NO136050B - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av et antibiotisk aktivt kompleks bestående av de to nye antibiotica G-^+18 og Verdamicin I og de to kjente antibiotica Sisomicin og Gentamicin A med formelen:

i hvilken, for Gentamicin A: R = Hj R-j_ = 0H$ R2 = OH* R^ = Hj R^=CH, med en enkeltbinding mellom <C>15 °S <C>l6*

for Sisomicin: R = CHy, \ - Hj R2 = Hj R^ = Hj R^ = NHg, raed en dobbeltbinding mellom C15 °S <C>16*

for Verdamicin I: R - CH^j B. ± = Hj R2 = H» Rl,. = CH^

R^ = NH25 med en dobbeltbinding mellom C-^ og Cl6<*> og

for Antibioticum G-^18: R = CHy, R-j_ = 0H-, R2 = OH*

R^ = CH^ R5 = OH, med en enkeltbinding mellom C-^ og <C>l6<*>

eller av de enkelte antibiotica samt farmasøytisk godtagbare syreaddisjonssalter av slike forbindelser, hvilken fremgangsmåte er karakterisert ved at en mikroorganisme av arten Micromonospora grisea dyrkes i et vandig næringsmedium under aerobe betingelser og at det antibiotiske kompleks eller ett eller flere av de enkelte antibiotica isoleres, enten som frie baser eller i form av syreaddisjonssalter.

Micromonospora grisea

Mikroorganismen Micromonospora grisea (av og til betegnet som M. grisea) ble erholdt fra jordprover i nærheten av Topeka, Kansas. Mikroorganismen er deponert hos United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division,- Peoria, Illinois, hvorfra underkulturer er tilgjenge-lig, og har fått deponeringsnummer NRRL 38OO.

Micromonospora grisea er blitt klassifisert som en ny art av Micromonospora på grunnlag av dets taxonomiske og vekstegen-skaper på en rekke standardmedier.

Micromonospora grisea produserer et grå-gront pigment når det dyrkes på forskjellige medier som karakteriseringsmediet angitt nedenfor. Den mest kjennetegnende egenskap nos Micromonospora grisea er dets evne under regulerte betingelser til å danne et antibiotisk aktivt produkt som består av h hovedbestanddeler, som definert nedenfor, sammen med mindre mengder av andre stoffer som ennu ikke er identifisert.

Ved.beskrivelsen av mikroorganismen M. grisea anvendes

her to farvebetegnelser. Den forste farvebetegnelse er tatt fra "Color Harmony Manual", ^th Edition, 1958, utgitt av Container Corporation of America (U.S.A.) og beskrivelsen av

den forste f arvebetegnelse er tatt fra "Descriptive Color Natne Dictionary" av Taylor, Knoche og Granville, også utgitt av Container Corporation of America (U.S.A.) (1950). Den annen farvebetegnelse er et synonym eller et nært synonym av den forste og er tatt fra National Bureau of Standards Circular No. 553 (1955)-U.S.A.

Når det steriliserte medium inokuleres med Micromonospora grisea og inkuberes ved 26 - 28°C i 2h dager, iakttaes folgende farveutviklinger: Sporulasjonsområde: "Slate green g231i", "grayish green 150"$ ved forlenget inkubasjon kan sporulasjonsområdet bli sort.

Vegetativt område: "light tan g3gc", "light yellowish brown 76".

Micromonospora grisea kan videre karakteriseres ved folgende taxonomiske data:

Micromonospora grisea reduserer ikke nitrat, vokser godt på gelatin under bevirkning av hydrolyse, og vokser i medier inneholdende 1,5$ natriumklorid, men vokser ikke i et lignende medium inneholdende 3% natriumklorid.

Micromonospora grisea krever assimilerbare kilder til carbon og'nitrogen for god vekst og antibioticumproduksjon. Et vidt område av slike Silder kan anvendes.

Denne mikroorganisme er aeroti og vokser ved temperaturer fra 20° til ^0°C, fortrinnsvis 28 - 35°C, og ved pH-verdier på fra 6,5 til 8,5, fortrinnsvis 7,2 - 8,3.

I tillegg til de foregående taxonomiske data kjennetegner

tabellene I, II og III M. grisea ytterligere:

Fermentering av

Micromonospora grisea

Fermenteringen utfores under anvendelse av standardmetoder for fremstilling av antibiotica ved dyrkning av mikroorganismer.

Betraktelige mengder av antibiotica produseres når mikroorganismen dyrkes i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder til carbon og nitrogen under aerobe, fortrinnsvis submerst- aerobe, betingelser. Eksempler på assimilerbare carbon-kilder er carbohydrater, som de som er angitt i Tabell II, særlig glucose, xylose og mannose. Eksempler på assimilerbare kilder til nitrogen er proteiner og aminosyrer, og materialer ' inneholdende disse, som kjottekstrakt, gjærékstrakt og soyabonnemel. God vekst og antibioticumproduksjon kan fåes ved å anvende fermenteringsmetod-ene angitt i eksempel 1. Mediene kan supplementeres med spormengder av uorganiske salter som magnesiumsulfat, ferrosulfat,

og særlig koboltklorid for å oke antibioticumproduksjonen.

