NO162522B

NO162522B - Vandig opploesning av paa forhaand fremstilte polymerer med oekte viskositetsegenskaper og fremgangsmaate for aa oeke viskositeteen i en opploesning av paa forhaand fremstilte polymerer.

Info

Publication number: NO162522B
Application number: NO845235A
Authority: NO
Inventors: Kathleen Marie Antloga; Lawrence Ernest Ball; William Michael Griffin
Original assignee: Standard Oil Co Ohio
Priority date: 1983-12-29
Filing date: 1984-12-27
Publication date: 1989-10-02
Also published as: CA1271150A; GB2153834A; AR242042A1; NO845235L; GB8432161D0; GB2153834B; MX163159B; NO162522C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en vandig oppløsning

av på forhånd fremstilte polymerer med økte viskositetsegenskaper og en fremgangsmåte for å øke viskositeten i en opp-løsning av på forhånd fremstilte polymerer.

Forsåvidt angår foreliggende oppfinnelse kan alle polymerer inndeles i to klasser: biopolymerer og syntetiske polymerer. Biopolymerer er polymerer som fremstilles i det minste del-

vis ved innvirkningen av biologiske prosesser, mens syntetiske polymerer fremstilles ved hjelp av kjemiske fremgangsmåter .

Biopolymerer kan fåes fra en rekke naturlige plante-kilder, inkludert utsondringer fra tre, frøekstrakter, tang, stivelser og cellulosederivater. Noen biopolymerer, slik som visse polysaccharider, kan fremstilles ved hjelp av mikroorganismer.

Et velkjent eksempel på en mikrobiell biopolymer er xanthangummi som er et anionisk heteropolysaccharid fremstilt ekstracellulært fra carbohydratstoffer ved hjelp av organismer av slekten Xanthomonas, som f.eks. X. campe stris og X. begoniae. Xanthan og flere andre mikrobielle biopolymerer, som f.eks. sopproduktet scleroglucan som selges

under varemerket "Polytran" og et polysaccharid erholdt fra jordbakterien Erwinia markedsført under varemerket "Zanflo"

er tilgjengelig i kommersielle mengder for slike anvendelser som trykksverter og belegg, kosmetika, keramikk, malings-fortykkere, boreslam, farmasøytiske midler og mat. Noen mikrobielle biopolymerer har evne til å virke som overflateaktive midler, som f.eks. surfactin fremstilt av Bacillus subtilis. Disse overflateaktive midler er nyttige som flokkulerings-midler, emulgatorer, demulgeringsmidler, detergenter, lim-stoffer og væsker for anvendelse ved forøkt oljeutvinning.

En mikrobiell biopolymer fåes vanligvis enten ved gjærings- eller enzymatisk syntese. Ved fermentering plasseres en mikroorganisme som genetisk er i stand til å bygge opp en bestemt polymer, i et medium med de nødvendige næringsstoffer og det nødvendige substrat. Polysaccharidet utvinnes fra dette medium. Ved enzymatisk syntese fjernes mikrobeceller fra en cellekultur slik at det blir tilbake en dyrkingsvæske som inneholder det ekstracellulære enzym. Enzymet bringes så i kontakt med substratet hvorved polysaccharidet fremstilles. For ytterligere informasjon vedrørende polysaccharider og fremstilling av disse henvises det til "Microbial Polysaccharides", Kirk- Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 3. ed., vol. 15, sidene 439 - 58.

Syntetiske polymerer fremstilles ved å kombinere én eller flere typer monomere stoffer under betingelser som er egnet for polymerisering. De er vanligvis mindre komplekse enn biopolymerer idet de som oftest består av en regelmessig rekkefølge av enkle monomerenheter.

Både biopolymerer og syntetiske polymerer kan tilsettes til vann eller andre oppløsningsmidler for å danne oppløsninger som har fordelaktige egenskaper, som f.eks. forøkt oppløsningsviskositet. Viskositeten i disse oppløsninger kan variere sterkt avhengig av mengde polymer i oppløsning, molekylvekt og polymerens struktur, temperatur, tilstedeværelse av salter (særlig flervalente salter, slik som magnesium og kalsium) og andre faktorer.

Vedvarende stabilitet hos polymeroppløsninger under krevende betingelser med hensyn til temperatur, saltinnhold, trykk, skjærkrefter og tilstedeværelse av oxygen og kjemikalier, er viktig for enkelte brukere. Noen mikroorga-

nismer, enten de naturlig foreligger i oppl0snings.miljøet eller er innført ved forurensning, er også i stand til å bryte ned polymere stoffer og derved nedsette viskositeten i oppløsningen. F.eks. utskiller mange mikroorganismer enzymer (cellulase, amylase) som kan hydrolysere polysaccharider til monosaccharider som kan brukes i organismens metabolisme. Syntetiske polymerer kan også tape viskositet under mikrobe-angrep.

Av de ovenfor angitte grunner er ett av formålene ved den pågående forskning å produsere stabile polymeroppløsninger.

Oppløsningen må være stabil både overfor de kjemiske, termiske og biologiske forhold man støter på i forskjellige industri-elle prosesser. Av særlig interesse er letingen etter en polymer-oppløsning for anvendelse i forøkt oljeutvinning som beholder sin stabilitet under forbehandlingstrinn, injeksjon

og gjennom den oljeførende formasjon.

Av økonomiske grunner er det et annet formål å oppnå maksimal viskositet til minst mulig kostnad, dvs. høyest mulig viskositet fra den minst mulige mengde polymer i opp-løsningen.

Oppfinnelsen vedrører en vandig oppløsning av på forhånd fremstilte polymerer med økte viskositetsegenskaper.

