Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia czystej soli zwiazku antybakteryjnego oznaczo¬ nego symbolem MM 13902.W brytyjskim patencie Nr 1 363 075 opisano spo¬ sób wytwarzania na drodze fermentacyjnej uzytecz¬ nego inhibitora (J-laktamazy przy uzyciu pewnych szczepów Streptomyces olivaceus. Dotychczas przyj¬ mowano, ze produkt, opisany w brytyjskim paten¬ cie Nr 1363 075 jest zwiazkiem zasadniczo czys¬ tym.Stwierdzono, ze w istocie jest inaczej i ze z pro¬ duktu tego mozna wyodrebnic wystepujacy w nim w niewielkiej ilosci inny skladnik, wykazujacy wy¬ soka aktywnosc antybakteryjna oznaczony symbo¬ lem MM 13902. Przyjmuje sie, ze jest on czescio¬ wo odpowiedzialny za aktywnosc antybakteryjna produktu, opisanego w brytyjskim opisie patento¬ wym Nr 1363 075, przy czym bierze on niewielki tylko udzial w procesie hamowania (3-laktamazy przez ten produkt.Poza tym, znane sa takze inne inhibitory p-lak- tamazy, wytwarzane przez szczepy z rodzaju Strep¬ tomyces, na przyklad inhibitory, opisane w zglo¬ szeniu patentowym RFN Nr 2 340 005. Jednak w przypadku tych produktów nie wykazano takiej ak¬ tywnosci antybakteryjnej, jaka przejawia zwiazek MM 13902.Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania czystej soli zwiazku antybakteryjnego, oznaczonego sym¬ bolem MM 13902.Wedlug wynalazku sposób wytwarzania soli zwia¬ zku MM 13902 polega na chromatograficznym roz¬ dzielaniu roztworu kompleksu MM 4550 na frak¬ cje, skladajace sie w zasadzie z roztworu soli zwiaz¬ ku MM 13902 i inne frakcje, a nastepnie na wyod¬ rebnieniu z otrzymanego roztworu soli zwiazku MM 13902.Okreslenie frakcje, skladajace sie w zasadzie z roztworu soli zwiazku MM 13902, odnosi sie albo do roztworu, zawierajacego pojedynczy antybiotyk, a mianowicie zwiazek MM 13902, albo do roztwo¬ ru, zawierajacego oprócz zwiazku MM 13902 lub jego soli, inny antybiotyk, jednakze w ilosci mniej¬ szej od ilosci zwiazku MM 13902. Odpowiednia za¬ wartosc zwiazku MM 13902 lub jego soli w ogólnej ilosci antybiotyków w danej frakcji wynosi 70%, a najbardziej odpowiednia 80%, korzystnie 90— 100%.Stwierdzono, ze dogodna metoda okreslania, któ¬ ra frakcja sklada sie z roztworu zwiazku MM 13902 jest badanie widma absorpcyjnego UV od¬ bieranych próbek. Frakcje wykazujace widmo UV podobne do widma, jakie przedstawia rys. 1, za¬ zwyczaj zawieraja sam zwiazek MM 13902, a wiec zasadniczo nie zawieraja innego antybiotyku, takie¬ go jak produkt kompleks MM 4550. Na ogól od¬ powiednio czyste sa te frakcje, które wykazuja wy¬ razne maksimum absorpcji UV, wynoszace okolo 305 mm.Zazwyczaj sposób wyzej opisany stosuje sie w 94 00694 3 celu wyodrebnienia zwiazku MM 13902 w postaci soli dwuzasadowej. Jednakze jednozasadowe sole zwiazku MM 13902 oraz zwiazek MM 13902 w po¬ staci wolnego kwasu na ogój nie sana tyle stabil¬ ne, aby mozna je bylo wyodrebniac z mieszanin takiej, jak kompleks MM 4550. W przypadku, kie¬ dy ^onieccne jest otrzymanie soli jednozasadowej zwiazku MM 13902, wzglednie zwiazku MM 13902 w postaci wolnego kwasu, wytwarza sie je w spo¬ sób, polegajacy na zakwaszeniu soli dwuzasadowej zwiazku MM 13902. Ze wzgledu na ich nietrwa- losc, sole jednozasadowe oraz wolny kwas sa trud- aa do otrzymywania.Jak poprzednio stwierdzono, przy pomocy me¬ tody chromatograficznej najkorzystniej wyodrebnia sie zwiazek MM 13902 w postaci soli dwusodowej.Sole zwiazku MM 13902 lepiej rozpuszczaja sie w wodnych ukladach rozpuszczalników, anizeli w roz¬ puszczalnikach silnie lipofilowych i dlatego pod¬ czas oczyszczania chromatograficznego, prowadzone¬ go w sposób wedlug wynalazku, korzystne jest sto¬ sowanie wodnych ukladów rozpuszczalników.W sposobie wedlug wynalazku korzystnie sto¬ suje sie wodne roztwory elektrolitów, zbuforowa- ne do obojetnej, w przyblizeniu, wartosci pH, lacz¬ nie z nosnikami polarnymi, takimi jak zasadowe zywice jednowyrnienne. Mozna zatem zastosowac wodny roztwór chlorku sodowego, zbuforowany zwyklym buforem, takim jak bufor fosforanowy, do wartosci pH okolo 7, lacznie z nosnikami, które moga zawierac trzeciorzedowa grupe aminowa lub czwartorzedowa grupe amoniowa. Stwierdzono, ze odpowiednimi nosnikami sa zasadowe celulozowe wymieniacze jonowe i zasadowe wymieniacze jo¬ nowe, otrzymane z poprzecznie usieciowanego dek¬ stranu. Szczególnie odpowiednim nosnikiem jest QAE Sephadex A £5, zwlaszcza wtedy, kiedy uklad rpzpuszczalników sklada sie z 0,7 molarnego roz¬ tworu chlorku sodowego w buforze fosforanowym o wartosci pH =? 7.W sposobie wedlug wynalazku korzystnie stosu¬ je sie takze uklady rozpuszczalników, skladajace sie z mieszanin wody z rozpuszczalnikami organiczny¬ mi mieszajacymi sie z woda, takim jak niski alka- nol, lacznie z obojetnym nosnikiem, takimi jak zel krzemionkowy lub celuloza. Szczególnie odpowied¬ nim ukladem rozpuszczalników, stosowanym lacz¬ nie z celuloza, jak mieszanina wody i izopropano- lu, a zwlaszcza mieszanina 7 : 3 izopropanolu i wo¬ dy.Jednakze produkt, wytworzony w sposób jak wy¬ zej opisano, przy uzyciu zywic jonowymiennych, zawiera bardzo duza ilosc chlorku sodowego i, ko¬ rzystnie, dokonuje sie odsolenia otrzymanego roz¬ tworu. Odsolenie prowadzic mozna przy pomocy metody, polegajacej na przepuszczaniu roztworu od góry do dolu przez kolumne, wypelniona substancja lipofilowa, na której zostaje zaadsorbowany zwia¬ zek MM 13902,, ale która rne adsorbuje chlorku sodowego. Odpowiednimi materialami do wypelnia¬ nia kolumny sa: miedzy innymi, polistyreny, takie jak Amberlite XAD4. Mocna tez posluzyc sie meto¬ da, saczenia zelowego, stosujac substancje takie, jak poprzecznie usieciowane dekstrany, na przyklad Sephadex G 25, lub zele polikrylóamidowe, takie 006 4 '•¦;.. V. ¦¦*?: f\ J.0^ * ; jak Biogel P 24. Do elucji antybiotyku z kolumny uzywa sie wody, wodnego metanolu i tym podob¬ nych. ., -».-¦¦¦¦..-,¦, Po. wytworzeniu w sposób, jak wyzej opisano, za- danych roztworów, sól dwuzasadowa zwiazku MM 13902 mozna otrzymac w postaci stalej przy pomo¬ cy usuniecia, w lagodnych warunkach, rozpuszczal¬ nika. Stwierdzono, ze odpowiedni .sposób otrzymy¬ wania tego zwiazku w poataci stalej polega na od- parowaniu pod zmniejszonym cisnieniem i zliofi- lizowaniu odebranych frakcji, zawierajacych zwia¬ zek MM 13902.Jesli jest to pozadane, proces wyzej opisany pro¬ wadzi sie w dwóch, lub wiecej stadiach. Na przy- klad, roztwór kompleksu MM 4550 rozdziela sie na frakcje zawierajace zwiazek MM 13902 lub je¬ go sól, zanieczyszczone innymi czynnikami anty- bakteryjnymi, wystepujacymi w ilosci, siegajacej wagowej zawartosci zwiazku MM 13902 lub jego soli. Nastepnie otrzymane frakcje poddaje sie liofo- lizacji, otrzymujac produkt, zawierajacy, na przy¬ klad, okolo 50—60% zwiazku MM 13902 lub jego soli. Z kolei otrzymany produkt poddaje sie chro¬ matografii, otrzymujac produkt zawierajacy, na przyklad, 90—100% zwiazku MM 13902 lub jego soli.W niniejszym opisie terminem kompleks MM 4550 oznaczono produkt, który pierwotnie w bry-' tyjskim opisie patentowym Nr 1363 075 nazwano MM 4550. Kompleks MM 4550 wytworzony w spo¬ sób, jak opisano w brytyjskim opisie patentowym Nr 1363 075, nie okazal sie produktem czystym.Zawiera on, w róznych wzajemnych stosunkach ilosciowych, sole zwiazku MM 4550, jak to opisane w dalszej czesci opisu, sole zwiazku MM 13902, oraz znaczne ilosci innych zwiazków. Kompleks MM 4550 nie wykazuje charakterystycznego widma UV, wykazywanego przez zwiazek MM 13902.Wartosc Iso kompleksu MM 4550, wytworzonego 40 w sposófe, jak .opisano w brytyjskim opisie paten¬ towym Nr 1 363 075, nie zawsze, ponizej 0,0004 g/ml.Wzajemny stosunek ilosciowy zawartosci soli zwia¬ zku M^E 4550 do zawartosci soli zwiazku MM 13902, obecnych w produkcie MM 4550 (kompleks) 45 jest w najwyzszym stopniu zmienny i sadzi sie, ze zalezy on od takich czynników, jak uzyty, w pro¬ cesie szczep drobnoustroju i/lub dokladnosc zasto¬ sowanej metody wyodrebniania. Ogólnie kompleks zawiera wiecej zwiazku MM 4550, anizeli zwiazku 50 MM 13902. Sposób wytwarzania kompleksu MM 4550 podano dalej.Stosowany w opisie termin' zwiazek MM 4550 odnosi sie do zasadniczo czystego zwiazku, bedace¬ go silnym inhibitorem p-laktamazy i wykazujace- 55 go w pewnym stopniu aktywnosc antybakteryjna.Wlasciwosci zwiazku MM 4550 podano w dalszej czesci opisu.Zwiazek MM 13902 jest stalym kwasem karbo- ksylowym, który w postaci zasadniczo czystej soli 60 sodowej odznacza sie nastepujacymi wlasciwoscia¬ mi: 1) jest dobrze rozpuszczalny w wodzie, roz¬ puszczalny w metanolu i zasadniczo nie¬ rozpuszczalny w chloroformie, eterze etylowym i weglowp4prach, 2) w roztworze wodnym wyka- 65 zuje charakterystyczne widmo UV, przy czym jedno94 006 6 z maksimów absorpcji ma wartosc okolo 305 mm, 3) w stezeniu 0,4% wag./wag., w swiezo sporza¬ dzonej tabletce z KBr, wykazuje charakterystyczne widmo IB z maksimami absorpcji o wartosci, mie¬ dzy innymi okolo 3 450, 2 950, 1750, i 1620, 1510, 1 400 i 1 260 cmH, 4) w DzO wykazuje charaktery- styczne widmo NMR, odznaczajace sie miedzy in¬ nymi, a) para dubletów w niskim polu przy okolo 2,85 t i 4,00 t, przy wartosci stalych sprzezenia wy¬ nosza okolo 14 Hz, b) dubletem przy okolo 8,55 r i c) ostrym singletem przy okolo 8,00 r, 5) wyka¬ zuje aktywnosc antybakteryjna wobec rozmaitych gatunków, miedzy innymi wobec szczepów Staphy- lococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes. Proteus mirabilis, Salmonella typhi i Pseudomonas aeruginosa, 6) dodany do ampicyliny wzmaga synergicznie jej