NO176664B - Fremgangsmåte ved fremstilling av tripeptidaldehyder - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedret fremgangsmåte ved fremstilling av tripeptidaldehyder med formel I:

hvor

R representerer hydrogen eller metyl

Phe står for en fenylalaningruppe

Pro er en L-prolingruppe og

Arg står for en L-arginingruppe,

i en renhet som er passende for farmasøytiske anvendelser, hvor fremgangsmåten omfatter de trekk som er angitt i krav l's ingress og hvor den ytterligere omfatter de trekk som er angitt i krav l's karakteriserende del.

[forkortelsene for L-prolin og L-arginin som Pro og Arg er i overensstemmelse med kjent teknikk, f .eks. Biochem. 7, 126, 773 (1972), Biochemistry 14, 449 (1975)].

Det er kjent at salter av D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd (H-D-Phe-Pro-Arg-H) utviser signifikant antithromin aktivitet. Acetatsaltet beskrevet i ungarsk patent 169.870 er imidlertid ikke passende for farmasøytisk anvendelse fordi det mister sin aktivitet meget raskt både i fast form og i form av en vandig løsning. Det samme fenomenet kan observeres i tilfellet med hydroklorid, citrat, tartrat, tosylatsalter og NG<->karboksyderivater av tripeptidaldehyd. Sulfatsaltet av H-D-Phe-Pro-Arg-H og N-metylderivatet derav er imidlertid meget stabilt selv i form av vandige løsninger (Britisk patent 2.091.270 og europeisk patent 185.390, og de er derfor egnet for terapeutisk anvendelse.

Sulfatsaltene over kan fremstilles som følger:

1. Sulfatsaltet av H-D-Phe-Pro-Arg-H kan fremstilles i henhold til britisk patent nr. 2.091.270 fra t-butoksykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd-hemisulfat eller fra t-butoksykarbonyl-D-f enylalanyl-L-prolyl-NG-karboksy-L-argininaldehyd i nærvær av 1 til 12 ekvivalenter av 1 til 12N vandig svovelsyre ved temperaturer mellom 40 til 60 °C. (Fremstillingen av det første utgangsmaterialet er beskrevet i eksempel 1 i det nevnte patentskriftet, mens fremstillingen av det beskyttede NG<->karboksyderivatet er beskrevet i Belgisk patent 880.844) . 2. Sulfatsaltet av H-D-Phe-Pro-Arg-H kan videre fremstilles i henhold til den nevnte beskrivelse ved hydrogenolyse av benzyloksykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-NG<->bensyloksykarbo-nyl-L-argininaldehyd (Z-D-Phe-Pro-Arg/Z/-H) i nærvær av en ekvivalent molar mengde av svovelsyre. (Fremstillingen av dobbelt-beskyttet tripeptid aldehyd som brukes som utgangsmateriale er beskrevet i ungarsk patent nr. 169.870). 3. I henhold til europeisk patent nr. 185.390 blir N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat (H-D-MePhe-Pro-Arg-H.H2S04) fremstilt på lignende måte til det frie tripep-tidaldehydsulfate ved å fjerne de beskyttende gruppene fra N-benzyloksykarbonyl-N-metyl-D-f enylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloksykarbonyl-L-argininaldehyd ved hydrogenolyse i nærvær av svovelsyre (fremstilling av tripeptidaldehydutgangs-materialet er også beskrevet i samme patent).

Den største ulempen med fremgangsmåtene beskrevet over, spesielt når produksjonen utføres i industriell skala, er at de ikke resulterer i produkter med passende renhet.

Produktet erholdt i fremgangsmåte 1 inneholder f.eks. 4 til 6% kalsiumsulfat. På basis av tynnsjiktkromatografisk analyse kan det erholdte produktet inneholde mer enn ca. 10% andre urenheter (f.eks. tripeptidalkohol, -syre, -acetal) i tillegg til kalsiumsalt, og dette betyr at den totale mengden av forurensende substanser kan overstige 20%. En annen ulempe med denne fremgangsmåten ligger i at nøytraliseringen av svovelsyre og filtrering av utfelt kalsiumsulfat medfører

ytterligere vanskeligheter.

Tripeptidaldehyd-sulfatsaltet fremstilt ved fremgangsmåte nummer 2 (hydrogenolyse) omfatter, i tillegg til 5 til 10% forurensninger detekterbare med tynnsjiktkromatografisk analyse, videre 10 til 15% tripeptidaldehydsulfat med D-L-D konfigurasjon i henhold til HPLC-analyse, og dermed kan det dannes totalt 15 til 25% forurensende biprodukter. De nevnte 5 til 10% av forurensningene består av følgende forbindelser: tripeptidsyre danner under syntesen av tripeptidaldehyd, tripeptidalkohol, et syklisk dekomponeringsprodukt som er beskrevet i europeisk patent 185.390 og en forbindelse med ukjent struktur som dannes i ulike mengder som er plassert rett under den ønskede forbindelsen i kromatogrammet.

Det er observert at "over-hydratisering" spiller en viktig rolle i produksjon av det siste biproduktet, Dersom hydrogenolysen utføres på en kjent måte, dvs. i nærvær av1molar ekvivalent svovelsyre ved romtemperatur og prosessen fortset-ter etter at hydrogenolysen er fullstendig, vil en ekstra flekk (Rf = 0,39 - 0.44) tilsvarende en forurensning alltid dukke opp under flekken til produktet (i tilfellet med H-D-Phe-Pro-Arg-H.H2S04, Rf = 0,52 - 0,57) på tynnsjiktkromato-grammet (adsorbent : kiselgel G, eluent : 25:20:6:11 blanding av etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann, fremkaller : klortolui-din) hvor forurensningen, i enkelte tilfeller, representerer den største urenheten.