Den vandige oppløsning er kjennetegnet ved at den er fremstilt ved å blande, under betingelser som bidrar til bakteriell vekst, en vandig oppløsning av på forhånd fremstilte polymerer med en bakterie valgt fra gruppen bestående av gram-negative stavbakterier, gram-positive stavbakterier og gram-positive kulebakterier, uten evne til ny-syntese av polymerene, men med evne til å øke viskositeten i polymeroppløsningen, idet denne evnen er påvist ved hjelp av følgende screening-fremgangsmåte:

(i) fremstilling av en dyrkningskultur av bakterien, (ii) fremstilling av en vandig oppløsning av de på forhånd fremstilte polymerer og tilsetning av næringsstoffer og mineraler som er påkrevet for bakteriell vekst, (iii) separering av oppløsningen i to deler, en test-og en kontrolldel, hvor begge deler mangler substrat bortsett fra de på forhånd fremstilte polymerer og derved mangler et utnyttbart substrat for å muliggjøre syntese av en annen polymer, (iv) inokulering av testoppløsningen med kulturen av bakterien og inkubering av test- og kontrollopp-løsningene, og (v) måling av viskositetene i både test- og kontroll-oppløsningene etter inkubering for å bestemme testoppløsningens viskositet i forhold til kon-trolloppløsningens viskositet.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for å øke viskositeten i en oppløsning av på forhånd fremstilte polymerer ved å blande under betingelser som begunstiger bakteriell vekst,

(a) en vandig oppløsning av på forhånd fremstilte poly-

merer og

(b) en bakterie valgt fra gruppen bestående av gram-negative stavbakterier, gram-positive stavbakterier og gram-positive kulebakterier uten evne til ny-syntese av polymerene, men med evne til å øke viskositeten i polymeroppløsningen i den følgende screeningfremgangsmåte: (i) fremstilling av en dyrkninqskultur av bakterien , (ii) fremstilling av en vandig oppløsning av de på forhånd fremstilte polymerer og tilsetning av næringsstoffer og mineraler som er påkrevet for bakteriell vekst, (iii) separering av oppløsningen i to deler, en test- og en kontrolldel, idet begge delene mangler substrat bortsett fra de på forhånd fremstilte polymerer og derved mangler et utnyttbart substrat for å muliggjøre syntese av en annen polymer, (iv) inokulering av testoppløsningen med kulturen av mikroorganismen og inkubering av test-

og kontrolloppløsningene, og

(v) måling av viskositetene i både test- og kon-trolloppløsningen etter inkuberingen for å bestemme testoppløsningens viskositet i forhold til kontrollopplusningens viskositet.

Det er nu oppdaget at visse bakterier er i stand til å øke viskositeten i en polymeroppløsning selv når den aktuelle bakterie i seg selv genetisk ikke er i stand til ny-syntese av polymeren. Uttrykket "ny-syntese" brukes her for å utelate de kjente teknikker hvor en bakterie bygger opp polymert materiale (slik som polysaccharider) fra monomerer og derved øker viskositeten i en oppløsning. Slik som foreliggende oppfinnelse er definert kan bakterien ikke bygge opp den utvalgte polymer fra monomerer. Denne fremgangsmåte passer derfor best for på forhånd fremstilte polymerer (dvs. polymerer som tidligere er blitt fremstilt enten ved kjemisk eller mikrobiell syntese). F.eks. kan en bestemt bakterie genetisk være ute av stand til å produsere et polysaccharid, men er i stand til å endre en oppløsning av polysaccharidet på en måte som bevirker en økning av dens viskositet.

Uten at det er ment å binde seg til en bestemt teori, antas det at bakterien virker på en måte som øker den gjennomsnittlige molekylvekt til polymerene i oppløsning, muligens gjennom virkningen av ett eller flere enzymer. Nedenunder gis det en nærmere beskrivelse av egnede polymerer, bakterier, viskositetsendringer og fremgangsmåten.

Polymerer

Polymerene som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse omfatter alle biopolymerer og syntetiske polymerer som er forenlige med vann. Det er foretrukket at polymerene ikke bare er forenlige med vann, men at de er lett oppløselige i vann ettersom de derved vil være lett tilgjengelige for bakteriene og eventuelle ledsagende ekstracellulære enzymer i et vandig medium. Selv delvis oppløselige eller vann-uopp-løselige polymerer anses imidlertid for å ligge innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse, forutsatt at det foreligger en grenseflate mellom polymeren og bakterien eller enzymene.

Forsåvidt gjelder foreliggende oppfinnelse betyr en "oppløsning" av polymer i tillegg til oppløst polymer, enhver vannfuktbar polymeroverflate slik som polymersuspen-sjoner, kolloidale dispersjoner, polymergeler eller -emul-sjoner, og fuktbare, faste polymerstoffer.

Ved den foretrukkede utførelsesform av oppfinnelsen kan polymeren velges blant de som er kjent for å være virk-ningsfulle ved en bestemt sluttanvendelse. F.eks. kan det velges et polyacrylamid dersom den ønskede anvendelse er vannbehandling, forøkt oljeutvinnelse, mineralforedling eller tremasse- og papirbearbeiding.

Det er blitt publisert omfattende informasjon ved-rørende anvendelser av polymeroppløsninger. Vannoppløselige polymere materialer med lange kjeder brukes i stor utstrekning som flokkuleringshjelp ved separasjon av faste stoffer og væsker. Bruken av aminerte stivelser, polyaminer og poly-acrylamider i industriell vannbehandling er oppsummert i "Water (Industrial)", Kirk- Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 2. ed., vol. 22. Andre polymere flokkulerings-midler brukes i slike prosesser som vannklaring, kloakkbe-handling, metallpolering, papirproduksjon, raffinering av sukker, mineralekstraksjon og bearbeiding av matvarer slik som omtalt i"Flocculating Agents", Kirk- Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 3. ed., vol. 10.

