NO156287B

NO156287B - Fremgangsmaate for modifisering, solubilisering og/eller hydrolyse av karbohydrater.

Info

Publication number: NO156287B
Application number: NO812358A
Authority: NO
Inventors: Sidney Alan Barker; Peter John Somers
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1980-07-11
Filing date: 1981-07-10
Publication date: 1987-05-18
Also published as: JPS5748997A; DE3171911D1; ZW14981A1; EP0044622B1; US4787939A; EP0044622A3; US4713118A; ZA814472B; NO156287C; EP0044622A2; SU1318171A3; NO812358L; JPH0133113B2

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for modifisering, solubilisering og hydrolyse av glykosidisk bundne karbohydrater som har reduserende grupper i form av lignocellulose eller stivelse-baserte materialer.

Cellulose er et polysakkarid som utgjør hovedkomponenten

i celleveggene til de fleste planter. Den er en polymer av Ø-D-glukoseenheter som er knyttet sammen under fjerning av vann slik at det danner kjeder med 2000-4000 enheter. I planter opptrer cellulose sammen med polysakkarider og hemicelluloser som stammer fra andre sukkere, for eksempel xylose, arabinose og mannose. I de treaktige deler i planter er cellulose intimt blandet og av og til kovalent bundet til lignin. Tre,

for eksempel, inneholder normalt 40-50 % cellulose, 20-30 %

lignin og 10-30 % hemicelluloser sammen med mineralsalter, proteiner og andre biokjemiske forbindelser.

Nedbrytning av cellulose kan istand-bringes ved forskjellige behandlinger, inklusive behandling med syrer og med enzymer som er til stede i visse bakterier, sopper og protozoer, og resul-terer primært i spaltning av cellulose-kjedemolekylene og som en konsekvens av dette i reduksjon av molekylvekten. Partiell hydrolyse med syrer gir et utvalg av produkter, ofte betegnet "hydrocellulose", hvis egenskaper er bestemt av hydrolyse-betingelsene som anvendes. Fullstendig syrehydrolyse av cellulose gir glukose. Behandling med syre ved oppløsning og gjenutfelling øker ofte tilgjengeligheten og tilbøyeligheten hos cellulose til angrep av enzymer, mikrober og kjemiske reagenser. Nedbrytning av cellulose ved hjelp av enzymer fører til forskjellige intermediære produkter, alt avhengig av det enzym som anvendes, idet sluttproduktene fra enzymisk nedbrytning av cellulose generelt er glukose, men med mikrober kan denne skride videre til hovedsakelig etanol, karbondioksyd og vann.

En rekke studier er gjort angående virkningene av cellulase-enzymer på cellulose. Det er anerkjent at cellulaser nedbryter de mer tilgjengelige amorfe områder i cellulose, men er ute av stand til å angripe de mindre tilgjengelige krystallinske områder. T. Sasaki m.fl. (Biotechnol. and Bioeng., 1^79, 21, 1031-1042)

har vist at cellulose oppløses i 60 % svovelsyre og at dens krystallinske struktur, når den gjenutfelles, er forsvunnet.

Den biologiske tilbøyelighet til cellulase hos den således behandlede cellulose er markert øket, og den kan solubiliseres i en grad av ca. 95 % og sakkarifiseres i en grad av 94 % i løpet av 43 timer. De rapporterte resultater for en ubehandlet cellulosekontrollprøve er dårlige, idet bare 26 % sakkarifisering er oppnådd etter 48 timer.

A. Girard (Ann. Chim. Phys., 1881, 24, 337-384) har vist

at vannfri hydrogenkloridgass ikke har noen innvirkning på cellulose, en oppdagelse som er bekreftet nylig av T.P. Nevell og W.R. Upton (Carb. Res., 1976, 49, 163-174). Disse sist-nevnte forskere understreker imidlertid de viktige effekter ved nærvær av små mengder av fuktighet.

En rekke industriprosesser er blitt utviklet eller fore-slått for fremstilling av glukose ved syrehydrolyse av cellulose. Disse inkluderer: 1. F. Bergious-prosessen (beskrevet i Ind. Eng. Chem., 1937, 29, 247 og i F.I.A.T. Report No. 499, 14. november 1945, s. 10 og 11) hvor HC1 anvendes og gjenvinnes ved vakuum-stripping. En forbedret versjon av denne prosess er beskrevet av J. Schoenemann (Chem. Ind. (Paris), 1958, 80, 140) som hevder å få et høyt glukoseutbytte (av størrelsesorden 90 % regnet på den poten-sielle glukose) i en total reaksjonstid av størrelsesorden 7 timer. 2. Noguchi-Chisso-prosessen som benytter effekten av små mengder av fuktighet og som krever 5 % HC1 ved en temperatur på 100°C i 3 timer, ved trinnvis motstrømskontakt mellom cellulose og HCl-gass ved temperaturer i området -5 til 125°C. Denne prosess er beskrevet av M.R. Ladisch (Process Biochem.,. Jan. 1979, s. 21) som hevder å ha oppnådd omdannelser på 95 % for cellulose og 23 % for hemicellulose.

