NO171274B - Tetrahydrocannabinolderivater samt anvendelse derav ved immunoassay for paavisning av cannabinol-metabolitter - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler nye tetrahydro-cannabinolderivater og anvendelsen av disse derivater som reagenser i forbedrede immunoassays for cannabinolmetabolitter i prøver av biologiske væsker.

Økning i bruk av marijuana har ført til utvikling av metoder for påvisning av den primære aktive bestanddel av planten<9->tetrahydrocannabinol (THC), og mer spesielt metabolitter av THCi urin og blodprøver. Disse metoder anvender bruken av merkede cannabinolderivater i sammenheng med antistoff mot metabolitter av drogen.

I praksis blir en blod- eller urinprøve som er mistenkt for å inneholde cannabinolmetabolitter (innebefattende glucuron-ider og andre konjugeringsprodukter) satt i kontakt med antistoffene i nærvær av et merket derivat. I den utstrek-ning at cannabinolmetabolitter er tilstede i prøven vil det være konkurranse for binding til bindingssetene til antistoffene og mengden av de bundede merkede derivater vil bli redusert i forhold til graden av slikt konkurranse.

Beskrivelse av enkelte representative immunoassays kan finnes i 0'Connor et al♦, J. Anal. Toxicol. 5:168 (1981), Law et al.. J. Anal. Toxicol. 8.: 14 (1984) og Childs et al. , J. Anal. Toxicol. 8:220 (1984). I alle disse referanser er det fortregning av av enkelte av de merkede cannabinol-derivater av metabolitter i assayprøvene som er basis for de beskrevende metoder. Overlegne assaysresultater vil erholdes når det merkede derivat gjenkjennes spesifikt av antistoffene og likevel lett blir fortrengt av de forskjellige produkter av cannabinol-metabolisme.

Foreliggende oppfinnelse omhandler nye derivater av cannabinol av formel hvor R er en sidekjede valgt fra gruppen omfattende en p-aminobenzylgruppe eller en forgrenet eller lineær amino-alkylgruppe med fra 1 til 7 karbonatomer eller et organisk eller mineralsyre-addisjonssalt derav, eller et organisk salt eller mineralsyre-addisjonssalt derav, som eventuelt er kovalent bundet til en markør for å lette påvisning. Foreliggende oppfinnelse omhandler ytterligere anvendelse av slike forbindelser ved immunoassay av cannabinolmetabolitter samt antistoff mot cannabinolmetabolitter som er istand til å binde selektivt til slike forbindelser, spesielt for påvisning av cannabinolmetabolitter i blod eller urinprøver.Påvisning av metabolittene lettes ved bruken av de merkede derivatforbindelser som omfatter forbindelsene ifølge oppfinnelsen kovalent bundet til et passende markørmolekyl.

Foreliggende oppfinnelse kan lettere bli forstått under referanse til de følgende figurer, hvor: Fig. 1 viser formelen til utgangsmaterialene og intermediatene involvert i syntesen av (trans-rac)-1-(3-aminoproksy)-6a,7,10,10a-tetrahydro-6,6-dimetyl-3-pentyl-6H-dibenzo(b,d)-pyran-9-karboksylsyre monohydroklorid ; Fig. 2 viser formlene til intermediatene og sluttproduktet av syntesen av (trans-rac)-6a,7,10,lOa-tetrahydro-1-(4-aminobenzyl)-6,6-dimetyl-3-pentyl-6H-dibenzo(b,d)pyran-9-karboksylsyre monohydroklorid; og Fig. 3 er en grafisk figur av en standardkurve for immuno assayet av THC som viser forandringen i absorbanse ved 492 nm som en funksjon av 9-karboksy-ll-nor-<9->tetrahydro-cannabinol konsentrasjonen.

Immunoassayene med forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er rettet mot påvisningen av cannabinolmetabolitter i biologiske væsker så som humant blod og urinprøver. Som brukt heri betyr uttrykket "cannabinol-metabolitter" A<8>ellerA 9 tetrahydrocannabinol og de katabolske produkter av disse forbindelser innebefattende konjugeringsprodukter så som glucuronidene. Uttrykket "cannabinol-derivat" betyr et kjemisk syntetisert derivat av eller A,<9>tetrahydro-cannabinol.

Antistoff brukt ved påvisningen kan fremstilles ved å bruke ethvert av et bredt område mulige immunogener. Disse immunogener omfatter en cannabinol-metabolitt eller derivat konjugert til et passende immunogent bæremolekyl. Konjugering til en bæresubstans er nødvendig fordi cannabinol-metabolittene eller derivatene i seg selv er haptener (molekyler som er istand til spesifikk binding til et antistoff, men ute av stand til å fremskaffe antistoff-produksjon, dvs. de er ikke immunogene).

Som brukt heri betyr uttrykket "immunogent bærer-molekyl"

makromolekyler som har egenskapen å uavhengig fremskaffe en immologisk respons i et "vertsdyr og som kan kovalent bindes til cannabinol-metabolitten eller derivatet. Passende bærer-molekyler innbefatter f.eks. proteiner, naturlige eller syntetiske polymerforbindelser, så som polypeptider, poly-saccarider osv. Protein bærer-molekyler er spesielt foretrukket. Når de er koblet til et bære-molekyl, blir cannabinol-metabolitten eller derivatet immunogent på grunn av hva som vanligvis er kjent som "bærer-effekten".

Proteinbærere som kan bli brukt i foreliggende oppfinnelse innebefatter, men er ikke begrenset til, pattedyr serum-proteiner, så som "keyhole limpet" hemocyanin, humant eller bovint gammaglobulin, humant, bovint eller kanin serum albumin eller metylerte eller andre derivater av slike proteiner. Andre protein-bærere vil være innlysende for fagmannen. Foretrukket, men ikke nødvendigvis, vil protein-bæreren være fremmed for vertsdyret i hvilket antistoffene mot cannabinol-metabolitten eller derivatet skal frem-skaffes.

Kovalent binding til' bærer-molekylet kan utføres ved metoder som er velkjente i faget hvor de nøyaktige valg vil være bestemt av naturen til de funksjonelle grupper i cannabinol-metabolitten eller derivatet og i bærer-molekylet som er tilgjengelig for kobling.

Når det engang er fremstilt, kan immunogenet bli brukt for å indusere dannelsen av antistoffer som er spesifikke overfor cannabinol-metabolitter i vertsdyr ved å injisere de immunogene stoffer i et vertsdyr, fortrinnsvis ved å bruke et vanlig hjelpestoff, såsom Freunds complete eller incomplete adjuvant og lignende. Passende vertsdyr innbefatter kaniner, hester, geiter, marsvin, rotter, kyr, sauer o.s.v. Det resulterende antiserum må være slik at antistoffene inneholdt deri, kalt anti-THC-antistoff, er i stand til spesifikt å binde til cannabinol-metabolittene som skal undersøkes og til de merkede forbindelser ifølge oppfinnelsen som bærer markørforbindelsene som beskrevet nedenfor. Egnetheten av antiserum-produktet kan raskt bekreftes ved vanlig eksperimentering.

