NO178743B - Fremgangsmåte og emballeringsmateriale til regulering av veksten av mikroorganismer i et komplekst medium omfattende væske - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til regulering av veksten av mikroorganismer i emballert materiale i form av et komplekst medium omfattende væske, hvor materialet bringes i berøring med et stort sett uoppløselig, immobilisert, veksthindrende stoff på en overflate av et emballeringsmateriale, idet det nevnte stoff har en slik sammensetning at det er aktivt overfor det emballerte materiale. Oppfinnelsen angår også et emballeringsmateriale som kan utføre reguleringen.

Eksempler på den skadelige virkning av mikroorganismer i industrien, helsevesenet og personlig pleie samt jordbruket er tallrike.

Ødeleggelse av matvarer oppstår vanligvis som et resultat av virkningen av mikroorganismer, enten bakterier, sopp eller begge deler, på matvarekomponenter. Prosessutvikling har innbefattet behandling av melk ved ultrahøy temperatur (UHT) som kan gi et produkt med en lagringstid på flere måneder uten kjøling. Denne prosess baserer seg imidlertid på behandling med høyere temperaturer (over 13 0°C) enn pasteurisering og fører til betydelige endringer i de organoleptiske egenskaper av behandlet melk. Mange forbrukere klager over en "kokt" smak på melk som er UHT-behandlet. De klager også på mindre frisk smak på fruktsafter som er varmebehandlet ved høyere temperaturer.

Det meste av ødeleggelsen av emballerte produkter oppstår pga. mikroorganismer som innføres etter varmebehandlingen.

Idag blir matvareprodukter håndtert i en rekke trinn fra innhøstingen av råmaterialene inntil de pakkes eller bearbeides til produkter. I mange land er den hygieniske standard innenfor matvareindustrien lav. Det kan derfor være fordel å koble et system til hindring av mikrobiell vekst inn i bearbeidings-kjeden ved en rekke punkter av denne for å sikre en høy kvalitet av de ferdige produkter.

Det ville være ønskelig å utvikle en generell metode for regulering av mikrobiell vekst og/eller metabolisme i emballerte matvarer. Ønskelige trekk ved en slik fremgangsmåte ville være å unngå tilsetningstrinn som vesentlig endrer beskaffenheten av matvaren, og gjøre reguleringsmetoden til en aktiv egenskap av matvarens emballeringsmateriale.

Det er kjent at visse proteiner kan binde mikroorganismer såsom bakterier.

Internasjonal patentsøknad med publikasjonsnummer WO82/04264 angir f.eks. en fremgangsmåte til hurtig bestemmelse av biokjemiske data for mikroorganismer, hvor disse bindes til et absorbsjonsmiddel, vanligvis en bærer i form av gel, som er forsynt med antistoffer svarende til mikroorganismene, og et næringsmedium tilsettes for å starte cellens metabolisme. Fremgangsmåten kan også anvendes til bestemmelse av konsentrasjonen av biokjemiske stoffer som virker inn på cellens metabolisme, f.eks. vitaminer og antibiotika.

Som et annet eksempel er bindingsegenskapene av lektiner angitt i detalj i artikkelen "Lectins as Molecules and Tools" av Halina Lis og Nathan Sharon i Ann.Rev.Biochem. 1986, nr. 55,

pp 35-67.

Ingen industrielt gjennomførbar metode som kan anvendes til fjerning eller hindring av mikroorganismer i matvarer, er imidlertid angitt i noen av disse dokumenter.

Det er også kjent at visse proteiner kan ødelegge mikroorganismer såsom sporer.

For eksempel er bruken av nisin som et mikrobiocid tilsetningsstoff i bearbeidede matvarer angitt i en artikkel av K.C. Eapen et al. i Journal of the Association of Food Scientists & Technologists, India, Vol. 20 nr. 5, sept./okt. 1983, pp 231-240.

Bruken av et slikt tilsetningsstoff i bearbeidede matvarer er imidlertid omstridt, og fabrikantene unngår en slik bruk så

sant det med rimelighet er mulig.

En rekke immoboliserte kvaternære ammoniumsalter har også vist seg å ha antimikrobiell virkning, og særlig 3-trimetoksy-silylpropyloktadecyl-dimetyiammoniumklorid har vært i utstrakt bruk i tekstilindustrien. Endo et al, Applied and Environmental Microbiology, Sept. 1987, pp 2050-2055 har for første gang antydet at et tertiært metylamin som er kovalent bundet til polystyrénfiber (TAF), er antimikrobielt i en bufferoppløsning. Måten som denne tertiæraminfiber virker på, synes å innbefatte en binding av mikrobielle celler til fiberoverflaten fulgt av en samvirkning mellom tertiæramin-gruppene og cellene, hvilket gir skade på cellemembranen ved en ukjent mekanisme, og til slutt cellelyse.

Skjønt den opprinnelige observasjon av Endo et al. av at TAF er antimikrobiell, tyder på at andre immobiliserte tertiæramin-overflater kan være antimikrobielle i en enkel saltoppløsning, indikerer den ikke at en slik antimikrobiell overflate også vil være aktiv i et komplekst medium såsom melk eller fruktsaft. Den antimikrobielle aktivitet av immobiliserte kvaternære ammoniumsalter, som er ganske høy i vann eller enkle salt-oppløsninger, vil f.eks. blokkeres eller forminskes ved utsettelse for en rekke forskjellige komplekse media. Med uttrykket "komplekst medium" slik det her er brukt, skal forstås et hvilket som helst medium som kan understøtte veksten av mikroorganismer, og som har de følgende egenskaper: de karbon- og nitrogenkilder som foreligger for vekst, er ikke bare enkle karbohydrater og aminosyrer, men er en blanding av forbindelser som f.éks. karbohydrater, polysakkarider, proteiner, peptider, lipider, organiske syrer, vitaminer og kofak-torer som foreligger som eller fås fra næringsmiddelrike, udefinerte komposisjoner, f.eks. plante- og dyreproduserte fluider, plante- og dyrevevsekstrakter og vevshydrolysater.

Det er også kjent at man som et alternativ til å inaktivere mikroorganismer ved varme eller annen vanlig behandling, kan oppnå inhibering og/eller inaktivering av organismene ved begrensning av tilførselen av essensielle vekstfaktorer. Essensielle vekstfaktorer kan være komposisjoner såsom spormineraler, vitaminer, organiske syrer, sukkere eller gasser (f.eks. oksygen). Hvilke av disse faktorer som er essensielle, vil avhenge av typen av mikroorganisme.

En faktor som de fleste, om ikke alle, mikroorganismer krever fra omgivelsene, er grunnstoffet jern. Jern er nødvendig som en kofaktor i mange enzymsystemer som cellene benytter for metabolske prosesser, samtidig som det er helt essensielt for de fleste mikrobielle ribonukleotidreduktaser.

US-PS 4 530 963 og 4 585 559 (DeVoe et al) angir en fremgangsmåte til inhibering av mikrobiell vekst i et flytende medium inneholdende ferrijern ved at mediet bringes i berøring med en siderofore som er kovalent bundet til en uoppløselig bærer. DeVoe et al. angir bruken av sideroforer såsom deferri-oksamin B som ikke er spesielt effektive for begrensning av mikrobiell vekst, da de sideroforer som anvendes, har en kinetisk utvekslingshastighet for jern som fører til at bundet jern senere frigjøres fra sideroforen inn i det medium som behandles.

I væsker med lav pH-verdi og reduserende miljøer, f.eks. fruktsafter, vil nesten alt jern foreligge i ferroformen.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der skaffet en fremgangsmåte til regulering av veksten av mikroorganismer i et emballert materiale i form av et komplekst medium omfattende væske, hvor materialet bringes i berøring med et stort sett uoppløselig, immobilisert, veksthindrende stoff på en overflate av et emballeringsmateriale, idet det nevnte stoff har en slik sammensetning at det er aktivt overfor det emballerte materiale, karakterisert ved at der som veksthindrende aktivt stoff velges et som ikke er et enzym, og hvis aktivitet ikke i vesentlig grad hindres av noen av bestanddelene i det emballerte materiale, og at man frembringer en relativ bevegelse mellom det emballerte materiale og det aktive stoff for å

fremme aktiviteten.