Fremgangsmåter for behandling av celluloseholdige materialer, for eksempel tremasse og papir, med syrer eller celluloseenzymer for fremstilling av enklere produkter, for eksempel glukose, har hittil hatt begrenset kommersiell betydning av en rekke årsaker, idet deres hovedulemper er en relativt lang-sommere hastighet med hvilken syrer og celluloseenzymer angriper cellulose, og et krav i de fleste tilfeller om forutgående de-lignifisering av det celluloseholdige materiale før behandling med syre eller enzym kan utføres på vellykket måte.

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for modifisering, solubilisering og/eller hydrolyse av et glykosidisk bundet karbohydrat som har reduserende grupper, i form av lignocellulose eller stivelse-baserte materialer, for frembringelse av en eller flere av effektene (A) modifisering av karbohydratet for indusering av øket tilgjengelighet og påvirkelighet for enzymer, mikrober og kjemikalier, (B) solubilisering av karbohydratet og (C) solubilisering og hydrolyse av en eller flere glykosidiske bindinger i karbohydratet for tilveiebringelse av løselige oligosakkarider og/eller glukose. Fremgangsmåten er karakterisert ved at karbohydratet bringes i kontakt med en blanding som omfatter saltsyre og et halogenid av litium, magnesium og/eller kalsium eller en forløper for nevnte halogenid. Det henvises forøvrig til krav 1.

Produkter fra solubilisering og/eller hydrolyse inkluderer høyere sakkarider, tri-, di-sakkarider og monosakkarider. Spesifikt inkluderer produktene fra cellulose cellodekstriner, cellotriose, cellobiose og glukose. Når prosessen anvendes for fremstilling av karbohydrat med forbedret påvirklighet,

kan det påvirkelige karbohydrat behandles videre for å produ-sere solubiliserings- og/eller nedbrytningsprodukter. Eksempel-vis kan det påvirkelige karbohydrat behandles med et enzym, i hvilket tilfelle den nøyaktige natur av produktene vil være avhengig av det enzym som anvendes og reaksjonsbetingelsene.

Når det gjelder cellulosebehandling med cellulase vil enzymer under egnede betingelser føre til produksjon av glukose.

Det glykosidisk bundne karbohydrat kan være tilstede

i hvilken som helst passende tilstand. Således kan det være til stede som fritt eller kombinert karbohydrat, i sin naturlige tilstand eller i form av en produsert artikkel. Fremgangsmåten er spesielt fordelaktig ved sin anvendelse på uløselige eller på annen måte immobiliserte karbohydrater, for eksempel ' cellulose alene eller blandet med andre bestanddeler i for eksempel tre, halm, mekanisk masse, kjemisk masse, avispapir, kartong, bagasse, maisffir, bomull, andre naturlige kilder, landbruksprodukter, avfallsprodukter, biprodukter eller fabrikkprodukter. Fremgangsmåten er også anvendelig på karbohydrater som eksisterer i sterkt orienterte former, for eksempel krystallinsk cellulose og andre orienterte strukturer

som normalt er sterkt utilgjengelige for enzymer og andre katalysatorer. Slik utilgjengelighet kan lages ved opptreden av et polysakkarid sammen med andre polymerer såsom cellulosen

sammen med lignin. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er anvendelig på modifisering eller solubilisering av cellulose uten forutgående delignifisering.

Saltsyre kan anvendes for å oppløse litium- eller magnesium-halognidet eller en forløper for dette.

I den blanding som anvendes ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen foretrekkes litiumhalogenider for solubilisering av cellulose, og litiumklorid foretrekkes særlig. Magnesium-halogenider foretrekkes for solubilisering og hydrolyse til D-glukose av stivelse, idet magnesiumklorid foretrekkes spesielt. Passende halogenid-forløpere inkluderer karbonater, bikarbonater, og hydroksyder, spesielt litium-karbonat, litiumhydroksyd, magnesium-karbonat og magnesiumhydroksyd. Behandlingen kan finne sted i to trinn, f.eks. ved behandling av cellulose kan det anvendes et litiumhalogenid fulgt av et magnesiumhalogenid.

Konsentrasjonen av salsyren kan variere innen

området 1 til 10 molar. Hvis fremgangsmåten anvendes for å gjøre karbohydratet mer tilgjengelig og påvirkelig for enzymer, mikrober og kjemikalier med begrenset eller selektiv karbohydrat-solubilisering, er den foretrukne konsentrasjon 1 molar. Hvis fullstendig solubilisering av karbohydratet ønskes, er den foretrukne konsentrasjon opp til 4 molar, spesielt 1-4 molar, men kan være høyere, dvs. opp til 10 molar, i visse tilfeller f.eks. ved behandling av polysakkarider, f.eks. chiten.