I en illustratorisk utførelsesform ble anti-THC-antistoff dannet mot tre forskjellige konjugater basert på tre THC derivater koblet til 9-posisjonen, slått sammen for bruk i oppfinnelsen (se eksempel 14). Det må imidlertid igjen utheves at den nøyaktige natur av konjugatene som brukes for å danne antistoffene, ikke er kritisk for oppfinnelsen så lenge de resulterende antistoff har den krevede brede spesifisitet for THC metabolitter.

Selv om fullstendig antiserum kan bli brukt, blir IgG-fraksjonen fortrinnsvis isolert ved salt-fraksjonering, såsom ammoniumsulfat-utfelling, ved DEAE-kromatografi eller ved andre metoder kjent i faget.

Enkelte av de nye cannabinol-forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er derivater av en hovedmetabolitt av THC,

11-nor-<9>(<8>)-THC-9-karboksylsyre hvor den fenoliske hydroksylgruppe er modifisert ved utskiftning av det fenoliske hydrogen med en p-aminobenzylgruppe eller en amino-terminal alkylgruppe som kan ha fra 1 til 7 karbonatomer. Når en aminoalkylgruppe brukes, kan gruppen være forgrenet eller rettkjedet så som aminopropyl, aminoiso-propyl, aminobutyl, aminoisobutyl og lignende.

Aminoforbindelsen og intermediatene ifølge oppfinnelsen kan bli brukt som fri base eller som syreaddisjonssalter av organiske eller mineralsyrer. Representative addisjonssalter som kan brukes innbefatter hydroklorid, hydrobromid, sulfonat, metansulfonat, nitrat, fosfat, trifluoracetat, oxalat, maleat, succinat, acetat og ligende.

Andre forbindelser ifølge oppfinnelsen er isocyanat eller isotiocyanat-derivater av aminoforbindelsene som kan fremstilles ved å behandle p-aminobenzyl eller amino-terminal alkylgruppene med henholdsvis fosgen og tiofosgen.

Ytterligere forbindelser ifølge oppfinnelsen er karboksylterminerte derivater av aminoalkylforbindelsene. Slike karboksyl-derivater kan fremstilles ved metoder vanligvis brukt i faget. F.eks. kan aminoterminal-alkylgruppene behandles med klor-, brom- eller jod-haloorganiske syrer med fra 1 til ca. 7 karbonatomer for å danne karboksylterminal-derivater. Slike forbindelser kan anvendes som sådanne eller som salter, såsom Na<+>, NH4<+>og lignende. Disse karboksyl-derivater kan kobles til amino- eller hydroksylgrupper på passende markørmolekyler ved bruk av koblingsmidler såsom l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid eller fortrinnsvis dicykloheksylkarbodiimid.

Alternativt kan karboksylforbindelsene ytterligere være modifisert for å danne aktiverte derivater så som N-hydroksysuccinimid esterderivater. Slike derivater kan fremstilles ved å omsette karboksylderivatene med en ønsket aktiverende forbindelse, såsom N-hydroksysuccinimid, i nærvær av et koblingsmiddel, såsom dicykloheksylkarbodiimid.

Det må understrekes at det er tilgjengeligheten av en tilkoblet kjede ved den fenoliske hydroksylgruppe av THC som gir overlegne diagnostiske egenskaper til forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse. Fagmannen vil umiddelbart forstå at ved bruken av intermediatene i følge oppfinnelsen er det mange andre måter som lignende tilkoblede kjeder med lignende funksjonelle grupper egnet for kobling til markørgrupper kan fremstilles på. For eksempel kunne et karboksylterminert derivat fremstilles direkte uten å gå om et aminoderivat som beskrevet heri.

De tilgjengelige funksjonelle grupper i forbindelsene ifølge oppfinnelsen gir et passende punkt for merking ved den kovalente kobling av en passende markørgruppe for å lette påvisningen i immunoassayet.

Passende markeringsgrupper for de merkede forbindelser innbefatter f.eks. biotin (for bruk i forbindelse med passende merket avidin); fluorescente kjemiluminiscente eller bioluminescente grupper eller radioisotoper såsom<3>H, 14C, 35S og 12<5>I som lett kan innføres i molekylet i mange former velkjent i faget på grunn av tilgjengeligheten av amino- og karboksylgruppene i forbindelsene. Slike grupper kan påvises og mengdebestemities ved væske-scintillerings-spektroirtetri, fluorescensspektroskopi, fluorescens-polarisering osv. etter behov.

Alternativt kan konjugatforbindelser fremstilles hvor forbindelsene ifølge oppfinnelsen er kovalent bundet til et enzym via den fri funksjonelle gruppe, innbefattende, men ikke begrenset til forskjellige peroksydaser, glukose-oksydase p<->galaktosidase og alkalisk fosfatase. Pepperrot peroksydase som kan påvises ved spektrofotometrisk analyse av dets aktivitet på et substrat, såsom pyrogallol eller o-fenylen-diamin, er spesielt foretrukket. Når det brukes enzymer, kan konjugat-forbindelsene bli brukt i forbindelse med vanlige additiver, buffere, fortynningsmidler og enzym-stabilisatorer.

Cannabinolderivatene ifølge foreliggende oppfinnelse danner overlegne reagenser for bruk i immunoassay delvis fordi de fremskaffer funksjonelle grupper ved hvilke merking kan utføres. Viktigere danner tilstedeværelsen av fenoliske og oksygen sidekjeder forbindelser som fremdeles kan binde til anti-THC-antistoff, men som gjør dette med redusert affinitet. Som et resultat blir den meget lett fjernet fra de antistoff-kombinerte seter av assayprøve-cannabinol-metabolitter. Immunoassayene som anvender disse merkede forbindelser, er således ekstremt følsomme.

Anti-THC-antistoffene og merkede forbindelser ifølge oppfinnelsen kan bli brukt i et antall immunoassays for påvisningen av cannabinol-metabolitter. Slike immunoassays kunne ha form av et radioimmunoassay enten i fri oppløsning eller i fast tilstand. Alternativt kunne enzym-immunoassays utføres igjen enten i fri oppløsning eller i fast tilstand. Fastfase-assays kan utføres ved bruk av faste partikler på hvilke antistoffene har blitt immobilisert. Partikler som kunne bli belagt med antistoffene innbefatter f.eks. latex-kuler, liposomer, erytrocytter, polyakrylamid-kuler, polystyren-kuler eller kuler laget av et antall andre passende polymerer. Immunoassayene kan være direkte eller indirekte med anvendelse av et andre antistoff rettet mot anti-THC-antistoffene.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir en prøve mistenkt for å inneholde cannabinol-metabolitter blandet med kjente mengder av en merket forbindelse ifølge oppfinnelsen og kjente mengder av anti-THC-antistoff absorbert på en polystyren-kule. Etter en inkuberings-periode blir den bundne merkede forbindelse separert fra den frie merkede forbindelse og mengden av enten fri eller bundet forbindelse måles og sammenlignes med verdiene erholdt ved å underkaste prøvene inneholdene kjente mengder av en cannabinol-metabolitt til samme analysetrinn.

