CS199264B2 - Způsob výroby streptomycinového antibiotika MM 13.902 - Google Patents

Description

Předložený vynález se týká způsobu výroby streptomycinového antibiotika, označeného MM 13.902, strukturního vzorce

HO_sSO

^C-NH-CO-Cfy COOf-f fr chemickým označením 3-[ (E)-2-acetarnidoethenylthio] -6- (1-sulfatoethyl) -7-oxo-l-azabicyklo[ 3.2.0] hept-2-en-2-karboxylová kyselina, popřípadě ve formě soli, izolovaného z některých kmenů Streptomyces, zvláště Streptomyces olivaceus po jejich kultivování. Bylo nalezeno, že toto mohutně působící antibiotikum, označené MM 13.902, působí synergický s peniciliny a cefalosporiny.

V britském patentovém spise 1 363 075 se popisuje, že fermentováním některých kmenů Streptomyces olivaceus je možno izolovat použitelný inhibitor /3-laktamasy. Až do zjištění podle tohoto vynálezu se mělo za to, že materiál, o kterém se jedná v britském patentovém spise 1 363 075, je v podstatě čistý. Zjistili jsme však, že tomu tak není, a že lze izolovat z tohoto materiálu složku, která je v něm obsažena v menším množství a vyznačuje se mohutnou antl· bakteriální účinností. Tento nový podíl je označen MM 13.902, a má se nyní za to, že je odpovědný za účast antibakteriální účinnosti, uvedené v britském patentovém spise 1 363 075, ačkoli je na druhé straně tato látka v souvislosti pouze s velmi malým podílem (3-laktamasové inhibiční aktivity, kterou se vyznačuje tento materiál, je jasné, že se v této přihlášce nemluví o ničem, co by bylo v rozporu s předmětem vynálezu britského patentového spisu 1 363 075. je známo, že další inhibitory β-laktamasy vznikají působením kmenů Streptomyces, například jak je tomu v případě kmenů uvedených v německé patentové přihlášce 2 340 005; ale u těchto materiálů, jinak známých, nebylo zjištěno, že by se vyznačovaly mohutnou antibakteriální účinností, jako je tomu v případě antibiotika MM 13.902.

Antibiotikum MM 13.902 je karboxylová kyselina, charakteru pevné látky, která se vyznačuje ve formě v podstatě čisté sodné soli těmito uvedenými vlastnostmi:

je velmi rozpustná ve vodě, rozpustná v methanolu, v podstatě nerozpustná v chloroformu, diethyletheru a v uhlovodících, ve vodném roztoku se vyznačuje charakteristickým ultrafialovým spektrem s absorpčním maximem za délky asi 305 nm (obr. 1), za koncentrace hmotnostně 0,4% v čerstvě připraveném kotoučku bromidu draselného se vyznačuje charakteristickým infračerveným spektrem s absorpčními maximy v oblastí vlnových délek — kromě jiných — asi 3450, 2950, 1750, 1620, 1510, 1400 a 1260 cm¹ (obr. 2), vyznačuje se charakteristickým NMR— —spektrem v D2O, přičemž toto spektrum se vyznačuje kromě jiného, viz obr. 3, párem dubletu v nízkém pólu, jež je centrováno asi při 2,85 S a 4,00 i a kopulačními konstantami přibližně 14 Hz;

dubletem, centrovaným přibližně při 8,55 S a ostrým singletem asi při 8,00 δ, dále se vyznačuje antibakteriální účinností proti různým druhům, počítaje v to — kromě jiných — kmeny Staphylococcuc aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Próteus mirabilis, Salmonella typhi a Pseudomonas aeruginosa, po smísení s ampicilinem se zde jeví synergická účinnost proti některým organismům, počítaje v to Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Próteus mirabilis, Próteus morganii a Staphylococcus aureus Russell.

Čistá disodná sůl MM 13 902 je inhibitOH rem δ laktamasy, a vyznačuje se hodnotou I50 (jak je zde dříve popsána] mezi 0,001 (Ug/ml a 0,0001 ^g/ml proti ó-laktamase Escherichia coli B—11.

Při testování na celulóze za použití chromatografie na tenkých vrstvách a za použití disodné soli MM 13.902 byly zjištěny tyto další přibližné hodnoty R_f:

n-butylalkohol/isopropylalkohol/voda 7:7:6 (objemově), R_f = 0,72, isopropylalkohol/voda 7 : 3 (objemově), R_£ = 0,85, n-butylalkohol/ethylalkohol/voda 7:7:

: 6, R_f = 0,81, n-propylalkohol/voda 4 : 1, R_f = 0,75.

Z jiného hlediska se dá MM 13.902 charakterizovat jako antibakteriálně účinná látka, obsahující síru, přičemž soli této látky vznikají během kultivování Streptomyces olivaceus ATTC 31126, a roztoky ve formě vodných roztoků disodných solí se vyznačují maximem absorpce v ultrafialové oblasti asi 305 nm a a si 225 nm, jak je to v podstatě patrné z obr. 1, uvedeného zde dále.

Jinak lze MM 13.902 charakterizovat jako antibakteriálně účinnou látku, která ve formě v podstatě čisté disodné soli má infračervené spektrum, jak je zachyceno na obr. 2 za póiužití čerstvě připraveného lisovaného kotoučku z bromidu draselného s hmotnostním obsahem 0,4% účinné složky, přičemž NMR—-spektrum této disodné soli je na obr. 3 za použití čerstvě připraveného roztoku v těžké vodě (D2O).

Materiál MM 13.902 není příliš stálý v kyselé formě, a proto je výhodnou formou provedení postupu podle tohoto vynálezu příprava solí MM 13.902. Jako vhodné soli antibiotika MM 13.902 lze označit soli se 2 ekvivalenty báze, a za nejvýhodnější soli lze označit ty, které vznikají s farmakologicky vhodnými ionty, jako jsou ionty sodíku, draslíku, vápníku, hořčíku, hliníku, běžně substituované amoniové ionty a podobně. Obzvláště vhodnými solemi jsou soli alkalických kovů, jako jsou soli sodné a draselné, například disodná nebo didraselná sůl.

Postupem podle tohoto vynálezu se připravuje antibiotikum MM 13.902 a jeho soli o čistotě nejméně 50%, vhodněji o čistotě nejméně 70% a s výhodou ό čistotě nad 80%, například 90 až 100%.

Přípravky s obsahem účinné látky podle tohoto vynálezu obsahují nejVihodněji: sodnou nebo draselnou sůl antibiotika MM

13.902, například disodnou nebo didraselnou sůl antibiotika MM 13.902.

Takové přípravky je možno vyrobit ve formě vhodné pro orální, topické nebo parenterální použití, a jde například o tablety, kapsle, krémy, sirupy, prášky, které lze použít k další úpravě, i sterilní formy, vhodné pro injekce nebo infuse. Tyto přípravky mohou obsahovat běžné farmaceuticky vhodné pomocné látky, jako jsou ředidla, pojivá, barviva, příchutě, konservační činidla, látky, urychlující rozpad tablety a podobně, vždy ve shodě s běžnou farmaceutickou praxí a za použití postupů, které jsou odborníkům na úseku výroby přípravků s antibiotiky dobře známé, jako je tomu například v případě penicilinů nebo cefalosporinů.

Antibiotikum MM 13.902 může být v přípravku podle tohoto vynálezu jako jediná terapeuticky účinná složka, nebo může být tamže spolu s jiným já-laktamasovým antibiotikem. Mezi vhodná β-laktamasová antibiotika patří ta, která jsou citlivá na (3-laktamásy a vyznačují se rovněž určitou vnitřní odolností proti β- laktamásám. Mezi taková anibiotika patří ampicilin, amoxycilin, benzylpenicilin, fenoxymethylpenicilin, propicilin; cefaloridin, cefoxidin, cefalo>thin, cefalexin, karbenicilin, tikarcilin a estery, hydrolyzovatelné in vivo z takových sloučenin, jako jsou fenylester-y, tolylestery·nebo indanylestery karbenicilinu nebo tikars cilinu, nebo acetoxymethylestery, pivaloyioxymethylestery nebo ftalidylestery^; ampicilinu, benzylpenioilinu, amoxyeilinu, cefaloridinu, cefaloglycinu a podobně.

Poměr antibiotika MM 13,902 nebo· jeho soli k (3-laktamovému antibiotiku činí 0b·¹ vykle mezi 10 : 1 až 1 : 10, například mezl 3 : 1 až 1 : 3.

Celkové množství antibakteriálně- účin? ných činidel v kterékoli dávkovači formě se pořhybuje obvykle mezi 50 až 1500^; mg, a obvykle činí 100 až 1000 mg.

Výhodné přípravky v jednotkových' dávkách podle tohoto vynálezu se mohou podávat jednou nebo vícekrát za den, například dvakrát až čtyřikrát za den při léčbě onemocnění močových cest, dýchacího traktu, měkkých tkání a podobně. Mohou se tedy tyto komposice použít při léčbě takových onemocnění, jako je bronchitida, kapavka, otitua media, mastitis a podobně.

Způsob výroby antibiotika MM 13.902 nebo jeho solí se vyznačuje tím, že se chromatoraficky dělí roztok komplexu MM 4550, jak je to zde ještě dále popisováno, na frakce, obsahující v podstatě roztok antibiotika MM 13.902 nebo odpovídající soli, a další frakce, načež se z odpovídajícího roztoku izoluje antibiotikum MM 13.902 nebo jeho odpovídající sůl.

Označením frakce, obsahující v podstatě roztok antibiotika MM 13.902 nebo odpovídající soli, se míní to, že buď je jediným antibioticky účinným materiálem v uvedeném roztoku antibiotikum MM 13.902 nebo odpovídající sůl, nebo, že je v roztoku přítomný a i jiný antibioticky účinný materiál, ale v menším množství ve srovnání s antibiotikem MM 13.902 nebo jeho solí. Je vhodné, představuje-li antibiotikum MM 13.902 nebo jeho sůl 70% vhodněji 80% a nejvhodněji 90 až 100% antibioticky účinného materiálu, který je obsažen v uvedené frakci. Bylo zjištěno, že nejvhodnějším způsobem stanovení frakcí, ve kterých je v podstatě obsaženo antibiotikum MM 13.902 nebo jeho sůl, je sledování ultrafialového spektra každého vzorku. Ty frakce, které se vyznačují ultrafialovým spektrem podobně, jako je tomu na obr. 1, obsahují obvykle antibiotikum MM 13.902 nebo jeho sůl, a jsou v podstatě prosté dalších antibioticky účinných látek, jako je antibiotikum MM 4550, jak je to zde dále ještě popsáno. Obecně řečeno vyznačují se frakce se- zřetelnou ultrafialovou absorpcí při asi 305 nm žádoucí čistotou.