Foretrukne litium-, magnesium- og/eller kalsiumhalogenider

er kloridene, bromidene og jodidene, idet klorider er de mest økonomiske og særlig foretrekkes. Fortrinnsvis er konsentrasjonen av disse halogenider i syren >1M, idet mettede løsninger er spesielt godt egnet. Effektive konsentrasjoner på >8M av litiumhalogenider i passende syrer kan oppnås ved omgivelsestemperatur eller ved temperaturer passende for det begrensede formål med å øke tilgjengeligheten og påvirkeligheten av karbohydratet for etter-følgende enzym-angrep. Generelt, jo høyere konsentrasjonen av en saltsyre som anvendes ved fremgangsmåten er, desto lavere konsentrasjonen av litium-, magnesium- eller kalsiumhalogenidet i metning ved romtemperatur. Magnesiumhalogenider har mer begrenset løse-lighet enn litiumhalogenider i halogensyrer. En mettet løsning (12,65 M) av litiumklorid i 1,05 M saltsyre ved 25° inneholder 54,64 g LiCl. En mettet løsning (11,3 M) av litiumklorid i 4 M saltsyre ved 20°C inneholder anslått 47,9 g LiCl.

Temperaturen ved hvilken karbohydratet bringes i kontakt med blandingen ligger innen området 50-100°C, fortrinnsvis 50-90°C.

Fullstendig solubilisering av karbohydratet oppnås generelt i løpet av 1 time ved 50°C, men er bare noen få minutter ved 90-100°C.

Under hydrolysetrinnet forbrukes noe av vannet i den blanding som brukes til kontakt, og dette blir viktig i nærvær av høye konsentrasjoner av løselig karbohydrat. Således vil 162 g cellulose, når den er fullstendig hydrolysert til glukose, ha forbrukt 18 g vann. Siden dette både vil øke konsentrasjonen av syren som anvendes og berøve litium/magnesium/kalsiumhalogenidet for vann, tas det fortrinnsvis passende trinn for å avhjelpe dette ved høye karbohydrat-konsentrasjoner.

I praksis varierer mengden av karbohydrat som opprinnelig

er suspendert i blandingen i henhold til karbohydratets natur, den fysiske tilstand som det opptrer i, dets tilgjengelighet i denne tilstand, samt polymerisasjonsgraden for karbohydratet. Når det gjelder cellulose, hvor suspensjon byr på noen vanskelig-heter, er 5-10 % konsentrasjoner lett oppnåelige, og 15 % konsentrasjon kan oppnås med forsiktighet. Generelt blir den be-grensende faktor hovedsakelig én som gjelder viskositet som bringer tilhørende problemer med varmeoverføring og effektiv blanding. Hvis hydrolyse tillates å skride frem, så kan ytterligere mengder av karbohydratet bli solubilisert. Tilsetning av vann som forbrukes i hydrolysen, blir også viktig i denne henseende, i likhet med den effektive konsentrasjon for syren. Stivelse, selv i det intakte stivelse-korn, kan bli solubilisert ved en mild behandling med kontaktblandingen, ofte under gel-punktet. Dette illustrerer med solubilisering og hydrolyse av stivelse (Amylum maydis) med saltsyre (2,0 M) mettet med MgC^ hvor behandling ved 50° i 3 timer, fulgt av 90° i 12 minutter, gir den mest effektive omdannelse til D-glukose. Dette kombi-nerer effekten av det tilsatte MgC^ med hensyn til å gjøre solubiliseringen av stivelse ved lave temperaturer lettere med en akselerert hydrolyse-rate til D-glukose ved en høyere temperatur.

Karbohydrater som er til stede i mikroorganismer, pattedyr-vev, plantevev og andre naturlige kilder, kan effektivt ekstra-heres selv hvis de er kjemisk knyttet i disse til proteiner eller lipider. Forhåndsbehandling av slikt vev eller endog de isolerte karbohydrater, under mildere betingelser som unngår overdreven solubilisering, muliggjør enzymer og mikrober til å angripe sine subtrater i et påfølgende trinn hurtigere og mer effektivt enn ubehandlet vev, karbohydrater eller karbohydratholdige materialer.

Hovedbesparelser i mengden av enzym eller annen katalysator kan oppnås som går opp til en faktor på minst 10 over en typisk prosess som ikke har noen slike forhåndsbehandlingstrinn. ben kontaktblanding som anvendes, er tilgjengelig for resirkulering for fornyet bruk.

En LiCl/HCl/H20-blanding adskilte seg fra NAC1/HC1/H20 i sin oppførsel på en Biogel P2 kolonne. LiCl/HCl utelukkes fra pakke-matrisen når blandingen injiseres, mens natriumklorid inkluderes.

Den viktigste anvendelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er ved fremstilling av glukose ut fra cellulose eller

stivelse. Alternativt kan fremgangsmåten anvendes for fremstilling av en modifisert cellulose som kan anvendes i denne form til å spinne fibre, ikke-vevede tekstiler eller andre artikler, f.eks. filmer eller membraner, ved kontinuerlig injeksjon i en væske som ikke er blandbar med reaksjonsblandingen, men fra hvilken det modifiserte polysakkarid eller cellulosen utfelles.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen har en rekke fordeler når den anvendes på cellulose, nemlig:

1. Et forhånds-delignifiserinstrinn kreves ikke.

2. Forhåndsbehandling kan velges for å redusere løseligheten til et minimum mens det bevares påfølgende tilgjengelighet

for enzyminnvirkning.