aktywnosc wobec organizmów, w tym wobec szczepów Esche¬ richia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morgami i Staphylococcus aureus (Russell).Czysta sól dwusodowa zwiazku MM 13902 jest inhibitorem P-laktamazy i wykazuje wartosc I50, jak opisano w dalszej czesci opisu, wobec (3-lakta- mazy Escherichia coli B 11 0,001 g/ml — 0,0001 g/ml.Czysta sól dwusodowa zwiazku MM 13902 wy¬ kazuje w chromatografii cienkowarstwowej na ce¬ lulozie nastepujace przyblizone wartosci R*: a) uklad n- butanol (izopropanol) woda — 7:7:6 obj./obj., Rf = 0,72, b) uklad izopropanol/woda — 7:3 obj./obj., Rf = 0,85, c) uklad n-butanol/etanol/ /woda — 7:7:6, Rf = 0,81, d) uklad n-propanol/ /woda — 4:1, Rf = 0,75.Zwiazek MM 13902 stanowi czynnik antybakte- ryjny, zawierajacy siarke, którego sole sa wytwa¬ rzane podczas prowadzenia hodowli Streptomyces olivaceus ATCC 31126, i który w postaci wolnego roztworu soli dwusodowej wykazuje maksimum absorpcji UV okolo 305 mm i okolo 225 mm, za¬ sadniczo takie, jakie przedstawia rys. 1.Zwiazek MM 13902 stanowi, poza tym, czynnik antybakteryjny, który w postaci zasadniczo czystej soli dwusodowej, w stezeniu 0,4% wag./wag., w swiezo sprzadzonej tabletce z KBr, wykazuje wid¬ mo absorpcji IS zasadniczo takie, jakie przedsta¬ wia rys. 2 i który w postaci zasadniczo czystej soli dwusodowej, w swiezo sporzadzonym roztworze P20, wykazuje widmo NMR, jak przedstawia rys. 3.Zwiazek MM 13902 w postaci wolnego kwasu moze okazac sie niestabilny. Odpowiednimi solami zwiazku MM 13902 sa sole dwuzasadowe. Do naj¬ bardziej odpowiednich soli tego rodzaju naleza sole z jonami farmaceutycznie dozwolonymi, takimi jak jon sodowy, potasowy, wapniowy, magnezowy, gli¬ nowy, jon amonowy podstawiony w zwykly spo¬ sób i tym podobne. Szczególnie korzystnymi solami sa sole metali alkalicznych, takie jak sól sodowa lub potasowa, na przyklad sól dwusodowa lub dwupotasowa.Odpowiednim zwiazkiem MM 13902, lub jego so¬ lami, wytwarzanymi w sposób wedlug wynalazku, sa zwiazki o czystosci co najmniej 50%, bardziej odpowiednimi sa zwiazki o czystosci co najmniej 75%, a najkorzystniejszymi sa zwiazki o czystosci co najmniej 80%, na przyklad o czystosci 90—100%.Zwiazek MM 13902 mozna otrzymac przez ho¬ dowle szczepu z rodzaju Streptomyces, a nastep¬ nie z hodowli wyodrebnia sie zwiazek MM 13902 lub jego sól.Stwierdzono, ze odpowiednimi szczepami, wy- twarzajaeymi zwiazek MM 13902, sa szczepy Strep¬ tomyces olivaceus i organizmy pokrewne. Najbar¬ dziej odpowiednimi organizmami, uzytymi w spo¬ sobie wedlug wynalazku sa takie szczepy Strepto¬ myces olivaceus, jak szczepy ATCC 21379, 21380, 21381, 21382, 31126 lub ich mutanty.Streptomyces olivaceus i organizmy pokrewne wykazuja nastepujace podstawowe cechy charak*- terystyczne: a) wytwarzaja zarodnikujaca grzybnie powietrzna o zabarwieniu szarym lub zóltym, b)pod wzgledem morfologicznym ich sporofory na¬ leza nó typu Rectiflexibiles lub Spirales, c) ich zarodniki maja powierzchnie gladka, d) nie wytwa¬ rzaja malanihy. Wlasciwosciami tymi odznaczaja siei gatunki wymienione w ponizszych tablicach Szczególnie korzystnym organizmem jest Strep¬ tomyces olivaceus ATCC 31126.W niniejszym opisie termin „hodowla" odnosi sie do odpowiednio kierowanego wzrostu organiz¬ mu w warunkach aerobowych, prowadzonego w obecnosci przyswajalnych zródel wegla, azotu, siar- ki i soli mineralnych. Tego rodzaju wzrost w wa¬ runkach aerobowych moze odbywac sie na podlozu stalym lub pólstalym, albo w podlozu plynnym, w którym sa rozpuszczone lub zawieszone skladniki pokarmowe. Hodowle mozna prowadzic metoda powierzchniowa lub podpowierzchniowa.W sklad podloza moga wchodzic produkty natu¬ ralne lub zwiazki o znanym skladzie chemicznym.W sposobie wedlug wynalazku szczególnie odpo¬ wiednie sa podloza, zawierajace zlozone skladniki pokarmowe, takie jak ekstrakt drozdzowy, maka sojowa i tym podobne. Stwierdzono, ze korzystne jest dodanie do podloza jonów kobaltu i siarcza¬ nowych oraz weglanu wapniowego.Korzystnie hodowle prowadzi sie w temperatu¬ rze 28±2°C, uzyskujac w tych warunkach dobre wydajnosci antybiotyku. Korzystnie proces fer¬ mentacyjny konczy sie po uplywie 2—3 dni od jego rozpoczecia.W niniejszym opisie termin „mutant" odnosi sie do kazdego mutantu szczepu, który utworzyl sie spontanicznie pod wplywem czynnika zewnetrzne¬ go, zastosowanego rozmyslnie albo inaczej. Do od¬ powiednich sposobów otrzymywania mutantów szczepów naleza metody, podane przez H. I. Adlera w „Techniaues for the Development of Micro — organisms", zamieszczonych w „Radiation and Radioisotopes for Industrial Micro — organisms", Proceadings of a Symposium, Wieden, 1973, strona 241, International Atomie Energy Authority. Do sposobów tych naleza: 1) promieniowanie jonizu¬ jace (takie jak promieniowanie X i promienie y» promieniowanie UV, promieniowanie UV lacznie z dzialaniem czynnika uczulajacego na swiatlo, takiego jak 8-metoksypsoralen), kwas azotanowy, hydroksyloamina, analogi zasady pirymidynowej, takie jak 5-bromouracyl, akrydyny, czynniki alki¬ lujace (takie jak iperyt, etylometanosulfonian), nadtlenek wodoru, fenole formaldehyd, cieplo, oraz 40 45 50 55 6094006 8 2) techniki genetyczne, takie jak rekombinacja, transformacja, transdukcja, lizogenizacja, konwersja lizogenna i selektywne techniki otrzymywania mu¬ tantów spontanicznych.Stwierdzono, ze zastosowanie czynnika, wywo¬ lujacego mutacje, moze prowadzic do otrzymania organizmów, wykazujacych zdolnosc do wytwarza¬ nia zwiekszonych ilosci zadanych antybiotyków. Na przyklad, w wyniku napromieniowania hodowli Streptomyces olivaceus ATCC 21379, a nastepnie wyizolowania szczepu, dajacego najwieksza strefe zahamowania wzrostu w próbie KAG, opisanej w dalszej czesci opisu, otrzymano szczep Streptomyces olivaceus ATCC 31126. ATCC 31126 zostal takze zdeponowany w Holandii pod numerem CBS 155.75'.Na ogól wszystkie procesy wyodrebniania i oczyszczania stosowane podczas otrzymywania za¬ danego antybiotyku, nalezy prowadzic w tempera¬ turze niepodwyzszonej, na przyklad w temperaturze ponizej 20°C, korzystniej w temperaturze, nie wyzszej niz 12°C.Zazwyczaj zadany produkt otrzymuje sie w za¬ sadzie z przesaczu hodowli, wobec czego pierwsze stadium procesu wyodrebniania korzystnie stanowi usuniecie czesci stalych brzeczki pofermentacyjnej, na przyklad przy pomocy odsaczenia.Surowy zwiazek MM 13902 lub jego sól mozna wyodrebnic ze sklarowanego przesaczu hodowli przy pomocy zaadsorbowania go na materiale ak¬ tywnym, takim jak wegiel aktywowany i temu podobne, a nastepnie wymyciu zadanego zwiazku z materialu aktywnego rozpuszczalnikiem, takim jak wodny aceton. Zazwyczaj procesowi takiemu poddaje sie sól dwuzasadowa zwiazku MM 13902.W inny sposób surowy zwiazek MM 13902 lub jego sól moza wyodrebnic z przesaczu hodowli przy pomocy ekstrakcji, stosujac lipofilowa sól amoniowa i rozpuszczalnik niemieszajacy sie z woda. Sposób ten czesto jest skuteczniejszy od wyzej opisanego sposobu, polegajacego na adsorbcji.Po odparowaniu rozpuszczalnika organicznego pod zmniejszonym cisnieniem stosuje sie zwiazek MM 13902 w postaci podstawionej soli amonio¬ wej. Korzystnie pierwotny roztwór podstawionej soli amoniowej zwiazku MM 13902 poddaje sie re- ekstracji do fazy wodnej przy uzyciu roztworu jodku metalu alkalicznego, takiego jak jodek so¬ dowy. W ten sposób otrzymuje sie zwykle wodny roztwór surowej soli dwuzasadowej zwiazku MM 13902.Surowy zwiazek MM 13902 lub jego sole, otrzy¬ mane w sposób, jak wyzej opisano, zazwyczaj poddaje sie chromatografii, wykonanej w sposób, jak wyzej opisano, w celu wytworzenia zwiazku o odpowiedniej czystosci.Zwiazek MM 13902 moze byc wykorzystany do produkcji srodków farmaceutycznych.Najbardziej odpowiednimi srodkami sa zwiazki, zawierajace sól sodowa lub potasowa zwiazku MM 13902, na przyklad sól dwusodowa lub dwu- potasowa zwiazku MM 13902.Srodki takie moga miec postac odpowiednia do stosowania doustnego, miejscowego lub pozajeli¬ towego, na przyklad postac tabletek, kapsulek, kremów, syropów, proszków do odtwarzania pier¬ wotnej postaci, oraz postac jalowa, odpowiednia do wstrzykiwania lub wlewów. Srodki te moga zawierac zwykle, farmaceutycznie dozwolone sklad¬ niki, takie jak rozcienczalniki, spoiwa, barwniki, substancje zapachowe, srodki konserwujace, czyn¬ niki ulatwiajace rozpad i tym podobne, zgodnie z praktyka farmaceutyczna sporzadzania postaci leków, zawierajacych antybiotyki, takie jak pe¬ nicyliny i cefalosporyny. io Srodki farmaceutyczne moga zawierac sam zwia¬ zek MM 13902, lub jego sole, jako jedyny czynnik terapeutyczny, wzglednie zwiazek MM 13902 lacz¬ nie z antybiotykami (3-laktamowymi. Do odpo¬ wiednich antybiotyków |3-laktamowych naleza an- tybiotyki wrazliwe na (3-laktamazy, jak równiez wykazujace w pewnym stopniu istotna opornosc wobec P-laktamaz. Do antybiotyków (5-laktamo- wych tego rodzaju naleza ampicylina, amoksycy- lina, penicylina benzylowa, penicylina fenoksyme- tylowa, propicylina, cefalorydyna, cefoksytyna, ce- falotyna, cefaloksyna, karbenicylina, tikarcylina oraz; estry tych zwiazków, ulegajace hydrolizie in vivo, takie jak estry fenylowy, tolilowy lub inda- nylowy karbenicyliny lub tikarcyliny, albo estry acetoksymetylowy, trójmetyloacetoksymetylowy lub ftalidylowy ampicyliny, penicyliny benzylowej, ameksycyliny, cefalorydyny, cefaloglicyny i tym podobne.Wzajemny stosunek ilosciowy zwiazku MM 13902, lub jego soli, do antybiotyku fl-laktamowego wy¬ nosi zazwyczaj 10:1—1:10, na