NO144394B - Fremgangsmaate for fremstilling av det beta-laktamase-inhiberende antibiotikum mm 13902 og alkalimetallsalter derav - Google Patents

Description

Britisk patent 1 363 075 åpenbarer at en nyttig P-laktamase-inhibitor kan oppnås ved fermentering av visse stammer av Streptomyces olivaceus. Før foreliggende oppfinnelse ble det

antatt at det materiale som er åpenbart i britisk patentskrift 1 363 075 var i alt vesentlig rent. Imidlertid er det oppdaget

at dette ikke er tilfelle og at en mindre komponent av det nevn-

te materiale kan isoleres og har kraftig antibakteriell aktivitet. Dette nye materiale betegnes MM 13902 og antas nå å være ansvarlig for en del av en viss antibakteriell aktivitet som er for hånden 1 materialet i henhold til britisk patent 1 363 075, selv om det

er ansvarlig for bare en meget liten del av 3-laktamase-inhiberende aktivitet som vises av det nevnte materiale. Naturligvis må o intet i denne beskrivelse oppfattes slik at det kreves beskyt-telse for materiale som er åpenbart i britisk patent 1 363 075.

•Andre 3-laktamase-inhibitorer er kjent å være produsert av stam-

mer av Streptomyces, f. eks,, slike som er åpenbart i BRD-utl. skrift 2 340 005, men slike kjente materialer har ikke vist seg å ha den kraftige antibakterielle aktivitet av den type som MM 13902 har.

Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det 3-laktamase-inhiberende antibiotikum MM 13902, og dets alkalimetallsalter.

MM 13902 er en fast karboksylsyre som i form av et i alt vesentlig rent natriumsalt har følgende karakteristika: I. Det er meget løselig i vann, løselig i metanol og så å si uløselig i kloroform, dietyleter og hydrokarboner. II. I vandig løsning har det et karakteristisk ultrafiolett-spektrum med absorpsjonsmaksima hvorav ett er ved ca. 305 nm. III. Når det er til stede som 0,4 vekt% i en nylaget KBr-tablett, har det et karakteristisk infrarødt-spektrum som har absorpsjonsmaksima ved bl.a. ca. 3450, 2950, 1750, 1620, 1510, 1400 og 1260 cm"<1>. IV. Det har et karakteristisk NMR-spektrum, målt i D20, som bl.a. har (a) et par lavfelts-dubletter sentrert ved tilnærmet 2,8 5 C og 4,00 t, med koplingskonstanter på tilnærmet 14 Hz; (b) en dublett sentrert ved tilnærmet 8,55 c,

og (c) en skarp singlett ved tilnærmet 8,00 £.

V. Det har antibakteriell aktivitet overfor forskjellige arter, inklusive bl.a. stammer av Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Salmonella typhi og Pseudomonas aeruginosa. VI. Når det er blandet med ampicillin, synergiserer det sin aktivitet overfor organismer inklusive stammer av Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii og Staphylococcus aureus Russell.

MM 13902 har følgende strukturformel (I):

Formelen stemmer overens med de ovennevnte identifikasjons-data.

Det rene di-natriumsalt av MM 13902 er en /3-laktamase-inhibitor og har en I^Q-verdi (som skal forklares i det følgende) på mellom 0,001 ^ug/ml og 0,0001 ^ug/ml mot Ø-laktamase av Escherichia coli B 11.

Ved kjøring på cellulose i et tynnsjiktkromatografi-system har det rene di-natriumsalt av MM 13902 følgende tilnærmede R^-verdier:

(a) n-butanol/isopropanol/vann - 7:7:6 vol./vol.;

(b) isopropanol/vann - 7:3 vol./vol.; R^ = 0,85

(c) n-butanol/etanol/vann - 7:7:6; R^ = 0,81

(d) n-propanol/vann - 4:1; R^ = 0,75

Ved et annet aspekt kan MM 13902 karakteriseres som et svovelholdig antibakterielt middel, hvis salter produseres under dyrkning av Streptomyces olivaceus ATCC 31126 og som i form av en vandig løsning av sitt di-natriumsalt har UV-absorpsjonsmaksima ved ca. 305 nm og ved ca. 225 nm i alt.vesentlig som vist i vedlagte figur 1.

Alternativt kan MM 13902 karakteriseres som et antibakterielt middel som i form av sitt i ålt vesentlig' rene di-natriumsalt har et IR-absorpsjonsspektrum i alt vesentlig som vist i fig. 2, når dette er opptatt på en nylaget 0,4 vekt% KBr-tablett og som i form av sitt i alt vesentlig rene di-natriumsalt har et NMR-spektrum i alt vesentlig som vist i fig. 3, opptatt med en nylaget løsning i I^0-

Materialet MM 13902 har tendens til å være ustabilt når

det er i sin ikke-saltdannede syreform. Følgelig tilveiebrin-

ger en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen salter av MM 13902. Saltene av MM 13902 er gjerne di-basiske salter. Fortrinnsvis er disse salter slike som er dannet med farmasøytisk akseptable ioner, f.eks. natrium-, kalium-, kalsium-, magnesium-, aluminium-, konvensjonelle substituerte ammoniumioner og lignende. Spesielt egnede salter er alkalimetallsalter, f.eks. natrium-, eller kaliumsaltene, f.eks. di-natrium- eller di-kaliumsaltene.

MM 13902 og dets salter som tilveiebringes ved hjelp av oppfinnelsen, er gjerne minst 50 % rene, bedre minst 70 % rene og fortrinnsvis 80 % rene, f.eks. 90-100 % rene.

Farmasøytiske preparater som omfatter MM 13902 inneholder gjerne et natrium- eller kaliumsalt av MM 13902, f.eks. di-natrium- eller di-kaliumsaltet av MM 13902.

Slike preparater kan være i en form som er egnet for oral, topisk eller parenteral bruk. Eksempelvis kan tabletter, kaps-ler, kremer, siruper, rekonstituerbare pulvere og sterile for-

mer som er egnet for injeksjon eller infusjon, anvendes.' Slike preparater kan inneholde konvensjonelle farmasøytisk akseptab-

le materialer, såsom fortynningsmidler, bindemidler, farvemidler, aromastoffer, konserveringsmidler, smuldremidler og lignende i overensstemmelse med konvensjonell farmasøytisk praksis på en måte som er velkjent for fagmannen på området vedrørende sammensetning av antibiotika såsom penicilliner og kefalosporiner.

MM 13902 eller dets salter kan være til stede i preparatet som eneste terapeutisk middel eller kan være til stede sammen med et @-iaktarrrantibiotikum. Egnede 3-laktam-antibiotika innbefatter slike som er kjent å være følsomme overfor /3-laktamaser og som også har en viss indre motstandskraft overfor /3-laktamaser. Slike /3-laktam-antibiotika

■innbefatter ampicillin, amoksycillin, benzylpenicillin, fenoksy-metyIpenicillin, propicillin, cefaloridin, cefoxitin, cefalotin, cefalexin, carbenicillin, ticarcillin og in vivo-hydrolyserbare estere av slike forbindelser, for eksempel fenyl-, tolyl- eller indanyl-esterne av carbenicillin eller ticarcillin eller acetoksymetyl-, pivaloyloksymetyl- eller ftalidylesterne av ampicillin, benzylpenicillin, amoksycillin, cefaloridin, cefalo-glycin og lignende.

Forholdet mellom MM 13902 eller et salt derav og /3-laktam-antibiotikum er normalt mellom 10:1 og 1:10, for eksempel mellom 3:1 og 1:3.

Den totale aktivitet av antibakterielle midler som er tilstede i en enhetsdoseform vil normalt være mellom 50 og 1500 mg og vil vanligvis være mellom 100 og 1000 mg.

Foretrukne enhetsdosepreparater som inneholder MM 13902 kan administreres en eller flere ganger om dagen, for eksempel 2 til 4 ganger i løpet av dagen, ved behandling av sykdommer i uringangene, åndedrettsveiene, i det myke vev og lignende. Således kan preparatene anvendes ved behandling av slike sykdommer som bronkitt, gonoré, otitus media, mastitis og lignende.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen vedrører således

fremstilling av det ovenfor beskrevne 3-laktamase-inhiberende antibiotikum MM' 13902 samt alkalimetallsalter derav, og fremgangsmåten er karakterisert ved at en mikroorganisme av slekten Streptomyces dyrkes, komplekset MM 4 550 utvinnes fra dyrkningsmediet og forbindelsen MM 13902 eller et salt derav isoleres fra komplekset, ved hjelp av kjente kromatograferingsmetoder.

