NO141997B - Anvendelse av substrat for bestemmelse av desoksyribonuklease eller dettes antistoff - Google Patents
Anvendelse av substrat for bestemmelse av desoksyribonuklease eller dettes antistoff Download PDFInfo
- Publication number
- NO141997B NO141997B NO750272A NO750272A NO141997B NO 141997 B NO141997 B NO 141997B NO 750272 A NO750272 A NO 750272A NO 750272 A NO750272 A NO 750272A NO 141997 B NO141997 B NO 141997B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- substrate
- dns
- determination
- dnase
- dilution
- Prior art date
Links
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 title claims description 26
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 title claims description 26
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 20
- 229940109357 desoxyribonuclease Drugs 0.000 title 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 claims description 13
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 25
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 25
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 9
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 229960004533 streptodornase Drugs 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].[NH2+]1C=CN=C1 JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000009066 Hyaluronoglucosaminidase Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000002250 NAD+ Nucleosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010000193 NAD+ Nucleosidase Proteins 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010011834 Streptolysins Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 101150038956 cup-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010004031 deoxyribonuclease A Proteins 0.000 description 1
- 108010004029 deoxyribonuclease B Proteins 0.000 description 1
- 229940119679 deoxyribonucleases Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000012332 laboratory investigation Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003458 metachromatic effect Effects 0.000 description 1
- DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L methyl green Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC(=CC=1)[N+](C)(C)C)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000009928 nephrosis Diseases 0.000 description 1
- 231100001027 nephrosis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
- C12Q2304/10—DNA staining
- C12Q2304/18—Thionin-type dyes, e.g. Azure, Toluidine Blue
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
- G01N2333/922—Ribonucleases (RNAses); Deoxyribonucleases (DNAses)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Optical Filters (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Oppfinnelsens gjenstand er anvendelse av substrat inneholdende et kompleks av høymblekylært desoksyribonukleinsyre (DNS) og 2-amino-7-dimetylamino-3-metyl-difenaztioniumklorid (toluidinblå 0), fortrinnsvis i vektforhold DNS:toluidinblå 0 ca.
2:1/ til bestemmelse av enzymaktiviteten av desoksyribonuklease eller til bestemmelse av desoksyribonukleaseantistoff.
Tidsrommet mellom en bakteriell infeksjon og dens mani-festasjon, inkubasjonstiden, er klinisk stum og også laboratorieunder-<s>økelser fører sjelden til en diagnose før manifestasionen. Men den direkte påvisning av bakterielle stoffskifteprodukter ville det være mulig med en tidlig erkjennelse, den etterfølgende titerøkning av ett mot dette £toffskifteprodukt rettet antistoff gir en ekstra bekreftelse. Streptokokker av gruppen A danner flere slike ekstracellulære stoffskifteprodukter med enzymkarakter, som under tiden er immunogent virksomme, f.eks . Streptolysin 0, NAD-glykohydrolase, Streptodornase, Hyaluronidase og Streptokinase. Bestemmelsen av antistreptolysintiteren ved A-streptokokksykdommer hører til de innførte metoder,
hvor ved samtidig nærvær av andre sykdommer som Hepatitis, Lupus erythematodes, Nephrose og andre kan riktignok forutsettes ved u-spesifikke forstyrrelser av en øket titer av antistreptolysinet.
Dyrker man A-streptokokker i et egnet næringsmedium, så kan man i den bakteriefrie væsken over kulturen påvise desoksyribonukleaser av forskjellig elektroforetisk bevegelighet, som betegnes som Streptc dornase A, B, C og D (DNase A, B, C og D). Streptodornase B utgjør mengde- og aktivitetsmessig den største del, således at dette isoen-zym ved streptokokkinfeksjon trer tydeligst frem ved antilegemdannelse.
I forskjellig klinisk-kjemiske undersøkelser er det vist
at ved hudinfeksjoner forårsaket av A-streptokokker endres antistreptolysintiteren lite eller overhodet ikke, mens serumspeilet av Antistreptodornase B finnes tydelig forhøyet.