Obvykle se uvedený postup používá k izolování antibiotika MM 13.902 ve formě dvojsodné soli. Je-li nutná sůl s jedním ekvivalentní báze antibiotika MM 13.902 nebo volná kyselá forma antibiotika MM 13.902, pak- se může připravit okyselením dvojbazické soli antibiotika MM 13.902, protože obecně monobazické soli antibiotika MM

13.902, jakož i volná kyselá forma téhož antibiotika nejsou dostatečně stálé, aby bylo možno takové látky izolovat z reakční směsi, jako je tomu v případě dále popisovaného komplexu MM 4550. Nelze tedy snadno získat monobazické soli uvedeného antibiotika, případně volnou kyselou formu právě se zřetelem na špatnou stabilitu těchto látek.

Jak to zde již bylo uvedeno, máme za to, že chromatografické izolování antibiotika MM 13.902 se nejlépe provádí za použití solí antibiotika MM 13.902 jako je dvojsodná sůl. Soli antibiotika MM 13.902 jsou rozpustnější ve vodných rozpouštědlech, než ve vysoce lipofilních rozpouštědlech, a v důsledku toho je výhodné použití vodných systémů rozpouštědel při chromatograf íčkem čištění, použitém podle tohoto vynálezu.

Ukázalo se, že vhodné jsou roztoky elektrolytů, pufrované přibližně do neutrality, a to společně s polárními podkladovými materiály, jako jsou bazické lontoměničové pryskyřice. Takže se může·použít vodný roztok chloridu sodného, pufrovaný na hodnotu asi pH 7 běžným pufrem, jako je fosfátový pufr, spolu s nosným materiálem, který může obsahovat terciární aminoskupiny nebo kvartérní amoniové skupiny. Bylo nalezeno, že vhodnými nosnými materiály jsou hazické iontoměničové deriváty celulózy, a dále bazické iontoměničové zesítěné dextrany, a jako zvláště výhodný nosný materiál lze označit QAE Sefadex A25, zvláště při použití rozpouštědlového systému, jímž: je 0,7 M roztok chloridu sodného ve fosfátovém pufru o pH 7.

Dále se hodí k použití spolu s inertním nosným materiálem, jako ie silikagel nebo celulóza, systém, obsahující směs vody a organického rozpouštědla/ mísitelného s vodou, jako je nižší alkanol, a jako zvláště výhodný systém při použití celulózy se jeví směs vody a isopropylalkoholu, zvláště v poměru 3 : 7 (isopropylaikohol : voda).

Avšak produkt, jak se získá za použití výše uvedených postupů s iontoměničovými pryskyřicemi,· obsahuje často velmi vysoký podíl chloridu sodného, takže se doporučuje shromážděné roztoky odsolit, což lze provést prolitím kolonou, obsahující lipofilní materiál, na kterém se antibiotikum MM 13.902 adsorbuje, nikoli však chlorid sodný. Mezi vhodné materiály do takových kolon patří polystyreny, jako je Amber lit XAD 4, jinak se může použít gelové filtrace s využitím filtračních činidel, jako jsou zesítěné dextrany typu sefadex G 25 a polyak* rylamidové gely, jako je Biogel P2. Antibiotikum lze potom eluovat z kolony za použití vody, vodného methylalkoholům podobně.

Po izolaci očekávaných-roztoků za použití výše uvedeného postupu lze získat dvojbazickou sůl antibiotika MM 13.902 v pevné formě odstraněním rozpouštědla za mírných podmínek. Bylo zjištěno, že vhodným způsobem získání takových pevných podílů je oddestilování rozpouštědla za sníženého tlaku s následujícím lyofilizováním souhrnu frakcí, obsahujících antibiotikum MM

13.902.

Je-li to žádoucí, může se výše uvedený postup provádět ve dvou nebo více stupních·. Na příklad roztok komplexu MM 4550 se může dělit na frakce, obsahující antibiotikum MM 13.902 nebo jeho soli, znečištěné dalšími antibakteriálními činidly až do obsahu, odpovídající váze MM 13.902, načež se z frakcí lyofiliso váním získá materiál, obsahující na příklad asi 50 až 60 % z antibiotika MM 13.902 nebo jeho soli, a dalším chromatograf ováním· tohoto materiálu se získá podíl, obsahující na ipříklad 90 až 100 proč. antibiotika MM 13.902 nebo odpovídající soli.

Pro účely tohoto vynálezu se výraz „kom199264 plex antibiotika MM 4550“ používá k popisu materiálu, který byl původně označen MM 4550 v britském patentovém spise 1 363 075. Při opakování příkladů z britského patentového spisu 1 363 075 se zjistilo, že komplex MM 4550 je nečistý produkt, obsahující v různých poměrech soli antibiotika MM 4550, jak to zde ještě dále bude popsáno, a soli antibiotika MM 13.902, jakož i podstatná množství dalších látek. Komplex MM 4550 se nevyznačuje charakteristickým ultrafialovým spektrem antibiotika MM 13.902. Hodnota Iso, jak je zde ještě dále popsána, komplexu antibiotika MM 4550 při opakování postupu z britského patentového spisu 1 363 075 je obvykle nižší než 0,0004 jug/ml. Poměr solí antibiotika MM 4550 a solí antibiotika MM 13.902, přítomných v komplexu MM 4550, je — jak se domníváme — velmi proměnný, a má se za to, že závisí na takových faktorech, jako je kmen organismu, který byl použit, a/nebo použitý postup izolace, ale obvykle bylo zjištěno, že řečený komplex obsahuje více antibiotika MM 4550 ve srovnání s antibiotikem MM 13.902. Příprava, komplexu MM 4550 je zde dále popsána v popisné části.

V této přihlášce se výraz „MM 4550” používá k označení v podstatě čisté látky, která je mocným inhibitorem jž-laktamásy a vyznačuje se rovněž určitou antibakteriální účinností. Vlastnosti antibiotika MM 4550 jsou zde dále popsány.

Z jiného hlediska popisuje tento vynález způsob přípravy antibiotika MM 13.902 a jeho solí, přičemž se způsob vyznačuje kultivováním kmene Streptomyces produkujícího antibiotikum MM 13.902, načež se z kultury izoluje antibiotikum MM 13.902 nebo jeho sůl.

Bylo nalezeno, že v případě kmene, produkujícího antibiotikum MM 13.902, se jedná o Streptomyces olivaceus, a příbuzné organismu, jak to zde ještě dále bude uvedeno.

Nejvbodnějším organismem, který se dá použít, je Streptomyces olivaceus, a to například kmen ATCC 21 379, 21 380, 21 381, 21 382, 31 126 nebo odpovídající mutanty.

Zvláště výhodným kmenem k použití při postupu podle tohoto vynálezu je Streptomyces olivaceus ATCC 31126.

Výraz „kultivování“, jak je zde použit, znamená provedení aerobního růstu organismu za přítomnosti asimilovatelnýcb. zdrojů uhlíku, dusíku, síry a anorganických solí. K takovému aerobnímu růstu může dojít na pevném nebo polopevmém živném prostředí, nebo na kapalném prostředí, ve kterém jsou rozpuštěny nebo suspendovány živné složky. Kultivování se může provádět na aerobním povrchu nebo v submersní kultuře; živné prostředí může být složeno z komplexu živných složek, nebo může být chemicky definováno· Bylo zjištěno z našeho hlediska, že živná prostředí, obsahující komplex živných složek, jako je extrakt z kvasnic, moučka ze sojových bobů a podobné jsou zvláště vhodné, a jak jsme zjistili, je velmi výhodné přidávat ionty kobaltu, síranové a uhličitan vápenatý.

Bylo nalezeno, že kultivováním za teploty 28 + 2 °C se dosahují přijatelné výtěžky antibiotika, a jako výhodnou dobu kultivování zápary lze označit 2 až 3 dny po. počátku fermentování.

Výraz „mutant”, je-li zde použit, zahrnuje jakýkoli kmen mutantu, vznikající buď samovolně nebo vlivem působení vnějšího činidla, ať již se toto činidlo používá úmyslně nebo nikoli. Vhodné způsoby přípravy mutujících kmenů jsou popsány Η. I. Adlerem v „Radiation and Radioisotopes for Industrial Micro-organisms”, Proceedings of a Symposium, Vídeň 1973, str. 241, International Atomic Energy Authority, článek „Techniques for the Development of Micro-organísms”. Patří sem:

1. Ionizační záření, jako jsou paprsky rentgenového a gama záření, ultrafialové světlo, ultrafialové světlo spolu s fotosensibilisačním činidlem, jako je 8-methoxypsoralen, kyselina dusitá, hydroxylamin, pyrimidln a analogická báze, jako je 5-bromuracil, látky ze skupiny akridinu, alkyladiční činidla, jako je yperit, ethylester kyseliny methansulfonové, dále peroxid vodíku, fenoly, formaldehyd, zahřívání a tak dále.

2. Genetické postupy, jako je rekombinace, transformace, transdukce, lysbgenizace, lysogenní konverze a selektivní postupy pro spontánní mutanty..

Bylo nalezeno, že použití činidla, podporujícího mutaci, může vést ke vzniku organismu, vyznačující se schopností produkovat zvýšená množství žádaných antibiotik. Například ozařováním kultur Streptomyces olivaceus ATCC 21 379 s následujícím izolováním vzniklého kmene má za následek vznik největšího pásma účinnosti při KAGtestu, což vedlo k izolování kmene Streptomyces olivaceus ATCC 31126, jak to. zde ještě bude dále popsáno, což je právě výhodný kmen k použití při postupu podle tohoto vynálezu. Kmen 31126 je deponován v Holandsku jako CRS 155.75.

Obecně řečeno provádějí se všechny postupy izolování a čištění za účelem přípravy žádoucího antibiotika za nikoli zvýšené teploty, například to má být pod 20 °C a ještě výhodněji za teploty do 12 °C,

Očekávaný produkt se obvykle získává převážně z filtrátu kultury takže výhodným počátečním stupněm při postupu izolování je odstranění pevných podílů z fermentování, například filtrací.

Nečistý preparát antibiotika MM 13.902 nebo jeho sůl se může získat z vyčeřeného filtrátu kultury adsorpci antibiotika MM 13.902 nebo odpovídající soli na aktivní adsorpční materiál, jako je aktivní uhlí nebo podobně, načež se eluuje očekávaná látka z aktivního materiálu za použití rozpouš199264 tědla, jako je vodný aceton. Obvykle se provádí tento postup za použití soli antibiotika MM 13.902 se dvěma ekvivalenty báze.

<, Jinak se může nečistý preparát antibiotika MM 13.902 nebo jeho sůl získat z filtrátu kultury extrakcí za použití lipofilní amoniové soli a rozpouštědla, nemísitelného s vodou. Tento postup je často účinnější než postup, popsaný zde právě výše. Antibiotikum MM 13.902 se dá získat ve formě substituované amoniové soli odpařením organického rozpouštědla za sníženého tlaku. S výhodou se počáteční roztok substituované amoniové soli antibiotika MM 13.902 potom extrahuje zpět do vodné fáze za použití roztoku jodidu alkalického kovu, jako je jodid sodný. Posléze zmíněná varianta postupu obvykle- vede k přípravě vodného roztoku nečisté soli antibiotika MM 13.902 se dvěma ekvivalenty báze.

