml) ved romtemperatur. Reaksjonsoppløsningen ble omrørt natten over. Oppløsningsmidlene ble fjernet ved 35°C under vakuum for å gi allyl-2-deoksy-2-(benzyloksykarbonyl)amino-3-0-acetyl-4,6-O-isopropyliden-a-D-glukopyranosid (9). Det acetylerte produktet 9 (5 g) ble oppvarmet i 90% eddiksyre ved 95°C i 10 minutter. Oppløsnings-midlet ble avdampet i vakuum. Produktet (3,91 g, 85%) var et gummiaktig materiale.
Rf = 0,2 (Heks.:EtOAc; 1:1).
<1>H-NMR (CDC13) : 1,9 (s, CH3) ; 2,56 (d, OH) ; 3,65-4,2 (m, 9H) ; 4,86 (d, J=3,6 Hz, H-l); 4,95-5,3 (m, 6H); 5,75-5,95 (m, 1H, CH=) og 7,35 (bs, arom.).
<13>C-NMR: 172,67 (s, 0=C-0-acetyl) , 156,83 (s, 0=C-0-benzyl); 136,86 (s, arom.); 133,93 (d, CH=); 129,0-128,64 (d, arom.); 118,69 (t, CH2=) ; 97,25 (d, C(l)); 74,6 og 72,39 (d) ; 69,04 (t, CH2-0-benzyl; 68,83 (d); 67,83 (t, 0-CH2-allyl); 61,89 (t); 54,33 (d, C(2) ) og 21,40 (q, CH3) .
Eksempel. 7 Allyl- 6- 0- r 2- deoksv- 2- acetamido- 3, 4, 6- tri- O- acetyl- g- D- qlukopyranosyl1- 2- deoksy- 2-( benzyloksykarbonyl)- amino- 3- 0- acetyl- a- D-<g>lukopyranosid ( 11): En oppløsning av donor 5 (0,32 g, 0,10 mmol), akseptor 10 (0,8 g, 0,20 mmol) og p-TsOH (40 mg) i tørr kloroform (20 ml) ble tilbakeløpsbehandlet under en N2-atmosfære i 24 timer. Efter avkjøling ble oppløsningen vasket med 10% vandig NaHC03, vann og saltoppløsning. Oppløsningsmidlet ble fjernet, og residuet ble underkastet FC (2:1: EtOAc:heks.) for å gi 11 (0,5 g). Rf = 0,35 (EtOAc).
<1>H-NMR (CDC13, 300 MHZ) : 1,90, 2,0, 2, 05 (s, CH3) ; 3,49 (d, OH) ; 3,55-4,29 (m, 9H) ; 4,8 (d, J=3, 54, H-l); 4,89 (d, J=8,42, H-l1)»* 4,95-5,35 (m, 5H) ; 5,74-5,89 (m, CH=) ; 6,1 (d, NH) og 7,25-7,35 (m, arom.).
<13>C-NMR: 172,35, 171,94, 171,46, 170,1 (s, 0=C-acetyl); 156,58 (s, 0=C-0-benzyl; 136,91 (s, arom.); 133,83 (d, CH=); 129,13, 128,78, 128,57 (d, arom.); 118,72 (d, CH2=) ; 103,02 (d, C(11)) ; 101,68 (d, C(l)); 74,42, 72,73, 72,51, 71,43, 69,28, 68,96(d); 68,79 (t, CH2-O-benzyl og CH2-0-allyl) ) ; 68,65 (d) ; 67,44, 62,65 (t, CH2) ; 55,38, 54,31 (d, C(2) og C(2')); 23,77 og 21,3 (q, CH3) .
Eksempel 8
Propyl- 6- 0- r 2- deoksy- 2- acetamido- 3, 4, 6- tri- O- acetvl- fl- D- aluko-pyranosyl1- 2- deoksy- 2- amino- 3- 0- acetvl- a- D- qlukopyranosid ( 12): En oppløsning av 11 (0,3 g) i etanol (16 ml) og cykloheksen (6 ml), ble tilsatt palladiumhydroksyd, og den resulterende reaksjonsblan-jdi<ng> ble tilbakeløpsbehandlet i 2 timer. Efter frafiltrering av katalysatoren, ble oppløsningsmidlet avdampet og residuet underkastet FC (EtOAc) for å gi 12 (130 mg, 60%).