przyklad 3:1—1:3.Calkowita ilosc czynników antybakteryjnyeh, za¬ wartych w dawce jednostkowej wynosi na ogól 50—1 500 mg, korzystnie 100—1000 mg.W leczeniu chorób dróg moczowych, dróg odde¬ chowych, tkanek miekkich i tym podobnych, srod¬ ki farmaceutyczne, zawierajace zwiazek MM 13902, podaje sie jeden raz lub kilka razy dziennie, na przyklad 2—4 razy dziennie. Srodki mozna sto- 40 sowac do leczenia takich chorób, jak zapalenie oskrzeli, rzezaczka, zapalenie ucha srodkowego, za¬ palenie gruczolu sutkowego i tym podobnych.Wynalazek objasniaja nastepujace przyklady.Opis metody 1. Oznaczanie I50 45 Wartosc I50 oznacza ilosc zwiazku, potrzebna do zahamowania w 50°/o hydrolizy ampicyliny przez |3-laktamaze Escherichia coli B 11. Organizm ten zawiera P-laktamaze kontrolowana przez czynnik R. Enzym ten jest enzymem typu Ilia, wedlug 50 systemu klasyfikacji, podanego przez Richmonda i Sykesa w Adv. in Microbiol. Physiol., 9, 31 (1973).Szybkosc katalizowanej przez (3-laktamaze hy¬ drolizy ampicyliny do kwasu penicylinowego moz¬ na sledzic przy pomocy próby skrobiowo-jodo- 55 metrycznej, polegajacej na oznaczaniu szybkosci tworzenia kwasu penicylinowego poprzez okreslenie odbarwiania sie kompleksu skrobi z jodem. Meto¬ de te, jak równiez preparatyke P-laktamazy opi¬ sali M. Cole, S. Elson i P. D. Fullbrook w Bio- 60 chemical Journal, 1972, 127, 295—308. Do metody tej wprowadzono poprawke polegajaca na tym, ze próbke inhibitora, przed wprowadzeniem ampi¬ cyliny jako substratu, preinkubowano z enzymem w ciagu 15 minut w temperaturze 37°C. Sposób 65 postepowania byl nastepujacy:94 006 9 10 Odczynniki Bufor: 0,05 molarny roztwór fosforanu potaso¬ wego o wartosci pH = 7.Roztwór skrobii z jodem: sporzadzony w sposób, podany przez Novicka w Biochemical J., (1962), 83, 236.Substrat: ampicylina w buforze w stezeniu 40 ^ig/ml. f3-laktamaza: enzym, wyizolowany z E. coli Bil w sposób, podany przez Cole i wsp., w Biochem. J., (1972), 127, 295. Preparat enzymu rozcienczono bu¬ forem w taki sposób, aby spadek gestosci optycznej w warunkach reakcji niehamowanej wynosil okolo 0,3 jednóstki/100 sekund. Mozna takze uzyc inne szczepy E. coli, a zwlaszcza te szczepy, które za¬ wieraja czynnik R, na przyklad R TEM.Warunki reakcji: reakcje prowadzono w kuwe¬ tach 1 cm, w temperaturze 37°C, w spektrofoto¬ metrze SP 800 Pye Unicam. Do aparatu wstawia¬ no 4 kuwety z badanymi próbami oraz odpowia¬ dajace im próby slepe. Pierwsza kuweta, kontrol¬ na, nie zawierala inhibitora, kuwety druga, trzecia i czwarta natomiast zawieraly inhibitor w róznych rozcienczeniach.I tak: Odczynniki Odczynnik skrobiowo- -jodowy (3-laktamaza E. coli Bufor Inhibitor w buforze Substrat (dodawano po | inkubowaniu powyz¬ szych mieszanin w ciagu 15 minut w temperaturze 37°C.Kuweta z badana próba 1,0 ml 0,1 ml 0,3 ml 0,1 ml 1,0 ml Kuwetu z próba slepa 1,0 ml —. 0,4 ml 0,1 ml 1,0 ml Po zakonczeniu reakcji oznaczano zmiane gestos¬ ci optycznej przy dlugosci fali 590 nm i mierzono szybkosc reakcji jako zmiane wielkosci gestosci optycznej/100 sekund, w przedziale czasowym 3— 6 minut. Próbke inhibitora rozcienczano w taki sposób, aby uzyskac rozcienczenie, potrzebne do zmniejszenia szybkosci reakcji o 50°/o w stosunku do reakcji kontrolnej, bez udzialu inhibitora.Opis metody 2. Próba KAG Próba KAG stanowi metode ustalania obecnosci inhibitora |3-laktamazy w brzeczkach fermentacyj¬ nych lub w poszczególnych stadiach wyodrebnia¬ nia. Plynne podloze agarowe posiewa sie w tem¬ peraturze 45°C odpowiednim szczepem Klebsiella aerogenes, produkujacym (3-laktamaze, po czym miesza sie z jalowym roztworem penicyliny G, uzytym w ilosci wystarczajacej do uzyskania ste¬ zenia 6 ng penicyliny G/ml uzyskanego podloza agarowego. Podloze to, rozlane na plytke Petri'ego, pozostawia sie w celu zestalenia, po czym wyko¬ nuje sie w warstwie agaru jednakowej wielkosci dolki cylindryczne przy pomocy jalowego metalo¬ wego wycinaka. W dolki wprowadza sie badane roztwory, po czym plytke inkubuje sie w stalej temperaturze, w zakresie 27—37°C. Podczas inku¬ bacji inhibitor, zawarty w badanym roztworze, dy- funduje z dolka do agaru i hamuje tam dzialanie s (Maktamazy, wytwarzanej przez komórki Klebsiella.Penicylina G jest chroniona przed zniszczeniem przez P-laktamaze, wobec czego jej ilosc wystar¬ cza do zapobiegania wzrostowi Klebsiella. W tych miejscach agaru, do których inhibitor nie przenika w dostatecznym stezeniu, penicylina G ulega znisz¬ czeniu pod wplywem dzialania p-laktamazy, co z kolei umozliwia gesty wzrost Klebsiella. Wokól dolków, zawierajacych inhibitor tworza sie przej¬ rzyste okragle strefy zahamowania wzrostu Kleb¬ siella. Rozmiary kazdej strefy zaleza od stezenia inhibitora w badanym roztworze. Aktywnosc ba¬ danych roztworów, wyrazana w dowolnie, przyje¬ tych jednostkach/mililitr, wylicza sie przez odnie¬ sienie do krzywej standardowej, podajacej zalez¬ nosc srednicy strefy od logarytmu stezenia inhibi¬ tora. Ten sam spoaób postepowania mozna wyko¬ rzystac w bioautografii.; Opis metody 3. Otrzymywanie produktu MM 4550 (kompleks) odpowiadajacego produktowi opisanemu w brytyjskim opisie patentowym nr 1363 075 Prowadzono hodowle Streptomyces olivaceus ATCC 21379 na skosie agarowym w butli Roux, w ciagu 7 dni, w temperaturze 28°C. trzyto podloze agarowe o nastepujacym skladzie: Skladnik Dosc (g/l) Ekstrakt drozdzowy 10,0 Jednowodzian glukozy 10,0 Agar 15,0 . Woda wodociagowa do 11 Jako „ekstrakt drozdzowy" uzyto produkt „Yea- tex" produkcji Bovril Food Ingredients, natomiast „agar" produkcji Oxoid Limited.Podloze przed sterylizacja doprowadzono do war¬ tosci pH = 6,8.Do hodowli w butli Roux wprowadzono 50 ml jalowej wody dejonizowanej, zawierajacej 0,02% Tween 80 (zastrzezony znak ochronny). Tween 80 jest to jednoester kwasu olejowego i sorbitu, sprze¬ zony z tlenkiem etylenu. Nastepnie przy pomocy wytrzasania utworzono zawiesine zarodników, któ¬ ra wprowadzono, jako inokulum, do 75 1 jalowego podloza posiewowego w 100 1 fermentorze ze stali nierdzewnej.Uzyto podloze posiewowe o nastepujacym skla¬ dzie: Skladnik Ilosc (g/l) Maka sojowa 10,0 Jednowodzian glukozy 20,0 Woda wodociagowa do 11 Jako „make sojowa" uzyto produkt „Arkasoy 50", produkcji British Arkady Co, Ltd.Do podloza, przed sterylizacja, dodano jako sro¬ dek przeciwpienny, olej sojowy, zawierajacy 10°/o obj./obj., preparatu Pluronic L 81, w ilosci 50 ml. 40 45 50 55 60u um 12 Pluronic Ju 81 jest to polimer blokowy tlenku etylenu i tlenku propylenu, produkcji Jacobsen van den Berg U. K. Ltd.Podloze w fermentorze poddano sterylizacji para w temperaturze 120°C w ciagu 20 minut. Hodowle posiewowa mieszano przy pomocy mieszadla tar¬ czowego z lopatkami o srednicy 20 cm przy szyb¬ kosci 340 obrotów/minute, wprowadzajac przez belkotke jalowe powietrze w ilosci 150 litrów/mi¬ nute. Tank wyposazony byl w przegrody. Utrzy¬ mywano temperature 28°C. Po uplywie 45 godzin inkubacji w tych warunkach pobrano 7,5 1 otrzy¬ manej hodowli i wprowadzono ja, jako inokulum, do 1$0 1 jalowego podloza fermentacyjnego w 300 1 fermentorze ze stali nierdzewnej. Uzyto podloza ffermentacyjnego o nastepujacym skladzie: Skladnik Dosc (g/l) Maka sojowa (Arkasoy 50) 10,0 Jednowodzian glukozy 20,0 Kreda (stracony weglan wapniowy) 0,2 Chlorek kobaltowy (CoCl2-6H2G) 0,001 Woda wodociagowa do 11 Dodano 300 ml oleju sojowego, zawierajacego % preparatu Pluronic L SI, jako srodek przeciw- pienny. Proces fermentacyjny zakonczono po uply¬ wie 48 godzin i brzeczke pofermentacyjna poddano klarowaniu przy pomocy odwirowania. Sklarowana brzeczka wykazywala 50°/o zahamowania w próbie enzymatycznej przy rozcienczeniu 1/100 000. 100 1 sklarowanej brzeczki mieszano z 12 kg mokrej wagi celulozy jonowymiennej Whatman DE 32 w formie octanowej. Jest to celuloza mi¬ krokrystaliczna, podstawiona grupami dwuetylo- aminoetylowymi, produkcji H. Reeve Angel & Co.Zawiesine przesaczono i z celulozy wymyto pro¬ dukt MM 4550 (kompleks) przy pomocy 12 1 0,5 molarnego siarczanu potasowego. Otrzymany eks¬ trakt zatezono do objetosci 6 1 w wyparce z pod¬ noszaca sie warstewka cieczy pod zmniejszonym cisnieniem, w temperaturze ponizej 30°C. Dodano 12 1 acetonu, wytracajac duza ilosc siarczanu po¬ tasowego. Otrzymany roztwór przesaczono i zate¬ zono do objetosci 200 ml przy pomocy odparowania pod zmniejszonym cisnieniem, w temperaturze po¬ nizej 30°C. Otrzymany produkt naniesiono na ko¬ lumne o wymiarach 76 mmX2 m, wypelniona zy¬ wica Amberlite XAD-4. Jest to niejonowa zywica polistyrenowa produkcji Rhon & Haas Co.Do wymycia kolumny uzyto wode dejonizowana, odbierajac frakcje po 140 ml. Polaczone frakcje, w których przy pomocy próby KAG stwierdzono obecnosc substancji czynnej, o lacznej objetosci 2,2 1, zatezono do objetosci 275 ml przy pomocy ultrafiltracji z uzyciem blony Amicon UM-05 o srednicy 150 mm, produkcji Amicon Ltd. Ope¬ racje prowadzono pod cisnieniem azotu 4,2 kG/cm2.Otrzymany koncentrat zliofilizowano, otrzymujac 2,2 g brazowego proszku o wartosci I50 0,004 ^g/ml-1 g proszku rozpuszczono w 1 1 0,2 molarnego siar¬ czanu sodowego i roztwór ten zmieszano z 1 1 2% wagVobj. roztworu wodorosiarczanu cztero-n- -butyloamoniowego, produkcji AB Astra, w dwu- chlorometanie. Faze dwuchlorometanowa, po od¬ staniu, oddzielono, oziebiono do temperatury —7Q°C, przesaczono w celu usuniecia lodu, po czym zatezono przy pomocy odparowania do ofejeto&ci ml. Do koncentratu dodanp 400 ml eteru natto- s wego 40—60PC, pp czym odwirowano osad, który rozpuszczono w 10 ml dwuchlorometanu i poddano ekstrakcji 10 ml wody, zawierajacej 80 mg jodku barowego i 70 mg weglanu barowego. Rozdzielono utworzone fazy, $aze wodna przesaczono i dopro¬ wadzono do wartosci pH = §•§. Roztwór ten zliofili¬ zowano, otrzymujac zólty proszek, który przemyto acetonem w celu usuniecia nadmiaru jodku baro¬ wego, po czym jasnozólta pozostalosc odwirowano i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem. Wydaj¬ nosc: 13 mg, wartosc I*, 0,0004 |jig/ml.Opis metody 4. Adsorpcja na weglu aktywowa¬ nym przesaczu hodowli w celu otrzymania pro¬ duktu opisanego w brytyjskim opisie patentowym nr 1361075 W przypadku przesaczu hodowli, wytworzonego w sposób, jak wyzej opisano w opisie metody 3, otrzymywano w antybakteryjnej próbie dyfuzji do agaru wobec Klebsiella aerogenes strefe zahamo¬ wania o srednicy dlugosci 17 mm, w próbie KAG strefe zahamowania o srednicy dlugosci 38 mm oraz I50 przy rozcienczeniu 1/100 000. 