Den kromatografiske isolering foretas ved separering av en

løsning av det nevnte kompleks, i fraksjoner som består i alt vesentlig av en løsning av MM 13902 eller et salt derav, med hvilket menes at enten det eneste antibiotiske materiale som er til stede i den løsning er MM 13902 eller et salt derav eller at hvis et annet antibiotisk materiale er til stede, så er det tilfelle i meget minre grad enn hva tilfellet er for MM 13902, eller salt derav.

Mer egnet representerer MM 13902 eller et salt derav 70 %, fortrinnsvis 80 % og helst 90-100 %, av det antibiotiske materiale som er tilstede i fraksjonen. Det er funnet at en akseptabel metode for bestemmelse av hvilke fraksjoner som i alt vesentlig består av en løsning av MM 13902 eller et salt derav, er å kjøre UV-absorpsjonsspektret for hver prøve. De fraksjoner som viser et UV-spektrum lik det som er gjengitt i figur 1, inneholder normalt MM 13902 eller et salt derav ialt vesentlig fritt for annet antibiotisk materiale såsom MM 4550 som skal beskrives i det følgende. Generelt er de fraksjoner som viser et distinkt UV-absorpsjonsmaksimum ved ca. 305 nm, av den ønskede renhet.

Normalt anvendes den ovenfor beskrevne fremgangsmåte

for isolering av MM 13902 som et di-basisk salt. Hvis et mono-basisk salt av MM 13902 eller den frie syre MM 13902 kreves i og for seg, kan de fremstilles ved surgjøring av et di-basisk salt av MM 13902 da generelt de monobasiske salter av MM 13902 og den frie syre MM 13902 ikke er tilstrekkelig stabile for isolering fra slike blandinger som MM 4550 (kompleks) som beskrevet i det følgende. Disse monobasiske salter og den frie syre er ikke lett oppnåelige på grunn av deres lave stabilitet.

Som tidligere angitt antas det at den kromatografiske isolering av MM 13902 best utføres ved anvendelse av et salt av MM 13902, for eksempel di-natriumsaltet. Salter av MM 13902 er mer løselige i vandige løsningsmiddelsystemer enn i høyt lipofile løsningsmidler, og det foretrekkes følgelig å anvende vandige løsningsmiddelsystemer i de kromatografiske rensninger som anvendes i forbindelse med foreliggende oppfinnelse.

Det har vist seg at vandige løsninger av elektrolytter som er pufret til tilnærmet nøytralitet, har vist seg egnet for anvendelse i forbindelse med polare bærematerialer såsom basiske ionebytteharpikser. Således kan en vandig løsning av natriumklorid som er pufret til pH ca. 7 med en konvensjonell puffer, for eksempel en fosfatpuffer, anvendes i tilknytning til bærematerialer som kan inneholde tertiære aminogrupper eller kvaternære ammoniumgrupper. Det har vist seg at basiske ione-byttecelluloser og basiske ionebytte-tverrbundne dekstraner er egnede bærematerialer og at QAE "Sephadex" A25 spesielt er et meget godt egnet bæremateriale, spesielt når løsningsmiddel-systemet omfatter 0,7 m natriumklorid i pH 7-fosfatpuffer.

("Sephadex" er en handelsbetegnelse).

Alternativt har det vist seg at løsningsmiddelsystemer som omfatter blandinger av vann og vann-blandbare organiske løsningsmidler, for eksempel en lavere alkanol, er egnet for anvendelse i tilknytning til inerte bærematerialer, for eksempel silikagel eller cellulose. Et spesielt godt egnet løsningsmidde1-system for anvendelse med cellulose er en blanding av vann og isopropanol, spesielt en 7:3 blanding av isopropanol og vann.

Imidlertid inneholder produktet fra de ovenfor angitte fremgangsmåter som anvender ionebytteharpikser, hyppig en meget høy andel av natriumklorid, slik at det er fordelaktig å avsalte de oppsamlede løsninger. Avsalting kan utføres ved å føre løsningen nedover en kolonne som inneholder et lipofilt materiale på hvilket MM 13902 adsorberes, men som ikke adsorberer natriumklorid. Egnede kolonnematerialer omfatter polystyrener, for eksempel "Amberlite" XAD 4. Alternativt kan gelfiltrering anvendes under anvendelse av filtreringsmidler såsom tverrbundne dekstroner, for eksempel "Sephadex" G 25 og polyakrylamidgeler, for eksempel "Biogel" P2 ("Amberlite", "Sephadex" og "Biogel"

er handelsbetegnelser). Antibiotikumet kan elueres fra kolonnen under anvendelse av vann, vandig metanol eller lignende.

Når de ønskede løsninger oppnås ved ovennevnte fremgangsmåte , kan det di-basiske salt av MM 13902 oppnås i fast form ved fjerning av løsningsmidlet under milde betingelser. Det har vist seg at en akseptabel metode"for oppnåelse av et slikt fast materiale er å fordampe de oppsamlede fraksjoner som inneholder MM 13902 under redusert trykk og frysetørke dem.

Om ønsket, kan den ovenfor angitte fremgangsmåte ut-føres i to eller flere trinn. Eksempelvis kan en løsning av MM 4550 (kompleks) separeres i fraksjoner som omfatter MM 13902 eller et salt derav som er kontaminert med opptil sin egen vekt av andre antibakterielle midler, fraksjonene kan frysetørkes

slik at de gir et materiale som for eksempel inneholder ca.

50-60 % MM 13902 eller et salt derav, og dette materiale kan så bli rekromatografert slik at man får et materiale som for eksempel inneholder 90-100 % MM 13902 eller et salt derav.

I forbindelse med denne beskrivelse anvendes betegnelsen "MM 4550 (kompleks) " for angivelse av det materiale som opprinnelig er betegnet MM 4550 i GB-PS 1.363.075. MM 4550 (kompleks) slik det fremstilles ved en gjentagelse av eksemplene i GB-PS 1.363.075, er et urent materiale som inneholder i varierende andeler salter av MM 4550 (som skal beskrives i det følgende) og salter av MM 13902, samt betydelige mengder av andre materialer. MM 4550 (kompleks) har ikke det karakteristiske UV-spektrum som MM 13902 har. Ij.Q-verdien (som skal beskrives i det følgende) til MM 4550 (kompleks) fremstilt ved repitisjon av eksemplene i GB-PS 1.363.075 er ikke normalt under 0,0004 yig/ml. Forholdet mellom salter av MM 4550 og salter av MM 13902 som er tilstede i

MM 4550 (kompleks) antas å være sterkt varierende og menes å

være avhengig av slike faktorer som stammen av organisme som anvendes og/eller de eksakte isolasjonsteknikker som anvendes,

men det har generelt vist seg at komplekset inneholder mer MM 4550 enn MM 13902. Fremstillingen av MM 4550 (kompleks) beskrives i det følgende idet avsnitt som vedrører "beskrivelser".

I forbindelse med denne beskrivelse anvendes betegnelsen "MM 4550" for beskrivelse av en ialt vesentlig ren forbindelse som er en kraftig /3-laktamase-inhibitor og som også er i besittelse av en viss grad av antibakteriell aktivitet. Egenskapene til MM 4550 beskrives i det følgende i det avsnitt som er betegnet "beskrivelser".

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen har det vist seg at stammer av Streptomyces olivaceus er spesielt egnet, og eksempler på slike organismer skal beskrives i det følgende.

Mest egnet er det å anvende som organisme en stamme av Streptomyces olivaceus, for eksempel ATCC 21379, 21380, 21381, 21382, 31126 eller mutanter derav.

En spesielt foretrukket organisme for anvendelse ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, er Streptomyces olivaceus ATCC 31126.

Slik den her anvendes betyr betegnelsen "dyrkning" den frivillige aerobe vekst av en organisme i nærvær av assimilerbare kilder av karbon, nitrogen, svovel og mineralsalter. En slik aerob vekst kan finne sted i et fast eller halv-fast nærings-medium eller i et flytende medium hvor næringssaltene er oppløst eller suspendert. Dyrkningen kan finne sted på en aerob overflate eller ved neddykket kultur. Næringsmediet kan være sammen-satt at komplekse næringsstoffer eller kan være kjemisk definert. Det har vist seg at media som inneholder komplekse næringsstoffer, for eksempel gjærekstrakt, soyabønnemel og lignende, er spesielt godt egnet. Det har også vist seg at tilsetning av koboltioner, sulfationer og kalsiumkarbonat er fordelaktig.

Det har vist seg at dyrkning ved en temperatur på

28 + 2°C gir akseptable utbytter av antibiotikum og at et godt tidspunkt for høstning av næringsbuljongen er 2-3 dager etter initiering av fermenteringen.

