FI98879C - Menetelmä nesteen käsittävän pakatun tuotteen sisältämien mikro-organismien kasvun säätelemiseksi ja pakkausmateriaali - Google Patents

Description

98879

Menetelmä nesteen käsittävän pakatun tuotteen sisältämien mikro-organismien kasvun säätelemiseksi ja pakkausmateriaali 5 Tämä keksintö koskee menetelmää monimutkaisen eli monia aineosia sisältävän väliaineen muodossa olevan, nesteen käsittävän pakatun tuotteen sisältämien mikro-organismien kasvun säätelemiseksi, jossa menetelmässä tuote saatetaan kosketukseen pakkausmateriaalin pinnassa olevan, 10 olennaisilta osiltaan liukenemattoman, immobilisoidun, kasvua ehkäisevän aktiivisuuden omaavan aineen kanssa, jolla aineella on sellainen koostumus, että se on aktiivinen mainitun pakatun tuotteen suhteen. Keksintö koskee myös pakkausmateriaalia, jonka pinnalla pakkausmateriaali, 15 jonka pinnalla on käytännöllisesti katsoen liukenematon, immobilisoitu, kasvua ehkäisevä aine, jotta saataisiin kosketus kompleksisen väliaineen muodossa olevaan, nesteen käsittävään tuotteeseen, mainitun aineen ollessa yhdistelmä, joka on aktiivinen tuotteeseen nähden estäen tuottees-20 sa olevien mikro-organismien kasvu.

Tausta

Esimerkit mikro-organismien haitallisesta vaikutuksesta teollisuudessa, terveydenhoidossa, henkilökohtaisessa hygieniassa samoin kuin maataloudessa ovat lukuisia.

25 Elintarvikkeiden pilaantuminen on normaalisti seu rausta mikro-organismien, joko bakteerien tai sienten tai molempien, vaikutuksesta elintarvikkeen aineosiin. Alalla tapahtuneista kehitysaskeleista mainittakoon maidon lsku-kuumennuskäsittely (UHT-käsittely), jolla voidaan saada 30 aikaan tuote, jonka säilyvyys on muutamia kuukausia ilman kylmäsäilytystä. Tämä menetelmä perustuu kuitenkin käsittelyyn pastörointilämpötilaa korkeammissa lämpötiloissa (yli 130 °C) ja johtaa käsitellyn maidon organoleptisten ominaisuuksien merkittäviin muutoksiin. Monet kuluttajat 35 valittavat UHT-käsitellyn maidon olevan "keitetyn" makuis- 2 - 98879 ta. He valittavat myös korkeahkoissa lämpötiloissa käsiteltyjen hedelmämehujen olevan vähemmän tuoreen makuisia.

Suurin osa pakattujen tuotteiden pilaantumisista johtuu kuitenkin lämpökäsittelyn jälkeen tuotteisiin tul-5 leista mikro-organismeista.

Elintarviketuotteita käsitellään nykyisin sarjassa vaiheita raaka-aineiden korjuusta niiden pakkaamisen tai käsittelyyn tuotteiksi. Elintarviketeollisuuden hygieniataso on alhainen monissa maissa. Siksi saattaa olla edul-10 lista sijoittaa järjestelmä mikro-organismien kasvun estä miseksi useaan käsittelyketjun pisteeseen valmiiden tuotteiden korkean laadun takaamiseksi.

Olisi toivottavaa kehittää yleinen menetelmä mikro-organismien kasviin ja/tai metabolian säätelemiseksi 15 raaka-aineessa, käsittelyn aikana ja pakatuissa elintar vikkeissa. Tällaisen menetelmän toivottavia piirteitä olisivat vaiheiden lisäämisen välttäminen, niin ettei muuteta olennaisesti elintarvikkeen luonnetta, ja se, että sääte-lymenetelmästä tehdään elintarvikkeen pakkausmateriaalin 20 aktiivinen ominaisuus.

On tunnettua, että tietyt proteiinit voivat sitoa mikro-organismeja, kuten bakteereja.

Kansainvälisessä hakemus julkaisussa W082/04264 esitetään esimerkiksi menetelmä mikro-organismeja koskevien 25 biokemiallisten tietojen määrittämiseksi nopeasti, jossa menetelmässä ne sidotaan adsorboivalle aineelle, tavallisesti geelin muodossa olevalle kantajalle, joka on varustettu mikro-organismeja vastaavilla vasta-aineilla, ja lisätään ravintoalustaa solumetabolian käynnistämiseksi. 30 Tätä menetelmää voidaan käyttää myös solumetaboliaan vaikuttavien biokemiallisten aineiden, esimerkiksi vitamiinien ja antibioottien, pitoisuuden määrittämiseen.

Eräänä toisena esimerkkinä mainittakoon Hälinä Lisin ja Nathan Sharonin artikkeli "Lectins as Molecules 35 and Tools", Ann. Rev. Biochem. 55 (1986) 35 - 67, jossa li 98879 3 kuvataan yksityiskohtaisesti lektiinien sitoutumisominai-suuksia.

Kummassakaan julkaisussa ei kuitenkaan esitetä kaupallisesti käyttökelpoista menetelmää, joka olisi sovel-5 lettavissa elintarvikkeessa olevien mikro-organismien poistoon tai ehkäisyyn.

On myös tunnettua, että tietyt proteiinit voivat tuhota mikro-organismeja, kuten itiöitä.

Esimerkiksi nisiinin käyttöä mikrobisidisena lisä-10 aineena käsitellyissä elintarvikkeissa kuvataan K. C. Eapenin et ai. julkaisussa, The Journal of the Association of Food Scientists & Technologists, India, 20, nro 5, syys-lokakuu 1983, 231 - 240.

Tällaisen lisäaineen käyttö käsitellyissä elintar-15 vikkeissa on käymässä kuitenkin yhä kiistanalaisemmaksi, ja valmistajat välttävät tällaista käyttöä, kun se on kohtuudella mahdollista.

Useilla immobilisoiduilla kvaternaarisilla ammo-niumsuoloilla on myös osoitettu olevan mikro-organismien 20 vastainen vaikutus, ja erityisesti 3-trimetoksisilyylipro-pyylioktadekyylidimetyyliammoniumkloridia käytetään laajasti tekstiiliteollisuudessa. Endo et ai. [Applied and Environmental Microbiology, maaliskuu 1987, 2050 - 2055] ovat osoittaneet ensimmäistä kertaa, että polystyreenikui-25 tuun kovalenttisesti sidotulla tertiaarisella me tyyli amiinilla (TAF) on mikrobien vastainen vaikutus puskuriliuoksessa. Tämän tertiääristä amiinia sisältävän kuidun vaikutustapaan näyttää liittyvän mikrobisolujen sitoutuminen kuidun pintaan, mitä seuraa tertiaaristen amiiniryhmien ja 30 solujen välinen vuorovaikutus, joka saa aikaan tuntemattomalla mekanismilla tapahtuvan solukalvon vaurioitumisen ja lopulta solun hajoamisen.

Vaikka Endon et ai. alkuperäinen havainto, että TAF on mikrobien vastainen, viittaa siihen, että muut immobi-35 llsoitua tertiääristä amiinia sisältävät pinnat saattavat 98879 4 olla mikrobien vastaisia yksinkertaisessa suolaliuoksessa, se ei osoita, että tällainen mikrobien vastainen pinta olisi aktiivinen myös monimutkaisessa väliaineessa, kuten maidossa tai hedelmämehussa. Niinpä esimerkiksi immobili-5 soitujen kvaternaaristen ammoniumsuolojen mikrobien vastainen aktiivisuus, joka on sangen korkea vedessä tai yksinkertaisissa suolaliuoksissa, salpautuu tai heikentyy erilaisten monia aineosia sisältävien väliaineiden vaikutuksesta. Termeillä "monimutkainen väliaine” ja "monia 10 aineosia sisältävä väliaine” tarkoitetaan tässä käytettynä mitä tahansa väliainetta, jolla on kyky edistää mikro-organismien kasvua, ja tällaisella väliaineella on seuraavat ominaisuudet: hiili- ja typpilähteet, joita on läsnä kasvua varten, eivät ole yksinomaan yksinkertaisia hiilihyd-15 raatteja ja aminohappoja vaan yhdisteseos, jossa yhdisteet ovat esimerkiksi hiilihydraatteja, polysakkarideja, proteiineja, peptidejä, lipidejä, orgaanisia happoja, vitamiineja ja kotekijöitä, jotka ovat läsnä runsasravinteisina määrittelemättöminä koostumuksina, esimerkiksi kasvien 20 ja eläinten tuottamina nesteinä, kasvi- ja eläinkudosuut-teina ja kudoshydrolysaatteina, tai peräisin sellaisista.

On myös tunnettua, että vaihtoehtona mikro-organismien inaktivoimiselle lämmöllä tai muulla tavanomaisella käsittelyllä niiden inhibitio ja/tai inaktivointi voidaan 25 saada aikaan rajoittamalla välttämättömien kasvutekijöiden saantia. Välttämättömiä kasvutekijöitä voivat olla esimerkiksi hivenaineet, vitamiinit, orgaaniset hapot, sokerit tai kaasut (esimerkiksi happi). Mitkä näistä tekijöistä ovat välttämättömiä, riippuu mikro-organismin tyypistä.