3. Forhåndsbehandling gjør all cellulose tilgjengelig for påfølgende enzyminnvirkning, snarere enn bare en fraksjon

av dette.

4. Forhåndsbehandlingen kan anvendes på et utvalg av polymerer alene eller som blandinger, f.eks. cellulose, for tilveiebringelse av lett tilgjengelighet for påfølgende hydrolyse. 5. Forsterket angrepsrate av cellulase og derfor lavere enzymbehov for fullstendig reaksjon. 6. Et anvendelig, vannbasert, solubiliserende middel som gir styring over solubilisering og hydrolyse. 7. En handlemåte som er hurtig både i heterogen og homogen fase. 8. Akselerering av hydrolyseraten med hensyn til en vandig syre av samme løsningsmolaritet som muliggjør oppnåelse av en gitt hydrolyserate ved en lavere temperatur enn hos en vandig

syre med samme løsningsmolaritet.

9. Evne til å behandle høye konsentrasjoner av cellulose spesielt i den heterogene fase, hvilket skyldes de styrings-tiltak som kan benyttes.

Her tilbyr fremgangsmåten ytterligere fordeler anvendt på cellulose, siden reagensene i henhold til oppfinnelsen kan mani-puleres videre under fremgangsmåten slik at de ønskede formål med fremgangsmåten nås. I det følgende angis en liste av para-metre som ikke er eksklusive innen oppfinnelsens termer,.men indikerer faktorene for og over dem som allerede er omtalt, som faller innen oppfinnelsens krav og som ville bli anvendt av fagmannen på området.

1. Tilsetning av vann ut over det som forbrukes av hydrolysen av de glykosidiske bindinger i karbohydratene. En slik vannmengde kan tilsettes i hvilket som helst trinn i prosessen, men fortrinnsvis så snart solubilisering av karbohydratet er oppnådd. Det menes at damp er inkludert

blant de former som vann kan tilsettes i.

2. Tilsetning av et alkali, karbonat eller bikarbonat, så snart karbohydratsolubilisering er oppnådd, slik at den totale syrekonsentrasjon i reaksjonsblandingen som anvendes i

prosessen avtar.

3. Fjerning av hydrogenhalogenid fra reagensene i reaksjonsblandingen under prosess-forløpet ved anvendelse av redusert trykk.

4. Reduksjon av metallhalogenid-konsentrasjonen under forløpet av prosessen ved tilsetning av vandig syre. 5. Samtidig tilsetning av både mer karbohydrat og vann under forløpet av prosessen. 6. Anvendelse av noe av eller hele den sure komponent i reagensene i den form som er stort sett uløselig i eller

ublandbar med resten av reagensene.

7. Anvendelse av et lukket system i hvilket karbohydratet bringes i kontakt med blandingen ved et trykk som kan være

over eller under atmosfæretrykk.

8. Fjerning av et reaksjonsprodukt under reaksjonsforløpet enten kontinuerlig eller diskontinuerlig. 9. Innføring av en annen fase som er ublandbar med den første som enten kan være gassformig, flytende eller fast, som ut-fører en eller flere funksjoner med agitering av reaksjonsblandingen, spesifikt eller selektiv fordeling av et produkt eller en reaktant, varmeoverføring, eller som modifiserer reaksjonen for å forhindre utilstedelig produksjon av uønskede biprodukter.

Oppfinnelsen skal illustreres ved de eksempler som er gitt nedenunder. I eksemplene var de analytiske metoder og sammen-setningene av materialene som ble anvendt, som følger: (a) Bestemmelse av totalt karbohydrat

Cystein/svovelsyrereagenset (700 mg L-cystein-hydroklorid-monohydrat i 1 liter 86 % svovelsyre) ble tilsatt til en porsjon av prøven/standarden slik at forholdet reagens til prøve/standard var 5:1 (normalt 5 cm 3 : 1 cm 3). Reagenset ble tilsatt til prøven i rør som var neddykket i et isbad. Rørene ble så anbrakt i kokende vannbad i 3 minutter, hvoretter de ble tatt ut og fikk avkjøle seg til romtemperatur. Absorbansen til hver løsning ble målt ved 420 mm og den oppnådde karbohydrat-konsentrasjon, ved referanse til passende standarder, ga de resultater som er gjengitt i eksemplene.

(b) Bestemmelse av reduserende sukkere

Puffer: Natriumacetat/eddiksyre; 0,05 M, pH 4,8.

Reagens: Kaliumferricyanid (0,117 g) og natriumkarbonat (1,95 g)

ble oppløst i destillert vann og fortynnet til 100 cm^. Denne løsning ble nylaget hver morgen.

-3 3 Standard-løsninger (0-600 ,ug.cm av D-glukose; 0,4 cm ) eller prøveløsninger (0,4 cm ) ble tilsatt i reagensrør, avkjølt x isbad som inneholdt reagens (2,0 cm 3 ) og puffer (1,5 cm 3). Etter blanding ble reagensrørene holdt i et kokende vannbad i 5 minutter og deretter avkjølt til romtemperatur. Reaksjons-blandingene ble fortynnet ved tilsetning av 4,0 cm 3 vann og absorbansen for hver løsning målt ved 420 nm. Differansen i aborbans mellom standard eller prøve og en blindprøve (fremstilt ved å erstatte prøve med vann) muliggjorde beregning av innholdet av redusert sukker, uttrykt i forhold til D-glukose.