Rf 0,54 (EtOH:MeCN:H20: 8:8:4).
Sm.p. amorft pulver.
<1>H-NMR: 0,94 (t, CH3) : 1,6 (q, CH2) ; 1,9, 2,0 og 2,1 (s, CH3C(0)); 3,25-4,3. (m) ; 4,72-4,85 (m) ; 4,8 (d, J=8,3,. h-l<1->)-; 4,92 (d, J=3,12, H-l); 5,08 (t, J=0,6, 1H); 5,24 (t, J=9,85, 1H) og 5,9
(NH) .
Eksempel 9
Propvl- 6- 0- f 2- acetaroido- 2- deoksy- ff- D- glukopvranosvl1-2-amino-2-deoksv- g- D- qlukopyranosid ( 13): Disakkaridet 12 (50 mg) ble deacetylert i metanol (10 ml under anvendelse av Amberlite IR-400 (OH") (0,5 g) harpiks med omrøring ved romtemperatur i 4 timer. Harpiksen ble frafiltrert, og filtratet ble konsentrert for å gi propyl-6-O-[2-acetamido-2-deoksy-/3-D-glukopyranosyl] -2-amino-2-deoksy-a-D-glukopyranosid (13), 30 mg, 85%.
Rf. sm.p. amorft pulver.
<1>H-NMR (DMS0-d6) : 0,85 (t, CH3) ; 1,55 (q, CH2CH3) ; 1,80
(s, CH3C(0)-) ;
Eksempel 10
O- nitro- 3. 4, 6- tri- 0- acetvl- 2- azido- pyranose ( 16):
Under en nitrogenatmosfære ble finpulverisert og tørret cerium(IV)ammoniumnitrat (60 g) og natriumazid (4 g) satt til en oppløsning av glukal-triacetat (15, 10 g) i tørt acetonitril (200 ml) ved -2 0°C. Den resulterende suspensjon ble kraftig omrørt ved denne temperaturen i 7 timer. Blandingen ble derefter fortynnet med eter (3 00 ml) , vasket med vann, Na2C03-oppløsning, vann og saltoppløsning. Efter tørring over MgS04 ble oppløsningsmidlene fjernet for å gi 16. (12 g) som et gummiaktig materiale..16 ble tørret med høyvakuum-pumpe og anvendt ved neste reaksjon uten ytterligere rensning.
Rf = 0,7 (heksan:etylacetat: 1:1).
<1>H-NMR: -2,0-2,15 (s, CH3CO) , 4,0-4,3 (m) , 4,90-5,-55 (m) , 6,33 (d, J=4,2), 6,21 (d, J=l,9) og 5,63 (d, J=8,9).
Eksempel 11
3, 4, 6- tri- 0- acetyl- 2- azido- pyranose ( 17):
Til en oppløsning av 0-nitro-3,4,6-tri-0-acetyl-2-azido-pyranosid (.16 12 g, fra ovenstående forsøk) i dioksan (70 ml) ble tilsatt en oppløsning av natriumnitritt (14 g) i vann (15 ml), og den resulterende blanding ble oppvarmet ved 80°C i 10 timer. Efter avkjøling til romtemperatur ble iskaldt vann tilsatt. Den vandige fasen ble ekstrahert med eter, og eterekstrakten ble behandlet på vanlig måte for å gi råproduktet JL7. Det rå 17 ble underkastet FC ("flash" kromatografi) (heksan:etylacetat: 1:1) for å gi 3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-pyranose (17., 7,5 g, 62% i to trinn).
Eksempel 12
Allyl- 2- azido- 3, 4, 6- tri- 0- acetvl- pyranosid ( 18):
Til en omrørt oppløsning av 17 (4,6 g) i tørr diklormetan, ble tilsatt kaliumkarbonat (3,8 g, flammetørret) og trikloracetonitril (5,6 ml) under en tørr nitrogenatmosfære. Omrøring ble fortsatt 5 timer ved romtemperatur. Uoppløselig kaliumkarbonat ble filtrert fra, og filtratet ble konsentrert og tørret ved høyvakuum for å gi trikloracetimidat (6,6 g). Dette trikloracetimidat ble tatt opp i tørr kloroform (50 ml) inneholdende allylalkohol (4 ml). Til den resulterende oppløsning ble satt trimetylsilyltriflat (0,1 ml), og omrøring under tørr N2-atmosfære ble fortsatt i 2 timer. Trietylamin (3 ml) ble tilsatt, og den resulterende oppløsning ble konsentrert og underkastet FC (diklormetan:aceton: 9,5:0,5) for å gi allyl-2-azido-3,4,6-tri-O-acetyl-pyranosid (18, 4,6 g, 90%).