Den økende differensialdiagnostiske betydning av Antistreptodornase-B-titer nødvendiggjør enkle gjennomførbare fremgangsmåter til bestemmelse av antistreptodornasespeilet i blodserumet. Det er følgelig kjent en fremgangsmåte til å påvise antistreptodornase ved hjelp av metylgrønn og som beror på at en bestemt mengde desoksyribonuklease inkuberes med det serum som skal undersøkes på antistoffer. I avhengighet av tilstedeværende mengde av Streptodor-naseantistoffer nedsettes desoksyribonuklease i sin aktivitet. Tilsettes det til denne blanding et metylgrønn-desoksyribonukleinsyre-(DNS)-kompleks, så spaltes i avhengighet av den ennu tilstedeværende streptodornaseaktivitet metylgrønn-DNS-komplekset som derved avfarves. Avleseligheten ved gjennomføring av reaksjonen i en fortynningsrekke av serumet er ikke helt lett og fører ofte til feilaktige slutt-punktbestemmelser. Fremstillingen av dette reagens krever en relativt høy anvendelse av høymolekylært DNS.
Det er kjent at toluidinblå 0 formår å farve en høymole-kylær DNS-hcbldig agar blå, mens stedene i agaren, som eksempelvis ved bakteriell innvirkning inneholder enavbygget DNS, farves rosa med ' toluidinblå.
Det er nå funnet et substrat for bestemmelse av desoksyribonuklease og dens antistoffer, som inneholder et kompleks av høy-molekylært desoksyribonukleinsyre (DNS) og 2-amino-7-dimetylamino-3-metyldifenaztioniumklorid (toluidinblå 0). Anvendelsen av et DNS-kompleks med det metakromatiske farvestoff 2-amino-7-dimetylamino-3-metyl-difenaztioniumklorid (toluidinblå 0) ved den kvantitative bestemmelse, nemlig av streptodornase-antistoffer byr i forhold til de kjente fremgangsmåter fordeler. Innvirkning av ikke antigenbundet DNase fører derved til en avspaltning av farvestoffet fra komplekset under dannelse av en blå utfelling. Den overstående oppløsning blir farveløs. Det kan således ved bestemmelse av antistreptodornase-titeren i prøvesera ved hjelp av en fortynningsrekke fastslås de serumfortynninger ved enkle avlesninger, hvor det tilstedeværende antistoff ennu nettopp binder en bestemt mengde DNase og således opptrer nettopp ikke mere en blå utfelling. Det er hensiktsmessig å standardisere sluttpunktbestemmelse ved medføring av et serum med et fastlagt antistreptodornase B-innhold.
Ved bestemmelsen av desoksyribonuklease muliggjør anvendelsen av DNS-toluidinblå-komplekset en sammenlignbar enkel fast-slåing av reaksjonens sluttpunkt. Den ukjente DNase-aktivitet kan derved eksempelvis måles ved sammenligning med aktiviteten av en fastlagt enzymstandard, idet det inntil grenseverdien av enzymaktiviteten opptrer en blå utfelling, eller det kan forelegges en bestemt mengde av DNase-antilegemer og ved"hjelp av DNS-toluidinblå-komplekset påvises den konsentrasjon av DNase, som ikke mere bindes av den definerte antilegememengde og fører til spaltning av substratet under dannelse av en blå utfelling.
Fremgangsmåten til fremstilling av substratet er relativt enkel.
Hertil haes i vann eller i en vandig pufferoppløsning DNS og toluidinblå 0 og den lette uklarhet som danner seg oppløses ved kokning og samtidig homogenisering. Fortrinnsvis fremstilles substratet i en pufferoppløsning, hvis pH-verdi kommer nær reaksjons-optimum for den DNase som skal bestemmes. Egnede pH-verdier ligger
i området mellom pH 4 og pH 9• Hertil er det å anvende pufferstoffer, slik de anvendes for biologisk og fysiologisk arbeide, fortrinnsvis slike, som er foreslått av N.E. Good et al. Biochemistry 5, 467 (1966), For det nøytrale pH-området er det eksempelvis tris-hydroksymetylaminometan som er egnet. Fortrinnsvis anvendes ved substrat fremstillingen jordalkaliioner, eksempelvis i form av vannopp-løselig kalsium- eller magnesiumsalter, for ved besteffimelsesuLga.xi&o-punktet å sikre den fulle aktivitet av det på substratet innvirkende enzym, altså DNasen.
