NO134685B - - Google Patents

Description

Dannelsen av slim i industrivann er et stort problem for

industrien.

Uttrykket "slim" er bredt og omfatter et vidt område av viskose, slimete eller læraktige materialer og blandinger funnet i industrivann. Slim er ofte polymere av natur og kan stort sett klassifiseres som kjemiske, biologiske eller sammensatte slim avhengig av deres årsak og sammensetning. Råmaterialer og utstyr som brukes i papirindustrien er f.eks. ikke sterile og vann som brukes i forbindelse med slikt utstyr blir kontinuerlig besmittet med et stort antall mikrooranismer fra slike kilder som tremasse, kjemikalier, luft, kompletteringsvann og liknende. De eksisterende betingelser når det gjelder temperatur og liknende tillater vekst av et stort antall mikroorganismer. Veksten av visse spesielle former av disse biologiske smittestoffer forårsaker eller frembringer polymere avsondringer eller produkter som er eller blir slim.

Hittil har slimdannelse blitt bekjempet ved tilsetning av slimicider til industrivann (f.eks. bak-vann (white water) i forbindelse med masse- og papirindustri). Hensikten med slike slimicider er å ødelegge eller stanse veksten av noen av de mange organismer som er tilstede i vannet for derved å hindre eller forsinke dannelsen av slim. Slimicider (eller toksikanter som de noen ganger kalles) deles i to hovedkategorier. Den første er biocidene og den andre er biostatene. Kjemikalier som brukes som slimicider har omfattet klor, fenylmerkuriacetat, pentaklorfenol, tributyltinnoksyd og isotiocyanater hvilke alle sammen er relativt giftige overfor mennesker.

Mange forskere har undersøkt årsakene til slimdannelse i industrivann og det er alminnelig anerkjent at et bredt spektrum av bakterier, hovedsakelig gram-negative bakterier, er ansvarlige for dannelsen av slim, spesielt slim i papirfabrikker. Gjær og mugg forårsaker mindre slim enn bakterier, spesielt i papirfabrikker. Selv om for eksempel mugg lett isoleres fra industrivann og

dyrkes i laboratoriet, har det ikke blitt observert rask naturlig muggvekst fra blandede kulturer i resirkulert industrivann.

De som er opptatt med å søke etter slimicider eller toksikanter har periodevis observert mangelen på sammenheng mellom totalt bakterietall og slimdannelse. Ofte har det blitt notert høye bakterietall i omgivelser hvor det ikke har blitt observert nevneverdig slimdannelse. Tilsvarende har det blitt observert lave totale bakterietall i sammenheng med betydelig oppsamling av slim. Disse oppdagelser har vært kilde til bekymring for de som er ansatt i vannbehandlingsindustrien.

Søkerne har observert at levan (en spesiell type fruktose-polymer som dannes av et stort antall bakterier) er en viktig komponent i mange industrislim. Søkerne har videre oppdaget at det er vanskelig og økonomisk ugjennomførlig å forsøke å ødelegge eller stoppe veksten av alle vanlige bakterier som frembringer levan. Det har blitt funnet at slimansamling kan bekjempes lettere ved tilsetning av enzymet levan hydrolase til industri-

vannet for derved å hydrolysere det levan som er frembragt av bakteriene. Selv om enzymet kan brukes i forbindelse med biocider og biostater, kan effektiv bekjempelse av slimdannelse oppnås bare

ved bruken av dette spesifikke enzymet (dvs. levan hydrolase).

Industrivann omfatter det vann som brukes i industrianlegg for slike formål som å overføre partikkelformig materiale (f.eks. papirmasse), kjøling og liknende. Selv om denne oppfinnelse er anvendbar på et vidt område av industrivann hvor slimdannelse karakteristisk opptrer, er denne oppfinnelse spesielt nyttig ved behandling av bak-vann i forbindelse med masse- og papirfabrikker. Derfor vil denne oppfinnelse bli beskrevet med spesiell henvisning til behandling av slimdannelse i vannsystemer i papirfabrikker uten å være begrenset til dette.