Slik den her anvendes, inkluderer betegnelsen "mutant"

enhver mutant-stamme som oppstår spontant eller via effekten av et eksternt middel hva enten dette middel anvendes frivillig eller på annen måte. Egnede metoder for produksjon av mutant-

stammer innbefatter dem som er gjengitt av H.I. Adler i Techniques for the Development of Micro-organisms i "Radiation and Radio-isotopes for Industrial Micro-organisms", Proceedings of a Symposium, Wien, 1973, s. 241, International Atomic Energy

Authority og disse innbefatter:

I. Ioniseringsstråling (for eksempel røntgen- og ^-stråler),

UV-lys, UV-lys pluss et fotosensibiliseringsmiddel (for eksempel 8-metoksypsoralen), salpetersyre, hydroksyl-

amin, pyrimidinbase-analoger (for eksempel 5-bromuracil), akridiner, alkyleringsmidler (for eksempel sennepsgass, etylmetansulfonat), hydrogenperoksyd, fenoler, form-

aldehyd, varme, og

II. Genetiske teknikker, for eksempel rekombinasjon, trans-formasjon, transduksjon, lysogenisasjon, lysogen om-

dannelse og selektive teknikker for spontane mutanter.

Det har vist seg at anvendelsen av et mutasjonspåskyndende middel kan føre til produksjon av organismer som har evne til å produsere forhøyede mengder av de ønskede antibiotika. Eksempel-

vis fører bestråling av kulturer av Streptomyces olivaceus ATCC

21379 fulgt av isolering av den resulterende stamme, som viste seg å produsere den største sone med aktivitet på KAG-analysen som skal beskrives i det følgende, til isolasjon av Streptomyces olivaceus ATCC 31126 som er en foretrukken stamme for anvendelse i forbindelse med oppfinnelsen. ATCC 31126 er også deponert i Nederland som CBS 155.75.

Generelt bør alle isolerings- og renseprosesser som anvendes for oppnåelse av det ønskede antibiotikum, finne sted ved ikke-forhøyede temperaturer, for eksempel under 20°C og mer hen-siktsmessig ikke over 12°C.

Det ønskede produkt oppnås normalt overveiende fra kulturfiltratet slik at det foretrukne innledningstrinn i isoleringsprosessen er fjerning av fast materiale fra fermenteringen, for eksempel ved filtrering.

Et urent preparat av MM 13902 eller et salt derav kan oppnås fra det klarnede kulturfiltrat ved absorbering av MM 13902 eller et salt derav på et aktivt materiale, for eksempel aktiv-kull eller lignende og deretter eluering av den ønskede substans fra det aktive materiale under anvendelse av et løsningsmiddel som for eksempel vandig aceton. Normalt utføres denne fremgangsmåte på et di-basisk salt av MM 13902.

Alternativt kan et urent preparat av MM 13902 eller et salt derav oppnås fra kulturfiltratet ved ekstrahering under anvendelse av et lipofilt ammoniumsalt og et løsningsmiddel som ikke er blandbart med vann. Dette er ofte mer effektivt enn den fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor. (MM 13902 kan oppnås som det substituerte ammoniumsalt ved fordampning av det organiske løsningsmiddel under redusert trykk). Fortrinnsvis tilbakeekstraheres så startløsningen av det MM 13902-substituerte ammoniumsalt til en vandig fase ved anvendelse av en løsning av et alkalimetalljodid, for eksempel natriumjodid. Denne siste prosessvariant fører generelt til fremstilling av en vandig løsning av et urent di-basisk salt av MM 13902.

De urene former av MM 13902 eller dets salter som beskrevet ovenfor utsettes normalt for de kromatografiske prosesser som er beskrevet ovenfor, i den hensikt å produsere materiale med akseptabel renhet.

Følgende "beskrivelser" gir generell informasjon som er nyttig ved isolering av antibakterielle forbindelser. De følgende eksempler belyser utførelsesformer, av oppfinnelsen.

Beskrivelse 1

I ^-bestemmelse

I^Q-verdien er den materialmengde som kreves for å gi

50 % inhibering av hydrolyse av ampicillin ved hjelp av /3-laktamase-enzymet av Escherichia coli Bil, en organisme som inneholder en R-f aktor-styrt /3-laktamase. Denne /3-laktamase er klassifisert som et enzym av type Illa i henhold til klassifiseringen etter Richmond og Sykes [gjengitt i Microbiol.Physiol. 9 31 (1973)].

Hastigheten av )3-laktamase-hydrolyse av ampicillin til dens penicilloinsyre kan følges av en stivelse/jodometrisk analyse hvor man måler hastigheten for dannelsen av penicilloinsyre ved å følge avfarvningen av et stiveIse/jod-kompleks. Denne metode og fremstillingen av /3-laktamase er beskrevet i en artikkel av Cole M., Elson S. og Fullbrook P.D. (Biochemical

Journal 1972, 127, 295-308). En lett modifikasjon av ovennevnte metode ble anvendt ved det at prøven av inhibitor ble pre-inkubert med enzymet i 15 minutter ved 37°C før tilsetning av substratet ampicillin. Fremgangsmåten var som følger:

Reagenser

Betingelser

Reaksjonene ble utført i 1 cm kyvetter ved 37°C i et SP 800 Pye Unicam spektrofotometer. Dette instrument kan holde fire prøve-kyvetter og deres tilsvarende blindprøver. Den første kyvette ble anvendt for kontrollreaksjonen og inneholdt ikke noen inhibitor. Annen, tredje og fjerde kyvette ble anvendt for forskjellige fortynninger av inhibitoren. Man hadde således:

Reaksjonene ble fulgt ved registrering av forandring i optisk tetthet ved 590 nm og måling av hastigheten av reaksjonen som optisk tetthetsforandring pr. 100 sek. i løpet av et tids-intervall på 3-6 minutter. Inhibitorprøven ble fortynnet til det ble nådd en fortynning som ga 50 % av reaksjonshastigheten sett i ikke-inhibitor-kontrollprøven.

Beskrivelse 2

KAG- analysen

KAG-analysen er en fremgangsmåte for bestemmelse av nærvær av en /3-laktamase-inhibitor i fermenteringsbuljonger eller i trinn i isoleringen. Smeltet næringsagar av 45°C kim-dannes med en egnet /3-laktamaseproduserende stamme av Klebsiella aerogenes og blandes så med en tilstrekkelig mengde av en steril løsning av penicillin G slik at man får en konsentrasjon av 6 ^ug/ml av penicillin G i agaren. Agaren helles så ned i en petri-skål, og etter stivning lages det sylindriske groper med jevn avstand i agarsjiktet ved anvendelse av en steril metall-kutter. Løsningene som skal testes, innføres i gropene. Skålen inkuberes så ved en konstant temperatur mellom 27 og 37°C. I inkuberingsperioden diffunderer eventuell inhibitor i testløsningen ut fra gropen inn i agaren og inhiberer der innvirkningen av |3-laktamase som er produsert av Klebsiella-cellene . Penicillin G er således beskyttet fra ødeleggelse av j3-laktamase og er tilstede i tilstrekkelig konsentrasjon til å forhindre veksten av Klebsiella. I de deler av agaren hvor inhibitoren ikke er diffundert i tilstrekkelig konsentrasjon, ødelegges penicillin G av /3-laktamasen, og tett vekst av Klebsiella får mulighet til å utvikle seg. Klare sirkulære inhiberingssoher av Klebsiella-vekst dannes således rundt gropene som inneholder inhibitor,

idet størrelsen av hver sone er avhengig av konsentrasjonen av inhibitor i løsningen som skal testes. Kraftigheten (vilkårlige enheter/ml) av testløsninger oppnås ved henvisning til en standard-linje av log.kons. inhibitor mot sonediameter. Dette analyse-system kan også anvendes for bioautografi.

Beskrivelse 3

Fremstilling av MM 4550 ( kompleks) sammenlignbar med det som er åpenbart i GB- PS 1. 363. 075

Streptomyces olivaceus ATCC 21379 ble dyrket i 7 dager ved 28°C på en fast agar-skråkultur i en Roux-kolbe. Agar-mediet hadde følgende sammensetning:

["Gjærekstrakten" var "Yeatex" fra Bovril.Food Ingredients, postboks 18, Wellington Road, Burton-on-Trent, Storbritannia, og "Agaren" kom fra Oxoid Limited, Southwark Bridge Road, London, S.E.1. , Storbritannia].

Mediet ble justert til pH 6,8 før sterilisering. 50 ml sterilt avionisert vann som inneholdt 0,02 % "Tween" 80 (handelsbetegnelse; "Tween" 80 er et polyoksyetylensorbitan-monooleat) ble tilsatt til en Roux-kolbe-kultur, og sporene ble suspendert ved rysting. Denne sporesuspensjon ble så tilsatt som podestoff til 75 1 av sterilisert kimtrinn-medium i en 100 1 fermentator av rustfritt stål. Sammensetningen av kimtrinn-mediet var som følger:

("Soyabønnemelet" var "Arkasoy" 50 fra British Arkady Co. Ltd., Old Trafford, Manchester).