Tilstrebes en isotoni av substratet eksempelvis med plasma, så kan dette oppnås ved tilsvarende salttilsetninger. Et hertil vanligvis anvendt salt er natriumklorid. Som- DNS er det egne et handelsvanlig preparat med en høy molekylvekt (over 1.000.000), fortrinnsvis et DNS fra fiskesperma. Det er imidlertid også anvend-bart DNS med lavere molekylvekt og av annen opprinnelse. Konsentrasjonen av DNS utgjør hensiktsmessig 0,01 til 0,03$, fortrinnsvis 0,02%; konsentrasjonen av toluidinblå 0 utgjør 0,005 til 0,01555, fortrinnsvis 0,01?. Konsentrasjonen av de fortrinnsvis som jordalkali-ioneleveranter anvendte kalsium- eller magnesiumsalter utgjør fortrinnsvis 0,1 til 0, 5%. Disse salter tjener til aktivering av DNase. Det ved denne fremgangsmåte fremstilte substrat er en klar, homogen, blå oppløsning. Forholdet av de to komponenter i substratet kan hensiktsmessig velges innen fornuftige grenser. Hensiktsmessig er det ca. 2 vektdeler DNS på 1 vektdel toluidinblå 0, idet av-vikelser på 10% av dette forhold ikke er utslagsgivende.
Ofte vil det ved gjennomføring av prøven nære hensiktsmessig å foreta fortynningen av oppløsningene med en fortynningsvæske som inneholder et puffersystem, som er å utvelge tilsvarende pH-optimum av den DNasen som skal bestemmes. Ved siden av de av Good et al. (1966) foreslåtte pufferstoffer og andre for biokjemiske arbeider anvendbare puffersystemer har det for bestemmelser av DNaser i pH-området 6,0 til 8,0 vist seg som gunstig anvendelse av imidazol-saltsyre. Fortynnelsesvæsken inneholder fortrinnsvis en av stabili-satorene slik de hyppig anvendes ved arbeider i fortynnede enzymopp-løsninger. Proteiner, eksempelvis albuminer, gelatin og deres deri-vater er hertil likeså brukbare som polyhydroksyforbindelser, eksempelvis dekstraner og sukker.
Substratet egner seg spesielt i mikro-fremgangsmåter til bestemmelse av Streptodornase-antilegemer i klinisk diagnose, spesielt for de i serologien vanlige mikrotiterplater.
Det består imidlertid intet hinder til å anvende substratet under anvendelse av større voluma i reagensrør i makroprøven. Ved hjelp av substratet lar det seg likeledes som anført ovenfor
også utføre bestemmelser av DNase.
Ved en sammenlignende undersøkelse av antistreptodornase-B-titeren ved friske og pasienter som har gjennomgått en streptokokkinfeksjon, finnes med det i eksemplene angitte prøvesystem en tydelig økning av antistreptodornase B ved pasientene.
Mens ved normalpersoner serumtiteren av streptodornase-antilegemer ligger under 1:200, kan det ved titer over 1:200 blant annet diagnostisk sluttes til nærvær av reumatisk feber, infeksjoner av de øvre luftkanaler eller Glomeruleonephritis.
Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.
E ksempler.
1. Fremstilling av DNS- substratet.
Til 100 ml destillert vann settes 0,3 g trishydroksymetyl-aminometan, 0,5 g NaCl, 15 mg renset DNS og 0,05 ml av en 0,01 molar kalsiumkloridoppløsning. Oppløsningens pH-verdi innstilles ved hjelp av 1,Q ml 0,1 normal HC1 til pH 7,0. Blandingen kokes ca. 10 sekunder. Derved oppstår en homogen, klar oppløsning. Til den ennu varme opp-løsning har man 0,3 ml av en 0,1 molar toluidinblå-O-oppløsning, som fordeler seg homogent i første oppløsning.
Etter avkjøling er DNS-substratet egnet for aktivitets-bestemmelser. Skulle det ved en lengere lagring fremkomme fnokker,
så må substratoppløsningen igjen kort kokes opp før anvendelse.
. 2. Fremstilling av Streptodornase- B- antigen.
Av en 16 timer kultur av en DNase B-dannende A-strento-kokkstamme fremstillet etter kjente metoder renset DNase innstilles til 30 enheter pr. ml (målt i et Brookfield mikrorotasjonsviskosi-meter) (referert til DNase I fra Pankreas). Umiddelbart før prøven fortynnes antigenoppløsningen 1:30.