30 Eräs tekijä, jota useimmat, elleivät kaikki, mikro- organismit tarvitsevat ympäristöstä, on alkuaine rauta. Rautaa tarvitaan kotekijänä monissa entsyymijärjestelmissä, joita solut käyttävät metaboliaprosseissa, ja se on ehdottoman välttämätöntä useimmille mikrobien ribonukleo-35 tidireduktaaseille.

li 98879 5 US-patenttijulkaisuissa 4 530 963 ja 4 585 559 (DeVoe et ai.) esitetään menetelmä mikrobien kasvun estämiseksi rauta(III):a sisältävässä nestemäisessä väliaineessa saattamalla väliaine kosketukseen liukenemattomaan 5 kantajaan kovalenttisesti sidotun sideroforin kanssa. DeVoe et ai. esittävät sellaisten sideroforien kuin defer-rioksamiini B:n käyttöä, jotka eivät ole käytännössä tehokkaita mikrobien kasvun estämisessä, sillä käytetyillä sideroforeilla on sellainen kineettinen vaihtonopeus rau-10 dan suhteen, joka johtaa sitoutuneen raudan myöhempään vapautumiseen sideroforista käsiteltävään väliaineeseen.

Nesteissä, joiden pH on alhainen, ja pelkistävissä ympäristöissä, kuten hedelmämehuissa, rauta on lisäksi lähes kokonaan ferromuodossa [rauta(II):na].

15 Keksinnön kuvaus

Keksinnön kohteena on menetelmä monimutkaisen eli monia aineosia sisältävän väliaineen muodossa olevan, nesteen käsittävän pakatun tuotteen sisältämien mikro-organismien kasvun säätelemiseksi, jossa menetelmässä tuote 20 saatetaan kosketukseen pakkausmateriaalin pinnassa olevan, olennaisilta osiltaan liukenemattoman, immobilisoidun, kasvua ehkäisevän aktiivisuuden omaavan aineen kanssa, jolla aineella on sellainen koostumus, että se on aktiivinen mainitun pakatun tuotteen suhteen.

25 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että valitaan kasvua ehkäisevän aktiivisuuden omaavaksi aineeksi aine, joka ei ole entsyymi, ja jonka aktiivisuus ei oleellisesti esty pakatun tuotteen jonkun komponentin vaikutuksesta, ja että aktiivisuutta edistetään aikaansaa-30 maila suhteellinen liike pakatun tuotteen ja aktiivisen aineen välillä.

Keksinnön kohteena on myös pakkausmateriaali, jonka pinnalla on käytännöllisesti katsoen liukenematon, immobi-lisoitu, kasvua ehkäisevä aine, jotta saataisiin kosketus 35 kompleksisen väliaineen muodossa olevaan, nesteen käsittä- 98879 6 vään tuotteeseen, mainitun aineen ollessa yhdistelmä, joka on aktiivinen tuotteeseen nähden estäen tuotteessa olevien mikro-organismien kasvu.

Keksinnön mukaiselle pakkausmateriaalille on tun-5 nusomaista, että kasvua ehkäisevän vaikutuksen omaavan aineen, joka ei ole entsyymi, aktiivisuus ei oleellisesti esty jonkin tuotteessa olevan komponentin vuoksi.

Sen ansiosta, että aktiiviset aineet, joita on yksi tai useampia, immobilosoidaan pakkausmateriaalin pintaan, 10 niitä ei ole olennaisia määriä materiaalissa eikä niitä myöskään tule olennaisia määriä materiaalin lisäaineeksi.

Aktiiviset aineet, joita on yksi tai useampia, voivat toimia mikro-organismien säätelijöinä, inhiboijina, tuhoajina ja/tai poistajina materiaaleissa, erityisesti 15 monia aineosia sisältävissä väliaineissa, kuten nestemäisissä tai kiinteissä elintarvikkeissa.

Aktiivinen aine tai kukin niistä on edullisesti epäorgaaninen tai orgaaninen koostumus, joka pintaan sidottuna säilyttää affiniteetin mikro-organismien suhteen 20 ja siten sitoo ja/tai hävittää mikro-organismeja.

Mainitut aktiiviset aineet, joita on yksi tai useampia, ovat sitovia aineita, joilla on sitoutumisaffini-teetti mainitussa toisessa materiaalissa olevien mikro-organismien suhteen ja jotka siten sitovat ja/tai hävit-25 tävät mikro-organismeja, tai aineita, joilla on sitoutu-misaffiniteetti mikro-organismien vähintään yhden biologisen kasvutekijän suhteen ja jotka sitten rajoittavat mainittujen yhden tai useamman kasvutekijän tarjollaoloa.

Mainitulla sitovalla aineella on edullisesti suuri 30 sitoutumisaffiniteetti mikro-organismien tai mahdollisesti niiden yhden tai useamman kasvutekijän suhteen, mutta alhainen sitoutumisaffiniteetti materiaalissa olevien muiden koostumusten suhteen.

Tapauksissa, joissa mainitulla sitovalla aineella 35 on sitoutumisaffiniteetti mikro-organismien suhteen, aine - 98879 7 voi olla sitova polymeeri, esimerkiksi lektiini, vasta-aine tai polysakkaridi. Sitovalla polymeerillä on edullisesti spesifinen affiniteetti glykokonjugaatin tai polysakkaridin suhteen, ja se on regeneroitavissa pesemällä 5 kilpailevalla sokerilla. Mikro-organismit voivat olla bakteereja tai sieniä.

Mainitut aineet, joita on yksi tai useampia, voivat sisältää amiinipitoisen yhdisteen muodossa olevaa ainetta, jolla on kyky vahingoittaa riittävästi mainitussa mate-10 riaalissa olevia mikro-organismeja niiden kasvun estämiseksi. Yhdisteellä voi olla sitoutumisaffiniteetti mikro-organismien suhteen, ja se voi olla tertiaarinen amiini tai kvaternaarinen ammoniumsuola. Yhdiste voi erityisesti sisältää dimetyyliaminopropyyli-, dimetyyliaminobutyyli-15 tai dietyyliaminopropyyliryhmän.

Tapauksissa, joissa sitovalla aineella on sitoutu-misaffiniteetti mainittujen yhden tai useamman kasvutekijän suhteen, sitovalla koostumuksella on riittävä sitoutu-misvakio ja kineettinen stabiilius mainittujen yhden tai 20 useamman kasvutekijän sitomisen suhteen, niin että koostumus pystyy menestyksellisesti kilpailemaan mikro-organismien kanssa yhdestä tai useammasta kasvutekijästä. Koostumuksella voi olla affiniteetti vähintään yhden kasvutekijöihin kuuluvan hivenaineen, esimerkiksi rau-25 ta(IXl):n tai rauta(II):n suhteen. Rauta(lll):n ollessa kyseessä koostumus voi olla deferriferrikromi A, jonka sitoutumisvakio rauta(III):n suhteen on vähintään 1030 l*mol_1 ja jolla on kyky muodostaa rauta(lll):n kanssa ki-neettisesti stabiili kompleksi, joka stabiilius on vähin-30 tään kymmenkertainen ferrioksamiini B -kompleksiin nähden. Rauta(Xl):n ollessa kyseessä koostumus voi olla pyri-miini.

Aktiiviset aineet voivat olla omilla vyöhykkeillään mainituissa pintaosissa tai, jossa aineet ovat keskenään 35 yhteensopivia, ne voivat olla mainitulla plntaosilla yh- teensekoitettuina.

98879 8

Pakkausmateriaali voi olla verkon tai säiliön muodossa .

Edellä esitetyn periaatteen eräässä erityissovel-lutuksessa on sellaisia pintoja säilytys- tai jakelusäi-5 liön sisällä, jotka on päällystetty yhdellä tai useammalla aktiivisella aineella. Aktiivisia aineita voidaan immobi-lisoida monille erilaisille pinnoille, mukaan luettuina polymeerihartsit tai kopolymeerit, kuten polystyreeni, polyeteeni, polypropeeni, polyamidit, polystyreeniaktyyli-10 nitriili tms., pahvi, joka voi sisältää tai olla sisältämättä polymeeriä, ja lasi. Tyypilliset elintarvikesäiliöt ovat polymeeriä tai polymeerillä, kuten polyeteenillä, päällystettyä metallia tai pahvia. Pahviset elintarvike-säiliöt päällystetään tai kyllästetään tyypillisesti poly-15 meerillä, kuten polyeteenillä.

Hyvä kontakti nestemäisen materiaalin ja yhden tai useamman aktiivisen aineen välillä saadaan aikaan nestemäisen materiaalin ja yhdellä tai useammalla aktiivisella aineella päällystetyn pinnan liikkuessa suhteessa toisiin-20 sa jakelusäiliössä tämän normaalin käsittelyn seurauksena. Vaihtoehtoisesti aktiivinen aine tai kukin niistä sidotaan säiliöstä erillään olevan välineen, jolla saadaan aikaan läheinen kosketus nestemäisen tuotteen kanssa, pintaan.

Jotta keksintö olisi selvästi ymmärrettävissä ja 25 helposti toteutettavissa, seuraavassa kuvataan sen kolmea suoritusmuotoa viitaten kaikkien yhteydessä liitteenä olevaan kaavamaiseen kuvioon, joka esittää nestemäisen elintarvikkeen pakkaamiseen käytettävän muovilla päällystetyn pahvisäiliön pystyleikkausta.

30 Säiliö 8 on US-patenttijulkaisussa 4 211 357 esi tettyä tyyppiä, mutta sen sisäpinnoille 10, 12, 14 ja 16 on sidottu yhtä tai useampaa aktiivista ainetta. Useiden aktiivisten aineiden ollessa kyseessä nämä voidaan joko sitoa omille pintavyöhykkeilleen (jotka voivat sekoittua) 35 tai ne voidaan sekoittaa yhteen (jos ne ovat yhteensopi- 98879 9 via) ja sitoa seos pinnoille. Yhtä tai useampaa ainetta voidaan sitoa myös säiliön 8 pohjan sisäpintaan (ei kuvassa). Säiliössä 8 on yläsauma 18, joka sulkee katon 20, jolloin muodostuu avoin tila 21 ja nestemäinen elintarvike 5 22 suojataan ulkopuolella olevalta atmosfääriltä. Säiliön 8 sisäpintoihin 10, 12, 14 ja 16 sidotut aineet, joita on yksi tai useampia, vaikuttavat nestemäiseen elintarvikkeeseen 22. Eräässä toisessa esimerkissä vain katon 20 sisäpinnat 10 ja 12 päällystetään yhdellä tai useammalla 10 aineella, mutta nämä sisäpinnat 10 ja 12 joutuvat kosketukseen nestemäisen tuotteen 22 kanssa säiliön 8 normaalin käsittelyn seurauksena tai liikuttamalla säiliötä 8 ja nestemäistä tuotetta 22 kontrolloidusti tai säilyttämällä tai kuljettamalla säiliötä 8 alassuin käännettynä.

