SE453020B - Serologisk diagnostik av beta-streptokockinfektioner med anvendning av maskinell avlesning med fotometer for mikrotiterplattor - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 453 020 andra substanser i serum än antikroppar som kan neutralisera den hemolytiska aktiviteten hos reducerad streptolysin O. Man har därför som komplement till AS-reaktionen på senare år tagit upp antideoxyribonukleas-B-reaktionen, ADNas-reaktionen, då den- na oftare än AS-reaktionen blir positiv vid streptokockbetin- gade hudinfektioner. Metoden för ADNas-bestämningen utarbetades redan 1949 men fick större intresse först 1958, när det visade sig att firstreptokockerna producerade fyra deoxyribonukleaser, A, B, C och D med olika egenskaper. DNas B påvisades nästan en- bart bland grupp A-streptokocker och var mest frekvent och rik- ligast förekommande bland dessa streptokocker.

ADNas-tester utföres vanligen som en neutralisationsreaktion med streptokock-DNas B som antigen. Principen för testet är att det färgade substratet avfärgas vid tillsats av enzym. Patientsera innehåller varierande koncentrationer av antikroppar mot DNas B efter streptokockinfektioner. Halten av antikroppar i serum mä- tes genom tillsättning av en viss mängd serum till enzymet in- nan detta tillsätts till substratet. Vid förekomst av antikrop- par fås en hämning av enzymaktiviteten med en minskad nedbryt- ning/avfärgning av substratet som följd.

I sin nuvarande utformning utföres testet så att en konstant mängd enzym, uppdelat på ett antal lika stora volymer, försät- tes med serie spädning av serum 1:50, 1:100, 1:200 etc. Vid jämförelse med kända kontrollsera kan man visuellt avgöra i hur hög utspädning ett patientserum inhiberar avfärgning av substra- tet för att på så vis få ett mått på koncentrationen av anti- kroppar. Reaktionen göres på s.k. mikrotiterplattor av transpa- rent plast, ca 8 x 12 x 1 cm med 12 st. brunnar i 8 rader, såle- des inalles 96 brunnar, vilka vardera rymmer ca 200 pl vätska.

Dispenseringen av reagenserna underlättas av manuell och auto- matiserad utrustning såsom flerkanaliga mikropipetter, etc. och tack vare mikrotekniken blir reagensåtgången liten.

Testet kan emellertid även göras så, att enzymet försättes med serum och avfärgningen av substratet följes kontinuerligt mot tiden, s.k. kinetisk analys.

.Qi 10 15 20 25 30 35 453 020 Omfattningen av testningen har undersökts i ett par länder och har därvid visat sig ligga på ca 4 miljoner test per år.

Uppfinningen avser ett sätt att förenkla utvärderingen av tes- ten och kännetecknas av att en avläsning sker maskinellt i en fotomster för mikrotiterplattor och att analysresultaten bear- betas automatiskt genom att en minidator anslutes till fotome- teIIl .

Enligt uppfinningen användes en fotometer försedd med 640 nm in- terferensfilter vid ADNas-test för avläsning av patientserums inhibering av avfärgningsreaktionen med streptokock-deoxyribo- nuskleas B och DNA-metylgrönt på mikrotiterplattor.

Apparatur för maskinell avläsning av mikrotiterplattor har ut- vecklats inom andra områden och funnit användning på många mik- robiologiska laboratorier. Exempel på dylik apparatur är Flow Laboratories Multiskan, Multiskan MC, Dynatech MR580, MR600, Microelisa Auto Reader, flerkanalsfilterfotometrar för digital avläsning av förändringar i absorbansen i små vätskevolymer dis- penserade på mikrotiterplattor.

Nedbrytningen av DNA med DNas kan följas visuellt med DNA-metyl- grönt som substrat. Lämpligen sker därvid fotometriska bestämnin- gar vid ca 640 nm, men DNA-aktiviteten kan också följas i UV-om- rådet vid ca 260 nm.> Genom att ansluta en minidator såsom PET eller ABC 800 kan man .sedan få ut analysresultaten bearbetade.

Utförandet av ett test skall beskrivas mera detaljerat i följan- de utföringsexempel.

Utföringsexempel, ADNas B-testet ADNas B-testet utfördes i stort enligt den metodik som prosen- terades av Nelson, J. och medarbetare i J. Lab. Clin. Med. 71: 867, 1968. 5 10 15 20 25 30 35 453 020 Serum med utgångsspädningen 1/25 späddes i en spädningsserie 1/2, 1/4 etc., i stället för, som Nelson rekommenderar, i tre serier med utgångsspädningarna 1/50, 1/60 och 1/80.

Streptokock DNas B enzym: DNas B enzym från streptokocker isolerades och renades med jonbyteskromatografi, isoelektrisk fokusering mm.

