NO174262B - Middel for p}visning og bestemmelse av peroksydase-aktivitet - Google Patents
Middel for p}visning og bestemmelse av peroksydase-aktivitet Download PDFInfo
- Publication number
- NO174262B NO174262B NO864776A NO864776A NO174262B NO 174262 B NO174262 B NO 174262B NO 864776 A NO864776 A NO 864776A NO 864776 A NO864776 A NO 864776A NO 174262 B NO174262 B NO 174262B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- agent
- solution
- determination
- tetraalkylbenzidine
- peroxidase
- Prior art date
Links
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical group CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 2
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 2
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical class C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 108010035289 Glucose Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYNRGZULARUZCC-UHFFFAOYSA-N [4-(4-azaniumyl-3,5-dimethylphenyl)-2,6-dimethylphenyl]azanium;dichloride Chemical compound Cl.Cl.CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 NYNRGZULARUZCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010046301 glucose peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000002535 lyotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002444 monopotassium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000015861 monopotassium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002524 monosodium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000018342 monosodium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000002352 nonmutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007248 oxidative elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- WKZJASQVARUVAW-UHFFFAOYSA-M potassium;hydron;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [K+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC([O-])=O WKZJASQVARUVAW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 229960001922 sodium perborate Drugs 0.000 description 1
- YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M sodium;oxidooxy(oxo)borane Chemical compound [Na+].[O-]OB=O YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/725—Haemoglobin using peroxidative activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
- C12Q2326/10—Benzidines
- C12Q2326/12—3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, i.e. TMB
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Electrophonic Musical Instruments (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
- Electrical Discharge Machining, Electrochemical Machining, And Combined Machining (AREA)
- Paper (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår et middel for påvisning og bestemmelse av peroksydase-aktivitet, som i en vandig oppløsning inneholder et tetra-alkyl-benzidin eller et salt derav, et peroksyd eller et hydrogenperoksyd-dannende system, og en buffer.
Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av et slikt middel samt anvendelsen av middelet i analytiske metoder.
En vesentlig forutsetning for innføring av enzymimmuno-analyser som med hensyn til deres påvisningsfølsomhet er likeverdige radioimmunologiske metoder, er disponerbarheten av stabile markørenzymer og tilsvarende høyfølsomme farve-dannelsesreagenser, hvormed den katalytiske aktivitet av disse markørenzymer for å registrere på måleteknisk enkel måte. Som spesielt egnede markørenzymer viser seg for dette oksydoreduktaser glukoseoksydaser og peroksydase. Per-oksydasereaksjoner hører generelt til de hyppigst anvendte enzymatiske påvisningsreaksjoner. Alle for eksempel i "Methods of Enzymatic Analyses", H.U.Bergmeyer, Ed. 3. utgave, vol. 1, sidene 210-221, Verlag Chemie, Weinheim
(1983) omtalte fremgangsmåte beror, som glukose-bestemmelsen ved hjelp av glukoseoksydase på den støkiometriske frem-bringelse av hydrogenperoksyd. Dette kan derefter igjen, ved peroksydase-katalysert oksydasjon av et farveløst substrat, omsettes til et farvet produkt, som enkelt kan kvantifiseres spektrofotometrisk.