Eksempel 13
Allvl- 2- azido- pyranosid ( 19):
Til oppløsningen av 18 (4,6 g) i metylalkohol (300 ml) ble tilsatt Amberlite IRA-401 (OH", 100 ml), og omrørt natten over. Efter filtrering av harpiksen ble filtratet konsentrert for å gi allyl-2-azido-pyranosid (19., 2 g, 65%) .
Eksempel 14
Allvl- 2- azido- 4, 6- 0- isopropyliden- D- qlukopyranosid ( 20): Allyl-2-azido-pyranosid (2 g) ble homogenisert med dimetoksypropan (50 ml) under anvendelse av sonifikering. Denne opp-løsningen ble tilsatt en katalytisk mengde av p-TSA, og omrørt natten over. Reaksjonsblandingen ble tatt opp i etylacetat, og efter vanlig opparbeidelse og konsentrering ble residuet underkastet FC (heksan:etylacetat: 3:1, inneholdende 0,5% TEA) for å gi 0,9 g allyl-2-azido-4,6-0-isopropyliden-D-glukopyranosid (20). Rf = 0,31 (heksan:etylacetat: 3:1, inneholdende 0,5% TEA).
<1>H-NMR: 1,40 og 1,50 (s, CH3) , 3,10-4,20 (m) , 4,4 (d, J=8,03, H-l av jØ-anomer) , 4,90 (d, J=3,74, H-l av a-anomer) , 5,20 5,36 (m, CH2=) og 5,9 (m, CH=).
<13>C-NMR: 19,2 og 29,07 (q, CH3) , 97, 70 (d, C(l) av 100,06 (d, C(l) av B) , 101,55 (s, C-CH3) , 118,02 (t, CH2=) og 133,31 (d, CH=).
Eksempel 15
Allvl- 2- azido- 3- 0- benzyl- D- qlukopvranosid ( 22):
En oppløsning av allyl-2-azido-4,6-O-isopropyliden-D-glukopyranosid (2_0, 13 0 mg, 0,5 mmol) i DMF (5 ml) ble behandlet med NaH (24 mg, 1 mmol) og benzylbromid (171 mg, 0,12 ml, 1 mmol). Omrøring ble fortsatt i 3 timer, hvorefter tynnskiktkromatografi (tic) (heksan:etylacetat: 1:1) indikerte fullstendig dannelse av 21. Reaksj onsblandingen inneholdende 2_1 ble surgjort med 7N HC1 og omrørt i 1 time. Ekstraksjon med eter, vanlig opparbeidelse og FC (heksan:etylacetat 2:1) ga allyl-2-azido-3-0-benzyl-D-glukopyranosid (60 mg, 40%). Rf 0,17 (heksan:etylacetat 1:1).
<1>H-NMR: 2,22 og 2,80 (b, 2 OH), 3,20-4,40 (m), 4,75 og 4,95 (AB, J=ll,2, _benzyl) , 4", 92 (d, J=3,75, H-l av a-), 5 ,.2-5,4 (m, CH2=) og 5,92 (m, CH=).
<13>C-NMR: 62,6 og 62,75 (t, C(6)), 63,63, 66,51 (d), 69,18, 71,24 (t, CH2 av allyl), 70,78, 71,41 71,96 (d), 75,74 (t, benzyl), 80,67, 83,15 (d) , 97,53 (d, C(l) ava-), 101,81 (d, C(l) av )3-) , 118,63, 118,8 (t, CH2=), 128,74, 129,31 (d, arom.), 133,78 (d, CH=) og 13 8,6 (s, arom.).