For å eliminere denne forurensningen må reaksjonens endepunkt bestemmes meget nøyaktig og reaksjonen må stoppes når endepunktet nås.

Når reaksjonens endepunkt er bestemt ved tynnsjiktkromatografi, og analysen krever 20 til 30 minutter dersom eluentblandingen over brukes, kan ikke reaksjonen stoppes ved endepunktet, spesielt ved industrielle betingelser. Biproduktet med den tidligere definerte Rf-verdien blir generelt produ- sert i ca. 3 til 4% på grunn av "overhydratisering". Dette biproduktet er mer toksisk enn sluttproduktet, og det må også fjernes av denne årsak.

Produktet er meget utsatt for racemisering og de forurensende forbindelsene som er dannet i løpet av de beskrevne proses-sene kan ikke fjernes i praksis. Siden sluttproduktet ikke kan renses, for å erholde et sluttprodukt med en renhet som er passende for farmasøytisk bruk, må produksjonen av intermediatene med passende renhet og undertrykkelse av biprodukt-dannelsen kunne løses. Dette betyr inhibering av racemisering under prosessen.

Målet med foreliggende oppfinnelse er å komme frem til en fremgangsmåte som muliggjør undertrykkelse av dannelse av de nevnte biprodukter og fremstilling av tripeptidaldehydsalter med formel I med en renhet på minst 5%.

Oppfinnelsen er basert på at dannelsen av D-L-D produktet, dvs. racemiseringen, er meget påvirket av pH. I et medium med en pH større enn 7 og selv i nøytrale medier vil sluttproduktet og intermediatene undergå racemisering. I et surt medium (pH = 2) vil sluttproduktet være stabilt i flere måneder. Det må derfor finnes en teknologi som sikrer at pH i reaksjonsblandingen ikke blir nøytral eller basisk, selv ikke for en kort tid. For å oppnå dette målet må arginin-laktam frigjøres fra sitt salt in situ under kondensasjon av det blandede anhydridet av NG<->bensyloksykarbonyl-L-arginin-laktam hydroklorid med formel IV :

- hvor Arg er det samme som tidligere definert og Z betyr benzyloksykarbonyl - og dipeptidet med formel V: - hvor R, Phe og Pro er som tidligere definert og Z er som beskrevet over - på en slik måte at basen deretter tilsettes til reaksjonsblandingen. Under slike betingelser reagerer arginin-laktam som er frigjort in situ med en gang, in situ nascendi, med det blandede anhydridet til det korresponder-ende beskyttede tripeptid-laktamet med formel III : - hvor Z, R, Phe, Pro og Arg er som tidligere definert - og dermed kan dannelsen av et basisk medium som resulterer i racemisering unngås.

Videre er oppfinnelsen basert på at dersom komplekset som dannes med litiumaluminiumhydrid, erholdt under reduksjonen av det beskyttede tripeptid-laktamet med formel III erholdt som beskrevet over, dekomponeneres på en slik måte at reak-sjonsmediet blir tilsatt til fortynnet, fortrinnsvis 1 N, kald (0-5 °C) svovelsyre i overskudd, i motsetning til europeisk patent nr. 185.390 hvor svovelsyren tilsettes til reaksjonsblandingen, kan den sure pH i reaksjonsblandingen sikres. Dermed kan racemisering av det beskyttede tripeptidaldehydet unngås eller reduseres i betydelig grad.

Oppfinnelsen er videre basert på at hydrogenolysen av tripeptidaldehydet med formel II fremstilt som beskrevet over må utføres i nærvær av et overskudd av svovelsyre ved lav temperatur, under 10"C og fortrinnsvis ved 6 til 8°C.

I henhold til våre forsøksresultater, hvor hydrogenolysen av Z-D-Phe-Pro-Arg(Z)-H utføres ved forskjellige temperaturer i nærvær av 1 molar ekvivalent svovelsyre, er de detekterbare forurensningene ved tynnsjiktkromatografisk analyse av det erholdte produktet som følger : 17% ved 40°C, 10% ved romtemperatur (20 - 25°C). 4% ved 6 til 10°C. Innholdet av D-L-D isomer i produktet var henholdsvis 29, 15 og 6 til 7%. Dette betyr at dersom hydrogenolysen utføres ved lavere temperatur vil mengden av biprodukter bli vesentlig redusert, mens den nødvendige tiden for hydrogenolysen ikke vil øke merkbart ved lavere temperaturer.

Dersom hydrogenolysen utføres ved lavere temperaturer i nærvær av et overskudd av svovelsyre, vil det oppnås en stor fordel ved at dannelsen av biproduktet med en Rf på 0,39- 0,44 kan undertrykkes i betydelig grad, og det er heller ikke nødvendig å detektere reaksjonens endepunkt eksakt. I henhold til våre forsøk dersom hydrogenolysen av Z-D-Phe-Pro-Arg (Z) -H utføres i nærvær av 1,5 til 1,7 molekvivalenter svovelsyre i tetrahydrofuran ved temperaturer på 6 til 8°C, vil mengden av biprodukt med den nevnte Rf bare dannes i spormengder selv etter 1 times "overhydratisering".

Det er foretrukket å bruke svovelsyre i alle trinnene i prosessen fordi bruk av f.eks. saltsyre vil medføre at sulfatsaltet blir forurenset av kloridioner.