Enzymet i lösning förvarades ospätt vid -2500 eller frystorkat vid +5°C och späddes/löstes i lämplig pH-buffert före använd- ning.

DNA-metylgrönt substrat: Högpolymeriserat kalvtymus-DNA lös- tes till en koncentration av 0,1% (w/v) tillsammans med 0,005% 0,01% (w/v) metylgrönt, renat genom kloroformextraktion, i t.ex. 50 mM tris-HCl, pH 7,8 med 10 mM MgSO4 eller 50 mM imid- azolbuffert pH 7,7, med 10 mM Mg S04. Som bakteriostatikum kan användas 0,02 % (w/v) natriumazid eller 0,7 % (W/v) kloro- form.

Efter ca 48 timmar vid rumstemperatur frystes substratet och förvarades vid -25°C eller frystorkades och förvarades vid -+5°C.

Standardserum: Humanserum med känd titer inaktiverades (56°C, 30 min.) före utspädning 1/25.

Spädningsvätska: Som spädningsvätska kan lämpligen användas 10 mM tris-HCl-buffert, pH 7,6 med 0,1 % (w/v) bovint serum- albumin.

Metodik 1.

Till en mikrotiterplatta av transparent plast sattes 100 / referenslösning för fotometern. ul spädningsvätska till alla brunnar i kolumn 1, som Till alla brunnar i kolumn 2 sattes 25/ul spädningsvätska, 25/ul DNas-spädning och 50/ul DNA-metylgrönt som (enzym + substrat) kontroll dvs. reaktionskontroll. 10 15 20 25 30 35 453 020 Till alla brunnar i kolumn 3 sattes 50/ul spädningsvätska och 50/ul DNA-metylgrönt, som substratkontroll.

Till alla brunnar i kolumnerna 4 - 12 sattes 25/ul späd- ningsvätska utom till brunnarna i första raden.

För beräkning av titrar hos standardsera och patientsera utnyttjades kolumnerna 4 - 12 på första plattan och kolum- nerna 2 - 12 på ytterligare plattor. Kolumn 1 användes genomgående på alla plattor för referenslösning för foto- metern. Nedanstående beskrivning för kolumn 4 - 12 på första plattan gäller även kolumn 2 - 12 på alla efterföl- jande plattor.

Till första radens brunnar i kolumnerna 4 - 12, sattes 50/ul inaktiverat (56°C, 30 min.) standardserum eller patientserum, spätt 1/25 med spädningsvätska. Lämpligen kan tre standardsera med olika titrar sättas till brun- narna i kolumn 4 - 6.

Från första radens brunnar i kolumnerna 4 - 12 framställ- des spädningsserier av standard- och patientsera från 1/25 (rad A), 1/50 (rad B) etc. till 1/3200 (rad H), med 25/ul i varje brunn.

Kolumnerna 4 - 12 försattes med 25/ul DNas-spädning till varje brunn. Plattorna skakades på speciellt skakbord och sattes i 37°C termostat i 15 minuter, varvid plattorna skakades ytterligare en gång efter ca halva tiden.

Totalspädningen av serum plus enzym i brunnarna blev 1/50 (rad A), 1/100 (rad B) etc. till 1/6400 (rad H).

Kolumnerna 4 - 12 försattes med 50/ul DNA-metylgrönt till varje brunn. Plattorna skakades enligt ovan och inkubera- des i 37°C termostat. Efter 15 minuter skakades plattorna. ytterligare en gång, varefter de fick stå i termostaten 19 - 24 timmar. 10 15 20 25 30 35 40 453 020 Avläsning: Reaktionen avlästes med hjälp av en fotometer för mikrotiterplattor, Flow Laboratories Multiskan, Multiskan MC, Dynatech MR 580-, Dynatech MR 600-/ Microelisa Auto Reader eller liknande.

Reaktionen avläses optimalt vid 640 nm men kan läsas vid - 575 - 680 nm eller 422 nm. Vissa av fotometrarna har möjlighet till korrigering av absorbansvärdena för repor och ojämnheter h på mikrotiterplattorna vilket kan göras vid 465 - 505 nm eller bäst vid 700 nm och större våglängd.

Till fotometern är ansluten en lämplig smådator med flexskive- enhet och printer t.ex. Commodore CBM model 8032 eller Luxor ABC 800 eller liknande.

Ett program har utvecklats som presenterar data på bildskärm och medger att operatören kan korrigera uppenbart felaktiga värden varefter resultatet skrivs ut på skrivaren i tabell- form. Alla data lagras på flexskiva för vidare bearbetning och arkivering. Programmet beräknar titrarna för patient- och kontrollsera enligt nedanstående definitioner: Positiv reaktion (+) definieras som att absorbansen för pro- vet är större än eller lika med medelvärdet för absorbansen för DNA-metylgrönt minus 50 % (kolumn 3).