For denne av peroksydase katalyserte reaksjon egnede kromogene systemer er derfor undersøkt og beskrevet i stort antall (se Bergmeyer). For bestemmelse av peroksydaseaktivitet i enzymimmuno-analyser oppfyller bare få kravene, spesielt med hensyn til påvisningsfølsomhet. Generelt skulle et kromogent substrat muliggjøre en høy omsetningshastighet og føre til et farvestabilt produkt med en høy molar ekstinksjonskoeffisient. Videre skulle stoffer foretrekkes, hvis håndtering ikke medfører noen sunnhetsskadelig risiko. I kommersielle analyseutstyr for på peroksydase baserte enzym-immino-analyser kommer fremfor alt o-fenylendiamin (OPD) og 2,2'-azinodi-(3-etylen-benzotiazolinsulfonat-6) (ABTS) til anvendelse. Så vel OPD som også ABTS er som de fleste peroksydase-substrater mutagene. En gruppe av de hyppigst anvendte substrater er de av benzidin-typen, hvortil også tetrametylbenzidin (TMB) hører. TMB er en sikker ikke-mutagen erstatning for karciogene peroksydasesubstrater av benzidin-typen som benzidin, diaminobenzidin og lignende. I tallrike undersøkelser fremkom ingen henvisning til mutagene egen-skaper av dette benzinderivatet ("Tetrahedron" 30, 3299
(1976), "Cancer Lett." 1, 39 (1975), "J. Forensic Sei." 21, 816 (1976). TMB ble siden 1974 av flere andvendt til bestemmelse av pseudoperoksydase-aktivitet av hemoglobin eller cytokrom P 450 og allerede av Liem et al., "Anal. Biochem." 98, 388-393 (1979) til deteksjon av peroksydase-aktivitet i immunkomplekser ved immunperoksydase-farve-teknikken. Disse forfattere henviser i deres konklusjon på side 392 på de gode farveegenskaper, imidlertid også til den lave oppløselighet av TMB i vanligvis anvendte buffersystemer og til den oksydative spalting av TMB.
Ved anvendelse av TMB i enzymimmuno-analyser viser imidlertid den lave vannoppløselighet av dette kromogen seg under prøvebetingelsene som meget begrensede. I NL-søknad 8001972 og i US-PS 4 503 143 beskrives derfor forholdsregler som øker oppløseligheten. I begge publikasjoner oppnås den forbedrede oppløselighet ved anvendelse av organiske oppløsningsmidler. Ved tilsetning av dimetylsulfoksyd (1 % v/v i den bruksferdige blanding) får man i henhold til angivelsene i NL 8001972 en TMB-konsentrasjon på 100 mg/l, det vil si 0,42 mmol/1 henholdsvis på 43 mg/l, det vil si 0,18 mmol/1 i US-PS 4 503 143. Derimot tilbys vanligvis OPD eller ABTS i 50 eller 100 ganger høyere molar konsentrasjon til enzymet. En variasjon av konsentrasjonen av tetraalkylbenzidin i enzymprøven viser at den for oppnåelse av tetraalkylbenzidin i enzymprøven viser at den for oppnåelse av den maksimale omsetningshastighet nødvendige metning av peroksydase med substrat ikke oppnås ved de ovennevnte TMB-konsentrasjoner.
Det besto derfor det behov å finne et til bestemmelse av peroksydase egnet tetraalkylbenzidinholdig middel, som ikke har ovennenve ulemper. Et slikt middel er oppfinnelsens gjenstand.
Overraskende ble det funnet at et med hensyn til påvisnings-følsomhet vesentlig forbedret middel av tetraalkylbenzidin kan fåes, idet en oppløsning som inneholder denne forbindelse eller et av dens derivater, innstilles med en vandig buffer som inneholder en egnet hydrogenperoksydkonsentrasjon til en pH-verdi mellom pH 2,5 og 3,9. Enskjønt det for vanlige peroksydase-substrater og også for TMB er beskrevet et pH-optimum av enzymaktiviteten ved pH 5 til pH 6 (US-PS 4 503 143, "Methods of Enzymatic Analyses", H.U.Bergmeyer, Ed., 3. utgave, vol. III, s- 286-293, Verlag Chemie, Weinheim
(1983)), viser midlet ifølge oppfinnelsen, ved en uvanlig lav pH-verdi, spesielt i et område på pH 3,1 til 3,6, en i forhold til hittil omtalte midler forbedret påvisningsfølsom-het, som det vises i eksemplene 2 og 3.