170 1 sklaro¬ wanego przesaczu hodowli przepuszczono w tem¬ peraturze 5°C od dolu ku górze z szybkoscia 800— 1000 ml/minute przez kolumne o srednicy okolo 23 cm, wypelnionej do wysokosci 40 cm weglem aktywowanym Farnell BO, produkcji Dearborn Chemicals Ltd., 60—80 mesh, przemyto 1 nor¬ malnym kwasem solnym i zbuforowano do war¬ tosci pH = 6 przy pomocy roztworu fosforanu. Na¬ stepnie odmyto od wegla brzeczke przy pomocy 1 wody dejonizowanej i kolumne, w temperatu¬ rze 20°C poddano elucji 20**/© acetonem. Polaczone frakcje, zawierajace substancje czynna, o ogólnej objetosci 10 1 zatezono przy pomocy odparowania pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze po¬ nizej 30°C do objetosci 6 1, po czym zliofilizowano^ otrzymujac 282 g surowego produktu MM 4550 (kompleks), o wartosci I50 4),05 {Ag/nil. Odzysk inhi¬ bitora enzymu: 22%.Podobne wyniki uzyskano przy uzyciu innego wegla aktywowanego, a mianowicie wegla Darco- granular, produkcji Honeywill—Atlas Ltd.Opis metody 5. Chromatografia przesaczu hodowli na zywicy jonowymiennej w celu otrzymania pro¬ duktu opisanego w brytyjskim opisie patentowym nr 1363 075 Kolumne o srednicy wewnetrznej dlugosci 1 cm wypelniono do wysokosci 6 cm zywica jonowy¬ mienna Dowex 21 K, 20—50 mesh USA, w formie chlorkowej. Jest to zywica polistyrenowodwuwi- nylobenzenowa, produkcji BDH Chemicals Ltd., za¬ wierajaca grupy zasadowe.Otrzymane zloze o objetosci 4,7 ml przemyto mniej wiecej 4 razy po 4,7 ml 5°/o wodnego meta¬ nolu, a nastepnie 1 raz 4,7 ml wody destylowanej.Na kolumne te naniesiono 2 litry przesaczu ho¬ dowli, otrzymanego scisle w sposób, opisany wy¬ zej w opisie metody 3. Nastepnie zywice przemy¬ to 508/* wodnym metanolem, w celu usuniecia za¬ nieczyszczen. 80 85 40 45 50 55 600460* 13 14 Z zywicy produkt MM 4550 (kompleks) wymyto 50% wodnym metanolem, zawierajacym !Wii NaCl.W ponizszej tabliey I uzyskane wyniki podano w jednostkach aktywnosci* Zalozono zawartosc 8 jednostek produktu MM 4550 (kompleks) w 1 ml przesaczu hodowli. Odbierane z kolumny frakcje poddawano badaniu przy pomocy dyfuzyjnej me¬ tody okreslania aktywnosci antybakteryjnej wobec Klebsiella aerogenes. Jednostki aktywnosci wyli¬ czono przez odniesienie do krzywej standardowej, podajacej zaleznosc wielkosci srednicy strefy za¬ hamowania od aktywnosci w j/ml, dla róznych rozcienczen przesaczu hodowli, uzytego jako wzorca.Z danych, zamieszczonych w ponizszej tablicy I, wynika, ze uzycie kolumny jest skutecznym spo¬ sobem zatezania produktu MM 4550 (kompleks).Frakcje 2—5 wlacznie zawieraly 60% aktywnosci w calkowitej objetosci, wynoszacej tylko 37 ml.Calkowita zawartosc suchej masy w tych frakcjach wynosi okolo 210 mg, podczas gdy na kolumne naniesiono 35 g substancji stalej.Tablica I Wyniki chromatografii na zywicy Dowex 21 K Próbka 1 Przesacz hodowli Ekstrakt 1 Ekstrakt 2 Ekstrakt 3 Ekstrakt 4 Frakcja 1 Frakcja 2 Frakcja 3 Frakcja 4 Frakcja 5 Frakcja 6 Frakcja 7 Frakcja 8 pH 2 6,5 6,9 7,0 7,0 7,0 7,8 7,8 7,7 7,7 7,6 7,5 7,6 7,6 Objetosc (ml) 3 1970 550 525 595 300 7,0 7,0 8,5 ,0 11,5 11,0 14,2 ,0 J/ml 4 8 <1 <1 <1 <1 84 328 440 320 160 80 66 33 Razem: Calko¬ wita akty¬ wnosc 760 | <100 <100 <100 <100 588 2 296 3 740 2 200 1840 880 937 660 13 141 Opis metody 6. Ekstrakcja jonowo-asocjacyjna przesaczu hodowli w celu otrzymania produktu, opisanego w brytyjskim opisie patentowym nr 1363 075 Do 10 1 sklarowanego przesaczu hodowli, wy¬ tworzonego w sposób, jak wyzej opisano w opisie metody 3, dodano 248 g siarczanu sodowego, po czym otrzymany roztwór poddano ekstrakcji 10 1 2% roztworu wodorosiarczanu cztero-n-butylo- amonowego w dwuchlorometanie, przy mieszaniu w ciagu 30 minut. Utworzone fazy rozdzielono i faze dwuchlorometanowa oziebiono do tempera¬ tury 2°C. Zawieszona w niewielkiej ilosci wode usunieto przy pomocy przesaczenia przez bibule Whatman Nr 1 PS. Otrzymany roztwór dwuchlo- ie 26 ae 4ft rometanowy zatezono do objetosci 20 ml przy po¬ mocy odparowania pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze ponizej 30°C. Po dodaniu 40d ml eteru naftowego 40—60°C wytracil sie gumowaty produkt, zawierajacy produkt MM 4550 (kompleks).Otrzymany gumowaty produkt odwirowano, roz¬ puszczono w 50 ml dwuchlorometanu i poddano ekstrakcji 50 ml wody, zawierajacej 1 g jodku ba¬ rowego i 1 g weglanu barowego, przy wytrzasaniu w ciagu 2 minut. Obecne w mieszaninie substancje stale odsaczono i rozdzielono utworzone fazy. Faze wodna, zawierajaca produkt MM 4550 (kompteks) w postaci soli barowej, doprowadzono do wartosci pH = 6,5, a nastepnie zliofilizowano, otrzymajac 317 mg surowego produktu MM 4550 (kompekS), o wartosci I50 0,001 jjig/ml.Opis metody 7. Sposób wytwarzania czesciowo oczyszczonego kompleksu antybiotycznego, zawie¬ rajacego zwiazek MM 4550 i zwiazek MM 1390% przy pomocy wodorosiarczanu cztero-n-butykwnio- niowego 12,5 g surowego produktu MM 4550 (kompleks), wytworzonego w sposób, jak wyzej opisano? w opi¬ sie metody 4, rozpuszczono w 125 ml wody, po czym poddano ekstrakcji 125 ml 10% Wag./obj. roztworu wodorosiarczanu cztero-n-butyloamino- wego w dwuchlorometanie. Obie fazy rozdzielano i faze dwuchlorometanowa poddano ekstrakcji 100 ml wody o temperaturze 2°C, zawierajacej 190 mg jodku sodowego, przy powolnym mieszaniu, doprowadzajac faze wodna do wartosci pH = 6,4 przy pomocy ^/t NaHCC3. Otrzymany roztwór zliofilizowano i sucha pozostalosc przemyto ace¬ tonem, trzymujac 88 mg produktu, stanowiacego mieszanine soli sodowych zwiazku MM 4550 i zwiazku MM 13902, o wartosci I50 0^0002 ^g wo¬ bec p-laktamazy Escherichia coli. Odzysk anty¬ biotyków: 70%.Aktywnosc antybakteryjna mieszanin ampicyliny i produktu, wytworzonego w sposób, jak wyzej opisano w opisie metody 7, oznaczono metoda ko¬ lejnych rozcienczen w podlozu agarowym. Otrzy¬ mane najmniejsze stezenia hamujace podano w po¬ nizszej tablicy II.Tablica II Synergizm pomiedzy ampicylina a produktem* wytworzonym w sposób, jak wyzej opisano w opisie metody 7 % 55 6* 60 Organizm 1 K coli B 11 E.coli JT4I7 ' B. coli JT39 Shigella sonnei S239 Ampi¬ cylina 2 500 250 500 125 Ampicylina+produkt MM 4550 (kompleks) w stezeniu: 84 fig/ml 3 5tf0 250 500 125 1 ng/ml 4 500 250 . 500 125 10fj.g/ml 50 50 * 26*94006 c.d. tablicy II 16 "1 Klebsiella aeroge- nes A Klebsiella aeróge- nes IP 282 Proteus mi- rabilis 889 Proteus mi- rabilis 247 Proteus morganii F Proteus rettgeri R110 Staph. au¬ reus (Russell) Staph. aure- us (Ru¬ ssell H) 2 ' 125 50 500 500 50 250 250 500 | 3 50 500 125 50 125 125 4 ¦ 5* 12,5 50 ,0 * <0,1 <0,1 <0,1* 0,5* 0,5 0,5 0,5 1 0,25* 0,25 W powyzszej tablicy II uzyto nastepujacych 25 skrótów: * Czesciowe zahamowanie przez sam produkt MM 4550 (kompleks) w podanych stezeniach.Podobne efekty synergiczne stwierdzono w przy¬ padku mieszanin amoksycyliny z produktem 30 MM 4550 (kompleks).Opis metody 8. Sposób wytwarzania czesciowo oczyszczonego kompleksu antybiotycznego, zawiera¬ jacego zwiazek MM 4550 i zwiazek MM 13902, przy uzyciu chlorku cetylodwumetylobenzyloamoniowego 35 Zliofolizowany produkt o wartosci I50 0,02 jjig/ml, wymyty mieszanina acetonu i wody z kolumny, wypelnionej weglem aktywowanym Farnell, w spo¬ sób, jak wyzej opisano w opisie metody 4, roz¬ puszczono w wodzie destylowanej, otrzymujac roz- 40 twór o stezeniu 13 mg/ml. Roztwór ten doprowa¬ dzono do wartosci pH = 6,5. 