For regulering av skumming ble 50 ml av 10 volum% "Pluronic" L81 i soyabønneolje tilsatt til fermenteringsmediet før sterilisering. ("Pluronic" L81 ble levert av Jacobsen van den Berg U.K. Ltd., 231 The Vale, London, W.3,. , Storbritannia,

og er en blokkpolymer av etylenoksyd og propylenoksyd).

Mediet ble dampsterilisert i fermentatoren i 20 minutter ved 120°C. Kimtrinnkulturen ble omrørt ved 340 opm med en agita-tor forsynt med vingeskiver, 21,6 cm i diameter, og forsynt med 150 l/min. steril luft gjennom en sprinkler med åpne ender. Dyrkningskaret var utstyrt med ledeplater. Temperaturen ble regulert ved 28°C, og etter inkubering under disse betingelser i 45 timer ble 7,5 1 av denne kimkultur tilsatt som podestoff til 150 1 sterilt fermenteringsmedium i en 300 1 fermentator av rustfritt stål. Fermenteringsmediet hadde følgende sammensetning:

300 ml av 10 % "Pluronic" L81 i soyabønneolje ble tilsatt for å forhindre skumming. Fermenteringen ble innhøstet etter 48 timer og klarnet ved sentrifugering. Det klarnede brygg ga 50 % inhibering i enzymanalysen ved en fortynning på 1 til 100.000. 100 1 av det klarnede brygg ble omrørt med 12 kg våt vekt av "Whatman" DE32 ionebyttecellulose i acetatform (levert av H. Reeve Angel & Co., 14 New Bridge Street, London E.C.4, Storbritannia; materialet er en mikrokrystallinsk cellulose substituert med dietylaminoetylgrupper). Oppslemmingen ble filtrert og MM 4550 (kompleks) eluert fra cellulosen med 12 1 0,5m kaliumsulfat. Ekstrakten ble konsentrert til 6 1 i en klyvende film-inndamper under vakuum og under 30°C. Meget av kaliumsulfatet ble utfelt ved tilsetning av 12 1 aceton. Løsningen ble filtrert og konsentrert til 200 ml ved inndampning under vakuum under 30°C. Konsentratet ble ladet i en 76 mm x 2 m kolonne av "Amberlite" XAD-4-harpiks (produsert av Rhom & Haas Co., Philadelphia, U.S.A.; materialet er en ikke-ionisk polystyrenharpiks,) eluert med avionisert vann, og eluatet ble oppsamlet i 140 ml fraksjoner. Aktive fraksjoner, påvist ved KAG-analysen, ble gitt større volum (2,2 1) og konsentrert til 275 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av en "Amicon" UM-05 membran (150 mm diameter) (levert av Amicon Ltd., 5 7 Queen 's Road, High Wycombe) under nitrogen-trykk på 4,2 kg/cm 2. Konsentratet ble frysetørket og ga som utbytte 2,2 g av brunt pulver (I^q = 0,004 yug/ml). 1 g av pulveret ble oppløst i 1 liter av 0,2m natriumsulfat og blandet med 1 liter av 2 vekt/vol.% tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat (fra AB Astra, S6dertaije, Sverige) i diklormetan. Diklormetanfasen ble separert ved hjelp av tyngdekraften, avkjølt til -70°C, filtrert for fjerning av is og konsentrert ved inndampning til 20 ml. 400 ml petroleter 40-60°C ble tilsatt til konsentratet og utfellingsproduktet oppsamlet ved sentrifugering. Utfellingsproduktet ble gjenoppløst i 10 ml diklormetan og ekstrahert med 10 ml vann som inneholdt 80 mg bariumjodid og 70 mg bariumkarbonat. Fasene ble separert, vannfasen filtrert og justert til pH 6,5. Løsningen ble frysetørket og ga et gult pulver. Det faste stoff ble vasket med aceton slik at overskudd av bariumjodid ble løst ut, og det blekgule, faste stoff ble gjenvunnet ved sentrifugering og tørket i vakuum. Utbyttet var 13 mg (I5Q = 0,0004/,ug/ml) .

Beskrivelse 4

Demonstrasjon av karbonadsorpsjon av kulturfiltrat, anvendelig ved oppnåelse av materiale som beskrevet i GB- PS 1. 361. 075

Kulturfiltrat oppnådd som i beskrivelse 3 ga en sonediameter på 17 mm i en hull-i-plate-agardiffusjons-antibakteriell analyse mot Klebsiella aerogenes; en sonediameter på 38 mm i KAG-analysen og I5Q-verdi ved en fortynning på 1 i 100.000. Det klarnede kulturfiltrat (170 1) av 5°C ble perkolert ved oppadgående strømning gjennom en kolonne med diameter 22,9 cm pakket til en høyde på 40,6 cm med aktiv kull ("Farnell BO"/ levert av Dearborn Chemicals Ltd., Dilton, Widnes, Lancs., 60-80 mesh forhåndsvasket med ln HCl og pufret med fosfat til pH 6) ved en strømningshastighet på 800-1000 ml/min. Brygget ble vasket fra kullet med avionisert vann (10 1) og kolonnen eluert med 20 % aceton ved 20°C. De aktive fraksjoner utgjorde 10 1 og ble konsentrert ved inndampning i vakuum, under 30°C til 6 1 og frysetørket slik at man fikk 282 g rått MM 4550 (kompleks) som hadde en I^Q-verdi på 0,05 yug/ml. Gjenvinningen av enzym-inhiberende aktivitet var 22 %.

Et alternativt aktivert trekull som gir lignende resultater er "Darcogranular carbon" (levert av Honeywill-Atlas Ltd., Mill Lane, Carshalton, Surrey).

Beskrivelse 5

Demonstrasjon av ionebytteharpiks- kromatografi av kulturfiltrat, anvendelig ved oppnåelse av materiale som beskrevet i GB- PS 1. 363. 075

En kolonne med innvendig diameter 1 cm ble pakket til

en høyde av 6 cm (sjiktvolum 4,7 ml) med "Dowex" 21K ionebytteharpiks (20-50 U.S. mesh, kloridform) ("Dowex" 21K ble levert av B.D.H. Chemicals Ltd., Poole, Dorset, Storbritaniia, og er en polystyren/divinylbenzenharpiks som inneholder basiske grupper). Harpikssjiktet ble så vasket med tilnærmet 4 x 4,7 ml av 5 % vandig metanol, fulgt av 1 x 4,7 ml destillert vann. To liter kulturfiltrat ble oppnådd ialt vesentlig som beskrevet i beskrivelse 3 og tilført til kolonnen. Harpiksen ble så vasket med 50 % vandig metanol for fjerning av forurensninger.

MM 4550 (kompleks) ble eluert fra harpiksen med 5 % NaCl

i 50 % vandig metanol. Tabell 1 nedenunder viser resultatene som ble oppnådd, angitt som aktivitetsenheter. MM 4550 (kompleks)-innholdet i kulturfiltratet ble vilkårlig satt til 8 enheter/ml. De eluerte fraksjoner fra kolonnen ble analysert under anvendelse av en antibakteriell diffusjonsmetode mot Klebsiella aerogenes,

og aktivitetsenhetene ble beregnet ved henvisning til en standard-linje fremstilt ved å avsette sonediameter mot enheter/ml for forskjellige fortynninger av kulturfiltrat (dvs. kulturfiltratet

ble anvendt som standard).

Det kan sees at kolonnen var en effektiv måte å konsen-trere MM 4550 (kompleks). Fraksjonene 2-5 inklusive inneholdt 60 % av aktiviteten i et totalt volum på bare 37 ml. Den totale tørre vekt av disse fraksjoner var ca. 210 mg, mens 35 g fast stoff var tilsatt til kolonnen.

Beskrivelse 6

Demonstrasjon av ionepar- ekstraksjon av kulturfiltrat, anvendelig ved oppnåelse av materiale som beskrevet i GB- PS 1. 363. 075

248 g natriumsulfat ble tilsatt til 10 1 klarnet kulturfiltrat som var fremstilt som beskrevet i beskrivelse 3, og løsningen ble ekstrahert med 2 % tetra-n-butyl-ammoniumhydrogen-sulfat i diklormetan (10 1) ved røring i 30 minutter. Fasene ble separert og diklormetanfasen avkjølt til 2°C. En liten mengde av suspendert vann ble fjernet ved filtrering gjennom "Whatman" nr. 1 PS papir.. Diklormetanløsningen ble konsentrert til 20 ml ved inndampning i vakuum under 30°C. Tilsetningen av

400 ml petroleter (40° - 60°) felte ut en gummi som inneholdt MM 4550 (kompleks).