Forøkt oljeutvinning (EOR) krever vanligvis injeksjon av en vandig væske, som f.eks. vann eller saltvann, for å skyve oljen foran seg gjennom formasjonen til en produksjons-brønn. Det tilsettes ofte en polymer til i det minste en del av den injiserte væske for å danne et slam med forhøyet viskositet. Den polymerfortykkede væske forflytter seg med en jevn front og minimaliserer den forbipassering og "finger-ing" som ellers kan oppstå under konvensjonell vannflømming.

Polymerer som ansees for å være anvendbare ved forøkt oljeutvinning (EOR) omfatter guargummi, hydroxypropylguar, nat-riumcarboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, carboxy-methylhydroxyethylcellulose, xanthangummi, glucan, jonannes-brødtregummi, polyacrylamid, hydrolysert polyacrylamid, poly(acrylsyre)og salter derav, poly(2-acrylamido-2-methyl-propan-svovelsyre)(2-salt) (AMPS), poly(acrylsyre-coacrylat-ester, poly(vinylpyrrolidon), cellulosesulfatestere, poly-(ethylenoxyd), poly(vinylalkohol), polyamin, poly(vinyl-acetat-comaleinsyreanhydrid) og poly(styrensulfonsyre) og salter derav. Blant disse er hydroxyethylcellulose, carboxy-methylhydroxyethylcellulose, xanthangummi og hydrolysert polyacrylamid foretrukket.

Konsentrasjonen av polymeroppløsningen som brukes i

EOR bestemmes vanligvis av permeabiliteten i bergarten og viskositeten til oljen i formasjonen. Av økonomiske grunner holdes konsentrasjonen på de minimale virkningsnivåer som vanligvis er mellom 20 ppm og 3000 ppm, mer vanlig 50 til 1000 ppm, og mest vanlig 200 til 600 ppm. Andre formasjons-forhold som må tas i betraktning ved utvelgelse av en virk-som polymer, er høye temperaturer, skjærspenninger, høyt saltinnhold og ekstreme pH-verdier.

Ellers brukes polymerer på oljefelter ved boring, støping, oppbryting, surgjøring, styring av vannproduksjon, forhindring av sandproduksjon, leirestabilisering, tapt sirkulasjon og lignende. Vanligvis brukes guar, guarderi-vater, celluloseholdige stoffer, xanthaner, gummier fra johannesbrødtre, stivelser og syntetiske polymerer som f.eks. polyacrylamid, slik det er mer fullstendig beskrevet i Chatterji, J. og Borchards, J.K., "Applications of Water-Soluble Polymers in the Oil Field", J. Pet. Tech. , 2042 - 2056, (nov. 1981).

Foretrukkede polymerer til midler for mobilitetskon-troll i EOR har alle eller de fleste av de følgende kjenne-tegn: 1. God oppløselighet i vann med en høy positiv virkning på oppløsningsviskositet; 2. Evne til å tåle oppløste salter (saltvann) i den vandige oppløsning; 3. Høy molekylvekt for maksimal viskositetsvirkning; 4. Fri for usedvanlig stor grad av forgrening eller geler som kan forårsake injeksjonsproolemer; 5. Stabilitet under termiske, biologiske og skjær-spenningspåvirkninger i formasjonsmiljøet og under inj eksjonsprosessen; 6. Eventuelt billig ved produksjon i stort volum eller med en naturlig forekomst i stort volum.

Måling av viskositet

Viskositeten av en vannoppløselig polymer i oppløsning er en funksjon av mange faktorer, hovedsakelig molekylvekt og elektrolyttisk egenskap. Dess høyere molekylvekt polymeren har, dess høyere er viskositeten. Ladede polymerer har også en tilbøyelighet til å tape viskositet i vann med høyt saltinnhold på grunn av nøytralisering av ladningene med ionene i oppløsning.

Ved foreliggende oppfinnelse vil det bli anvendt.den klassiske definisjon av viskositet for newtonske væsker hvor viskositet er lik skjærspenning dividert med skjærhastigheten. Skjærspenning defineres videre som den kraft pr. arealenhet som kreves for å gi skjærvirkningen. Skjærhastigheten er en målt verdi.

En egnet måte å måle viskositet på er å anvende et viskosimeter som f.eks. et Brookfield viskosimeter. Brookfield viskosimeter måler viskositet ved å måle den kraft som kreves for å rotere en spindel i en væske. Ettersom praktisk talt alle væsker blir tynnere når temperaturen øker, og tykkere når de avkjøles, bør temperaturen i væskene som sammenlignes måles og om mulig holdes lik.

LVT-viskosimeteret fra Brookfield med UL-adapteren (ultra-lav viskositet] er særlig egnet for denne anvendelse. UL-adapteren gir forsterkningsvirkninger som muliggjør mål-inger med en reproduserbarhet på 0,2 centipoise (eps) i det ultralave viskositetsområdet fra 0 til 10 eps. Kalibrering av instrumentet ga en gjennomsnittlig feil på - 0,2 eps i begge ender av skjærhastighetsområdet (10 sekunder , og 70 sekunder ). Skjærhastigheten på instrumentet kan varieres fra 73,42 til 0,36 sekunder som dekker det skjærområdet man støter på i formasjonen under flømmingsprosessen (vanligvis 10 sekunder ) .

Andre måleinnretninger slik som kapillar-viskosimeteret, skive- og kjegle-viskosimeteret, og konsentriske sylindere kan anvendes dersom det er hensiktsmessig.