(c) Bestemmelse av D- glukose

Puffer: 2-amino-2-(hydroksymetyl)-propan-1,2-diol (TRIS),

0,5 H, pH 7,0 Reagens A: Glukose-oksidase (19.500 enheter pr. g, 50 mg)

oppløst i 50 cm^ puffer

Reagens B: Peroksidase (fra pepperrot, 90 enheter pr. mg, 10 mg)

og 2,2A azino-di-(3-etylbenztiazolinsulfonsyre (ABTS, 50 mg) oppløst i 100 cm<3> puffer.

Standard-løsninger av D-glukose eller ukjente løsninger

som inneholdt D-glukose (0-0,1 mg pr. cm 3 , 0,2 cm 3) ble blandet

3 3

med 0,5 cm av reagens A og 1,0 cm av reagens B. Etter 30 minutter ved 37°C ble absorbansen for hver løsning målt ved 420 nm og konsentrasjonen av D-glukose i de ukjente løsninger bestemt under referanse til kalibreringen med D-glukose-standardløsninger.

(d) Gel- gjennomtrengningskromatograf i

Kromatografi ble utført på Biogel P-2 (Biclad Laboratories Limited). To kolonnestørrelser ble anvendt, avhengig av den analytiske teknikk som ble anvendt for bestemmelse av materiale i eluatet fra kolonnen.

Metode A:

Kromatografi ble utført på Biogel P-2 i en glasskolonne (volum 425 cm<3>, lengde 150 cm) med vannkappe som ble holdt på 60°C. Kolonnen ble pumpet ved 0,8 cm<3.>min ^. Eluatet fra kolonnen ble spaltet og analysert ved (i) differential-refraktormetri (Waters Associates Model R401) som opererte

3 -1

ved 0,32 cm .min og/eller (ii) en automatisert cystein/- svovelsyremetode for total heksose-bestemmelse (S.A. Barker, M.J. How, P.V. Peplow og P.J. Somers, Anal. Biochem., 26,

(1968), 219) som opererte ved 0,1 cm3.min. 1 prøvestrømnings-hastighet. Prøvevolumet som ble påført kolonnen med Biogel P-2 var 0-0,1 cm inneholdende 0-5 mg karbohydrat.

Metode B;

Kromatografi ble utført som i metode A, med unntagelse

av at det ble anvendt en kolonne (145 cm x 0,6 cm intern dia-meter) som opererte ved en strømningshastighet på 0,15 cm<3>.min<-*>. Analyse av kolonne-eluatet var ved cystein/svovelsyre-metoden for total heksose-bestemmelse som i metode A. Det anvendte prøvevolum var 0-0,01 cm 3 inneholdende 0-0,5 mg karbohydrat.

Arealet under hver topp av karbohydrat-materiale ble inte-grert og sammenlignet med det areal som ble produsert, av en standard av D-glukose. Resultatene ble uttrykt som prosent av det totale karbohydrat som ble bestemt i eluatet. Der hvor produktene var en oligomer serie, er nomenklaturen Gl, G2 Gn anvendt for å indikere antall sukkerenheter i hver oligomer.

(e) Fuktighetsinnhold

Analyseresultater som her er vist, er basert på de vekter som ble tatt for analyse, og gir ikke rom for fuktighet med mindre annet er angitt.

Fuktighetsinnhold som ble observert, ved tørking ved 55°

i vakuum over ^2^5' var:

(f) Sammensetning av materialer

(i) Celluloseinnhold

Duplikatprøver (ca. 25 mg) ble veid nøyaktig inn i reagens-rør forsynt med propp, og svovelsyre (98 %, 1 cm MAR kvalitet) ble tilsatt. Temperaturen i disse suspensjoner ble holdt under 0°C ved hjelp av et is/saltbad (-10°C). Etter 48 timer ved 4° ble 8,0 cm<3> destillert vann tilsatt og rørene oppvarmet i 2,5 timer i kokende vannbad. Etter avkjøling til romtemperatur ble innholdet av D-glukose og totalt karbohydrat bestemt.

De oppnådde resultater fra denne prosedyre er angitt i tabell la.

(ii) Innhold av lett hydrolyserbare nøytrale karbohydrater som stammer fra ikke- cellulose- polysakkarider ( for eksempel hemicellulose)

Prøver (50-60 mg) av tørket materiale ble veid nøyaktig inn i reagensrør og trifluoreddiksyre (2,0 M, 2,0 cm<3>) tilsatt. Rørene ble forseglet og oppvarmet i kokende vannbad i 6 timer. Etter avkjøling, og åpning av rørene, ble trifluoreddiksyre fjernet ved fordampning. Fordampningsresten ble tatt opp i borat puffer (0,13 M, pH 7,5, 1,0 cm 3) og analysert under anvendelse av borat-anione-utbyttingskromatografi (JEOL karbohydrat-analysesystem). De oppnådde resultater fra denne prosedyre er gjengitt i tabell lb.