Gummien ble oppsamlet ved sentrifugering, gjenoppløst i

50 ml diklormetan og ekstrahert med 50 ml vann som inneholdt 1 g bariumjodid og 1 g bariumkarbonat, ved rysting i 2 minutter.

Det tilstedeværende faste stoff ble filtrert fra og de to faser separert. Vannfasen som inneholdt MM 4550 (kompleks) som barium-saltet, ble justert til pH 6,5 og frysetørket slik at man fikk 317 mg av et rått preparat av MM 4550 (kompleks) med en I5q-

verdi på 0,001 ^ug/ml.

Beskrivelse 7

Fremstilling av delvis renset antibiotisk kompleks inneholdende

MM 4550 og MM 13902 under anvendelse av tetra- n- butylammoniumhydrogensulfat

Et rått preparat av MM 4550 (kompleks) fremstilt som

angitt i beskrivelse 4, ble gjenoppløst i vann (12,5 g i 125 ml)

og ekstrahert med 125 ml av 10 vekt/vol.% tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat i diklormetan. De to faser ble separert og diklormetanet tilbakeekstrahert med 100 ml vann av 2°C, som inneholdt 190 mg natriumjodid, ved langsom omrøring og justerig av vannfasen til pH 6,4 med 2 % NaHCO^. Løsningen ble fryse-

tørket og det tørre, faste stoff vasket med aceton slik at man fikk et utbytte på 88 mg av et preparat av blandede natriumsalter av MM 4550 og MM 13902 med en I5Q-verdi på 0,0002 ^ug mot Escherichia coli Ø-laktamase. Gjenvinningen av antibiotika

var 70 %.

Den antibakterielle aktivitet av blandinger av ampi-

cillin og materiale fremstilt som beskrevet i beskrivelse 7, ble målt ved seriefortynningsmetoden i næringsagar. De minste inhiberende konsentrasjoner som ble oppnådd, er gjengitt i tabell 2.

Beskrivelse 8

Fremstilling av delvis renset antibiotisk kompleks inneholdende MM 4550 og MM 13902 under anvendelse av cetyldimetylbenzylammoniumklorid

Frysetørket produkt (I50 = 0,02 ^ug/ml) fra en "Farnell"-kullkolonne eluert med aceton/vann som angitt i beskrivelse 4, ble oppløst i destillert vann ved en konsentrasjon på 13 mg/ml. Løsningen ble justert til pH 6,5.

100 ml av løsningen ble ekstrahert med samme volum av 0,1 % cetyldimetylbenzylammoniumklorid i diklormetan. Fasene ble separert ved sentrifugering og den organiske fase tilbakeekstrahert med 100 ml av en 0,05 % natriumjodidløsning. Fasene ble separert og eventuelt diklormetan i vannfasen fjernet ved å holde løsningen under redusert trykk i 10 minutter.

Vannløsningen ble frysetørket og produktet fra fryse-tørkningen vasket tre ganger med 50 ml-porsjoner av aceton. Det aceton-vaskede produkt ble tørket i en vakuum-eksikator slik at man fikk et lysebrunt pulver (4,3 mg; I5Q = 0,002 ^Aig/ml) .

Beskrivelse 9

Fremstilling av delvis renset antibiotisk kompleks inneholdende

MM 4550 og MM 13902 under anvendelse av gelfiltrering

1 g av rått MM 4550 ,(kompleks), I5Q = 0,2 yug/ml, frem-

stilt ved den fremgangsmåte som var angitt i beskrivelse 4, ble kromatografert på "Sephadex" G25 (fin kvalitet), under anvendelse av aceton/vann i volumforholdet 4:6 som elueringsmiddel. Kolonne-dimensjonene var 2,5 cm x 32 cm, og elueringen ble utført med 1,5 ml/min. De aktive fraksjoner ble kombinert, konsentrert i vakuum under 30°C og frysetørket slik at man fikk et utbytte på

22 mg amorft, bøffelfarvet fast stoff med en I^Q-verdi på

0,005 ^ug/ml. Gjenvinningen var 88 % og rensningen 40 ganger.

Beskrivelse 10

Fremstilling av renset antibiotisk kompleks inneholdende MM 4550

og MM 13902 under anvendelse av cellulose- kromatografi

MM 4550 (kompleks) (610 mg) fremstilt som angitt i beskrivelse 7, ble kromatografert på en 2,5 cm x 32 cm kolonne av cellulose ("Whatman" CC 31) og eluert med en blanding av isopropanol/vann i volumforholdet 7:3 ved 1,5 ml/min. De antibakterielt aktive fraksjoner ble kombinert, konsentrert i vakuum under 30°C og frysetørket slik at man fikk et utbytte på 40 mg av et brunt, amorft, fast preparat av antibiotisk kompleks I50 = 0,00007 ^ug/ml. Den meget lave verdi av Ij- O indikerer

at det aktive materiale har forbedret renhet.

Ved en annen anledning ga ovennevnte prosess et materiale

med en I,- o = 0,001 yug/ml. Dette materiale hadde den antibakterielle aktivitet som er vist i tabell 3, ved måling med en standard mikrotiter-metode i "Oxoid" sensibilitetsbuljong under anvendelse av lett podestoff (1 % av buljong som hadde stått natten over).

Beskrivelse 11

MM 4550

MM 4550 kan kjennes på sine egenskaper, som er som følger: MM 4550 er et surt, fast stoff som i form av et natriumsalt og har følgende karakteristika: I. Det er meget løselig i vann, løselig i metanol og ialt vesentlig uløselig i kloroform, dietyleter og hydrokarboner . II. I vandig løsning har det et karakteristisk ultra-fiolett-spektrum med absorpsjonsmaksima ved ca. 238 nm og ved ca. 287 nm. III. Når det er tilstede i 0,4 vekt% i en nylaget KBr-skive , har det et karakteristisk infrarødt-spektrum som har absorpsjonsmaksima blant annet ved ca. 3450, 2950, 1765, 1695, 1510, 1390 og 1260 cm<-1.> Hvis et ytterligere spektrum tas ca. en uke etter fremstillingen av KBr-skiven, viser spektrumet betydelige forandringer, for eksempel er den store topp som tidligere var ved ca.

1765 cm betydelig redusert i størrelse eller er fraværende.

IV. Det har et karakteristisk NMR-spektrum, målt i D20,

og dette spektrum har blant annet (a) et par lavfelts-dubletter sentrert tilnærmet ved 2,45T og 3,65T med koplingskonstanter på tilnærmet 15 Hz;

(b) en dublett sentrert ved tilnærmet 8.55X og (c) en skarp singlett ved tilnærmet 7,95t. V. Ved kjøring over cellulose i et tynnsjiktskromatografi-system har det følgende meget tilnærmede R^-verdier: (a) butanol/isopropanol/vann - 7:7:6 vol./vol.; R^ = 0,6 (b) isopropanol/vann - 7:3 vol./vol.; R^ = 0,7

(c) n-butanol/etanol/vann - 7:7:6 vol./vol.; R^ = 0,7

(d) n-propanol/vann - 4:1 vol./vol.; R^ = 0,6

VI. Det er i besittelse av antibakteriell aktivitet overfor forskjellige arter inklusive blant annet stammer av Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Acinetobacter anitratus, Serratia marcescens og Shigella sonnei. VII. Det er i besittelse av enzym-inhiberende aktivitet overfor /3-laktamasene som produseres ved forskjellige arter inklusive blant annet Escherichia coli, Klebsiella aerogenes og Staphylococcus aureus. Det har en I5Q-verdi (som definert ovenfor) på mindre enn 0,0001 yug/ml mot /3-laktamase fra Escherichia coli Bli. VIII. Ved blanding med ampicillin synergiserer det sin aktivitet mot organismer inklusive stammer av Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii og Staphylococcus aureus Russell.

IX. Aminosyre-analyse indikerer at materialet er ikke et polypeptid eller protein. Ingen a-aminoadipinsyre finnes etter syrehydrolyse.

X. Det reagerer med Ehrlich's reagens (300 mg av 4-dimetyl-aminobenzaldehyd oppløst i en blanding av 54 ml n-butanol,

9 ml etanol og 9 ml konsentrert saltsyre) og gir en

blå farve på papirkromatogram og tynnsjiktkromatografi-ark.

XI. Det er ikke en generell enzymgift og inhiberer ikke følgende enzymer ved konsentrasjoner i overskudd av dem som kreves for å inhibere /3-laktamasen av Escherichi coli;

monoamin-oksydase, karbonisk anhydrase, dopa dekarboksy-lase, trypsin, chymotrypsin eller urease.