Oppfinnelsen har til hensikt å forbedre den kjente teknikk og angår derfor et middel av den innledningsvis nevnte art og dette middel karakteriseres ved at det inneholder holder en eller flere buffere som innstiller en pH-verdi innen området 2,5 til 3,9 men ikke noe organisk oppløsningsmiddel.
Som antydet innledningsvis angår oppfinnelsen også en fremgangsmåte for fremstilling av dette middel og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at tetraalkylbenzidin tilsettes til en oppløsning som ikke inneholder organisk oppløsningsmiddel og som har en pE-verdi på 1,5 til 2, og at den oppnådde oppløsning blandes med en ytterligere oppløsning som heller ikke inneholder organisk oppløsningsmiddel men inneholder peroksyd og buffere, som efter blanding innstiller en pH-verdi i området 2,5 til 3,9.
Til slutt angår oppfinnelsen anvendelsen av midlet som beskrevet ovenfor i analytiske metoder der peroksydase- eller pseudoperoksydaseaktivitet påvises og bestemmes.
Midlet kan også inneholde et penicillin eller et av dets ved hjelp av sur hydrolyse dannede avbygningsprodukter som omtalt i DE-søknad P 35 41 979.
Midlet kan fremstilles ved oppløsning av en fast til-beredning, for eksempel et lyofilisat, et granulat eller en
tablett, idet de for det flytende middel anvendte komponenter tetraalkylbenzidin, pencillin eller dets nedbrytningsprodukter, peroksydene og bufferstoffene, er inneholdt i mengdeforhold slik at de ved oppløsning i et bestemt volum av overveiende vandige oppløsningsmidler, foreligger i de nevnte konsentrasjoner. De faste midlene kan i tillegg dessuten inneholde tilslag som glidemidler, fyllstoffer og spreng-midler, eksempelvis polyetylenglykol, urinstoff og bi-karbonater.
Som tetraalkylbenzidiner er fremfor alt slike anvendbare som inneholder ett til tre karbonatomer i alkyldelen, fortrinns-vis 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) eller dets dihydroklorid. Som peroksyder er det egnet natrlumperborat, hydrogenperoksyd i flytende form eller som fast urinstoff-addukt eller også et hydrogenperoksyd-genererende system bestående av D-glukose og glukoseoksydase, idet det innstilles en konsentrasjon på 0,5 til 10 mmol/1. Som buffer-stoffer foretrekkes lyotrope stoffer som citrater og acetater.
Ved fremstillingen av et middel i flytende form oppløses tetraalkylbenzidin i en første sur oppløsning av fortynnet saltsyre eller av maursyre med en pH-verdi på 1,5 til 2,0. Eventuelt tilsettes penicillin eller dets ved sur hydrolyse dannede, nedbrytningsprodukter, til denne oppløsning.
En andre, mindre sure oppløsning fremstilles ved oppløsning av peroksydene eller ved innføring i tilfellet anvendelse av en oppløsning av hydrogenperoksyd, i oppløsninger av eksempelvis eddiksyre eller mononatrium- henholdsvis monokalium-citrat, hvis pH-verdi kan reguleres med natrium-hydroksyd mellom 3 og 6.
Ved sammenblanding av de to oppløsninger i et bestemt forhold fåes det bruksferdige middel.
Oppfinnelsen skal forklares ved hjelp av noen eksempler.
Eksempler
1. Fremstilling av et bruksferdig TMB- substratmiddel Stamoppløsning 1: TMB-dihydroklorid oppløses under omrøring i en konsentrasjon på 5 g/l, det vil si på 16 mmol/1 i dobbeltdestillert vann og innstilles med 5 normal saltsyre til pH 1,5. Til denne oppløsning settes - penicillin G under omrøring i en sluttkonsentrasjon på 200 mg/l, det vil si på 0,56 mol/l.