I henhold til en annen side ved oppfinnelsen er der skaffet et emballeringsmateriale som har et stort sett uoppløselig, immobilisert veksthindrende stoff på en overflate som er beregnet på å komme i berøring med et annet materiale i form av et komplekst medium omfattende en væske, idet det nevnte stoff er en komposisjon som er aktiv overfor det annet materiale med hensyn til å hindre veksten av mikroorganismer i dette, karakterisert ved at det veksthindrende, aktive stoff, som ikke er et enzym, har en aktivitet som ikke er tilbøyelig til å bli vesentlig hindret av noen av bestanddelene i det annet materiale.

Det eller de aktive stoffer hverken utgjør eller blir noe vesentlig tilsetningsstoff til materialet, fordi de immobiliseres på en overflate av emballeringsmaterialet.

Det eller de aktive stoffer kan tjene til å regulere, hindre og/eller fjerne celler såsom mikroorganismer i materialer, særlig komplekse medier såsom flytende eller faste matvarer.

Det aktive stoff eller hvert av de aktive stoffer er med fordel en uorganisk eller organisk komposisjon som ved binding til overflaten beholder en affinitet for mikroorganismer for derved å binde og/eller ødelegge mikroorganismene.

Det eller de aktive stoffer omfatter fortrinnsvis et bindingsstoff som har en høy bindingsaffinitet for spesielle bestanddeler i det emballerte materiale for derved å binde disse, og en lav bindingsaffinitet for slike andre bestanddeler i det emballerte materiale som er tilbøyelige til å hindre bindingen av de spesielle bestanddeler.

Når bindingsstoffet har en høy bindingsaffinitet, kan stoffet være en bindingspolymer, f.eks. et lektin, et antistoff, et polysakkarid eller et enzym (såsom et lysozym). Bindingspolymeren har fortrinnsvis en spesifikk affinitet for et glykokonjugat eller polysakkarid og er regenererbar ved vasking med konkurrerende sukker. Et enzym, fortrinnsvis lytisk enzym, kan utgjøre eller være knyttet til bindingspolymeren. De nevnte celler kan være fra gruppen bestående av somatiske celler, vevsceller og røde blodceller eller kan være bakterier og sopp.

Stoffet eller stoffene kan omfatte et stoff i form av en aminholdig forbindelse som kan påføre biologiske celler i det nevnte materiale tilstrekkelig skade til å hindre deres vekst. Forbindelsen kan ha en bindingsaffinitet for cellene og kan være et tertiæramin eller et kvaternært ammoniumsalt. Forbindelsen kan spesielt omfatte gruppen dimetylaminopropyl, dimetylaminobutyl eller dietylaminopropyl.

I tilfeller hvor bindingsstoffet har en bindingsaffinitet for den eller de nevnte vekstfaktorer, skaffer bindingskomposisjonen en bindingskonstant og en kinetisk stabilitet for bindingen av vekstfaktoren eller -faktorene som er tilstrekkelig til at komposisjonen med hell kan konkurrere med de nevnte celler for vekstfaktoren eller -faktorene. Komposisjonen kan ha en affinitet for i det minste ett spormetall, f.eks. ferrijern eller ferrojern, som utgjør vekstfaktoren eller -faktorene. For ferrijern kan komposisjonen være deferriferrikrom A, som har en bindingskonstant for ferrijern på minst IO<30> l/mol og en kapasitet for dannelse av et kinetisk stabilt kompleks med ferrijern som er minst 10 ganger mer stabilt enn et sådant kompleks med ferroksamin B. For ferrojern kan komposisjonen være pyrimin.

De aktive stoffer kan foreligge ved hver sine soner av de nevnte overflatepartier eller de kan være blandet med hverandre over de nevnte overflatepartier, dersom stoffene er forenlige med hverandre.

Emballeringsmaterialet kan være i form av et banemateriale eller en beholder.

I en spesiell anvendelse av det ovenfor angitte prinsipp er der inne i en lagrings- eller distribusjonsbeholder skaffet overflater belagt med det eller de aktive stoffer. Det eller de aktive stoffer kan immobiliseres på en rekke forskjellige overflater innbefattet polymerharpikser eller kopolymerer såsom polystyren, polyeten, polypropen, polyamider, polystyren/- akrylnitril og lignende, kartong som inneholder eller ikke inneholder en polymer, eller glass. Typiske matvarebeholdere omfatter en polymer eller et metall eller kartong belagt med en polymer såsom polyeten. Matvarebeholdere av papp er typisk belagt med eller impregnert med en polymer såsom polyeten.

God kontakt mellom flytende materiale og det eller de aktive stoffer er skaffet ved den relative bevegelse mellom væsken og den overflate som er belagt med det eller de aktive stoffer i en distribusjonsbeholder som et resultat av normal håndtering av distribusjonsbeholderen. Alternativt er det eller de aktive stoffer bundet til overflaten av en innretning som er adskilt fra beholderen som skaffer den intime berøring med det flytende produkt.

Bindingsstoffet kan foreligge i kombinasjon med et biocid middel.

På denne måte kan mikroorganismer såsom bakterier i materialet reguleres ved immobilisering av mikroorganismene. Det blir derfor forholdsvis enkelt å separere mikroorganismene fra materialet. Når mikroorganismene er immobilisert, kan de utsettes for mikrobiocide forbindelser.

Fremgangsmåten medfører at organiske bindingsforbindelser, f.eks. bindingspolymerer, bundet til en uoppløselig bærer kan benyttes som et middel til immobilisering av bakterieceller og fjerning av cellene fra en flytende fase. Bindingspolymeren er fortrinnsvis et protein, f.eks. lektin, antistoff eller enzym eller et polysakkarid som har en spesifikk affinitet for mikroorganismer. Bindingen av polymeren til den uoppløselige bærer kan være enten kovalent ved anvendelse av et hvilket som helst antall passende kjemiske koblingsmetoder, eller ikke-kovalent, idet man drar fordel av den hydrofobe beskaffenhet av polymeren for å fremme passiv absorpsjon til et materiales kontaktoverflate. Når de riktige polymerer er blitt identifisert, kan denne teknikk anvendes direkte til å fjerne bakterier fra flytende materialer såsom melk i store kvanta eller til å begrense eller isolere bakteriene på en fast overflate ved at de bindes til denne.

Eksempler på proteiner som ødelegger eller inhiberer bakterieceller, og som kan anvendes i samband med bindingsforbindelsene for å regulere mikrobiell vekst er lytiske enzymer, såsom lysozym eller lysostafin og baktericide oksidative enzymer såsom laktoperoksidase eller myeloperoksidase.

På denne måte blir det mulig å hindre vekst av biologiske celler i komplekse media, f.eks. flytende matvarer såsom melk eller fruktsaft, faste matvarer såsom kjøtt eller fisk eller kontaminert blod eller serum, idet man reduserer avhengigheten av varme eller annen vanlig behandling.

Dette er basert på den oppdagelse at visse aminholdige forbindelser som oppviser antimikrobiell aktivitet i enkle media såsom bufferoppløsninger, også oppviser antimikrobiell aktivitet i komplekse media såsom matvarer. Nærmere bestemt er det funnet at visse tertiæraminforbindelser oppviser antimikrobiell aktivitet i komplekse media. Denne oppdagelse er overraskende, da det ikke tidligere er blitt identifisert tertiæraminer som oppviser antimikrobiell aktivitet både i enkle media såsom bufferoppløsninger og i komplekse media såsom matvarer.