Streptromyces olivaceus a příbuzné organismy se vyznačují těmito primárními vlastnostmi:

Mají sporulující vzdušné mycelium v zelené nebo žluté sérii, mají sporofonní morfologii buď textiflexibilního nebo spirálového typu, mají spory s hladkým povrchem a neprodukují melanin.

Druhy s těmito právě uvedenými vlastnostmi jsou dále uvedeny v tabulkách 5 až

9.

Nečisté formy antibiotika MM 13.902 nebo jeho solí, jak jsou popsány výše, se obvykle čistí chromatografickými postupy, zde ještě dále popsanými se zřetelem na přípravu materiálů vyhovující čistoty.

V dalším popise jsou obecné informace, kterých lze využít při izolaci antibakteriálně účinných látek. V příkladech je postup podle tohoto vynálezu blíže popsán.

Příklad 1

Stanovení hodnoty I50

Hodnota I50 znamená množství materiálu, jehož je třeba k dosažení 50% inhibování hydrolýzy ampicilinu enzymem (3-laktamasou z Escherichia coli Bil, což je organismus, obsahující R-faktorem kontrolovanou jodoškrobové činidlo ^-laktamasa z Escherichia coli pufr ’ inhibitor pufru substrát {přidává se po inkubování výše uvedených směsí 15 minut při 37 °Cj

Reakce se sledují záznamem změny optické hustoty při 590 nm a měřením rychlosti reakce ze změny optické hustoty po

100 sekund během časových odstupů 3 až e (S-laktamasu. Tato /3-laktamasa je klasifikována jako typ lila enzym podle klasifikace Rlchmonda a Sykese, Adv. in Microbiol. Physiol. 9, 31 (1973).

Rychlost jS-laktamasové hydrolýzy ampicilinu na kyselinu penicilovou se dá Sledovat jodometrickým testem na škrob, přičemž se měří rychlost vzniku kyseliny penicilové následujícím odbarvením komplexu jodu se škrobem.

Tento postup, jakož i příprava (3-laktamasy jsou popsány autory M. Cole, S. Elson a P. D. Fullbrook, Biochem. J. 127, 295 (1972). Byla provedena malé úprava zmíněného postupu, záležející v tom, že se vzorek inhibitoru předinkubuje s enzymem po 15 minut za teploty 37 °C, dříve než se přidává k ampicilinu jako substrátu.

Postup je tento:

Reakčni činidla:

pufr: 0,05 M roztok pufru z fosforečnanu draselného, jodoškrobový roztok: příprava viz Novick,

Biochem J. 83 236 (1962) substrát: ampicilin 40 ^g/ml v pufru enzym (3-laktamasa: příprava z Escherichia coli B 11, jak to popsal Cole se spol., Βίοchem J. 127, 295 (1972). Ředění enzymového přípravku v pufru bylo takové, že se tím dosáhne pokles o asi 0,3 jednotek optické hustoty při neinhibované reakci za 100 sekund. Mohou se použít další kmeny Escherichia coli, produkující /3-laktamasu, zvláště ty, které se vyznačují přítomností R-faktoru, např. R. TEM.

Reakčni podmínky

Reakce se provádějí v kyvetkách 1 cm za teploty 37 °C za použití spektrofototaetru SP 800 Pye Unicam. V přístroji lze použít 4 vzorky s odpovídajícími slepými pokusy. Pevná kyveta se použije ke kontrole reakce a neobsahuje inhibitor, druhá, třetí a čtvrtá kyveta se použijí pro různá ředění inhibitoru.

Takže

Kyveta se vzorkem slepý pokus

1,0 ml	1,0 ml
0,1 ml	—
0,3 ml	0,4 ml
0,1 ml	0,1 ml
1,0 ml	1,0 ml

minut. Vzorek inhibitoru se ředí, až se dosáhne zředění, za kterého se dosáhne 50% rychlost reakce ve srovnání s kontrolním pokusem bez inhibitoru.

i 99 2 64

Příklad 2

KAG — test

Tímto označením se pojmenovává postup stanovení přítomnosti inhibitoru /J-laktamasy ve fermentační zápaře nebo během stupňů izolování. Roztavený živný agar se za teploty 45 °C očkuje vhodným kmenem Klebsiella aerogenes, produkujícím (3-laktamasu, a potom se smíchá s dostačujícím množstvím sterilního roztoku penicilinu G, takže se dosáhne koncentrace Θ ^g/ml penicilinu G v agaru. Agar se dále vlije na Petriho misky, a po ztužení se ve vrstvě agaru provedou sterilním kovovým nožem rovnoměrně od sebe oddělené cylindrické zářezy, a testované roztoky se vnesou do řezů, načež se miska inkubuje za konstantní teploty mezi 27 až 37 °C. Během doby inkubování difunduje jakýkoli inhibitor v testovaném roztoku ze zářezu do agaru a tam inhibuje působení jS-laktamasy, produkované v buňkách Klebsíelly. Penicilín G je takto chráněn před působením ^-laktamasy a tím před rozkladem, a je přítomný v koncentrací, dostačující k tomu, aby předešel 'růstu Klebsielly. V těch částech agaru, do kterých nedifundoval inhibitor v dostačující koncentraci, je penicilín G rozrušen působením /3-laktamasy, a to umožňuje vývoj hustého vzrůstu Klebsielly. Takže se vytvoří čirá kruhová pásma inhibování vzrůstu Klebsielly kolem zářezů, obsahujících Inhibitor, přičemž velikost každého pásma je závislá na koncentraci inhibitoru v testovaném roztoku. Účinnost (za vyjádření jednotkami/ml) testovaného roztoku se získá odkazem na standardní proložení logaritmu koncentrace inhibitoru proti průměru pásma. Tento test se dá rovněž použít při bioautografii.

Příklad 3

Příprava komplexu MM 4550, který lze porovnat s produktem podle britského patentového spisu 1 363 075.

Kmen Streptomyces olivaceus ATCC 21 370 se nechá růst 7 dní za teploty 28 °íC na pevném agarovém řezu v Rouxově baňce. Agarové prostředí má toto složení:

Složka množství v g/1'

Extrakt z kvasnic 10,0 monohydrát glukózy 10,0 agar 15,0 voda z vodovodu doplnit na litr

Extrakt z kvasnic je totožný s produktem „Yeatéx”, a „Agar”, v obou případech britské výrobky.

Hodnota pH prostředí se upraví na 6,8 před sterilizováním. Do kultury v Rouxově baňce se přidá 50 ml sterilní, iontů zbavené vody, obsahující 0,02% Tween 80' (tj. monooleylester polyoxyethylensorbltanu), a spory se suspendují potřásáním. Získaná suspenze sporů se přidá· jako očko do 75 litrů prostředí stupně sterilního očkování ve fermentačním zařízení obsahu 100 z nerezové oceli. Složení prostředí sterilního očkování bylo:

Složka Množství (g/1) moučka ze sójových bobů 10,0 monohydrát glukózy 20,0 voda z vodovodu doplnit na litr¹ (Moučka ze sójových bobů je produkt At> kasoy 50).

Ke zvládnutí pěnění se přidává do férmentačního prostředí před sterilizováním 50 ml objemově 10% roztoku Pluronic L 81 (chráněná značka), je to blokový polymer ethylenoxidu a propylénoxidu v sójovém oleji.

Prostředí se sterilizuje párou ve fermentačním zařízení po 20 minut za teploty 120 stupňů Celsia. Kultura ze stupně očkování se míchá za 340 otáček za minutu: diskovým míchadlem o průměru 25 cm, přičemž se zavádí sterilní vzduch v množství 150 litrů za minutu. Kultivační zařízení je opatřeno přepážkami, teplota se kontroluje na výši 28 °C a po inkubování za těchto podmínek po dobu 45 hodin se přidá z této kultury 7,5 litrů jako očko do 150 liltrůsterilního fermentačního prostředí, obsaženého ve fermentačním zařízení z nerezové oceli objemu 300 litrů. Fermentační prostředí má toto složení:

Složka Množství (g/1)'

Moučka ze sójových bobů
(Arkasoy 50, viz výše)	10,0
monohydrát glukózy	20,0
křída (přesrážený uhličitan
vápenatý)	0,2
hexahydrát chloridu kobaltna-
tého	0,001
voda z vodovodu doplnit na	litr

K zamezení pěnění se přidá 300 ml 10% roztoku Pluronic L 81 v sójovém oleji, ZaJS hodin se fermentační kapalina, vyčeří odstředěním, načež se u vyčeřené zápáry. jeví 50% inhibování při enzymovém testu za ředění 1 na 100 000. Z vyčeřené. zápary se do 100 litrů zamíchá 12 kg (váha za vlhka) iontoměničové celulózy v acetátovém cyklu Whatman DE 32, je to mikrokrystalická celulóza, substituovaná diethylaminoethylovými skupinami.

Suspenze se filtruje a komplex-MM 4550 se eluuje z modifikované celulózy za · použití 12 litrů 0,5 M roztoku síranu draselné1!J92G4 ho. Extrakt se zahustí na objem 6 litrů za použití šikmého odpařovacího zařízení z vrstvy filmu, a to za použití vakua a teploty nejvýše 30 °C. Značný podíl síranu draselného še vysráží přidáním 12 litrů acetonu, roztok se filtruje, načež se zahustí na objem 200 ml ve vakuu za teploty pod 30 °C. Koncentrát se nanese na kolonu 76 mm na 2 m s náplní Amberlit XAD—4, (je to neiontová polystyrénová pryskyřice] eluování se provádí vodou, přičemž se jímají frakce po 140 ml. Aktivní frakce podle vyhodnocení zmíněným KAG—testem se spojí dohromady na celkový objem 2,2 litrů, a tento podíl se zahustí na 275 ml ultrafiltrací za použití membrány Amicon UM—05 o průměru 150 mm za tlaku dusíku 4,2 atom. Koncentrát se lyofilizuje, a získá se tak

2,2 g hnědého prášku (I50 0,004 ,«g/mlj.