Stamoppløsning 2: Til 900 ml dobbeltdestillert vann ble det satt 1,4 ml iseddik, 1,5 ml 1 normal NaOH og 250 mg, det vil si 3 mmol H2O2 urinstoff-hydrogenperoksyd-addukt. Efter fullstendig oppløsning ble det oppfylt med dobbeltdestillert vann til 1 liter.
Bruksoppløsning: En volumdel av stamoppløsning 1 og 10 volumdeler av stamoppløsning 2 ble sammenblandet.
Den således fremstilte bruksoppløsning hadde en pH-verdi på 3,3. Den viste ved 650 nm en optisk densitet på 0,025. Efter tilsetning av 5 ganger volumet av 0,5 svovelsyre utgjorde den ved 450 nm målte ekstinksjon 0,008.
2. Kinetisk peroksvdase- aktivltetsprøve
Et ifølge metoden av Nakane og Kawaoi, "J. Histochem. Cytochem." 22, 1084-1091 (1974) fremstilt konjugat av pepperrot-peroksydase (Boehringer Mannheim, FRG) og kanin-antihuman-IgE-antistoff (Behringwerke, Marburg, FRG) ble fortynnet i fosfatbufreet koksaltoppløsning (PBS for "phosphate buffered saline") hvortil det var tilsatt 10 mg/ml storfeserumalbumin. Derav ble det tilsatt 20 pl i en kuvette av et volum på 1 ml av den ifølge eksempel 1 fremstilte bruksoppløsning. Efter blandingen ble ekstinksjonsendringen i løpet av de første minutter registrert ved 650 nm. På samme måte ble det registrert den av enzymkonjugatet bevirket ekstinksjonsendring pr. minutt av en ifølge NL 8001972, eksempel 1 c, fremstilt bruksoppløsning av 99 mg/l, det vil si 0,41 mmol/1 TMB i en vandig oppløsning av 0,99 % (v/v) dimetylsulfoksyd og 8,73 g/l trinatriumcitrat x IH2O, som var blitt innstilt med fosforsyre på pH 6,0. Som middelverdi av en dobbeltbestemmelse ble det for TMB-bruksoppløsning ifølge eksempel 1 oppnådd en ekstinksjonsendring pr. minutt på 1.318 og for TMB-bruksoppløsningen ifølge NL 8001972 en verdi på 0,193. 3. Anvendelse i enzvmlmmuno- analvse til bestemmelse av saml pt.
IgE.
Mikroprøveplater av polystyren (Nunc, Roskilde, Danmark, Kat.-Nr. 262170) ble belagt ifølge den av Voller et al., "Bull.World Health-Organ." 53, 55-65 (1976) omtalte fremgangsmåte. Hertil ble det pr. brønn inkubert 150 pl av en oppløsning av det i eksempel 3 angitte anit IgE-antistoff i en konsentrasjon på 10 pg/ml i av Voller et al. angitt belegningsbuffer i 15-20 timer ved romtemperatur. Efter frasugning av oppløsningen og vasking med 1 g/l polyoksy-etylen(20)sorbitanmonolaureat, også kalt "Tween"-20, i PBS ("PBS-Tween") ble det i 8 brønner innført 100 pl av for-skjellige fortynninger av et IgE-holdig humanserum i PBS, hvortil det var satt 10 mg/ml storfeserumalbumin, og inkubert 1 time ved romtemperatur. De i disse prøver ved fortynnings-trinnet oppnådde konsentrasjoner av IgE utgjorde 1000, 500, 100, 25 og 10 IU/ml. Efter to gangers vasking med "PBS-Tween" ble det i alle benyttede brønner innført 100 pl av en egnet fortynning av det i eksempel 3 omtalte konjugat i "PBS-Tween", hvortil det var satt 10 mg/ml storfeserumalbumin, og inkubert 1 time ved romtemperatur. Efter ytterligere to gangers vasking ble det i hver fjerde av de pr. konsentra-sjonstrinn benyttede 8 brønner hver gang pipettert 100 pl av den i eksempel 1 omtalte bruksoppløsning og inkubert 30 minutter ved romtemperatur. Analogt ble det hver gang anvendt 100 pl av det i eksempel 3 omtalte TMB-middel ifølge NL 8001972 for de gjenværende 4 brønner. Efter utløp av inkubasjonsfasen ble det tilsatt 100 pl av en 0,5 n H2SO4 og dermed stoppet enzymreaksjonen. Ekstinksjonene av de dannede farveoppløsninger ble målt med apparatet Behring ELISA-Processor (Behringwerke, Marburg, FRG) og er vist i tabellen.
