NO125822B

NO125822B -

Info

Publication number: NO125822B
Application number: NO0807/69A
Authority: NO
Inventors: O Wagner; W Kaufmann; A Arens; K Bauer; E Irion; E Rauenbusch
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1968-05-06
Filing date: 1969-02-26
Publication date: 1972-11-06
Also published as: IL31343A; DK122822B; FI46390C; ES366831A1; US3622461A; FR2009853A1; FI46390B; IL31343A0; CH492784A; SE354076B; BE730359A; NL6902078A

Description

Fremgangsmåte til utvinning av L-asparaginase fra Escherichia coli.

L-asparaginase er kjent. Den forekommer intracellulært i Escherichia coli (H.A. Campbell, L.T. Mashburn, E.A. Boyse, L.J. Old, Biochemistry 6 (1967), side 721 tal 730 og den her videre nevnte litteratur) og ble utvunnet på følgende måte fra cellemassen av "E. coli B" = E. coli ATCC 11303: Frigjøring av enzymet ved knusing av bakteriecellen? med ultralyd eller maling med aluminiumoksyd, fjerning av knuste celler og nukleinsyrer ved utfelling med manganklorid og etter-følgende sentrifugering, råenzymets utsaltning fra den ovenstående oppløsning med ammoniumsulfat, dialyse og ytterligere rensing ved kromatografi på DEAE-cellulosesøyler.

Dyrkingen av E. coli-celler foregikk i næringsbuljong, peptonoppløsning, på "Trypticase Soy Agar" og i en næringsopp-løsning av sammensetning "Dehydrated Bacto-Nutrient Brotn" 0,8 %, glukose 1,0 %, dinatriumhydrogenfosfat 0,6 % og kaliumdihydrogen-fosfat 0,3 % (H.A. Campbell, L.T. Mashburn, E.A. Boyse, L.J. Old, Biochemistry 6 (1967) sidene 720 til 730, J. Roberts, M.D. Prager, N. Bachynsky, Cancer Research 26 (1966), sidene 2213 til 2217).

Disse arbeidsmetoder er imidlertid ikke egnet for en teknisk utvinnelse av enzymet.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til utvinning

av L-asparaginase fra Escherichia coli i teknisk målestokk og i gode utbytter idet fremgangsmåten er karakterisert ved at man fra næringsmediet hvor Escherichia coli er dyrket, utfeller cellematerialet med organiske baser av den generelle formel

og med molekylvekt over 1000, eller deres salter, oppslutter det f.eks. ved sentrifugering isolerte cellemateriale med aceton eller andre med vann blandbare eller begrenset blandbare organiske oppløsningsmidler, fraskiller cellematerialet og ekstraherer dette med vann, fjerner ekstraherte celler, nukleinsyrer og ballastprotein ved utfelling med ovenfor nevnte organiske baser eller deres salter, og fra den ovenstående oppløsning utfeller og isolerer L-asparaginase med aceton eller andre med vann blandbare eller begrenset blandbare organiske oppløsningsmidler.

Som organisme ble det anvendt Escherichia coli ATCC 9637. Det er imidlertid i praksis også egnet alle andre Escherichia coli-stammer, f.eks. Escherichia coli ATCC 4157, 8677, 8739, 9723, 10536, 10586, 11105, 11126, 11303, 12142, 12408, 12911, . 13676, 13706, 13762, 14948.

Forsøk med rystekulturer viste at anvendelsen av så-kalte "syntetiske" næringsoppløsninger og de hittil for disse for-mål kjente næringsoppløsninger bare førte til svak L-asparaginase-dannelse. Derimot får man bakterieceller av høy enzymatisk aktivitet med næringsoppløsninger, som ved siden av de nødvendige uorganiske ioner og aminosyre- og peptidblandinger i form av celleautolysater eller proteinhydrolysater som N-kilde inneholder egnede organiske syrer som C-kilde. Maissvellevannoppløsning-er oppfyller disse krav på fremragende måte. Ennå bedre resultater oppnås når man øker den i maissvellevann tilstedeværende konsentrasjon av melkesyre og dessuten tilfører NH^<+->ioner. Istedenfor melkesyre kan man også anvende ravsyre, fumarsyre eller L-eplesyre. Tilsetninger av ved E. coli forgjærbare kull-hydrater, f.eks. glukose, fruktose, mannose, maltose, galaktose osv. eller av aminosyrene DL-valin, DL-serin, L-cystein, L-tryp-tofan og DL-norvalin bevirker en represjon, tilsetninger av L-glutaminsyre, L-asparaginsyre, DL-alanin og glykokoll bevirker derimot en befordring av syntesen av L-asparaginase.