Som et resultat av at reaksjonene utføres som beskrevet over, vil mengden av D-L-D isomer i sluttproduktet med formel I høyden være 2 til 4% mens de andre forurensningene (tripeptidsyre og alkohol) dannes i mengder på under 1%.

Basert på beskrivelsen over, vedrører oppfinnelsen en forbedret fremgangsmåte ved fremstilling av tripeptidaldehyder med formel I, hvor R, Phe, Pro og Arg er samme som tidligere definert, i farmasøytisk ren form, ved kondensasjon av et laktam med formel IV, hvor Arg er samme som tidligere definert og Z står for benzyloksykarbonyl, med et dipeptid med formel V, hvor R, Z, Phe og Pro er som tidligere definert, via et blandet anhydrid, redusere tripeptid-laktamet med formel II med litiumaluminiumhydrid og hydrogenolysere det erholdte beskyttede tripeptidaldehydet med formel II, i nærvær av svovelsyre, som omfatter : a,) frigjøre det NG<->beskyttede L-argininlaktamet in situ under kondensasjon av NG<->beskyttet L-argininlaktamhydroklorid med formel IV, hvor Z er som definert, og dipeptidet med formel V, hvor R, Z, Phe og Pro er som tidligere definert, til et blandet anhydrid i reaksjonsblandingen ved etterfølgende tilsetting av en base til blandingen av reaksjonskomponenter, deretter redusere det nettopp erholdte beskyttede tripeptid-laktamet med formel II, hvor R, Z, Phe, Pro og Arg er som tidligere definert, dekomponere det erholdte komplekset ved å tilsette reaksjonsblandingen til et overskudd av 1 N svovelsyre ved en temperatur på 0 til 5°C, utføre hydrogenolyse av det beskyttede tripeptidet med formel II, hvor R, Z, Phe, Pro og Arg er som tidligere definert, ved en temperatur lavere enn 10°C i nærvær av 1 til 2 molekvivalenter svovelsyre eller

a2) etter reduksjon av det erholdte beskyttede tripeptid-laktamet med formel III, hvor R, Z, Phe, Pro og Arg er som tidligere definert, dekomponere det dannede komplekset ved å tilsette reaksjonsblandingen til et overskudd av 1 N svovelsyre ved en temperatur på 0 til 5°C, utføre hydrogenolysen av det dannede beskyttede tripeptidet med formel II, hvor R, Z, Pro, Phe og Arg er som tidligere definert, ved en temperatur under 10 °C i nærvær av 1 til 2 molekvivalenter svovelsyre eller

a3) utføre hydrogenolysen av det beskyttede tripeptidet med formel II, hvor R, Z, Phe, Pro og Arg er som tidligere definert, ved en temperatur lavere enn 10°C i nærvær av 1 til 2 molekvivalenter svovelsyre.

I henhold til foreliggende oppfinnelse utføres reaksjonen fortrinnsvis som følger : Fra t-butoksykarbonyl-NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininlaktam blir den beskyttende t-butoksykarbonylgruppen fjernet på en kjent måte. NG<->bensyloksykarbonyl-L-argininlaktamhydroklori-det med formel IV som er dannet holdes i en dimetylformamid-løsning ved en temperatur på -15 til -20°C, deretter blir denne løsning tilsatt til det dannede anhydridet dannet fra dipeptidet med formel V (bensyloksykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolin eller N-metyl-N-bensyloksykarbonyl-D-fenylalanyl-L- prolin) og klorkarbonsyre-isobutylester. Basen, fortrinnsvis trimetylamin, blir deretter tilsatt til reaksjonsblandingen. Under disse betingelsene vil laktamet, som frigjøres in situ på grunn av basens virkning, reagere umiddelbart med det blandede anhydridet og danne et beskyttet tripeptidlaktam og dermed kan dannelsen av det basiske mediet som medfører racemisering unngås. Om ønskelig kan det erholdte produktet renses ved rask filtrering gjennom et sjikt av silikagel. Ved å velge den beskrevne operasjonssekvensen, som er forskjellig fra kjent teknikk, er det ikke behov for kostbar rensing av det beskyttede tripeptidlaktamet ved kolonnekromatografi.

Det beskyttede tripeptidlaktamet med formel III er erholdt, reduseres med litiumaluminiumhydrid i tørr tetrahydrofuran. Det erholdte komplekset dekomponeres, i motsetning til europeisk patent nr, 185.390, ved å tilsette reaksjonsblandingen til fortynnet, fortrinnsvis 1 N, svovelsyre som brukes i overskudd under avkjøling til 2 til 4°C. Den endelige pH verdien på 2 til 3 justeres ved eventuell tilsetting av svovelsyre. Reaksjonsblandingen blir deretter opparbeidet ved kjente metoder. Det beskyttede tripeptidaldehydet med formel II renses ved filtrering gjennom et sjikt av silikagel. Hydrogenolysen utføres fortrinnsvis i et polart organisk løsningsmiddel, fortrinnsvis tetrahydrofuran eller lavere alkanol, f.eks. metanol, etanol, iso-propanol, fortrinnsvis i etanol. Det er foretrukket at hydrogenolysen ikke utføres i et lukket system, men ved gjennombobling av hydrogen gjennom reaksjonsblandingen. I praksis er hydrogengassen som bobles gjennom systemet i en finfordelt form som kan erholdes f.eks. ved å føre gassen gjennom et G2-filter.