TABELL
Ekstinksjonsverdier i Sandwich-enzymimmuno-analyse
Claims (5)
1.
Middel for påvisning og bestemmelse av peroksydase-aktivitet, som i en vandig oppløsning inneholder et tetraalkylbenzidin eller et salt derav, et peroksyd eller et hydrogenperoksyd-dannende system, og en buffer,
karakterisert ved at det
inneholder en eller flere buffere som innstiller en pH-verdi innen området 2,5 til 3,9 men ikke noe organisk oppløsningsmiddel.
2.
Middel ifølge krav 1, karakterisert ved at tetraalkylbenzidinet inneholder 1 til 3 karbonatomer i alkyldelen.
3.
Middel ifølge krav 1, karakterisert ved at tetraalkylbenzidinet er 3,3', 5,5'-tetrametylbenzidin.
4.
Fremgangsmåte for fremstilling av et middel ifølge krav 1 for påvisning og bestemmelse av peroksydaseaktivitet, karakterisert ved at tetraalkylbenzidin tilsettes til en oppløsning som ikke inneholder organisk oppløsnings-middel og som har en pH-verdi på 1,5 til 2, og at den oppnådde oppløsning blandes med en ytterligere oppløsning som heller ikke inneholder organisk oppløsningsmiddel men inneholder peroksyd og buffere, som efter blanding innstiller en pH-verdi i området 2,5 til 3,9.
5.
Anvendelse av midlet ifølge krav 1 i analytiske metoder der peroksydase- eller pseudoperoksydase-aktivitet påvises og bestemmes.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853541978 DE3541978A1 (de) | 1985-11-28 | 1985-11-28 | Mittel zur bestimmung von peroxidase-aktivitaet, verfahren zur herstellung und seine verwendung |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO864776D0 NO864776D0 (no) | 1986-11-27 |
| NO174262B true NO174262B (no) | 1993-12-27 |
| NO174262C NO174262C (no) | 1994-04-06 |
Family
ID=6287013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO864776A NO174262C (no) | 1985-11-28 | 1986-11-27 | Middel for påvisning og bestemmelse av peroksydase-aktivitet |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5610026A (no) |
| EP (1) | EP0224210B1 (no) |
| JP (1) | JPH07108237B2 (no) |
| AT (1) | ATE56097T1 (no) |
| AU (1) | AU610488B2 (no) |
| CA (1) | CA1291402C (no) |
| DE (2) | DE3541978A1 (no) |
| DK (1) | DK571086A (no) |
| ES (1) | ES2018153B3 (no) |
| FI (1) | FI85877C (no) |
| GR (1) | GR3001134T3 (no) |
| MX (1) | MX170487B (no) |
| NO (1) | NO174262C (no) |
| PT (1) | PT83826B (no) |
| ZA (1) | ZA868980B (no) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3541979A1 (de) * | 1985-11-28 | 1987-06-04 | Behringwerke Ag | Mittel zur bestimmung von peroxidase-aktivitaet mit stabilisator, verfahren zur herstellung und seine verwendung |
| DE3641830A1 (de) * | 1986-12-08 | 1988-06-09 | Fraunhofer Ges Forschung | Immunenzymatischer test mit detektion durch farbumschlag im sichtbaren spektralbereich |
| JPH0740957B2 (ja) * | 1987-07-24 | 1995-05-10 | 帝人株式会社 | ペルオキシダーゼ活性測定用の色原体水溶液 |
| US5532138A (en) * | 1990-04-26 | 1996-07-02 | Behringwerke Ag | Method and kits for determining peroxidatively active catalysts |
| DE4037764A1 (de) | 1990-11-28 | 1992-06-04 | Behringwerke Ag | Waschloesung fuer festphasen-immunometrische verfahren, die stabilisatoren fuer das markierungssystem enthaelt und ihre verwendung |
| DE4037776A1 (de) * | 1990-11-28 | 1992-06-04 | Behringwerke Ag | Waschloesung fuer festphasen-immunometrisches verfahren, die einen komplexbildner fuer metallionen enthaelt und ihre verwendung |