Eksempler

Det følgende er ikke-begrensende eksempler som illustrerer syntesen av enkelte av de nye cannabinolderivater ifølge oppfinnelsen samt bruken av en av av disse forbindelser i et enzym-immunoassaysystem. Den kjemiske struktur av intermediatene og sluttproduktet av syntesen av

(trans-rac)-1-(3-aminoproksy)-6a,7,10,10a-tetrahydro-6,6-dimetyl-3-pentyl-6H-dibenzo-[b,d]pyran-9-karboksylsyre monohydroklorid er vist i fig. 1. De kjemiske strukturer av intermediatene og sluttproduktet av syntesen av (trans-rac)-6a,7,10,10a-tetrahydro-l-(4-aminobenzyl)-6,6-dimetyl-3-pentyl-6H-dibenzo(b,d)pyran-9-karboksylsyre er vist i fig. 2. Romertallene betegner forbindelsene i over-skriftene for eksemplene 1 til 13 og refererer til struktur-formlene vist i fig. 1 og 2.

Eksempel 1

Fremstilling av

Et<y>l 4- metyl- 5- hydroksv- 7- pentylcoumarin- 3- propionat ( I)

En 5-liters flaske utstyrt med en mekanisk røreanordning, termometer og nitrogenbobler ble tilsatt 210,1 g (1,17 mol) av olivetol (5-pentyl-resorcin; Aldrich), 300,0 g (1,30 mol) av dietyl-2-acetoglutarat (Aldrich) og 180,0 g (1,117 mol) av fosforoksyklorid. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur og begynte sakte å fortykkes. Etter 3 dager hadde blandingen blitt fast, ved hvilken tid den fikk stå i ytterligere 7 dager uten omrøring.

Den faste blanding (lys grønn i farge) ble oppløst i 2,0 1 metylenklorid og overført til en 6-liters separasjonstrakt. Det organiske lag ble vasket med 10 1 dejonisert vann i fem like deler og tørket over vannfri Na2S04og oppløsningsmid-delet ble så strippet av på en roterende evaporator (40°C, 50 mm Hg) for å gi 672,7 g (166%) av et lyserødt fast stoff). Dette faste stoff ble igjen oppløst i 1,0 1 etyl acetat på et dampbad, fulgt av tilsetning av heksaner under fortsatt oppvarming. Oppløsningen fikk avkjøle seg til romtemperatur og ble så plassert i en fryser (-10°C) over natten. De resulterende krystaller ble filtrert på enBuchner-trakt, vasket med ca. 1,01 av en blanding av kalde heksaner:etylacetat (2:1) og tørket ved 100°C/10 mm Hg i en vakuumovn i 20 timer for å gi 243,5 g (60%) av lyserøde krystaller, smeltepunkt 118-120°C.

Eksempel 2

Fremstilling av

7. 10- Dihvdro- l- hydroksv- 3- pentyl- 6H- dibenzo( b. d) pyran- 6, 9-f8H)- dion ( II)

En 5-liters flaske utstyrt med en mekanisk røreanordning, termometer, tilsetningstrakt og nitrogenbobler ble tilsatt80,0g (2,0 mol) av 60% NaH oppløsning i mineralolje (Aldrich). Mineraloljen ble fjernet ved å vaske dispersjonen med 1500 ml hexaner (Fisher) i tre like deler. 160 g (0,462 mol) av forbindelse I ble tilsatt flasken og de to faste stoff ble blandet mekanisk. Et vannbad med 20°C konstant temperatur ble plassert under flasken og 1,4 1 destillert dimetylsulfoksyd (DMSO) ble forsiktig tilsatt dråpevis, slik at blandingens temperatur aldri steg over20°C.

Etter 6 timer var tilsetningen fullstendig og badet ble fjernet. Blandingen ble omrørt i ytterligere 1 time og så plassert i en fryser (-10°C) over natten. Påfølgende dag ble blandingen varmet til romtemperatur og helt opp i en ekstraktor fylt med 12 1 isvann og 250 ml konsentrert HC1, hvorpå den ble raskt omrørt i 2 timer. Ettersom blandingen ble omrørt begynte faste partikler å utfelles. Disse faste partikler ble samlet opp ved filtrering gjennom en Buchner-trakt og vasket med 200 ml av en mettet NaHC03-oppløsning, fulgt av 250 ml deionisert vann. De faste partikler ble lufttørket og tørket i en vakumovn (100°C/l mm Hg) i 16 timer for å gi 124,8 g (90%) av et off-white fast stoff,

smeltepunkt 181-184"C.

Eksempel 3

Fremstilling av

7, 8, 9, 10- Tetrahvdro- l- hydroksy- 3- pentylspiro- 6H- dibenzo-( d. b) Pvran- 9 , 2- Q'- 3') - dioksolan- 6- on f III)

En 3 liters flaske utstyrt med et termometer, mekanisk røre-anordning, Dean-Stark felle, konsensator og nitrogenbobler ble tilsatt 20,0 g (0,32 mol) av etylenglykol, 18,4 g (0,062 mol) av forbindelse II, 1,0 g av p-toluensulfonsyre mono-hydrat og 1,0 1 toluen. Oppløsningen ble kokt under tilbake-løp over natten og 16,3 ml azeotropt vann ble samlet opp i fellen. Reaksjonen ble avkjølt til romtemperatur og overført til en 2 liters separasjonstrakt hvor den først ble vasket med 3 00 ml mettet NaHCX^-oppløsning og derpå med 300 ml deionisert vann.

Toluen-laget ble tørket over Na2S04og deretter strippet på en roterende evaporator (60°C/50 mm Hg) til en brun olje som ble gjenoppløst i ca. 100 ml metylenklorid. 20 ml heksan ble tilsatt oppløsningen, og blandingen ble plassert i en fryser (-10°C) over natten. Krystaller ble dannet som ble samlet opp ved filtrering ved en Buchner-trakt, vasket med 30 ml heksan og tørket over natten i en vakumovn (25°C/l mm Hg) for å gi 14,7 g (69%) av et off-white fast stoff, smeltepunkt 110-113•C.

Eksempel 4

Fremstilling av

dl. l- Hvdroksv- 3- pentvl- 6. 6- dimetvl- 6a. 7- dihvdro- 6H- dibenzo-fd, b) pvran- 9( 8K )- on ( IV )

En 3 liters flaske utstyrt med en mekanisk røreanordning, termometer, varmemantel, tilsetningstrakt, kondensator og en nitrogenbobler ble tilsatt 12,5 g (0,515 mol) av Mg-biter

(Fisher) og 500 ml vannfri eter. Derpå ble 73,1 g (0,515 mol) av jodometan (Aldrich) tilsatt dråpevis til suspensjonen med en slik hastighet at det opprettholdes et forsiktig tilbakeløp. Etter avslutning av tilsetningen (ca. 3 0 minutter) ble en grå-sort oppløsning kokt under tilbake-løp i ytterligere 1 time, hvorpå en oppløsning av 16,9 g (0,040 mol) av forbindelse III i 3 00 ml vannfri tetrahydrofuran (THF) ble tilsatt dråpevis til tilbakeløpsoppløsningen i løpet av en periode på 2 0 minutter. Blandingen ble raskt gul og faste partikler avleiret seg på siden av flasken.