Forskjellige forskere har gitt oversikter over slim-problemet i papirindustrien forårsaket av mikroorganismer som er tilstede i bak-vann. Oppmerksomhet rettes mot følgende artikler og henvisningene i dem: Coster, E., The Slime Problem in the Paper Industry Caused by Microorganisms, Appita 21, Nr. 4: 131-138 (Januar 1968). Leckey, C. R., The Slime Board Method of Paper Mill Toxicant Evaluation, Tappi 43, Nr. 9: 781-783 (September 1960). Michalski, R.J. et al, A Method for Determining The Effeet of Dispersants in Slime Control Performance,

Tappi 46, Nr. 2: 167a-172a (Februar 1963).

Det har blitt observert av tidligere forskere at graden av slimdannelse ikke direkte kan sammenholdes med totale mikrobetall sannsynligvis fordi bak-vann inneholder et bredt spektrum av mikroorganismer. Nærværet av et bredt spektrum av mikroorganismer i slikt vann er imidlertid ansvarlig for aktiviteten hos andre forskere for å forsøke å finne frem til og fremstille kjemikalier med brede biocide eller biostatiske egenskaper.

I løpet av dette arbeide har det vist seg at en vanlig type polymer som fremstilles av mange bakteriearter, er et polysakkarid kjent som levan. Et levan er en polymer sammensatt av fruktoseenheter forbundet med beta-2,6'-bindinger. Det ble bestemt at problemet skulle angripes ved et direkte angrep på slimet, spesielt på levan, i motsetning til et angrep på de organismer som er ansvarlige for fremstillingen av slimet.

Det har blitt oppdaget at slimdannelser kan bekjempes eller reduseres ved tilsetning av enzymet levan-hydrolase (noen ganger kalt levan polyase) til industrivann inneholdende levan-dannende organismer.

Enzymet levan-hydrolase fremstilles av forskjellige mikroorganismer. Det er mulig at noe av enzymet produseres i selve systemet i visse industrivann. Dette kan delvis forklare mangelen på sammenheng mellom totalt mikrobetall og slimdannelse. De betingelser som eksisterer i industrivann som f.eks. bak-vann favoriserer imidlertid ikke vanligvis dannelsen av vesentlige mengder av enzymet. Derfor er det nødvendig å isolere og dyrke en egnet enzym-produserende mikroorganisme under betingelser som favoriserer maksimal produksjon av enzymet. Mikroorganismer som er angitt å produsere enzymet levan hydrolase omfatter de følgende:

Rhodotorula sp.

Azotobacter sp.

Bacillus sp.

Arthrobacter sp.

Micrococcus sp.

Pseudomonas sp.

Formen av enzymet vil variere avhengig av den spesielle kilde for enzymet som dyrkes. For eksempel produserer levan-hydrolase produsert av Azotobacter sp. et ekstra-cellulært enzym, mens gjæren Rhodotorula sp. produserer enzym inne i eller på celle-strukturen.

Levan-hydrolase brukes for å bekjempe slimdannelse ved

i den hensikt å tilsette enzymet til industrivann inneholdende slim-dannende mikroorganismer. Konsentrasjonen av enzymet kan variere meget og vil avhenge av slike faktorer som typen av industrivann som behandles (f.eks. bak-vann), betingelsene for behandlingen (f.eks. temperatur og pH for vannet), kilden for enzymet (f.eks. Rhodotorula sp.) og enzymaktiviteten. Når det brukes enzym i form av døde celler av gjæren Rhodotorula sp.

(ved en aktivitet på 20 enheter pr. gram), er konsentrasjoner på fra ca. 1 ppm opp til 100 ppm av cellene i vannet effektive.