15 Suoritusmuoto I (esimerkit 1-9) Tätä suoritusmuotoa kuvataan viitaten erityisesti bakteerien immobilisointiin elintarvikkeista, kuten maidosta ja hedelmäpohjäisistä juomista, hedelmäjuomat ja nektarit mukaan luettuina. On kuitenkin ymmärrettävä, että 20 tätä suoritusmuotoa voidaan käyttää yleisesti bakteerien immobilisointiin kaasumaisista, nestemäisistä ja kiinteistä faaseista.

Tässä suoritusmuodossa käytetään matriksia, johon yksi tai useampia spesifisesti sitovia polymeerejä on si-25 dottu joko kovalenttisesti tai passiivisesti. Esimerkkeihin tällaisista matriksesta kuuluvat polymeerit, kuten polyeteeni tai polystyreeni, lasi ja selluloosapohjäiset koostumukset, joihin sitova polymeeri on sidottu passiivisesti adsorboimalla tai kovalenttisesti sitomalla. Sito-30 valla polymeerillä päällystetyt pinnat voidaan saattaa kosketukseen nestemäisen tuotteen, kuten maidon, kanssa joko käyttämällä in-line-patruunaa tai muuta kosketusta edistävää järjestelmää siirtovaiheen aikana tai osana lopullista pakkausmateriaalia. Tämän tehtävänä on poistaa 35 kontaminoivat bakteerit adsorboimalla tai kompleksoimalla 98879 10 ne kiinteään faasiin, jolloin lopullisena seurauksena on pakatun tuotteen säilymisajan piteneminen ja/tai epätoivottavien organismien eliminointi.

Jos lopullinen pakkausmateriaali on jakelusäiliö 8, 5 hyvä kontakti nestemäisen tuotteen 22 ja matriksiin sidotun sitovan polymeerin välillä saadaan aikaan tuotteen 22 ja säiliössä olevien sitovalla polymeerillä päällystettyjen pintojen 10, 12, 14, 16 liikkumisella suhteessa toisiinsa, joka on seurausta säiliön normaalista käsittelys-10 tä. Sitova polymeeri sidotaan vaihtoehtoisesti nestemäistä tuotetta liikuttavan ja sekoittavan erillisen välineen pintaan. Bakteerien erotus saadaan aikaan, kun väline poistetaan tai nestemäinen tuote 22 kaadetaan pois säiliöstä 8, jolloin bakteerit jäävät kiinni tyhjennetyn säi-15 liön sisäpintaan 10, 12, 14, 16.

Sitovia polymeerejä ovat sellaiset polymeerit kuin lektilnit, polysakkaridit ja vasta-aineet. Sitoutumisen välittäjänä on spesifinen vuorovaikutus bakteerisolun pinnalla esillä olevan jonkin molekyylin ja sitovan polymee-20 rin välillä.

Sitovien polymeerien immobi li sointi kiinteään alustaan voi olla luonteeltaan joko kovalenttista tai ei-kova-lenttista. Tämän vuorovaikutuksen tärkeänä ominaispiirteenä on se, että sitovat polymeerit pysyvät tiukasti si-25 toutuneina eivätkä vapaudu bakteeriensitomisvaiheiden ai kana. Sitovien polymeerien kovalenttinen sitominen voidaan toteuttaa monin eri menetelmin, jotka ovat alalla hyvin tunnettuj a.

Vaihtoehtona kovalenttiselle immobilisoinnille voi 30 olla joissakin olosuhteissa edullista kiinnittää sitovat polymeerit ei-kovalenttisesti materiaalin kanssa kosketukseen tulevaan pintaan hydrofobisen vuorovaikutuksen kautta. Sitovan polymeerin vesiliuosta inkuboidaan kosketuksessa materiaalin kanssa kosketukseen tulevan pinnan kans-35 sa, johon proteiini on määrä sitoa. Tämä johtaa ajasta,

II

- 98879 11 lämpötilasta ja pitoisuudesta riippuvaan sitovasta polymeeristä koostuvan molekyylikerroksen muodostiimi seen hydrofobiselle materiaalin kanssa kosketukseen tulevalle pinnalle passiivisen adsorption kautta.

5 Läsnä olevista mikro-organismeista sekä käyttöpara- metreista riippuen erotusprosessi voi olla joko selektiivinen, jolloin poistetaan jokin tietty epätoivottava mikro-organismilaji, tai epäselektiivinen siinä mielessä, että useimmat tai kaikki kontaminoivat mikro-organismit 10 poistuvat.

Tämä suoritusmuodon yhteydessä testatuille sitovilla polymeereillä on suuri bakteeriensitomiskapasiteetti joko spesifisesti tietyn tyyppisten bakteerien suhteen tai epäspesifisesti muutamien tyyppien suhteen. Sitovina poly-15 meereinä käytettävien lektiinien ollessa kyseessä sitoutuminen pysähtyy ja prosessi kääntyy päinvastaiseen suuntaan lisättäessä kilpailevia sokeriliuoksia, ja siksi sitovalla polymeerillä päällystetyt pinnat voidaan "pestä" puhtaiksi tällä tavalla.

20 Säiliön 8 sisäpintoihin sidottu sitova polymeeri sitoo ja immobilisoi nestemäisessä tuotteessa 22 olevia mikro-organismeja. Haluttaessa voidaan säiliön 8 joihinkin tai kaikkiin sisäpintoihin sitoa myös aktiivista ainetta, joka salpaa mikro-organismin metaboliaa.

25 Suoritusmuotoa I valaisevat seuraavat keksintöä rajoittamattomat esimerkit 1-9:

Esimerkki 1

Tutkittiin olosuhteita, joissa sitovia polymeerejä kiinnitetään passiivisella adsorptiolla materiaalin kanssa 30 kosketukseen joutuviin pintoihin. Hyviä tuloksia saatiin aikaan muutamilla polymeereillä, esimerkiksi Dolichos biflorus ja Vicia villosa -lajeista saatavilla lektiineil-lä. Muilla lektiineillä, mukaan luettuna konkanavaliini A, saatiin samanlaisia tuloksia, mikä viittaa siihen, että 35 tämä on lektiineille yhteinen ominaispiirre. Myös immu- 98879 12 noglobuliinimolekyyleillä on samankaltaisia ominaisuuksia.

Lektllnlt leimattiin radioaktiivisestl ja niistä valmistettiin varastoliuokset puskuriin. Näistä valmistettiin sitten laimennussarja ja asetettiin annoksia pisteik-5 si joko polystyreeni- tai polyeteenipinnalle ja inkuboi-tiin 1 tunti lämpötilassa 37 °C, minkä jälkeen tehtiin pesu puskurilla. Näissä tutkimuksissa käytetty polyeteeni-pinta oli tavallista maitotölkkimateriaalia, joka koostui polyeteenilevyllä päällystetystä pahvista.

10 Tulokset osoittivat, että sitoutuminen läheni kyl- lästyspistettä tiheyden ollessa 5-10 ng/mm2 tutkitusta lektiinistä riippuen. Tästä päätellen lektllnlt sitoutuvat hydrofobisiin muovipintoihin ja sitoutumisen ylärajan määrää hydratoituneiden molekyylien pakkautumistiheys pinnal-15 la.

Esimerkki 2

Kun sitovia polymeerejä adsorboitiin passiivisesti polymeeripintaan (katso esimerkki 1) ja saatettiin pinta sitten kosketukseen suspension kanssa, joka sisälsi pes-20 tyjä ihmisen punasoluja puskurissa, tapahtui punasolujen sitoutumista immobilisoituun proteiiniin.

Kun polymeerejä oli inkuboitu 30 min punasolujen kanssa, käsitellyn polymeerin pinnalla näkyi mikroskoopilla tarkasteltaessa yhtenäinen solumatto useimpien tutkit-25 tujen polymeerien yhteydessä.

Hyviä tuloksia saavutettiin erilaisilla sitovilla polymeereillä, mukaan luettuna Dolichos biflorus -lektiini ja Vicia villosa -lektiini.

Esimerkki 3 30 Tutkittiin kaupan olevasta pastöroidusta maidosta eristettyjen kolmen tyypillisen maitoa pilaavan bakteerin kykyä sitoutua erilaisiin polymeeripinnalle passiivisesti adsorboituihin sitoviin polymeereihin. Näiden kolmen organismin todettiin alalla hyvin tunnetuin luokitusmenetel-35 min olevan Bacillus brevis, Enterobacter sp. ja Pseudomo- li 98879 13 nas sp. Sitovia polymeerejä adsorboitiin passiivisesti polymeeripintaan edellisessä esimerkeissä kuvatulla tavalla. Bakteereja suspendoitiin fosfaattipuskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen ja näitä kolmea organismia sisäl-5 täviä suspensioita saatettiin sitten kosketukseen käsiteltyjen polymeeripintojen kanssa. Bakteerien sitoutuminen arvioitiin mikroskoopin avulla tarkastelemalla. Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että muutamat sitovat polymeerit, kuten Dolichos biflorus, Vicia villosa, Limulus 10 polyphemus ja Solanum tuberosun -lektiinit, sitoivat tehokkaasti näiden erilaisten mikrobiluokkien tyypillisiä lajeja.