Den resulterende heterogene blanding ble kokt ved tilbakeløp over natten og derpå avkjølt til romtemperatur. Reaksjonen

ble stoppet ved forsiktig tilsetning av 56 ml IN HC1 i løpet av ca. 20 minutter for å danne en oppløsning under forsiktig tilbakeløp. Ytterligere 210 ml av 6N HC1 ble tilsatt i løpet av 20 minutter og den mørkegrønne oppløsning ble omrørt i

ytterligere 1 time og overført til en 2 liters separasjonstrakt hvor det vandige lag ble kastet.

Eterlaget ble ekstrahert trinnvis med 2 00 ml deionisert vann, 200 ml mettet NaHC03-oppløsning og 200 ml deionisert vann, hvorpå oppløsningen ble tørket over Na2S04og strippet på en rotasjonsevaporator (40°C/50 mm Hg) til en mørkegrønn olje. 50 ml eter ble tilsatt og blandingen fikk stå over natten ved romtemperatur. Det dannet seg krystaller som ble samlet opp på en Buchner-trakt, vasket to ganger med 25-50 ml kald (-10°) eter:heksan (1:1) og tørket over natten i en vakuumovn (25°C/1 mm Hg) for å gi 9,7 g (63%) av et lyst gult materiale, smeltepunkt 198-2 00°C.

Konsentrasjonen av moderluten på en rotasjonsevaporator (40°C/50 mm Hg) og tilsetningen av 10 ml eter dannet ytterligere faste materialer som ble tørket i en vakumovn (25°C/1 mm Hg) for å gi 1,3 g av et lyst grønt fast stoff, smeltepunkt 193-198°C. Totalt utbytte var 71%.

Eksempel 5

Fremstilling av

dl- 6ae, 7, 10, 10a- Tetrahydro- l- hydroksv- 6. 6- dimetvl- 3- pentvl-6H- dibenzo( b, d) pvran- 9( 8E )- on fV)

En 2 liters mantlet resinflaske utstyrt med en mekanisk rører, tørris-kondensator, tilsetningstrakt og gassinntaks-ventil ble tilsatt 1,5 1 flytende NH3og 0,15 g litiumtråd

(alfa) ble tilsatt, noe som gjorde oppløsningen blå. Etter 3 minutter ble en oppløsning av 32,0 g (0,102 mol) av forbindelsen VI i 500 ml tørr THF tilsatt dråpevis inntil den blå fargen forsvant. Denne fremgangsmåte ble gjentatt inntil et totale på 2,7 g (0,39 g-atom) av litiumtråd hadde blitt tilsatt og tilsetningen av forbindelse IV var fullstendig (ca. 2 timer). Den blå oppløsning ble omrørt i 15 minutter ved -33°C og derpå stoppet med 150 ml mettet NH4C1, tilsatt forsiktig i løpet av 10 minutter.

NH3ble tillatt å avdampe raskt (i løpet av ca. 2,5 timer), hvorpå 500 ml deionisert vann ble tilsatt. pH av oppløsnin-gen "ble justert fra 12 til 1 med forsiktig tilsetning (over ca. 2 timer) av 800 ml konsentrert HC1. Oppløsningen ble ekstrahert med 1,5 1 av metylenklorid i tre like deler og den organiske fase ble tørket over Na2S04og strippet på en rotasjonsevaporator (40°C/50 mm Hg) til et gult oljeaktig faststoff.

Det faste stoff ble gjenoppløst i ca. 100 ml kloroform på et dampbad og 500 ml heksan ble tilsatt. Oppløsningen ble konsentrert i en rotasjonsevaporator (35°C/50 mm Hg) inntil ca. 2 00 ml destillat hadde blitt samlet opp. Krystaller begynte å danne seg og blandingen fikk stå over natten ved romtemperatur, hvorpå de faste partikler ble samlet opp ved filtrering på en Buchner-trakt og vasket med 1,5 1 varm (50°C) heksan i tre like deler.

De vaskede faste partikler ble tørket over natten i en vakuumovn (25°C/1 mm Hg) for å gi 27 g (84%) av et off-white fast stoff, smeltepunkt 161-164"C. Tynnsjiktkromatografi-sammenligning med autentiske standarder i heksan: EtOAc (3:1) viste at det faste materialet i hovedsak var forbindelse V med noe kontaminerende cis isomer. Rensing av materialet ble utført ved en av to metoder.