Fermenteringen utfores vanligvis i to eller tre trinn, idet

det forste trinn eller de to forste trinn vies kimdannelsen av mikroorganismen for å danne et passende inokulum. Som en alminnelig regel krever store (tank) fermenteringer to kimdannelsestrinn mens ryste-kolbefermenteringer krever bare ett kimdannelsestrinn. Rimdannelses-trinnet utfores under aerobe betingelser under omroring, fortrinnsvis roterende omroring ved f.eks. ca. 250-^00 opm, vanligvis ved en temperatur i området fra ca. 25° til ca. 35°C i 1 - <*>f dager.

Det siste fermenteringstrinn'(produksjonstrinnet) påbegynnes ved å inokulere under sterile betingelser et passende medium med det på forhånd fremstilte inokulum. Produksjonstrinnet av fermenteringen utfores vanligvis i samme temperaturområde som kimdannelsestrinnet. Videre kreves det vanligvis fra ca. h til ca. 7 dager for å nå toppaktivitet. Ulik kimdannelsestrinnet hvor pH vanligvis forblir stabil, krever produksjonstrinnet regulering av pH til området fra ca. 7,2 til ca. 8,3- .

I lopet av fermenteringen, særlig efter de forste 2h timer, folges fermenteringen ved bestemmelser ved passende mellomrom (f.eks„ hver 6. eller 8.- time), for å bestemme når den antibiotiske toppaktivitet nåes.

Bestemmelsen er fortrinnsvis en standard skive-platebestemmelse under anvendelse av et passende medium og forsoksorganisme. Full-stendige detaljer angående foretrukne bestemmelser er gitt nedenfor.

Isolering av antibiotica

Mr den antibiotiske toppaktivitet er nådd, hostes produktet,

i alminnelighet ved en kombinasjon av trinn som syring, filtrering, adsorpsjon, eluering og inndampning, f.eks. lyofilisering. Ved en foretrukken isolasjonsmetode felles tilstedeværende calciumioner som et uopploselig salt, hele fermenteringsvæsken syres, fortrinnsvis med en mineralsyre, og fermenteringsblandingen klares ved filtrering eller sentrifugering. Efter noytralisasjon adsorberes det antibiotiske produkt på en passende kationbytteharpiks, f.eks. en svakt sur ionebytteharpiks i ammoniumformen, elueres med fortynnet alkali, fortrinnsvis ammoniumhydroxyd, og isoleres ved inndampning, f.eks. ved lyofilisering.

Ved en særlig foretrukken metode tilsettes oxalsyre, ca. 5 -

8 g/l av fermenteringsvæsken, til hele væsken for å felle calcium som uopploselig oxalatsalt, og fermenteringsvæskens pH innstilles på

2,0 med sterk mineralsyre, f.eks. 6N svovelsyre, for å frigjore anti-biotikumet fra myceliet. Efter filtrering noytraliseres den klarede væske med ammoniumhydroxyd, de antibiotiske stoffer adsorberes på "Amberlite IRC-50" NH^ 20-50 mesh ionebytteharpiks, og den forbrukte (ekstraherte) væske kastes. Det antibiotiske preparat elueres fra harpiksen med base, fortrinnsvis 2N ammoniumhydroxyd, og eluatet konsentreres til lite volum i vakuum og inndampes til torrhet, f.eks. ved lyofilisering.

De antibiotiske stoffer

Påvisning av de antibiotiske stoffer og bestemmelse av homogeni-tet av fraksjoner utfores ved papirkromatografi og utfores efter to metoder: 1) ved bruk av reagenser, og 2) ved en mikrobiell metode. Den forste metode utfores ved å besproyte papirkromatogrammene med 0, 2$% ninhydrin i pyridin-aceton og derpå oppvarme ved 105°C i flere minutter. Sonene fremtrer som farvede flekker mot en hvit bakgrunn.

Mikrobiell påvisning av de antibiotiske soner utfores ved å legge papiret på en agarplate podet med Staphylococcus aureus ATCC 6538P. Efter 10 minutter fjernes papiret og efter en passende inkuberingsperiode (vanligvis 16-18 timer) iakttas inhiberingssohene som representerer de antibiotiske stoffer. Disse og lignende prover vi-s'er at det antibiotiske produkt erholdt ved fermenteringsprosessen beskrevet ovenfor består av en rekke bestanddeler. Fire av bestand-delene synes å utgjore hoveddelen av produktet, og disse betegnes

som de "fire hovedbestanddeler" i det efterfolgende.