Således gir bindingen mellom den foreliggende bindingskomposisjon og vekstfaktoren eller -faktorene et stabilt kompleks hvor ingen av reaktantene som et resultat av affiniteten i vesentlig grad blir nedbrutt eller forringet i løpet av rimelig tid, dvs. at vekstfaktoren eller -faktorene danner et stort sett uoppløselig kompleks med bindingskomposisjonen. Ved bruk av en immobilisert syntetisk ferrochelator med tilstrekkelig styrke til med hell å konkurrere med mikroorganismene for ferrojern, kan f.eks. veksten av mikroorganismer effektivt reguleres.

For at oppfinnelsen klarere skal forstås og lettere kunne utføres skal tre utførelsesformer nå beskrives, alle under henvisning til den ledsagende skjematiske tegning, som viser et vertikalsnitt gjennom en plastbelagt pappbeholder som anvendes til emballering av flytende matvarer.

Tegningen viser en beholder 8 av den type som er beskrevet i US-PS 4 211 357, men med ett eller flere aktive stoffer bundet til sine innvendige overflater 10, 12, 14 og 16. I tilfellet av en rekke aktive stoffer kan disse enten være bundet til hver sine soner (som kan gå over i hverandre) av overflatene, eller de kan være blandet sammen (dersom de er forenlige) og blandingen bundet til overflaten. Stoffet eller stoffene kan også være bundet til den innvendige bunnflate (ikke vist) av beholderen 8. Beholderen 8 omfatter en toppforsegling 18 som lukker et tak 20 slik at der dannes et åpent rom 21 og den flytende matvare 22 forsegles mot den utvendige atmosfære. Stoffet eller stoffene som er bundet til de innvendige overflater 10, 12, 14 og 16 av beholderen 8, er aktive overfor den flytende matvare 22. I et annet eksempel er bare de innvendige overflater 10 og 12 av taket 2 0 belagt med stoffet eller stoffene, men disse indre overflater 10 og 12 kommer i berøring med væsken 2 2 ved normal håndtering av beholderen 8 eller som følge av kontrollert rysting av beholderen 8 og væsken 22, eller ved at beholderen 8 lagres eller transporteres med taket 2 0 vendende ned.

UTFØRELSESFORM I

Denne utførelsesform skal beskrives med spesiell henvisning til immobilisering av bakterier fra matvarer såsom melk og fruktbaserte drikker, herunder fruktdrikker og nektarer. Det skal imidlertid forstås at den foreliggende utførelsesform generelt er nyttig til immobilisering av bakterier i et komplekst medium omfattende væske.

Den foreliggende utførelsesform anvender en matriks eller et substrat som en eller flere spesifikke bindingspolymerer er blitt bundet til, enten kovalent eller passivt. Eksempler på slike matrikser omfatter polymerer såsom polyeten eller polystyren og glass- og cellulosebaserte komposisjoner som bindingspolymeren er blitt bundet til ved passiv absorpsjon eller ved kovalent binding. Den overflate som er belagt med bindingspolymer, kan anbringes i berøring med et matvareprodukt, f.eks. et flytende produkt såsom melk, som en del av det endelige emballeringsmateriale. Dette tjener til å fjerne de kontaminerende bakterier ved absorpsjon eller sekvestrasjon til den faste fase med det endelige resultat at det forlenger lagringstiden for det pakkede produkt og/eller eliminerer uønskede organismer.

Hvis emballeringsmaterialet er en distribusjonsbeholder 8, blir god kontakt mellom det flytende produkt 22 og bindingspolymeren som er bundet til matriksen, skaffet ved den relative bevegelse mellom produktet 22 og den med bindingspolymer belagte overflate (10, 12, 14, 16) i beholderen 8 som et resultat av normal håndtering av beholderen. Separasjon av bakteriene oppnås når det flytende materiale 22 helles ut av beholderen 8, idet bakteriene forblir bundet til den indre overflate (10, 12, 14, 16) av den tømte beholder.

Bindingspolymerer er polymerer såsom lektiner, polysakkarider, antistoffer eller lysozym. Bindingen formidles ved spesifikk interaksjon mellom et molekyl som er blottlagt på bakteriecel-lens overflate, og bindingspolymeren.

Arten av immobilisering av bindingspolymerene på en fast bærer kan være enten kovalent eller ikke-kovalent. Det viktige trekk ved denne interaksjon er at bindingspolymerene forblir i fast binding og ikke frigjøres i løpet av bakteriebindingstrinnet. Kovalent binding av bindingspolymerene kan oppnås ved en rekke forskjellige teknikker som er velkjent i faget.

Som et alternativ til kovalent immobilisering kan det være ønskelig under visse omstendigheter å binde bindingspolymerene ikke-kovalent til en materialkontaktoverflate ved hydrofob interaksjon. En vandig oppløsning av en bindingspolymer inkuberes i berøring med materialkontaktflaten som proteinet skal bindes til. Dette fører til den tid-, temperatur- og konsentrasjonsavhengige dannelse av et molekylært lag av bindingspolymer på den hydrofobe materialkontaktflate ved en passiv absorpsjonsprosess.

Avhengig av de mikroorganismer som foreligger, og parametrene i forbindelse med anvendelsen kan ekstraksjonsprosessen enten være selektiv for å fjerne en spesiell uønsket art av mikroorganismer eller ikke-selektiv i den betydning at de fleste eller alle kontaminerende mikroorganismer fjernes.

De bindingspolymerer som er blitt utprøvet i den foreliggende utførelsesform, har stor kapasitet for binding til bakterier, enten spesifikt til visse typer bakterier eller mer ikke-spesifikt til flere typer. Når det gjelder lektiner som bindingspolymerer, blir bindingen■stanset og reversert ved tilsetning av oppløsninger av konkurrerende sukker, og derfor kan overflater belagt med bindingspolymer "vaskes" rene på denne måte.

Visse faste matvarer såsom fisk og kjøtt nedbrytes ved bakteriekontaminering og spredning av kontamineringen fra overflaten. Det ligger innenfor området for den foreliggende utførelsesform å anvende det samme prinsipp for oppnåelse av øket lagringstid for slike produkter ved at de faste matvarer omgis med en væske og en folie, eller en folie alene, idet bindingspolymeren er bundet til folien.

I beholderen 8 på tegningen virker en bindingspolymer på innvendige overflater på beholderen 8 slik at den binder og immobiliserer mikroorganismer i væsken 22. Om ønskelig kan et aktivt stoff- som blokkerer metabolismen av mikroorganismen, også være bundet til noen av eller alle de innvendige overflater av beholderen 8.

Denne utførelsesform skal nå beskrives nærmere under henvisning til de følgende ikke-begrensende eksempler.

Eksempel 1

Betingelser ble evaluert for binding av bindingspolymerer til materialkontaktflater ved passiv absorpsjon. Gode resultater ble oppnådd for en rekke polymerer, f.eks. lektinene fra Dolichos biflorus og Vicia villosa. Andre lektiner herunder Concanavalin A ga lignende resultater, hvilket tyder på at dette er en vanlig egenskap for lektiner. Immunglobulin-molekyler har også lignende egenskaper.

Lektinene ble merket radioaktivt, og utgangsoppløsninger av disse ble fremstilt i en buffer. Disse ble deretter seriefor-tynnet og porsjoner anbragt flekkvis på en overflate av enten polystyren- eller polyeten og inkubert i 1 h ved 37°C fulgt av vasking i buffer. Polyetenoverflaten i disse undersøkelser var vanlig beholdermateriale for melk bestående av et polyetenark belagt på en papplate.

Resultatene viste at bindingen nærmet seg metning ved 5-10 ng/mm<2> avhengig av det lektin som ble testet. Fra dette trakk man den konklusjon at lektiner binder seg til hydrofobe plast-overflater med den øvre grense for binding bestemt av paknings-tettheten av de hydratiserte molekyler på overflaten.

Eksempel 2

Når bindingspolymerer ble passivt adsorbert på en polymeroverflate (se eksempel 1) og deretter utsatt for en suspensjon av vaskede humane røde blodlegemer (RBC) i buffer, fant der sted en binding av de røde blodceller til det immobiliserte protein.