| GB9027131D0 (en) * | 1990-12-14 | 1991-02-06 | Rice Evans Catherine | Diagnostic test |
| US5332662A (en) * | 1992-07-31 | 1994-07-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Methods for determining peroxidatively active substances |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2460903C3 (de) * | 1974-12-21 | 1981-12-24 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Neue 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidine |
| JPS5263794A (en) * | 1975-11-21 | 1977-05-26 | Shionogi Seiyaku Kk | Test piece for latent blood |
| JPS5399319A (en) * | 1977-02-09 | 1978-08-30 | Hidematsu Hirai | Novel qualitative and quantitative detecting method and detecting body for antgenic substance |
| US4077772A (en) * | 1977-05-31 | 1978-03-07 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Method for the determination of hemoglobin in trace amounts |
| US4340394A (en) * | 1979-11-13 | 1982-07-20 | Miles Laboratories, Inc. | Stabilization of benzidine-type indicators with various enhancers |
| US4503143A (en) * | 1982-08-20 | 1985-03-05 | Btc Diagnostics Limited Partnership | Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen |
| US4504579A (en) * | 1982-11-08 | 1985-03-12 | Abbott Laboratories | Stabilized peroxidase compositions |
| ZA841078B (en) * | 1983-03-01 | 1984-09-26 | Warner Lambert Co | Peroxidase activity detection composition |
| US4789630A (en) * | 1985-10-04 | 1988-12-06 | Cetus Corporation | Ionic compounds containing the cationic meriquinone of a benzidine |
| DE3541979A1 (de) * | 1985-11-28 | 1987-06-04 | Behringwerke Ag | Mittel zur bestimmung von peroxidase-aktivitaet mit stabilisator, verfahren zur herstellung und seine verwendung |
| US5206150A (en) * | 1990-10-26 | 1993-04-27 | University Of Kentucky Research Foundation | Composition of, method of producing and method of using a stabilized formulation for assaying peroxidase activity |
-
1985
- 1985-11-28 DE DE19853541978 patent/DE3541978A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-11-21 EP EP86116137A patent/EP0224210B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 AT AT86116137T patent/ATE56097T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-21 ES ES86116137T patent/ES2018153B3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 DE DE8686116137T patent/DE3673768D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-26 FI FI864816A patent/FI85877C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-11-27 NO NO864776A patent/NO174262C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-11-27 DK DK571086A patent/DK571086A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-11-27 JP JP61280951A patent/JPH07108237B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-11-27 MX MX004449A patent/MX170487B/es unknown
- 1986-11-27 AU AU65780/86A patent/AU610488B2/en not_active Ceased
- 1986-11-27 ZA ZA868980A patent/ZA868980B/xx unknown
- 1986-11-27 PT PT83826A patent/PT83826B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-11-28 CA CA000524125A patent/CA1291402C/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-11-30 GR GR90400759T patent/GR3001134T3/el unknown
-
1994