Noen polymere oppløsninger vil oppvise thixotrope egenskaper, kjennetegnet ved en oppløsnings evne til å bli flytende når den utsettes for rysting, omrøring eller annen påvirkning, og deretter vende tilbake til en gel ved henstand. Vanlige eksempler på dette er majones og maling. Thixotropi er også ønskelig for polymeroppløsninger som brukes ved for-økt oljeutvinning hvor oppløsningen er mer flytende for å lette pumping, men blir mer viskøs når den først er kommet inn i den oljebærende formasjon.

Ikke-newtonskér væsker er de hvor en endring i skjærhastigheten ikke er proporsjonal med en endring i skjær-spenningen. For slike væsker bestemmes forholdet mellom skjærhastighet og skjærspenning noen ganger ved flere skjærhastig-.heter. Selv om de polymere oppløsninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan være ikke-newtonske, vil skjærhastigheter som oppnåes ved å bruke et enkelt sett betingelser for skjærspenning vanligvis være tilstrekkelig for anvendelse som et grunnlag ved sammenligning for å bestemme eventuell endring i viskositet. Om ønsket kan det gjøres tilleggsmålinger av skjærhastighet med forskjellige skjærkrefter. For disse formål gjøres således alle sammenligninger som om væskene som måles oppførte seg som newtonske væsker. Fremgangsmåter for å bestemme viskositet ligger godt innenfor fagkunnskapene til en analytisk kjemiker, og nærmere retningslinjer kan finnes i lærebøker, tidsskrifter og instruksjonshefter fra produsenter av viskosimetere,

Forsåvidt gjelder foreliggende oppfinnelse ansees en endring i målt viskositet på ca. 10% for å være svært betyde-lig når man sammenligner en oppløsning av prøvepolymer med en kontrolloppløsning. Ettersom vanlig tilgjengelig utstyr ikke er i stand til å måle vekten av polymerer med en molekylvekt opp mot 1 million nøyaktig, ble endringen i polymeren målt indirekte ved å bestemme intrinsik viskositet.

Den vanligste fremgangsmåte for å beregne molekylvekten til en polymer i oppløsning er bruken av "intrinsik viskositet" [N]. Den intrinsike viskositet "[N]" kan relateres til molekylvekten til polymeren ved hjelp av ligningen til Mark, Houwink og Sakurada:

[N] = KM<a>

hvor K og a er konstanter som er en funksjon av polymertypen, temperaturen og oppløsningsmidlet. (Denne ligning er nærmere omtalt i Billmeyer (se nedenunder)).

Konstantene bestemmes først ved å måle polymerer med kjent molekylvekt. Bestemmelsen av [N] gjøres ved hjelp av kapillar-viskosimetri av fortynnede polymeroppløsninger ved flere konsentrasjoner. Viskositetsdata ekstrapoleres til 0 konsentrasjon for å gi en verdi relatert til molekylvekt ved en konstant polymertype, et konstant oppløsningsmiddel og en konstant temperatur.

Selv om de konstante verdier ikke er kjente og de abso-lutte verdier for molekylvekt er ukjente, er fremgangsmåten likevel nyttig ettersom verdien for [N] er direkte proposjonal med en lav potens av molekylvekten. I et oppløsningsmiddel-temperatur-polymer-system hvor konstantene ikke er tilgjengelige, kan verdiene for [N] brukes til å bestemme økninger eller reduksjoner i molekylvekt, men ikke de faktiske verdier. Dette konseptet omtales ytterligere i en populær lærebok (Billmeyer, Jr., F.W., Textbook of Polymer Science, 3. ed., New York: Interscience Publishers. 1965; s. 79 - 85). Denne fremgangsmåte er tilfredsstillende ettersom man bare behøver å bestemme relative endringer i molekylvekt.

Bakterier

Bakteriene som kan brukes i foreliggende oppfinnelse har evne til å øke eller i det minste stabilisere viskositeten av på forhånd fremstilte polymerer i oppløsning.

I oppfinnelsens videste aspekt kan en egnet bakterie utvelges ved å velge én eller flere kandidater og utføre den nedenfor beskrevne utsorteringsprøve for bestemmelse av bakteriens virkning på polymeroppløsningen. Aktuelle bakterier kan finnes nesten hvor som helst. Jordprøver og planter er logiske steder likesåvel som grunn- og overflate-vann. Tilgjengelighet av oxygen burde ikke være en begrens-ende faktor ved utvelgelsen ettersom både aerobe og anaerobe bakterier kan benyttes. Eksisterende kulturer av bakterier kan selvfølgelig prøves me;d hensyn på anvendbarhet i foreliggende oppfinnelse.

Bakteriesorter- som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse, omfatter gram-negative aerobe stavbakterier, gram-negative fakultativt anaerobe stavbakterier, gram-negative anaerobe stavbakterier og gram-positive kulebakterier. Ytterligere informasjon vedrørende egenskapene til hver

av disse sorter kan finnes i Bergy' s Manual of Determinative Bacterioloqy, (8. ed.), R.E. Buchanan og N.E. Gibbons, Co-editors (1974.

Når prøven først er erholdt, bør bakterien isoleres

og formeres på én eller flere typer laboratoriemedier under anvendelse av standard teknikker.

F r emga ng små t e

Oppfinnelsen kan utøves ved å bruke en hvilken som helst fremstillingsmetode som er egnet for mikrobiologisk syntese. Fremgangsmåter som er vanlig brukt innen teknikken oppdeles i to kategorier:satsvis og kontinuerlig. Ved en satsvis fremgangsmåte plasseres alt av utgangsmaterialer inkludert bakteriene i en beholder hvor de forblir inntil det ønskede produkt er dannet, hvoretter beholderen tømmes og produktet fraskilles. Ved en kontinuerlig fremgangsmåte blir råmaterialene tilsatt og produktet fjernet ved en konstant hastighet. For fremstilling og behandling av store mengder materialer er det foretrukket med en kontinuerlig fremgangsmåte, selv om satsvise fremgangsmåter er særlig nyttige når det ønskes nøye kontroll over fremgangsmåten.