Etter en 3 0 min inkubasjon av polymer med røde blodceller ble overflaten av den behandlede polymer ved mikroskopisk under-søkelse vist å være et sammenflytende teppe av celler med de fleste bindingspolymerer som ble utprøvet.

Gode resultater ble oppnådd med en rekke forskjellige bindingspolymerer innbefattet Dolichos biflorus-lektin og Vicia villosa-lektin.

Eksempel 3

Tre representative melkeødeleggende bakterier som var blitt isolert fra pasteurisert melk i handelen, ble undersøkt med hensyn til sin evne til å binde seg til en rekke forskjellige bindingspolymerer som var passivt adsorbert på en polymeroverflate. De tre organismer var identifisert som Bacillus brevis, Enterobacter sp. og Pseudomonas sp. ved klassifiseringsmetoder som er velkjente i faget. Bindingspolymerer ble passivt adsorbert på en polymeroverflate på en måte lignende den som er beskrevet i de tidligere eksempler. Bakteriene ble suspendert i fosfatbuffret saltoppløsning, og suspensjoner av disse organismer ble deretter plassert i berøring med de behandlede polymeroverflater. Bindingen av bakteriene ble evaluert ved mikroskopisk undersøkelse. Resultatene av denne undersøkelse antydet at flere bindingspolymerer såsom lektiner fra Dolichos biflorus, Vicia villosa. Limulus polyphemus og Solanum tuberosum var virksomme mht. å binde typiske arter av disse forskjellige mikrobeklasser.

Eksempel 4

100.CFU/ml av Bacillus sp.-celler ble suspendert i tris-buffret saltoppløsning. og inkubert med en polymermatriks som bindingspolymerene var blitt kovalent koblet til. Antallet frie bakterier i suspensjon ble bestemt ved mikroskopisk evaluering av en porsjon av supernatantfluidet (etter bunnfelling av matriksen). På denne måte ble de immobiliserte bindingpoly-merers evne til å binde og fjerne mikrobekontamineringen påvist, og bakteriecellers affinitet til matrikser dekket med bindingspolymer ved forsøksbetingelsene fastlagt. Effektiviteten av bakteriefjerningen ved denne fremgangsmåte ved bruk av f.eks. Dolichos biflorus ble i noen tilfeller funnet å være nesten 100%.

Eksempel 5

En stamme av Saccaromvces ble anskaffet fra Pure-Pak, Inc., Walled Lake, MI, USA. Denne stamme var opprinnelig isolert fra tranebærsaft og var blitt funnet å vokse i og ødelegge en rekke forskjellige fruktsafter.

Cellene ble dyrket enten i eplesaft som var blitt steril-filtrert, eller i syntetisk medium anskaffet fra Difco.

Likeartede resultater ble oppnådd uansett vekstbetingelsene.

Lektinet fra Dolichos biflorus ble anskaffet fra Sigma Chemical Co. og immobilisert enten ved passiv adsorpsjon på en poly-styrenoverflate eller ved cyanogenbromid-kobling til agaroseperler.

Når Saccharomvces-celler kom i berøring med en overflate inneholdende det immobiliserte lektin, ble det funnet at cellene bandt seg hurtig og fast til overflaten.

For eksempel ble minst 90% av cellene i suspensjonen etter

1-2 h funnet å være bundet til de uoppløselige agaroséperler som bar det immobiliserte Dolichos biflorus-lektin.

Bindingen var meget stabil og var ikke vesentlig reversibel i 2 4 h. Celler som var bundet på denne måte, kunne lett fjernes fra saften enten ved bunnfelling av perlene og dekantering av supernatanten eller ved passasje over et makroporøst filter såsom glassull.

Eksempel 6

Solanum tuberosum-lektin ble bundet til en Petriplate av polystyren ved passiv adsorpsjon, og platen ble utsatt for melk som hadde fått tilsatt IO<6> celler pr. ml av enten Bacillus brevus eller Pseudomonas fluorescens. Etter inkubasjon i 30 min ble platene renset og undersøkt ved lysmikroskopi. I begge tilfeller ble binding av bakterier til den lektinbelagte overflate observert, men bindingsarealet kunne ses å være betydelig mindre enn det som ble observert å være dekket med blærer, som ble identifisert som melkefettkuler. Dette eksperiment viser at dette lektin, som kan binde melkødeleg-gende bakterier, også kan binde overflatekomponenter av membranene i melkefettkulene, og at den sistnevnte virkning forer til en reduksjon av teknikkens effektivitet. Denne reduksjon i effektiviteten utelukker bruken av dette lektin i melk.

Eksempel 7

En undersøkelse ble utført for å bestemme den optimale densitet av bindingspolymer på den uoppløselige bærermatriks. CNBr-aktiverte agaroseperler ble konjugert med lektin i forskjellige mengder på 1-50 mg/ml og utsatt for celler i 1 h. Effektiviteten av bindingen ble bestemt ved bedømmelse av antallet frie celler som var tilbake i oppløsningsfasen. Det ble funnet at maksimal binding av celler fant sted når.lektinmengden på perlene, var mellom 15 og 3 0 mg/ml. Bindingen under disse forhold var i overkant av 95%. Ingen ytterligere binding ble funnet ved mengder på inntil 50 mg/ml. En vesentlig reduksjon av bindingen ble observert med lektinmengder på mindre enn 10 mg/ml.

Eksempel 8

(Dette eksempel skal også betraktes som inkludert i utførelses-' -form II) .

Binding av Saccharomvces cervisiae til tertiæraminer ble vist ved to metoder. Ved den første ble kolonner (90x6 mm) pakket med perler av IRA-68 og IRA-94. Kolonnene ble ekvilibrert med Ringers-oppløsning av 1/4 styrke. 1 ml Ringers-oppløsning inneholdende S_;_ cerevisiae-celler (10e celler pr. ml) i suspensjon i ble tilført søylen og eluert med Ringers-oppløsning. Fraksjoner på 1 ml eluat ble tellet i et bakterie-tellekammer, og antallet eluerte celler ble beregnet. 45% av cellene ble retardert i både IRA-68 og IRA-94. Ved den annen metode, som er beregnet på direkte å vise binding i oppløsning, ble perler av IRA-68 ekvilibrert i Ringers-oppløsning og 250 mg perler plassert i et 10 ml reagensrør. 2 ml Rmgers-oppløsning inneholdende cerevisiae i suspensjon ble overført til røret. Reagensrøret ble inkubert vertikalt ved værelsetemperatur i 2 h, pH-verdien målt (5,4) og supernatanten helt av. Steril Ringers-oppløsning ble tilsatt to ganger for å vaske bort ikke-bundne celler. Binding av S_;_ cervisiae-celler til IRA-68-perler ble vist ved mikroskopisk undersøkelse.

Eksempel 9

Bindingsevnen av forskjellige mikroorganismer til andre utvalgte proteiner ble undersøkt. Lysozym, fibronektin og bovinserumalbumin (BSA) ble koblet kovalent til CNBr-aktiverte agaroseperler.

Sterk binding (mer enn 80% dekning) til lysozym ble vist for Pseudomonas fluorescens TP2, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Staphvlococcus xvlosus, mens Bacillus subtilis vegetative celler bandt i mindre grad. Ingen binding av Saccharomvces cervisiae, Escherichia coli, Serratia marcescens eller IL. subtilis-sporer ble påvist.

UTFØRELSESFORM II

Denne utførelsesform skal beskrives med spesiell henvisning til inhibering av mikrobevekst i matvarer som et komplekst medium, f.eks. melk og fruktbaserte drikker, innbefattet fruktdrikker og nektarer. Det skal imidlertid forstås at den foreliggende utførelsesform er nyttig for å hindre mikrobiell vekst i gassformede, flytende og faste faser generelt.