I henhold til en foretrukket utførelsesform av prosessen blir det beskyttede tripeptidaldehydet med formel II av passende renhet oppløst i tetrahydrofuran og denne løsningen blir tilsatt til en avkjølt vandig katalysatorsuspensjon bestående av 1,5 til 1,7 molekvivalenter 1 N svovelsyre. Forholdet mellom organisk løsningsmiddel og vandig fraksjon er 70-50: 30-50, fortrinnsvis 60:40. Som katalysator brukes fortrinnsvis 10-30 vekt-% 10% palladium på kull eller platina. Hydrogeneringen utføres under avkjøling til 6 - 8°C ved bobling av finfordelt hydrogen gjennom systemet. Reaksjonens forløp kan følges ved tynnsjiktkromatografi.

I henhold til en annen foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten blir det beskyttede tripeptidaldehydet som brukes som utgangsprodukt oppløst i tetrahydrofuran og en katalysator inneholdende 10% palladium utfelt på bariumsulfatalumi-nium-oksidbærer, fortrinnsvis bariumsulfatbærer, brukt som katalysator.

Hydrogeneringen utføres ved 6 til 8 ° C i nærvær av 1,5 molekvivalenter 1 N svovelsyre ved bobling av finfordelt hydrogen gjennom systemet. Fullstendigheten av reaksjonen kan følges ved tynnsjiktkromatografi.

I henhold til en foretrukket utførelsesf orm av fremgangsmåten i oppfinnelsen, blir det beskyttede tripeptidet som brukes som utgangsmateriale oppløst i etanol, deretter blir denne løsning tilsatt til en avkjølt vandig suspensjon inneholdende 10% palladium på kullkatalysator og 1 molekvivalent 1 N svovelsyre. Hydrogeneringen utføres ved en temperatur på mellom6til 8°C ved å boble finfordelt hydrogen gjennom systemet og prosessen følges ved tynnsjiktkromatografi.

Produktet kan enkelt gjenvinnes fra reaksjonsblandingen ved å filtrere fra katalysatoren og fordampe det organiske løsningsmidlet fra den vandig-organiske løsningen ved en temperatur under 40°C, fortrinnsvis 25 - 30°C, og deretter frysetørke den vandige løsningen enten direkte eller etter å ha justert pH til ca. 4. pH justeres fortrinnsvis ved å bruke en ionebytter-masse av hydroksyfase eller ved å bruke 0,1 N svovelsyre.

Når prosessen i henhold til oppfinnelsen utføres i en pilot plant, er maksimal forurensning av det erholdte produktet (D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydsulfat og N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat) som er detekterbart med tynnsjiktkromatografi maksimalt 1%, mens innholdet av D-L-D isomer som er detekterbart med HPLC er maksimalt 2 til4%. Den totale mengden av urenheter kan dermed reduseres til ca. 3 til 5%, som er i henhold til kravene som stilles til farmasøytiske substanser, i motsetning til kjente proses-ser med urenheter på 15 til 25%.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse vil bli nærmere illustrert med de etterfølgende, ikke-begrensende eksempler.

Rf-verdiene ble bestemt ved tynnsjiktkromatografi på silikagel (Kieselgel G, Reanal, Budapest) ved å bruke en eluent-blanding som er gitt i eksemplene. Fremkallingen ble utført ved at de klorerte kromatografiske platene ble behandlet med o-toluidinløsning (2,5 g o-toluidin og 10 ml eddiksyre løst i 500 ml vann) etter tørking.

EKSEMPEL 1.

Fremstilling av D-fenylalanyl-L-propyl-L-argininaldehydsul-fat.

201 g (0,3 mol) benzyloksykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininaldehyd ble løst i 2 liter tetrahydrofuran ved romtemperatur. Samtidig ble 60 g 10% palladium på kull suspendert i 0,6 liter ionebyttet vann, deretter tilsatt 1 N svovelsyre (0.45 mol). Suspensjonen inneholdende katalysatoren avkjøles til en temperatur på 2 til 5°C og tetrahydrofuranløsningen av det beskyttede tripeptidaldehydet og 0,2 liter ionebyttet vann ble tilsatt under røring. Deretter ble hydrogen boblet gjennom løsningen og temperaturen ble holdt på 6 - 8°C under fortsatt røring.

Reaksjonens forløp ble fulgt ved tynnsjiktkromatografi ved å bruke en 60:20:6:11 løsning av etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann som elueringsmiddel. (Rf-verdiene til utgangsmaterialet, mellomproduktet og sluttproduktet er henholdsvis 0,92-0,96, 0,38-0,44 og 0,1-0,10).

Reaksjonen er ferdig innen 3-4 timer. Ved slutten av reaksjonen ble katalysatoren filtrert fra og vasket med 3 x 100 ml ionebyttet vann. Filtratet og vaskevannet blandes, deretter destilleres tetrahydrofuran av i en rotavapor under vakuum ved 25 - 30°C.

Den resterende vandige løsningen ekstraheres med 2 x 3 00 ml diklormetan og pH i den vandige fasen justeres. Dersom pH er forskjellig fra 4, blir pH justert til 4 med 0,1 N svovelsyre eller ved en OH-ionebyttermasse (f.eks. Ag1x 2).

Volumet av løsningen blir justert til 1,5 liter ved tilsetting av ionebyttet vann og løsningen frysetørkes. Det erholdes 125 g (83,2%) av det ønskede produktet,

Rf = 0.52 - 0.57 (etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann = 25:20:6:11).

[a]<20>D= -117 ° (c = 1, vann)

Total mengde urenheter i h.h.t. tynnsjiktkromatografi : 3 - 5%, mens D-L-D isomerinnholdet ved HPLC er ca. 2-3%.

Benzyloksykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N<9->benzyloksykarbonyl-L-argininaldehyd som ble brukt som utgangsmateriale, ble fremstilt som følger : Trinn 1: Benzyloksykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininlaktam.

429,5 g (1,1 mol) t-butoksykarbonyl-NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininlaktam (europeisk patentsøknad 185.390) blir suspendert i 1300 ml tørr kloroform. Deretter blir 1300 ml 189 g/100 ml (ca. 5 N) saltsur etylacetat tilsatt dråpevis under røring og avkjøling med isvann, med en hastighet som gjør det mulig å unngå økning av temperaturen til over 15°C. I løpet av en kort tid starter utskilling og utfelling av en krystal-linsk substans. Suspensjonen røres ved romtemperatur i 3 timer, deretter fortynnes med 3000 ml tørket 1:1 løsning av eter og etylacetat. Det utfelte krystallinske stoffet filtreres fra, vaskes med 2 x 1000 ml aceton og 500 ml eter, tørkes så over fast kaliumhydroksid og fosforpentoksid i en vakuumeksikator.

Etter tørking i ca. 1 time blir NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininlaktam-hydrokloridet oppløst i 1000 ml tørr dimetylformamid, avkjølt til -15 til -20"C og tilsatt til et blandet anhydrid fremstilt som følger :396 g (1 mol) N-benzyloksykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolin (Nicolaides, E et al: J.Med.Chem..11, 74 (1968) og europeisk patentsøknad nr, 185.396) blir oppløst i 1000 ml anhydrøs dimetylformamid og 11 ml (1 mol) N-metylmorfolin tilsettes. Blandingen avkjøles til -15 til -20°C, og 132 ml (1 mol) klorkarbonsyreisobutylester tilsettes dråpevis med samme temperatur under røring i løpet av 3 - 5 minutter. Det blandede anhydridet avkjøles til -20 til -25°C etter 10 minutters røring og blandes med dimetylformamid-løsningen av NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininlaktamhydroklorid erholdt over. Deretter blir 308 ml ( 2.2 mol) trietylamin tilsatt dråpevis til reaksjonsblandingen ved samme temperatur i løpet av ca. 30 minutter, deretter blir suspensjonen rørt videre i 1 time ved -20 til -25°C. pH i dampfasen kontrolleres med vått pH-papir: dersom pH faller til under 8, blir det tilsatt mer trietylamin. Blandingen fortynnes deretter med 2 liter benzen og de utfelte saltene filtreres fra og vaskes med 2 x 500 ml benzen.

Til benzendimetylfiltratet tilsette 1,5 1 vann og fasene separeres. Den vandige dimetylformamids nedre fase ekstraheres med 2 x 500 ml benzen. De samlede benzenløsningene vaskes med 2 x 0,5 1 vann, 1 x 0,5 1 0.1 N svovelsyre og deretter 3x0,51 vann og tørkes over vannfri natriumsulfat og inndampes til 2 liter under vakuum ved maksimalt 40"C.

360 g kiselgel-G suspenderes i benzen og det dannes et filtersjikt, hvor forholdet mellom diameter og høyde er 8:1 til 4:1. Benzenløsningen suges gjennom sjiktet ved et lite vakuum og filtersjiktet vaskes med 4,8 1 benzen på samme måte. De samlede benzenløsningene blir konsentrert til ca. 600 ml under vakuum ved maksimalt 40°C og deretter tilsettes31 diisopropyleter under kraftig røring.

Det utfelte stoffet filtreres fra, vaskes med 2 x 600 ml diisopropyleter og tørkes i vakuumeksikator over fosforpentoksid og paraf inbiter. Det erholdes 510 g (76%) av den ønskede forbindelsen. Det totale innholdet av forurensninger bestemt ved tynnsjiktkromatografi er 1-2%.

Rf = 0,55 - 0,65 (etylacetat)

(Rf-verdiene av D-L-D laktam er 0,45-0,50 i etylacetat).

[a]<20>D= -55,8 ° (c = 1, tetrahydrofuran)

Trinn 2: Benzyloksykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininaldehyd. 3 00 mg (0,45 mol) beskyttet tripeptidlaktam (eksempel 1, trinn 1) løses i 2,5 liter vannfri tetrahydrofuran avkjølt til -5°C. Løsningen avkjøles til -2 0 til -25°C i et tørris/ acetonbad og en løsning av litiumaluminiumhydrid og tetrahydrofuran med en konsentrasjon på 0,7 mol/l, tilsvarende 0,375 mol litiumaluminiumhydrid, tilsettes under kraftig røring i løpet av 20-25 minutter. Reduksjonens forløp følges ved tynnsjiktkromatografi ved å bruke en 240:20:6:11 blanding av etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann som elueringsmiddel. Dersom det er nødvendig kan det tilsettes mer litiumaluminiumhydrid inntil flekken med en Rf-verdi på 0,75 - 0,80, tilsvarende laktam, opptrer.

Når reaksjonen er ferdig, blir reaksjonsblandingen porsjonsvis helt opp i 3 liter 1 N svovelsyre ved 2 - 3°C under rør-ing. Den endelige pH-verdien justeres eventuelt ved tilsetting av mer svovelsyre. Vann tilsettes løsningen til den blir uklar, og deretter ekstraheres den med 3 x 0,9 1 n-heksan. Mellom to ekstraksjoner vil materialet separeres som en olje-aktig fase, og derfor blir den homogenisert med tetrahydrofuran, deretter opakisert ved å tilsette litt vann. Den vandige fasen ekstraheres med 2x2 liter diklormetan. De samlede diklormetanfraksjonene vaskes med 2x0,515% natriumhydrogenkarbonat ved 4 - 8°C, deretter 2 x 0,5 1 destillert vann ved4til 8°C, tørket over vannfri natriumsulfat og inndampet under vakuum ved maksimalt 40°C. (Det erholdes ca. 300 g av den oljeaktige substansen).