Negativ reaktion (-) definieras som att absorbansen för pro- vet är mindre än eller lika med medelvärdet för enzym + DNA- -metylgrönt plus 50 % (kolumn 2). ' Positiv/negativ reaktion (+/-) definieras som att absorbansen för provet ligger mellan ovanstående värden, och bedöms som negativ reaktion.

ADNas-titern anges som reciproka värdet av den högsta total- spädningen av serum plus DNas B enzym i brunnen (metodik n) punkt 7) som definierats som positiv reaktion enligt ovan.

Ett exempel på utskrift av resultatet från en bestämning av titrarna för standard- och patientsera enligt ovan visas i tabellen. 453 020 omr. A nmcwum >fiuflwOm wwo. v "mcwnm >flummmz oofi u NP ooæ n ff oow " oP ooæ u ooN N m ooN H ß ooN N w ooæ u m oow u w ooww A u om v H N ~^UmHo umuuflfi I I I | | 1 1 I | + I 1 w I I I I I I I .I I + l I U 1 -\+ - -\+ - - - -\+ - + - - h I + |\+ + , I I I + ..\+ + l I m 1 + + + |\+ |\+ I + + + | 1 Q |\+ + + + + + + + + + | l U + + .+ + + + + + + + l I m + + + + + + + + + + | | 4 NF vf op m w ß w m w m N P wNo.o mmo.o Nmo.o mmo.o Nmo.o mmo.o vmo.o mmo.o wmo.o oæN.o >No.o moo.o m mNo.o ~mo.o mNo.o omo.o mNo.o NNo.o >No.o wmo.o ~mo.o wßN.o wNo.o mmm.m U ßNo.o wmo.o mmo.o mmo.o mmo.o mmo.o mmo.o wmo.o Nwo.o wwN.o vmouo ~oo.o m mNo.o PwN.o ~mo.o wNN.o mNo.o mmo.o ~mo.o mw~.o omo.o ß>N.o mNo.o ßmm.m m wmo.o «ßN.o wFN.o m@N.o m~P.o fmo.o Nwo.o wwN.o wmP.o wæN.o mmo.o «oo.o Q FN~.o ßmN.o wmN.o wmN.o æNN.o wvN.o wNN.o owN.o mNN.o æwN.o >No.o æmm.m U ß«N.o wmN.o ~vN.o mmN.o fmN.o vwN.o «wN.o w>N.o vmN.o «wN.o wmo.o moo.o m mNN.o mwN.o NNN.o wmN.o foN.o æmN.o æmN.o w>N.o omN.o mNN.o mmo.o wmm.ß 4 Nr .rv ow m w ß w m w m N P P muumam Q Q W m 4 H

Claims (8)

s 10 15 20 25 30 35 453 020 Patentkrav

1. l. Sätt vid serologisk diagnostik av ß-streptokockinfek- tioner genom att streptokock-DNas B neutraliseras med patientserum på mikrotiterplattor. k ä n n e t e c k n a t av att en avläsning sker maskinellt i en fotometer för mikro- títerplattor och att analysresultaten bearbetas automatiskt genom att en minidator anslutes till fotometern.

2. Sätt enligt krav l. k ä n n e t e c k n a t av att DNA- -metylgrönt användes som substrat och att plattan belyses med monokromatiskt ljus med 575-680 nm eller 422 nm. företrädes- vis med 64O nm.

3. Sätt enligt krav 1. k ä n n e t e c k n a t av att DNA användes som substrat, att mikrotiterplattor av UV-transpa- rent plast användes och att plattorna belyses med monokroma- tískt UV-ljus med våglängden 260 eller 254 nm.

4. Sätt enligt krav 1. k ä n n e t e c k n a t av att DNA användes som substrat, att míkrotiterplattor av UV-transpa- rent plast användes och att plattorna belyses med monokroma- tiskt ljus och fluorescensen avläses.

5. Sätt enligt något av krav 1-4. k ä n n e t e c k n a t av att avläsningar göres på en serie utspädningar av serum.

6. sätt enligt något av krav l-4,“ k ä n n e tïe c k n a t av att mätningarna göres upprepade gånger på samma prov med tidsmellanrum.

7. Användning av en fotometer försedd med 640 nm interfe- rensfilter vid ADNas-test för avläsning av patientserums in- hibering av avfärgningsreaktionen med streptokock-deoxyri- bonukleas B och DNA-metylgrönt på mikrotiterplattor. 0:» 455 020 q

8. Användning av en fotometer försedd med 260 eller 254 nm filter vid ADNas-test för avläsning av patíentserums ínhibe- ring av reaktionen mellan streptokock-deoxyríbonukleas B och DNA och patientserum på míkrotíterplattor.