Denne utførelsesform anvender en matriks som en eller flere aminholdige forbindelser som hindrer mikrobevekst i komplekse medier, er blitt bundet til enten kovalent eller passivt. Eksempler på slike matrikser omfatter polymerer såsom polyeten eller polystyren og metall-, glass- og cellulosebaserte komposisjoner som forbindelsen er blitt bundet til ved passiv adsorpsjon eller ved kovalent binding. Den belagte overflate kan anbringes i berøring med et matvareprodukt, f.eks. et flytende produkt såsom melk, ved at det utgjer en del av det endelige emballeringsmateriale. Dette tjener til å ødelegge de kontaminerende bakterier.

De aminholdige forbindelser ifølge denne utførelsesform er de tertiære aminer, særlig oksiderte tertiære aminer, eller kvaternære ammoniumsalter, nærmere bestemt de som har den egenskap at de hindrer mikrobevekst i komplekse medier. Representative egnede aminholdige forbindelser av den først-nevnte klasse er de som har formelen:

hvor n er 1-6, særlig 1, 2, 3, 4 eller 6, og x er 1-18, særlig 1, 2, 4 eller 18. Den forbindelse ifølge formelen I hvor n er 3 og x er 1, er aktiv overfor Saccharomvces cerevisiae, og de forbindelser ifølge formelen I hvor n er 2 og x er 1, eller hvor n er 3 og x er 2, er aktive overfor E_j_ coli.

Representative for den annen klasse er forbindelser dannet ved partiell oksidasjon av tertiæraminer konjugert til polystyren. Et eksempel på dette er de forbindelser som dannes ved behandlingen av dimetylmetylamin konjugert til en styreh/- divinylbenzen-kopolymer (polystyren) med hydrogenperoksid. Mer generelt kan klassen av forbindelser som kan gjøres effektive ved behandling med hydrogenperoksid eller et tilsvarende oksidasjonsmiddel, representeres ved formelen:

Typisk vil disse forbindelser ha lav eller ingen antimikrobiell aktivitet i komplekse medier før oksidasjon. Forut for den foreliggende oppfinnelse var det blitt rapportert at tertiæraminer og kvaternære ammoniumsalter har antimikrobiell aktivitet i bufferoppløsninger eller vann. Før den foreliggende oppfinnelse er imidlertid ingen aminholdige forbindelser blitt rapportert å ha betydelig antimikrobiell aktivitet i komplekse medier.

En aminholdig forbindelse er nyttig i henhold til den foreliggende utførelsesform når den hindrer veksten av bakterier eller sopp i et komplekst medium i den følgende test. ^n bakterie tilsettes pasteuriset melk i en mengde på 10<1->10<3> celler pr. ml og inkuberes i 120-192 h ved en temperatur på 11°C. Den aminholdige forbindelse tilsettes melken i immobilisert form på den innvendige overflate av beholderen for melken før inkubasjon. Etter inkubasjon og minst 24 h etter tilsetning av den aminholdige forbindelse blir melken testet for nærvær av bakteriene ved fortynning og platetelling. Et bakterienivå på mindre enn IO<5> celler pr. ml er ansett som akseptabelt. Testen kan også utføres i en fruktsaft såsom appelsinsaft, eplesaft eller lignende. De mikroorganismer som anvendes i testen, kan være bakterier, gjær eller mugg. Den aminholdige forbindelse er bundet kovalent til en polymerryggrad gjennom en kobling såsom en aminkobling eller en fenylenkobling. Generelt vil konsentrasjonen av den immobiliserte aminholdige forbindelse være mellom 0,3 og 15,4 jzeq/cm<2>. Overskytende aminholdig forbindelse kan fjernes ved vasking etter en kort inkubasjonsperiode. Konsentrasjonen av den immobiliserte aminholdige forbindelse er tilstrekkelig til å bevirke betydelig inhibering av mikroorganismen i den væske som behandles.

Avhengig av de mikroorganismer som foreligger, og anvendelses-parametrene er inhiberingsprosessen enten selektiv overfor en spesiell uønsket mikroorganisme-art eller ikke-selektiv i den forstand at mesteparten eller alle kontaminerende mikroorganismer inhiberes. Dette kan oppnås ved inhibering av bakteriene som en komponent i selve væskebeholderen. Visse faste matvarer, såsom fisk og kjøtt nedbrytes ved bakteriell kontaminering og spredning av kontaminering fra overflaten. Det ligger innenfor omfanget av den foreliggende utførelsesform å anvende det samme prinsipp for oppnåelse av øket lagringstid eller holdbarhet for slike produkter ved at de faste matvarer omgis med en væske og en folie eller en folie alene, idet den aminholdige forbindelse er bundet til folien.

I en beholder 8 som vist på tegningen vil en aminholdig forbindelse belagt på innvendige overflater av- beholderen 8 ha den virkning at de binder og inhiberer mikroorganismer som vokser i væsken.

Denne utførelsesform vil nå bli beskrevet nærmere under henvisning til de følgende ikke-begrensende eksempler:

Eksempel ( i)

Den antimikrobielle aktivitet av en aminholdig overflate ble vist ved tilsetning av 100 mg "Amberlite" IRA-68-perler, parti nr. 66F-0148 (levert av. Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA) i reagensrør til 2 ml av en 50 mM tris-buffer (pH-verdi 7,5) podet med IO<5> celler pr. ml matødeleggende mikroorganismer såsom Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, eller Bacillus brevis. Disse perler er representative for polyakrylamidoverflater inneholdende N,N-dimetylaminopropyl-grupper konjugert til polymerens amidnitrogen. Rør ble rystet ved 22°C, og levedyktige celler som ble tilbake, ble målt ved platetelling. I løpet av 2 h i nærvær av den tertiære overflate hadde antallet levedyktige celler av Bacillus brevis sunket med mer enn én størrelsesorden og antallet levedyktige celler av Pseudomonas fluorescens og Escherichia coli sunket med mer enn fire størrelsesordener.

Eksempel ( ii)

Den antimikrobielle aktivitet av en annen aminooverflate ble vist ved tilsetning av 100 mg "Amberlite" IRA-94-perler, parti nr. 12 3F-0163 (levert av det ovenfor nevnte Sigma Chemical Co.) i reagensrør til 2 ml av en 50 mM tris-buffer (pH-verdi 7,5) podet med IO<5> celler pr. ml Psudomonas fluorescens, Escherichia coli eller Saccharomvces cerevisiae. Perleoverflaten er representativ for overflater inneholdende 4 meq/g av partielt oksidert dimetylmetylamin konjugert til en styren/divinyldiben-zen-kopolymer. Rørene ble rystet ved 22°C, og levedyktige celler som var tilbake, ble målt ved platetelling. Innen 2 h hadde antallet levedyktige celler i nærvær av tertiæramin-overflaten sunket med mer enn fire størrelsesordener for alle tre forsøksorganismer.

Eksempel ( iii)

En kartong med en aktiv antimikrobiell overflate vil øke lagringstiden for pasteurisert fruktsaft ved å hindre veksten av den mikroflora som foreligger. For å vise dette ble 100 mg av dimetylaminopropyl-polyakrylamid-perlene (IRA-68) tilført et reagensrør inneholdende 2 ml steril eplesaft. Rør ble podet med en Saccharomvces cerevisiae-kultur for å gi 10<3> celler pr. ml og inkubert ved 11°C. Nærværet av tertiæramin-overflaten inhiberte både veksthastigheten og det samlede celletall. Organoleptisk evaluering av testprøvene etter syv dager viste at sammenligningsprøvene var blitt ødelagt, mens prøvene med aminholdig overflate ikke var blitt det. Dette eksempel illustrerer den test som ble benyttet til å identifisere effektive aminholdige forbindelser i henhold til denne utførelsesform.