Den oljeaktige resten oppløses i en 7:3 blanding av diklormetan og aceton, føres gjennom et filtersjikt (diameter:høyde = 5:1) fremstilt av 900 g kiselgel-60 ved å bruke en 7:3 blanding av diklormetan og aceton som elueringsmiddel, ved suging. Filtersjiktet vaskes deretter med 6 1 av den samme eluentblandingen. Prosessen må ikke vare lenger enn 20 minutter. De kombinerte filtratene inndampes til ca. 600 ml under 40°C, deretter blir 1 1 benzen tilsatt og løsningen dampes inn igjen. Produktet utfelles ved tilsetting av 1.6 liter cykloheksan under røring. Bunnfallet filtreres av, vaskes med 2 x 0,3 1 cykloheksan og tørkes under vakuum i eksikator ved romtemperatur over parafinbiter. Det erholdes 240 g (79.7%) av det ønskede produktet.

Rf = 0,52 - 0,62 (etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann = 240:20:6:11)

Innhold av urenheter i h.h.t. tynnsjiktkromatografi:0,5 -2%.

[cc]20D = -0,8°C (c = 1, tetrahydrofuran).

EKSEMPEL 2.

Fremstilling av D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat. 2 0,1 g (0,03 mol) bensyloksykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininaldehyd løses i 214 ml tetrahydrofuran og løsningen avkjøles til 0°C. 4,3 g palladium-på-kull-katalysator suspenderes i 70 ml ionebyttet vann og 102 ml 1 N svovelsyre (0,051 mol) tilsettes.

Katalysatorsuspensjonen avkjøles til 2 - 5°C og luften fjernes med nitrogengass. Tetrahydrofuranløsningen over tilsettes til suspensjonen under røring og finfordelt hydrogen bobles gjennom systemet. Temperaturen holdes mellom 6 og 8°C ved avkjøling med is. Reaksjonsforløpet kontrolleres ved tynnsjiktkromatografi og samme elueringsmiddel som i eksemplet. Ved slutten av reaksjonen (ca. 3 timer) opparbeides den erholdte reaksjonsblandingen som i eksempel l. Utbytte : 12.5 g (83,2%).

Rf = 0,52 - 0,57 (etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann = 25:20:6:11)

[cc]20D=- 117<0>(c = 1, vann)

Innhold av urenheter på basis av tynnsjiktkromatografi:3,5%. D-L-D isomerinnhold på basis av HPLC : 1,5%.

EKSEMPEL 3.

Fremstilling av D-fenylalanyl-_prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat.

201 g (0.3 mol) benzyloksykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininaldehyd oppløses i 2 1 etanol ved romtemperatur. 60 g katalysator bestående av 10% palladium-på-bariumsulfat-bærer suspenderes i 0,6 1 ionebyttet vann og600 ml 1 N svovelsyre (0,3 mol) tilsettes. Suspensjonen kjø-les til 2,5°C og den etanolske løsningen av beskyttet tripeptidaldehyd tilsettes. Ionebyttet vann tilsettes deretter i en slik mengde som tilsvarer et 6:4 forhold av løsningsmiddel til vandig fase.

Deretter blir hydrogen boblet gjennom blandingen under røring og kjølt til 6-8°C. Hydrogeneringsforløpet følges ved tynnsjiktkromatografi i henhold til eksempel 1. Ved slutten av reaksjonen (3-4 timer) filtreres katalysatoren fra og vaskes med ionebyttet vann flere ganger. Filtratene samles og alko-holen fordampes i rotavapor ved 25 - 30°C. Den vandige løs-ningen, med en pH på ca. 3-4, blir direkte frysetørket.101 g (65%) av det ønskede produktet erholdes i form av mono-hydratet, som har samme kvalitet som produktet erholdt i eksempel 1.

EKSEMPEL 4.

Fremstilling av D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat.

Fremgangsmåten i eksempel 3 følges, bortsett fra at 43 g 10% palladium-på-kull-katalysator, tidligere vasket til nøytral, brukes som katalysator.

125,1 g (83,2%) av det ønskede produktet erholdes med samme

kvalitet som produktet i eksempel 1.

EKSEMPEL 5.

Fremstilling av N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydsulfat.

2 0,5g (0,03 mol) N-bensyloksykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-NG<->benzyloksykarbonyl-L-arginin-aldehyd løses i 214 ml etanol og tilsettes deretter 110 ml ionebyttet vann, 60 ml 1 N svovelsyre (0,03 mol) og 3 g 10% palladium-på-kull-katalysator. Finfordelt hydrogengass tilsettes blandingen under kjøling til 6 - 8°C. Reaksjonsforløpet følges ved tynnsjiktkromatografi med en blanding av 25:20:6:1 etylacetat/ pyridin/eddiksyre/vann som elueringsmiddel. På kromatogrammet har Rf-verdiene til utgangsmaterialet, mellomproduktet og sluttproduktet verdier på henholdsvis 0,9, 0,7 og 0,4. Reaksjonen er fullstendig etter ca. 2 timer. Ved slutten av reaksjonen filtreres katalysatoren fra og vaskes med 3 x 30 ml ionebyttet vann. Filtratet og vaskevæsken samles og inndampes i en rotavapor til ca. 100 ml ved en temperatur på maks. 25°C. Restene ekstraheres med 2 x 50 ml diklormetan. Sporene av organisk løsningsmiddel fjernes fra den vandige løsningen ved destillasjon og restene fortynnes med ionebyttet vann til et volum på ca. 2 00 ml. pH kontrolleres til ca. 4. I tilfellet med nødvendig justering av pH tilsettes enten 0,1 N svovelsyre eller ionebyttemasse i OH'-fasen (f.eks. AG 1X8) . Løsningen fryses og frysetørkes. Utbytte 12,5 g (75%)

Rf = 0,35 - 0,45 (etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann = 25:20:6:1) .