I den første opprensningsmetode ble det brukt en høytrykks-væske-kromatografi (HPLC) Magnum 70 kolonne, pakket med Partisil 4 0 silica og anvendt hexaner:EtOAc (4:1) som mobil fase. En 15-20 g prøve ble injisert i kolonnen og 500 ml fraksjoner ble samlet opp med en totale på 8,5 1 tilført mobil fase. Ved denne fremgangsmåte ble 72,1 g av cis/ trans blandingen adskilt i de rene komponenter for å gi 55,1 g (76%) av trans-forbindelse V, smeltepunkt 163-165<*>C og 10,3 g (14%) av den tilsvarende cis-forbindelse, smeltepunkt 145-148°C. ;I en alternativ fremgangsmåte ble isomerisering utført for å isomerisere alt av blandingen til trans-forbindelsen V. En 500 ml flaske utstyrt med en mekanisk rører, termometer og nitrogenbobler ble tilsatt 11,9 g (0,037 mol) av ovenfor nevnte faste materiale, oppløst i 250ml metylenklorid og avkjølt til -10°C (is-salt bad). Oppløsningen ble tilsatt 17,3 g (0,129 mol) av A1C13som hevet den innvendige reaksjonstemperatur til -5°C. Suspensjonen ble omrørt ved -5° 5°C i 5 timer og derpå helt opp i ca. 500 ml isvann og overført til en separasjonstrakt hvor fasene ble tillatt å separere. ;Metylenkloridlaget ble tørket over vannfri Na2S04, konsentrert på en rotasjonsevaporator (40°C/50mm Hg)til et off-white fast stoff suspendert i 500ml heksan og oppvarmet til tilbakeløp på et dampbad i 15 minutter. Den varme suspensjonen ble filtrert på en Buchner-trakt, vasket med ca. 100ml kokende heksan og tørket i en vakuumovn (25°C/10 mm Hg) over natten for å gi 9,5 g (80%) av den hvite faste forbindelse V, smeltepunkt 161-166,5°C. ;Eksempel 6 ;Fremstilling av ;ftrans- rac)- 6a, 7, 8. 9, 10, lOa- Heksahvdro- 1, 9- dihydroksv- 6, 6-dimetyl- 3- pentvl- 6H- dibenzo( b. d) pyran- 9- karbonitril ( VI) ;En oppløsning av 5 g (0,158 mol) av forbindelse V i 175 ml metanol ble tilsatt en suspensjon av 5 g (0,102 mol) av natriumcyanid i 20 ml metanol og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur under nitrogen i 2 timer. En oppløsning av 5,75 ml iseddiksyre i 50 ml metanol ble tilsatt blandingen og omrøring ble fortsatt i 30 minutter. pH av blandingen ble justert til ca. 2 med vannfri HC1 og blandingen ble omrørt over natten under nitrogen. ;Oppløsningsmidlet ble destillert av ved å bruke et 40 °C-vannbad og aspirator over en 1-timers periode, hvorpå residuet ble delt mellom 75 ml vann og 100 ml metylenklorid. Det vandige lag ble ekstrahert med ytterligere 100 ml metylenklorid, hvorpå de kombinerte organiske lag ble tørket over vannfri Na2SC>4 og inndampet på en rotas jonsevaporator (40°C/20 mm Hg) til tørrhet. Ytterligere tørking ble utført i en 1/2 time ved 0,5 mm Hg for å gi 5,5 g (100%) av forbindelse VI som et lys gult skum. Dette materialet ble brukt uten ytterligere opprensing for fremstillingen av forbindelse VII, selv om en analytisk prøve ble rekrystallisert fra metylenklorid/petroleumeter (1:10) for å gi vannfri nåler, smeltepunkt 131-133°C. ;Eksempel 7 ;Fremstilling av ;ftrans- rac)- 6a, 7. 8, 9, 10. lOa- Heksahydro- 1, 9- dihydroksy- 6, 6-dimetvl- 3- penty1- 6H- diben z o ( b, d) pyran- 9- karboksylsvre metvlester ( VII) ;En omrørt oppløsning av 5,5 g (0,0160 mol) av forbindelse VI i 150 ml metanol ble behandlet ved bobling i vannfri HC1 ved 3°C i et isbad i løpet av en periode på 1,25 timer til metning. Flasken ble lukket med et septum og holdt ved -2CC i 48 timer, hvorpå 75 ml 6N vandig HC1 ble tilsatt. Blandingen ble inndampet i en rotasjonsevaporator (35°C/20 mm Hg) og derpå ved 0,5 mm Hg for å danne en olje. ;Oljen ble suspendert i 150 ml 50% vandig metanol og tillatt å stå over natten ved 25°C. Et fyldig hvitt presipitat dannet seg, som ble samlet opp ved filtrering og derpå oppløst i 250 ml etylacetat. En liten mengde vann ble separert fra blandingen og det organiske lag ble tørket over vannfri Na2S04og derpå inndampet til tørrhet i vakuum (30° C/20 mm Hg). ;Residuet ble triturert med 50 ml petroleumeter (kokepunkt30-60°C). De faste partikler ble samlet opp ved filtrering, vasket med 50 ml petroleumeter i to like deler og tørket under vakuum (40°C, 0,5 mm Hg) i 2 timer for å gi 1,3 g (53%) av et fargeløst fast stoff, smeltepunkt 178-180°C. Moderluten ble inndampet for å gi 1,3 g (22,5%) av en gul olje som NMR-analyse viste var den epimeriske hydroksyester av forbindelse VII. Det totale utbytte var således 75%. ;Eksempel 8 ;Fremstilling av ;ftrans- rac)- 6a, 7. 10, 10a- Tetrahvdro- l- hydroksy- 6, 6- dimetyl- 3-pentyl- 6H- dibenzo( b, d) pyran- 9- karboksylsyre- metylester ;( VIII) ;En 50 ml reaksjonsflaske utstyrt med en nitrogenbobler og en magnetisk rører ble tilsatt 1,4 g (0,0037 mol) av forbindelse VIII, 10 ml pyridin og 2,0 ml tionylklorid og derpå omrørt ved romtempertur under nitrogen i 1 time. Reaksjonen ble stoppet ved å helle den opp i 30 ml isvann, og deretter ekstrahert i 90 ml etylacetat i tre like deler. ;Det organiske lag ble tørket over vannfri Na2S04og inndampet til tørrhet i vakuum (25°C, 1 mm Hg) for å gi 1,2 g av et fast skum. Dette skum ble triturert med 3 0 ml petroleumeter (30-60°C) for å gi 975 mg (73%) av et lyse-gult fast stoff, smeltepunkt 107-110°C. En analytisk prøve ble rekrystallisert fra eter-hexaner (1:6) for å gi fargefri krystaller, smeltepunkt 139-141°C. ;Eksempel 9 ;Fremstilling av ;( trans- rac)- 1- f 3- Aminopropoksy)- 6a, 7, 10. 10a- tetrahydro- 6. 6-dimetvl- 3- pentvl- 6H- dibenzo( b, d) pyran- 9- karboksylsyre monohydroklorid ( IX) ;358 mg (0,001 mol) av forbindelse VIII ble tilsatt en suspensjon av 60 mg (0,0015 mol) av natriumhydrid (Aldrich, 60% i mineralolje, forvasket med heksan) i 30 ml N,N-dimetyl-formamid (DMF) og blandingen ble omrørt ved romtemperatur under nitrogen i 3 0 minutter. Derpå ble 560 mg (0,00021 mol) av N-3-brompropylftalimid tilsatt, for å gi en brun oppløsning som ble omrørt under nitrogen i 3 timer. ;Blandingen ble helt opp i 20 ml isvann og ekstrahert i 40 ml etylacetat i to like deler. De organiske lag ble tørket over vannfri Na2S04og inndampet i vakuum (25°C, 1 mm Hg) for å gi 740 mg av en gul olje. Oljen ble oppløst i 10 ml heksan: etylacetat (7:3) og renset ved kolonne-kromatografi i en 28 g silicagelkolonne som hadde blitt forpakket i heksan:etylacetat (7:3). 200 ml fraksjoner ble samlet opp, og de som inneholdt det ønskede produkt som vist ved TLC på silicagel, ble inndampet i vakuum (25°C, 1 mm Hg) for å gi 322 mg (57,9%) av et farveløst skum. ;Alt skummet ble oppløst i 10 ml 15% metylamin i metanol, omrørt under nitrogen ved romtemperatur i 1 time og derpå inndampet i vakuum (25°C, 1 mm Hg) til tørrhet. Residuet ble tatt opp i en blanding av 10 ml 2N NaOH og 10 ml metanol og omrørt under nitrogen under natten. Blandingen ble så inndampet i vakuum (25°C, 50 mm Hg) til nær tørrhet, gjort sur med 6N HC1 til pH 2 og ekstrahert i 20 ml etylacetat i to like deler. De organiske lag ble tørket over vannfri Na2S04og inndampet til tørrhet i vakuum (25°C, 1 mm Hg) og residuet ble triturert for å gi 90 mg (35%) av et fargeløst fast stoff, smeltepunkt 255-257<*>C.