3. Fremstilling av fortynningsvæske.
400 ml av en vandig oppløsning av storfealbumin, som inneholder 250 mg storfealbumin pr. 100 ml, blandes med 100 ml av en 0,25 molar imidazol-HCl-puffer av pH 8,0, som inneholder 1,47 g kalsiumkloriddihydrat og 0,6 g magnesiumsulfat pr. liter.
4. Bestemmelse av Streptodornase- B- antistoffer i sera.
Bestemmelsen gjennomføres på følgende måte:
I mikrotiterplater ifylles i kopp 2 fra første rekke
25/Ul av fortynningsvæsken ifølge (3), i kopp 3, 2x25^ul av samme fortynningsvæske og i de følgende kopper hver gang 25/Ul av fortynningsvæsken. Derpå ifylles i kopp 1, 2 og 3 hver gang 25/Ul av en 1:50-fortynning av et serum fra friske personer. Når man går ut fra kopp 2, overpipetteres hver gang 25^ul av den dannede serumfortynning til kopp 4 og videre til kopp 6 og hver gang i kopp 8, 10 og 12. Når man går ut fra kopp 3 overføres hver gang 25/Ul av tilsvarende serumfortynning i kopp 5 og videre også i koppene 7, 9 og 11. Fra koppene 3, 11 og 12 kasseres deretter hver gang 25/Ul fra serumfortynningen.
Derved oppstår, gående ut fra kopp 1, en fortynningsrekke på 1:50,
100, 150, 200, 300, 400, 600, 800, 1200, l600, 2500 og 3200. De samme fortynningsrekker ansettes for de pasientsera som skal bestemmes i rekke 2 og 3 av mikrotiterplaten. Nå settes til hver av 25/Ul serumfortynning 25/Ul av antigenarbeidsfortynning ifølge (2) og hensettes 4 minutter på et rystebord. Deretter tilsettes 50^ul av substratopp-løsningen ifølge (1) til hver av fortynningene.
Derpå foregår en inkubasjon av blandinger ved 37°C.
Dannelsen av en blåutfelling viser fortynningen av det i serumet tilstedeværende antilegeme, som ikke mer formål å binde den tilsatte DNase. Så snart en i prøveblandingen medførte kontrollserum, hvis titer ble fastlagt med 1:150, danner utfelling inntil fortynning 1:150, foretas avlesning av verdiene. I foreliggende eksempel ble det i første rekke funnet en gjennomgående utfellingsdannelse. Titeren er således mindre enn 1:50. I annen rekke opptrådte utfellingsdannelse i fjerde kopp. Titeren er således 1:150. I tredje rekke danner det seg en utfelling fra åttende kopp tilsvarende en titer på 1:600.
5. Bestemmelse av desoksyribonuklease
I den første rekke av en mikrotiterplate ifylles i kopp 1 50 mikroliter av en kimfri, filtrert kulturoppløsning av streptokokker. De følgende kopper fylles med 25 mikroliter av fortynningsvæsken ifølge (3). Ved overføring av hver gang 25 mikroliter fra den første til annen, videre fra den annen i den tredje kopp osv. oppstår det en fortynningsrekke i avtrappingen 1:2, 1:4, 1:8 osv.
En DNase med kjent aktivitet fortynnes i annen rekke av mikrotiterplaten på samme måte. Nå tilsettes til hver gang 25 mikroliter av enzymfortynningene 50 mikroliter av substratopp-løsningen ifølge (1). Derpå foregår en inkubasjon av blandingen ved 40°C i 3 timer. Dannelsen av en blå utfelling gjelder som mål for enzymaktiviteten. Det anvendte streptokokk-kulturfiltrat danner en utfelling inntil 8. kopp tilsvarende en fortynning på 1:128.
Den som standard medførte kjente DNase fører i det angitte prøvesystem alltid til en utfellingsdannelse inntil 10. kopp tilsvarende en fortynning på 1:512.
Som resultat er det således å fastslå at kulturfil-tratet som ble undersøkt har en DNase-aktivitet på 25% av stan-darden.