Z tohoto prášku se 1 g rozpustí v litru 0,2 M roztoku síranu sodného, a roztok se smíchá s litrem 2% roztoku (váha na objem) kyselého tetra-n-butylamoniumsulfátu v dichlormethanu. Roztok v uvedeném rozpouštědle se samovolně oddělí, ochladí se na —70 °C, filtrací se zbaví ledu a zahuštěním se koncentruje na 20 ml. Ke koncentrátu se přidá 400 ml petroletheru o t. v. 40 až 60 °C, načež se vysrážený podíl oddělí odstředěním. Sraženina se znovu rozpustí v 10 ml dichlormethanu, roztok se extrahuje 10 ml vody, která obsahuje 80 mg jodidu barnatého a 70 mg uhličitanu barnatého, vzniklé fáze se oddělí, vodný podíl se filtruje a jeho pH se upraví na hodnotu 6,5. Lyofilizováním roztoku se získá žlutý prášek, který se promyje acetonem, čímž se rozpustí nadbytek jodidu barnatého, načež se bledě žlutá pevná látka odstředí a vysuší se ve vakuu. Výtěžek činí 13 mg. (Ϊ50 = 0,0004 jMg/ml).

Příklad 4

Důkaz adsorpce filtrátu kultury na uhlí, což se hodí pro získávání materiálů, popsaných v britském patentovém spise 1 361 075.

Filtrát kultury, jak se získá z postupu podle příkladu 3, je charakterizován průměrem pásma; 17 mm při vpichu na agaru za difusního antibakteriálního testu proti Klebsiella aerogenes; průměrem pásma 38 milimetrů při KAG testu a hodnotou I50 v zředění 1 na 100 000. Za chlazení na 5 °C se 170 litrů vyčeřeňého filtrátu kultury perkoluje tokem vzhůru kolonou o průměru

22,5 cm, ve které je do výšky 40 cm aktivní uhlí (Farnell BO, V. Británie, velikost částeček 60 až 80 mesh; uhlí je proprané za použití N roztoku kyseliny chlorovodíkové, a pufrované na hodnotu 6 fosfátovým pufrem). Průtoková rychlost činí 800 až 1000 mililitrů za minutu.

Uhlí se potom vymyje za použití 10 litrů iontů zbavené vody, načež se kolona eluuje za teploty 20 °C 20% acetonem. Aktivní frakce, které činí dohromady 10 litrů, se zahustí ve vakuu zateploty pod 30 °C na objem 6 litrů, a lyofilizováním se získá 282 g surového komplexu MM 4550; tento preparát je charakterizován hodnotou I50 0,05 jUg/ml. Regenerace inhibiční enzymové aktivity odpovídá 22 %.

Jako jiné aktivní uhlí, za jehož použití se dosahuje podobných výsledků, je Darcogranular carbon (V. Británie).

Příklad 5

Důkaz použitelnosti iontoměničové chromatografie filtrátu kultury při získávání materiálu, popsaného v britském patentovém spise 1 363 075.

Do kolony s vnitřním průměrem 1 cm se použije jako náplň do výšky 6 cm (objem lože 4,7 ml) iontoměničová pryskyřice DOWEX 21 K (velikost částeček 20 až 50 mesh, v chloridovém cyklu) a jde o polystyren-divlnylbenzenovou pryskyřici s bazickými skupinami). Lože pryskyřice se promyje za použití asi 4 podílů po 4,7 ml 5% vodného methanolu, dále jednou za použití 4,7 ml destilované vody, a použijí se 2 litry filtrátu z kultury v podstatě podle postupu z popisu 3; tento podíl se nanese na kolonu načež se promytím za použití 50% vodného methanolu odstraní nečistoty.

Komplex MM 4550 se eluuje z pryskyřice 5% roztokem chloridu sodného v 50% vodném methanolu. V tabulce 1, připojené dále, jsou výsledky, vyjádřené formou jednotek účinnosti. Obsah komplexu MM 4550 ve filtrátu kultury je 8 jednotek na ml. Frakce, eluované z kolony, se testují za použití antibakteriálního difusního postupu proti Klebsiella aerogenes, a jednotky účinnosti se propočtou za použití standardizovaného grafu, který se vyhodnotí nanášením průměru pásma proti jednotkám na ml u různých zředění filtrátu kultury (to je za použití filtrátu kultury jako standardu).

Je patrné, že použití kolony Je účinným způsobem koncentrování komplexu MM 4550. Frakce 2 až 5 obsahují 60% účinnosti v celkovém objemu pouze 37 ml. Celková váha sušiny těchto frakcí činí pouze 210 mg při vnesení 35 g pevných podílů do kolony.

Tabulka 1

1B

Výsledky chromatografování na Dowexu 21K

Vzorek	PH	Objem ml	jednotek/ml	jednotek celkem
filtrát kultury	6,5	1970	8	15 760
perkolát 1	6,9	550	pod 1	pod 100
2	7,0	525	pod 1	pod 100
3	7,0	595	pod 1	pod 100
4	7,0	300	pod 1	pod 100
eluát 1	7,8	7,0	84	588
2	7,8	7,0	328	2296
3	7,7	8,5	440	3740
4	7,7	10,0	320	2200
5	7,6	11,5	160	1840
6	7,5	11,0	80	880
7	7,6	14,2	66	937
8	7,6	20,0	33	660
	-	celkem		13 141
Příklad 6			Příklad 7
Důkaz použitelnosti	extrakce	filtrátu kul-	Příprava částečně čištěného komplexu
tury párem iontů při	získávání materiálů	antibiotika, obsahujícího	MM 4550 a MM
podle britského patentového spisu 1 363 075.	13.902 za použití kyselého tetra-n-butylamo-

niumsulfátu.

Do 10 litrů vyčeřeného filtrátu kultury, připraveného postupem podle popisu 3, se přidá 240 g síranu sodného, a roztok se extrahuje 30 minut mícháním s 10 litry 2% roztoku kyselého tetra-n-butylamoniumsulfátu v dichlormethanu. Po oddělení fází se roztok v dichlormethanu ochladí na 2 °C, malé množství suspendované vody se odstraní filtrací za použití filtračního papíru Whatman 1 PS, načež se dichlořmethanový roztok zahustí na 20 ml odpařením ve vakuu za teploty pod 30 °C. Přidáním 400 ml petroletheru o t. v. 40 až 60 °C se vysráží gumovitý podíl, obsahující komplex M 4550.

Tento gumovitý podíl se oddělí centrifugováním, rozpustí se znovu v 50 ml dichlormethanu, a roztok se extrahuje do 50 ml vody, obsahující 1 g jodidu barnatého a 1 g uhličitanu barnatého za potřásání po 2 minuty. Přítomné pevné podíly se odfiltrují, obě fáze se oddělí, vodný podíl, obsahující komplex MM 4550 ve formě barnaté soli, se okyselí na hodnotu pH 6,5, načež se lyofilizováním získá 317 mg surového přípravku komplexu MM 4550 o hodnotě I50 = 0,001 jMg/ml.

Surový přípravek komplexu MM 4550, jak se získá postupem podle příkladu 4, se znovu rozpustí ve vodě, totiž 12,5 g v 125 ml vody, a roztok se extrahuje za použití 125 ml 10% (váha podle objemu) roztoku kyselého tetra-n-butlyamoniumsulfátu v dichlormethanu. Obě fáze se oddělí, a roztok v dichlormethanu se extrahuje za chlazení na 2 C použitím 100 ml vody s obsahem 190 mg jodidu sodného za pomalého míchání a úpravy hodnoty pH vodné vrstvy na 6,4 přidáním 2% roztoku kyselého uhličitanu sodného. Roztok se dále lyofilizuje, pevný podíl se promyje acetonem, takže se získá 88 mg směsi sodných solí MM 4550 a MM 13.902 o hodnotě Í50 = 0,0002 ,ug proti /3-laktamase Escherichia coli. Regenerování antibiotik = 70 %.

Antibakteriální účinnost směsi amplcilinu a materiálu, připraveného podle příkladu 7, se stanoví sériovým ředěním na živném agaru. Minimální inhibični koncentrace, jak byly získány, jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Synergismus ampicilinu a materiálu z přípravy podle příkladu 7

Organismus Amplcilin Ampicilin + komplex MM 4550 jako takový 0,1 /xg/ml 1 ^g/ml 10 jUg/ml

Escherichia coli B 11	nad 500	nad 500	500	50
JT417	250	250	250	50
JT39	nad 500	nad 500	500	25 +
Shigella sonnei S239	125	125	125	25+
Klebsiella aerogenes A	125	25	5+	pod 0,l+
IP282	50	50	12,5	0,5+
Próteus mirabilis 889	nad 500	nad 500	50	0,5
247	nad 500	125	5,0	0,5
Próteus morganii F	50	50	25	0,5
Próteus rettgeri R110	250	125	25 +	0,25+
Staphylococcus aureus
(Russell]	250	125	pod 0,1	0,25
Staphylococcus aureus
(Russell H)	nad 500	pod 0,1	pod 0,1	pod 0,1
+·’ Za těchto koncentrací způsobuje sám	vány pro	směsi amoxycilinu	a komplexu
komplex MM 4550	částečné inhibování	MM 4550.

Podobné synergické efekty bylo pozoroPříklad 8

Příprava částečně čištěného komplexu antibiotik, obsahujícího MM 4550 a MM 13.902 za použití cetyldimethylbenzylamoniumchloridu.

Lyofilizovaný produkt o hodnotě I50 = = 0,02 ,ug/ml, eluovaný acetonem z Farnellovy kolony s náplní aktivního uhlí, jak je to uveden v popisu 4, se rozpustí v destilované vodě na koncentraci 13 mg/ml. Hodnota pH roztoku se upraví na 6,5.

100 ml tohoto roztoku se extrahuje stejným objemem 0,1% roztoku cetyldimethylbenzylamonlumchloridu v dichlormethanu, fáze se oddělí odstředěním, a organická fáze se extrahuje zpět do 100 ml 0,05% roztoku jodidu sodného. Fáze se opět oddělí, a jakýkoli podíl dichlormethanu v oddělené vodné fázi se odstraní udržováním vodného roztoku za sníženého tlaku po 10 minut.

Vodný roztok se lyofilizuje, produkt lyofilizování se promyje třikrát za použití vždy 50 ml acetonu, načež se produkt po promytí acetonem suší ve vakuovém eksikátoru za vzniku lehce hnědého prášku, který se získá ve výtěžku 4,3 mg; hodnota I50 = = 0,02 ^g/ml.

Příklad 9

Příprava částečně čištěného komplexu antibiotik s obsahem MM 4550 a MM 13.902 za použití gelové filtrace.

g surového komplexu MM 4550 o hodnotě 150 = 0,2 připraveného postupem podle příkladu 4, se chromatografuje na Sefadexu G25 (jemnozrněný) za použití směsi acetonu a vody (objemově 4 : 6) k eluování. Rozměry kolony jsou 2,5 cm na 32 cm, a eluování se provádí za průtoku

1,5 ml za minutu. Aktivní frakce se spojí, zahustí se ve vakuu za teploty pod 30 °C, a lyofilizováním se získá 22 mg amorfní, mírně hnědě zbarvené pevné látky o hodnotě I50 = 0,005 jUg/ml. Regenerování odpovídá 88 %, vyčištění je čtyřicetinásobné. Příklad 10

Příprava čištěného komplexu antibiotik, obsahujícího MM 4550 a MM 13.902 za použití chromatografie na celulóze.