Adskillelsen oppnåes ved en rekke kjente metoder, som motstroms-ekstraksjon eller kromatografi på ionebytteharpikser eller andre faste adsorbenter som silicagel, kromosorb og cellulose. Silicagelkromato-grafi foretrekkes. De to forste av de fire hovedbestanddeler elueres med den nedre fase av en opplosningsmiddelblanding bestående av kloroform, isopropanol og konsentrert ammoniumhydroxyd (2:1:1 i volum), elueringen fortsettes med den nedre fase av 1:1:1 blanding av de samme opplosningsmidler inntil desorpsjon av de gjenværende antibiotiske stoffer er fullstendig.

Av forskjellige fysikalske, kjemiske og biologiske data kan det vises at de fire hovedbestanddeler er:

1. Verdamicin I, et hittil ukjent antibioticum.

2. Sisomicin, de biologiske egenskaper av sisomicin er beskrevet i Journal of Antibiotics Vol.XXIII No. 11, sider 551-565. Fremstillingen og egenskapene av antibioticumet er angitt i belgisk patent nr. 73551^5.

3. Antibioticum G-<>>+l8j hittil ukjent.

h. Gentamicin A. De antibakterielle egenskaper av gentamicin A

er angitt av Weinstein et al i Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1965, side 816-820, og dets struktur ble publisert av Maehr og Schaffner i Journal of the American Chemical Society, 8_9_:25, December 6, 1967.

Oppforselen av disse fire hovedbestanddeler ved papirkromatografi er angitt i Tabell V.

I tillegg til de fire hovedbestanddeler er det av og til mulig å påvise nærværet av andre antibakterielle stoffer. Disse stoffer dannes imidlertid 1 slike minimale mengder at deres isolasjon, rens-ning og identifikasjon ikke har lykkes tilfredsstillende. Eksempelvis ble et råekstrakt inneholdende praktisk talt alle de ved fermenteringen dannede antibiotica redusert i volum til et sirupsaktig konsentrat. Konsentratet ble så underkastet oppadgående kromatografi på "Chromar 500" i ca. 1 time under anvendelse av et system bestående av kloroform, methanol og konsentrert ammoniumhydroxyd (1:1:1 volum). Når krornatogrammet ble bioautografert mot Staphylococcus aureus

ATCC 6538P, var små mengder av ytterligere tre fermenteringsprodukter såvidt påvisbare. Disse produkter hadde folgende Rf-verdier (så nært som de kunne bestemmes) : 0,!+l, 0,30 og 0,12.

Som nevnt ovenfor viser fysiko-kjemisk analyse av Verdamicin I at det er et nytt stoff, men strukturen er beslektet med gentamicin C2. Hydrolyse av disse to antibiotica med 6N saltsyre ved 100°C i 2 timer, fulgt av papirkromatografi i et opplosningsmiddelsystem bestående av enten (1) n-butanol:pyridin:vann:eddiksyre i forholdene 6:^:3:1 (volum), eller (2) propanolrpyridin:vannieddiksyre i forholdene ér^^l (volum), og besproytning av kromatogrammene med ninhydrin, viser klart at gentamicin C2 og Verdamicin I gir hydrolyseprodukter som er forskjellige. I begge systemer viser kromatogrammene nærværet av to felles produkter hvorav ett er 2-desoxystraptamin. Det gjenværende hydrolyseprodukt for Verdamicin I, er imidlertid forskjellig fra det tilsvarende fra gentamicin C2«

På basis av de fysikalske og kjemiske data angitt nedenfor,og ved analyse av dets hydrolyseprodukter, antas Verdamicin I å ha folgende strukturformel uten stereokjemiske angivelser:

Kjemikalske og fysikalske egenskaper for Verdamicin I er angitt i Tabell VI :

Verdamicin I danner lett solvater og hydrater fra-hvilke det er vanskelig å erholde det usolvaterte eller det vannfrie antibioticum. Elementæranalysen angitt i Tabell VI er fblgelig i utmerket overensstemmelse med antibioticumet'som .trihydratet (dvs. C2qH^^0^N^.3H2O).

Verdamicin I oppviser ingen absorbsjon i det ultrafiolette område 220-<1>+00 nm. Videre er det stabilt overfor koking i minst 30 minutter i 0,1 molar puffere i pH-området 2-10.

Verdamicin I (frie base) har et karakteristisk kjernemagnetisk resonansspektrum (NMR) som vist i Fig. 2 på tegningene. NMR-spektret ble erholdt ved å anvende et "Varian A-60-A" spektrometer (Varian Associates, 611 Hansen Way, Palo Alto, California) på en opplbsning av ca. 0,31 ml inneholdende ca. 22 mg antiobioticum i en deuteriumoxyd (D20)-diméthylsulfoxyd' (DMSO)-blanding. Spektret er registrert i deler pr. million (PPM) fra 3-(trimethylsilyl)-propansulfonsyre-natriumsalt, den internasjonale standard.

Verdamicin I-sulfat har et karakteristisk infrarodt absorb-sjonsspektrum i mineralolje (Nujol) som vist i Fig. 1 på tegningene.