Det er karakteristisk at fremgangsmåten gjennomføres ved betingelser som er optimale for bakteriens vekst ettersom de maksimale resultater fåes ved en høy metabolsk hastighet. Disse optimale betingelser svarer vanligvis til de man finner i bakteriens naturlige miljø. Om mulig kopieres miljøet, hvorved man får den samme temperatur, pH, saltholdighet, innhold av sporelementer og andre materialer.

Dersom miljøet ikke kan kopieres på en lettvint måte, brukes et standard næringsmedium for å tilveiebringe vann, sukker, aminosyrer, vitaminer, mineraler og sporelementer. Slike medier er tilgjengelige hos leverandører av biologisk materiale.

Det optimale pH- og temperaturområde for hurtig vekst, samt området for tolererbare betingelser, kan lett bestemmes ved hjelp av vanlige prøver som er kjent for fagfolk. En nærmere beskrivelse av disse prøver er gjengitt i "Growth", Ralph N. Costilow, Ed. Manual of Methods for General Bacterio-logy, s. 65 - 179 (1981).

Kontrollfremgangsmåte for bakteriell viskositetsforøkning

Den følgende fremgangsmåte kan brukes til å kontrollere polymeremner for å bestemme om en gitt bakterie vil øke

viskositeten i en oppløsning av polymeren. Den kan også

brukes til å kontrollere aktuelle bakterier for å be-

stemme om de vil øke viskositeten i en gitt polymer. Fremgangsmåten kan også brukes til å kontrollere fullstendig nye blandinger av polymerer og bakterier.

A. Fremstilling av kultur. Det fremstilles en dyrkningskultur av bakterien i et egnet dyrkningsmedium. Den spesifikké

pH og bestanddelene i mediet vil variere avhengig av kravene til den bestemte bakterie. Denne kultur inkubéres fortrinnsvis i 24 timer ved organismens optimale dyrkingstem-peratur.

B. Inokulering av polymeroppløsningen. Polymeroppløsningen oppkonsentreres fortrinnsvis tilstrekkelig til å gi målbare viskositeter for viskositetsprøven, men er tilstrekkelig for-tynnet til at polymermengden ikke er giftig for bakterien. Polymeroppløsningen kan steriliseres ved hjelp av damp eller andre midler for å unngå virkningene av konkurrerende vekst av uønskede mikrobielle forurensninger. Det tilsettes eventuelt en oppløsning av basalsalter til polymeren for å sikre bakteriene essensielle naeringsstof f er og mineraler.

Den voksende cellekultur kan så sentrifugeres, vaskes for å fjerne eventuelle rester av dyrkingsmedium og resuspen-deres i en minimal mengde destillert'vann. For å oppnå optimale resultater, utføres det en celletelling for å bestemme konsentrasjonen av celler. En utmålt mengde inokulum som inneholder en gitt konsentrasjon av celler, tilsettes så til oppløsningen som inneholder den på forhånd fremstilte polymer. Det fremstilles også en kontrolloppløsning som har den samme konsentrasjon av polymeroppløsning og basalsalter, men som ikke inneholder noen bakterie. Det tilsettes et ekvivalent volum med sterilt destillert vann til kontrollen for å tilpasse volumet etter inokulum tilsatt til oppløsningene som inneholder den på forhånd fremstilte polymer. C. Inkubering av oppløsningen. Kontrollen og polymeroppløs-ningen med mikroorganismen inkubéres ved den optimale dyrk-ingstemperatur for bakterien inkubéres ved den optimale dyrk-av oppløsningen fjernes med jevne mellomrom for å påvise tendenser i eventuell viskositetsendring. Definitive resultater fåes vanligvis etter en inkubasjon på 2 til 7 dager.

Etter inkubasjonen fjernes bakteriene ved sentrifugering (eller andre fremgangsmåter som er forenlige med polymeren og bakterien), idet en bakteriefri opp-

løsning av polymeren blir tilbake.

D. Bestemmelse av viskositetsendringer

Viskositeten i den bakteriefrie oppløsning kan bestemmes ved hjelp av fremgangsmåtene som er omtalt ovenfor, som f.eks. med et Brookfield viskosimeter med en ultralav viskositetscelle som gir viskositetsdata (centipoise) ved forskjellige skjærhastigheter. Viskositeten i prøveoppløs-ningen sammenlignes med viskositeten i kontrolloppløsningen. Dersom viskositeten i prøveoppløsningen er større enn i kontrolloppløsningen, kan bakterien anses som å være i stand til å øke viskositeten i en oppløsning av den polymer.

Flere bakterier ble kontrollert for å bestemme

deres virkning på polymeroppløsninger, idet den følgende generelle fremgangsmåte ble fulgt bortsett fra der hvor annet er spesielt angitt.

Fremstilling av et medium. Et basalsaltmedium ble fremstilt

i en konsentrasjon med dobbelt styrke for senere fortynning med den hensiktsmessige polymeroppløsning. Oppløsningen av basalsalter besto av det følgende:

Den nøyaktige sammensetning av basalsaltmediet er vanligvis ikke kritisk og den kan endres avhengig av kravene til bakterien som prøves. Det samme medium med basalsalter bør imidlertid brukes gjennom en lik serie av visko-sitetsprøver ettersom nærværet av salter kan påvirke visko-sitetsegenskapene til en polymer i oppløsning.

CaCl2" 2^0 ble autoklavert separat for å unngå ut-felling med de øvrige bestanddeler ved oppvarmning. Etterat begge oppløsninger hadde avkjøltes til værelsetemperatur, ble CaCl2 • 2H20 tilsatt til de øvrige bestanddeler. Mediet med basalsalter ble kontrollert med hensyn på renhet ved å stryke ut en alikvot på en plate med næringsagar og inkubere platen ved 30°C i 24 timer.

