NO138753B - Innretning til fremstilling av kuler av smeltet metall, saerlig av sink, kadmium eller tinn, henholdsvis av legeringer som inneholder aluminium, kadmium, kobber, magnesium, titan, sink eller tinn - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for dyrkning av vanlig forkjølelsesvirus.

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for dyrkning av vanlig for-kjølelsesvirus som kan anvendes ved fremstillingen av en vaksine som kan gi en grad av immunitet mot vanlig forkjølelse.

Det har hittil ikke vært praktisk mu-lig å dyrke vanlig forkjølelsesvirus in vitro.

Det er nå blitt funnet at vanlig for-kjølelsesvirus kan bli dyrket in vitro under spesielle forhold som avviker fra de som vanligvis blir brukt ved virusdyrkning i levende celler.

Dyrkingen av vanlig forkjølelsesvirus

er spesielt av betydning siden den kan danne grunnlaget for en vaksine som ved innsprøytning vil gi en viss grad av immunitet til den vaksinerte person mot vanlig forkjølelse.

Det er nå blitt funnet at dyrkingen av

vanlig forkjølelsesvirus er — i det minste i de første trinn •— bestemt av valget av spesielle temperatur- og pH-forhold som avviker fra dem som vanligvis nyttes ved virusdyrkning.

Det er således blitt funnet at vanlig

forkjølelsesvirus som fås direkte fra mennesket, bør inkuberes i nyrevev eller celler fra primater ved en temperatur under den som ellers kommer i betraktning, og i et engere område av pH-verdien.

Oppfinnelsen fremskaffer altså en fremgangsmåte for fremstilling av et pro-dukt som kan bli anvendt som et vaksine-mellomprodukt eller for eksperimentelle formål hvori et saltmedium som egner seg for vevsdyrking og som inneholder levende nyrevev eller celler fra primater blir innpodet med stoffer som inneholder i det minste en stamme av vanlig forkjølelses-virus fra mennesker hvoretter mediet blir inkubert ved en temperatur av fra 30° C til 36° C ved en pH mellom 6,4 og 7,4 inn-til viruset har formert seg i mediet.

Inkubasjonstrinnet bør utføres under relativ bevegelse av dyrkningsmediet i forhold til vevet eller cellene, fortrinnsvis ved rulling av karet som inneholder dyrkningsmediet og vevet eller cellene.

Fortrinnsvis er pH mellom 6,8 og 7,2. Saltmediet som anvendes, er fortrinnsvis et som er isotonisk, f. eks. Parker's medium 199 eller Hank's saltmedium tilsatt f. eks. en del av et enzymhydrolyse-produkt av lactalbumin.

I et hvert tilfelle bør det anvendte medium være slik at det understøtter veksten in vitro av de levende animalske celler eller vev.

Virusinfisert stoff kan oppnås direkte fra mennesket ved f. eks. neseutspyling eller gurgling. Disse stoffer kan inneholde ytterligere virusorganismer, og det foretrekkes at dyrkningsmediet inneholder ett eller flere antibiotika for å drepe disse. Det foretrekkes derfor å anvende et medium som inneholder passende mengder av penicillin og streptomycin og et egnet antifungisk middel, f. eks. mycostatin.

Det levende animalske celle- eller vevsmateriale ved dyrkingen er fortrinnsvis i form av et enkelt lag av celler som formerer seg i saltoppløsningen. Det er blitt funnet at med hensyn til i det minste flertallet av stammene av vanlig forkjø-lelsesvirus blir de beste resultater oppnådd når cellene er fra nyrene i mennes-kefoster som fjernes fra gravide kvinner i tredje til fjerde måned ved keisersnitt. Visse stammer av vanlig forkjølelsesvirus er blitt funnet å formere seg under de ovenfor nevnte forhold når cellematerialet eller vevet stammer fra nyrene hos aper, f. eks. arter av Macacus, f. eks. Rhesus- og cynomolgusaper.

Det er av stor betydning å være i stand til å studere viruspreparater som er fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse for å justere den relative styrke av preparater som er fremstilt under vari-erende betingelser. Det er også av betydning å ha en slik justeringsmetode som kan bli anvendt som en kontrollmetode ved fremstillingen av vaksine eller vaksine-mellomprodukt.

Det er nå blitt funnet at den cytopatiske virkning som oppstår hos vanlige for-kjølelses viruspartikler ved inkubasjon med levende animalske celler i et passende medium, fremskaffer en metode til å justere styrken av et bestemt preparat. Når inkubasjonen blir utført i overensstemmelse med forholdene ifølge den foreliggende oppfinnelse, forårsaker den cytopatiske virkning av sykdomsdannende viruspartikler dannelsen av flekker (også kalt fokale lesjoner), som lett kan ses under mikro-skopet. Etter en viss inkubasjonstid begyn-ner flekker å opptre i cellelaget som et re-sultat av virkningen av individuelle sykdomsdannende viruspartikler som kulturen opprinnelig ble innpodet med. Disse flekker blir i dette krav kalt primære flekker. Under inkubasjonen produserer cellene selv ytterligere mengder av virus som med tiden sprer seg gjennom cellelaget og forårsaker dannelsen av hva som betegnes sekundære flekker. Det er bare antallet av primære flekker som angir styrkegrad av det anvendte viruspreparat.