Eksempel 1

Behandling av cellulose med løsninger av litiumklorid og litiumklorid/ saltsyre ved forhøyede temperaturer.

To testløsninger ble tillaget ved å anbringe 50 mg-porsjoner av cellulosefibre i to reagensglass og å tilsette dertil i ett tilfelle en mettet løsning av litiumklorid (5,0 cm 3) og i det annet tilfelle en løsning av saltsyre (0,5 M) mettet med litiumklorid. Reagensglassene ble forseglet, holdt i kjøleskap natten over og så anbrakt i et kokende vannbad. Etter 5 minutter ble det reagensglass som inneholdt HCl/LiCl tatt ut, da cellulosen var praktisk talt oppløst, og ble avkjølt i et isbad. Glasset som inneholdt LiCl-løsning ble holdt i det kokende vannbad i 12 timer. Løsningen og den overstående væske, respektive, ble analysert på totalt karbohydrat under anvendelse av standard-løsninger av D-glukose i mettet litiumklorid-løsning. Resultatene er gjengitt i tabell 2. Disse resultater viser at behandling med 0,5 M saltsyre mettet med litiumklorid gir høy grad av solubilisering (ca. 54 %). Det solubiliserte karbohydrat ble vist ved gelgjennomtrengningskromatografi å være stort sett glukose (5,0 mg cm -3 av 6,0 mg cm 3 solubilisert) idet resten hovedsakelig var et disakkarid.

Eksempel 2

Behandling av cellulosefibre med saltsyre av varierende konsentrasjon med mettet litiumklorid.

50 mg-prøver av cellulosefibre ble anbrakt i reagensglass som hver var tilsatt 5,0 cm<3> løsning av saltsyre (0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 eller 4,0 M) mettet med litiumklorid. Reagensglassene ble forseglet og anbrakt i et kokende vannbad. Glass ble tatt ut så snart som solubilisering ble observert visuelt, eller når signifikant misfarvning var synlig. Ved uttagningen ble reagensglassene avkjølt i et isbad og lagret i kjøleskap inntil analyse på totalt karbohydrat i løsning som i eksempel 1. De oppnådde resultater er gjengitt i tabell 3. Dataene i tabell 3 viser at saltsyre (4,0 M) mettet med litiumklorid hadde oppnådd praktisk talt 100 % solubilisering.

Eksempel 3

Behandling av cellulosefibre med HC1 ( 4, 0 M) som inneholder varierende konsentrasjoner av litiumklorid.

Metoden fra eksempel 2 ble gjentatt under anvendelse av fastsatt HCl-konsentrasjon (4,0 M), men med varierende litiumklorid-konsentrasjoner. De anvendte litiumklorid-konsentrasjoner var 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 M og mettet. Resultatene er gjengitt i tabell 4.

Eksempel 4

Behandling av cellulosefibre med saltsyre av varierende konsentrasjoner mettet med litiumklorid med en forhåndsbehandling ved romtemperatur før solubilisering ved forhøyet temperatur.

Metoden fra eksempel 2 ble gjentatt med unntagelse av at saltsyreløsningene med molaritet 0,1, 0,5 og 1,0, mettet med litiumklorid, ble anvendt og at testløsningene fikk henstå i 60 timer ved romtemperatur før oppvarmning. Resultatene er gjengitt i tabell 5, og dataene i tabellen, i sammenligning med tabell 3, indikerer at forhåndsbehandling øker cellulose-solubilisering.

Eksempel 5

Behandling av forskjellige celluloseholdige materialer med saltsyre ( 1, 0 M) mettet med litiumklorid.

De materialer som ble undersøkt var cellulosefibre, mekanisk masse, avispapir 1 (Daily Mirror), avispapir 2 (Observer, ingen trykksverte) og et gjær-glukan. 50 mg-prøver av hvert materiale ble suspendert i en løsning

(5 cm 3) av saltsyre (1,0 M) mettet med litiumklorid og behandlet som i eksempel 4. De oppnådde løsninger ble klarnet ved se rtrifugering før analyse med hensyn på totalt karbohydrat og for molekylær fordeling ved gelgjennomtrengningskromatografi. De oppnådde resultater er gjengitt i tabell 6. Dataene som var presentert i tabell 6, indikerer at cellulose-fibrene er fullstendig solubilisert (innen eksperimentelle feilgrenser) og at det solubiliserte karbohydrat for den mekaniske masse og avispapir kommer gunstig ut av sammenligning med det som der er tilgjengelig.

Eksempel 6

Behandling av forskjellige celluloseholdige materialer med saltsyre ( 4, 0 M) mettet med litiumklorid.

De materialer som ble undersøkt var cellulosefibre, mekanisk masse, avispapir 1 (Daily Mirror), avispapir 2 (Observer, ingen trykksverte) og som kontrollprøver glukose og cellobiose. 50 mg-prøver av hvert materiale ble suspendert i en løsning (5,0 cm<3>) av saltsyre (4,0 M) mettet med litiumklorid. Suspensjonene ble forseglet i glassrør og anbrakt i et kokende vannbad.