Esimerkki 4

Bacillus sp. -soluja suspendoitiin tiheydeksi 100 15 CFU/ml (pesäkkeenmuodostusyksikköä/ml) tris-puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen ja inkuboitiin polymeerimat-riksin kanssa, johon oli kytketty kovalenttisesti sitovia polymeerejä. Määritettiin vapaiden bakteerien lukumäärä suspensiossa tutkimalla mikroskoopin alla supernatantti-20 näyte (matriksin laskeutumisen jälkeen). Tällä menetelmällä osoitettiin immobilisoitujen polymeerien kyky sitoa ja siten poistaa kontamimoivia mikrobeja ja todettiin bakteerisolujen affiniteetti sitovalla polymeerillä päällystettyjen matriksien suhteen koeolosuhteissa. Havaittiin, että 1 25 bakteerien poistoteho oli tällä menetelmällä käytettäessä esimerkiksi Dolichos biflorus -lektiiniä joissakin tapauksissa lähes 100 %.

Esimerkki 5

Pure-Pak, Inc., Walled Lake, MI, USA, luovutti 30 erään Saccharomyces -kannan. Tämä kanta oli alunperin eristetty karpalomehusta ja sen oli havaittu kasvavan erilaisissa hedelmämehuissa ja pilaavan niitä.

Soluja kasvatettiin joko omenamehussa, joka oli steriloitu suodattamalla, tai synteettisessä alustassa, 35 jonka toimitti Difco.

98879 14

Saatiin kasvatusolosuhteista riippumatta samanlaisia tuloksia.

Dolichos biflorus -lektiinin toimitti Sigma Chemical Co., ja se immobilisoitiin joko absorboimalla 5 passiivisesti polystyreenipintaan tai kytkemällä syano-geenibromidin avulla agaroosihelmiin.

Kun Saccharomyces-solut saatettiin kosketukseen immobilisoitua lektiiniä sisältävän pinnan kanssa, niiden havaittiin sitoutuvan nopeasti ja tiukasti pintaan.

10 Havaittiin esimerkiksi, että vähintään 90 % suspen siossa olevista soluista sitoutui 1-2 tunnissa liukenemattomiin agaroosihelmiin, joilla oli immobilisoitua Dolichos biflorus -lektiiniä.

Tämä sitoutuminen oli hyvin stabiilia, eikä merkit-15 sevää irtoamista tapahtunut 24 tunnin aikana. Tällä tavalla sidotut solut oli helppo poistaa mehusta joko antamalla helmien laskeutua ja dekantoimalla supernatantti tai johtamalla mehu suurihuokoisen suodattimen, kuten lasivillan, läpi.

20 Esimerkki 6

Solanum tuberosum -lektiini sidottiin polystyree-nistä valmistettuun petrimaljaan passiivisesti adsorboimalla ja malja saatettiin kosketukseen maidon kanssa, johon oli lisätty tiheydeksi 106 solua/ml joko Bacillus bre-25 vusta tai Pseudomonas fluorescensi. Kun maljoja oli inku-boitu 30 min, ne huuhdottiin ja tutkittiin optisella mikroskoopilla. Kummassakin tapauksessa havaittiin bakteerien sitoutumista lektiinillä päällystettyyn pintaan, mutta sitoutumispinta-alan havaittiin olevan olennaisesti pie-30 nempi kuin alueen, jonka havaittiin peittyneen rakkuloilla, jotka identifioitiin maitorasvapallosiksi. Tämä koe osoittaa, että tällä lektiinillä, jolla on kyky sitoa maitoa pilaavia bakteereja, on myös kyky sitoa maitorasvapal-losten kalvojen pintakomponentteja ja tämä viimeksi mai-35 nittu aktiivisuus johtaa menetelmän tehon heikkenemiseen.

li 98879 15 Tämä tehon heikkeneminen sulkee pois tämän lektiinin käytön maidossa.

Esimerkki 7

Tehtiin tutkimus liukenemattomalla alustamatriksil-5 la olevan sitovan polymeerin optimaalisen tiheyden määrittämiseksi. CnBr:lla aktivoituihin agaroosihelmiin kytkettiin vaihtelevia määriä lektiiniä käyttäen pitoisuuksia 1-50 mg/ml ja annettiin helmien olla kosketuksessa solujen kanssa tunnin ajan. Sitoutumistehokkuus määritettiin 10 mittaamalla liuosfaasiin jääneiden vapaiden solujen lukumäärä. Havaittiin, että solujen sitoutuminen oli tehokkaimmillaan lektiinikuormituksen helmillä ollessa 15 -30 mg/ml. Sitoutumisaste oli näissä olosuhteissa yli 95 %. Lisäsitoutumista ei havaittu kuormituksen kasvaessa 15 arvoon 50 mg/ml. Merkittävä sitoutumisen väheneminen havaittiin lektiinikuormituksten ollessa alle 10 mg/ml.

Esimerkki 8 (Tämä esimerkki voidaan katsoa kuuluvaksi myös suoritusmuodon II piiriin.) 20 Saccharomyces cerevisiaen sitoutuminen tertiääri- siin amiineihin osoitettiin kahdella menetelmällä. Ensimmäisessä menetelmässä täytettiin pylväät (90 x 6 mm) IRA-68- ja IRA-94-helmillä. Pylväät tasapainotettiin Ringersin liuoksella (vahvuus 1/4). 1 ml Ringersin liuokseen valmis-25 tettua S. cerevisiae -solususpensiota (106 solua/ml) laitettiin pylvääseen ja eluoitiin Ringerin liuoksella. Elu-aattifraktioille (1 ml) tehtiin laskenta bakteerilasken-takammiossa ja laskettiin eluoituneiden solujan lukumäärä.

45 % soluista pidättyi sekä IRA-68- että ISA-94-pylvää-30 seen. Toisessa menetelmässä, joka suunniteltiin osoit-: tamaan suoraan sitoutuminen liuoksessa, IRA-68-helmet ta sapainotettiin Ringersin liuoksessa ja laitettiin 250 mg helmiä 10 ml:n koeputkeen. 2 ml Ringersin luokseen valmistettua S. cerevisiae -solususpensiota siirrettiin putkeen.

35 Koeputkea inkuboitiin pystysuorassa asennossa huoneen läm- 98879 ie pötilassa 2 tuntia, mitattiin pH (5,4) ja dekantoitiin supernatantti. Lisättiin kahdesti steriiliä Ringersin liuosta sitoutumattomien solujen pesemiseksi pois. S. cerevisiae -solujen sitoutuminen IRA-68-helmiin osoitet-5 tiin mikroskooppitutkimuksella.

Esimerkki 9

Tutkittiin erilaisten mikro-organismien sitoutumista muihin valittuihin proteiineihin. Kytkettiin lysotsyy-miä, fibronektiiniä ja naudan seerumialbumiinia (BSA) ko-10 valenttisesti CNBr:lla aktivoituihin agaroosihelmiin.

Voimakas sitoutuminen (peitto yli 80 %) lystosyymin osoitettiin Pseudomonas fluorescens TP2:n, Streptococcusx lactisin, Streptococcus thermophilusin ja Staphylococcus xylosusin kohdalla, kun taas vegetatiiviset Bacillus 15 subtilis -solut sitoutuivat vähäisemmässä määrin. Saccha- romyces cerevisiaen, Escherichia colin, Sernatia marces-censin ja B. subtlis -itiöiden kohdalla ei havaittu ollenkaan sitoutumista.

Suoritusmuoto II (esimerkit (i) - (xi)) 20 Tätä suoritusmuotoa kuvataan viitaten erityisesti mikrobien kasvun estämiseen monia aineosia sisältäviä väliaineita edustavissa elintarvikkeissa, kuten maidossa ja hedelmäpohjäisissä juomissa, mukaan luettuina hedelmäjuomat Ja -nektarit.

25 Tässä suoritusmuodossa käytetään matriksia, johon on liitetty joko kovalenttisesti tai passiivisesti yhtä tai useampaa amiinipitoista yhdistettä, jotka estävät mikrobien kasvua monia aineosia sisältävissä väliaineissa. Esimerkkeihin tällaisista matrikseista kuuluvat polymee-30 rit, kuten polyeteeni tai polystyreeni, metalli, lasi ja selluloosapohjaiset koostumukset, joihin yhdiste on sidottu joko passiivisesti adsorboimalla tai kovalenttisesti sitomalla. Päällystetty pinta voidaan saattaa kosketukseen elintarviketuotteen, esimerkiksi nestemäisen tuotteen, 35 kuten maidon, kanssa joko in line -patruunana tai muuna li . 98879 17 kosketusta edistävänä järjestelmänä siirtovaiheen aikana tai osana lopullista pakkausmateriaalia. Tämän tarkoituksena on kontaminoivien bakteerien tuhoaminen.

Tässä suoritusmuodossa käytettävät amiinipitoiset 5 yhdisteet ovat tertiaarisia amiineja, osittain hapetettuja tertiaarisia amiineja tai kvaternaarisia ammoniumsuoloja, erityisesti sellaisia, joilla on kyky estää mikrobien kasvua monia aineosia sisältävissä väliaineissa. Ensinmainittuun ryhmään kuuluvia tyypillisiä soveltuvia amiinipitoi-10 siä yhdisteitä ovat yhdisteet, joilla on kaava

/<CH2>xH

0 X

Il /

(polymeeri A) - C-N-(CH2)n-N

15

Nch2)xh jossa n on 1 - 6, erityisesti 1, 2, 3, 4 tai 6, ja x on 1-18, erityisesti 1, 2, 4 tai 18. Yhdiste, jolla on kaa-20 va I, jossa n on 3 ja x on 1, on aktiivinen Saccharomyces cerevisiaeta vastaan, ja yhdisteet, joilla on kaava I, jossa n on 2 ja x on 1 tai jossa n on 3 ja x on 2, ovat aktiivisia E. colia vastaan.