Claims (1)
- Anvendelse av substrat inneholdende et kompleks av høymolekylært desoksyribonu kleinsyre (DNS) og 2-amino-7-dimetylamino-3-metyl-difenaztioniumklorid (toluidinblå 0) fortrinnsvis i vektforhold DNS: toluidinblå 0 ca. 2:1, til bestemmelse av enzymaktiviteten av desoksyribonuklease eller til bestemmelse av desoksyribonukleaseantistoff.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19732344441 DE2344441C3 (de) | 1973-09-04 | Verfahren zur Herstellung eines Substrats für die Bestimmung von Desoxyribonuklease und deren Antikörper |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO750272L NO750272L (no) | 1975-04-01 |
| NO141997B true NO141997B (no) | 1980-03-03 |
| NO141997C NO141997C (no) | 1980-06-11 |
Family
ID=5891540
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO743154A NO142579C (no) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | Substrat for bestemmelse av desoksyribonuklease og dets antistoff og fremgangsmaate for fremstilling av substratet |
| NO750272A NO141997C (no) | 1973-09-04 | 1975-01-29 | Anvendelse av substrat for bestemmelse av desoksyribonuklease eller dettes antistoff |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO743154A NO142579C (no) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | Substrat for bestemmelse av desoksyribonuklease og dets antistoff og fremgangsmaate for fremstilling av substratet |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3990946A (no) |
| JP (1) | JPS5722000B2 (no) |
| AT (1) | AT336781B (no) |
| BE (1) | BE819526A (no) |
| CH (1) | CH612008A5 (no) |
| DK (1) | DK134651C (no) |
| FI (1) | FI56283C (no) |
| FR (1) | FR2242685B1 (no) |
| GB (1) | GB1464038A (no) |
| IE (1) | IE39676B1 (no) |
| IT (1) | IT1020393B (no) |
| LU (1) | LU70841A1 (no) |
| NL (1) | NL179658C (no) |
| NO (2) | NO142579C (no) |
| SE (1) | SE401272B (no) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3038286A1 (de) * | 1980-10-10 | 1982-05-19 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur bestimmung der streptokokken-desoxiribonuclease b nach der toluidinblau o-methode |
| SE453020B (sv) * | 1983-07-06 | 1988-01-04 | Statens Bakteriologiska Lab | Serologisk diagnostik av beta-streptokockinfektioner med anvendning av maskinell avlesning med fotometer for mikrotiterplattor |
| FR2589166B1 (fr) * | 1985-10-25 | 1988-06-10 | Sopar Sa Nv | Procede de determination de l'activite des dnases |
| AU6418486A (en) * | 1985-10-25 | 1987-04-30 | Sopars, N.V. S.A. | Determination of deoxyribonuclease in biological fluid |
| FR2597504B1 (fr) * | 1986-04-18 | 1988-07-08 | Sopar Sa Nv | Procede de determination de l'activite des dnaases |
| DE3637253A1 (de) * | 1986-11-03 | 1988-05-05 | Behringwerke Ag | Latex-agglutinations-verfahren zum nachweis von anti-streptokokken-desoxyribonuclease b |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3042587A (en) * | 1960-11-29 | 1962-07-03 | Merck & Co Inc | Stabilized desoxyribonuclease preparation |
-
1974
- 1974-08-30 NL NLAANVRAGE7411561,A patent/NL179658C/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-09-02 IT IT26857/74A patent/IT1020393B/it active
- 1974-09-03 LU LU70841A patent/LU70841A1/xx unknown
- 1974-09-03 AT AT711474A patent/AT336781B/de active
- 1974-09-03 CH CH1195174A patent/CH612008A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-09-03 GB GB3844974A patent/GB1464038A/en not_active Expired
- 1974-09-03 DK DK465874A patent/DK134651C/da not_active IP Right Cessation
- 1974-09-03 US US05/502,500 patent/US3990946A/en not_active Expired - Lifetime
- 1974-09-03 FI FI2571/74A patent/FI56283C/fi active
- 1974-09-03 IE IE1821/74A patent/IE39676B1/xx unknown
- 1974-09-03 NO NO743154A patent/NO142579C/no unknown