Komplex antibiotika MM 4550 ve váze 610 mg se připraví, jak je to uvedeno v postupu přípravy 7, a chromatografuje se na koloně 2,5 cm na 32 cm celulózy (Whatman CC 31) s následujícím eluováním směsí isopropylalkoholu a vody, objemově 7 : 3, to za průtoku 1,5 ml za minutu. Frakce s antibakteriální aktivitou se spojí, zahustí se ve vakuu za teploty pod 30 °C a lyofilizováním se získá ve výtěžku 40 mg hnědá amorfní pevná látka komplexu antibiotika o hodnotě I50 = 0,0007 ^g/ml. Velmi malá hodnota I50 je důkazem, že byl získán aktivní materiál se zlepšenou čistotou.

Při různých příležitostech byl získán za použití výše uvedeného postupu materiál s hodnotou I50 0,001 ^g/ml. Tento materiál se vyznačuje antibakteriální účinností, jež je uvedena v následující tabulce 3 za stanovení standardním mikrotitračním postupem se senzitivní záparou za užití lehkých oček (1 % ze zápary, přes noc).

T a b u 1 k a 3

Antibakteriální účinnost směsi antibiotik MM 4550 a MM 13.902 o hodnotě Iso 0,001 jug/ml

Organismus Minimální inhibiční koncentrace v ^g/ml

Staphylococcus aureus (Oxford) 7,5 (Russell) 7,5

Streptococcus faeoalis 125

Bacillus subtilis 0,9

Escherichia coli (10418) 3,7 (Bil) 15

Klebsiella aerogenes 1,8

Enterobacter cloacae 62

Próteus mirabilis 7,5

Providentia stuartii 7,5

Acinetobacter anitratus 0,9

Pseudotaonas aeruginosa 250

Serratia marcescens 7,5

Salmonella typhimurium 15

Shigella sonnei 7,5

Příklad 11

MM 4550

Antibiotikum MM 4550 se vyznačuje podle zjištění těmito vlastnostmi: je to pevná látka povahy kyseliny, a ve formě sodné soli má dále uvedené vlastnosti:

1. Sůl je velmi rozpustná ve vodě, rozpustná v methanolu, v podstatě nerozpustná v chloroformu, diethyletheru a uhlovodících.

2. Ve vodném roztoku se vyznačuje charakteristickým ultrafialovým světlem s absorpčními maximy asi při 238 nm a 287 nm.

3. Za koncentrace váhově 0,4 % v čerstvě připraveném lisovaném kotoučku z bromidu draselného má charakteristické infračervené spektrum s absorpčními maximy kromě jiných při 3450, 2950, 1765, 1695, 1510, 1390 a. 1260 cm¹. Změří-li se další spektrum asi ža týden po přípravě lisované tablety z bromidu draselného, jeví se ve spektru podstatné změny, například potud, že široký a mohutný pík při 1765 cm¹ se značně zmenší, popřípadě i zmizí.

4. Sůl má charakteristické NMR-spektrum v těžké vodě; toto spektrum se vyznačuje kromě jiného párem dubletů v nízkém poli, centrovaných přibližně při 2,45 τ a 3,65 τ s kopulačními konstantami asi 15 Hz; dubletem, centrovaným přibližně při 8,55 τ, a ostrým singletem přibližně při 7,95 τ.

5. Při chromatografování na tenké vrstvě celulózy byly nalezeny tyto hodnoty R_f v následujících soustavách:

butylalkohol/isopropylalkohol/voda, objemově 7 : 7 : 6, Rj — 0,6, isopropylalkohol/voda objemově 7 : 3, R_f = 0,7, n-butylalkohol/ethylalkohol/voda, objemově 7 : 7 : 6, R_f = 0,7 a n-propylalkohol/voda, objemově 4 : 1, R_f = 0,6.

6. Vyznačuje se antibakteriální účinností proti různým druhům mikroorganismů, kromě jiným proti kmenům Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Próteus mirabilis, Acinetobacter anitratus, Serratia marcescens a Shigella sonnei.

7. Vyznačuje se enzymovou inhibiční aktivitou proti (3-laktamasám, vznikajícím v různých druzích mikroorganismů, kromě jiných v Escherichia coli, Klebsiella aerogenes a Staphylococcus aureus. Hodnota Iso (jak zde dále ještě definována] činí pod 0,0001 (tíg/ml proti β-laktamase z Escherichia coli Bil.

8. Při smíchání s ampicilinem dochází k synergismu účinku proti některým mikroorganismům, počítaje v to kmeny Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Próteus mirabllis, Próteus morganii a Staphylococcus aureus Russell.

9. Z analýzy aminokyselin je zřejmé, že uvedený materiál nemá charakter polypeptidu nebo proteinu; po provedení hydrolýzy v kyselém prostředí nebyla zjištěna kyselina «-aminoadipová;

10. Látka reaguje s Ehrlichovým činidlem (300 mg p-dimethylaminobenzaldehydu se rozpustí ve směsi 54 ml n-butylalkoholu, 9 ml ethylalkoholu a 9 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové) ze vzniku modré barvy na papíře po provedené chromatografii, nebo na destičce k provedení chromatografie na tenké vrstvě.

11. Látka není obecně enzymovým jedem a neinhibuje dále uvedené enzymy za koncentrací vyšších, než jsou ty, kterých je třeba k inhibování (3-laktamasy z Escherichia coli: monoaminoxidasa, anhydrása kysličníku uhličitého, dopa-dekarboxylása, trypsin, chymotrypsin nebo ureasa.

Příklad 12

Příprava komplexu MM 4550, a dělení tohoto komplexu na antibiotika MM 4550 a MM 13.902.

Izolační postupy, které byly detailně popsány v části popisů, se mohou použít i zde s četnými obměnami sledů provádění dílčích postupů. Zvláště vhodným řazením postupů je chromatografie na uhlí, extrakce párem iontů a chromatografie na celulóze, jak je to zde dále popisováno:

340 1 filtrátu z kultury, jak se získá v příkladu 3, se perkoluje tokem směrem vzhůru za průtokové rychlosti 800 až 1200 ml za minutu kolonou o průměru 22,5 cm a o výše 53 cm, kde je náplní aktivní uhlí Farnell BO. Toto uhlí bylo již předtím použito k adsorbování komplexu MM 4550, a bylo regenerována promytím za použití těchto dále uvedených složek:

0,5 N roztok hydroxidu sodného, směs 0,2 N roztoku hydroxidu sodného a acetonu (3 : 2), voda, N roztok kyseliny chlorovodíkové, voda, fosfátový pufr o hodnotě pH 6, a voda.

Promytím kolony vodou (20 litrů) se vymyje filtrát kultury, načež se provede eluování tokem směsi acetonu a vody (2 : 8) směrem dolů za průtoku 200 až 250 ml za minutu. Jímají se frakce o objemu litr. Frakce s obsahem komplexu MM 4550 se zjistí antibakteriálním difúzním testem za použití Klebsiella aerogenes, spojí se (celkem 11 litrů), načež se tento podíl zahustí ve vakuu za teploty pod 30 °C na objem 5,5 litrů. Regenerování komplexu MM 4550 v tomto stadiu odpovídá 20 %.

Koncentrát se ochladí na 2 °C, přidá se

5,5 1 2% (váha podle objemu) roztoku kyselého tetra-n-butylamoniumsulfátu v dichlormethanu, podchlazeného na —5 °C, a obě fáze se míchají 2 minuty. Potom se roztok v dichlormethanu oddělí, a za chlazení na 0^cC se přidá k litru 0,6% roztoku jodidu sodného. Obě fáze se mírně rozmíchávají, přičemž se pH vodné fáze postupně upravuje na 6,5 až 7,0 přidáváním 2% vodného roztoku kyselého uhličitanu sodného. Vodná fáze se po oddělení lyofilizuje, sušený pevný podíl se extrahuje suchým acetonem, který rozpustí nadbytek jodidu sodného, aceton se odstraní z nerozpustného podílu ve vakuu, a jako zbytek se získá 1,1 g n,ahnědle zbarveného prášku. Celkový výtěžek regenerování komplexu MM 4550 v tomto stupni činí 10 %. Vyčištění, přepočteno na celkové množství rozpuštěných pevných podílů ve filtrátu kultury, je stodvacetipětinásobné.

Kolona o průměru 2,5 cm se naplní práškovanou celulózou (Whatman CC 31} ve směsi isopropylalkoholu a vody (7:3, objemově) do výšky 32 cm. Odděleně se rozpustí 500 mg zmíněného nahnědlého prášku v 2 ml směsi isopropylalkoholu a vody (7:3, objemově), a provede se chromatografie za použití téhož rozpouštědla a průtokové rychlosti 1,5 ml za minutu. Z kolony se odebírají frakce po 3 ml, a z nich se spoji ty, které se vyznačují v ultrafialovém spektru absorpčním maximem při 285 nm. Jejich zahuštěním a lyofilizováním se získá komplex MM 4550. Z předchozích pokusů je zřejmé, že frakce, vyznačující se absorpcí při 285 nm, obsahují antibakteriálně účinný materiál, inhibující enzymy.

Výtěžek lyofilizovaného komplexu MM 4550 činí 35 mg. Látka je amorfní, hnědě zbarvená, a je charakterizována hodnotou I50 0,0001 ^g/ml. Regenerace aktivního materiálu v tomto stupni odpovídá celkově 3 proč., stupeň vyčištění je šestistynásobný.

Antibakteriální účinnost tohoto přípravku se stanoví standardním mikrotitračním postupem, totiž testem sensitivity zápary a použití lehkého očka. Hodnoty minimálních inhibičních koncentrací jsou podobné oněm, které zde byly předtím uvedeny v tabulce 3.

Analýzou přípravku chromatografováním ha tenké vrstvě celulózy („Chromatogram”), při vyvíjení soustavou n-butylalkohol, isopropylalkoliol, voda (7 : 7 : 6) byly nalezeny dvě aktivní látky, jedna o hodnotě R_f = 0,58, která byyla označena MM 4550, a druhá o hodnotě R_ř = 0,72, která byla označena MM 13.902. Obě tyto látky lze detegovat bioautograficky za použití četných mikroorganismů, kam patří Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus (Oxford), Staphylococcus aureus (resistentní na penicilín], Escherichia coli (sensitivní i resistentní na penicilín J, Salmonella typhimurium, Próteus mirabilis a Próteus morganii.

Při jiném pokusu byly tyto dvě látky děleny na tenké vrstvě celulózy za vyvíjení směsí isopropylalkoholu a vody (8 : 2), načež byla provedena extrakce z celulózy fosfátovým pufrem. Každý extrakt byl testován na inhibování ,ό-laktamasy, a bylo zjištěno, že obě látky inhibují /3-laktamasu Escherichia coli. Obě látky se rovněž vyznačují synergismem s benzylpenicilinem proti Klebsiella aerogenes.