Eksempel 16
Allyl- 2- deoksy- 2- acetamido- a- D- qlukopyranosid ( 24) :
En suspensjon av N-acetylglukosamin (23., 1 g) i allylalkohol (10 ml) inneholdende 2% HC1 ble oppvarmet ved 100°C i 10 min. Allylalkohol ble avdampet med vannpumpe, og residuet ble underkastet FC (EtOAc:EtOH: 4:1) for å gi allyl-2-deoksy-2-acetamido-a-D-glukopyranosid (24, 0,9 g, 76%). Rf 0,32 (EtOAc:EtOH: 4:1), sm.p. = 180-182<e>C.
<1>H-NMR (DMSO-D6) : 1,85 (s, CH3) , 3,10-3,70 (m, 6H) , 3,9 og 4,1 (2dd, CH2 av allyl), 4,68 (d, J=3,0, H-l), 5,15 og 5,30 (2bd, CH2=) , 5,9 (m, CH=) og 7,74 (d, J=7,75, NH) .
Eksempel 17
Allyl- 2- deoksv- 2- acetamido- 4, 6- 0- isopropvliden- a- D- glukopvranosid ( 25) : Allyl-2-deoksy-2-acetamido-a-D-glukopyranosid (24., 1 g) ble homogenisert med dimetoksypropan (10 ml) under anvendelse av sonifikering. Til denne oppløsningen ble satt en katalytisk mengde av p-TSA, og omrørt natten over. TEA (3 ml) ble tilsatt, oppløsningsmidlene ble avdampet og residuet ble underkastet FC (etylacetat) for å gi allyl-2-deoksy-2-acetamido-4,6-0-isopropyliden-a-D-glukopyranosid (2_5, 1 g, 86,5%). Rf = 0,5 (etanol:etylacetat: 1:9).
<1>H-NMR: 1,40 og 1,50 (2s, CH3) , 1,98 (s, CH3CO) , 3,44 (bs, OH) , 3,58-4,20 (m) , 4,82 (d, J=3,8, H-l), 5,22 (dd, CH2=) , 5,85 (m, CH=) og ,.6,07 (d, J=8,7, NH) .
<13>C-NMR: 19,71 og 29,69 (q, CH3) , 23 ,88 (q, CH3CO) , 54,68 (d, C(2)), 62,82 (t, C(6)), 64,15, 71,14, 75,29 (d), 69,02 (t, CH2 av allyl), 97,65 (d, C(l)), 100,5 (s, C-CH3) , 118,69 (t, CH2=) , 133,99 (d, CH=) og 172,08 (s, CH3CO).
Eksempel 18
Allyl- 2- deoksy- 2- acetamido- 3- 0- benzyl- Q:- D- qlukopyranosid ( 26) :
En suspensjon av bariumoksyd (613 mg), bariumhydroksyd (158 mg) og 2-deoksy-2-acetamido-4,6-0-isopropyliden-a-D-glukopyranosid (25, 470 mg) i tørt DMF (10 ml) ble langsomt tilsatt benzylbromid. Omrøring ble fortsatt i 3 timer, hvorefter, når tic viser intet utgangsmateriale, reaksjonsblandingen ble surgjort med 7N HC1 og omrørt natten over. Vanlig opparbeidelse og FC (9:1, EtOAc:EtOH) ga allyl-2-deoksy-2-acetamido-3-0-benzyl-a-D-glukopyranosid (14, 210 mg). Rf 0,48 (9:1, EtOAc:EtOH).
<1>H-NMR: 1,9 (s, CH3C0) , 2,35 og 2,9 (2s, OH) , 3,5-4,3 (m) , 4,7 (AB av benzyl), 4,8 (d, J=3,7, H-l), 5,23 (m), 5,85 (m) og 7,3 (m). <13>C-NMR: 24,06 (q, CH3CO) , 52,63 (d, C(2)), 62,84 (t, C(6)), 68,83 (t, CH2= av allyl), 71,34 og 72,18 (d), 74,61 (t, benzyl), 80,73 (d), 97,55 (d, C(l)), 118,45 (t, CH2=) , 128,66 og 129,25(d), 134,1 (d, CH=), 138,95 (s, arom.) og 170,6 (s, CH3C0).
Eksempel 19
Allvl- 2- deoksy- 2- acetamido- 3, 6- di- 0- benzyl- a- qlukopyranosid ( 27): 27 ble fremstilt fra 26 på lignende måte som beskrevet for 14. ovenfor. Efter surgjøring med 7N HC1 ble reaksjonsblandingen ekstrahert med etylacetat, og vanlig opparbeidelse av etylacetat-ekstrakten ga råproduktet som er en blanding av di- og tri-benzyl-derivater. Fra denne blandingen ble 2_7 isolert ved FC (4:1, CH2C12: aceton) i 60%.