Beskrivelse 12

Organismer

Egenskapen med hensyn til å produsere MM 4550 (kompleks) ble først oppdaget i kulturene ATCC 21379, ATCC 21380, ATCC 21381

og ATCC 21382 som var isolert fra jordprøver fra henholdsvis Spania, New Zealand, Syd Afrika og Israel. I laboratorier viste disse kulturer seg å være identiske, og alle ble identifisert som Streptomyces olivaceus, av Dr. Bousfield, actinomycetes-eksperten ved National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, Skottland, under anvendelse

av den i vide kretser aksepterte 1967-klassifikasjon av Htitter [Systematic der Streptomyceten, S. Karger, Basel, 382 pp]. MM 4550-produksjon er siden blitt funnet i andre streptomyces-arter, hvilket kan sees av tabell 4.

S. olivaceus ble først beskrevet av Waksman i 1919 [Cultural Studies of Species of Actinomyces, Soil. Sei., 8,71 - 215]. Deretter, i 1960, beskrev en gruppe russiske forskere en art med svært nærliggende karakteristika, men som de kalte Actinomyces (Streptomyces) fulvoviridis. [Kuchaeva m.fl., Trud. Inst. Mikrobiol., Akad Nauk. SSSR., 8, 226 - 253 (1960)].

Mikro-organismer av slekten Streptomyces er ekstremt variable i sine morfologiske og fysiologiske karakteristika, avhengig av de betingelser som de dyrkes under. Beskrivelser av mange arter var tidligere blitt publisert før eksistensen av denne ekstreme variabilitet var erkjent, med derav følgende duplisering og synonymi. Htltter (1967) oppgir 25 arter som synonyme med S. olivaceus inklusive S. fulvoviridis. For å

løse den forvirring i nomenclatur og klassifikasjon som hersket, ble det internasjonale Streptomyces-prosjekt (I.S.P.) påbegynt i 1962, Shirling m.fl., Int. J. Syst. Bacteriol, 18, 69 - 189

(1968). Forskere som har arbeidet med dette prosjekt, har ut-ført en rekke studier med sikte på å frembringe nøyaktige beskrivelser av arter av Streptomyces under standard betingelser. I dette skjema er standard beskrivelser frembrakt av type-stammer av ca. 400 navngitte arter inklusive Streptomyces olivaceus og Streptomyces fulvoviridis. I.S.P.-beskrivelsen av S. olivaceus og S. fulvoviridis avviker bare med hensyn til to karakterer: (I) formen av sporoforen og (II) evnen til å nyttiggjøre inositol som eneste karbon-kilde.

S. olivaceus er beskrevet som følger:

Sporekjedemorfologi:

Spirales med åpne spiraler som løper gjennom sikksakk-sporekjeder som antydes i avsnittet Rectiflexibiles. Modne sporekjeder som generelt er lange, ofte med mer enn 50 sporer pr. kjede.

Nyttiggjørelse av karbon: D-glukose, L-arabinose, D-xylose, i-inositol, D-mannitol, D-fruktose og rhamnose nyttiggjøres for vekst. Ingen vekst eller bare spor av vekst på sukrose og raffinose.

S. fulvoviridis er beskrevet som følger:

Sporekjedemorfologi:

Rectiflexibiles. Modne sporekjeder moderat korte med 10-50 sporer pr. kjede. Nyttiggjørelse av karbon: D-glukose, L-arabinose, D-xylose, D-mannitol, D-fruktose og rhamnose nyttig-gjøres for vekst; nyttiggjørelse av sukrose er tvilsom. Ingen vekst eller bare spor av vekst på i-inositol eller raffinose.

Karakterisering av et antall kulturer kalt, eller synonyme med, S. olivaceus eller S. fulvoviridis og andre beslektede arter ble bestemt under anvendelse av de standard metoder og media (Shirling m.fl., Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313 - 340,

(1966) som er anbefalt i I.S.P.

Kulturene stammet fra forskjellige kilder. ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 ble isolert fra jord på basis av produserende MM 4550 (kompleks). De andre stammer ble oppnådd fra forskjellige kultur-sammenligner for sammenligningsformål.

Resultater av testene for produksjon av MM 4550 (kompleks), farve i luft-mycel, sporofor-form, farve på substratmycelet, løselig pigmentproduksjon, melaninproduksjon og karbonkilde-nyttiggjørelse er gjengitt i tabellene 4-8. For alle stammer er sporeoverflaten, undersøkt ved hjelp av elektronmikroskopi, glatt.

Fra I.S.P.-beskrivelsen er det klart at spiralveksten

til sporoforen i S. olivaceus er av variabel karakter. Ekte spiraler ble observert med variabel flittighet i type-artene av S. olivaceus, dvs. ATCC 3335. Majoriteten av sporoforene var lang. Ingen ekte spiraler ble observert fra kulturene ATCC 21379, 21,380, 21381 eller 21382, selv om sporoforene var lange og viste tendens til å danne spiral blant en bakgrunn av Rectiflexibiles-typer. I to S. olivaceus-stammer, NCIB 8238 og NCIB 8509, var imidlertid majoriteten av sporoforer av Rectiflexibiles-typen.

I NCIB 8238 var de av middels lengde mens de av NCIB 8509 var lange.

Sporoforene som ble observert fra ATCC 15863, type-artene av S. fulvoviridis, var kortere enn dem som sees fra isolatene ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 og 31126 og var bare av Rectiflexibiles-typene. Med hensyn til denne karakter til-svarer derfor isolatene ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 og 31126 ganske godt, men ikke nøyaktig S. olivaceus-beskrivelsen.

Isolatene ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 og 31126

viser en viss variabilitet med hensyn til inositol-nyttiggjørelse som er den annen avvikende karakter i henhold til beskrivelsene av I.S.P.-typeartene mellom artene S. olivaceus og S. fulvoviridis (tabell 8). ATCC 31126 og ATCC 21380 nyttiggjør inositol, som er karakteristisk for S. olivaceus, mens de andre stammer viser tvilsom eller negativ nyttiggjørelse. Imidlertid er det ikke generelt ansett tilfredsstillende å separere fra en art på basis av evnen til å nyttiggjøre et enkelt karbohydrat. En slik for-skjell kan oppstå ved en enkelt gen-mutasjon og ansees ofte å

være bare av stammesignifikans. Forskjellen i sukkernyttiggjørelse hos S. olivaceus-stammene NCIB 8138, NCIB 8509, ATCC 21549, ATCC 12019 og ATCC 3335 antyder at mange autoriteter ikke betrakter dem som art-signifikante. Således er ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 og 31126 riktig betegnet som S. olivaceus.

Med mindre ytterligere studier avdekker mer betydelige forskjeller mellom de kulturer som for tiden kalles S. olivaceus og S. fulvoviridis, er det mulig at de til slutt vil bli aner-kjent internasjonalt som en enkelt art. I dette tilfelle vil det korrekte navn, i henhold til prioritetsreglen, være S. olivaceus, og dette vil også inkludere de kulturer som er

angitt av Hutter som synonyme med S. olivaceus.

Undersøkelse av kulturfiltrater av stammene av S.

olivaceus og beslektede arter for produksjon av MM 4550 (kompleks)

kan utføres som følger:

Kulturfiltrater av de angitte stammer ble avsatt som

flekker på "Whatman" nr. 1 papirstrimler med 20 ^ul pr. opprinnelse og kromatografert koldt i n-butanol/isopropanol/vann (7:7:6)

natten over. Et annet sett med strimler ble kjørt i n-butanol/ iseddik/vann (12:3:5), også koldt natten over. En delvis renset prøve av MM 4550 (kompleks) ble også kjørt i de to systemer på

samme tid som kontrollprøve.

Alternativt er det mulig å ekstrahere 25 ml av klarnet

brygg med 12,5 ml av 0,2 % cetylbenzylammoniumklorid i diklormetan, separere fasene, tilbakeholder den organiske fase, tilsette 2,5

ml av 0,5 % natriumjodidløsning, ryste, separere fasene, tilbake-holde den vandige fase og anvende denne kromatografisk, for eksempel ved å avsette en flekk på 5 ^u på tynnsjiktkromatografi-strimler og kjøre det i n-butanol/isopropanol/vann, 7:7:6.

Streptomyces olivaceus og beslektede organismer har

følgende grunnleggende karakteristika:

(a) De er i besittelse av sporedannende luft-mycel i

enten den grå eller gule serie.

(b) De er i besittelse av en sporofon-morofologi av

enten rextiflexibiles- eller spirales-type.

(c) De har sporer med glatt overflate.

(d) De produserer ikke melanin.

Arter som har de ovennevnte karakteristika, inkluderer

dem som det er referert til i tabellene 5 til 9.