Tabulka 4

Antibakterialní účinnost MM 4550 a MM víjení soustavou butylalkohol/isopropylalko13.902 podle stanovení bioautografií (chro- hol/voda, objemově 7:7:6) matografie na tenké vrstvě celulózy za vyOrganismus průměr pásma při bioautografii

Pásmo v mm MM 4550, Pásmo v mm MM 13.902

R_f = 0,58 R, = 0,70

Klebsiella aerogenes	20,0	20,0
Prouteus mirabilis	17,5	13,5
Próteus morganii	16,0	9,5
Salmonella typhi	19,5	21,0
Escherichia coli 10418	20,0	13,5
Bil	17,5	10,5
Enterobacter aerogenes	6,5	bez pásma
Staphylococcus aureus (Oxford)	13,0	4,0
(Russell)	12,0	4,0
Bacillus subtilis	24,0	15,0

Příklad 13

Příprava komplexu MM 4550 a dělení tohoto komplexu na MM 4550 a MM 13.902.

1100 litrů filtrátu kultury z fermentování Streptocuccus olivaceus ATCC 31126 se za hodnoty pH 6,5 a při 5 °C perkoluje za průtokové rychlosti 3,2 litry za minutu kolonou rozměrů 0,3 m na 1 m s náplní granulovaného aktivního uhlí Darco. Toto uhlí bylo již předtím použito k adsorpcl komplexu MM 4550, a bylo regenerováno k dalšímu použití promytím těmito činidly:

0,5 roztok hydroxidu sodného, směs 0,2 N roztoku hydroxidu sodného a acetonu (3 : : 2), voda, N roztok kyseliny chlorovodíkové, voda, fosfátový pufr o pH 6, voda.

Promytím kolony vodou (60 litrů), se vymyje filtrát kultury, načež se kolona eluuje při 30 ⁰¹ C směsí acetonu a vody (2:8, objemově) za průtoku 1,1 litrů za minutu. Odebere se 60 litrů, načež se jímá 5 frakcí po 10 litrech. Ty frakce, které obsahují komplex antibiotika MM 4550 podle vyhodnocení antibakteriálním difusním testem na Klebsiella aerogenes, se spojí, a celkový objem 40 litrů se zahustí ve vakuu za teploty pod 30 °C na objem 32 litrů. Regenerace MM 4550 (jako komplexu) v tomto stupni odpovídá 15 %.

Koncentrát se ochladí na 5 °C, přidá se 16 litrů 0,2% roztoku cetyldimethylbenzylamoniumchloridu v dichlormethanu, rovněž podchlazeného na 5 °C, a obě fáze se promíchávají po 5 minut. Roztok v dichlormethanu se oddělí, za teploty 5 °C se přidá do

3,75 litrů 0,4% roztoku jodidu sodného, opět se obě fáze míchají 5 minut, načež se vodný podíl oddělí a lyofilizuje. Pevný podíl se zbaví nadbytku jodidu sodného extrakcí acetonem, načež se vysušením pevného zbytku, nerozpustného v acetonu, získá 2,87 g nahnědle zbarveného prášku. Celkový výtěžek komplexu MM 4550 v tomto stupni odpovídá 6 %. Čištění, přepočteno na veškeré pevné rozpuštěné podíly ve filtrátu kultury, je stošedesátinásobné.

Kolona o průměru 63 mm se naplní práškovanou celulózou (Whatman CC 31) ve směsi isopropylalkoholu a vody (7 : 3, objemově) do výšky 300 mm. Rozpustí se 2,0 g ze zmíněného nahnědlého produktu v 5 ml směsi isopropylalkoholu a vody (7 : 3), a provede se chromatografie za průtoku 3 ml za minutu. Frakce, obsahující komplex MM 4550 podle stanovení testem na Klebsiella aerogenes, se spojí, zahustí se odpařením ve vakuu za teploty pod 30 °C, načež se lyofilizováním zbylého podílu získá 207 mg hnědé pevné látky. Regenerování komplexu MM 4550 v tomto stupni odpovídá 51 %, stupeň vyčištění je pětinásobný.

Kolona o průměru 16 mm se naplní práškovanou celulózou (Whatman CC 31] ve směsi n-propylalkoholu a vody (4:1, objemově ) do výšky 300 mm. Ze zmíněného hnědého produktu se rozpustí 198 mg ve směsi vody a n-propylalkoholu (1 : 1), a chrómatografuje se za použití soustavy n-propylalkohol—voda (4:1, objemově) za průtokové rychlosti 0,5 ml za minutu. Jímají se frakce o objemu 6 ml, ty se biotestují na Klebsiella aerogenes, a u každé frakce se změří ultrafialové spektrum. Frakce 23 až 28, vyznačující se maximem při 305 nm, obsahují dvojsodnou sůl MM 13.902. Tyto frakce se spojí, roztok se zahustí ve vakuu, a lyofilizováním zbytku se získá 30 mg pevné látky. Tento přípravek se vyznačuje jedním pásmem antibiotické účinnosti, a má R_f — 0,77 při chromatografování na tenké vrstvě celulózy v soustavě n-propylalkohol—voda (4 : 1, objemově). Zónu lze detegovat bioautografií za použití Bacillus subtilis. Frakce 29 až 40 s maximem absorpce v ultrafialovém spektru při 285 nm, obsahují MM 4550. Spojí se, zahustí se ve vakuu, a lyofilizováním zbytku se získá 53 mg pevné látky, obsahující sůl MM 4550, znečištěnou malým množstvím soli MM 13.902.

Příklad 14

Organismy

Vlastnosti produkovat komplex MM 4550 byla nejprve zjištěna u kultur Streptomyces olivaceus ATCC 21 379, ATCC 21 380, ATCC 21 381, a ATCC 21 382, jež byly izolovány ze vzorků půdy ze Španělska, Nového Zélandu, Jižní Afriky a Izraele v tom kterém případě. Při laboratorním zjišťování bylo konstatováno, že tyto kultury jsou identické, a všechny byly indentifikovány jako Streptomyces olivaceus v National Colleetion of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, Skotsko, a to za použití obecně používané klasifikace Huttera (1967, Systematic der Streptomyceten, S. Karger, Basilej, 382 stran). Od té doby byla zjištěna produkce MM 4550 v dalších druzích streptomycet, jak je to patrné z tabulky 4.

S. olivaceus popsal jako prvý Waksman (1919, Cultural Studies of Species of Actinomyces, Soil Sci., 8 71—215). Později v r. 1960, skupina sovětských pracovníků popsala druhy s velmi podobnými charakteristickými vlastnostmi, ale pod označením Actinomyces (Streptomyces) fulvoviridis, viz Kučajeva a spol., Trud. Inst. Mikrobiol., Akad. Nauk SSSR 8, 226 (1960).

Mikroorganismy rodu Streptomyces jsou zcela mimořádně variabilní z hlediska morfologie a fyziologie, a to v závislosti na podmínkách pěstování. Byly popsány četné druhy, dříve než byla zjištěna tato mimořádná variabilita, a důsledkem toho byly duplicity a synonymní označení. Hutter v r. 1967 uvádí 25 druhů jako synonym S. olivaceus počítaje v to S. fulvoviridis. K zvládnutí tohoto zmatku v nomenklatuře a klasifikaci se začalo v r. 1962 s „International Streptomyces Project”, viz Shirling a spol., Int. J. Syst. Bacteriol. 18, 69 (1968). Spolupracovníci toh.oto úkolu provedli sérii studií a přispěli k přesnému popisu druhů Streptomyces za standardisovaných podmínek. Byly tedy provedeny popisy typů kmenů 400 pojmenovaných species, počítaje v to Streptomyces olivaceus a Streptomyces fulvoviridis.

I. S. P. popis Streptomyces olivaceus a S. fulvoviridis se liší pouze dvěma charakteristikami:

(i) forma sporoforů, a (ii) schopnost používat inositol jako jediný zdroj uhlíku.

Streptomyces olivaceus je popisován takto:

Morfologie řetězů spor: spirální sekce s otevřenými spirálami, prostupujícími flexibilními řetězci spor, tedy sekce rectiflexibilní. Řetězy zralých spor obvykle dlouhé, často s více než 50 sporami na řetězec. Využívání zdrojů uhlíku: D-glukčza, L-arabinóza, D-xylosa, i-inositol, D-mannitol, D-frukosa a rhamnosa jsou použitelné; nebyl pozorován růst na sacharose a raffinose.

Streptomyces fulvoviridis je popisován takto:

Morfologie řetězů spor: sekce rectiflexibilní, zralé spory v řetězcích středně krátkých, 10 až 50 spor na řetězec.

Využívání zdrojů uhlíku: D-glukóza, L-arabinosa, D-xylosa, D-mannitol, D-fruktosa a rhamnosa jsou použitelné. Nebyl pozorován vzrůst, nebo jen stopy na i-inositolu a raffinose.

Charakterizace četných kultur, pojmenovaných jako S. olivaceus nebo S. fulvoviridis, nebo názvy synonymními, jakož i dalších species byla provedena za použití standardizovaných postupů a prostředí (Shirling a spol., Int. J. Syst. Bacteriol 16, 313 (1966), jak to bylo doporučeno v International Streptomyces Project (ISP).

Kultury byly z různých zdrojů. ATCC 21 379, 21 380, 21 381, 21 382 byly izolovány z půdy na podkladě produkce komplexu MM 4550. Další kmeny byly získány z různých sbírek kultur pro účely srovnávání.

Výsledky testů produkce komplexu MM 4550, barvy vzdušného mycelia, tvaru sporofor, barvy substrátu mycelia, produkce rozpustného pigmentu, produkce melaninu a využití zdrojů uhlíku jsou v tabulkách 4 až 8. Pro všechny kmeny platí, že povrch spor podle elektronové mikroskopie je hladký.

Z popisu ISP je jasné, že spirální vzrůst sporoforů v Streptomyces olivaceus má proměnný charakter. Pravé spirály byly pozorovány s proměnnou frekvencí u typu species S. olivaceus, například ATCC 3335. Větší podíl sporoforů tvoří dlouhé tvary. U kultur ATCC 21 379, 21 380, 21 381 nebo 21 382 nebyly pozorovány pravé spirály, ačkoliv sporofory byly dlouhé, a jevila se u nich tendence tvořit spirály mezi pozadím rectiflexibilního typu. Avšak ve dvou případech

S. olivaceus, NCIB 8238 a NCIB 8509 byla větší část sporofor rectiflexibllního typu. V případě NCIB 8238 byly středně dlouhé, zatímco v případě NCIB 8509 byly dlouhé.

Sporofory, pozorované u ATCC 15 863, typ species S. fulvoviridis, byly kratší, než jak tomu bylo v případě izolovaných podílů z ATCC 21 379, 21 380, 21 381 a 21 382 i 31126, a byly výlučně rectiflexibilního typu. Se zřetelem na tento charakter odpovídají izolované podíly ATCC 21 379, 21 380, 21 381, 21 382 a 31126 dosti dobře, nikoli však zcela přesně popisu S. olivaceus.