Toista ryhmää edustavat yhdisteet, joita muodoste-25 taan hapettamalla osittain polystyreeniin kytkettyjä tertiaarisia amiineja. Eräs esimerkki tällaisista yhdisteistä ovat yhdisteet, joita muodostetaan käsittelemällä styree-ni-divinyylibentseenikopolymeeriin (polysytreeniin) kytkettynä dimetyylimetyyliamiinia vetyperoksidilla. Yleisem-30 min ilmaistuna yhdisteryhmää, josta voidaan tehdä tehokas käsittelemällä vetyperoksidilla tai vastaavalla hapetti-mella, voi edustaa kaava 98879 18

/C""V

(polymeeri g) — c f \ C

-f* " (ch2)x -h Näillä yhdisteillä on tyypillisesti alhainen mikrobien vastainen aktiivisuus, tai sitä ei ole ollenkaan, 10 monia aineosia sisältävässä väliaineessa ennen hapetusta. Ennen tätä keksintöä tertiaarisilla amiineilla ja kvater-naarisilla ammoniumsuoloilla on ilmoitettu olevan mikrobien vastainen vaikutus puskuriliuoksissa tai vedessä. Ennen tätä keksintöä ei ole kuitenkaan kuvattu amiinipi-15 toisia yhdisteitä, joilla on merkittävä mikrobien vastainen vaikutus monia aineosia sisältävissä väliaineissa.

Amiinipitoinen yhdiste on tämän suoritusmuodon mukaisesti käyttökelpoinen, kun se estää bakteerien tai sienten kasvua monia aineosia sisältävässä väliaineessa 20 seuraavassa testissä. Lisätään bakteerisoluja (101 - 103 solua/ml pastöroituun maitoon ja inkuboidaan 120 - 192 tuntia lämpötilassa 11 °C. Amiinipitoinen yhdiste lisätään maitoon immobilisoidussa muodossa helmillä tai maidolle tarkoitetun säiliön sisäpinnalla ennen inkubointia. Kun 25 maitoa on inkuboitu vähintään 24 tuntia amiinipitoisen yhdisteen lisäämisen jälkeen, siitä testataan bakteerien läsnäolo laimentamalla ja tekemällä maljalaskenta. Baktee-ripitoisuutta alle 105 solua/ml pidetään hyväksyttävänä.

Tämä koe voidaan tehdä myös hedelmämehussa, kuten appel-30 siinimehussa, omenamehussa tms. Kokeessa käytettävät mikro-organismit voivat olla bakteereja, hiivoja tai homeita. Amiinipitoinen yhdiste sidotaan kovalenttisesti polymeeri-runkoon sidoksella, kuten amidi- tai fenyleenisidoksella. Immobilisoidun amiinipitoisen yhdisteen pitoisuus on 35 yleensä 0,3 - 16 pekvcm'2. Ylimääräinen amiinipitoinen li 98879 19 yhdiste voidaan poistaa pesemällä lyhyen inkubolntijakson jälkeen. Inunoblllsoidun amllnipltoisen yhdisteen pitoisuus on riittävä aikaansaamaan mikro-organismin esto suurin piirtein kokonaan käsiteltävässä nesteessä.

5 Läsnä olevista mikro-organismeista ja käyttöpara- metreista riippuen inhibitioprosessi on joko selektiivinen, johonkin tiettyyn epätoivottavaan mikro-organismilajiin kohdistuva, tai epäselektilvinen siinä mielessä, että useimmat tai kaikki kontaminoivat mikro-organismit tulevat 10 inhiboiduiksi. Tämä voitaisiin toteuttaa bakteerit joko siirtoprosessilinjassa olevan komponentin avulla tai itse nestesäiliössä olevalla komponentilla.

Säiliön 8 sisäpinnan päällysteenä oleva amiinipi-toinen yhdiste toimii mikro-organismien sitojana ja niiden 15 kasvun estäjänä nesteessä.

Suoritusmuotoa II valaisevat seuraavat keksintöä rajoittamattomat esimerkit (i) - (xi).

Esimerkki (i)

Amiinipitoisen pinnan mikrobien vastainen aktiivi-20 suus osoitettiin lisäämällä 100 mg "Amberlite" IRA-68-hel-miä, erä nro 66F-0148 (toimittajana Sigma Chemical Co.,

St. Louis, Mo., USA) 50 mM Tris-puskuriin, pH 7,5 (2 ml), joka oli inokuloitu elintarvikkeita pilaavilla mikro-organismeilla, kuten Pseudomonas fluorescensilla, Escheric-' 25 hia colilla tai Bacillus brevisilla (105 solua/ml), koe putkissa. Nämä helmet edustavat polyakryyliamidipintoja, jotka sisältävät polymeerin amidityppiatomeihin kytkettynä N,N-dimetyyliaminopropyyliryhmiä. Putkia sekoitettiin lämpötilassa 22 °C ja jäljellä olevat elävät solut mitattiin 30 maljalaskennalla. Elävien Bacillus brevis -solujen lukumäärä oli vähentynyt yli yhdellä kertaluvulla ja Pseudomonas fluorescens ja Escherichia coli -solujen lukumäärä yli neljällä kertaluvulla kahdessa tunnissa tertiaarisen pinnan läsnä ollessa.

98879 20

Esimerkki (ii)

Erään toisen amiinipinnan mikrobien vastainen aktiivisuus osoitettiin lisäämällä 100 mg "Amberlite" IRA-94-helmiä, erä nro 123F-0163 (toimittaja mainittu Sigma 5 Chemical Co.) koeputkissa 2 ml:aan 50 mM Tris-puskuria (pH 7,5), joka oli inokuloitu Pseudomonas fluorescensilla, Escherichia colilla tai Saccharomyces cerevisiaella (105 solua/ml). Helmen pinta edustaa pintoja, jotka sisältävät 4 mekv/g osittain hapetettua dimetyyliamiinia kytkettynä 10 styreeni-divinyylibentseenikopolymeeriin. Putkia sekoitet tiin lämpötilassa 22 °C ja mitattiin jäljellä olevat elävät solut maljalaskennalla. Elävien solujen lukumäärä oli laskenut tertiaarisen pinnan läsnä ollessa kahdessa tunnissa yli neljän kertaluvun verran kaikkien kolmen tutki-15 tun organismin ollessa kyseessä.

Esimerkki (iii) Tölkki, joka sisältää mikrobien vastaisesti vaikuttavan pinnan, pidentäisi pastöroidun hedelmämehun säily-misaikaa estämällä läsnä olevan mikrobiflooran kasvua.

20 Tämän osoittamiseksi lisättiin 100 mg dimetyyliamino-propyylipolyakryyliamidihelmiä (IRA-68) koeputkeen, joka sisälsi 2 ml steriiliä omenamehua. Putket inokuloltiin Saccharomyces cerevisiae -viljelmällä solutiheyteen 103/ml ja inkuboitiin lämpötilassa 11 °C. Tertiääristä amiinia 25 sisältävän pinnan läsnäolo rajoitti sekä kasvunopeutta että solujen kokonaismäärää. Tutkittavien näytteiden or-ganoleptinen arviointi seitsemän vuorokauden kuluttua osoitti, että vertailunäytteet olivat pilaantuneet, kun taas amiinipitoisen pinnan sisältävät näytteet eivät ol-30 leet. Tämä esimerkki valaisee testiä, jota käytetään tämän suoritusmuodon mukaisten vaikuttavien amiinipitoisten yhdisteiden identifioinnissa.

Esimerkki (iv) Tämä esimerkki valaisee tertiääristä amiinia sisäl-35 tävää pintaa, jolla on vähäinen vaikutus Saccharomyces

II

98879 21 cerevisiaen kasvun estäjänä esimerkissä (111) kuvatuissa olosuhteissa. 100 mg "Dowex" WGR-2-helmiä, erä nro 83F-0120 (toimittaja mainittu Sigma Chemical Co.) lisättiin omenamehuun (2 ml), joka oli inokuloitu S. cerevisiaella 5 solutiheyteen 103/ml, ja sekoitettiin lämpötilassa 11 °C.

Nämä helmet edustavat pintoja, jotka sisältävät styreeni-divinyylibentseenikopolymeeriin kytkettyä dimetyylimetyy-liamiinia. Kasvua seurattiin maljalaskennalla; vain pieni ero elävien solujen lukumäärässä havaittiin amilnipinnan 10 sisältävien putkien ja vertailuputkien välillä 6 vuorokauden aikana. Samanlaisissa kokeissa, jotka tehtiin puskuroiduissa suolaliuoksissa monia aineosia sisältävien väliaineiden sijasta, WGR-2-helmlllä osoitettiin olevan mikrobien vastaisia ominaisuuksia yhtäpitävästi Endon et ai.

15 havaintojen kanssa, ja siten osoitettiin, että yksinkertaisissa väliaineissa havaittava mikrobien vastainen aktiivisuus ei korreloi tällaisen aktiivisuuden kanssa monia aineosia sisältävissä väliaineissa.

Esimerkki (v) 20 Sen osoittamiseksi, että dimetyyliaminopropyyli- polyakryyliamidipinta on tehokas pastöroidun maidon säily-misajan pidentäjänä, toistettiin esimerkin (lii) mukainen koe käyttämällä rasvatonta kuivamaitoa monia aineosia sisältävänä väliaineena, "Amberlite" IRA-68-helmiä amiinipi-25 toisena pintana ja Pseudomonas fluorescensia testiorganis-mlna. Amilnipinnan läsnäolo vähensi merkittävästi Pseudomonas fluorescensin kasvunopeutta tässä väliaineessa.