Over 500 ppm har enzymet ofte en tendens til å misfarge det vannet som behandles. Gode resultater oppnås vanligvis ved konsentrasjoner på 0,5 til 20 ppm (f.eks. 1-10 ppm). Slike celler brukes hensiktsmessig ved tørking av cellene, fortynning av dem med et salt (f.eks. et metallsulfat som f.eks. natriumsulfat) til eri konsentrasjon på for eksempel 10 vékt% og deretter tilsetning av den oppnådde blanding til det vannet som skal behandles. Om ønsket kan enzymet tilsettes til vannet alene eller blandet med andre vanntilsetninger (f.eks. biocider, biostater, buffere og

liknende).

Nærværende oppfinnelse skal videre illustreres ved de følgende spesielle eksempler. Om ikke annet er angitt er alle deler og prosenter etter vekt.

Eksperimentell fremstilling av enzymet levan hydrolase

a) Vedlikehold av Rhodotorula sp.

En art av gjæren Rhodotorula sp. ble isolert ved bruk av

anrikning kulturteknikker. Denne mikroorganisme ble funnet å være istand til å bryte ned levan og ble deretter oppbevart i jordrør og på skrå-agarmedium med følgende sammensetning i gram pr. liter:

Ved fremstillingen av skråmediet ble tilstrekkelig destillert vann tilsatt for å løse opp de ovenfor angitte ingredienser. Den oppnådde løsning ble justert til pH 7,5 med 2,5 M natriumhydroksyd og 1,2% W/V agar (Difco) ble tilsatt. Suspensjonen ble så fylt opp til ønsket volum med destillert vann. Agaren ble smeltet ved oppvarmning av mediet og koking i så kort tid som mulig. Mediet ble overført til reagensglass og sterilisert ved 121°C i 20 minutter. Glassene ble avkjølt i skrå stilling for å oppnå en lang skråside og en kort ende.

Skråmediet ble inokulert fra jordrør og kulturene av Rhodotorula sp. ble inkubert ved 30°C i fra fire til fem dager

før bruk.

b) Fremstilling og inokulering av spiremedium.

2 ml av en 5 ml steril vannsuspensjon av en fire til fem

dager gammel Rhodotorula-kultur ble brukt for å inokulere 50 ml spiremedium i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe med ledeplate. Spire-mediet inneholdt de følgende ingredienser i gram pr. liter vandig medium:

pH i mediet ble justert til 6,7.

Mediet ble sterilisert ved behandling i autoklav ved 121 C i 20 minutter og så avkjølt så raskt som mulig. Etter inokulering ble kulturene inkubert på en inkubator-rystemaskin (New Brunswick Gyrotory Model G-25) som arbeidet ved ca. 150 rpm og 27°c i 24-26 timer.

c) Fremstilling og inokulering av et inokuleringsmedium. Innholdet i en 24-26 timers 50 ml kultur av spirevekst ble

brukt for å inokulere 500 ml inokuleringsmedium til en to-liters Erlenmeyerkolbe med ledeplate. Inokuleringsmediet inneholdt følgende ingredienser i gram pr. liter vandig medium:

Oppløsningen ble justert til pH 6,7, sterilisert i autoklav ved 121°C og avkjølt så raskt som mulig. Etter inokulering ble kulturene inkubert i 22-24 timer som beskrevet for utsædsmediet.

d) Fremstilling og inokulering av produksjonsmediet.

Innholdet i to 22-24 timers 500 ml kulturer av inokulum-vekst ble brukt til å inokulere 8 kg produksjonsmedium i et 14 liters fermenteringskar. Fermenteringskaret var helt flenset og omrøring ble utført av to faste turbinskovlrørere i 10 cm avstand fra hverandre og med 10 cm diameter. Steril luft ble innført gjennom et 0,6 cm åpent I.D.-rør plassert rett under bunnrøreren. Fermenteringskaret ble kjørt med en omrørerhastighet på 700 omdr. pr. min. med en luftstrøm på ett volum luft pr. volum medium pr.