<1>H-NMR: 1,9 (s, CH3C0), 2,75 (s, OH), 3,5-4,3 (m), 4,5-4,78 (2AB av benzyl), 4,82 (d, J=3,72, H-l), 5,2 (m) , 5,4 .(-d, J=9,28 NH) , 5,85 (m) og 7,3 (m, arom.).
<13>C-NMR: 24,06 (q, CH3CO) , 52,42 (d, C(2)), 68,82 (t, C(6)), 70,78 (t, CH2= av allyl), 72,81 og 80,5 (d) , 74,31 og 74,48 (2t, benzyl), 97,51 (d, C(l)), 118,34 (t, CH2=) , 128,28, 128,4, 128,66, 129,1, 129,18 og 130,59 (d), 134,22 (d, CH=), 138,39 og 138,48 (s, aromatisk) og 170,44 (s, CH3C0).
Eksempel 2 0
Allyl- 2- deoksy- 2- acetamido- 3, 6- di- Q- benzyl- a- qlukopyranosid- 4- 0-difenvlfosfat ( 28): Til en oppløsning av 21<_> (2,75 g) , dimetylaminopyridin (3 g) og pyridin i tørr kloroform (50 ml) ble langsomt satt difenyl-fosforkloridat (5 ml). Omrøring ble fortsatt i 2 timer ved romtemperatur. Reaksjonsoppløsningen ble fortynnet med kloroform, og vanlig opparbeidelse og FC (9:1, metylenklorid:aceton) ga 28 i 95% utbytte. Rf 0,37 (diklormetan:aceton: 9:1). <1>H-NMR: 1,8 (s, CH3) , 3,66 (dd), 4,05-3,76 (m) , 4,05-4,34 (2AB) , 4,85-4,72 (m), 4,88 (d, J=3,9), 5,6-5,0 (m), 6,85 (m, CH=) og 7,60-7,0 (m, aromatisk). <13>C-NMR: 23,26 (q, CH3CO) , 51,78 (d, C(2)), 68,51, 70,25, 73,37, 73,54, 76,93, 78,11, 96,54 (d, C(l)), 117,83 (t, CH2=) , 120,14-128,69 (arom.), 133,46 (d, CH=), 138,05 og 138,15 (s, arom.) og 169,66 (s, CH3C0) . Eksempel 21 2- deoksy- 2- acetamido- 3, 6- di- 0- benzyl- a- qlukopyranose- 4- 0-difen<y>lfosfat ( 29): En oppløsning av forbindelse 28. (1,6 g) og 1,5-cyklooktadien-bis(metyldifenylfosfin)-iridiumheksafluorfosfat (0,2 g) i tørt, oksygenfritt tetrahydrofuran (50 ml) ble omrørt under en hydrogen-atmosfære inntil den oransje farven på oppløsningen ble lys gul. Hydrogenet ble erstattet med tørr nitrogengass, og omrøring ble fortsatt i 3 timer ved 50°C. Efter avkjøling av reaksjons-oppløsningen ble jod (0,5 g) og vann (10 ml) tilsatt og omrørt natten over ved romtemperatur. Reaksjonsoppløsningen ble fortynnet med etylacetat (150 ml) , og etylacetat-oppløsningen ble vasket med vandig natriumsulfitt-oppløsning (5%)r vann og saltoppløsning, tørret over MgS04 og konsentrert. Residuet ble underkastet FC (diklormetan: aceton: 4:1) for å gi forbindelse 29.
(0,75 g, 50%). Rf 0,12 (diklormetan:aceton: 9:1).
<13>C-NMR: 23,17 (q), 52,67, 68,8, 69,51, 69,61, 73,38, 73,53, 76,8, 77,25, 77,38, 77,49, 91,0 (d, C(l)), 130,11-120,1 (d, aromatisk), 137,87, 138,03, 150,47, 150,51 og 170,49 (alle s).