Eksempel f iv)

Dette eksempel viser en tertiæramin-overflate som har liten virkning når det gjelder å hindre veksten av Saccharomyces cerevisiae under de betingelser som er beskrevet i Eksempel (iii). 100 mg "Dowex" WGR-2-perler, parti nr. 83F-0120 (levert av det ovennevnte Sigma Chemical Co.) ble tilsatt 2 ml eplesaft som var blitt podet med S^. cerevisiae i en mengde på IO<3> celler pr. ml, og rystet ved 11°C. Disse perler er representative for overflater inneholdende dimetylmetylamin konjugert til en styren/divinylbenzen-kopolymer. Vekst ble målt ved platetelling, og bare en liten forskjell i antall levedyktige celler ble observert mellom rør inneholdende aminoverflaten og sammenligningsrør i løpet av en periode på 6 dager. I lignende undersøkelser utført i buffrede saltoppløsninger istedenfor et komplekst medium ble det vist at WGR-2-perler har antimikrobielle egenskaper i overensstemmelse med hva som ble funnet av Endo et al, hvilket viser at antimikrobiell aktivitet i et enkelt medium ikke samsvarer med slik aktivitet i komplekse medier.

Eksempel fv)

For å vise effektiviteten av dimetylaminopropyl-polyakrylamid-overflaten mht. å øke lagringstiden for pasteurisert melk ble det eksperiment som er beskrevet i eksempel (iii),, gjentatt med ikke-fettholdig tørrmelk som det komplekse medium, "Amberlite" IRA-68-perler som den aminholdige overflate og Pseudomonas fluorescens som forsøksorganismen. Nærværet av aminoverflaten reduserte i betydelig grad veksthastigheten av Pseudomonas fluorescens i dette medium.

Eksempel ( vi)

Dette eksempel viser nytten av en annen aminholdig overflate til regulering av mikrobiell vekst i et komplekst medium. 100 mg "Amberlite A-21"-perler bestående av partielt oksidert dimetylmetyalmin konjugert til en styren/divinylbenzen-kopolymer ble tilsatt 2 ml steril eplesaft. Den partielle oksidasjon av disse perler ble oppnådd ved forutgående behandling med hydrogenperoksid. Rørene ble inokulert med en Saccharomvces cerevisiae-kultur for å gi 10<2->10<3> celler pr. ml og inkubert ved enten 6°, 11° eller 25°C. I alle tilfeller ble veksten av cellene dramatisk hindret som følge av nærværet av disse overflater. Dessuten ble bederving av saften funnet å bli sterkt retardert i forhold til sammenligningsprøvene.

Eksempel ( vii)

Dette eksempel viser at en immobilisert kvaternær ammonium-forbindelse, tidligere kjent som en aktiv antimikrobiell overflate, er inaktiv i nærvær av et komplekst medium. En oppløsning av 3-trimetoksysilylpropyloktadecyl-dimetyl-ammoniumklorid (Sylgard, US-PS 4 259 103) ble fremstilt ved tilsetning til vann og anvendt til å belegge innsiden av et dyrkningsrør. Rørene ble fikk tilsatt enten en enkel buffer-oppløsning eller steril eplesaft, disse medier ble deretter podet med IO<5> celler pr. ml av S_j_ cerevisiae når det gjaldt buffer og IO<3> celler pr. ml når det gjaldt eplesaft. Prøvene ble podet ved ll°C. På forskjellige tidspunkter etter poding ble prøver tatt ut og levedyktige kolonidannende enheter bestemt ved platetelling. Antifungal aktivitet ble vist ved at gjærcellene i en bufferoppløsning ble drept hurtig (innen 8 h). Denne observasjon var i overensstemmelse med det som tidligere er kjent. I motsetning til dette ble der imidlertid ikke observert noen reduksjon av cellelevedyktighet i prøver av eplesaft, og normal vekst ble observert over 5 dager i forhold til sammenligningsprøvene. Dette viste at den antimikrobielle virkning av dette middel var gått tapt i et komplekst medium.

Eksempel ( viii)

Antifungal aktivitet av den aminholdige overflate ble vist i et dyrkningsmedium for gjær (Bacto Malt Extract Broth, Difco).

250 mg "Amberlite" IRA-68 og IRA-94 ble plassert i reagensrør, og 5 ml vekstmedium inneholdende IO<3> celler pr. ml av Saccharomvces cerevisiae ble tilsatt hvert rør. Vekst i hhv. rør med perler og sammenligningsrør ble målt ved platetelling i 6 dager. Etter 6 dager hadde antallet S^. cerevisiae-celler i sammenligningsprøvene nådd IO<9> celler pr. ml, mens der ikke ble påvist noen vekst i hverken IRA-68- eller IRA-94-rørene. Antall celler i disse rør var mindre enn IO<3> etter 6 dagers inkubasjon.

Eksempel fix)

Binding av Saccharomyces cerevisiae til tertiæraminer ble vist ved to metoder. Ved den første ble kolonner (90 x 6 mm) pakket med "Amberlite" IRA-68- og IRA-94-perler. Kolonnene ble ekvilibrert med Ringers-oppløsning av 1/4 styrke. 1 ml Ringers-oppløsning inneholdende S^ cerevisiae-celler (IO<6> celler pr. ml) i suspensjon ble tilført kolonnen og eluert med Ringers-oppløsning. Eluatfraksjoner på 1 ml ble tellet i et bakterietellekammer, og antall celler som var eluert, ble beregnet. 45 % av cellene kunne ikke elueres hverken i IRA-68-eller IRA-94-kolonner med Ringers-oppløsning. Ved den annen metode, som er beregnet på å vise direkte binding i oppløsning, ble IRA-68-perler ekvilibrert i Ringers-oppløsning og 250 mg perler anbragt i et 10 ml reagensrør. 2 ml Ringers-oppløsning inneholdende S^ cerevisiae i suspensjon ble overført til røret. Reagensrøret ble inkubert vertikalt ved værelsetemperatur i 2 h, pH-verdien målt (5,4) og supernatanten dekantert. Steril Ringers-oppløsning ble tilsatt to ganger for å vaske bort ikke-bundne celler. Binding av S_j. cerevisiae-celler til IRA-68-perler ble vist ved mikroskopisk undersøkelse.

Eksempel ( x )

For å vise at den inhibitoriske virkning av de aminholdige overflater på Saccharomvces cerevisiae er rettet mot cellemembranen, ble S^. cerevisiae-celler suspendert i buffer (IO<5 >celler pr. ml) inneholdende 5 % sakkarose med eller uten 50 mg/ml "Amberlite" IRA-68. Prøver ble tatt, og deres platingseffektivitet på et medium inneholdende 0,01% natrium-dodecylsulfat (SDS) ble bestemt. SDS er et overflateaktivt middel og kan bryte ned biologiske membraner. Den konsentrasjon av SDS som ble anvendt (0,01%), er imidlertid lavere enn den dødelige konsentrasjon for S^. cerevisiae. Etter eksponering for IRA-68 i 70 h hadde cellene en 80 % lavere platingseffektivitet på 0,01% SDS-medium i forhold til medium uten.SDS. Prøver som ikke var utsatt for IRA-68, viste ingen forskjell med hensyn til platingseffektivitet, hvilket antydet at eksponering for IRA-68 gjorde S^. cerevisiae-celler følsomme for de membran-nedbrytende virkninger av SDS ved denne normalt ikke-dødelige konsentrasj on.

Eksempel fxi)

Ytterligere bevis på at eksponering for IRA-68 bryter ned membranintegriteten av Saccharomvces cerevisiae ble oppnådd ved farging av cellene med Trypan-blått. Farging med Trypan-blått indikerer levedyktighet av eukaryote celler ved en farge-eksklusjonsmekanisme. Celler som har en intakt cellemembran, tillater ikke fargen å komme inn i cellen og farges derfor ikke. Ikke-levedyktige eller skadede celler, som har en permeabel membran, tillater fargen å komme inn og farge dem blå. S_i. cerevisiae-celler ble suspendert i buffer (IO<5> celler pr. ml) inneholdende 5 % sakkarose med eller uten 50 mg/ml IRA-68. Etter 120 timers utsettelse for IRA-68 var mer enn 80 % av S_s_ cerevisiae-celiene farget blå, mens bare 2-3 % av sammenligningscellene som ikke var blitt utsatt for IRA-68, var farget.