Det er innlysende at ikke alle stammer av vanlig forkjølelsesvirus vil vokse i det ovenfor beskrevne medium, men det kan lett bestemmes om en spesiell stamme er passende ved å prøve den på følgende måte: Viruset blir inkubert som beskrevet ovenfor, og cellematerialet blir betraktet under et mikroskop når et vesentlig antall av primære flekker er blitt dannet, men før dannelsen av sekundære flekker, og antallet av primære flekker blir opptalt.

Det passende tidspunkt ved hvilket observasjonen må gjøres for å telle primære, flekker, kan ikke bestemmes med nøyaktighet da det vil avhenge i ethvert gitt tilfelle av det anvendte cellemateri-ale, den virusstamme som blir prøvet, og dens styrkegrad og dyrkningsforholdene. Den optimale tid for observasjon kan vari-ere fra to til tolv dager (f. eks. 5 eller 6 dager) eter inkubasjonens begynnelse, men med erfaring kan man lett bestemme den optimale tid. Under dannelsen av de primære flekker vil antallet av disse sam-menlignet med antallet av flekker som blir opptalt i et kontrollforsøk med en standardprøve av virus, angi den omtrent-lige styrkegrad av det prøvede preparat i forhold til standardpreparatet. Bestemmel-sen vil være mest nøyaktig på et tidspunkt når det maksimale antall av primærflekker er dannet og før dannelsen av sekundære flekker setter inn.

Den foreliggende oppfinnelse atskiller seg spesielt fra tidligere forslag for det første i temperaturen ved hvilken inkubasjonen blir utført (disse temperaturer er vesentlig under de som vanligvis anvendes ved vevsdyrking) og også i forbindelse med den anvendte pH.

Den foreliggende oppfinnelse angår spesielt det tilfelle at det anvendte medium inneholder et alkalimetall-bicarbo-nat, fortrinnsvis natriumbicarbonat, i en mengde av mellom 0.001 og 0.01 M, idet bicarbonatet fortrinnsvis er tilstede i en mengde av fra 0.002 til 0.005 M. Andre stoffer kan imidlertid bli brukt for å gi den ønskede pH i mediet, f. eks. en natriumfosfatpuffer, som gir pH-verdier på mellom 7.14 og 7.69 ved en sluttkonsentrasjon på 0.05 M i mediet. Den foretrukne temperatur er mellom 31° C og 35° C, f. eks. mellom 32 og 34° C. De beste resultater blir oppnådd ved tilnærmelsesvis 33° C, dvs. mellom 32,5 og 33,5° C.

Det er blitt funnet at ved dyrkingen av de virus som er nevnt ovenfor, er det mu-lig å oppnå et vandig medium som inneholder viruset eller virusene, og den vandige oppløsning kan bli skilt fra det faste materiale, f. eks. ved sentrifugering, etter inkubasjon fra 2 til 14 dager og fortrinnsvis 4 til 12 dager, og spesielt fra 6 til- 9 dager.

Når produktet i henhold til foreliggende oppfinnelse skal anvendes ved fremstillingen av en vaksine mot vanlig for-kjølelse, kan det være nødvendig å kon-sentrere antigenet i mediet, dvs. ved ultra-sentrifugering, dialyse eller ved gjennom-strømning i en ionevekslingkolonne. De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen: Eksempel 1.

En suspensjon av celler fra apenyrer ble fremstilt fra en opprinnelig kultur av vev fra apenyrer. Disse celler ble fortyn-net til en konsentrasjon av omtrent 60.000 pr. ml. i et medium som besto av 5 pst. kalveserum, 0,5 pst. lactalbuminhydrok-sat i Hank's saltoppløsning inneholdende 0,035 pst. av natriumbikarbonat, 100 enheter pr. ml. av penicillin og 100 mg av streptomycin. Volum på 0,5 ml. av denne suspensjon ble innført i rør i en rullemas-kin og ble inkubert i omtrent tre dager mens de var i ro. Mediet ble nå fjernet og erstattet med 1,5 ml. av et nytt medium som besto av 2 pst. av kalveserum, 0,25 pst. av lactalbumin og natriumbikarbonat og antibiotika som før. Til hver kultur ble tilsatt 0,2 ml. fra en neseutvaskning av en pasient eller en frivillig som var blitt be-smittet med HGP-stammen av forkjølel-sesvirus. Kulturen ble plassert i en rulleanordning i en inkubator ved 33° C. Ca. fem dager senere begynte nedbrytingen i cellelaget. Etter ca. 10 dager var nedbrytingen tydelig, og mediet inneholdt da det ble isolert, store mengder virus.

Eksempel 2.

Eksempel 1 ble gjentatt under anvendelse av en natriumfosfatpuffer som hadde en pH på 7,2 ved en sluttkonsentrasjon på 0,05 M. Det følgende eksempel beskriver hvordan prøvene på styrke kan bli utført.