Eksempel 10

Fremstilling av

( trans- rac)- 9- Hydroksy- 6a, 7, 8. 9, 10, lOa- hexahydro- 1-( 4-nitrobenzyl)- 6. 6- dimetyl- 3- pentvl- 6H- dibenzo( b, d) pvran- 9-karboksylsyre metvlester ( X)

En oppløsning av 3,80 g (0,01 mol) av forbindelse VII (se eksempel 8) i 150 ml aceton ble omrørt under argon i en 500 ml tre-halset flaske, mens 2,25 g (0,01 mol) a p-nitro-benzylbromid ble tilsatt. 7 g (0,05 mol) av fint pulverisert vannfritt K2C03ble tilsatt og den resulterende suspensjon ble omrørt raskt under argon i 18 timer ved 25°C. Analyse ved tynnsjikt-kromatografi (TLC) på silicagelplater i heksan-etylacetat (7:3) med 10% CeS04/H2S04, hvori resultatene ble gjort synlige ved en 10% fosfomolybdensyre/ etanol-spray fulgt av oppvarming, viste at reaksjonen var

fullstendig.

Blandingen ble filtrert og residiet ble inndampet i vakuum for å gi en gul olje. Denne olje ble oppløst i 5 ml eter og helt over en 30 g plugg av silica gel (70-230 mesh, E. Merck) i en sintrert glasstrakt. Pluggen ble så eluert med 4 00 ml eter og oppløsningsmidlet ble samlet opp og inndampet til tørrhet på en rotasjonsevaporator ved 30°C.

Krystallisering av residuet fra eter-heksan (1:5) ga 4,7 g av et lett fast stoff, smeltepunkt 120-123'C.

Eksempel 11

Fremstilling av

( trans- rac)- 6a, 7, 10. lOa- Tetrahvdro- l-( 4- nitrobutyl- 6. 6-dimetvl- 3- pentyl- 6H- dibenzo( b, d) pyran- 9- karboksylsvre met<y>lester ( XI)

En blanding inneholdende 2,5 g (0,00488 mol) av forbindelse X, 15 ml pyridin og 7,75 g (0,05075 mol) av P0C13ble omrørt ved romtemperatur under argon i 2 timer. Blandingen ble så helt opp i 100 ml knust is og ekstrahert med 100 ml volumdeler av CH2C12. Det organiske lag ble tørket over Na2S04, filtrert og inndampet til tørrhet. Residuet ble tatt opp i 30 ml CH2C12og filtrert gjennom en plugg av 20 g silicagel (70-230 mesh). Pluggen ble eluert med 100 ml 1:1 heksan-eter og eluenten ble inndampet til tørrhet på en rotasjonsevaporator ved 3 0°C.

Residuet ved triturering fra 50 ml petroleumeter ga i 2 utbytter 1,65 g (68%) av fargefrie prismer, smeltepunkt 165-167°C.

Eksempel 12

Fremstilling av

ftrans- rac)- 6a. 7, 10. lOa- Tetrahydro- 1-( 4- aminobenzvl)- 6, 6-dimetyl- 3- pentvl- 6H- dibenzo( b , d) pyran- 9- karboksylsyre met<y>lester ( XII)

En blanding inneholdene l,65g (0,003 mol) av forbindelse XI, 50 ml CH2Cl2/100 ml etanol og 3,4 g 85% hydrazinhydrat (Aldrich) ble raskt omrørt som en oppslemming. 500 ml teknisk Raney-nikkel (forrenset med 3 ml volumdeler av etanol) i etanol ble så tilsatt i en del. Blandingen ble raskt omrørt ved romtemperatur i 1 time hvorpå katalysatoren ble fjernet ved filtrering over en pute av Celit. Puten ble renset med tre 25 ml volumdeler hver av CH2C12og etanol, og de kombinerte filtrater ble inndampet på en rotasjonsevaporator (40°C, 5 mm Hg).

Residuet ble tatt opp i 25 ml CH2C12, passert gjennom en plugg av 25 g silcia gel (70-230 mesh, E. Merck) og eluert med 300 ml hexan-etylacetat (1:1). Det kombinerte eluat ble inndampet på en rotasjonsevaporator (40°C, 5 mm Hg) for å gi1,5 g av et gult semi-fast stoff. Dette grovprodukt ble igjenrenset som beskrevet ovenfor og så krystallisert fra heksan-eter. Et utbytte på 956 mg (62%) av et lys gult fast stoff, smeltepunkt 112-114'C, ble erholdt.

Eksempel 13

Fremstilling av

( trans- rac)- 6a, 7. 10, lOa- Tetrahydro- l-( 4- aminobenzvl)- 6. 6-dimetyl- 3- pentyl- 6H- dibenzo( b, d) pvran- 9- karboksylsvre

( XIII)

En blanding inneholdene 110 mg (0,22 mmol) av forbindelse XII, 10 ml 2N NaOH og 25 ml etanol ble oppvarmet ved tilbakeløp under argon i 1 time. Denne blanding ble inndampet på en rotasjonsevaporator (30°C, 0,5 mm Hg) for å fjerne mesteparten av etanolen og bringe volumet til ca. 15 ml. pH ble justert til 2 med 6N HCl og blandingen ble ekstrahert med to 30 ml volumdeler av CH2C12.

Det organiske lag ble tørket over Na2S04og derpå inndampet (30°C, 10 mm Hg) for å gi 105 mg av et brunt skum. Den amorfe aminosyre kunne ikke krystalliseres, men analyse med 400 MHZNMR, IR og masse-spektroskopi var konsistent med den ventede struktur og viste at produktet i hovedsak var homogent.

Eksempel 14

Fremstilling av anti- THC- antiserum

100 mg av et cannabinol-derivat av formel

ble oppløst i 20 ml 30% metanol ved pH 4,5. Til denne oppløsning ble 84 mg 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbo-diimid-hydroklorid tilsatt og pH ble justert til 4,5. Etter blandingen til romtemperatur i 3 0 minutter ble 100 mg metylert bovint serum albumin tilsatt i 20 ml vann under blanding og pH ble igjen justert til 4,5. Oppløsningen ble blandet i 1 time ved romtempertur og derpå over natten ved 4°C, hvoretter ethvert ukonjugert cannabinol-derivat ble fjernet ved dialyse mot 1000-ml volumskift av natriumfosfatbuffer ved 4"C for å gi et THC-metylert albuminkonjugat.

100 mg av lipopolysaccarid (LPS; mikrobisk kilde) i 5 ml vann ble kombinert med 1 ml 1,0 M NaI04og behandlet i 2 timer ved romtemperatur i mørket. 1 ml etylen-glykol ble

tilsatt og blandingen ble omrørt i ytterligere 3 0 minutter ved romtemperatur. De aktiverte lipopolysaccarid ble tilsatt en Sephadex<R>G-25 kolonne ekvilibrert med vann og en turbid effluent fraksjon ble samlet opp.