UTFØRELSESFORM III

Den foreliggende utførelsesform skal her beskrives med spesiell henvisning til binding av jern i matvarer såsom melk og fruktbaserte drikker innbefattet fruktdrikker og nektarer. Det skal imidlertid forstås at den foreliggende utførelsesform er nyttig for binding av jern fra væskefaser generelt.

Fortrinnsvis anvender man en matriks som en jernbindingskomposisjon er blitt bundet til enten kovalent eller ikke-koValent. Eksempler på slike matrikser innbefatter polymerer såsom polyeten eller polystyren og glass- og cellulose-baserte komposisjoner som den jernbindende komposisjon er blitt bundet til ved passiv adsorpsjon eller ved kovalent binding. Overflaten som er belagt med den jernbindende komposisjon, kan anbringes i berøring med et matvareprodukt, f.eks. et flytende produkt såsom fruktsaft, som en del av emballeringsmaterialet. Dette tjener til å fjerne jernet som understøtter veksten av mikroorganismene, ved chelering til den faste fase, med det endelige resultat at lagringstiden for det pakkede produkt forlenges og/eller veksten av de uønskede eller patogene organismer reduseres eller hindres.

God kontakt mellom det flytende produkt i en beholder 8 og den jernbindende komposisjon som er bundet til matriksen i beholderen, skaffes ved relativ bevegelse mellom væsken 22 og bindingsoverflaten i beholderen. Separasjon av det bundne jern oppnås når det flytende materiale helles ut av beholderen, idet jernet blir tilbake bundet på den innvendige overflate av den

tømte beholders innvendige overflate.

Egnede jernbindingskomposisjoner innbefatter deferriferrikrom A, dipyridyl, pyrimin eller blandinger derav.

Arten av immobilisering av den jernbindende komposisjon til en fast bærer kan være enten kovalent eller ikke-kovalent. Den viktigste egenskap av denne samvirkning er at komposisjonen som er immobilisert på bæreren, skal forbli fast bundet og ikke frigjøres i løpet av jernbindingstrinnet. Kovalent binding av jernbindingskomposisjonen kan oppnås ved en rekke forskjellige teknikker som er velkjent i faget. I noen tilfeller kan det være ønskelig å innbefatte linkere eller avstandsarmer for å tillate at en jernbindende komposisjon har ytterligere bevegelsesfrihet og/eller eksponering overfor det flytende materiale. Disse kan innlemmes i løpet av immobiliseringstrin-net.

Som et alternativ til kovalent immobilisering kan det være ønskelig under visse omstendigheter å binde den jernbindende komposisjon ikke-kovalent til en materialkontaktflate ved hydrofob samvirkning. En vandig oppløsning av en jernbindende komposisjon inkuberes i berøring med den materialkontaktflate som den jernbindende komposisjon skal bindes til.

Jernbindende komposisjoner bundet til materialkontaktflater på denne måte er stabile, og de fremstilte substrater kan lagres enten i en bufferoppløsning eller tørkes uten tap av aktivitet. Konsentrasjonen av den immobiliserte jernbindende komposisjon er tilstrekkelig til å bevirke betydelig inhibering av mikroorganismene i-det flytende eller faste materiale som behandles.

Når jernholdige medier anbringes i berøring med en uoppløselig matriks omfattende jernbindingskomposisjonen koblet til et substrat, kan jernet overføres kvantitativt fra en fri til en bundet form hvor det ikke lenger er tilgjengelig for mikrobevekst. Denne kvantitative overføring finner sted så lenge der er overskytende bindingskapasitet pa den uoppløselige matriks i forhold til fritt jern og så lenge jernet ikke er kompleksert i en utilgjengelig form såsom heme.

Resultatet av denne overføring av jern til en uoppløselig form er at konsentrasjonen av fritt jern reduseres betydelig til under den nedre grense som er nødvendig for mikrobevekst. Således blir veksten av mikroorganismer som kontaminerer mediet, redusert ved berøring med den jernbindende matriks i forhold til den situasjon hvor mediet ikke er plassert i berøring med en slik overflate, og holdbarheten blir tilsvarende øket. Under disse betingelser er de eneste måter mikroorganismene kan overvinne inhiberingen på, å nedbryte den jernbindende matriks eller utvikle jernbindende midler (sideroforer) som har høyere bindingskonstanter enn matriksen. I disse tilfeller vil der fortsatt gå en betydelig tid før man observerer at veksten på nytt starter. Dette gjelder særlig i det sistnevnte tilfelle på grunn av den kinetiske stabilitet av de uoppløselige komplekser.

I en beholder 8 som vist på tegningen vil en jernbindende komposisjon som er bundet til de innvendige flater av beholderen 8, tjene til å binde og immobilisere jernet i den flytende matvare 22. Om ønskelig kan et bindingsprotein og/eller stoff som blokkerer metabolismen av mikroorganismen, også bindes til noen av eller alle de innvendige overflater av beholderen 8.

De følgende eksempler illustrerer igjen den foreliggende utførelsesform.

Eksempel I

Dette eksempel illustrerer immobiliseringen av en jernbindende komposisjon på glassperler.

Ferrikrom A ble renset direkte fra mediet Ustilaqo spheroqena ved rekrystallisasjon.

Denne jernchelator ble kovalent bundet til glass i den jernmet-tede form som beskytter jernbindingsdomenet. 40 mg av det rekrystalliserte ferrikrom A ble oppløst i 40 ml aceton inneholdende 0,4 ml pyrimid. Dette fikk så tilsatt 40 mg tosylklorid, og reaksjonsblandingen ble omrørt ved værelsetemperatur i 1 h. På dette tidspunkt ble 2 g aminopropylglass-perler med kontrollert porestørrelse tilsatt blandingen, og reaksjonen ble tillatt å fortsette i ytterligere 4 h. Det ble deretter iakttatt at det rødfargede ferrikrom A hovedsakelig var forbundet med glassperlene. Reaksjonsblandingen ble filtrert og vasket to ganger med aceton, to ganger med vann og til slutt ytterligere to ganger med aceton. De orange-røde perler ble tillatt å tørke.

Eksempel II

For å evaluere det immobiliserte ferrikrom A-produkt produsert ved fremgangsmåten ifølge eksempel I, ble ikke-spesifikk bakgrunn for reaktivitet med ubundet jern eliminert ved fremgangsmåten ifølge det foreliggende eksempel.

Ureagerte primære aminogrupper og ferrikrom A-glassperler ble blokkert ved reaksjon med eddiksyreanhydrid. 2 g ferrikrom A-glassperler ble suspendert i 10 ml av en 100:1 aceton/pyri-dinblanding. Til dette ble der satt 2,73 ml eddiksyreanhydrid, og reaksjonen ble inkubert i minst 1 h. Perlene ble vasket i aceton, fulgt av to vaskinger med vann og ytterligere to vaskinger med aceton. De derivatiserte perler ble tørket i vacuum.

Eksempel III

Dette eksempel viser fremgangsmåten til regenerering av en jernbindingskomposisjon inneholdende bundet jern.

Bundet jern ble fjernet fra det immobiliserte ferrikrom A ved suspensjon av 1 g ferrikrom A-glassperler i 5 ml vann og tilsetning av 0,25 ml av en 1 M KSCN og 5 mg natriumditionitt. Reaksjonsblandingen ble tillatt å stå i minst 1 h, og i løpet av dette tidsrom ble det observert at fargen gikk tapt fra glassperlene. Perlene som jernet var fjernet fra (deferriferrikrom A), ble deretter vasket to ganger med vann og to ganger med aceton. Deferriferrikrom A-glassperlene ble deretter tørket og sterilisert med 80 % etanol.

Eksempel IV

Dette eksempel viser vekstinhibering av bakterier ved fremgangsmåten ifølge denne utførelsesform.