100 ml otrzymanego roztworu poddano ekstrakcji 100 ml 0,1% roztworu chlorku cetylodwumetylo- benzyloamoniowego w dwuchlorometanie. Utworzo- 45 ne fazy rozdzielono przy pomocy odwirowania i faze organiczna poddano ekstrakcji 100 ml 0,05% roztworu jodku sodowego. Fazy rozdzielono, po czym usunieto dwuchlorometan, pozostaly w fazie wodnej, przy pomocy pozostawienia roztworu w 50 ciagu 10 minut pod zmniejszonym cisnieniem. i Otrzymany roztwór wodny zliofilizowano i pro¬ dukt przemyto 3 razy po 50 ml acetonu, a nastepnie wysuszono w eksykatorze prózniowym, otrzymujac 4,3 mg jasnobrazowego proszku, o wartosci I50 55 0,002 jig/mi.Opis metody 9. Sposób wytwarzania czesciowo oczyszczonego kompleksu antybiotycznego, zawiera¬ jacego zwiazek MM 4550 i zwiazek MM 13902, przy pomocy saczenia zelowego 1 g surowego produktu 60 MM .4550 (kompleks), o wartosci I50 0,2, jJig/ml, wy¬ tworzonego w sposób jak wyzej opisano w opisie metody 4, poddano chromatografii na Sephadex G25 (fine grade), stosujac do wymywania kolumny mieszanine 4 :6 obj. (obj. acetonu i wody. Wy- 65 miary kolumny: 2,5 cmX32 cm. Elucje prowadzo¬ no z szybkoscia przeplywu 1,5 ml/minute. Frakcje zawierajace substancje czynna, polaczono, za- tezono, pod zmniejszonym cisnieniem w tem¬ peraturze ponizej 30°C i zliofilizowano, otrzymujac 22 mg bezpostaciowej, brazowawej pozostalosci, o wartosci I50 0,005 |jig/ml. Wydajnosc: 88%, oczyszcze¬ nie: 40X.Opis metody 10. Sposób wytwarzania oczyszczo¬ nego kompleksu antybiotycznego, zawierajacego zwiazek MM 4550 i zwiazek MM 13902, przy pomo¬ cy chromatografii na celulozie 610 mg produktu MM 4550' (kompleks), wytworzonego w sposób, jak wy¬ zej opisano w opisie metody 7, poddano chromato¬ grafii w kolumnie, wypelnionej celuloza Whatman CC 31. Wymiary kolumny: 2,5 cmX32 cm. Do wy¬ mywania kolumny stosowano mieszanine 7 : 3 (obj. izopropanolu i wody, elucje prowadzono z szybkos¬ cia przeplywu 1,5 ml/minute.Frakcje, zawierajace czynna substancje antybak- teryjna, polaczono, zatezono pod zmniejszonym cis¬ nieniem w temperaturze ponizej 30° i zliofilizo¬ wano, otrzymujac 40 mg bezpostaciowej, brazowej, stalej pozostalosci, stanowiacej kompleks antybio- tyczny o wartosci I50 0,00007 ^g/ml. Bardzo niska wartosc I50 wskazuje na to, ze otrzymano aktyw¬ ny produkt o wysokiej czystosci.W innym przypadku, w sposób, jak wyzej opi¬ sano, otrzymano produkt o wartosci I50 0,001 fig/ml.W ponizszej tablicy III zamieszczono dane, odno¬ szace sie do aktywnosci antybakteryjnej tego pro¬ duktu, oznaczonej przy pomocy standardowej me¬ tody mikromiareczkowej z uzyciem bulionu Oxoid do okreslania wrazliwosci, stosujac rzadkie inoku- lum (1% 16 — godzinnej brzeczki).Tablica III Aktywnosc antybakteryjna mieszaniny zwiazku MM 4550 i zwiazku MM 13902 o wartosci I50 0,001 fig/ml Organizm Staphylococcus aureus (Oxford) Staphylococcus aureus (Russell) Streptococcus faecalis Bacillus subtilis Escherichia coli (10418) Escherichia coli (B 11) Klebsiella aerogenes Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Providentia stuartii Acinetobacter anitratus Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Salmonella typhimurium Shigella sonnei Najmniejsze ste¬ zenie hamujace w ^g/ml 7,5 7,5 125, 0,9 3,7 1*8 62 7,5 7,5 0,9 250 7,5 7,517 94 006 18 Opis metody 11. Zwiazek MM 4550 Zwiazek MM 4550 mozna rozpoznac na podsta¬ wie jego wlasciwosci ponizej wyszczególnionych.Zwiazek MM 4550 jest substancja stala o charak¬ terze kwasu, który w postaci soli sodowej odzna¬ cza sie nastepujacymi wlasciwosciami: I) jest dobrze rozpuszczalny w wodzie, rozpusz¬ czalny w metanolu i zasadniczo nierozpuszczalny w chloroformie, eterze etylowym i weglowodorach, II) w roztworze wodnym wykazuje charakterys¬ tyczne widmo UV z maksimami absorpcji o war¬ tosci okolo 238 nm i okolo 287 nm, III) w stezeniu 0,4% wag./wag., w swiezo sporza¬ dzonej tabletce z KBr, wykazuje charakterystycz¬ ne widmo IR, z maksimami absorpcji o wartosci, miedzy innymi, 3450, 2950, 1765, 1695, 1510, 1390 oraz 1260 cm-1. Przy ponownym badaniu widma po uplywie okolo 1 tygodnia od sporzadzenia ta¬ bletki z KBr stwierdza sie wybitne zmiany zarysu widma na przyklad duzy szczyt pierwotnie o war¬ tosci 1765 cm-1 staje sie niewielki, wzglednie zu¬ pelnie zanika, IV) w DzO wykazuje charakterystyczne widmo NMR odznaczajace sie, miedzy innymi, a) para dubletów w niskim polu przy okolo 2,45t i 3,65t, przy czym wartosci stalych sprzezenia wynosza okolo 15 Hz, b) dubletem przy okolo 8,55t i c) o- strym singletem przy okolo 7,95t, V) w chromatografii cienkowarstwowej na celulo¬ zie wykazuje nastepujace, bardzo przyblizone war¬ tosci Rf: a) uklad butanol (izopropanol) woda — 7:7:6 obj./obj., Rf = 0,7, c) uklad n-butanol(etanol) 7 : 3 obj./obj., Rf = 0,7, c) uklad n-butanol-etanol) woda — 7:7:6 obj./obj., Rf = 0,7, d) uklad n-pro- panol (woda — 4:1 obj/obj., Rf = 0,6, VI) wykazuje aktywnosc antybakteryjna wobec rozmaitych gatunków, miedzy innymi wobec szcze¬ pów Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mi- rabilis, Acinetobacter anitratus, Serratia marcescensi i Shigellasonnei, i VII) wykazuje aktywnosc inhibitora enzymatycz- neg wobec p-laktamaz, wytwarzanych przez rózne gatunki, miedzy innymi przez Escherichia coli, Klebsiella aerogenes i Staphylococcus aureus. Wo¬ bec |3-laktamazy Escherichia coli B 11 wykazuje wartosc I50, jak opisano w powyzszej czesci opisu, mniejsza od 0,0001 |xg/ml, VIII) dodany do ampicyliny wzmaga synergicz- nie jej aktywnosc wobec organizmów, w tym wo¬ bec szczepów Escherichia coli, klebsiella aerogenes,; Proteus mirabilis, Proteus morganii i Staphylococ¬ cus aureus Russell, i IX) analiza aminokwasów wykazala, ze zwiazek ten nie jest ani polipeptydem ani bialkiem. Po hy¬ drolizie kwasowej nie stwierdzono obecnosci kwasu a-aminoadypinowego, X) reaguje z odczynnikiem Ehrlicha, stanowia¬ cym roztwór 300 mg 4-dwumetyloaminobenzalde- hydu w mieszaninie 54 ml n-butanolu, 9 ml eta¬ nolu i 9 ml stezonego kwasu solnego, dajac blekit-; ne zabarwienie na chromatogramach bibulowych i plytkach stosowanych w chromatografii cienko-1 warstwowej, , XI) nie jest ogólna trucizna enzymów i nie ha-j muje aktywnosci nastepujacych enzymów w ste¬ zeniach wyzszych od stezen koniecznych do zaha¬ mowania aktywnosci P-laktamazy Escherichia coli: oksydaza monoaminowa, dehydrataza weglanowa, dekarboksylaza DOPA, trypsyna, chymotrypsyna, ureaza.Opis metody 12. Organizmy Po raz pierwszy wlasciwosc wytwarzania pro¬ duktu MM 4550 (kompleks) odkryto w przypadku hodowli szczepów ATCC 21379, ATCC 21380, ATCC 21381 i ATCC 21382, wyizolowanych z próbek gle¬ by pochodzacych odpowiednio z Hiszpanii, Nowej Zelandii, Republiki Poludniowej Afryki i Izraela.W badaniach laboratoryjnych hodowle te okazaly sie identyczne i wszystkie zostaly sklasyfikowane przez Dr Bousfielda, eksperta z dziedziny promie¬ niowców w National Collection of Industrial Bac- teria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, Scotland, przy wykorzystaniu ogólnie przyjetego w 1967 roku systemu klasyfikacyjnego Huettera, podanego w Systematic der Streptomyceten, S. Kar- ger, Basel, str. 382, jako Streptomyces olivaceus.Od tego czasu zjawisko wytwarzania zwiazku MM 4550 stwierdzono takze i w przypadku innych pro¬ mieniowców, jak to uwidoczniono w ponizszej ta¬ blicy IV.S. olivaceus po raz pierwszy opisal Waksman w roku 1919 w Cultural Studies of Species of Actino- myces, Soli, Sci., 8, 71—215. Nastepnie w roku 1960, grupa radzieckich badaczy opisala gatunek o bar¬ dzo zblizonych wlasciwosciach, który nazwano Actinomyces (Streptomyces) fulvoviridis (Kuczajewa i wsp. Trud. Inst. Mikrobiol. Akad. Nauk SSSR, 8, 226—253 (1960).Drobnoustroje z rodzaju Streptomyces sa nad¬ zwyczaj zmienne w swych wlasciwosciach mor- fologiczych i fizjologicznych, zaleznie od warun¬ ków wzrostu. Opisy wielu gatunków opublikowano jeszcze przed stwierdzeniem istnienia tego zjawis¬ ka, co w konsekwencji doprowadzilo do powtórzen i nazywania róznymi nazwami tych samych ga¬ tunków. Huetter w 1967 r. wymienil nazwy 25 ga¬ tunków, lacznie ze S. fulvoviridis, bedace synoni¬ mami S. olivaceus. W 1962 r. rozpoczely sie prace w ramach International Streptomyces Project, zmierzajace do wyjasnienia zamieszania w termi¬ nologii i klasyfikacji (Shirling i wsp. Int. J. Syst.Bacteriol., 18, 69—189 (1968). Wykonawcy tych prac przeprowadzili szereg badan, zmierzajacych do o- pracowania dokladnych opisów gatunków rodzaju Streptomyces w warunkach standardowych. Zgod¬ nie z tym programem opracowano znormalizowane opisy typowych szczepów 400 nazwanych gatun¬ ków, lacznie ze Streptomyce olivaceus i Strepto- riiyces fulvoviridis.S. olivaceus i S. fulvoviridis w opisie wedlug I.S.P. róznia sie dwoma cechami charakterystycz¬ nymi: I) ksztaltem sporoforu i II) zdolnoscia wy¬ korzystywania inozytolu jako jedynego zródla we¬ gla.S. olivaceus opisano, jak nastepuje: Morfologia lancuchowa zarodników: grupa Spi- rales, z otwartymi spiralami laczacymi sie powy¬ ginanymi lancuchami zarodników wlasciwymi dla grupy Rectiflexibiles. Lancuchy dojrzalych zarod- 40 45 50 55 6019 94 006 ników na ogól dlugie, czesto zawieraja ponad 50 zarodników na jeden lancuch.Wykorzystanie wegla do wzrostu: D — glukoza, L — arabinoza, D — ksyloza, i — inozytol, D — mannitol, D — fruktoza oraz ramnoza. Brak wzro¬ stu wzglednie tylko slady wzrotu na sacharozie i rafinozie.S. fulvoviridis opisano, jak nastepuje: Morfologia lancucha zarodników: grupa Recti- flexibiles. Lancuchy dojrzalych zarodników umiar¬ kowanie krótkie, zawieraja 10—50 zarodników na lancuch.Wykorzystanie wegla do wzrostu: D — glukoza, L — arabinoza, D — ksyloza, D — mannitol, D — fruktoza i ramnoza. Wykorzystanie sacharozy wat¬ pliwe. Brak wzrostu, wzglednie tylko slady wzrostu na i-inozytolu lub rafinozie.Charakterystyke hodowli, nazwanych S. oliva- ceus lub S. fulvoviridis, albo ich synonimami, oraz innych pokrewnych gatunków, oparto o metody i podloza standardowe (Shirling i wsp., Int. J. Syst.Bacteriol., 16, 313—340 (1966), zalecane w Interna¬ tional Streptomyces Project (ISP).Hodowle pochodzily z róznych zródel. Szczepy ATCC 21379, 21380, 31381, 21382 wyizolowano z gle¬ by, biorac pod uwage ich przydatnosc do wytwa¬ rzania produktu MM 4550 (kompleks). Inne szczepy sprowadzono z innych róznych kolekcji szczepów dla porównania.Wyniki badan, dotyczacych wytwarzania produk¬ tu MM4550 (kompleks), zabarwienia grzybni po¬ wietrznej, uksztaltowania spcroforu, zabarwienia grzybni podstawowej, wytwarzania rozpuszczalne¬ go barwnika, wytwarzania melaniny oraz wyko¬ rzystywania zródel wegla, podano w ponizszych tablicach IV—VIII. Wszystkie szczepy wytwarzaly