5 ml tetrahydrofuran inneholdene 38,75 mg av et cannabinol-derivat av formel

ble satt til den aktiverte LPS-aktiverte effluent og blandingen ble inkubert i 18 timer ved 22°C i mørket. 2 ml av en oppløsning av 4,5 mg/ml NaBH4i H20 ble tilsatt og blandingen ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Ukonjugert THC-derivat ble fjernet ved dialyse i 2 dager mot hyppige skift av vann og i 2 dager mot 0,1 M eddiksyre, pH 3,5 for å gi et THC-LPS konjugat.100mg av humant IgG ble oppløst i 7 ml 0,2 M NaHC03, pH 9,6 og 108 mg av et cannabinolderivat av formel

i 2 ml dioksan ble tilsatt. Ytterligere 9 ml dioksan ble tilsatt, blandingen ble blandet intermittent i 4 timer ved 4'C, hvorpå 180 ml kald aceton ble tilsatt. Blandingen ble sentrifugert i 10 minutter ved 2 000 x g og pelleten ble

vasket en gang med 20 ml kald aceton. Etter sentrifugering i 10 minutter ved 2 000 x g ble pelleten resuspendert i 10 ml

fosfatbuffret saltvann (PBS). Dialyse ble utført i 3 dager ved 4'C mot to skift pr. dag av 1000 ml volumdeler PBS for å gi et THC-human IgG konjugat.

New Zealand hvite kaniner ble injisert intramuskulært ved de fire aksillære regioner med 200 yig THC i form av de ovenfornevnte konjugater i 1 ml Freunds fullstendig adjuvant. Booster injeksjoner inneholdene 100 pg av samme konjugater ble gitt etter to uker i 1 ml Freunds ufullstendige adjuvant, og antiserum ble samlet opp fra ørevenene etter 4 uker.

Akseptable anti-THC antisera fra de tre kaniner ble slått sammen for bruk som beskrevet nedenfor.

Eksempel 15

Rensing av anti- THC- IgG

10 ml av en mettet ammoniumsulfat-oppløsning ble sakte

tilsatt dråpevis til 2 0 ml anti-THC-antiserum under kontin-uerlig omrøring ved 23°C. Opprinnelig dannet et hvitt

presipitat seg som fikk gjenoppløses før ytterligere ammoniumsulfattilsetning. Etter at ca. 6 ml av ammonium-sulf atoppløsning hadde blitt tilsatt, besto presipitatet fortsatt, og fra dette punkt ble sakte dråpevist tilsetning fortsatt uten pause. Omrøring av suspensjonen ble fortsatt i 2 timer ved romtemperatur, etter at alt av ammoniumsulfat-oppløsningen hadde blitt tilsatt, hvoretter blandingen ble sentrifugert ved 1500 x g i 30 minutter ved romtemperatur. Denne fremgangsmåte plasserer mesteparten av IgG i pelletten.

Etter sentrifugering ble supernatantvæsken dekantert og pelletten ble oppløst ved tilsetning av TRIS/salin (blanding) til et endelig volum på 20 ml. IgG i oppløsningen ble represipitert ved gjentagelse av ovenfor nevnte ammoniumsulfattilsetning og sentrifugeringstrinn, hvorpå supernatantvæsken igjen ble dekantert. Pelletten ble oppløst i 10 ml 0,02 M Tris/salin, pH 7,5 med 0,01% timerosal (natrium etylkvikksølvtiosalicylat).

For å fjerne ammoniumsulfatet fra den IgG-inneholdene oppløsning ble dialyse utført over natten ved 4°C mot 3 toliters volumdeler av 0,02 M Tris/salin. Materialene i dialyseposen ble så bragt til et endelig volum på 20 ml ved tilsetning av 0,02 M Tris/salin. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2000 x g i 30 minutter ved 4°C, og en liten pellett som hadde dannet seg, ble kastet. Proteinkonsentra-sjonen i den endelige IgG-inneholdene oppløsning ble så bestemt ved spektrofotometrisk analyse ved 280 nm til å være ca. 5,3 mg/ml.

Eksempel 16

Fremstilling av anti- THC- kuler

En 4-liters vakuumsflaske ble fylt til 2500 ml-merket med 1/4 tommes frosne polystyrenkuler (Clifton Plastics, Inc, Clifton Heights, PA) og 2500 ml 95% etanol ble tilsatt under omrøring. Flasken ble plassert under våkum (1 mm Hg) i 30 minutter ved romtemperatur og etanolen ble dekantert. Etanol-tilsetningen, vakumbehandlingen og dekanterings-trinnene ble gjentatt ytterligere to ganger, hvorpå kulene ble suspendert i 3 liter deionisert vann. Vannet ble dekantert og kulene ble vasket ytterligere to ganger på denne måte med 3-liters deler av deionisert vann.2liter deionisert vann ble så tilsatt til de dekanterte kuler og blandingen fikk stå over natten ved romtemperatur. Gjennom vaskeprosedyren er det viktig at kulene aldri får tørke ut.

For å bekle de vaskede kuler med antistoff mot THCble anti-THC IgG-oppløsningen beskrevet ovenfor fortynnet til en endelig proteinkonsentrasjon på 25 pg/ml med 50 mM natrium- boratbuffer pH 8,0 (beleggoppløsning). Kulene ble belagt ved å tilsette 143 ml (nok til å dekke kulene) av overtrekks-oppløsningen til et oppmålt volum på 250 ml av de nedfelte kuler (ca. 1000 kuler) hvorfra vannet hadde blitt dekantert og så å la blandingen stå i 18 til 24 timer ved 18-26°C.

Etter beleggprosedyren ble overtrekksoppløsningen dekantert og kastet og kulene ble vasket tre ganger ved 4°C med 500 ml volumdeler av en vaskebuffer inneholdene 0,01 M natriumfosfat i 0,15 M salin med 0,01% timerosal, pH 7,2. Hver gang ble kulene grundig suspendert i vaskeoppløsningen ved omrøring og oppløsningen ble dekantert etter at kulene hadde fått nedfelt seg. Gjennom denne prosedyre ble det nøye sikret at kulene ikke tørket ut.

Derpå ble kulene behandlet for å blokkere umettede seter ved å bruke en av to fremgangsmåter. Gjennom prosedyren som følger ble kulene håndtert kun med plast- eller glassanord-ninger.

Et 250 ml nedfelt volum, (ca. 1000 kuler) av de vaskede anti-THC-belagte kuler ovenfor, ble behandlet etter dekante-ring med ca. 143 ml (nok til å dekke kulene) av en 45"C-blokkerende buffer inneholdene 100 mM natriumfosfat med 1% bovint serum albumin (BSA) og 0,05% timerosal, pH 6,8 i 18-24 timer. Etter blokkeringsbufferbehandlingen ble kulene vasket tre ganger med 500 ml deler av fersk blokkerings-buf f er ved 4'C. Hver gang ble kulene suspendert i bufferen under omrøring og fikk utfelles, og bufferen ble dekantert. For lagring ble en mengde av blokkeringsbufferen tilstrek-kelig til å dekke kulene tilsatt, og kulene ble oppbevart ved 4°C inntil de trenges.

Selvfølgelig kan ovenfornevnte fremgangsmåte skaleres opp etter behov så lenge de relative deler av kuler og oppløs-ninger opprettholdes.