<*>minutt. Temperaturen ble holdt på 27°C <+> 2°C ved hjelp av et sirkulerende vannbad. Skummet ble regulert ved bruken av anti-skummidler.

Under produksjonsfasen ble veksten kontrollert ved måling av pH og pakket cellevolum (packed cell volume). Det sistnevnte ble målt i kalibrerte koniske centrifugerør. Levan hydrolyseaktivitet ble målt ved en modifikasjon av tetrazoliumkloridmetoden beskrevet av Avigad, et al.^ Levansubstrat for enzymforsøket ble fremstilt ved å bruke Aerobacter levanicum ifølge metoden til Avigad 2], men isolering av levan ble utelatt. Formen av levan som ble oppnådd ved isoleringsfremgangsmåten blir ikke nevneverdig nedbrutt av ensymet frembragt:av vår art av Rhodotorula. Enzym-undersøkelsesmetoden var som følger: Rhodotorulaceller ble adskilt fra fermenterin<g>smediet ved sentrifugering eller etanolutfeining. 1] Avigad, L, Ruth Zelikson og S. Hestrin, Selective Determination of Sugars Manifesting Enediol Isomerism by Means of Reaction with Tetrazolium. Biochem. J. 80, 57-61 (1961)

2] Avigad, L., Methods in Carbohydrate Chemistry V, 161-165. Academic Press, New York (1965).

Cellene ble fortynnet i 0,05 M morfolinopropan sulfonsyrebuffer (pH 6,5). En ml av fortynnet enzym ble tilsatt til hver av tre reagensglass. Glassene ble plassert i vannbad på 40°C i fem minutter. En ml av substrat inneholdende minst 10 mikromol levan (bestemt som fruktose) ble tilsatt til de første to glass, idet det tredje ble brukt som blindprøve. Etter nøyaktig 30 minutters reaksjonstid ble 2,0 ml 0,5 M natriumhydroksyd tilsatt til alle tre glass. En ml av substratet ble tilsatt til blindprøven. Så ble 2,0 ml 10%ig sinksulfat-heptahydrat tilsatt til alle glass. Utfeiningen ble fjernet enten ved filtrering eller sentrifugering og 1,0 ml av væsken over utfeiningen ble tilsatt til hvert av de tre reagensglassene. Etter tilsetning av 1,0 ml l%ig 2,3,5-tri-fenyl-2H-tetrazoliumklorid ble glassene plassert i et 40°C vannbad i fem minutter. Så ble 1,0 ml 0,5 M NaOH tilsatt til hvert glass. Etter nøyaktig 15 minutter ble 5 ml av en 10 volum% iseddik i metanoloppløsning tilsatt for å stoppe reaksjonen. Den optiske tetthet ble målt ved 580 nyu i et spektrofotometer. Glass som inneholder en rød utfelning i det ovenstående forsøk må kastes og cellene fortynnes videre for nytt forsøk. Enheter for aktivitet pr. vektenhet defineres som produktet av fortynningsfaktor og optisk tetthet ved 580 millimikron.

Når forsøk anga at utbyttet av levan-hydrolase nådde et maksimum, ble fermenteringen avsluttet og cellene av Rhodotorula ble oppsamlet.

e) Gjenvinning av levan hydrolase

En total vekt på 45.300 g kulturmedium (broth) ble samlet

fra seks produksjonsfermenteringskar 44 timer etter inokulering. Mediet ble sendt gjennom en separator som skilte mediet i en vørterfase og en gjærkonsentrat. Vørterfasen ble fortynnet til originalvolumet av kulturmediet og igjen sendt gjennom sentrifugen. Gjærkonsentratene fra de første og andre sentrifugeringer ble forenet. Den andre vørter, som hadde et meget lavt pakket gjær-cellevolum, ble kastet. Det totale gjærkonsentratet ble fortynnet til 2,5 ganger sitt volum med vann inneholdende en prosent av et ikke-ionisk overflateaktivt middel (i handelen som DC-161 fra Economics Laboratory, Inc. St. Paul, Minnesota). Det har blitt funnet at aktiviteten og utseendet av sluttproduktet forbedres med vask med det overflateaktive midlet. Suspensjonen ble igjen sendt gjennom separatoren og vørteren kastet. Gjærkonsentratet ble fortynnet med denaturert alkohol (95% etanol) inntil alkohol-