- 1974-09-04 SE SE7411155A patent/SE401272B/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-09-04 BE BE148191A patent/BE819526A/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-09-04 FR FR7430023A patent/FR2242685B1/fr not_active Expired
- 1974-09-04 JP JP10098974A patent/JPS5722000B2/ja not_active Expired
-
1975
- 1975-01-29 NO NO750272A patent/NO141997C/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK465874A (no) | 1975-05-05 |
| DE2344441A1 (de) | 1975-03-27 |
| IE39676L (en) | 1975-03-04 |
| IE39676B1 (en) | 1978-12-06 |
| CH612008A5 (no) | 1979-06-29 |
| NL7411561A (nl) | 1975-03-06 |
| NO743154L (no) | 1975-04-01 |
| FI56283B (fi) | 1979-08-31 |
| NL179658C (nl) | 1986-10-16 |
| NO141997C (no) | 1980-06-11 |
| US3990946A (en) | 1976-11-09 |
| NO750272L (no) | 1975-04-01 |
| IT1020393B (it) | 1977-12-20 |
| NO142579B (no) | 1980-06-02 |
| GB1464038A (en) | 1977-02-09 |
| FR2242685A1 (no) | 1975-03-28 |
| FR2242685B1 (no) | 1978-06-09 |
| DK134651C (da) | 1977-05-16 |
| BE819526A (fr) | 1975-03-04 |
| AU7289374A (en) | 1976-03-04 |
| SE401272B (sv) | 1978-04-24 |
| LU70841A1 (no) | 1976-08-19 |
| NO142579C (no) | 1980-09-10 |
| DE2344441B2 (de) | 1976-02-19 |
| ATA711474A (de) | 1976-09-15 |
| DK134651B (da) | 1976-12-13 |
| JPS5052228A (no) | 1975-05-09 |
| SE7411155L (no) | 1975-03-05 |
| NL179658B (nl) | 1986-05-16 |
| AT336781B (de) | 1977-05-25 |
| FI257174A (no) | 1975-03-05 |
| FI56283C (fi) | 1979-12-10 |
| JPS5722000B2 (no) | 1982-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boobis et al. | A simple one-step enzymatic fluorometric method for the determination of glycerol in 20 μl of plasma | |
| Lindsay et al. | Single-step, chromogenic Limulus amebocyte lysate assay for endotoxin | |
| Spira et al. | Micromethod for assaying reverse transcriptase of human T-cell lymphotropic virus type III/lymphadenopathy-associated virus | |
| US4101382A (en) | Novel reagent and method for the determination of urea in biological fluids | |
| US4525452A (en) | Enzyme immunoassay with step of immersing sample in deionized water | |
| Clark et al. | Studies on the repression of β-galactosidase in Escherichia coli | |
| CN106370855B (zh) | 基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒 | |
| NO141997B (no) | Anvendelse av substrat for bestemmelse av desoksyribonuklease eller dettes antistoff | |
| Gregg | Bioluminescence in clinical microbiology | |
| US3778350A (en) | Diagnostic agent and method for determining glucose | |
| US4390622A (en) | Neisseria bacteria species identification and beta lactamase testing methods | |
| Mackie et al. | Regulation of the gal operon of Escherichia coli by the capR gene | |
| SE453614B (sv) | Forfarande for bestemning av kreatinkinas-mb-isoenzym formen av kreatinkinas samt diagnostestkit herfor | |
| Erickson et al. | Turbidimetric assay of staphylococcal nuclease | |
| CN107991500A (zh) | 糖化血红蛋白检测试剂盒 | |
| Scopes | A new enzymic method for inorganic phosphate determination | |
| JPH0833499A (ja) | 有害物質検出法 | |
| Murphy | Arterial actomyosin: effects of pH and temperature on solubility and ATPase activity | |
| Goudswaard et al. | Immunochemical determination of human lysozyme by laser nephelometry. | |
| US4812398A (en) | Reagent for measuring amylase activity and measuring method thereof | |
| KAVANAGH | Elements of photometric assaying | |
| US4481291A (en) | Process for determining streptococcal desoxyribonuclease B according to the toluidine blue O method | |
| Fitzgerald et al. | The microbiological assay of aneurine: an improved method employing Lactobacillus fermenti 36 | |
| Barton-Wright | The microbiological assay of the vitamin B 6 complex (pyridoxine, pyridoxal and pyridoxamine) with Kloeckera brevis | |
| Cooperman | [176] Microbiological assay of folic acid activity in serum and whole blood |