Fremstilling av en kultur. Bakterier og salter som skulle kontrolleres ble dyrket på skråmedier av henholdsvis næringsagar og Sabouraud dextroseagar. Bakteriene ble inkubert ved 30°C i 24 timer, aerobt og/eller anaerobt avhengig av deres fysiologiske egenskaper. Kulturrenhet ble bestemt ved hjelp av gram-farving og mikroskopisk undersøkelse. 5 ml av basalsaltmediet ble tilsatt til hver skråkultur og orga-nismene ble fjernet fra overflaten ved vortexing. Som inokulum ble det brukt 5 hundredels ml av cellesuspensjonen. Fremstilling av polymeroppløsningen. En viss mengde av poly-meroppløsningen ble tilsatt til deionisert vann for å få en konsentrasjon på 2400 ppm (vekt/volum). Polymeroppløsningen ble justert til pH 7,0 og ble dampsterilisert ved 1,05 kg/cm<2 >og 121°C i 60 minutter. Oppløsningen ble deretter testet med hensyn på renhet slik som beskrevet for oppløsningen av basalsaltene.

Inkubering. Oppløsningen av basalsalter og polymeroppløsningen ble blandet i et volumforhold på 1:1 hvorved man fikk en 5 ml stor prøveoppløsning. 5 hundredels ml av den bakterielle suspensjon (inokulumet) ble tilsatt til hver av de tre rea-gensrørene. Rørene ble inkubert i 14 dager under betingelser beskrevet for inokulumfremstillingen. Etter inkubering ble hvert rør undersøkt med hensyn på turbiditet som er en indika-sjon på bakteriell vekst.

Intrinsik viskositet. Til disse forsøk ble det brukt resultater for sammenlignende endringer i molekylvekter. Metabolske produkter med lav molekylvekt ble ikke fjernet og ble antatt ikke å gi noe bidrag til viskositeten. På grunn av vaskefrem-gangsmåten for fjerning av bakteriecellene.fra polymeroppløs-ningen, kan enhver viskositetsendring tilskrives en endring i polymeren selv og ikke tilstedeværelsen av biologiske rester. Temperaturen ved den intrinsike viskositetsbestemmelse var 25°C.

Eksempler 1- 4

En gram-negativ stavbakterie karakterisert som en stamme fra slekten Enterobacter ble isolert fra oljefeltpro-dusert vann og tildelt deponerings nummer ATCC 39553. I tidligere labo-ratorieforsøk hadde denne stamme vist evne til å bruke det delvis hydrolyserte polyacrylamid, "Dow Pusher 500", som sin eneste carbonkilde for vekst.

Mediene som ble brukt til dette forsøk ble fremstilt

i to deler. En første polymeroppløsning ble fremstilt ved å oppløse Dow Pusher 500® slik den fåes i handelen i destillert vann ved en konsentrasjon på 2400 ppm (vekt/volum) og pH 7,0. Den andre oppløsning ble fremstilt på samme måte men etter rensing av polymeren ved alkoholekstraksjon. Begge oppløsninger ble omrørt i 24 timer, veid før sterilisering og deretter autoklavert (sterilisert) i 1 time ved 121°C og 1,0 5 kg/cm 2. Alt vann som gikk tapt på grunn av autoklavering ble erstattet ved å tilsette sterilt destillert vann inntil polymeroppløsningene nådde sin opprinnelige vekt.

Det ble fremstilt en oppløsning av basalsalter Ved en dobbel konsentrasjon slik som forklart ovenfor. Den inneholdt 0,02% BBL gjærekstrakt, 0,2% KH2P04, 0,2%

K2HP04, 0,1% (NH^ 2S04°g °'02% CaC12 ' 2H2° 1 destillert vann ved pH 7,0. CaCl2 ble fremstilt som en adskilt forhånds-oppløsning og tilsatt til oppløsningen av salter etterat begge var blitt sterilisert og avkjølt til værelsetemperatur.

De to separate oppløsninger av "Dow Pusher 500" og basalsalter til dette forsøk ble fremstilt ved aseptisk å blande 1:1 oppløsninger av basal sal tmedium (2X) og 24 00 ppm (vekt/volum) polymeroppløsning.

Kulturen av Enterobacter sp. ATCC 39553 ble dyrket aerobt på en skrå næringsagar (Difco) ved 30°C i 24 timer. Cellene ble innhøstet ved å tilsette 5 ml steril basalsaltoppløsning til skråkulturen i prøverøret og vortexing røret forsiktig. Denne cellesuspensjon ble brukt som inokulum for dette forsøk.

Alle flasker ble inkubert ved 30°C i 14 dager. Aerob inkubering omfattet rotasjonsrysting av flaskene ved 200 rpm. Anaerob inkubering ble utført i et anaerobt kammersystem

Kontrolloppløsningen ble inkubert både aerobt og anaerobt.

Etter inkubering ble alle prøveoppløsninger og kontroller sentrifugert (10.000 x g, 30°C, 20 min) og supernatanten ble dekantert aseptisk over i rene, sterile prøveflasker. Viskositetene til oppløsningene ble målt.

Molekylvekten til "Dow Pusher 500" ble forutsatt å være 3,4 x IO<6>, basert på publiserte data (F.D. Martin og J.S. Ward, Polymer Preprints, vol. 22, nr. 2, American Chemical Society Meeting, august, 1981, s. 24). Viskositeten i kontrolloppløsningen ble også forutsatt å være konstant. Detaljerte data som viser målt viskositet,intrinsik viskositet og beregnet molekylvekt for polymeren i kontrolloppløs-ning A og eksempler 1 og 2 foreligger i tabell 1.