Eksempel 1

Fremstilling av MM 4550 ( kompleks) og separering i MM 4550 og MM 13902

Isoleringsmetodene som er beskrevet i ovenstående be-skrivelsesavsnitt, kan anvendes i en rekke sekvenser. En spesielt egnet sekvens er karbonadsorpsjon, ionepar-ekstraksjon og cellulosekromatografi som beskrevet nedenunder: 340 1 kulturfiltrat (oppnådd som angitt i beskrivelse 3) ble perkolert ved oppadgående strømning ved 800-1200 ml/min. gjennom en kolonne (diameter 22,9 cm, høyde 53,3 cm) pakket med "Farnell" BO kull. Kullet var brukt tidligere for adsorpsjon av MM 4550 (kompleks) og ble regenerert ved vasking med følgende reagenser : 0,5n NaOH; 0,2n NaOH/aceton (3:2); vann; ln HCl;

vann; fosfat-puffer pH 6; vann.

Kolonnen ble vasket med 20 1 vann for erstatning av kulturfiltratet og eluert ved nedadgående strømning med aceton/ vann i volumforholdet 2:8 ved 200-250 ml/min. En liters fraksjoner ble oppsamlet. Fraksjoner inneholdende MM 4550 (kompleks) , som bestemt ved en antibakteriell diffusjonsanalyse under anvendelse av Klebsiella aerogenes ble kombinert (11 liter) og konsentrert ved inndampning i vakuum under 30°C til 5,5 1. Gjenvinning av MM 4550 (kompleks) i dette trinn var 20 %.

Konsentratet ble avkjølt til 2°C, 5,5 1 av 2 vekt/vol.% tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat i diklormetan ved -5°C ble tilsatt og de to faser blandet sammen i 2 minutter. Diklormetanfasen ble separert og tilsatt til en liter natriumjodidløsning (0,6 %) ved 0°C. De to faser ble forsiktig omrørt og vannfasen gradvis justert til pH 6,5-7,0 med 2 % vandig løsning av NaHC03. Vannfasen ble separert og frysetørket. Det tørkede faste stoff ble ekstrahert med tørr aceton for oppløsning av overskytende natriumjodid, og acetonen ble fjernet fra det uløselige residuum i vakuum, slik at man fikk et utbytte på 1,1 g av et bøffelfarvet pulver. Den totale gjenvinning av MM 4550 (kompleks) i dette trinn var 10 %. Rensningen, beregnet på totalt oppløst fast stoff i kulturfiltratet var 125 ganger.

En kolonne med diameter 2,5 cm ble pakket med cellulose-pulver ("Whatman" CC 31) i isopropanol/vann, 7:3 vol./vol. til en høyde på 32 cm. 500 mg av det bøffelfarvede pulver ble opp-løst i 2 ml isopropanol/vann 7:3 vol./vol. og kromatografert under anvendelse av det samme løsningsmiddel ved en strømnings-hastighet på 1,5 ml/min. 3 ml-fraksjoner ble oppsamlet fra kolonnen, og disse - som viste UV-absorpsjonsmaksima ved ca.

285 nm, ble kombinert, konsentrert og frysetørket slik at man fikk MM 4550 (kompleks). Tidligere eksperimenter har fastslått at fraksjoner som absorberer ved ca. 285 nm, inneholdt enzym-inhiberende, antibakterielt aktivt materiale.

Utbyttet av frysetørket MM 4550 (kompleks) var 35 mg. Det hadde et brunt, amorft utseende og en på 0,0001 ^ug/ml. Gjenvinningen av aktivt materiale i dette trinn var totalt 3 %

og rensningen totalt 600 ganger.

Den antibakterielle aktivitet for dette preparat ble fastslått ved standard mikrotiter-metode i "Oxoid" sensibilitets-testbuljong under anvendelse av lett podestoff. De resulterende minste inhiberende konsentrasjoner var lik dem som er vist i tabell 3 ovenfor.

Analyse av preparatet ved hjelp av tynnsjiktkromatografi på cellulose (Eastman Kodak "Chromagram"-ark) utviklet med n-butanol; isopropanol:vann (7:7:6) separerte to aktive substanser, én med en tilnærmet R^-verdi på 0,58 som ble betegnet MM 4550,

og en med en tilnærmet R^-verdi på 0,72 som ble betegnet MM 13902. Begge disse materialer kan påvises ved hjelp av bioautografi på et utvalg organismer inklusive B. subtilis, Staphylococcus aureus (Oxford), Staphylococcus aureus (penicillin-resistent), Escherichia coli (penicillin-sensitiv og -resistent), Salmonella typhimurium, Proteus mirabilis, Proteus morganii og Klebsiella aerogenes. Noen av de oppnådde resultater er oppsummert i tabell 4.

I et ytterligere eksperiment ble de to substanser separert på et cellulose tynnsjikt utviklet med isopropanol/vann (8:2) og ekstrahert fra cellulosen med fosfatpuffer. Hver ekstrakt ble analysert med hensyn på j3-laktamase-inhibering, og begge substanser viste seg å være inhibitorer for Escherichia coli j3-laktamase. Begge substanser viste seg også å være synergistiske med benzylpenicillin mot Klebsiella aerogenes.

Eksempel 2

Fremstilling av MM 4550 ( kompleks) og separering i MM 4550 og MM 13902

1100 1 kulturfiltrat fra fermenteringen av Streptomyces olivaceus ATCC 31126 ved pH 6,5 og 5°C ble perkolert ved 3,2 l/min. gjennom en kolonne (0,3 m x 1 m) pakket med "Darco" granu-lært kull. [Kullet var allerede anvendt for adsorpsjon av MM 4550 (kompleks) og ble regenerert før bruk ved vasking med følgende reagenser: 0,5n NaOH; 0,2n NaOH/aceton (3:2); vann; ln HC1;

vann; fosfat-puffer, pH 6; vann].

Kolonnen ble vasket med 60 1 vann for erstatning av kulturfiltratet og eluert med aceton/vann (2:8 vol./vol.) ved 30°C og 1,1 l/min. 60 1 ble oppsamlet, fulgt av 5 x 10 1 fraksjoner. De fraksjoner som inneholdt MM 4550 (kompleks), bestemt ved den antibakterielle diffusjonsanalyse under anvendelse av Klebsiella aerogenes, ble oppsamlet (40 1) og konsentrert i vakuum under 30°C til 32 1. Gjenvinningen av MM 4550 (kompleks) i dette trinn var 15 %.

Konsentratet ble avkjølt til 5°C, 16 1 av 0,2 % cetyldimetylbenzylammoniumklorid i diklormetan ved 5°C ble tilsatt og de to faser blandet i 5 minutter. Diklormetanfasen ble separert og tilsatt til 3,75 1 natriumjodidløsning (0,4 %) ved 5°C. De to faser ble blandet i 5 minutter, vannfasen separert og frysetørket. Det tørre faste stoff ble ekstrahert med tørr aceton for oppløsning av overskytende natriumjodid, og det resterende faste stoff ble tørket i vakuum slik at man fikk et utbytte på 2,87 g av et bøffelfarvet pulver. Den totale gjenvinning av MM 4550 (kompleks) i dette trinn var 6 %. Rensningen, beregnet på totalt oppløst fast stoff i kulturfiltratet, var 160 ganger.

En kolonne med diameter 63 mm ble pakket med cellulose-pulver ("Whatman" CC 31) i isopropanol/vann (7:3 vol./vol.) til

en høyde av 300 mm. 2,0 g av det bøffelfarvede pulver ble opp-

løst i 5 ml isopropanol/vann (7:3 vol./vol.) og kromatografert i det samme løsningsmiddel ved 3 ml/min. Fraksjoner inneholdende

MM 4550 (kompleks), fastslått ved analyse mot Klebsiella aerogenes, ble oppsamlet, konsentrert ved inndampning i vakuum under 30°C

og frysetørket slik at man fikk et utbytte på 207 mg av et brunt,

fast stoff. Gjenvinningen av MM 4550 (kompleks) i dette trinn

var 51 % og rensningen 5 ganger.

En kolonne med diameter 16 mm ble pakket med cellulose-pulver ("Whatman" CC 31) i n-propanol/vann (4:1 vol./vol.) til en høyde av 300 mm. 198 mg av det brune faste stoff ble oppløst i vann/n-propanol (1:1) og kromatografert i n-propanol/vann (4:1 vol./vol.) ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min. 6 ml-fraksjoner ble oppsamlet, bioanalysert mot Klebsiella aerogenes og UV-spektret for hver fraksjon målt. Fraksjoner 23-28, med et UV-maksimum på ca. 305 nm, inneholdt di-natriumsaltet av MM 13902. Disse fraksjoner ble samlet, konsentrert under vakuum og fryse-

tørket slik at man fikk 30 mg fast stoff. Dette preparat viste

bare én sone med antibiotisk aktivitet ved R_ = 0,77 på tynnsjiktkromatografi under anvendelse av Eastman Kodak celluloseplater med n-propanol/vann (4:1 vol./vol.) Sonen ble påvist ved bioautografi på Bacillus subtilis. (Fraksjoner 29-40, med UV-absorpsjons-

maksimum ved ca. 285 nm, inneholdt MM 4550. De ble kombinert, konsentrert under vakuum og frysetørket slik at man fikk 53 mg fast stoff som inneholdt et salt av MM 4550 kontaminert med en liten mengde av et salt av MM 13902).