De mere karakteristiske absorbsjonsbånd er angitt i Tabell VU nedenfor.

Av de folgende fysiokjemiske data og kjemiske avbygning, antas det at antibioticum G-^18 har strukturen vist i formel I nedenfor. Ingen konklusjoner med hensyn til stereokjemien må imidlertid trekkes av denne strukturformel:

Når det underkastes standard kromatografiske metoder, oppviser i det vesentlige rent antibioticum G-^18 folgende monster:

Antibioticum G-<!>+l8 er et aminoglycosid-antibioticum og horer derfor til den gruppe som innbefatter gentamicin, neomycin, paro-momycin, sisomicin og kanamycin. Det isoleres vanligvis i form av et amorft hvitt fast stoff med folgende fysikalske konstanter: smp. 138°-l!+*f°C. j dreining: +1>+O0i 9° .(c=0,3, H20) ; Molekylvekt (massespektrometri) = <*>+97; Empirisk formel: C20HifO°10Nl+ (base); C20Hlf0010<Wl>f.2H2S0lf (sulfat).

N.M.R.-spektrum: I det vesentlige som vist i Figur h på tegningene, som ble erholdt fra en opplosning inneholdende 15% antibioticum G-<*>fl8 i deuterio-methanol med 3% tetramethylsilan tilsatt som intern referanse.

I.R.-spektrum: I en Nujol-grot i det vesentlige som vist i Figur '3 på tegningene, som har karakteristiske absorbsjonsbånd som folger:

Andre kjemiske og fysikalske egenskaper for de antibiotiske stoffer Verdamicin I og G-^18 er angitt i Tabell VIII og IX nedenfor:

Mikrobiologisk bestemmelse av antibioticum G - hlQ

Bestemmelsen er en standard skive-platebestemmelse under anvendelse av "Difco" Antibiotisk medium nr. 5 og Bacillus subtilis A.T.C.C. 6633 som forsoksorganisme. De fysikalske betingelser for proven er i det vesentlige som beskrevet av Grove og Randall for neomycin i "Assay Methods of Antibiotics", utgitt av Medical Encyclo-pedia Incorporated (1955). -Proven utfores mot et standard preparat av antibioticum G-<>>+l8 med en angitt styrke på 1000 mcg/mg. En mikroorganisme av standarden i en inhiberingssone på 16,5^- 1,5 mm i denne prove. Det standard antibiotiske sulfatsalt viser ca. 750 mcg/mg mot den standarde antibioticumbase.

Mikrobiologisk bestemmelse av Verdamicin I og andre antibiotica produsert. av M. grisea

Den mikrobiologiske bestemmelse av dé antibiotiske stoffer skjer ved en skive-platebestemmelse under anvendelse av Staphylococcus aureus ATCC 6538P som forsoksorganisme. De. fysikalske betingelser for proven svarer til dem som er beskrevet for gentamicin (Oden et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 19635 American Society for Microbiology). Den standarde Verdamicin I-base har en definert styrke av 1000 mcg/mg. Et meg av standarden vil under bestemmelses-betingelsene gi en inhiberingssone på 17,0 - 1,3 mm.

Verdamicin I base viser 1©00 mcg/mg ved gentamicin-bestemmelsen og doseresponskurven for verdamicin er parallell med den for gentamicin. Verdamicin I-sulfat viser 6^ h mcg/mg ved gentamicinbestemmelsen og 695 mcg/mg mot sin egen base som sammenligningsstandard.

Salter

De nye antibiotica ifolge oppfinnelsen, nemlig Verdamicin I

og G-^l8, er basiske og danner syreaddisjonssalter med organiske og uorganiske syrer. Eksempler på slike syrer er svovelsyre, saltsyre, fosforsyre, toluen-p-sulfonsyre, ravsyre, maleinsyre, eddiksyre, propionsyre, cyclopropancarboxylsyre, adamantancarboxylsyre, pyro-slimsyre, benzoesyre og fenyleddiksyre. Saltene innbefatter også alkalimetallderivatene av de antibiotiske salter av tobasiske eller trebasiske syrer. I alminnelighet er saltene vannopploselige og kan dannes ved å behandle en vandig opplosning av antibioticumet med en stokiometrisk mengde syre og lyofilisere den erholdte opplosning. Saltene kan også felles fra en vandig opplosning ved tilsetning av vannblandbare organiske opplosningsmidler som lavere alkylketoner (f.eks. aceton), lavere alkoholer (f.eks. methanol), cycliske ethere (f.eks. tetrahydrofuran), eller lavere tertiære amider som dimethyl-formamid og diethylacetamid.

Biologiske egenskaper av de antibiotiske stoffer

A.: Antibioticum G-^ l8 :

I Tabell X og XI ér angitt de ln vitro antibakterielle akti- viteter av antibioticum G- hl8 mot en rekke grampositive og gramnegative bakterier, som erholdt under anvendelse av aksepterte stand ardmetoder.