Rørene ble så behandlet og analysert som angitt i eksempel 1

med hensyn på totalt karbohydrat og for molekylær fordeling ved gelgjennomtrengningskromatografi. De oppnådde resultater er gjengitt i tabell 7. Dataene indikerer fullstendig solubilisering av cellulosefibre.

Eksempel 7

Behandling av cellulosefibre med forskjellige syrer i løsninger mettet med uorganiske salter. 50 mg-prøver av cellulose ble suspendert i forskjellige løsninger (5,0 cm 3) som spesifisert i tabell 8a og 8b. Suspensjonene ble enten lagret ved 4°C i 20 timer før anbringelse i et kokende vannbad eller anbrakt i et kokende vannbad umiddelbart, og de prosedyrer som er beskrevet i eksempel 1 ble fulgt. Alle rør ble holdt i isbad etter oppvarmning til de var ferdige for analyse med hensyn på totalt karbohydrat. De oppnådde resultater er gjengitt i tabell 8(a) og tabell 8(b).

Eksempel 8

Behandling av cellulosefibre med saltsyre ( 3, 5 M) alene

50 mg-prøver av cellulosefibre ble anbrakt i reagensglass som hver var tilsatt saltsyre (3,5 M, 5,0 cm ). Glassene ble forseglet og anbrakt.i kokende vannbad. Glassene ble tatt ut etter 2, 4, 8 og 12 timer. Løsninger etter 8 og 12 timer var gule, og den resterende cellulose ble sort, mens løsninger etter 2 og 4 timer var farveløse og rest-cellulosen hvit. Analyse av den overstående løsning ble utført med hensyn på totalt karbohydrat. De oppnådde resultater er gjengitt i tabell 9. Dataene der viser, i sammenligning med eksempel 2, tabell 3, effektiviteten av saltsyren i kombinasjon med litiumklorid. Således nås 17 % solubilisering med HC1 (3,5 M) i løpet av 720 minutter sammenlignet med fullstendig solubilisering i løpet av 55 sekunder med HC1 (4,0 M) mettet med litiumklorid eller 83 % solubilisering i løpet av 55 sekunder med HC1 (3,0 M) mettet med litiumklorid.

Eksempel 9

Solubilisering og hydrolyse av cellulosefibre med forskjellige kombinasjoner av vann, saltsyre og litiumklorid ved 50°C

Prøver av cellulosefibre ble anbrakt i flasker med skrukork, og den aktuelle test-løsning (10 cm 3), spesifisert i tabell 20, ble tilsatt. Flaskene ble anbrakt i et vannbad ved 5 0° og innholdet omrørt ved hjelp av magnetrører. Prøver - på 0,1 cm ble tatt ut ved spesifiserte tidsintervaller, fortynnet med vann til 10 cm<3> og lagret ved 4°C til analyse ble utført. Analyser med hensyn på totalt karbohydrat og D-glukose ble utført med passende fortynning av prøver ved de høyere cellulosekonsentrasjoner. De oppnådde resultater er gjengitt i tabell 10. De data som der inneholdes viser effektiviteten av saltsyre (4,0 M) mettet med litiumklorid med hensyn til å solubilisere cellulosefibre ved 1, 5 eller 10 %; fullstendig solubilisering er iakttatt ved 50°C i løpet av 1 time, innen grensene for eksperimentelle feil.

Eksempel 10

Solubilisering og hydrolyse av cellulosefibre ved saltsyre

( 4, 0 M) mettet med litiumklorid ved behandling ved 50°C fulgt

av forhøyet temperatur.

Prøver (0,5 eller 1,0 g) av cellulosefibre ble anbrakt i flasker med skrukork som hver var tilsatt saltsyre (4,0 M)

mettet med litiumklorid (10,0 cm<3>). Flaskene ble anbrakt i et bad ved 50°C i enten 1 eller 2 timer, idet innholdet ble omrørt ved hjelp av magnetrører. Ved slutten av dette første trinn ble det tatt ut alikvoter (1,0 cm 3) som ble anbrakt i mindre flasker. Disse flasker ble så neddyppet i et vannbad ved 80°C eller et kokende vannbad. Flasker ble tatt ut ved de spesifiserte tidsintervaller, avkjølt og holdt ved 4°C

3 3 inntil analyse. Prøvene ble fortynnet (0,1 cm til 100 cm-)

før analyse med hensyn på totalt karbohydrat, D-glukose og,

der hvor det er angitt, relativ molekylær fordeling ved gelgjennomtrengningskromatografi. De oppnådde resultater er gjengitt i tabellene 11 og 12. Løsningene av saltsyre (4,0 M) mettet med litiumklorid ble karakterisert ved måling av brytnings-indeks ved 20°C under anvendelse av natrium-D-linjen. Løsninger av forskjellige litiumklorid-konsentrasjoner ble også målt.

Disse resultater er vist i tabell 13. Av disse data, og det målte tetthet, ble en løsning av saltsyre (4,0 M) mettet med litiumklorid anslått å inneholde:

Eksempel 11

Solubilisering og hydrolyse av stivelse ( Amylum maydis) ved hjelp av saltsyre ( 2, 0 M) mettet med magnesiumklorid • 6H,, 0 ved behandling ved 50° eller ved 50° og 90°.