zarodniki o powierzchni gladkiej w obrazie, uzys¬ kanym w mikroskopie elektronowym.Z opisu ISP wynika, ze spiralny wzrost sporo- foru S. olivaceus ma charakter zmienny. Prawdzi¬ we spirale obserwowano, z rózna czestotliwoscia, u typowego gatunku S. olivaceus, to znaczy u szcze¬ pu ATCC 3335. W wiekszosci byly to sporofory dlugie. Nie stwierdzono wystepowania prawdzi¬ wych spirali w przypadku hodowli ATCC 21379, 21380, 21381 lub 21382, aczkolwiek sporofory byly dlugie i przejawialy tendencje do skrecania sie w spirale posród form typu Rectiflexibiles. Jednakze sporofory dwóch szczepów S. olivaceus, a miano¬ wicie NCIB 8238 i NCIB 8509 w wiekszosci byly typu Rectiflexibiles. W przypadku szczepu NCIB 8238 byly to sporofory sredniej dlugosci, natomiast sporofory szczepu NCIB 8509 byly dlugie.Sporofory szczepu ATCC 15863, typowego gatun¬ ku S. fulvoviridis, byly krótsze od sporoforów wy¬ izolowanych szczepów ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 31126 i wystepowaly wylacznie w typie Rectiflexibiles. Pod wzgledem tej cechy charakte¬ rystycznej, wyizolowane szczepy ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 i 31126 odpowiadaja dobrze, chociaz nie calkiem dokladnie, opisowi S. olivaceus.Wyizolowane szczepy ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 i 31126 wykazuja pewna zmiennosc odnosnie do wykorzystywania inozytolu, co w opisach I.S.P. typowych gatunków stanowi dalsza ceche rozróz¬ niajaca pomiedzy gatunkami S. olivaceus i S. ful- voviridis, jak to przedstawia ponizsza tablica VIII.Szczepy ATCC 31126 i ATCC 21380 wykorzystuja inozytol, co stanowi ceche charakterystyczna S. oli- vaceus, natomiast w przypadku innych szczepów nie stwierdza sie wykorzystywania inozytolu, wzglednie jest ono watpliwe. Jednakze na ogól u- waza sie, ze zdolnosc do wykorzystywania jednego weglowodanu nie jest wystarczajaca podstawa do wydzielenia osobnego gatunku. Róznica taka moze byc wywolana mutacja pojedynczego genu i przyj¬ muje sie ja czesto tylko za ceche szczepowa. Rózni¬ ce w wykorzystywaniu cukrów przez szczepy NCIB 8138, NCIB 8509, ATCC 21549, ATCC 12019 ora2 ATCC 3335. S. olivaceus sa tego rodzaju, ze liczni badacze nie zaliczaja ich do cech gatunkowych. Dla¬ tego slusznie szczepy ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 i 31126 oznaczono S. olivaceus.Jesli dalsze badania nie doprowadza do wykry¬ cia bardziej istotnych róznic pomiedzy szczepami obecnie nazywanymi S. olivaceus i S. fulvoviridis, zaistnieje mozliwosc miedzynarodowego uznania tych szczepów za jeden gatunek. W takim przy¬ padku poprawna nazwa bedzie, na zasadzie pierw¬ szenstwa, S. olivaceus, obejmujaca takze nazwy szczepów, wymienione przez Huettera, a bedace synonimami S. olivaceus.Przesacz hodowli szczepów S. olivaceus i po¬ krewnych gatunków, pod wzgledem zawartosci pro¬ duktu MM 4550 (kompleks), bada sie w nastepujacy sposób.Tablica IV Aktywnosc antybakteryjna zwiazku MM 4550 i zwiazku MM 13902, oznaczona przy pomocy bioautografii (chromatografia cienkowarstwowa na celulozie w ukladzie butanol/alkohol izopropylowy/woda — 7:7:6 obj./obj.) Organizm Klebsiella aero- genes Proteus mira- bilis Proteus morganii Salmonella typhi Escherichia coli 10418 Escherichia coli Bil Enterobacter aerogenes Staphylococcus aureus (Oxford) Staphylococcus aureus (Russell) Bacillus subtilis Srednica strefy zahamowania \ Zwiazek MM 4550 sred¬ nica strefy w mm, przy Rf 0,58 ,0 17,5 16,0 19,5 ,0 17,5 6,5 13,0 12,0 24,0 Zwiazek 1 MM 13 902 srednica strefy w mm, przy Rf 0,70 ,0 13,5 9,5 21,0 13,5 ,5 brak strefy 4,0 4,0 ,0 40 45 5021 tiooft 22 Przesacze hodowli wyszczególnionych szczepów nanoszono na paski bibuly Whatman Nr 1, w ilosci po 20 ul na 1 punkt startowy, po czym chroma- tografowano w ukladzie n-butanol (izopropanol) woda — 7:7:6, w ciagu 16 godzin, w chlodni.Jednoczesnie rozwijano druga serie chromatogra- mów w ukladzie n-butanol (lodowaty kwas octo¬ wy) woda — 12:3:5, takze w ciagu 16 godzin, W chlodni. Równolegle w tych samych ukladach i warunkach, rozwijano chromatogramy z nanie¬ siona czesciowo oczyszczona próbka produktu MM 4550 (kompleks) jako wzorcem.Inaczej badanie mozna wykonac w sposób po¬ legajacy na tym, ze 25 ml sklarowanej brzeczki poddaje sie ekstrakcji 12,5 ml roztworu chlorku cetylobenzyloamoniowego w dwuchlorometanie, po czym rozdziela sie utworzone fazy, do fazy orga¬ nicznej dodaje sie 2,5 ml 0,5c/o-owego roztworu jodku sodowego, wytrzasa i rozdziela utworzone fazy. Faze wodna poddaje sie chromatografii, na przyklad nanoszac 5 \i\ na plytke do chromatografii cienkowarstwowej i rozwijajacej chromatogram w ukladzie n-butanol (izopropanol) woda — 7:7:6.Tablica V Zdolnosc hodowli Streptomyce olivaceus, Streptomyces fulvoviridis i gatunków pokrewnych do wytwarzania produktu MM 4550 (kompleks) Hodowla Streptomyce olivaceus ATCC 21379 Streptomyce olivaceus ATCC 31126 Streptomyce olivaceus ATCC 21380 Streptomyce olivaceus ATCC 21381 Streptomyces olivaceus ATCC Streptomyces olivaceus NCIB Streptomyces olivaceus NCIB Streptomyces flavovirens ATCC Streptomyces flavus ATCC Streptomyces fulvoviridis ATCC Streptomyces argenteolus ATCC Streptomyces sioyaensis ATCC Streptomyces lipmanii NRRL 21382 8238 8509 ¦- 3320 3369 15863 11009 13989 3584 Wytwarza¬ nie produk¬ cji MM 4550 (kompleks) + + + + + + + + + + + + + 1 Tablica VI Zabarwienie i morfologia dojrzalej zarodnikujacej grzybni powietrznej Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis i gatunków pokrewnych po 14 dniach hodowli na podlozach ISP 80 40 45 55 60 Szczepy Streptomyces olivaceus ATCC 21549, ATCC 12019, ATCC 3335 nie wytwarzaja produktu MM 4550 (kompleks). Szczep 15863 jest zdeponowa¬ ny takze pod numerem RIA 660.Hodowla ATCC 21379 ATCC 31126 ATCC 21380 ATCC 21381 ATCC 21382 NCIB 8238 1 NCIB 8509 ATCC 21549 ATCC 12019 ATCC 3335 ATCC 15863 ATCC 3320 ATCC 3369 ATCC 11009 ATCC 13898 SS szara szara/ brazo¬ wa szara szara szara/ biala szara/ biala szara szara szara szara szara/ biala szara/ bleki¬ tna szara jasno¬ szara biala/ szara YM 1 szara szara/ brazo¬ wa szara szara szara szara szara szara szara szara szara szara szara szara/ brazo¬ wa biala GA szara/ biala szara szara -jasno¬ szara szara szara szara szara szara szara szara/ biala szara/ zie¬ lona szara szara/ biala biala/ zólta OM szara 'szara szara szara/ biala szara szara szara szara szara szara szara szara jasno¬ szara/ brazo¬ wa szara/ zie¬ lona szara/ biala Morfolo¬ gia i wy¬ miary sporo- foru dlugi RF dlugi RF dlugi RF dlugi RF dlugi RF sredni RF dlugi RF dlugi S dlugi RF/S dlugi RF/S sredni RF dlugi RF sredni RF/RA sredni RF/RA krótki S W powyzszej tablicy VI uzyto nastepujacych skrótów: SS = sole nieorganiczne — agar skrobiowy (pod¬ loze ISP Nr 4)94 006 23 YM = ekstrakt drozdzowy — agar z ekstraktem slodowym (podloze ISP Nr 2) GA = glicerol — agar z asparagina (podloze ISP Nr 5) OM = agar z maka owsiana (podloze ISP Nr 3) RF = Rectiflexibiles RA = Retinaculiaperti S = Spirales Tablica VII Zabarwienie grzybni podstawowej Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis i gatunków pokrewnych, ogladanej z przeciwnej strony 24 c.d. tablicy VII Hodowla ¦ 1 ¦ ATCC 21379 ATCC 31126 ATCC 21380 ATCC 21381 ATCC 21382 NCIB 8238 NCIB8509 ATCC 21549 ATCC ; 12019 ATCC 3335 ATCC 15863 ATCC 3320 ATCC 3369 ATCC 11009 ss 2 oliwko¬ wa oliw.so- wo- brazowa cliwko- wa ciemno¬ brazowa oliwko¬ wa brazowa brazowa plowo- zólta/ czarna plowo- zólta brazowa brazowa/ szara zólta/ brazowa plowo- zólta/ szara czarna YM 3 oliwko- wo- brazowa oliwko- wo- brazowa oliwko- wo- zielona ciemno¬ brazowa oliwko¬ wa oliwko¬ wa/ brazowa cliwko- wa brazowa/ czarna plowo- zólta brazowa ciemno¬ brazowa oliwko¬ wa/ brazowa zólto- brazowa czarna/ zólta GA 4 szfcra/ brazowa brazowa oliwko- wo- brazowa oliwko- wo- zielona brazowa brazowa oliwko- wo- brai owa brazowa / czarna plowo- zólta brazowa oliwko- wo- brazowa oliwko¬ wa/ brazowa plowo- zólta/ zielona czarna/ zólta OM oliwko¬ wo- zielona oliw.ko- wo- brazowa oliwko- wo- zclta oliwko- wo- zielona oliwko- wo- zielona oliwko¬ wo- i zólta oliwko- wo- zólta plowo- zólta/ szara plowo- zólta szara oliwko- wo- zólta poma¬ ranczo¬ wa/ brazowa zólta szara/ zielona | 30 50 55 60 65 1 1 ATCC 13989 2 poma¬ ranczo¬ wa 3 zólta 4 zólta bez barwy W powyzszej tablicy VII uzyto nastepujace skró- ^ SS = sole nieorganiczne — agar skrobiowy (pod¬ loze ISP Nr 4) YM = ekstrakt drozdzowy — agar z ekstraktem slo¬ dowym (podloze ISP Nr 2) GA = glicerol — agar z asparagina (podloze ISP Nr 5) OM = agar z maka owsiana (podloze ISP Nr 3) Tablica VIII Wytwarzanie rozpuszczalnych barwników przez Streptomyces olivaoeus, Streptomyces fulvoviridis i gatunki pokrewne Hodowla ATCC 21379 ATCC 31126 ATCC 21380 ATCC 21381 ATCC 21382 NCIB 8238 NCIB 8509 ATCC 21549 ATCC 12019 ATCC 3335 ATCC 15863 ATCC 3320 ATCC 3369 ATCC 11009 ATCC 13989 Rozpuszczalne barwniki niemelanoidowe SS — — — + jasno- bra¬ zowy — — + rózo- wawy YM — — — — + jasno- brazo- wy _ — + 'asno- brazo- wy + jasno- poma- ran- czowy GA — — — + jasno- bra- zowy + jasno- czer- wony/ brazo¬ wy _ — OM + jasno- zólty — — + jasno- bra- zowy jasno- zólty + jasno- brazo- wy — O) 2 co * Wytwar2 melanin] — — — — 1 _ —94 006 26 W powyzszej tablicy VIII uzyto nastepujace skró¬ ty: SS = sole nieorganiczne — agar skrobiowy (pod¬ loze ISP Nr 4) YM = ekstrakt drozdzowy — agar z ekstraktem slodowym (podloze ISP Nr 2) GA = glicerol — agar z asparagina (podloze ISP Nr 5) OM = agar z maka owsiana (podloze ISP