TABELL X

In vitro antibakteriell aktivitet - Medium: Tryptose-fosfat medium pH 7,2 - 7,5.

I Tabell XII er der angitt in vivo antibakterielle data erholdt med antibioticum G-<*>fl8. Vertsdyrene anvendt for å erholde disse data, var "Carworth Farms CF-1" mus som veiet ca. 18-20 g, delt i grupper på 7. In vivo beskyttelse (PD^Q) ble bestemt ved å injisere musene intra-peritonealt med en dodelig dose av patogene bakterier. En gruppe av musene tjente som kontroll, de andre grupper fikk forskjellige enkelt-doser av antibioticum G-^18 en time senere. De ubeskyttende kontrolldyr dode i lbpet av 18-2*+ timer. Forsbket slutter M3 timer efter infeksjon, når antallet av levende mus i hver gruppe som fikk antibioticum G-^18, telles. Resultatene er analysert ved standard statistiske metoder for å bestemme PD^Q-verdier med 95$ konfidensgrenser.

Tabell XLTI viser in vivo forsøksresultater som illustrerer

den antiprotozoelle aktivitet av antibioticum G-^18. Vertene for disse forsbk var nylig avvendte Royal Hart hanrotter (3-^f uker gamle) som veide ca. 50-70 g. Forsoksmetoden er en modifikasjon av en beskrevet av R; J. Schnitzer på side 355-^3 i "Experimental Chemotherapy",

Vol. 1, Academic Press, New York (1963).

B: Verdamicin I

In vitro

Verdamicin I oppviser et bredt spektrum av antibakteriell aktivitet ved provning in vitro mot representative grampositive og gramnegative bakterier. Det er virksomt mot kanamycin-resistente bakterier, men synes å være kryssresistent med gentamicin. Antibioticumet oppviser ikke noen særlig in vitro aktivitet mot gjær.

I Tabell XIV er angitt minimums-inhiberingskonsentrasjonene for Verdamicin I-sulfat mot representative arter av bakterier og gjær. Provene ble utfort i gjær-kjottbuljong (pH 7?^), og inhibering ble bestemt efter 2h timer og igjen efter h8 timer. Resultater erholdt med gentamiein-sulfat er anfbrt til sammenligning.

In vivo

Verdamicin I ble provet mot fire arter av smittsomme bakterier i mus og ble administrert som en enkelt subcutan dose 1 time efter infeksjon ved intraperitoneal injeksjon av en dodelig mengde patogen. En gruppe av mus tjente som kontrolldyr, de andre grupper fikk forskjellige døser av Verdamicin I. Db ubeskyttede kontrolldyr dode i lbpet av 18-2<!>+ timer. Forsokene sluttet h8 timer efter infeksjon., da antallet av levende mus i hver gruppe som hadde fått Verdamicin I, ble talt. Resultatene ble analysert ved standard statistiske metoder for å bestemme PD^0-verdier med 95$ konfidensgrenser.

I Tabell XV er angitt resultatene av disse in vivo forsok som viser at Verdamicin I er et kraftig antibakterielt middel mot både grampositive og gramnegative organismer. Resultater erholdt med gentamicin er angitt til sammenligning. Tabell XV angir også den akutte toksisitet av Verdamicin I ved intravenbs administrasjon.

C.: Biologisk aktivitet av blandingen av antibiotica erholdt ved dyrkning av

Micromonospora grisea

Det antibiotiske preparat som hovedsakelig omfatter verdamicin I, Sisomicin, Antibioticum G-^-18 og Gentamicin A, oppviser et bredt spektrum av antibakteriell aktivitet når det proves in vitro mot grampositiveog gramnegative bakterier. Tabell XVI viser, minimums-inhiberingskonsentrasjonene for den antibiotiske blanding mot representative arter av bakterier og gjær. Provene ble utfort i gjær-kjottbuljong (pH 7,<*>+).

Anvendelse av de antibiotiske stoffer

Som vist ovenfor er antibioticum G-H-18 og Verdamicin I og deres farmasoytisk godtagbare derivater meget aktive antibiotica som har en uheldig virkning på veksten av grampositive og gramnegative mikroorganismer. Eksempelvis er de virksomme mot Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis., Escherichia coli, Salmon-ella, Klebsiella, Proteus og Pseudomonas. Dessuten motvirker antibioticum G-^18 veksten av helminther som Syphacia obvelata og Hymeno-lepsis nana, og protozoer, særlig parasittiske protozoer som Tricho-monas vaginalis og Entamoeba histolytica. Begge disse antibiotica er imidlertid inaktive mot gjær og filamentformige fungi som Saccharo-myces, Candida, Aspergillus og Trichophyton.