Sammenlignet med kontrollen forårsaker organismen en økning

i viskositet eller stabiliserer den rensede polymer mot de-komponering i løpet av de 14 dagene. Under anaerobe betingelser øker Enterobacter sp. ATCC 39553 den tilsynelatende molekylvekt til "Dow Pusher 500" fra 3,4 x IO<6> til 5,7 x IO<6>, en økning på ca. 68%. Ut fra endringer i intrinsik viskositet ble det gjort beregninger av molekylvekt.

Eksempler 5- 8

Fremgangsmåtene ovenfor ble gjentatt for å bestemme endringer i intrinsik viskositet slik som omtalt ovenfor.

Alle betingelser var de samme bortsett fra når annet er angitt.

Tabell 2 oppsummerer intrinsik viskositetsresultater for disse oppløsninger inkubert med Enterobacter sp.ATCC 39553 i 2 uker. Det ble funnet relative viskositetsøkninger i alle prøver som ble testet. Den største økning i oppløsnings-viskositet forelå i de prøver som var inkubert anaerobt. Ettersom det ikke var tilgjengelig en kontroll for å sammen-ligne virkningene av en renset polymer under anaerob inkubering, ble virkningene av rensing ansett for å være sekundære. Eksempler 2 og 6 ble derfor sammenlignet med kontroll C, den nærmeste sammenligning.

Dataene for intrinsik viskositet fra eksempler 1 til

4 og kontroller A og B er også vist i tabell 2.

E ksempler 9 - 130

Det ble valgt ut åtte bakteriestammer i tillegg til Enteroba cter sp. ATCC 39553 for utprøving. Alle hadde evne til å vokse aerobt og/eller anaerobt i forskjellige vannoppløse-lige polymerer. De ni stammer identifiseres ved hjelp av de følgende slektsnavn og deponeringsbe<*>

Gram-negative stavbakterier: Gram-positive kuleb?

Gram-positive stavbakterier: Bacillus sp.ATCC 39556 Stammene ATCC 39555, 39560 og 39558 var laboratorieforurens-ninger isolert fra vandige polymeroppløsninger. Alle de øvrige bakterier ble isolert fra vann produsert på oljefelt og boreslam.

Alle stammer (med unntak av ATCC 39559) ble dyrket aerobt i næringsvæske (Difco) ved 30°C i 24 timer. Stamme ATCC 39559 ble inkubert anaerobt ved 30°C i 24 timer under anvendelse av næringsvæske inneholdende thioglycolat.

Etter inkubasjon ble bakteriene vasket tre ganger ved sentrifugering (5000 x g, 5°c, 10 min.) med sterilt destillert vann. De vaskede celler ble resuspendert i en minimal mengde sterilt destillert vann. Det ble utført celletellinger på hver cellesuspensjon ved å bruke et Petroff-Hausser telle-kammer.

Til dette forsøk ble det fremstilt medier i to deler. Polymeroppløsninger ble fremstilt i destillert vann ved en konsentrasjon på 2400 ppm (vekt/volum) og pH 7,0. Polymerene i tabell 3 ble brukt i den form de fåes kjøpt og etter rensing ved ekstraksjon.

Alle oppløsninger ble omrørt i 24 timer, veid og deretter autoklavert (sterilisert) i 1 time ved 121°C og 1,05 kg/cm 2. Alt vann som gikk tapt under autoklaveringen ble erstattet ved å tilsette sterilt destillert vann inntil poly-meroppløsningene nådde sin opprinnelige vekt.

Et medium med basalsalter ble fremstilt slik som beskrevet i eksempel 1. Atten forskjellige polymermedier ti.l dette forsøk ble fremstilt ved aseptisk å blande 1:1 (volum/ volum) oppløsninger av medium med basalsalter og 24 00 ppm polymeroppløsning. 50 ml store alikvoter av polymermedier ble aseptisk overført til rene, sterile 150 ml Erlenmeyer-kolber. Hver kolbe (unntatt kontrollene) ble inokulert til en konsentrasjon på o lo 3 bakterier/ml med vedkommende cellesuspensjon. Kontroller ble inokulert med ekvivalente volumer av sterilt destillert vann.

Alle kolber ble inkubert ved 30°C i to uker. Aerob inkubasjon omfattet rotasjonsrysting av kolbene ved 200 opm, og anaerob inkubasjon ble utført i et anaerobt kammersystem. Kontroller ble inkubert aerobt.

Etter inkubasjon ble alle prøveoppløsninger og kontroller sentrifugert (10.000 x g, 30°C, 20 min.) og supernatanten dekantert aseptisk over i en ren, steril prøveflaske. Bestemmelser av den tilsynelatende viskositet ble gjort ved å bruke et Brookfield viskosimeter. Tabell 4 viser resul-tatene fra eksemplene 9 - 130 og omfatter også data fra eksemplene 1 til 8.

Bakteriell økning av viskositet i polymeroppløsning

Flere prøver som ble testet i denne polymer/bakterie-kontroll viste økninger i oppløsningsviskositet etter 2 ukers inkubasjon. Noen av prøvene som oppviste bakteriell økning av viskositet i polymeroppløsning er gjengitt i tabell 5, gruppert etter kodebetegnelsen for bakterien.

Fotnote til tabell 5

1 "A" betyr aerob. "An" betyr anaerob.

2 Intrinsik viskositet indikerer prosentvis endring i polymerens molekylvekt i forhold til kontrollen.

3 "Dow Pusher 500 " . i

4 Renset ved ekstraksjon med methanol.

7 Renset ved ekstraksjon med acetonitril.

Bakteriene ifølge tabell 6 ble før inngivelsen

av foreliggende patentsøknad deponert ved American Type Cul-ture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland under en av-tale hvorved de vil bli tilgjengelige for almenheten etter utstedelsen av patent. Hver bakteriekultur deponert ved ATCC har fått tildelt et særskilt nummer.