Nr 3) + = wytwarza barwnik — = nie wytwarza barwnika * = badano na agarze peptonowo-drozdzowym z zelazem (podloze ISP Nr 6), agarze z ty¬ rozyna (podloze ISP Nr 17) i brzeczce tryp- tonowo-drozdzowej (podloze ISP Nr 1).Tablica IX Wykorzystanie zródel wegla przez Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis i gatunki pokrewne Hodowla ATCC 21379 ATCC 31126 ATCC 21380 ATCC 21381 ATCC 21382 NCIB 8238 NCIB 8509 ATCC 21549 ATCC 12019 ATCC 3335 ATCC 15863 ATCC 3320 ATCC 3369 ATCC 11009 ATCC 13989 Ramnoza + + + + + + + — + + + + + + — Rafinoza — — — - + - ± — ± — — — — — + Sacharoza — — — — — — — — + ± — + ± — + Inozytol + + + — — — — + + + — - + + + Glukoza + + + + + + + + + + + + + + + Ksyloza + + + + + + + + + + + + + + + Fruktoza + + + + + + + + + + + + + + + Mannitol + + + + + + + + + + + + + + + Arabinoza + + + + + + + + + + + + + + — W powyzszej tablicy IX uzyto nastepujace skró¬ ty: + = zwiazek jest wykorzystywany jako zródlo we¬ gla — = zwiazek nie jest wykorzystywany jako zródlo wegla ± = wykorzystywanie jest watpliwe lub bardzo nieznaczne Przyklad I. Otrzymywanie produktu MM4550 (kompleks) i jego rozdzial na zwiazek MM 4550 i zwiazek MM 13902.Sposoby wyodrebniania, wyszczególnione w po¬ wyzszej czesci opisu, zawierajacej opisy metod, mozna stosowac w rozmaitej kolejnosci. Szczególnie korzystna jest nastepujaca, opisana ponizej, kolej¬ nosc procesów: adsorpcja na weglu, ekstrakcja jo- nowo-asocjacyjna, chromatografia na celulozie. 340 1 przesaczu hodowli, wytworzonego w spo¬ sób, jak wyzej opisano w opisie metody 3, prze¬ puszczono od dolu ku górze z szybkoscia 800— 1200 ml/minute przez kolumne o srednicy okolo 23 cm i wysokosci okolo 51 cm, wypelniona weglem aktywowanym Farnell BO. Wegiel zostal poprzed¬ nio uzyty do adsorpcji produktu MM 4550 (kom¬ pleks), a nastepnie zregenerowany przy pomocy przemycia nastepujacymi odczynnikami: 0,5 nor¬ malny NaOH, 0,2 normalny roztwór 3:2 NaOH w acetonie, woda, 1 normalny HC1, woda, bufor fosfo- ranowy o wartosci pH = 6, woda.Nastepnie kolumne przemyto 20 1 wody w celu wyparcia przesaczu hodowli i wymywano od góry do dolu mieszanina 2:8 obj./obj. acetonu i wcdy, przy szybkosci przeplywu 200—250 ml/minute. Od¬ bierano frakcje 1 1. Frakcje, w których przy po¬ mocy dyfuzyjnej metody oznaczania aktywnosci antybakteryjnej z uzyciem Klebsiella aerogenes stwierdzono obecnosc produktu MM 4550 (kom¬ pleks), polaczono, do ogólnej objetosci 11 1, po czym zatezono przy pomocy odparowania pod zmniejsza¬ nym cisnieniem w temperaturze ponizej 30°C do objetosci 5,5 1. W tym stadium odzysk produktu MM 4550 (kompleks) wynosil 20%.Otrzymany koncentrat oziebiono do temperatury 2°C, dodano do niego 5,5 1 2% wag./obj. roz¬ tworu wodorosiarczanu cztero-n-butyloamoniowego w dwuchlorometanie, oziebionego do temperatury ^5°C i utworzone 2 fazy mieszano razem w ciagu 2 minut. Faze dwuchlorometanowa oddzielono i do¬ dano do 1 1 0,6% roztworu jodku sodowego w tem¬ peraturze 0°C. Utworzone dwie fazy lagodnie mie¬ szano, po czym faze wodna stopniowo doprowadzo¬ no wartosci pH = 6,5—7,0 przy pomocy 2% roz¬ tworu NaHC03. Faze wodna oddzielono i zliofili- zowano. Sucha pozostalosc poddano ekstrakcji su¬ chym acetonem w celu rozpuszczenia i odmycia nadmiaru jodku sodowego, po czym usunieto pod zmniejszonym cisnieniem aceton z nierozpuszczal¬ nej pozostalosci, otrzymujac 1,1 g plowozóltego proszku. W tym stadium ogólny odzysk produktu MM 4550 (kompleks) wynosil 10%. Oczyszczenie, w przeliczeniu na ogólna ilosc substancji stalych* rozpuszczonych w przesaczu hodowli: 125x.Kolumne o srednicy 2,5 cm wypelniono do wy¬ sokosci 32 cm zawiesina proszku celulozowego Whatman CC 31 w mieszaninie 7:3 obj/obj. izo- propanolu i wody. 500 mg plowozóltego proszku rozpuszczono w 2 ml mieszaniny 7:3 obj./obj. izo- propanolu i wody i poddano chromatografii, przy uzyciu tego samego rozpuszczalnika i przy szyb¬ kosci przeplywu 1,5 ml/minute. Z kolumny odbie¬ rano frakcje 3 ml. Frakcje wykazujace maksima absorpcji UV o wartosci okolo 285 nm polaczono, zatezono i zliofilizowano, otrzymujac produkt MM 4550 (kompleks). W badaniach wstepnych ustalono, .ze frakcje, wykazujace absorpcje przy okolo 285 nm, zawieraja substancje hamujaca ak¬ tywnosc enzymu, o aktywnosci antybakteryjnej.Odzysk zliofilizowanego produktu MM 4550 (kompleks) wynosil 35 mg. Ma on wyglad substancji bezpostaciowej o zabarwieniu brazowym. Wartosc I50 0,0001 p,g/ml. W tym stadium ogólny odzysk substancji czynnej wynosil 3%, oczyszczenie: 600 x.Aktywnosc antybakteryjna otrzymanego produk¬ tu oznaczono przy pomocy standardowej metody mikromiareczkowej z uzyciem bulionu Oxoid do okreslania wrazliwosci, stosujac rzadkie inokula.Uzyskane najmniejsze stezenia hamujace byly zblizone do stezen, podanych w powyzszej tab¬ licy III. 40 45 50 55 6027 94 006 28 W wyniku rozdzialu otrzymanego produktu przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej na celu¬ lozie, z uzyciem plytek Eastman Kodak „Chromo- gram" i mieszaniny 7:7:6 n-butanolu, izopropanolu i wody, otrzymano dwie substancje czynne. Pierw¬ sza z nich, o wartosci Rf okolo 0,58 nazwano zwiaz¬ kiem MM 4550, druga, o wartosci Rf okolo 0,72, zwiazkiem MM 13902. Oba te zwiazki mozna wy¬ kryc przy pomocy bioautografii z uzyciem róznych organizmów, w tym Bacillus subtilis, Staphylococ- cus aureus (Oxford), Staphylococcus aureus (peni- cylinooporny), Escherichia coli (penicylinowrazliwy i penicylinooporny), Salmonella typhimurtum, Pro- teus mirabilis, Proteus morganii i Klebsiella aero- genes. Niektóre z otrzymanych wyników zamiesz¬ czono w powyzszej tablicy IV.W toku dalszych badan, obie substancje rozdzie¬ lono przy pomocy chromatografii cienkowarstwo¬ wej na celulozie, z uzyciem do rozwijania chroma- togramu mieszaniny 8:2 izopropanolu i wody, po czym poddano ekstrakcji z celulozy buforem fos-' foranowym. Kazdy z otrzymanych ekstraktów ba¬ dano pod wzgledem hamowania aktywnosci 0-lak- tamazy. Wykazano, ze oba zwiazki sa inhibitorami (3-laktamazy Escherichia coli, oraz, ze oba dzialaja synergicznie z penicylina benzylowa wobec Klebr siella aerogenes.Przyklad II. Otrzymywanie produktu MM 4550 (kompleks) i jego rozdzialu na zwiazek MM 4550 i zwiazek MM 13902 1100 1 przesaczu hodowli, pochodzacego z fer¬ mentacji Streptomyces olivaceus ATCC 31126, o wartosci pH = 6,5 i temperaturze 5°C, przepusz¬ czono z szybkoscia 3,2 l/minute przez kolumne o wymiarach 0,3 mXl m, wypelniona granulowa¬ nym weglem Darco. Wegiel zostal poprzednio uzy¬ ty do adsorpcji produktu MM 4550 (kompleks), a nastepnie zregenerowany przed uzyciem przy pomocy przemycia nastepujacymi odczynnikami: 0,5 normalny NaOH, 0,2 normalny roztwór 3:2 NaOH w acetonie, woda, 1 normalny HC1, woda, bufor fosforanowy o wartosci pH = 6, woda.Nastepnie kolumne przemyto 60 1 wody w celu wyparcia przesaczu hodowli i wymywano miesza¬ nina 2:8 obj./obj. acetonu i wody, w temperatu¬ rze 30°C i z szybkoscia przeplywu 1,1 l/minute. Odeb¬ rano z kolumny 60 1 odcieku, a nastepnie 5 frakcji, kazda o objetosci 10 1. Frakcje, w których przy pomocy dyfuzyjnej metody oznaczania aktywnosci antybakteryjnej z uzyciem Klebsiella aerogenes stwierdzono obecnosc produktu MM 4550 (kom¬ pleks), polaczono, do ogólnej objetosci 40 1, po czym zatezono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze ponizej 30°C do objetosci 32 1. W tym stadium odzysk produktu MM 4550 (kompleks) wynosil 15%.Otrzymany koncentrat oziebiono do temperatury °C, dodano do niego 16 1 0,2°/o roztworu chlor¬ ku cetylodwumetylobenzyloamoniowego w dwu- chlorometanie, oziebionego do temperatury 5°C, po czym utworzone dwie fazy mieszano w ciagu minut. Faze dwuchlorometanowa oddzielono i dodano do 3,75 1 0,4°/o roztworu jodku sodo¬ wego w temperaturze 5°C. Obie fazy mieszano w ciagu 5 minut, po czym faze wodna oddzielono i zlifilizowano. Sucha pozostalosc poddano eks¬ trakcji suchym acetonem w celu rozpuszczenia i odmycia nadmiaru jodku sodowego, po czym po- zostalosc wysuszono po#d zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 2,#7 g plowozóltego proszku. W tym stadium ogólny odzysk produktu MM 4550 (kom¬ pleks) wynosil 6%. Oczyszczenie, w przeliczeniu na ogólna ilosc substancji stalych rozpuszczonych w przesaczu hodowli: 160 x.Kolumn^ o srednicy 63 mm wypelniono do wy¬ sokosci 300 mm zawiesina proszku celulozowego Whatman CC 31 w mieszaninie 7:3 obj./obj. izo¬ propanolu i wody. 2,0 g plowozóltego proszku roz- puszczono w 5 ml mieszaniny 7:3 obj./obj. izopro¬ panolu i wody, i poddano chromatografii, przy uzyciu tego samego rozpuszczalnika i przy szyb¬ kosci przeplywu 3 ml/minute. Frakcje, w których przy pomocy metody z uzyciem Klebsiella aeroge- m nes stwierdzono obecnosc produktu MM 4550 (kom¬ pleks), polaczono, zatezono przy pomocy odparo¬ wania pod zmniejszonym cisnieniem w tempera¬ turze ponizej 30°C i zliofilizowano, otrzymujac 207 mg brazowej pozostalosci. W tym stadium od- zysk produktu MM 4550 (kompleks) wynosil 51°/o, oczyszczenie: 5x.Kolumne o srednicy 16 mm wypelniono do wy¬ sokosci 300 mm zawiesina proszku celulozowego Whatman CC 31 w mieszaninie 4:1 obj/obj n-pro- panolu i wody. 198 mg brazowej pozostalosci roz¬ puszczono w mieszaninie 1:1 wody i n-propanolu, i poddano chromatografii, przy uzyciu mieszaniny 4:1 obj/obj n-propanolu i wody, i przy szybkosci przeplywu 0,5 ml/minute. Z kolumny odbierano frakcje 6 ml i badano je metoda biologiczna wobec Klebsiella aerogenes. Badano takze widmo UV kazdej frakcji. Frakcje 