Disse antibiotica og deres farmasøytisk godtagbare derivater kan anvendes under in vivo eller in vitro betingelser. De kan anvendes til å inhibere eller odelegge påvirkelige arter av de ovenfor beskrevne organismer, og sammen med såper og vaskemidler til å fjerne organismer fra overflaten av laboratorieutstyr, kirurgiske instru-menter, laboratorieglassvarer og lignende. I' lys av deres in vivo virkning kan disse antibiotica og deres farmasøytisk godtagbare derivater anvendes til å odelegge eller inhibere påvirkelige organismer i pattedyrverter, f.eks. mus, rotter, katter, hunder og kveg.

De antibiotiske stoffer og deres farmasoytisk godtagbare derivater kan også anvendes til å behandle sykdommer som skyldes påvirkelige organismer i mennesker.

For deres anvendelse in vivo bringes et antibioticum valgt blant antibioticum G-^-18 og antibioticum Verdamicin I og deres farma-søytisk godtagbare derivater, i en form som er egnet for terapeutisk administrasjon, f.eks. ved å blandes med en farmasoytisk bærer eller hjelpemiddel. Preparatene kan være i form av en doseringsenhet, f.eks. et formet produkt. Preparatene er imidlertid fortrinnsvis i form av injiserbare preparater i ampuller, eller salver,

kremer eller hudvann.

Eksempel 1

1. Rystekolbeproduksjon av antibioticum med M. grisea

a. Inokulumfremstilling: En 300 ml kolbe inneholdende 100 ml

>av folgende sterile medium inokuleres med en lokkefull av M.grisea fra en agar-skråkulturj

Kolben inkuberes under kontinuerlig rystning på en roterende ryster ved 250 - 300 opm ved 25° - 35°C inntil en betraktelig vekst er oppnådd. Dette tar vanligvis fra 1 - h dager.

b. Fermentering: En 2,0 1 kolbe inneholdende 500 ml av neden-stående medium inokuleres med et 5$ inokulum fremstilt i trinn a:

Det inokulerte medium fermenteres ved fra ca. 26° til ca. 35°C 1 fra ca. h til ca. 7 dager under kontinuerlig omroring på en roterende ryster ved 200-300 opm. Fermenteringen bestemmes periodisk efter de forste k- 8 timer for å bestemme når toppen av antibiotisk aktivitet er oppnådd, og på dette punkt opparbeides fermenteringsvæsken ved fremgangsmåten i eksempel h.

Eksempel 2

lh 1 tankfermentering av M. grisea

a. Kimtrinn: En 25 ml porsjon inokulum, fremstilt som beskrevet i eksempel 1, overfores til en 2 liter Erlenmeyerkolbe inneholdende 500 ml sterilt inokulummedium. Inokulumet inkuberes i fra ca. 2 til ca. h dager under kontinuerlig omroring ved ca. 280 opm ved ca. 28°C.

b. Fermenteringstrinn: Hele innholdet av kimkolben overfores til en lh 1 fermentator inneholdende 10 1 sterilt medium B. Fermenteringsblandingen inkuberes ved ca. 35°C under kontinuerlig omroring

ved ca. 250-500 opm i ca. 90 timer. pH holdes mellom 7,2 og 8,3

under fermenteringen mens kulturmediet luftes med ca. 3 til ca. 5 1

luft pr. minutt. Fermenteringsblandingen analyseres periodisk efter de forste kS timer for å bestemme når toppantibiotisk aktivtet er

oppnådd, og på dette punkt opparbeides fermenteringsblandingen ved fremgangsmåten i eksempel

Eksempel 3

95 1 tankfermentering av M. grisea

Inokulumtrinn

1,0 1 Medium C i de ovennevnte forhold fremstilles. pH innstilles på 7,3 og 0,5 1 porsjoner innfores i 2 1 Erlenmeyerkolber. Mediet steriliseres i h5 minutter ved 121°C. Der avkjoles til værelsetemperatur og hver kolbe inokuleres med 5 ml av en kultur av M.grisea. Hver kolbe inkuberes i 72 timer på en roterende ryster (.200 opm) ved 30°C. Inokulumet (25 ml/kolbe) overfores til 0,5 1 sterilt medium C og hver kolbe inkuberes i M3 timer på en roterende ryster ved 30°C. 5,0 1 av dette inokulum forenes og tilsettes til 90 1 sterilt medium C, temperaturen innstilles på 30°C, pH på ca.

7,3 - 7,7, luftingen på ca. 28 - 56 l/min, og omrystingen på ca. 200-i+OO opm. Fermenteringen fortsettes i fra ca. 100 til ca. 130 timer inntil toppantibiotisk aktivitet er oppnådd, og derpå opparbeides fermenteringsvæsken ved fremgangsmåten i eksempel