Styrken av et preparat som inneholder HGP-virus, blir prøvet i vevskulturer under anvendelse av sekundære kulturer av celler fra rhesusnyrer. Mellom 30.000 og 40.000 celler blir innpodet i rør som er i ro og som inneholder 0,5 ml av et medium som består av 5 pst. kalveserum og 0,5 pst. av lactal-buminhydroksat (LAH) i Hank's saltopp-løsning inneholdende 0,03 pst. av natriumbikarbonat og 100 enheter av penicillin, 100 |ig av streptomycin og 20 enheter av mycostatin pr. ml. Etter en periode av stasjonær dyrking på fra 24 til 48 timer ved en temperatur på 36° C blir dyrkningsmediet fjernet og erstattet av 1,5 ml av et medium inneholdende 2 pst. av kalveserum og 0,25 pst. av lactalbuminhydroly-sat og som også inneholder de andre be-standdeler i det opprinnelige medium i de mengder som er angitt ovenfor. Kulturene blir deretter inokulert med et virusinne-holdende materiale enten øyeblikkelig eller innen en dag etter skiftingen av medium, og de innpodede kulturer blir inkubert ved 33° C i en rulleanordning under de forhold som er beskrevet i eksempel 1. De beste resultater blir oppnådd med me-dier som har en middel pH på 7,0—7,4. I en modifikasjon av denne metode kan den ønskede pH i mediet bli oppnådd ved anvendelse av i stedet for natriumbicarbonat, en natriumfosfatpuffer av pH 7,14 til 7,69 ved en sluttkonsentrasjon av 0,05 M i mediet. Etter inkuberingen blir det med mellomrom tatt prøver som blir undersøkt mikroskopisk for å telle antallet av flekker som opptrer på cellelaget. I disse for-søk vil det bli funnet at opp til omtrent tre dager etter innpodningen vil antallet av flekker som opptrer, være direkte pro-porsjonalt med konsentrasjonen av virus i de preparater som prøves. Ved tellingen av flekkene er det naturligvis nødvendig å bestemme det minste antall av celler i en focal lesjon for at den skal telles som en flekk. Man kan således f. eks. bli enig om at en fokus må inneholde i det minste 10 celler for å bli notert som en flekk. Det er selvfølgelig å anvende det samme system for telling ved preparatene som blir prøvet som ved standardprøvene av virus som blir anvendt av sammenligningsgrunner. Prø-ver som viser et uvanlig høyt antall flekker, dvs. 15 eller 18, kan etter avtale utelates fra de observerte resultater. Etter omtrent tre dager finner man at antallet flekker øker, og man kan anta at disse siste flekkene er sekundære flekker.

Ved anvendelsen av prøvemetoden som er beskrevet ovenfor med HGP virus i kulturer av nyreceller fra aper, er det blitt funnet at av de betingelser som er anvendt for formeringen av viruset, er pH-verdien av større betydning enn de ioni-serte forbindelser som blir anvendt for å gi den ønskede pH. Tilstedeværelsen av bicarbonationet er derfor ikke et nødven-dig trekk ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse eller ved den prøvemetoden som er beskrevet ovenfor, idet passende puffere, f. eks. de ovenfor nevnte fosfatpuffere, kan bli anvendt.

Det er også blitt vist at dersom HGP virus blir blandet før innpodingen i kulturmediet med et spesielt hyperimmunan-tiserum som er fremstilt i en kanin, blir flekkantallet redusert. Derfor kan prøve-metoden som er beskrevet ovenfor, bli anvendt ikke bare som en kontrollmetode ved fremstillingen av en vaksine, men også i forbindelse med et spesielt immunserum for bestemmelse og kontroll av virusstam-mene som er innarbeidet i vaksinen. Meto-den kan videre bli anvendt for å fastslå antistoff reaksjonen mot eksperimentielle

vaksiner eller prøvevaksiner som er blitt

tilført dyr eller mennesker.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for dyrking av vanlig forkjølelsesvirus ved inkubering i et vevdyrkings-system omfattende et kultur - medium, inneholdende celler som stammer fra primater, som f. eks. rhesus-aper og bavianer, som er istand til å underholde veksten av den utvalgte stamme eller stammer av virus, karakterisert ved at kulturmediet opprettholdes ved en temperatur av fra 30—36° C, og ved en pH av 6,4—7,4, og beveges i forhold til cellene under inkuberingen.

2. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 1, karakterisert ved at pH er mellom 6,8 og 7,2.

3. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 1—2, karakterisert ved at temperaturen er mellom 32° C og 34° C.

4. Fremgangsmåte som angitt i en hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at mediet inneholder et alkalimetallbicarbonat i en konsentrasjon av mellom 0,001 M og 0,01 M.

5. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 4, karakterisert ved at konsentrasjonen er mellom 0,002 og 0,005 M.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at vev- eller cellematerialet er i form av et enkelt skikt av celler som vokser i mediet.

7. Fremgangsmåte som angitt i hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at mediet inneholder en natriumfosfatpuffer, som har en pH av mellom 7,14 og 7,69 ved en konsentrasjon av 0,05 M.