[cc]<20>D= -126,0 ± 5°C (c = 1, vann)

Totalt innhold av urenheter på basis av tynnsjiktkromatografi : 2-3%.

Innhold av urenheter på basis av HPLC : 3-5%.

N-benzyloksykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininaldehyd brukt som utgangsmateriale kan fremstilles som følger :

Trinn 1 : N-benzyloksykarbonyl-N-metyl-D-f enylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloksykarbonyl-L-argininlaktam. 42,95 g (0,11 mol) t-butoksykarbonyl-NG<->bensyloksykarbonyl-L-argininlaktam suspenderes i 110 ml tørr kloroform, og 275 ml saltsuretylacetat (11-15 g/100 ml) tilsettes under konstant røring. Reaksjonsblandingen røres i ca. 3 timer ved romtemperatur, endepunktet til reaksjonen bestemmes ved tynnsjiktkromatografi ved å bruke en 60:20:6:11 blanding av etylacetat/ pyridin/eddiksyre/vann som eluent. (Rf-verdiene til utgangsmaterialet og sluttproduktet er henholdsvis ca. 0,9 og 0,3). Ved slutten av reaksjonen fortynnes blandingen med 400 ml dietyleter, den utfelte krystallinske substansen filtreres fra, vaskes med 2 x 100 ml dietyl eter og 2 x 50 ml aceton, tørkes i vakuumeksikator over fosforpentoksid og kaliumhydroksid. Etter 1-2 timers tørking av det erholdte laktam-saltet (ca. 0,1 mol) blir det løst i 100 ml vannfri dimetylformamid og lagret ved -15"C inntil bruk ved tilsetting til et blandet anhydrid fremstilt som følger: Frigjøring av N-benzyloksykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolin.

50,9 g (0.1 mol) N-benzyloksykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolin-cykloheksylammoniumsalt løses i 200 ml dietyleter og 12 0 ml 1 N svovelsyre. Eterfasen vaskes med 2 x 50 ml vann, tørkes over vannfri natriumsulfat og inndampes under redusert trykk ved opptil 35°C til det erholdes en tykk olje. Restene (ca. 0,1 mol) løses i 170 ml vannfri dimetyl form-amid, avkjøles til -15°C og tilsettes 11,2 ml (0,1 mol) N-metylmorfolin under røring. 13,2 ml isobutoksykarbonylklorid tilsettes dråpevis i løpet av 3 til 5 minutter ved samme temperatur. Etter ytterligere 5-10 minutters røring blir dimetyl f ormamid-suspensj onen av aminokomponenten tilsatt til det erholdte blandede anhydridet og deretter tilsettes 35 ml trietylamin under kraftig røring ved -2 0 til -25"C. pH i dampfasen kontrolleres (pH må være over 8) og om nødvendig tilsettes ytterligere mengder av trietylamin. Reaksjonsblan-

dingen røres i 1 time ved -15°C, 1 time ved 0°C og fortynnes deretter med 200 ml benzen og 150 ml vann.

Fasene separeres og den vandige fasen ekstraheres med 3 x 30 ml benzen. De samlede benzenfraksjonene vaskes med 2 x 50 ml vann, tørkes over vannfri natriumsulfat og inndampes under redusert trykk ved opptil 40°C til det erholdes en tykk olje. Den oljeaktige resten løses i 75 ml 2:1 eter/tetrahydrofuran og filtreres gjennom et filtersjikt som følger: 3 00 g (5-gangers mengde) Kieselgel-60 suspenderes i eter og filtersjiktet fremstilles med et diameter:høyde forhold på 3:1. Den øverste flekken av forurensninger elueres med en 95:5 eter:tetrahydrofuranblanding mens det ønskede produktet elueres med ren tetrahydrofuran. Innholdet av substanser i fraksjonene kontrolleres ved tynnsjiktkromatografi ved å bruke en 480:20:6:11 blanding av etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann som elueringsmiddel. Rf-verdien til det ønskede produktet er 0,71 - 0,75. De samlede fraksjonene inndampes under vakuum ved opptil 35°C til det erholdes en tykk olje og produktet brukes og lagres på tørris. Utbytte : 58.8 g (85%).

Rf : 0,71 - 0,75 (etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann = 480:20:6:11)

[a]<20>D= + 13.5° (c = 1, tetrahydrofuran).

Trinn 2.

N-benzyloksykarbonyl-N-metyl-D-f enylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloksykarbonyl-L-argininaldehyd.