Eksempel

Isolering av antibioticumkomplekset

Til 60 1 fermenteringsvæske erholdt ved fremgangsmåten som beskrevet i eksempler 1-3, tilsettes ca. h- 00 g oxalsyre under kraftig omroring. Fermenteringsblandingens pH innstilles på 2,0 med 6N svovelsyre og omrbres i ca. 20 minutter. Den syrede fermenterings-blanding filtreres og filtratet oppbevares. Myceliekaken vaskes med springvann og vaskingene forenes med den filtrerte væske. På dette punkt er det fordelaktig å forene filtratene og vaskingene erholdt fra ca. tre 60 1 fermenteringer (dvs. ca. 180 1). De forenede filtrater og vaskinger nøytraliseres med 6N ammoniumhydroxyd (der kreves fra ca. 500 til ca. 900 ml). Antibioticumkomplekset absorb-eres på "IRC-50" i ammoniumformen ved å fore den nbytrale væske gjennom en kolonne av harpiks som er 5,1 cm i diameter og 65,6 cm hby. Strbmningshastigheten innstilles på ca. 175-200 ml/min. inntil all væske er behandlet. Kolonnen vaskes farvefri med avionisert vann (ca. 20 1). Antibioticumkomplekset desorberes med 2N ammoniumhydroxyd med en hastighet på ca. 80 ml/min. fulgt av avionisert vann når eluatets pH når 10. Eluatet inndampes i vakuum til ca. 1 liter og lyofiliseres for å få det antibiotiske kompleks.

Alternativt kan, når eluatet er sterkt farvet, en behandling med "IRA-^OIS" utfores. Denne behandling utfores vanligvis ved å fore eluatet fra den foregående kolonne gjennom en kolonne av "IRA-^01S" (2,5 cm diameter x 51 cm hby) med en hastighet på ca. 120 ml/ min. "IRA-M-01S"-kolonnen vaskes fri for antibioticum og eluatet

og vaskingene inndampes som beskrevet ovenfor.

Eksempel 5

A. Fremstilling av sulfatsaltet av det antibiotiske kompleks

37 g av den rå kompleksbase erholdt i henhold til eksempel opplbses i 1000 ml vann og pH innstilles på K, 5 med svovelsyre. Opp-løsningen omrores med "Darco G-60" i ca. 1/2 time og filtreres. Filtratet inndampes til ca. 100 ml og, tilsettes til et overskudd av methanol. Det dannede bunnfall av de blandede sulfater frafiltreres og torres under vakuum.

B. Overforing av sulfatsaltet til basen av det antibiotiske kompleks

De blandede sulfater erholdt i henhold til trinn A suspenderes i 1000 ml kloroform og ammoniakkgass bobles gjennom suspensjonen i ca. 1/2 time. Blandingen filtreres og filtratet inndampes til torrhet for å få basen av det antibiotiske kompleks.

Eksempel 6

Isolering av Verdamicin I, Sisomicin, Antibioticum G-^18 og Gentamicin A

5,^5 kg silicagel suspenderes i den nedre fase av en opplosningsmiddelblanding bestående av isopropanol:kloroformrkons.ammoniumhydroxyd (1:2:1^i volum). Suspensjonen overfores i en kromatograferings-kolonne med en indre diameter på ca. 10 cm.

100 g antibiotisk kompleks- erholdt fra eksempel h suspenderes

i ca. 1,0 1 av .den nedre fase av opplosningsmiddelsystemet anvendt for å fremstille den kromatografiske kolonne. Den således erholdte suspensjon filtreres og det erholdte uopploselige materiale oppbevares for videre behandling. Filtratet inndanpes til ca. 1,0 1 for det anbringes på toppen av kolonnen.

Det tidligere erholdte uopploselige materiale (ca. 66 g) opplbses under oppvarmning og omroring i methanol, og der filtreres for å fjerne det tilstedeværende uorganiske materiale (ca. 6 g). Den methanoliske opplosning avkjbles under utsettelse for luft og filtreres igjen for å fjerne det meste av det lite opplbselige Gentamicin A-carbonat.

Det antibiotiske kompleks fra hvilket det meste av Gentamicin

A er fjernet, adsorberes på den ovenfor fremstilte silicagelkolonne' og kromatogrammet utvikles med opplosningsmiddelblandingen idet 2,0 1 fraksjoner taes fra kolben under full strom. Når sisomicin er desorbert (hvilket vanligvis tar fra ca. 90 til ca. 100 fraksjoner), for-andres forholdet av opplosningsmidlene til 1:1:1 og elueringen fortsettes inntil det gjenværende materiale er desorbert. I alminnelighet er, ved utforelse av adskillelsen av det antibiotiske kompleks i en kolonne av denne stdrrelse, antallet av fraksjoner som oppsamles fra ca. 250 til ca. 350. En flekk av hver fraksjon avsettes på filtrerpapir og proves med ninhydrinreagens for å bestemme nærvær eller fravær av antibioticum, dvs. ninhydrin-positivt materiale. De fraksjoner som inneholder antibiotiske stoffer underkastes papirkromatografi i et system bestående av kloroform:methanol:17$ ammoniumhydroxyd (2:1:1 i volum) fulgt av bioautografi mot Staphylococcus. aureus ATCC 6538P, for å bestemme hvilke fraksjoner inneholder det samme antibioticum. Fraksjonene forenes i overensstemmelse med be-stemmelsene gjort ved kromatografi og bioautografi, de forenede fraksjoner inndampes i vakuum til ca. 100 ml og lyofiliseres.