Eksempel 2 2
2- deoksy- 2- acetamido- 3, 6- di- O- benzyl- qlukopyranosyl- trikloracetimidat- 4- G— difenylfosfat ( 30) : En blanding av forbindelse 29. (0,53 g) , kaliumkarbonat (3 g, flammetørret) og trikloracetonitril (3 ml) i tørr kloroform (alkoholfri) ble omrørt ved romtemperatur natten over. Kalium-karbonatet ble filtrert fra. Filtratet ble konsentrert, og residuet (Rf 0,65; diklormetan:aceton: 4:1) ble tørret under høyvakuum og anvendt som sådant ved neste reaksjon.
Eksempel 2 3
Allvl- 6- O- r 2- deoksy- 2- acetamido- 3 , 6- di- 0- benzvl-/ 3- D- qlukopyranosyl1- 2- deoksy- 2- azido- 3- 0- benzvl- D- qlukopyranosid- 4'-O-difenvlfosfat ( 31): Til en oppløsning av ovenstående trikloracetimidat 3_0 og allyl-2-azido-3-0-benzyl-D-glukopyranosid (0,53 g) i tørr kloroform, ble tilsatt molekylsikt (10 g, pulverformig, flamme-tørret). Oppløsningen ble omrørt under en N2-atmosfære i 1 time. Denne tørre reaksjonsblandingen ble langsomt tilsatt trimetylsilyltriflat (0,2 ml) og omrøring ble fortsatt ved romtemperatur i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat (100 ml) inneholdende trietylamin (3 ml). Molekyl-sikten ble frafiltrert, og filtratet ble konsentrert. FC (diklormetan: aceton: 4:1) av residuet ga produktet 31 (0,15 g), Rf 0,49 (diklormetan:aceton: 4:1).
IR (nujol) : 2110 cm"<1> (N3) .
1H-NMR: .1,75 (s, CH3) , 4,95-3 ,20 (m) , 5,40-5,04 (m) , 5,85 (m) og 7,50-7,00 (m, aromatisk).
<13>C-NMR: 23,35 (q, CH3) , 82,32-50,71 (d, ring-karboner), 96,89 (d, a-anomerisk C(l)), 100,45, 100,58 og 100,97 (d, /?-anomerisk C(l') og C(l'), 117,95 (t, CH2=), 129,77-120,24 (d, aromatisk), 133,26 (d, CH=), 137,96, 138,29, 150,41 og 171,89 (alle s).
Eksempel 24
Propvl- 6- 0- \ 2- deoksy- 2- acetamido-) 3- D- qlukopvranosyl 1 - 2- deoksy- 2-amino- D- glukopyranosid- 4'- 0- fosfat ( 32): En oppløsning av forbindelse 31 (65 mg) i metanol (15 ml) ble hydrogenert over 10% Pd/C (40 mg) ved 8 bar trykk i 2 timer. Efter tilsetning av platinaoksyd (20 mg) katalysator til reaksjonsblandingen ble hydrogenering fortsatt ved 8 bar i ytterligere 2 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og filtratet ble konsentrert for å gi forbindelse 32. (30 mg). Eksempel 2 5 6- 0- F 2- deoksv- 2- acetamido- 3, 6- di- O- benzyl- ff- D- qlukopvranosyl1- 2-deoksv- 2- azido- 3- 0- benzyl- D- qlukopyranose- 4'- 0- difenylfosfat ( 33): Forbindelse 31 ble fremstilt fra allyl-6-0-[2-deoksy-2-acetamido-3 , 6-di-0-benzyl-/3-D-glukopyranosyl ] -2-deoksy-2-azido-3-0-benzyl-D-glukopyranosid-4 1 -0-dif enylf osf at (3JL) ved å fjerne den allyl-beskyttende gruppen, på lignende måte som beskrevet for fremstilling av 2-deoksy-2-acetamido-3,6-di-0-benzyl-a-glukopyranose-4-0-dif enylf osf at (29.) . Eksempel 2 6 2- deoksv- 6- r 2- deoksv- 2- acetamido-/ 3- D- cflukopyranosyl- 2- amino- a- D-glukopvranose- 1, 4'- bis ( fosfat) ( 35): Forbindelse H (80 mg) ble oppløst i tørt THF (20 ml) og avkjølt til -70°C under en nitrogenatmosfære. Oppløsningen ble behandlet med 1,6M butyllitium i heksan (0,1 ml) og derefter dibenzylfosforkloridat (50 mg). Blandingen ble omrørt ved -70°C i 5 min., og 10% palladium/karbon (100 mg) katalysator ble tilsatt. Blandingen ble hydrogenert under 6 kgcm"<1> i 17 timer. Efter 17 timer ble platinaoksyd (100 mg) tilsatt, og hydrogenering ble fortsatt ved 6 kgcm"<1> i ytterligere 2 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og filtratet ble nøytralisert med vandig ammoniakk og konsentrert for å gi 35 mg av et fast stoff.