Esimerkki (vi) Tämä esimerkki osoittaa erään toisen amiinia slsäl-30 tävän pinnan käyttökelpoisuuden mikrobien kasvun kontrolloijana monia aineosia sisältävässä väliaineessa. 100 mg "Amberlite A-21" -helmiä, jotka koostuivat styreenl-di-vinyylibentseenikopolymeeriin kytketystä osittain hapetetusta dlmetyylimetyyliamiinista, lisättiin steriiliin ome-35 namehuun (2 ml). Näiden helmien osittainen hapetus saa- 98879 22 tiin aikaan käsittelemällä ne ennalta vetyperoksidilla. Putket inokuloitiin Saccharomyces cerevisiae -viljelmällä siten, että solutiheydeksi tuli 102 - 103/ml, ja inkuboi-tiin lämpötilassa 6, 11 tai 25 °C. Näiden pintojen läsnä-5 olo vähensi dramaattisesti solujen kasvua kaikissa tapauksissa. Lisäksi mehun pilaantumisen havaittiin viivästyvän suuresti vertailunäytteisiin verrattuna.

Esimerkki (vii) Tämä esimerkki osoittaa, että immobilisoitu kvater-10 naarinen ammoniumyhdiste, joka tunnetaan aktiivisena mikrobien vastaisena pintana, on epäaktiivinen monia aineosia sisältävän väliaineen läsnä ollessa. Valmistettiin 3-tri-metoksisilyylipropyylioktadekyylidimetyyliammonium-kloridiliuos (US-patenttijulkaisu 4 259 103, Sylgard) li-15 säämällä tätä ainetta veteen ja päällystettiin sen avulla viljelyputken sisäpinta. Putkiin lisättiin joko yksinkertaista puskuriliuosta tai steriiliä omenamehua ja nämä väliaineet inokuloitiin sitten S. cerevisiaella, jota lisättiin 105 solua/ml puskurin ollessa kyseessä ja 103 so-20 lua/ml omenamehun tapauksessa. Näytteitä inkuboitiin lämpötilassa 11 eC. Otettiin näytteitä eri aikoina inokuloin-nin jälkeen ja määritettiin elävät pesäkkeenmuodostus-yksiköt maljalaskennalla. Sienten vastaisen aktiivisuuden osoitti hiivasolujen nopea kuoleminen (8 tunnissa) pusku-25 riliuoksessa. Tämä havainto sopi yhteen aiempien tietojen kanssa. Solujen elinkyvyn heikkenemistä ei sen sijaan havaittu omenamehunäytteissä ja vertailunäyteisiin nähden kasvu oli normaalia 5 vrk:n ajan. Tämä osoitti, että tämän aineen mikrobien vastainen aktiivisuus hävisi monia aine-30 osia sisältävässä väliaineessa.

Esimerkki (viii)

Amiinipitoisen pinnan sienten vastainen aktiivisuus osoitettiin hiivaelatusalustassa (Bacto Malt Extract Broth, Difco). Koeputkiin laitettiin 250 mg "Amberlite" 35 IRA-68- ja IRA-94-helmiä ja lisättiin kuhunkin putkeen

II

98879 23 5 ml kasvualustaa, joka sisälsi 103 solua/ml Saccharomyces cerevislaeta. Helmiä sisältävissä putkissa ja vertailuput-kessa esiintyvää kasvua mitattiin maljalaskennalla 6 vrk:n ajan. S. cerevislae -solujen lukumäärä oli saavuttanut 5 6 vrk:n kuluttua vertailunäyttelssä arvon 109 solua/ml, kun taas ORA-68- ja IRA-94-putklssa el havaittu mitään kasvua. Solujen lukumäärät näissä putkissa olivat alle 103 solua 6 vrk:n inkuboinnin jälkeen.

Esimerkki (ix) 10 Saccharomyces cerevislaen sitoutuminen tertiaari- siin amiineihin osoitettiin kahdella menetelmällä. Ensimmäisessä menetelmässä pylväät (90 x 6 mm) täytettiin "Amberlite" IRA-68- ja IRA-94-helmillä. Pylväät tasapainotettiin Ringersin liuoksella (1/4 vahvuudesta). Pylvääl-15 le laitettiin 1 ml Ringersin liuokseen valmistettua S. cerevislae -solususpensiota (106 solua/ml) ja eluoitiin Ringersin liuoksella. Eluaattifraktioille (1 ml) tehtiin laskenta bakteerilaskentakammiossa ja laskettiin eluoitu-neiden bakteereiden lukumäärä. Soluista jäi 45 % eluoitu-20 matta sekä IRA-68- että IRA-94-pylväissä käytettäessä

Ringersin liuosta. Toisessa menetelmässä, joka suunniteltiin sitoutumisen osoittamiseen suoraan liuoksessa, IRA-68-helmet tasapainotettiin Ringersin liuoksessa ja laitettiin 250 mg helmiä 10 ml:n koeputkeen. Putkeen siirrostet-25 tiin 2 ml S. cerevislae -suspensiota Ringersin liuoksessa. Koeputkea lnkuboitiin pystyasennossa huoneen lämpötilassa 2 tuntia, mitattiin pH (5,4) ja dekantoitiin supernatantti. Lisättiin kahdesti steriiliä Ringersin liuosta sitoutumattomien solujen pesemiseksi pois. S. cerevislaen si-30 toutuminen IRA-68-helmiin osoitettiin mikroskooppisesti tutkimalla.

Esimerkki (x)

Sen osoittamiseksi, että amlinipitoisten pintojen Saccharomyces cerevislaeta inhiboiva vaikutus kohdistuu 35 solukalvoon, S. cerevislae -solut suspendoitiin puskuriin 98879 24 (10s solua/ml), joka sisälsi 5 % sakkaroosia yhdessä "Amberlite" IRA-68:n (50 mg/ml) kanssa tai ilman sitä. Otettiin näytteitä ja määritettiin niiden siirrostustehok-kuus alustalla, joka sisälsi 0,01 % natriumdodekyylisul-5 faattia (SDS). SDS on pinta-aktiivinen aine, ja sillä on kyky hajottaa biologisia kalvoja. Käytetty SDS-pitoisuus (0,01 %) on kuitenkin pienempi, kuin S. cerevisiaen suhteen tappava pitoisuus. Kun solut olivat olleet 70 tuntia lRA-68:n vaikutuksen alaisina, niiden siirrostustehokkuus 10 0,01 % SDSrää sisältävällä alustalla oli 80 % pienempi kuin alustalla, joka ei sisältänyt SDS:ää. Näytteissä, joita ei käsitelty IRA-68:11a, ei havaittu eroja siirros-tustehokkuudessa, mikä osoittaa, että IRA-68-käsittely herkisti S. cerevisiae -solut SDS:n kalvoja hajottavalle 15 vaikutukselle tämän normaalisti ei-tappavan pitoisuuden vallitessa.

Esimerkki (xi)

Lisätodisteita siitä, että IRA-68:n vaikutus heikentää Saccharomyces cerevisiaen kalvojen yhtenäisyyttä, 20 saatiin värjäämällä solut Trypan Blue -värjäysaineella. Trypan Blue -värjäys osoittaa eukaryoottisolujen elinkyky* syyden värinhylkimismekanismilla. Solut, joiden solukalvo on ehjä, eivät päästä väriä sisäänsä eivätkä siten värjäydy. Kuolleet tai vaurioituneet solut, joiden kalvo 25 on läpäisevä, päästävät värin sisäänsä ja värjäytyvät sinisiksi. S. cerevisiae -solut suspendoitiin puskuriin (105 solua/ml), joka sisälsi 5 % sakkaroosia yhdessä lRA-68:n kanssa (50 mg/ml) tai ilman sitä. Kun IRA-68 oli vaikuttanut näytteeseen 120 tuntia, yli 80 % S. cerevisiae -so-30 luista värjäytyi sinisiksi, kun taas vain 2 - 3 % vertai-lusoluista, joita ei ollut käsitelty lRA-68:lla, värjäytyi.

Suoritusmuoto III

Tätä suoritusmuotoa kuvataan tässä viitaten erityi-35 sesti raudan sitomiseen elintarvikkeista, kuten maidosta « · li 98879 25 ja hedelmäpohjäisistä juomista, mukaan luettuina hedelmä-juomat ja -nektarit. On kuitenkin ymmärrettävä, että tämä suoritusmuoto on käyttökelpoinen raudan sitomiseen nestemäisestä faaseista yleisesti.

5 Edullisesti käytetään matriksia, johon rautaa si tova koostumus on sidottu joko kovalenttisesti tai ei-ko-valenttisesti. Esimerkkeihin tällaisista matrikseista kuuluvat polymeerit, kuten polyeteeni tai polystyreeni, lasi ja selluloosapohjäiset koostumukset, joihin rautaa sitova 10 koostumus on sidottu passiivisesti adsorboimalla tai kovalenttisesti sitomalla. Rautaa sitovalla koostumuksella päällystetty pinta voidaan saattaa kosketukseen elintarviketuotteen, esimerkiksi nestemäisen tuotteen, kuten hedelmämehun, kanssa joko käyttämällä in line -patruunaa tai 15 muuta kontaktia edistävää järjestelmää siirtovaiheen aikana, tai pinta voi olla osana pakkausmateriaalia. Tämä poistaa rautaa, joka edistää mikro-organismien kasvua, kelatoimalla se kiinteään faasiin, jolloin lopputuloksena on pakatun tuotteen säilymisajan piteneminen ja/tai epä-20 toivottavien tai patogeenisten organismien kasvun vähentäminen tai estäminen.

Hyvä kontakti säiliössä 8 olevan nestemäisen tuotteen ja säiliössä olevaan matriksiin sidotun rautaa sitovan koostumuksen välillä saadaan aikaan nesteen 22 ja säi-25 liössä olevan sitovan pinnan liikkumisella suhteessa toisiinsa. Rautaa sitova koostumus voidaan vaihtoehtoisesti sitoa erillisen liikkuvan ja nestetuotetta sekoittavan välineen pintaan. Sidotun raudan erotus saadaan aikaan, kun väline poistetaan tai nestemäinen materiaali kaadetaan 30 pois säiliöstä, jolloin rauta jää sidotuksi tyhjennetyn säiliön sisäpintaan.