Izolované podíly ATCC 21 379, 21 380, 21 381 a 21 382 i 31126 se vyznačují určitou variabilitou se zřetelem na použitelnost inositolu jako zdroje uhlíku, což je další diferencující charakter podle I. S. P. popisu typu druhů mezi S. olivaceus a S. fulvoviridis (Tabulka 8). ATCC 31126 a ATCC 21 380 mohou využívat inositol, což je charakteristické pro S. olivaceus, na druhé straně u dalších kmenů se jeví pochybná použitelnost, popřípadě žádná. Avšak obvykle se to nepokládá za uspokojující dě199264 lit různé species na podkladě schopnosti využívat pouze jedinou látku ze skupiny cukrů. K takovému rozdílu může dojít mutací jediného genu, a má se často za to, že je to charakteristické pouze pro ten nebo óněn kmen. Rozdíl ve schopnosti využívat cukry z kmenů Streptomyces olivaceus NCIB 8138, NCIB 8509, ATCC 21 549, ATCC 12 019 a ATCC 3335 dává důvod k úvahám, proč četní to nepovažují za významný charakter Spečies. Takže ATCC 21 379, 21 380, 21 381 a'21382 i 31 126 jsou správně označovány jako Streptomyces olivaceus.

Pokud se v rámci dalších studií nedospěji: k podstatnějším a důležitějším rozdílům mezi kulturami, které jsou současně pojmenovávány S. olivaceus a S. fulvoviridis, je možné, že budou z mezinárodního hlediska označeny jako jediný druh. V takovém přípádě by-správné označení z hlediska pravidla priority znělo Streptomyces olivaceus, a to so týká i kultur, které uvádí Hutter jako synonym ní a S. olivaceus.

Průzkum filtrátu kultur kmenů Streptomyccs' olivaceus a příbuzných druhů se zřeteíérn na produkci MM 4550 (komplexu) se dá přbváděť takto:

^s Filtráty z kultur uvedených kmenů se nanesou co stopa na chromatografický papír Whatman č. 1, a to v dávce 20 μΐ se zřetelem na zdroj, a za chladu přes noc se provádí chromatografie za použití směsi n-butylalkohol-isopropylalkohol-voda (v poměru 7·; 7 : 6). Další série papírové chromaťografie se nechá běžet za chladu přes noc v soustavě n-butylalkohol/ledová kyselina octová/voda (12 : 3 : 5), a částečně čištěný vzorek komplexu antibiotika MM 4550 se rovněž pustí v obou dvou systémech v téže době jako testovaná látka.

Jinak je rovněž možno extrahovat 25 ml vyčeřené zápary za použití 12,5 ml 0,2% roztoku cetylbenzylamoniumchloridu v dichlbrmethanu, načež se oddělí fáze, orga28 nická fáze se pozdrží, smíchá se s 2,5 ml 0,5% roztoku jodidu sodného, a po protřepání se fáze oddělí, pozdrží se vodná fáze, a použije se chromatografický, například nanášením 5u na pásy chromatografie v tenké vrstvě za použití soustavy n-butylalkohol/isopropylalkohol/voda 7:7:6. Tabulka 5

Schopnost kultur Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis a podobných species produkovat MM 4550 (jako komplex) Kultura Produkce komplexu

MM 4550

Streptomyces olivaceus

ATCC 21 379 +

ATCC 31126 +

ATCC 21380 +

ATCC 21381 +

ATCC 21 382 +

NCIB 8238 +

NCIB 8509 +

Streptomyces flavovirens

ATCC 3320 +

Streptomyces flavus

ATCC 3320 +

Streptomyces fulvoviridis

ATCC 15 863 +

Streptomyces argenteolus

ATCC 11009 +

Streptomyces sioyaensis

ATCC 13 989 +

Streptomyces lipmanii

NRLL 3584 + (Streptomyces olivaceus ATCC 21 549, ATCC 12 019 a ATCC 3335 neprodukují komplex MM 4550; ATCC 15 863 je v depozitáři rovněž jako RIA 660).

1R92B4

Tabulka 6

Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis a podobné druhy, barva a morfologie zralých sporulujících vzdušných mycelil na prostředí ISP po růstu 14 dní

Kultura A B C D Morfologie sporoforů a velikost

ATCC	21 379	šedá	šedá
	31126	šedá/hnědá	šedá/hnědá
	21 380	šedá	šedá
	21 381	šedá	šedá
	21 382	šedá/bílá	šedá
NCIB	8 238	šedá/bílá	šedá
	8 509	šedá	šedá
ATCC	21 549	šedá	šedá
	12 019	šedá	šedá
	3 335	šedá	šedá
	15 863	šedá/bílá	šedá
	3 320	šedá/modrá	šedá
	3 369	šedá	šedá
	11 009	bledě šedá	šedá/hnědá
	13 898	bílá/šedá	bílá

Vysvětlivky:

A agar se škrobem a anorganickými solemi (ISP prostředí 4)

B agar se sladovým extraktem a extraktem z kvasnic (ISP prostředí 2)

C agar s glycerinem a asparaginem (ISP prostředí 5)

šedá/bílá	šedá	dlouhé, rf
šedá	šedá	dlouhé, rf
šedá	šedá	dlouhé, rf
bledě šedá	šedá/bílá	dlouhé, rf
šedá	šedá	dlouhé, rf
šedá	šedá	střední, rf
šedá	šedá	dlouhé, rf
šedá	šedá	dlouhé, s
šedá	šedá	dlouhé, rf/s
šedá	šedá	dlouhé, rf/s
šedá/bílá	šedá	střední, rf/s
šedá/zelená	šedá	dlouhé, rf/s
šedá	bledě šedá/hnědá	střední, rf/ra
šedá/bílá	šedá/zelená	střední, rf/ra
bílá/žlutá	šedá/bílá	krátké, s
D agar s ovesnou moučkou	(ISP prostředí

3) rf rectiflexibilní ra retinaculiaperti s spirály

Tabulka 7

Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis a podobné druhy, barva mycelia v substrátu z reversní strany.

Kultura .	A	B	C	D
ATCC 21 379	olivová	olivově hnědá	šedá/hnědá	olivově zelená
31 126	olivově hnědá	olivově hnědá	hnědá	olivově hnědá
21 380	olivová	olivově zelená	olivově hnědá	olivově žlutá
21 381	temně hnědá	temně hnědá'	olivově zelená	olivově zelená
21 382	olivová	olivová	hnědá	olivově zelená
NCIB 8 238	hnědá	olivová/hnědá	hnědá	olivově žlutá
8 509	hnědá	olivová	olivově hnědá	olivově žlutá
ATCC 21549	hnědá/černá	hnědá/černá	hnědá/černá	hnědá/šedá
12 019	hnědá	hnědá	hnědá	hnědá
3 335	hnědá	hnědá	hnědá	šedá
16 863	hnědá/šedá	temně hnědá	olivově hnědá	olivově žlutá
3 320	žlutá/hnědá	olivová/hnědá	olivová/hnědá oranžová/hnědá
3 369	hnědá/šedá	žlutošedá	hnědá/zelená	žlutá
11009	černá	černá/žlutá	černá/žlutá	šedá/zelená
ATCC 13 989	oranžová	žlutá	žlutá	bez barvy

Vysvětlivky viz tabulka 6

Tabulka 8

Streptomyces olivaceus, Streptomyces íulvoviridis a podobné příbuzné druhy: produkce pigmentu v prostředí kultury.

Kultura	rozpustné A	nemelanoidní	pigmenty D	Vznik melaninu+)
B	C
ATCC 21379	—			+ (mírně žlutý)	—
31 126	—	—	—	.—.	__
21 380	—	—	—	__	_
21 381	—	—	—	—	_
21 382	—	—	—	—	_
NCIB 8 238	+ (mírně hnědý)	—	+ (mírně hnědý)	+ (mírně hnědý)	—
8 509	—	—	—	+ (světle žlutý)	—
ATCC 21 549		+ (světle hnědý)	+ (světle červeno/hnědý)	+ (světle hnědý)
12 019	—.	—	—	—	_
3 335	—	—	—	.—	_
15 863	—	—	—	—	—,
3 320	+ (slabě růžový)	—	—		—
ATCC 3 369	—	—	—	—	—
11 009	—	+ (mírně hnědý)	—	—
13 989		+ (mírně oranžový)		-
vysvětlivky A, I	3, C a D: viz	tabulka 6	+ ) testováno nicemi a	na agaru s železem (:	peptonem, kvas1SP 6), agaru s
+ = pigment vzniká		tyrosinem	(ISP 17), a	na zápaře s tryp-
— = pigment nevzniká		tonem a kvasnicemi (ISP 1).

Tabulka 9

Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis a příbuzné druhy, testy využívání zdrojů uhlíku.

Kultura rh raf šach

ATCC 21379	+	—	—
31 126	+	—	—
21 380	+	—	—
21 381	+	—.	—
21 382	+	4-	—
NCIB 8 238	+	—	—-
8 509	+	±	—
ATCC 21549	—	— .	—
12 019	+	i	+
ATCC 3 335	4-	—	ί
15 863	+	—	—.
3 320	4- '	—	+
3 369	+	—	±
11 009	4~	—	—
13 989		+	+

1+1 + zdroj je využit zdroj není využit využití je pochybné nebo velmi chabé

ino	glu	xy	fru	man	ara
4-	4-	4-	4-	+	+
4-	+	4~	+	4-	+
4-	4-	+	4-	4-	4-
—	4-		+	4-	+
—	+	4-	4-	4-	4-
—	4-	+	4-	4-	4-
—	4-	+	4-	+	4-
4-	+	+	4-	+	+
4-	+	+	+	+	+
+	+	4~	4_	+	4-
—	4-	4-	+	4-	4-
—	+	+	+	4-	+
+	4-	+	4~	+	+
+	+	4-	+	4-	+
+	•4-	4~	4-	4-	—
Vysvětlivky:
rh	= rhamnosa,	raf =	raffinosa,	šach —
=	sacharosa, ino	— inositol, glu =	= glukó-
za,	xy = xylóza,	fru —	fruktóza,	man —

= mannitol, ara = arabinosa.

Příklad 15

Výhodný izolační postup přípravy MM 13.902.

Zásoba spor Streptomyces olivaceus ATCC 31126 se udržuje skladováním ve zkumavkách v suché půdě v uzavřeném zásobníku se sušidlem za teploty 20 °C. Malé množství zásobní půdy (asi 20 mg) se přenese asepticky do 500 ml Erlenmeyerovy baňky, obsahující 100 ml tohoto prostředí složka množství (g na litr) monohydrát glukózy 20,0 moučka ze sójových bohů 10,0 iontů zbavená voda doplnit na litr

Před sterilizováním se hodnota pH upraví na 6,5. Jako moučka ze sójových bobů se použije „Arkasoy 50”.