Referanser:
Bergamann M. and Zervas L., 65, 1192 (1932).
Czernecki S. et al., Tetrahedron Lett., 3535 (1976).
Evans M.E., Parrish F.W. and Long L., Jr., Carbohydr. Res., 3, 453
(1967) .
Grundler G. and Schmidt R.R., Liebigs Ann. Chem., 1826 (1984). Imoto M. et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 60, 2205 (1987).
Lewbart M.L. and Schneider J.J., J. Org. Chem., 34, 3505 (1969). Schmidt R.R. and Grundler G., Angew. Chem., 94, 790 (1982). Schmidt R.R., Angew. Chem. Int. Ed., 25, 212 (1986).
Srivatsava V. K., Jr., Carbohydr. Res., 103, 287-292 (1982). Sugawarw, Tamio et al., Jr., Carbohydr. Res., 194, 125-138 (1989). Weber H., Khorana H.G., J. Mol. Biol. 72, 219 (1972).

Claims (5)

1. Immunogent konjugat for behandling av septisk sjokk, karakterisert ved formelen: hvor P<1> er hydrogen eller fosfat; R2 er alkyl (C,_4) ; P<2> er hydrogen, propyl, allyl eller fosfat; n er et helt tall fra 1-30 og Q er et egnet bærer-protein eller peptid, valgt fra C<RM>197, et peptid avledet fra CRM197, difteri-toksoid, tetanus-toksoid og et peptid avledet fra difteri- eller tetanus-toksoid .
2. Forbindelse, karakterisert ved formelen hvor R1 er hydrogen eller lavere alkanoyl; R2 er (C,_4) alkyl; R3 er CO(CH2)4COOX hvor X er en gruppe med formelen: P<1> er hydrogen eller fosfat og P<2> er hydrogen, propyl, allyl eller fosfat.
3. Kovalent konjugat mellom et D-glukosamin-disakkarid og et bærerprotein, karakterisert ved at det er fremstilt ved metoden som omfatter trinnene: (i) fremstilling av et aktivert D-glukosamin-disakkarid ved omsetning av en forbindelse med formelen: hvor R, er hydrogen eller acyl, R2 er alkyl(C1.4), P<1> er hydrogen eller fosfat og P<2> er hydrogen, propyl, allyl eller fosfat, med et molekyl som omfatter to funksjonelle grupper av hvilke den ene kan reagere med den terminale gruppen i det aktiverte disakkarid og den andre kan reagere med bærer-proteinet; og (ii) omsetning av det aktiverte D-glukosamin-disakkarid-produkt fra (i) med et egnet bærer-protein eller peptid valgt fra CR<M>197, et peptid avledet fra CRM197, difteri-toksoid, tetanus-toksoid og et peptid avledet fra difteri- eller tetanus-toksoid, slik at konjugering finner sted.
4. Vaksine for profylakse av septisk sjokk, karakterisert ved at den omfatter et kovalent konjugat ifølge krav 1.
5. Forbindelse karakterisert ved formelen hvor Bn er benzyl; P<3> er fosfat eller difenylfosfat; P<4> er allyl, propyl, hydrogen eller dibenzylfosfat; Ac er lavere alkanoyl.