Soveltuviin rautaa sitoviin koostumuksiin kuuluvat deferriferrikromi A, dipyridyyli, pyrimiini tai niiden seokset.

35 Rautaa sitovan koostumuksen immobilisointi kiin teään alustaan voi olla luonteeltaan joko kovalenttista 98879 26 tai ei-kovalenttista. Tämän vuorovaikutuksen tärkeänä ominaispiirteenä on, että alustaan immobilisoidun koostumuksen tulisi pysyä tiukasti sitoutuneena eikä sitä saisi vapautua raudansitomisvaiheen aikana. Rautaa sitovan koos-5 tumuksen kovalenttinen sitominen voidaan toteuttaa monin erilaisin menetelmin, jotka ovat alalla hyvin tunnettuja. Joissakin tapauksissa saattaa olla toivottavaa sisällyttää yhdistelmään kytkentäryhmiä tai välihaaroja antamaan rautaa sitovalle koostumukselle jonkin verran lisää liikku-10 misvapautta ja/tai parantamaan kontaktia nestemäisen materiaalin kanssa. Nämä voidaan tuoda mukaan immobilisoin-tivaiheen aikana.

Vaihtoehtona kovalenttiselle immobilisoinnille voi joissakin olosuhteissa olla toivottavaa sitoa rautaa si-15 tova koostumus ei-kovalenttisesti materiaalin kanssa kosketukseen tulevaan pintaan hydrofobisen vuorovaikutuksen kautta. Rautaa sitovan koostumuksen vesiliuosta inkuboi-daan kosketuksessa kontaktipinnan kanssa, johon rautaa sitova koostumus on määrä sitoa.

20 Materiaalin kanssa kosketukseen tuleviin pintoihin tällä tavalla sidotut rautaa sitovat koostumukset ovat stabiileja, ja valmistettuja substraatteja voidaan säilyttää joko puskurilioksessa tai kuivattuina aktiivisuuden häviämättä. Immobilisoidun rautaa sitovan koostumuksen 25 pitoisuus on riittävä saamaan aikaan käsitellyssä nesteessä tai kiinteässä aineessa olevien mikro-organismien olennainen inhibitio.

Kun rautaa sisältävät välineet saatetaan kosketukseen liukenemattoman matriksin kanssa, joka sisältää rau-30 taa sitovaa koostumusta substraattiin kytkettynä, rauta voidaan muuttaa kvantitatiivisesti vapaasta sidottuun muotoon, jossa se ei enää ole saatavilla mikrobien kasvua varten. Tämä kvantitatiivinen muuttuminen tapahtuu niin kauan, kun liukenemattomassa matriksissa on ylimäärin si-35 tomiskapasiteettia vapaaseen rautaan nähden eikä rauta

II

98879 27 kompleksoidu saavuttamattomissa olevaan muotoon, kuten helmiksi.

Raudan muuttumisesta liukenemattomaan muotoon on seurauksena, että vapaan raudan pitoisuus alenee merkit-5 tävästi mikrobien kasvun tarvitseman alarajan alapuolella. Niinpä kontaminoivien mikro-organismien kasvu väliaineessa, joka on kosketuksessa rautaa sitovan matriksin kanssa, vähenee verrattuna tilanteeseen, jossa väliainetta ei saateta kosketukseen tällaisen pinnan kanssa, ja säilyvyys 10 paranee vastaavasti. Näissä olosuhteissa ainoat tavat, joilla mikro-organismit pystyvät voittamaan inhibition, on rautaa sitovan matriksin hajoaminen tai rautaa sitovien aineiden (sideroforien) muodostuminen, joilla on suurempi sitoutumisvakio kuin matriksilla. Näissäkin tapauksissa 15 havaitaan olennainen viive ennen kasvun alkamista. Tämä pätee erityisesti viimeksi mainittuun tapaukseen liukenemattomien kompleksien kineettisen stabiiliuden ansiosta.

Säiliön 8 sisäpintoihin sidottu rautaa sitova koostumus sitoo ja immobilisoi rautaa nestemäisestä elintar-20 vikkeesta 22. Sitovaa proteiinia ja/tai ainetta, joka estää mikro-organismin metaboliaa, voidaan haluttaessa lisätä säiliön 8 joihinkin tai kaikkiin sisäpintoihin. Biosi-dinen aine voi olla hajottava entsyymi.

Suoritusmuotoa valaisevat seuraavat esimerkit I - 25 VI.

Esimerkki I

Tämä esimerkki valaisee rautaa sitovan koostumuksen immobilisointia lasihelmille.

Ferrikromi A puhdistettiin suoraan Ustilago sphero-30 gena -väliaineesta uudelleenkiteytyksellä.

Tämä rautaa kelatoiva aine sidottiin kovalenttises-ti lasiin raudalla kyllästetyssä muodossa, mikä suojaa raudansitomiskohtia.

40 mg uudelleenkiteytettyä ferrikromi A:ta liuo-35 tettiin asetoniin (40 ml), joka sisälsi 0,4 ml pyridiiniä.

• .

98879 28 Tähän lisättiin sitten 40 mg tosyylikloridia ja reaktio-seoksen annettiin sekoittua huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Tässä vaiheessa seokseen lisättiin 2 g aminopropyy-lisäädeltyjä huokoslasihelmiä ja reaktion annettiin edetä 5 vielä 4 tuntia. Väriltään punaisen ferrikromi A:n havaittiin tällöin liittyneen suurelta osin lasihelmiin. Reak-tioseos suodatettiin ja pestiin kahdesti asetonilla, kahdesti vedellä ja lopuksi vielä kahdesti asetonilla. Oranssinpunaisten helmien annettiin kuivua.

10 Esimerkki II

Esimerkin I mukaisella menettelyllä valmistetun immobilisoidun ferrikromi A -tuotteen arvioimiseksi eliminoitiin epäspesifinen tausta sitoutumattoman raudan kanssa esiintyvän reaktiivisuuden suhteen tämän esimerkin 15 mukaisella menettelyllä.

Ferrikromi A -lasihelmillä olevat reagoimattomat primaariset aminoryhmät suojattiin saattamalla ne reagoimaan etikkahappoanhydridin kanssa. 2 g ferrikromi A -lasi-helmiä suspendoitiin seokseen, joka sisälsi suhteessa 20 100:1 asetonia ja pyridiiniä (10 ml). Tähän seokseen li sättiin 2,73 ml etikkahappoanhydridiä ja reaktioseosta inkuboitiin vähintään 1 tunti. Helmet pestiin asetonilla, kahdesti vedellä ja vielä kahdesti asetonilla. Derivati-soidut helmet kuivattiin alipaineessa.

25 Esimerkki III

Tämä esimerkki valaisee menetelmää sidottua rautaa sisältävän rautaa sitovan koostumuksen regeneroimiseksi.

Sitoutunut rauta poistettiin immobilisoidusta ferrikromi A:sta suspendoimalla 1 g ferrikromi A -lasihelmiä 30 veteen (5 ml) ja lisäämällä 0,25 ml IM KSCN-liuosta ja 5 mg natriumditioniittia. Reaktioseoksen annettiin seistä vähintään tunnin ajan, jona aikana värin havaittiin häviävän lasihelmistä. Helmet, joista oli poistettu rauta,

(deferriferrikromi A -helmet) pestiin sitten kahdesti ve-35 dellä ja kahdesti asetonilla. Sitten deferriferrikromi A

II

98879 29 -helmet kuivattiin ja steriloitiin käsittelemällä 80-%:isella etanolilla.

Esimerkki IV

Tämä esimerkki valaisee bakteerien kasvun estämistä 5 tämän suoritusmuodon mukaisella menetelmällä.

Psykotrooppinen Pseudomonas fluorescens -kanta eristettiin pilaantuneesta maidosta. 103 CFU näitä soluja lisättiin 5 ml:n annoksiin alustaa, joka sisälsi 6 g Na2HP04:a, 3 g KH2P04:a, 0,5 g NaCl:a, 1 g NH4Cl:a, 2 g glu-10 koosia 0,002 mol/1 MgS04 ja 0,0001 mol/1 CaCl2:a. Alustan rautapitoisuuden määritettiin olevan 1,2 pmol/l. Samaan aikaan helmien lisäämisen kanssa joihinkin näytteisiin lisättiin 10 mg DFFA-derivatisoituja lasihelmiä ja joihinkin etikkahappoanhydridillä suojattuja aminopropyylilasi-15 helmiä. Näytteitä inkuboitiin lämpötilassa 11 eC ja kasvu arvioitiin määrittämällä CFU/ml-arvo maljalaskennalla eri aikoina. Tulokset osoittivat, että immobilisoidun rautaa kelatoivan aineen lisääminen esti merkittävästi bakteeri-solujen kasvua. Näissä näytteissä tapahtui lopulta kasvua 20 pidentyneen viiveen jälkeen.

Esimerkki V

Tämä esimerkki valaisee sitä, ettei de£errioksamii-ni B sovellu rautaa sitovaksi koostumukseksi keksinnön mukaisen menetelmän yhteydessä.

25 Deferrloksamiini B (Desferal™, Ciba-Geigy) kytket tiin agaroosihelmiin, jotka oli muunnettu CNBr:lla alalla tunnetulla tavalla. Kovalenttinen sitoutuminen tapahtui Desferalin primaarisen aminoryhmän ja agaroosihelmien välillä, ja rautaa kelatoiva aine säilytti raudansitomisky-30 kynsä määritettynä edellisissä esimerkeissä kuvattujen kanssa analogisin kokein. Tehtiin muuten samanlainen kasvatustutkimus kuin esimerkissä IV yksityiskohtaisesti kuvattu, mutta lisättiin vastaava määrä Desferal-agaroosia DFFA-lasihelmien sijasta. Kasvun estymistä ei havaittu 35 edes lisättäessä olennainen ylimäärä rautaa sitovaa mat- · 98879 30

riksia saatavilla olevaan rautamäärään nähden; niinpä bakteereilla oli kyky ottaa vastaan Desferal -agaroosiin sidottua rautaa joko suoran tai epäsuoran kilpailun kautta. Esimerkki VI

5 (Tämä esimerkki voitaisiin katsoa myös suoritusmu odon II piiriin kuuluvaksi.) Tämä esimerkki valaisee sitä, miten kasvualustassa olevat tertiaariset amiinit estävät Saccharomyces-hiivan kasvulle välttämättömien komponenttien saannin.