Claims

1. Vandig oppløsning av på forhånd fremstilte polymerer med økte viskositetsegenskaper, karakterisert ved at den er fremstilt ved å blande, under betingelser som bidrar til bakteriell vekst, en vandig oppløsning av på forhånd fremstilte polymerer med en bakterie valgt fra gruppen bestående av gram-negative stavbakterier, gram-positive stavbakterier og gram-positive kulebakterier, uten evne til ny-syntese av polymerene, men med evne til å øke viskositeten i polymeroppløsningen, idet denne evnen er påvist ved hjelp av følgende screening-fremgangsmåte: (i) fremstilling av en dyrkningskultur av bakterien, (ii) fremstilling av en vandig oppløsning av de på forhånd fremstilte polymerer og tilsetning av næringsstoffer og mineraler som er påkrevet for bakteriell vekst, (iii) separering av oppløsningen i to deler, en test-og en kontrolldel, hvor begge deler mangler substrat bortsett fra de på forhånd fremstilte polymerer og derved mangler et utnyttbart substrat for å muliggjøre syntese av en annen polymer, (iv) inokulering av testoppløsningen med kulturen av bakterien og inkubering av test- og kontrollopp-løsningene, og (v) måling av viskositetene i både test- og kontroll-oppløsningene etter inkubering for å bestemme testoppløsningens viskositet i forhold til kon-trolloppløsningens viskositet.

2. Fremgangsmåte for å øke viskositeten i en oppløsning av på forhånd fremstilte polymerer, karakterisert ved å blande under betingelser som begunstiger bakteriell vekst, (a) en vandig oppløsning av på forhånd fremstilte polymerer og (b) en bakterie valgt fra gruppen bestående av gram-negative stavbakterier, gram-positive stavbakterier og gram-positive kulebakterier uten evne til ny-syntese av polymerene, men med evne til å øke viskositeten i polymeroppløsningen i den følgende screeningfremgangsmåte: (i) fremstilling av en dyrkningskultur av bakterien , (ii) fremstilling av en vandig oppløsning av de på forhånd fremstilte polymerer og tilsetning av næringsstoffer og mineraler som er påkrevet for bakteriell vekst, (iii) separering av oppløsningen i to deler, en test- og en kontrolldel, idet begge delene mangler substrat bortsett fra de på forhånd fremstilte polymerer og derved mangler et utnyttbart substrat for å muliggjøre syntese av en annen polymer, (iv) inokulering av testoppløsningen med kulturen av mikroorganismen og inkubering av test-og kontrolloppløsningene, og (v) måling av viskositetene i både test- og kon-trolloppløsningen etter inkuberingen for å bestemme testoppløsningens viskositet i forhold til kontrolloppløsningens viskositet.

3. Fremgcingsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det anvendes en bakterie valgt blant Enterobacter sp. ATCC 39553, Enterobacter sp. ATCC 39555, Citrobacter sp. ATCC 39560, Pseudomonas sp. ATCC 39558, Pseudomonas sp. ATCC 39554, Staphylococcus sp. ATCC 39557, Staphylococcus sp. ATCC 39552, Bacillus sp.. ATCC 39556 og Peptococcus sp. ATCC 39559.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det anvendes en polymer valgt fra gruppen bestående av polyacrylamid, hydrolysert polyacrylamid, polyvinylalkohol, xanthangummi, poly(2-acrylamido-2-methyl-propansulfonsyre), hydroxyethylcellulose, poly(acrylsyre), carboxymethylcellulose og glucan.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes en polymer valgt fra gruppen bestående av hydrolysert polyacrylamid, polyvinylalkohol, poly(2-acrylamido-2-methyl-propan-sulfonsyre) , xanthangummi, poly (acrylsyre) og glucan.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det anvendes en polymer valgt fra gruppen bestående av hydrolysert polyacrylamid, poly(acrylsyre) og glucan.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det som polymer anvendes hydrolysert polyacrylamid.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det som polymer anvendes poly(acrylsyre).

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det som polymer anvendes glucan.

10. Fremgangsmåte ifølge krav karakterisert ved at det som polymer anvendes hydrolysert polyacrylamid, og at det anvendes en bakterie valgt fra gruppen bestående av Enterobacter sp. ATCC 39555, Pseudomonas sp. ATCC 39558, Pseudomonas sp. ATCC 39554 og Enterobacter sp. ATCC 39553.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det som polymer anvendes polyvinylalkohol, og at det anvendes en bakterie valgt fra gruppen bestående av Enterobacter sp. ATCC 39555 og Pseudomonas sp, ATCC 39558.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det som polymer anvendes poly(2-acrylamido-2-methyl-propansulfonsyre), og at det anvendes en bakterie valgt fra gruppen bestående av Enterobacter sp. ATCC 39555, Staphylococcus sp. ATCC 39557 og Enterobacter sp. ATCC 39553.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det som polymer anvendes xanthangummmi, og at det anvendes en bakterie valgt fra gruppen bestående av Enterobacter sp. ATCC 39555 og Bacillus sp. ATCC 39556.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det som polymer anvendes glucan og at det anvendes en bakterie valgt fra gruppen bestående av Enterobacter sp. ATCC 39555, Bacillus sp. ATCC 39556, Pseudomonas sp. ATCC 39558, Pseudomonas sp. ATCC 39554, Enterobacter sp. ATCC 39553 og Citrobacter sp. ATCC 39560.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det som polymer anvendes poly(acrylsyre), og at det anvendes en bakterie valgt fra gruppen bestående av Pseudomonas sp. ATCC 39558 og Enterobacter sp. ATCC 39553.