En psykrotrop stamme av Pseudomonas fluorescens ble isolert fra bedervet melk. IO<3> CFU av disse celler ble podet inn i 5 ml porsjoner av et medium bestående av 6 g Na2HP04, 3 g KH2P04, 0,5 g NaCl, 1 g NH4C1, 2 g glukose, 0,002 M MgS04 og 0,0001 M CaCl2- Jernkonsentrasjonen av mediet ble bestemt til

1,2 //mol/1. På samme tid som cellene ble tilsatt, ble 10 mg av de DFFA-derivatiserte glassperler tilsatt noen av prøvene, mens eddiksyreanhydrid-blokkerte (capped) aminopropyl-glassperler ble tilsatt de andre. Prøvene ble inkubert ved 11 °C, og veksten ble evaluert ved bestemmelse av CFU pr. ml ved platetelling ved forskjellige tidspunkter. Resultatene viste at veksten av bakteriecellene ble betydelig inhibert ved tilsetning av den imobiliserte jernchelator. Vekst fant til slutt sted i disse prøver etter en lang forsinkelsesfase.

Eksempel V

Dette eksempel viser at desferrioksamin B ikke er egnet som en jernbindende komposisjon i den beskrevne fremgangsmåte.

Desferrioksamin B (Desferal ™, Ciba-Geigy) ble koblet til agaroseperler som var blitt modifisert med CNBr på kjent måte. Kovalent binding fant sted mellom den primære aminogruppe av desferal og agaroseperlene, og jernchelatoren beholdt sin jernbindingsevne som bestemt ved undersøkelser analoge med dem som er beskrevet i tidligere eksempler. En vekstundersøkelse i likhet med den som er beskrevet i eksempel IV, ble utført, bortsett fra at en ekvivalent mengde Desferalagarose ble tilsatt istedenfor DFFA-glassperler. Ingen vekstinhibering ble observert, selv ikke når et betydelig overskudd av jernbin-dingsmatriks ble tilsatt i forhold til det tilgjengelige jern. Bakteriene var således i stand til å oppta jern bundet til Desferalagarosen enten ved direkte eller indirekte konkur-ranse.

Eksempel VI

(Dette eksempel skal også anses å være inkludert i utførelses-form II).

Dette eksempel viser at tilstedeværelsen av tertiæraminer i et vekstmedium medfører at Saccharomvces nektes komponenter som er nødvendige for veksten.

IRA-94 og IRA-68 (Rohm & Haas) ble inkubert sammen med et komplekst medium inneholdende flere kombinasjoner av vekstfaktorer, idet mediet inneholdt følgende bestanddeler:

Etter 48 h eksponering av mediet for IRA-68 eller IRA-94 ble det behandlede medium podet med Saccharomvces-celler. Medium behandlet med IRA-94-perler understøttet ikke vekst, mens medium behandlet med IRA-68-perler viste vekst sammenlignbar med den i ikke-behandlet medium. Det medium som var behandlet med IRA-9 4, understøttet vekst av Saccharomyces når alle kombinasjoner av næringsmidler ble tilsatt igjen samtidig.

Den foreliggende fremgangsmåte har følgende fordeler:

A) De aktive stoffer bindes lett til matriksen enten passivt eller aktivt (kovalent) ved kjemisk behandling.

B) Matriksen kan være polymer, glass, rustfritt stål etc.

C) Bare ikke-giftige, matvareforenlige materialer anvendes. D) Migrering av de aktive stoffer og matriksmaterialene til materialet som behandles, er ubetydelig. E) De organoleptiske og næringsmessige kvaliteter av matvaren opprettholdes. F) Man oppnår aktive, affinitetsbaserte ekstraksjonssystemer for celler eller vekstfaktorer som etterlater andre bestanddeler intakte og upåvirkede.

G) Systemene er biologisk basert.

H) Spesifikke og ikke-spesifikke affiniteter er tilgjengelige

som i utførelsesformene I og II.

I) Regenerering av aktive stoffer er tilgjengelig for utførelsesformene I og III.

J) Man oppnår aktive, mikrobiologiske reguleringssystemer

for mikrobiologisk stabilisering etter fylling av beholdere.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte til regulering av veksten av mikroorganismer i et emballert materiale (22) i form av et komplekst medium omfattende væske, hvor materialet (22) bringes i berøring med et stort sett uoppløselig, immobilisert, veksthindrende stoff på en overflate (10, 12, 14, 16) av et emballeringsmateriale (8) , idet det nevnte stoff har en slik sammensetning at det er aktivt overfor det emballerte materiale (22), karakterisert ved at der som veksthindrende, aktivt stoff velges et som ikke er et enzym, og hvis aktivitet ikke i vesentlig grad hindres av noen av bestanddelene i det emballerte materiale (22), og at man frembringer en relativ bevegelse mellom det emballerte materiale (22) og det aktive stoff for å fremme aktiviteten.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det aktive stoff velges fra gruppen bestående av lektiner, polysakkarider, antistoffer, metallchelatorer og aminholdige forbindelser.

3. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at det aktive stoff omfatter et bindingsstoff som har en høy bindingsaffinitet for spesielle bestanddeler i det emballerte materiale (22) for derved å binde disse, og en lav bindingsaffinitet for slike andre bestanddeler i det emballerte materiale (22) som er tilbøyelige til å hindre bindingen av de spesielle bestanddeler.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at de spesielle bestanddeler er de nevnte mikroorganismer.

5. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at det aktive stoff omfatter en aminholdig forbindelse som er tilgjengelig for mikroorganismene i materialet (22) og kan påføre disse tilstrekkelig skade til å hindre deres vekst i det emballerte materiale (22).

6. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at det aktive stoff omfatter et bindingsstoff i form av en bindingskomposisjon som har affinitet til minst ett spormetall som utgjør en biologisk vekstfaktor for mikroorganismene i det emballerte materiale (22),'og skaffer en bindingskonstant og en kinetisk stabilitet for binding av det eller de nevnte spormetaller som er tilstrekkelige til at bindingskomposisjonen med hell kan konkurrere med mikroorganismene om spormetallene og holde på disse for således å begrense tilgjengeligheten av dem for mikroorganismene.

7. Emballeringsmateriale (8) som har et stort sett uopp-løselig, immobilisert veksthindrende stoff på en overflate (10,12,14,16) som er beregnet på å komme i berøring med et annet materiale (22) i form av et komplekst medium omfattende en væske, idet det nevnte stoff er en komposisjon som er aktiv overfor det annet materiale (22) med hensyn til å hindre veksten av mikroorganismer i dette, karakterisert ved at det veksthindrende, aktive stoff, som ikke er et enzym, har en aktivitet som ikke er tilbøyelig til å bli vesentlig hindret av noen av bestanddelene i det annet materiale (22).

8. Emballeringsmateriale som angitt i krav 7, karakterisert ved at de aktive stoffer er valgt fra gruppen bestående av lektiner, polysakkarider, antistoffer, metallchelatorer og aminholdige forbindelser.

9. Emballeringsmateriale (8) som angitt i krav 7 eller 8, karakterisert ved at det aktive stoff omfatter en aminholdig forbindelse, idet aminet er tilgjengelig for mikroorganismene i det annet materiale (22) og kan påføre disse tilstrekkelig skade til å hindre deres vekst i det annet materiale (22).

10. Emballeringsmateriale (8) som angitt i et av kravene 7-9, karakterisert ved at det nevnte aktive stoff omfatter et bindingsstoff i form av en bindingskomposisjon som har affinitet til minst ett spormetall som utgjør en biologisk vekstfaktor, og skaffer en bindingskonstant og en kinetisk stabilitet for binding av det eller de nevnte spormetaller som er tilstrekkelige til at bindingskomposisjonen med hell kan konkurrere med mikroorganismene om spormetallene og holde på disse for således å begrense tilgjengeligheten av dem for mikroorganismene.

11. Emballeringsmateriale som angitt i et av kravene 7-10, karakterisert ved at det på overflaten også har et biocid middel for inaktivering av de nevnte mikroorganismer.

12. Emballeringsmateriale som angitt i krav 11, karakterisert ved at det biocide middel er et lytisk enzym.