konsentrasjonen i blandingen nådde 70%. Det dannet seg et bunnfall som deretter ble oppsamlet ved filtrering. Filtratet ble kastet og kaken tørket i en vakuumovn ved 40°C. Kaken ble så malt til et fint pulver (80 mesh). En totalvekt på 736 g gjær ble oppsamlet som hadde en levan hydrolyseaktivitet på 20 enheter pr. gram.

Eksperimentelle fremgangsmåter for eksemplene 1- 5.

Apparatet som ble brukt i disse eksempler var likt det som er beskrevet av Leckey"^ . i dette eksperimentsystem føres bak-vann fra papirfabrikker (syntetisk eller naturlig) over trebord på en slik måte at det dannes en klump av tremasse, uløselig uorganisk materiale og mikrobeceller. Klumpen holdes sammen av bakterieslim slik at det er likt i egenskaper med den substans som er funnet å være et problem i papirfabrikker.

To bokser ble brukt i disse eksempler, en for å teste enzymet og en for kontrollformål. Hver boks var bygget for å romme ca. 19 1 bak-vann og fem slimbord plassert like ovenfor overflaten av vannet med en hellingsvinkel på ca. 45°. Bak-vannet ble ført over bordene fra et horisontalt grenrør festet til en neddykkbar pumpe. Fem hull i grenrøret befant seg ca. 5 cm over de fem bordene. Strømningshastigheten for vannet fra grenrøret varierte betydelig avhengig av slimdannelsen, men var i gjennom-snitt omkring 500 ml pr. minutt. I eksemplene 1-3 fikk man bak-vann fra en papirfabrikk daglig. Den første prøven besto av 28 1 for å fylle begge bokser. Deretter ble 3,8 liter friskt bak-yan^tilsatt etter at 3,8 liter hadde blitt fjernet. Den siste prøven ble brukt for bestemmelse av mikrobetallet i skålene, pH og kvalitativ analyse på fruktose. Temperaturen i boksene fikk fritt oppnå hver sine verdier for å simulere de varierende betingelser som finnes i papirfabrikker. Gjennomsnittlige temperaturverdier er angitt i resultatene. På enkelte dager varierte temperaturen over et ti graders temperaturområde.

For å kompensere for ulikheter i boksdimensjoner og pumper ble boksen som mottok enzymet ombyttet for hvert eksperiment. Enzym ble tilsatt ifølge synlig behov.

Skåltelling ble utført ved å bruke følgende medium ved et pH på 6,7-7,0

3] Leckey, C. R., The Slime Board Method of Paper Mill Toxicant Evaluation, TAPPI, 43, 781-783 (1960).

Destillert vann til 100 ml.

Mediet ble sterilisert ved 121°C i 30 minutter.

Alle skåler ble inkubert, etter inokulering, ved 45°C i

to dager. Kolonier ble tellet ved hjelp av en New Brunswick Colony Counter, Model C-110.

Kvalitative tester på fruktose ble utført ved hjelp av resorcmol-tioureareagensmetoden beskrevet av Avigad 21. I denne test blir både fruktose som levan og fri fruktose funnet om de er tilstede. Prøver ble også undersøkt på nærvær av fri fruktose alene ved å bruke 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazoliumkloridreagens (TTC). Det sistnevnte reagens kan også brukes for å finne glukose, men reaksjonen kan gjøres mere spesifikk for ketosesukkere ved bruk av en kort reaksjonstid. En positiv resorcinoltest (levan pluss fri fruktose) og en negativ TTC-test betyr at bare levan er tilstede.