34,14 g (0,05 mol) N-benzyloksykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-NG<->benzyloksykarbonyl-L-argininlaktam (eksempel 5 trinn 1) løses i 150 ml tørr tetrahydrofuran avkjølt til 0°C. Løsningen avkjøles til -20°C og 0,0375 mol litiumaluminiumhydrid løst i tetrahydrofuran tilsettes under røring i løpet av 5 til 10 minutter. Reaksjonsforløpet følges med tynnsjiktkromatografi ved å bruke en 240:20:6:11 blanding av etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann. (Rf-verdiene til det brukte laktamet som utgangsmateriale og aldehydet er hen-

holdsvis 0,8 og 0,5).

Om nødvendig tilsettes mer litiumaluminiumhydrid og ved slutten av reaksjonen helles blandingen porsjonsvis under konstant røring opp i 320 ml 1 N svovelsyre avkjølt til 2 til 4°C. Den endelige pH bør være mellom 2 og 3 og dette justeres ved å tilsette ytterligere svovelsyre om nødvendig. Dersom det dannes bunnfall, filtreres dette fra, løsningen fortynnes til den blir turbid og ekstraheres deretter med 3 x 100 ml n-heksan.

Den vandige tetrahydrofuranfasen ekstraheres med 250 ml diklormetan to eller tre ganger og de samlede diklormetan-løsningene vaskes med 2 x 50 ml vann, 2 x 50 ml kald 5% natriumhydrogenkarbonat og deretter med 2 x 50 ml vann. Deretter tørkes løsningen over vannfri natriumsulfat og inndampes under vakuum ved opptil 40°C.

Resten etter inndampingen løses i en 7:3 blanding av diklormetan og aceton (120 ml) og strømmer ved hjelp av suging gjennom et filtersjikt fremstilt av 108 Kieselgel-60 med hjelp av en 7:3 blanding av diklormetan og aceton. Deretter vaskes filtersjiktet med 600 ml av samme løsning. Prosessen bør ikke vare lenger enn 20 minutter.

De samlede filtratene inndampes til 50-60 ml under vakuum ved opptil 40°C, deretter gjentas denne operasjonen etter tilsetting av 100 ml benzen til restene. Produktet utfelles fra løsningen på ca. 50 - 60 ml ved tilsetting av 100 ml cykloheksan.

Bunnfallet vaskes med 2 x 30 ml cykloheksan og tørkes over parafinbiter i en vakuumeksikator. Utbytte : 18 g (53%).

Rf = 0,55 - 0,59 (etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann = 240:20:6:11).

[a]<20>D= + 14.1 ° (c = 1, tetrahydrofuran).

Totalt innhold av forurensninger i produktet er maks. 2-3%.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av tripeptidaldehyder med formel I,

hvor R representerer hydrogen eller metyl Phe står for en fenylalaningruppe Pro er en L-prolingruppe og Arg står for en L-arginingruppe i farmasøytisk ren form, ved kondensasjon av en NG<->beskyttet L-argininlaktam med formel IV :

hvor Arg er samme som definert over og Z står for benzyloksykarbonyl, med et dipeptid med formel V:

hvor R, Z, Phe og Pro er samme som definert over, via et blandet anhydrid, redusere tripeptidlaktamet med formel III:

hvor R, Z, Phe, Pro og Arg er samme som definert over, med litiumaluminiumhydrid, og hydrogenolysere det erholdte beskyttede tripeptidaldehydet med formel II:

hvor R, Z, Phe og Arg er samme som definert over, i nærvær av svovelsyre, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: a.,) frigjøre det NG<->beskyttede L-argininlaktamet in situ under kondensasjonen av NG<->beskyttet L-argininlaktamhydro klorid med formel IV:

hvor Z er samme som definert over, og dipeptid med formel V;

hvor R, Z, Phe og Pro er som definert over, til et blandet anhydrid i reaksjonsblandingen ved etterfølgende tilsetting av en base til blandingen av reaksjonskomponentene, deretter redusere det erholdte beskyttede tripeptidlaktamet med formel III:

hvor R, Z, Phe, Pro og Arg er som definert over, dekomponere det dannede komplekset ved å tilsette reaksjonsblandingen til et overskudd av 1 N svovelsyre ved en temperatur på 0 til5°C, deretter utføre hydrogenolyse av det beskyttede tripeptidet med formel II:

hvor R, Z, Pro, Arg og Phe er som definert over, ved en temperatur under 10 'C i nærvær av 1 til 2 molekvivalenter svovelsyre, eller a2) etter reduksjon av det erholdte beskyttede tripeptid-laktamet med formel III:

hvor R, Z, Phe, Pro og Arg er som tidligere definert, dekomponere det dannede komplekset ved å tilsette reaksjonsblandingen til et overskudd av 1 N svovelsyre ved en temperatur på 0 til 5°C, deretter utføre hydrogenolyse av det erholdte beskyttede tripeptidet med formel II, hvor Z, R, Pro, Phe og Arg er som tidligere definert, ved en temperatur under 10°C i nærvær av 1 til 2 molekvivalenter svovelsyre, eller a3) utføre hydrogenolysen av det beskyttede tripeptidet med formel II:

hvor R, Z, Phe, Pro og Arg er som tidligere definert, ved en temperatur under 10°C i nærvær av 1 til 2 molekvivalenter svovelsyre.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1,karakterisert vedat det NG-beskyttede L-argininlaktamet frigjøres fra laktamhydrokloridet med formel IV ved hjelp av trietylamin.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1,karakterisert vedat hydrogenolysen utføres ved en temperatur på 6 til 8°C.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 1-3,karakterisert vedat hydrogenolysen utføres ved at det bobles hydrogengass gjennom systemet.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 - 3,karakterisert vedat hydrogenolysen utføres i etanol eller tetrahydrofuran.