NO931655A 1992-05-07 1993-05-06 Immunogent konjugat for behandling av septisk sjokk, forbindelser samt kovalent konjugat mellom D-glukosamin-disakkarid og et bærerprotein NO180234C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87940392A 1992-05-07 1992-05-07

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO931655D0 NO931655D0 (no) 1993-05-06
NO931655L NO931655L (no) 1993-11-08
NO180234B true NO180234B (no) 1996-12-02
NO180234C NO180234C (no) 1997-03-12

Family

ID=25374087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO931655A NO180234C (no) 1992-05-07 1993-05-06 Immunogent konjugat for behandling av septisk sjokk, forbindelser samt kovalent konjugat mellom D-glukosamin-disakkarid og et bærerprotein

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0570682B1 (no)
JP (1) JPH0641200A (no)
KR (1) KR930023369A (no)
AT (1) ATE155790T1 (no)
AU (1) AU664609B2 (no)
CA (1) CA2095588A1 (no)
DE (1) DE69312391T2 (no)
DK (1) DK0570682T3 (no)
ES (1) ES2104984T3 (no)
FI (1) FI932053A (no)
GR (1) GR3024706T3 (no)
IL (1) IL105605A0 (no)
NO (1) NO180234C (no)
SG (1) SG47582A1 (no)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008214256A (ja) * 2007-03-02 2008-09-18 Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd 双頭型配糖化合物の製造方法及び双頭型配糖化合物並びに該双頭型配糖化合物を含有する糖鎖認識タンパク質結合剤
WO2010025542A1 (en) * 2008-09-05 2010-03-11 National Research Council Of Canada Lps based vaccines
CN114712383B (zh) * 2016-03-30 2024-09-24 阿尤维斯研究有限公司 新组合物和治疗方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1187753B (it) * 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
AU651319B2 (en) * 1989-07-27 1994-07-21 Univax Biologics Incorporated Lipid A analog/immunogenic carrier conjugates and the use thereof as vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
KR930023369A (ko) 1993-12-18
AU3841993A (en) 1993-11-11
EP0570682B1 (en) 1997-07-23
EP0570682A1 (en) 1993-11-24
NO931655L (no) 1993-11-08
DE69312391T2 (de) 1997-12-11
SG47582A1 (en) 1998-04-17
CA2095588A1 (en) 1993-11-08
ES2104984T3 (es) 1997-10-16
FI932053A0 (fi) 1993-05-06
NO931655D0 (no) 1993-05-06
GR3024706T3 (en) 1997-12-31
NO180234C (no) 1997-03-12
FI932053A (fi) 1993-11-08
IL105605A0 (en) 1993-09-22
DE69312391D1 (de) 1997-08-28
DK0570682T3 (da) 1998-02-16
JPH0641200A (ja) 1994-02-15
ATE155790T1 (de) 1997-08-15
AU664609B2 (en) 1995-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3717511B2 (ja) サポニン−抗原複合物とその用途
JP3027452B2 (ja) 改良されたオリゴ糖結合体ワクチン
KR100704826B1 (ko) Ｎ-아크릴로일화된 폴리사카라이드를 사용하여 제조된백신으로서 사용하기에 적합한 면역원성β-프로피온아미도-결합 폴리사카라이드 단백질 컨쥬게이트
US11191822B2 (en) Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US20140341909A1 (en) Conjugation of biomolecules using diels-alder cycloaddition
US20140170151A1 (en) Synthetic Oligosaccharides for Staphylococcus Vaccine
US11420993B2 (en) Semi-synthetic meningococcal conjugate vaccine
US10500262B2 (en) Synthetic antigen constructs against Campylobacter jejuni
AU651319B2 (en) Lipid A analog/immunogenic carrier conjugates and the use thereof as vaccines
US5952454A (en) Linking compounds useful for coupling carbohydrates to amine-containing carriers
EP0570682B1 (en) Synthetic lipid A glycoconjugate antigens for use in vaccines
KR100818163B1 (ko) 리보즈-리비톨-인산염의 올리고당 유도체 및 이를포함하는 백신
EP3269385A1 (en) Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP1000076A1 (en) HEXADECASACCHARIDE-PROTEIN CONJUGATE VACCINE FOR $i(SHIGELLA DYSENTERIAE) TYPE 1
WO1992016230A1 (en) Lipid a analog/immunogenic carrier conjugates, the use thereof as vaccines and polyvalent hyperimmune gammaglobulins
CN118420796A (zh) 空肠弯曲杆菌cg8486荚膜寡糖及其糖蛋白缀合物的合成方法和应用
Nishat Syntheses and immunological evaluation of zwitterionic polysaccharide (PS A1) based vaccines
Chakkumkal et al. Vaccines against Streptococcus pneumoniae serotype 5
Dmitriev et al. Glycopeptidolipids—a new class of artificial antigens with carbohydrate determinants. Synthesis of artificial antigen with type-specific oligosaccharide hapten from Neisseria meningitidis group B