10 IRA-94:ä ja IRA-68:n (Rohm & Haas) inkuboitiin mo nia aineosia sisältävän alustan kanssa, joka sisälsi muutamia kasvutekijäyhdistelmiä; alusta sisälsi seuraavia aineosia.

Typpilähde 15 Ammoniumsulfaatti 3,5 g/1

Hiililähde

Sakkaroosi 5,0 g/1

Vitamiinit

Yhdistelmä 1 Biotiini 2,0 pg/l 20 Kalsiumpantotenaatti 400,0 pg/l

Foolihappo 2,0 pg/l

Yhdistelmä 2 Isositoli 2000,0 pg/l

Niasiini 400,0 pg/l p-aminobentsoehappo 200,0 pg/l 25 Yhdistelmä 3 Pyridoksiini HC1 400,0 pg/l

Riboflaviini 200,0 pg/l

Tiamiini HC1 400,0 pg/l

Hivenaineet

Yhdistelmä 4 Boorihappo 500,0 pg/l 30 Kuparisulfaatti 40,0 pg/l

Kaliumjodidi 100,0 pg/l *

Yhdistelmä 5 Mangaanisulfaatti 400,0 pg/l

Natriummolybdaatti 200,0 pg/l

Sinkkisulfaatti 400,0 pg/l 35 Rautakloridi 200,0 pg/l li 98879 31

Suolat

Yksiemäksinen kaliumfosfaatti 1,0 g/1

Magnesiumsulfaatti 0,5 g/1

Natriumkloridi 0,1 g/1 5 Kalsiumkloridi 0,1 g/1

Kun alusta oli ollut 48 tuntia kosketuksessa IRA-68:n tai IRA-94:n kanssa, käsitelty alusta inokuloitiin Saccharomyces-soluilla. lRA-94-helmlllä käsitelty alusta ei edistänyt kasvua, kun taas lRA-68-helmlllä käsitellyssä 10 alustassa esiintyi käsittelemättömän alustan kanssa vertailukelpoista kasvua. lRA-94:llä käsitelty alusta ei edistänyt Saccharomyces-solujen kasvua, kun kaikki ravin-toaineyhdistelmät lisättiin takaisin samanaikaisesti.

Tällä menetelmällä on seuraavat edut: 15 A) Aktiiviset aineet on helppo sitoa matriksiin joko passiivisesti tai aktiivisesti (kovalenttisesti) kemiallisella käsittelyllä.

B) Matriksi voi olla polymeeriä, lasia, ruostumatonta terästä jne.

20 C) Käytetään pelkästään myrkyttömiä, elintarvikkei den kanssa yhteensopivia materiaaleja.

D) Aktiivisten aineiden ja matriksimateriaalien siirtyminen käsitteltävään materiaaliin on mitätöntä.

E) Elintarvikkeen organoleptiset ja ravitsemuksel- 25 liset ominaisuudet säilyvät ennallaan.

F) Saadaan aikaan aktiivisia, affiniteettiin perustuvia solujen ja kasvutekijöiden poistojärjestelmiä, jotka jättävät muut rakenneosat koskemattomiksi ja vahingoittumattomiksi .

30 G) Järjestelmät perustuvat biologisiin ilmiöihin.

H) On käytettävissä spesifinen ja epäspesifinen affiniteetti suoritusmuotojen 1 ja II yhteydessä kuvatulla tavalla.

I) Aktiivisten aineiden regenerolnti on mahdollista 35 suoritusmuotojen I ja III yhteydessä.

98879 32 J) Tarjotaan käyttöön aktiivisia mikrobiologisia säätelyjärjestelmiä mikrobiologisen tilanteen stabiloimi-seksi säiliöiden täytön jälkeen.

Teollinen käyttökelpoisuus 5 Keksinnön mukaiset suoritusmuodot ovat käyttökel poisia teollisuuden eri aloilla, erityisesti pakkausalalla.

Il

Claims (12)

98879 33

1. Menetelmä monimutkaisen eli monia aineosia sisältävän väliaineen muodossa olevan, nesteen käsittävän 5 pakatun tuotteen (22) sisältämien mikro-organismien kasvun säätelemiseksi, jossa menetelmässä tuote (22) saatetaan kosketukseen pakkausmateriaalin (8) pinnassa (10, 12, 14, 16. olevan, olennaisilta osiltaan liukenemattoman, immobi-lisoidun, kasvua ehkäisevän aktiivisuuden omaavan aineen 10 kanssa, jolla aineella on sellainen koostumus, että se on aktiivinen mainitun pakatun tuotteen (22) suhteen, tunnettu siitä, että valitaan kasvua ehkäisevän aktiivisuuden omaavaksi aineeksi aine, joka ei ole entsyymi, ja jonka aktiivisuus ei oleellisesti esty pakatun tuotteen 15 (22) jonkun komponentin vaikutuksesta, ja että aktiivi suutta edistetään aikaansaamalla suhteellinen liike pakatun tuotteen (22) ja aktiivisen aineen välillä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aktiivinen aine valitaan ryhmästä, 20 joka käsittää lektiinit, polysakkaridit, vasta-aineet, metallia kelatoivat yhdisteet ja amiinin sisältävät yhdisteet.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aktiivinen aine on sitova 25 aine, jolla on korkea sitomisaffiniteetti pakatun tuotteen (22) tiettyjen komponenttien suhteen ja joka siten sitoo näitä komponentteja, mutta vähäinen sitomisaffiniteetti tuotteessa (22) olevien muiden komponenttien suhteen, jotka muut komponentit siten eivät estä mainittujen tiettyjen 30 komponenttien sitoutumista.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut tietyt komponentit ovat tuotteen sisältämät mikro-organismit.

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai-35 nen menetelmä, tunnettu siitä, että aktiivinen 98879 34 aine käsittää amiinin sisältävän yhdisteen, joka amiini on mainitussa tuotteessa (22) oleville mikro-organismeille saatavissa ja kykenee aiheuttamaan niille riittävästi vahinkoa niiden kasvun estämiseksi tuotteessa (22).

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että aktiivinen aine käsittää sitovan yhdistelmän muodossa olevan sitovan aineen, jolla yhdistelmällä on affiniteetti vähintään yhdelle sellaiselle hivenainemetallille, joka toimii tuot-10 teessä (22) olevien mikro-organismien biologisena kasvutekijänä, ja jolla yhdistelmällä on sellainen sitoutumisva-kio ja kineettinen stabiilisuus, että tapahtuu riittävä hivenainemetallin (metallien) sitoutuminen ja että se siten menestyksellisesti kilpailee mikro-organismien kanssa 15 ja pidättää sitoutuneen hivenainemetallin (sitoutuneet hivenaineimetallit), ja siten rajoittaa hivenainemetallin (metallien) saatavuutta mikro-organismeille.

7. Pakkausmateriaali (8), jonka pinnalla (10, 12, 14, 16) on käytännöllisesti katsoen liukenematon, immobi- 20 lisoitu, kasvua ehkäisevä aine, jotta saataisiin kosketus kompleksisen väliaineen muodossa olevaan, nesteen käsittävään tuotteeseen (22), mainitun aineen ollessa yhdistelmä, joka on aktiivinen tuotteeseen (22) nähden estäen tuotteessa (22) olevien mikro-organismien kasvu, tunnet-25 t u siitä, että kasvua ehkäisevän vaikutuksen omaavan aineen, joka ei ole entsyymi, aktiivisuus ei oleellisesti esty jonkin tuotteessa (22) olevan komponentin vuoksi.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen pakkausmateriaali, tunnettu siitä, että aktiivinen aine on valit- 30 tu ryhmästä, joka käsittää lektiinit, polysakkaridit, vasta-aineet, metallia kelatoivat yhdisteet ja amiinin sisältävät yhdisteet.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen pakkausmateriaali, tunnettu siitä, että aktiivinen aine 35 käsittää amiinin sisältävän yhdisteen, jossa amiini on mainitussa tuotteessa (22) oleville mikro-organismeille li 98879 35 saatavilla ja kykenee aiheuttamaan niille riittävästi vahinkoa niiden kasvun estämiseksi tuotteessa (22).

10. Patenttivaatimuksen 7, 8 tai 9 mukainen pakkausmateriaali (8), tunnettu siitä, että aktiivi- 5 nen aine käsittää sitovan yhdistelmän muodossa olevan sitovan aineen, jolla yhdistelmällä on affiniteetti vähintään yhdelle sellaiselle hivenainemetallille, joka toimii biologisena kasvutekijänä, ja jolla yhdistelmällä on sellainen sitoutumisvakio ja sellainen kineettinen stabiili-10 suus mainitun metallin (mainittujen metallien) sitomiseksi, joka on riittävä, jotta sitova yhdistelmä pystyisi tehokkaasti kilpailemaan mainitusta metallista (mainituista metalleista) mikro-organismien kanssa ja pidättämään metallin (metallit) täten rajoittaen tämän (näiden) saata-15 vuutta mikro-organismeille.

11. Patenttivaatimuksen 7, 8, 9 tai 10 mukainen pakkausmateriaali, tunnettu siitä, että sen pinnassa myös on biosidinen aine, joka soveltuu mikro-organismien inaktivoimiseksi.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen pakkausmate riaali, tunnettu siltä, että biosidinen aine on hajottava entsyymi. 98879 36