- 1994-08-08 US US08/291,059 patent/US5610026A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0224210B1 (de) | 1990-08-29 |
| DE3673768D1 (de) | 1990-10-04 |
| DE3541978A1 (de) | 1987-06-04 |
| GR3001134T3 (en) | 1992-06-25 |
| FI85877B (fi) | 1992-02-28 |
| NO864776D0 (no) | 1986-11-27 |
| NO174262C (no) | 1994-04-06 |
| AU6578086A (en) | 1987-06-04 |
| FI85877C (fi) | 1992-06-10 |
| EP0224210A1 (de) | 1987-06-03 |
| ATE56097T1 (de) | 1990-09-15 |
| US5610026A (en) | 1997-03-11 |
| DK571086D0 (da) | 1986-11-27 |
| DK571086A (da) | 1987-05-29 |
| ZA868980B (en) | 1987-07-29 |
| FI864816A (fi) | 1987-05-29 |
| ES2018153B3 (es) | 1991-04-01 |
| MX170487B (es) | 1993-08-26 |
| FI864816A0 (fi) | 1986-11-26 |
| AU610488B2 (en) | 1991-05-23 |
| JPS62134100A (ja) | 1987-06-17 |
| PT83826A (de) | 1986-12-01 |
| JPH07108237B2 (ja) | 1995-11-22 |
| PT83826B (pt) | 1989-06-30 |
| CA1291402C (en) | 1991-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0103784B1 (en) | Catalyzed colorimetric and fluorometric substrates for peroxidase enzyme determinations | |
| Roth et al. | The quantitative determination of galactose—an enzymic method using galactose oxidase, with applications to blood and other biological fluids | |
| US4321397A (en) | 4-Aminoantipyrine dye for the analytic determination of hydrogen peroxide | |
| US4247631A (en) | Reagent and method for the analytic determination of hydrogen peroxide | |
| NO171417B (no) | Middel for paavisning og bestemmelse av peroksydase-aktivitet, en fremgangsmaate for fremstilling av midlet samt detsanvendelse | |
| US6008006A (en) | Determination of glycated proteins | |
| JPH0577399B2 (no) | ||
| KR870003205A (ko) | Hdl 콜레스테롤의 정량 방법 및 제제 | |
| EP0296752B1 (en) | Enhanced chemiluminescent reaction and diagnostic assay | |
| Morin et al. | Single Glucose Oxidase—Peroxidase Reagent for two-minute determination of serum glucose | |
| EP0185057A1 (en) | Assay of peroxidase enzyme activity | |
| NO174262B (no) | Middel for p}visning og bestemmelse av peroksydase-aktivitet | |
| EP0214262A1 (en) | IMPROVEMENTS RELATING TO ANALYSIS REAGENTS. | |
| EP0213156A1 (en) | Stabilized enzyme substrate solutions | |
| Van Lente et al. | Coupled-enzyme determination of catalase activity in erythrocytes | |
| US4849342A (en) | Method for carrying out enzyme assays | |
| KINOSHITA et al. | A fluorophotometric determination of serum creatinine and creatine using a creatinineamidohydrolase-creatineamidinohydrolase-sarcosine oxidase-peroxidase system and diacetyldichlorofluorescin | |
| US5149633A (en) | Process and reagent for the specific determination of fructosamine content in blood and samples obtained from blood | |
| EP0206316B1 (en) | Method and test composition for determination of hydrogen peroxide | |
| Kvannes et al. | A fluorometric assay of acyl-CoA oxidase activity by a coupled peroxidatic reaction: elimination of interfering side reactions | |
| US4800169A (en) | Test aids and method for the preparation thereof | |
| JPH0919296A (ja) | 発色基質の安定化方法、試薬及び微量成分の定量法 | |
| JPH05227995A (ja) | 過酸化物分解性物質測定用指示薬および試薬キット | |
| RU1788466C (ru) | Способ определени холестерина | |
| JP2004173519A (ja) | Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの安定化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN MAY 2002 |