Eksempel 17

Fremstilling av THC derivat- peroksydasekonjuqater

10mg pepperotperoksydase [Boehringer Mannheim eller Seravac (Pel Freeze)] ble aktivert for konjugering ved oppløsning i 3 ml deionisert vann, omrøring i 1 time i mørke ved romtemperatur. 1/2 ml av 0,1 M natrium-metaperiodat (natrium-periodat) ble sakte tilsatt nevnte oppløsning over 20 minutter under omrøring i mørket ved romtemperatur. Natrium-periodatoppløsningen ble fremstilt fersk umiddelbart før bruk, og aktiveringsreaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 0,5 ml 0,5 M etylenglykol, avkjølt til 4-8°C.

Blandingen ble umiddelbart plassert i en dialysepose (Spectrapor, molekylvekt-cutoff 12.000-14.000) og dialysert over natten ved 4°C mot 3 énliters skift av 0,01 M natriumacetatbuffer, pH 5,5. Etter dialyse ble materialet i posen (volum 4,0 ml) plassert i et 10 ml amber Wheaton beger.

For konjugeringsreaksjonen ble 4 ml av en 1:1 blanding av etanol:0,4 M natriumacetatbuffer, pH 5,5, inneholdene ca. 0,56 mg (trans-rac)-1-(3-aminoproksy)-6a,7,10,10a-tetrahydro-6,6-dimetyl-3-pentyl-6H-dibenzo(b,d)pyran-9-karboksylsyre monohydroklorid (forbindelse IX, se fig. 1 og eksempel 9 ovenfor) tilsatt dråpevis under omrøring til den aktiverte peroksydaseoppløsning og tillatt å reagere i 2 timer ved romtemperatur i mørket.

For å stabilisere Schiffs basen som hadde blitt dannet, ble1ml av 0,1 M natrium cyanoborhydrid tilsatt peroksydase-konjugeringsblandingen og blandingen ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur i mørket.

Den stabiliserte konjugeringsreaksjonsblanding ble så delt opp i fire like deler og satt på fire Farmasia PD-10-kolonner som på forhånd hadde blitt ekvilibrert med buffer inneholdene 0,2 M natriumfosfat pH 6,8 (kromatograferingsbuffer). De påsatte deler ble ført inn i toppene av kolonne-materialene og overlagt med 4 ml kromatograferingsbuffer.

En volumdel av kolonne-eluat på ca. 12,4 ml ble samlet opp fra hver kolonne. Spektrofotometrisk analyse ved 403 nm viste at gjennvinningen av peroksydase i konjugert form var ca. 66% idet ekstinksjonskoeffisienten ble tatt for å være 2,3. 5 ml av den konjugerte elatoppløsning ble fortynnet med 0,2 M natriumfosfatbuffer pH 6,8 (fortynnet THC-peroxidase-konjugatreagent) for bruk som beskrevet nedenfor.

Eksempel 18

THC- enzym immunoassay fremgangsmåte

En serie på 11 x 75 mm polystyren forsøksrør ble satt opp inneholdene duplikate 50 pl deler av urinprøver som skal analyseres eller normale kontroller eller THC-standard-inneholdende urinprøver. Standard og normal kontrolldelene ble tatt fra normale urinprøver inneholdene 0, 50, 100, 200 eller 500 ng/ml tilsatt 9-karboksy-ll-nor-<9->tetrahydro-cannabinol (100 yg/ml i absolutt etanol, Research Triangle Institute, Research Triangle Park, NC) . 250 jjI av det fortynnede THC-peroksydase konjugatreagens ble tilsatt hvert rør og rørene ble ristet. En anti-THC kule ble så tilsatt hvert rør, innholdet av rørene ble blandet og rørene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur.

Etter inkuberingen ble kulene vasket tre ganger ved å tilsette 3 ml mengder deionisert vann med risting og så aspirering av vannet. 2 50 pl av et kromogent reagens inneholdene 7,2 mg/ml o-fenylendiamindihydroklorid og 6 mM H202i 0,1 M kaliumsitratbuffer pH 5,25 med 0,1 ml/liter av oppløsningen Kathon CG® ( en isotiazolin-oppløsning fra Rohm og Haas) tilsatt som et preservativ til hver vasket kule og rørene ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur i mørke. Reaksjonsene ble så stoppet ved tilsetning av 1 ml 1 N svovelsyre til hvert rør og absorbansen av prøveoppløsn-ingene ble målt ved 492 nm.

En avtegning av absorbansen ved 492 nm mot 9-karboksy-ll-nor-A<9->tetrahydrocannabinol-konsentrasjonen for standardene som ble brukt er vist i fig. 3.

Eksempel 19

Klinisk<p>røveanalyse

For å etablere sensitiviteten og nøyaktigheten av THC-enzym immunoassayet i følge oppfinnelsen, ble en serie på 60 kliniske urinprøver vurdert ved å bruke assayet (EIA) og Roche THC radioimmunoassay (RIA)-systemet med resultatene vist i tabell 1. Terskelen for en positiv test i tabell 1 ble tatt for å være 50 ng/ml 9-karboksy-ll-nor-A<9->tetrahydro-cannabinol i EIA og100 ng/ml i RIA. Basert på disse kriterier for en positiv test viste kun prøve nr. 18 en uoverenstemmelse mellom resultatene erholdt fra de to analytiske metoder. Denne prøve var positiv ved EIA, men negativ ved RIA. Prøve 18 ble undersøkt på nytt med begge metoder og funnet å være positiv i de nye forsøk ved både RIA og EIA.

Som en ytterligere undersøkelse av spesifisiteten til THC-enzym-immunoassayet ble et antall droger ikke relatert til cannabinoidene tilsatt til sammenslåtte normale humane urin-prøver ved en konsentrasjon på 10.000 ng/ml og undersøkt ved hjelp av metoden. Ingen av disse forbindelser, som er opp-listet i tabell 2, var positive i assayet.

Mange modifikasjoner og variasjoner av foreliggende oppfinnelse kan foretas uten å fravike ideen eller omfanget av denne, noe som vil være tydelig for fagmannen. De spesielle utførelsesformer som er beskrevet heri er gitt kun som eksempler og oppfinnelsen er begrenset kun ut fra de forhold som er angitt i de medfølgende krav.

Claims (3)

1. Forbindelse,karakterisert vedformelen

hvor R er en sidekjede valgt fra gruppen omfattende en p-aminobenzylgruppe eller en forgrenet eller lineær amino-alkylgruppe med fra 1 til 7 karbonatomer eller et organisk eller mineralsyre-addisjonssalt derav, et isocyanat eller isotiocyanat-derivat av p-aminobenzyl eller aminoalkylgruppen, et karboksylterminert derivat av aminoalkylgruppen med fra 1 til 7 karbonatomer eller et salt derav samt et aktivert derivat av det karboksylterminerte derivat.

2. Forbindelse,karakterisert vedat den er (trans-rac)-1-(3-aminoproksy)-6a,7,10,10a-tetrahydro-6,6-dimetyl-3-pentyl-6H-dibenzo(b,d)pyran-9-karboksylsyre- - monoklorid.

3. Anvendelse av forbindelsen ifølge krav 1 ved immunoassay av cannabinol-metabolitter samt antistoff mot cannabinol-metabolitter som er istand til å binde selektivt til forbindelser ifølge krav 1.