Fordelingen av antibiotica fra kolonnen er stort sett som folger:

Eksempel 7

Fremstilling av Verdamicin I- sulfat

500 mg Verdamicin I fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 6

opploses i 90 ml vann og oppløsningens pH innstilles på ^,5 med fortynnet svovelsyre. Oppløsningen omrores med 1-2 g avfarvende trekull ("Darco G-60") i ca.■30 minutter og filtreres. Filtratet inndampes i vakuum til ca. 10 ml og helles i ca. 100 ml methanol under omroring. Den dannede suspensjon filtreres, det faste produkt vaskes med frisk methanol og torres, hvorved man får ca. ^50 mg Verdamicin I-sulfat.

Eksempel 8

Fremstilling av Verdamicin I- hydroklorid

<!>+00 mg Verdamicin I fremstilt i eksempel 6 opploses i ca.

75 ml vann og oppløsningens pH innstilles på <*>f,5 med fortynnet saltsyre. Oppløsningen omrores med 1-2 g avfarvende trekull ("Darco G-60") i ca. 30 minutter og filtreres. Filtratet inndampes i vakuum til ca. 75 ml og helles i 150 ml methanol:aceton (1:2 volum)-blanding under omroring. Den dannede suspensjon filtreres, det faste produkt vaskes med frisk aceton og torres hvorved man får ca. 300 mg Verdamicin I-hydroklorid.

Den ovenstående fremgangsmåte er generelt anvendbar og kan brukes med en ekvivalent mengde av de tidligere beskrevne syrer for å danne ikke-giftige syreaddisjonssalter som er de funksjonelle ekvivalenter av Verdamicin I-hydroklorid og av Verdamicin I-sulfat.

Eksempel 9

Fremstilling av Verdamicin I- base

390 mg Verdamicin I-sulfat, fremstilt som i eksempel 7, opploses i 10 ml vann. En "IRA-^OIS"-kolonne ("Amberlite" anionbytte-harpiks) med folgende dimensjoner: hoyde 25 cm, utvendig diameter 2 cm, fremstilles. Den antibiotiske opplosning innfores i harpiks-kolonnen og elueres med avionisert vann inntil eluatet er negativt mot ninhydrinreagens. Eluatet inndampes til ca. 25 ml og lyofili-séres -hvorved man får 230 mg Verdamicin I.

Eksempel 10

Fremstilling av Antibioticum G-* fl8- sulf at

2,6 g Antibioticum G-^-18

opploses i 250 ml vann og opplosningens pH innstilles på h, 2 med fortynnet (1-6N) svovelsyre. Ca. 5 g "Darco G-60" tilsettes til opp-løsningen og omrores i ca. 1 time ved værelsetemperatur. Suspensjonen filtreres og filtratet inndampes til torrhet i vakuum. Residuet opploses i 20 ml vann og oppløsningen tilsettes dråpevis til 500 ml

methanol under kraftig omroring. Den dannede suspensjon filtreres, det faste produkt vaskes med methanol og torres ved ca. k0°C i vakuum hvorved man får 3,36 g Antibioticum G- kl8-sulfat som analyserer ca. 700 mcg/mg.

På lignende måte kan andre syreaddisjonssalter fremstilles ved å erstatte svovelsyre med en ekvivalent mengde av andre uorganiske eller organiske syrer og ved å anvende aceton som det fellende opplos-ningsmiddel.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et antibiotisk aktivt kompleks bestående av de to nye antibiotica G-^18 og Verdamicin I og de to kjente antibiotica Sisomicin og Gentamicin A med formelen:

i hvilken, for Gentamicin A: R = H; R1 = OH; R2 = OH; R^ = H; R^ = OH, med en enkeltbinding mellom C-^ og Cl6; for Sisomicin: R = CH^; Rx = H; R2 = H; R^=-H; R^ = NH2, med en dobbeltbinding mellom <C>l5.<ogC>l6* for Verdamicin I: R = CH^; R1 = H; R2 = H; R^ = CH^; R^ = NH2, med en dobbeltbinding mellom C-^ og C"l6; og for Antibiotikum G-<>>+l8: R = CRy9 Rx OH; R2 = OH; R^ = CH-^; R^ OH, med en enkeltbinding mellom C-^ og <C>l6; eller av de enkelte antibiotica samt farmasoytisk godtagbare syreaddisjonssalter av slike forbindelser,karakterisert ved at en mikroorganisme av arten Micromonospora grisea dyrkes i et vandig næringsmedium under aerobe betingelser og at det antibiotiske kompleks eller ett eller flere av de enkelte antibiotica isoleres, enten som frie baser eller i form av syreaddisjonssalter.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1,karakterisert ved at der som mikroorganisme anvendes stammen Micromonospora grisea NRRL 38OO.