2,0 g-prøver av stivelse (Amylum maydis) ble anbrakt i beholdere med skrulokk som hver var tilsatt en løsning

(20,0 cm ) av saltsyre (2,0 M) mettet med magnesiumklorid• 6^0. Beholderne ble neddyppet i et bad med konstant temperatur, ved 50° i 30-180 minutter, idet innholdet ble omrørt ved hjelp av magnetrører. Etter passende tidsintervaller ble visse beholdere overført til et bad ved 90° i opp til 20 minutter. Etter avkjøling ble innholdet av totalt karbohydrat og D-glukose i løsningene bestemt. Resultatene er gjengitt i tabell 14. Kontroll-løsninger av saltsyre (1,0 M og 4,0 M) ble også anvendt som solubiliserings- og hydrolysemiljø. Det kan sees at under disse betingelser er hydrolyse til glukose neglisjer-bar i fravær av magnesiumkloridet og at den enkle solubilisering som oppnås i nærvær av magnesiumklorid oppnås ved høyere nivåer av saltsyre.

Eksempel 12

Solubilisering og hydrolyse av stivelse ved hjelp av saltsyre ( 2, 0 M) mettet med magnesiumklorid• 6H^ O med og uten tilsetning av vann under- hydrolysefasen.

Prosedyren fra eksempel 18 ble fulgt under anvendelse av stivelse (1,5 g) i saltsyre (2,0 M) mettet med magnesiumklorid-6H20 (10 cm<3>). Etter 3 timer ved 50° ble 0,15 cm3 vann tilsatt til det ene sett av løsninger cg hydrolysen fortsatt ved 50°. Innholdet av D-glukose i løsningene etter forskjellige tider er gjengitt i tabell 15.

Eksempel 13

3 prøver av samme størrelse og type av tørt filterpapir ble tatt. To av disse (i) og (ii) ble behandlet under anvendelse av prosessbetingelsene i henhold til US-patent 4.018.620. Den tredje (iii) ble behandlet under anvendelse av betingelsene i henhold til foreliggende oppfinnelse. Den løsning som ble anvendt for å behandle (i) var en mettet løsning av kalsiumklorid i vann inneholdende 0,1% saltsyre og med et 5% faststoffinnhold. Den løsning som ble anvendt for å behandle (ii) var en mettet løsning av kalsiumklorid i vann inneholdende 2,0% saltsyre og med et faststoffinnhold på 5%. Behandlingene av begge prøver (i) og (ii) ble utført ved en temperatur på 125 C i 30 minutter. Prtfve

(iii) ble behandlet med en vandig løsning inneholdende 11 vekt%

(1 molar) kalsiumklorid og 31% (6,8 molar) saltsyre og med et faststoffinnhold på 5%. Behandlingen ble utfart ved en temperatur på 70 C i 10 minutter.

Resultatene er gitt i tabell 16.

Resultatene viser at uttrykt som % solubilisering og % omdannelse (men beregnet) er det en signifikant forbedring når fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse anvendes.

Eksempel 14

En prøve av filterpapir ble behandlet med en vandig blanding inneholdende saltsyre i en slik andel at den hadde en konsentrasjon av 10 mol pr. kilogram vekt av hele reaksjonsblandingen. Sammensetningen av reaksjonsblandingen var som følger (alle tall i vekt/vekt):

36,4% saltsyre (8 molar)

5,1% kalsiumklorid (0,4 molar)

5,0% filterpapir

53,5% vann.

Behandlingen av filterpapiret ble utført ved å blande i

10 minutter ved en temperatur på 70 C. Ved slutten av behandlingen var 89,3% av det filterpapir som innledningsvis var til stede, blitt solubilisert. Omdannelse av filterpapir til glukose var 73,3%.

Reaksjonsblandingen ble fortynnet med vann - 30 g blanding ble laget opp til 1 liter - og behandlingen ble fortsatt i 30 minutter ved en temperatur på 130 C. Ved slutten av dette tidsrom ble omdannelsen av filterpapir til glukose funnet å ha øket til 82,6%.

Claims

Fremgangsmåte for modifisering, solubilisering og/eller hydrolyse av et glykosidisk bundet karbohydrat som har reduserende grupper, i form av lignocellulose eller stivelse-baserte materialer, for frembringelse av en eller flere av følgende effekter: (A) modifisering av karbohydratet for å indusere øket tilgjengelighet og påvirkelighet for enzymer, mikrober og kjemikalier, (B) solubilisering av karbohydratet, og (C) solubilisering og hydrolyse av en eller flere glykosidiske bindinger i karbohydratet for frembringelse av løselige oligosakkarider og/eller glukose,

karakterisert ved

at karbohydratet, ved en temperatur i området 50-100°C og et tidsrom i området 45 sekunder til 6 timer, bringes i kontakt med en blanding som omfatter saltsyre med en konsentrasjon innen området 1 til 10 molar og et halogenid av litium, magnesium og/eller kalsium eller en forløper for nevnte halogenid, idet halogenidet er til stede i en konsentrasjon innen området 1 molar til mettethet.