Eksempel 3

En foretrukken isolasjonsprosess for fremstilling av MM 13902

Et forråd av sporer av S. olivaceus ATCC 31126 ble holdt under lagring i rør av tørr jord i en lukket beholder med et tørrermiddel ved en temperatur på 20°C. En liten mengde av jord-forråd (tilnærmet 20 mg) ble overført aseptisk til en 500 ml erlenmeyerkolbe som inneholdt 100 ml av følgende medium:

pH-verdien ble justert til 6,5 før sterilisering. Soya-bønnemelet var "Arkasoy 50" fra British Arkady Co. Ltd., Old

• Strafford, Manchester, England.

Kolben ble inkubert på en roterende rystemaskin (240 opm) i ca. 30 timer ved 28°C. 2 ml av den resulterende vegetative vekst ble så anvendt for podning av en fast agar-skråkultur i en Roux-kolbe. Agarmediet hadde følgende sammensetning:

pH-verdien ble justert til 6,0 før sterilisering. (V-8 juice fåes fra Campbell's Soups Ltd., Kings Lynn, Norfolk, England).

Inokuleringen ble brett ut på agaroverflaten ved å rugge på kolben som så ble inkubert oppreist ved 30°C. Etter to dagers inkubering ble overflødig væske i kolben fjernet med pipette og inkuberingen fortsatt i ytterligere 4 dager.

Det var tidligere funnet at utviklingen av aktinofage

i skråkulturen undertrykkes hvis denne fremgangsmåte for Roux-kolbekulturen benyttes.

50 ml sterilisert avionisert vann inneholdende 0,02 % "Tween 80" ble tilsatt til en Roux-kolbekultur og sporene suspendert ved rysting. Denne sporesuspensjon ble så tilsatt som podestoff til 75 liter sterilisert kimtrinnmedium i en 100 liters fermentator av rustfritt stål. Sammensetningen av kimtrinnmediet var som følger:

For å regulere skummingen ble 50 ml 10 volum% "Pluronic L81" i soyabønneolje tilsatt til fermenteringsmediet før sterilisering .

Mediet ble dampsterilisert i fermentatoren i 20 minutter ved 120°C. Kimtrinnkulturen ble omrørt ved 140 opm med en skive-agitator utstyrt med vinger, diameter 19,1 cm, og forsynt med 75 l/min. steril luft gjennom en sprinkler med åpne ender.

Temperaturen ble regulert ved 28°C, og etter inkubering under disse betingelser i 48 timer ble innholdet i karet tilsatt som podestoff til 1500 liter sterilt fermenteringsmedium i en 2000 liter fermentator av rustfritt stål, fullstendig utstyrt med ledeplater. Fermenteringsmediet hadde følgende sammensetning:

pH-verdien ble justert til 6,0 med natriumhydroksyd før sterilisering. 3 liter av 10 % "Pluronic" L81 i soyabønneolje ble tilsatt før steriliseringen for å forhindre skumming. Etter steriliseringen ble pH-verdien igjen justert, til 7,0, med steril natriumhydroksydløsning. Fermenteringen ble omrørt ved 106 opm, idet rørerens aksel var utstyrt med to skive-skovlhjul utstyrt med vinger, diameter 48,3 cm. Temperaturen ble regulert ved 30°C og luftstrømmen til 1200 liter/min. Fermenteringen ble inn-høstet etter 60 timer og klarnet ved sentrifugering.

Materialet produsert som nevnt ovenfor, ble vilkårlig fastsatt til en aktivitet på 340 enheter/ml. Det ble gjort ana-lyser som beskrevet i beskrivelse 2.

Kulturfiltrat (1050 1; 340 enheter/ml) ved 10°C og pH 8 ble ekstrahert med 310 1 diklormetan ved 10°C, inneholdende cetyldimetylbenzylammoniumklorid (1200 g) ved pumping av de to væsker med forutbestemte strømningshastigheter gjennom en in-line-mikser. Fasene ble separert i en kontinuerlig "Sharples"-sentrifuge etter å være blitt blandet i ca. 2 minutter. Diklormetanfasen (300 1) ble tilbakeekstrahert med vandig natriumjodid. Tilbakeekstrak-sjonen ble utført i fire satser under anvendelse av en total vannmengde på 7 1, inneholdende 210 g natriumjodid. Fasene ble separert ved hjelp av tyngdekraften. Vannfasen ble justert fra pH 7,7 til pH 7,0 med saltsyre og filtrert. Natriumjodidekstrakten (7 1) inneholdt 21.900 enheter/ml.

En ionebyttekolonne ble fremstilt ved pakking av QAE "Sephadex" A25 (fra Pharmacia Ltd.) i pH 7 fosfatpuffer (0,05m) inneholdende natriumklorid (0,3m) i en glasskolonne med diameter 10 cm, til en høyde av 40 cm. Natriumjodidekstrakten (7 1) ved 5°C ble perkolert gjennom QAE "Sephadex" med 50 ml/min. Kolonnen ble eluert med 0,7m NaCl i 0,05m fosfatpuffer, pH 7 også ved 5°C med en strømningshastighet på 25 ml/min. 2 1 eluat ble slått ut, og 90 fraksjoner (100 ml) ble oppsamlet. Fraksjonene ble kjørt i et UV-spektrofotometer, og de fraksjoner som viste et absorpsjonsmaksimum ved ca. 305 nm ble oppsamlet og justert til pH 7 (fraksjoner 50 - 62, oppsamlet volum 1440 ml) 71.000 enheter/ ml. Det var tidligere vist at fraksjoner med et maksimum i dette område, inneholdt MM 13902.

Natriumklorid (5 g/100 ml) ble tilsatt til de oppsamlede fraksjoner 'som deretter ble perkolert ved 5°C gjennom en kolonne med diameter 6,3 cm, pakket med "Amberlite" XAD 4-harpiks (levert av Rohm & Haas Ltd.) til en høyde av 30 cm, ved en strømnings-hastighet på 20 ml/min. MM 13902 ble adsorbert på harpiksen under disse betingelser, mens de uorganiske forurensninger ikke ble det. Antibiotikaene ble eluert ved romtemperatur med 200 ml destillert vann, fulgt av 50 % vandig metanol. Eluatet (1 liter) ble inndampet under 30°C under redusert trykk til 70 ml, justert til pH 7 og frysetørket til et brunt, fast stoff (1,62 g) som var et delvis renset salt av MM 13902 med en aktivitet på

37.000 enheter/mg.

Delvis renset MM 13902-dinatriumsalt (1,0 g, 37.000 enheter/mg) ble kromatografert på en cellulosekolonne (3,8 cm x 30 cm; "Whatman CC31" cellulose), eluert med n-propanol/vann (4:1 vol./vol.) med en strømningshastighet på 2,5 ml/min. 170 ml eluat ble slått vekk og 100 x 15 ml fraksjoner oppsamlet. De fraksjoner som inneholdt MM 13902-dinatriumsalt (nr. 37 - 43), bestemt ved UV-absorpsjon, ble samlet (89 ml), inndampet under 30°C under redusert trykk for fjerning av n-propanol og fryse-tørket slik at man fikk 219 mg av et gulaktig pulver med en aktivitet på 73.000 enheter/mg.

Det ovenfor beskrevne materiale viste et UV-absorpsjonsmaksimum på ca. 308 nm med en E 1 , °/° på ca. 343. Dette materiale hadde de IR- og NMR-spektra som er vist i henholdsvis figur 2 og 3. Den antibakterielle aktivitet for materialet er vist i tabell 10. Elementær-analyse av dette materiale indikerte at det inneholdt blant annet nitrogen, svovel og natrium sannsynligvis i forholdet N:S:Na = 2:2:2. De positive og negative maksima av de sirkulære dikromi-kurver for dinatrium-MM 13902 ble bestemt på et "Cary-61" registrerende spektropolarimeter ved konsentrasjoner på 0,37 mg/ml med en veilengde på 1 cm. Resultatene var som følger:

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av 3-laktamase-inhiberende antibiotikum MM 13902 med formel: samt alkalimetallsalter derav, karakterisert ved å dyrke en mikroorganisme av slekten Streptomyces, utvinne komplekset MM 4550 fra dyrkningsmediet og isolere forbindelsen MM 13902 eller et salt derav fra komplekset ved kjente kromatograferingsmetoder.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Streptomyces olivaceus ATCC 31126.