23—28, wykazujace maksi¬ mum UV o wartosci 305 nm, zawieraly sól dwuso- dowa zwiazku MM 13902. Frakcje te polaczono, 40 zatezono pod zmniejszonym cisnieniem i zliofilizo¬ wano, otrzymujac 30 mg stalej pozostalosci. Otrzy¬ many produkt wykazywal w chromatografii cien¬ kowarstwowej, przy uzyciu plytek Eastman Kodak, pokrytych celuloza i mieszaniny 4:1 obj/obj n-pro- 45 panolu i wody, tylko jedna strefe aktywnosci anty- biotycznej, o wartosci Rf 0,77. Strefe te oznaczono przy pomocy bioautografii z uzyciem Bacillus subtilis.Frakcje 29—40 wykazywaly maksimum absorpcji 50 UV o wartosci okolo 285 nm i zawieraly zwiazek MM 4550. Frakcje te polaczono, zatezono pod zmniejszonym cisnieniem i zliofilizowano, otrzy¬ mujac 53 mg pozostalosci, zawierajacej sól zwiazku MM 4550, zanieczyszczona niewielka iloscia soli 55 zwiazku MM 13902.Przyklad III. Korzystny sposób wyodreb¬ niania zwiazku MM 13902.Zarodniki S. olivaceus ATCC 31126 przechowy- 60 wano w probówkach z sucha ziemia w zamknie¬ tym pojemniku w obecnosci czynnika suszacego w temperaturze 20°C. Niewielka ilosc ziemi z za¬ rodnikami, okolo 20 mg, przeniesiono w sposób ja¬ lowy do kolby Erlenmeyera ha 500 ml, zawieraja- 85 cej 100 mi podloza o nastepujacym skladzie: 40 45 50 5529 94 006 Skladnik Jednpwpdzian glukozy Maka sojowa , :,v.Woda dejonizowana Ilosc (g/l) 2 ,0 do 11 Podloze przed sterylizacja doprowadzono do war¬ tosci pH = 6,5. W sklad podloza wchodzila maka sojowa „Arkasoy„ 50", produkcji British Arkady Co. Ltd., Old Strafford, Manchester, England.Hodowle w kolbie mkubowano w temperaturze 28°C w ciagu 30 godzin na trzesawce obrotowej przy 240 obr./minute. Pobrano 2 ml otrzymanej hodowli, zawierajacej formy wegetatywne i posia¬ no skos agarowy w butli Roux. Uzyto podloze agarowe o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc ,0 ml ,0 g do 11 Wyciag roslinny V-8 Agar Woda dejonizowana Podloze przed sterylizacja doprowadzono do wartosci pH = 6,0. W sklad podloza wchodzil wy¬ ciag roslinny V-8 produkcji CampbeH's Soups Ltd., Kings Lynn, Norfolk, Anglia.Inokulum rozprowadzono po powierzchni agaru przy pomocy kolysania butla i inkubacje prowadzo¬ no w temperaturze 30°C, przy pionowym poloze¬ niu butli. Po uplywie dwóch dni hodowli nadmiar plynu w butli odpipetowano, po czym inkubacje kontynuowano w ciagu nastepnych 4 dni. W ba¬ daniach wstepnych ustalono, ze w przypadku tak prowadzonej hodowli w butli Roux rozwój akty- nofaga w hodowli na skosie zostaje stlumiony.Do hodowli w butli Roux dodano 50 ml jalowej wody dejonizowanej, zawierajacej 0,02% Tween 80 i przy pomocy wstrzasania sporzadzono zawiesine zarodników. Zawiesine te dodano nastepnie jako inokulum do 75 1 jalowego podloza posiewowego w 100 1 fermentorze ze stali nierdzewnej.Uzyto podloze posiewowe o nastepujacym skla¬ dzie: Skladnik Maka sojowa („Arkasoy 50") Jednowodzian glukozy Woda wodociagowa Ilosc (g/l) lOfi ,0 do 11 Do podloza przed sterylizacja dodano, jako sro¬ dek przeciwpienny, 50 ml oleju sojowego, zawie¬ rajacego 10% obj./obj. „Pluronic L 81".Podloze w fermentorze poddano sterylizacji para w temperaturze 120°C w ciagu 20 minut. Hodowle posiewowa mieszano przy pomocy mieszadla tar¬ czowego z lopatkami o srednicy okolo 19 cm przy szybkosci 140 obrotów/minute, wprowadzajac przez belkotke jalowe powietrze w ilosci 75 l/minute.Utrzymywano temperature 28°C. Po uplywie 48 godzin inkubacji w tych warunkach, zawartosc fermentora dodano, jako inokulum, do 1500 1 jalo¬ wego podloza fermentacyjnego w 2000 1 fermen¬ torze ze stali nierdzewnej, wyposazonym w prze¬ grody.Uzyto podloze fermentacyjne o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc (g/l) Mak,a. sojowa. („Arkasoy 50") 10,0 Jednowpdlzian-glukozy . - 20,0 Kjrsda*, (stracony, weglan wapniowy) 0,2 GlUprek kobaltowy (CoCl2v6H20) 0,001 Bezwodny si&rczan sodowy 1,0 Woda wodociagowa do 15001 Podloze przed sterylizacja ¦ doprowadzono do wartosci pH = 6,0 przy pomocy wodorotlenku so¬ dowego. Do podloza przed sterylizacja dodano, jako srode."" przeciwpienny, 3 1 oleju sojowego, zawie¬ rajacego 10% „Pluronic L 81". Po sterylizacji pod¬ loze doprowadzono do wartosci pH = 7,0 przy po¬ mocy jalowego roztworu wodorotlenku sodowego.Brzeczke; mieszano przy pomocy mieszadla, na któ¬ rego wale byly osadzone dwa wirniki tarczowe z lopatkami o srednicy okolo 48 cm, przy szyb¬ kosci 106 obrotów/minute. Utrzymywano tempera¬ ture 30°C, przeplyw powietrza 1200 l/godzine, pro¬ ces fermentacyjny zakonczono po uplywie 60 go¬ dzin i brzeczke pofermentacyjna poddano klaro¬ waniu przy pomocy odwirowania.Zalozono aktywnosc produktu, wytworzonego w sposób, jak wyzej opisano, 340 j/ml. Oznaczenia wykonywano w sposób, jak wyzej opisano w opi¬ sie metody 2. 1050 1 przesaczu hodowli o aktywnosci 340 j/ml oziebiono do temperatury 10°C, doprowadzono do wartosci pH = 8 i poddano ekstrakcji 310 1 dwu- chlcrometanu, oziebionego do temperatury 10°C, zawierajacego 1200 g chlorku cetylodwumetyloben- zyloamoniowego. Obie ciecze podawano pod cisnie- niem, z szybkoscia poprzednio ustalona, do ekstrak- tora, w którym mieszaly sie w ciagu okolo 2 mi¬ nut. Rozdzialu fazy dokonano przy pomocy prze¬ plywowej wirówki Sharples. 300 1 fazy dwuchloro- metanowej poddano czterokrotnej ekstrakcji wod- 40 nym roztworem jodku sodowego, uzywajac lacznie 7 1 wody, zawierajacej 210 g jodku sodowego. Fazy po odstaniu rozdzielono i faze wodna doprowadzo¬ no od wartosci pH = 7,7 do 7,0 przy pomocy kwa¬ su solnego, a nastepnie przesaczono. Otrzymany 45 ekstrakt w jodku sodowym, w lacznej objetosci 7 1, wykazywal aktywnosc 21900 j/ml.Kolumne szklana o srednicy 10 cm wypelniono do wysokosci 40 cm zawiesina QAE Sepadex A 25, produkcji Pharmacia Ltd., w 0,05 molarnym bufo¬ rze fosforanowym o pH = 7, zawierajacym 0,3 mo- larny chlorek sodowy. Przez kolumne przepusz¬ czono w temperaturze 5°C 7 litrów ekstraktu w jodku sodowym, przy szybkosci przeplywu 50 ml/ /minute. Nastepnie kolumne wymyto 0,7 molarnym NaCl w 0,05 molarnym buforze fosforanowym o wartosci pH = 7, w temperaturze 5°C i przy szybkosci przeplywu 25 ml/minute. Odrzucono 2 1 eluatu i odebrano 90 frakcji po 100 ml. Polaczono frakcje, w których spektrofotometrycznie stwier¬ dzono maksimum absorpcji UV o wartosci 305 nm (frakcje 50—62), otrzymujac laczna objetosc eluatu 1440 ml, wykazujacego aktywnosc 71000 j/ml. War¬ tosc pH doprowadzono do 7. W poprzednich bada¬ niach wstepnych stwierdzono, ze frakcje, wykazu¬ jace takie maksimum, zawieraja zwiazek MM 13902. 50 6031 94 006 32 Do otrzymanego ekstraktu dodano chlorek sodowy w ilosci 5 g/100 ml i otrzymany roztwór przepusz¬ czono w temperaturze 5°C przez kolumne o sred¬ nicy 6,3 cm wypelniona zywica Amberlite XAD 4, produkcji Rohm & Haas Ltd., do wysokosci 30 cm, przy szybkosci przeplywu 20 ml/minute. W tych warunkach na zywicy zostal zaadsórbowany zwia¬ zek MM 13902, natomiast nie zostaly zaadsórbo- wane zanieczyszczenia nieorganiczne. Zwiazek MM 13902 wymyto z kolumny w temperaturze po¬ kojowej 200 ml wody destylowanej, a nastepnie 50% wodnym metanolem. Otrzymano 1 1 eluatu, który zatezono do objetosci 70 ml przy pomocy odparowania pod zmniejszonym cisnieniem w tem¬ peraturze ponizej 30°C, doprowadzono do wartosci pH = 7 i zliofilizowano, otrzymujac 1,62 g brazo¬ wej pozostalosci, stanowiacej czesciowo oczyszczona sól zwiazku MM 13902, o aktywnosci 37000 j/mg. 1,0 g czesciowo oczyszczonej soli dwusodowej zwiazku MM 13902, o aktywnosci 37000 j/mg, pod¬ dano chromatografii na celulozie Whatman CC 31 w kolumnie o wymiarach 3,8 cmX30 cm, stosujac do wymywania mieszanine 4:1 obj./obj. n-propa- nolu i wody, przy szybkosci przeplywu 2,5 ml/mi¬ nute. Odrzucono 170 ml eluatu i odebrano 100 frakcji po 15 ml. Polaczono frakcje, w których przy pomocy pomiaru absorpcji UV stwierdzono wystepowanie soli dwusodowej zwiazku MM 13902 (frakcje 37—43), otrzymujac eluat o lacznej obje¬ tosci 89 ml, z którego pod zmniejszonym cisnieniem i w temperaturze ponizej 30°C usunieto n-propanol i otrzymany produkt zliofilizowano, otrzymujac 219 mg zóltawego proszku o aktywnosci 73000 j/mg.Otrzymany zwiazek wykazywal maksimum ab¬ sorpcji UV o wartosci okolo 308 nm, przy EJ °£°m okolo 343. Jego widma IR i NMR pokazano na rysunkach, odpowiednio, 2 i 3. Dane, odnoszace sie do aktywnosci antybakteryjnej zwiazku, za¬ mieszczono w ponizszej tablicy X. Analiza elemen¬ tarna wykazala zawartosc, miedzy innymi, azotu, siarki i sodu, przypuszczalnie w stosunku N:S:Na — 2:2:2. Dodatnie i ujemne maksima krzywych di- chroimu kolowego soli dwusodowej zwiazku MM 13902 oznaczono przy pomocy spektropolary- metru rejestrujacego Cary-61, przy stezeniach 0,37 mg/ml i dlugosci drogi optycznej 1 cm. Uzys¬ kano nastepujace wyniki: Mnm) AE/m 186 +67,24X10^* 221 —67,24X10^* 286 — 3,3 X10^* 323 — 8,2 X10^* T a b 1 i c a X Aktywnosc antybakteryjna soli dwusodowej zwiazku MM 13902 (metoda mikromiareczkowa — inokulum geste, 1/100, wzrost 16-godzinny) Organizm Bacillus subtilis A Staphylococcus aureus (Ox¬ ford) Staphyloccus aureus (Russell) Streptococcus faecalis Enterobacter cloacae N 1 Escherichia coli 10418 Escherichia coli JT 410 Klebsiella aerogenes A Proteus mirabilis 13 Proteus vulgaris WO 90 Providentia stuartii Pseudomonas aeruginosa A Salmonella typhimurium CT 10 Serratia marcescens US 39 Shigella sonnei Haemophilus influenzae P 6 Neisseria gonorrhoeae Najmniejsze stezenie hamujace (f^g/ml) 0,15 0,3 0,6 3,1 0,15 0,03 0,6 0,6 0,07 50 0,3 2,5 0,6—0,3 0,08 0,08 PL PL PL PL PL PL