Baňka se inkubuje 30 hodin za teploty 28 °C na rotační třepačce (240 kyvů za minutu). Potom se použijí ve vzniklého vegetativním vzrůstu 2 ml jako očko na řezu z pevného agaru v Bouxově baňce. Agar má toto složení:

složka množství šťáva ze zeleniny (V—8) 20,0 ml agar 20,8 g iontů zbavená voda doplnit na litr

Před sterilizováním se hodnota pH upraví na 6,0. - Λ

Očko se rozprostře po povrchu agaru nakláněním baňky, která se potom inkubuje za teploty 30 °C v postavení svislém. Po dvoudenním inkubování se přebytečná kapalina z baňky odtáhne pipetou, a v inkubování se pokračuje po další 4 dny.

Bylo již dříve zjištěno, že vývoj aktinofága v kultuře na řezu se potlačí, použije-li se tento způsob přípravy v kultivační baňce podle Rouxe.

Do kultury v Rouxově baňce se přidá 50 ml sterilní vody, zbavené iontů, a spory se suspendují potřásáním. A tato suspenze sporů se potom přidá jako očko do 75 litrů sterilního očkovacího prostředí ve fermentačním zařízení 100 litrů s nerezové oceli. Složení zmíněného prostředí je toto: složka množství (g na litr) moučka ze sójových bobů (Arkasoy 50) 10,0 monohydrát glukózy 20,0 voda z vodovodu doplnit na litr

Ke zvládnutí pěnění se přidává 50 ml 10% roztoku „Pluronic L 81” v sójovém oleji do {ermeniáčního prostředí před Sterilizováním.

Prostředí se sterilizuje párou ve fermentačním zařízení 20 minut při 120 °C. Kultura se míchá za použití 140 otáček za minutu diskovým míchadlem o průměru 18 cm, a zaváděcí trubičkou se připouští za minutu 75 litrů sterilního vzduchu.

Teplota se udržuje na 28 °C, a po inkubování 48 hodin za těchto podmínek se obsah nádoby přidá jako očko do 1500 litrů sterilního fermentačního prostředí ve fermentačním přepážkovém zařízení z nerezové oceli, obsahu 2000 litrů. Fermentační prostředí má toto složení:

složka množství (g na litr) moučka ze sójových bobů (Arkasoy 50) 10,0 monohydrát glukózy 20,0 srážený uhličitan vápenatý 0,2 hexahydrát chloridu kobaltnatého 0,001 bezvodý síran, sodný 1,0 voda z vodovodu doplnit na 1500 litrů

Před sterilizováním se upraví hodnota pH na 6,0 přidáním hydroxidu sodného, a k zabránění pěnění se rovněž před sterilizováním přidají 3 litry 10% roztoku „Pluronic L 81” v sójovém oleji. Po sterilizování se pH znovu upraví na hodnotu 7,0 sterilním roztokem hydroxidu sodného, a fermentační zápara se míchá za 106 otáček za minutu, přičemž na hřídeli míchadla jsou umístěny dva míchací disky o průměru 48 cm. Teplota se udržuje na 30 °C, přívod vzduchu činí 1200 litrů za minutu. Fermentace se zastaví za 60 hodin, a zápara se vyčeří centrifugováním.

Vzniklý materiál má aktivitu 340 jednotek na ml. Testy se provádějí, jak je to popsáno v popisu 2.

1050 litrů filtrátu kultury (340 jednotek na ml) se za teploty 10 °C a za hodnoty pH 8 extrahuje za použití 310 litrů dichlormethanu, chlazeného rovněž na 10 °C, obsahujícího 1200 g cetyldimethylbenzylamoniumchloridu, a to tak, že se obě kapaliny čerpají za předepsané průtokové rychlosti do míchacího zařízení. Fáze se oddělí v kontinuální centrifúze po smíchání asi na 2 minuty. 300 litrů dichlormethanového roztoku se extrahuje zpět vodným roztokem jodidu sodného. Tato extrakce se provádí ve 4 dávkách, přičemž se použije celkem 7 litrů vody s obsahem 210 g jodidu sodného. Fáze se dělí samovolně, pH vodné fáze se upraví z 7,7 na 7,0 přidáním kyseliny chlorovodíkové, a po filtraci se získá 7 litrů extraktu, obsahujícího v roztoku jodidu sodného 21 900 jednotek na ml.

Připraví se iontoměničová kolona, obsahující jako náplň Sephadex A 25 v 0,05 fosfátovém pufru (pH 7) s obsahem 0,3 M chloridu sodného, to ve skleněné koloně průměru 10 cm do výšky 40 cm. 7 litrů extraktu v jodidu sodném se za teploty 5 stupňů Celsia perkoluje zmíněným sefade193216 4 xem na průtokové rychlosti 50 ml za minutu. Kolona se eluuje 0,7 M roztokem chloridu sodného v 0,05 M fosfátovém pufru za hodnoty pH rovněž 7, při teplotě 5 °C ,a za průtokové rychlosti 25 ml za minutu. Z eluátu se dají stranou 2 litry (tento podíl není k potřebě) a potom se jímá 90 frakcí po 100 ml. Frakce se sledují ultrafialovými spektry, a ty frakce, u kterých se zjistí absorpční maximum při 305 nm, se spojí (frakce 50 až 62, celkový objem 1440 ml, 71 000 jednotek na ml) a jejich pH se upraví na 7. Bylo již zde dříve dokázáno, že frakce s maximem absorpce v této oblasti obsahují MM 13.902.

K celkovému podílu výše zmíněných frakcí se přidá chlorid sodný v množství 5 g na 100 ml, načež se spojené frakce perkolují za teploty 5 °C kolonou o průměru

6,3 cm s náplní pryskyřice Amberlit XAD 4 (Rohm & Haas Ltd). Náplň v koloně je do výšky 30 cm, průtokové rychlost 20 ml za minutu. MM 13.902 se adsorbuje za těchto podmínek na pryskyřici, anorganické nečistoty nikoli. MM 13.902 se -eluuje za teploty místnosti pomocí 200 ml destilované vody a potom 50% vodným methane lem. Llitr eluátu se zahustí za teploty pod 30 °C za sníženého tlaku na 70 ml, pH tohoto zbytku se upraví na hodnotu 7, a lyofilizováním se dále získá 1,62 g hnědého zbytku, což představuje částečně čištěnou -sůl MM 13.902 s aktivitou 37 000 jednotek na mg.

1,0 g částečně čištěné dvojsodné soli antibiotika MM 13.902 (37 000 jednotek na mgj se chromatografuje na koloně s celulózou (Whatman CG 31) rozměrů 3,8 cm na 30 cm za eluování směsí n-propylalkoholu a vody (4 : 1, objemově] s průtokovou rychlostí 2,5 ml za minutu. 170 ml eluátu není k potřebě, a potom se jímá 100 frakcí po 15 ml. Frakce s obsahem dvojsodné soli MM 13.902 (č. 37 až -43) podle vyhodnocení absorpcí v ultrafialovém světle se spojí na celkový objem 89 ml, odpařením ža teploty pod 30 °Č za sníženého tlaku se oddestiluje n-propylalkohol, a lyofilizováním se získá 219 mg žlutavého prášku š aktivitou 73 000 jednotek na mg.

Tento materiál se vyznačuje ©teonpčním maximem při 305 nm s Ε ϊ ™ asi 343. Infračervené a NMR—spektrum tohoto materiálu je na obr. 2 a 3 v tom kterém případě. Antibakteriální účinnost materiálu je uvedena v tabulce 10. Z elementární analýzy materiálu je jasné, že látka obsahuje dusík, síru a sodík (kromě jiných), přibližně v poměru N : 2 : Na = 2:2: 2. Pozitivní a negativní maxima křivek cirkuiárního dichroismu dvojsodné seli antibiotika MM 13.902 byla stanovena na spektropolarimetru Cary-61 za koncentrace 0,37 mg/ml při délce 1 cm.

Výsledky jsou tyto:

λ (nm j	Δ Έ/m
186	+67,24.IO’4
221	—67,24.104
286	— 3,3 .TO4
323	— 8,2 . 104
Tabulka 10

Antibakteriální účinnnost dvojsodné soli MM 13.902 (mikrotitrační postup, těžké inokulum, 1/100 zápara, přes noc)

Organismus Minimální inhibiční koncentrace jug/ml

Bacilus subtillis A	0,15
Staphylococcus aureus (Oxford)	0,3
(Russell J	0,6
Streptococcus faecalis	3,1
Entenobaceter cloacae NI	25
Escherichia coli 10 418	0,15
JT 410	5
Klebsiella aerogenes 13	0,6
Próteus vulgaris WO 90	0,6
Prov. etuartii	0,07
Pseudomonas aeruginosa A	50
Saliffionella typhimurium CT 10	0,3
Serratia marcescens US 39	'2,5
Shigella sonnei	0,6 až 0,3
Haemophiius influenzae P 6	0,08
Neisseria gonorrhoeae	0,08

Claims (5)

1. Způsob výroby streptomycínového antibiotika, označeného MM 13.902 strukturního vzorce ho₃so c-nu-co-cm,

Λ s názvem 3-[(E)-2-acetamidoethenylthioj-6-(l-sulfatoethyl)-7-oxo-l-azabicyklo[ 3.2. 0]hept-2-en-2-karboxylová kyselina, popřípadě ve formě soli, spočívající v aerobní kultivaci kmenů Streptomyces, zvláště Streptomyces olivaceus, v živném prostředí obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku, síry a minerálních solí, za podmínek obvyklých pro kultivování Streptomyces, vyznačený tím, že vzniklá směs antibiotik označená MM 4550 se chromatograficky dělí na frakce obsahující v podstatě sůl antibiotika MM 13.902 s maximem v ultrafialovém spektru při 305 nm a další frakce, a z roztoku se izoluje sůl antibiotika MM 13.902 oddestilováním rozpouštědla za sníženého tlaku s následujícím lyofilizováním.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se chromatografické dělení provádí za použití vodného roztoku elektrolytu, pufrovaného přibližně do neutrálního bodu spolu s polárním nosným materiálem.

3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačený tím, že se dělení provádí za použití vodného roztoku chloridu sodného pufrovaného na hodnotu pH 7 spolu s nosným materiálem, obsahujícím terciární aminoskupiny nebo kvartérní amoniové skupiny.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se chromatografické dělení provádí za použití soustavy rozpouštědel, což je směs vody a alkanolu s 1 až 4 atomy uhlíku spolu s inertním nosným materiálem.

5. Způsob podle bodů 1 a 4, vyznačený tím, že se jako soustava rozpouštědel používá směs vody a isopropylalkoholu, a jako inertní nosný materiál sillkagel nebo celulóza.