I eksemplene 4 og 5 ble syntetisk bak-vann sterilisert og så inokulert med en kjent levan-produserende bakterie, Aerobacter levanicum (ATCC nr. 15552) for å studere virkningen av Rhodotorula levan-hydrolase cellekonsentrasjon på bakterielt slim i et simulert papirfabrikksystem. Meget raskere eksperimentelle resultater kan oppnås i dette system enn med naturlig bak-vann fra papirfabrikk. Det syntetiske bak-vann inneholdt følgende ingredienser i gram pr. liter:

Det syntetiske bak-vanns pH ble justert til pH 5 med teknisk svovelsyre. <21> Avigad, L., Methods in Carbohydrate Chemistry V, 161-165, Academic Press, New York (1965).

I eksemplene 4 og 5 ble hver boks renset med 70%ig etanol før tilsetning av 20 liter av det sterile syntetiske bak-vann. Bak-vannet ble så inokulert med 2 liter A. levanicum-kultur. Bakteriene for inokuleringen ble dyrket i en liters flasker med ledeplate inneholdende 300 ml syntetisk bak-vann ved 27°C i 18 timer. Alle andre trekk i eksemplene 4 og 5 ble utført som beskrevet for eksperimenter med bak-vann fra papirfabrikker.

Tynnskiktskromatografi på cellulose ble brukt for å fastslå at fruktanet som er observert i bak-vann fra papirfabrikker er i det minste delvis identisk med det som dannes av Aerobacter levanicum og det ble nedbrutt på samme måte som det bakterielle levan.

Resultatene av eksemplene 1-5 angis i de følgende tabeller.

Eksempel 1

Dette eksempel ble utført på bakvann fra en Fourdrinier papirmaskin i papirfabrikk A.

Ubehandlet bak- vann

Eksempel 2

Dette eksempel ble utført på bak-vann fra en sylinder-papirmaskin fra papirfabrikk A.

Ubehandlet bak- vann

Eksempel 3

Dette eksempel ble utført på bak-vann fra en Fourdrinier papirmaskin fra papirfabrikk B.

Ubehandlet baki- vann

Eksempel 4

Dette eksempel ble utført med syntetisk bak-vann som var inokulert med Aerobacter levanicum (ATCC 15552).

Ubehandlet bak- vann

Eksempel 5

Dette eksempel ble utført med syntetisk bak-vann som var inokulert med Aerobacter levanicum (ATCC 15552). Ubehandlet bak- vannEnzymbehandlet bak- vann

De nyttige resultater som oppnås, kan forstås med henvisning til forsøk som gjøres på bak-vann fra papirfabrikk B (se f.eks. eksempel 3). Slimfjernelse fra bordene og hindring av ansamlinger av slim ble observert i det enzymbehandlede system

i motsetning til det ubehandlede system. I tillegg ble det notert en liten forskjell i temperatur mellom behandlet og ubehandlet vann, og den lavere temperaturen ble oppnådd i det behandlede vannet. Betydelig skumdannelse forekom stadig i ubehandlet vann, men var fraværende i det enzymbehandlede vannet. Lignende resultater ble oppnådd med bak-vann fra papirfabrikk A.

Claims (3)

1. Anvendelse av enzymet levanhydrolase, fortrinnsvis i form av.celler av gjæren Rhodotorula sp., til bekjempelse av slim dannelse i industrivann.

2. Anvendelse ifølge krav 2 av enzymet i en konsentrasjon av celler på 1-100 ppm til bekjempelse av slimdannelse i bak-vann fra en papirfabrikk.

3. Anvendelse ifølge krav 1 av enzymet for periodevis tilsetning til bakvann fra en papirfabrikk.