Også gjærekstrakt. egner seg som basis for næringsopp-løsningen.

Som godt egnet viser det seg følgende næringsoppløs-ninger :

Disse næringsoppløsninger podes med skrå-agarkulturer av E. coli ATCC 9637 og dyrkes på rystemaskin i ca. 20 timer ved 30°C. Kulturenes pH-verdi øker i denne tid til 8,5 til 8,9. De samme resultater fåes ved overføring av disse arbeidsbetingelser i den tekniske fermenteringsmålestokk.

Etter avsluttet dyrkning settes en organisk base med

en molekylvekt over 1000 eller dens salt til kulturbuljongen, hvorved cellene utfnokkes og blir lett sentrifugerbare. Etter cellenes resuspensjon i vann utfelles disse igjen ved tilsetning av aceton. Derved oppsluttes cellene og forandres således at den dannede L-asparaginase i neste trinn lar seg løse ut med vann.

Dette, trinn består i gjentatt adskillelse ved sentrifugering, g jentatt.r.resuspens jon og ekstrahering med vann. Fra denne sus-:, pensjon utfelles ved tilsetning av en av de ovennevnte organiske-, v baser de ekstraherte,celler, nukleinsyrer og ballastproteiner og fjernes ved sentrifugering. Fra den ovenstående vandige^opp-løsning kan L-asparaginase utfelles- ved. tilsetning av meget aceton. Istedenfor aceton lar det seg for cellenes oppslutning og utfelling av L-asparaginasen også.anvende andre med vann blandbare.eller begrenset blandbare organiske oppløsningsmidler som ræbanol, etanol, isopropanol, metyletylketon, dimetylsul-f- o oksyd.

I forhold til de tidligere kjente fremgangsmåter har fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen overraskende den store fordel å gi L-asparaginase i praktisk talt pyrogenfri tilstand. Bestemmelse av den relative L- asparaginase- aktivitet av bakterieceller isolert fra, kulturoppløsninger.

15,0 cn<r> kulturoppløsning sentrifugeres. Den ovenstående oppløsning kasseres. Bakteriecellene resuspenderes til

3 3

et volum av 15,0 cm i dobbeltdestillert H„0. 3,0 cm av denne cellesuspensjon fort- 7.ynnes med 12,0 cm dobbeltdestillert Ho0 og blandes med 15,0 cnr 2 % lg L-asparaginoppløsning i 1/10 molar fosfatpufferoppløsning med pH 7,0. Det følger deretter en til-

3

setning av 0,2 cm toluol.

Den således fremstilte reaksjonsblanding som nå inne-' holder 1,0 % L-asparagin og 1/10 resp. 1/6 av den i den opprinne-lige kulturoppløsningen foreliggende bakteriecellekonsentrasjon.;; (=1/10 (N)ormal resp. 1/6 (N)ormal), rystes under gummikorkluk-" ning i 3 timer ved 30°C. Etter utløp av denne tid oppvarmes blandingen 5 minutter ved 100°C, avkjøles igjen og klarsentri-fugeres. Den ovenstående oppløsning anvendes til kolorimetrisk NH^-nitrogen-bestemmelse med Nesslers reagens overfor ammoniumsulfat-standard-oppløsninger. Under disse prøvebetingelser.oppstår ved hjelp av i næringsoppløsning 1 dyrkede bakterieceller 0,025 til 0,04 %, ved hjelp av i næringsoppløsning 3 dyrkede . celler 0,04 % N. (Maksimalt avspaltbart N ved 1,0 % L-asparagin i reaksjonsblandingen= .0,106 % N)..

For å få et mål for den relative L-asparaginaseaktiyi-tet av E. coli-cellene multipliserer man den kolorimetrisk.be-stemte N-konsentrasjon med fortynningsfaktoren av den i- prøve-reaksjonsblandingen foreliggende bakteriecellekonsentrasjon. Således utgjør den relative L-asparaginase-aktivitet av.de r." . næringsoppløsning 1 dyrkede celler (0,025 til 0,04) x 10 = 0,25

til 0,4, aktiviteten'av de i næringsoppløsning 2 dyrkede celler (0,035 til 0,065) x 10 = 0,35 til 0,65 og aktiviteten av de i næringsoppløsning 3 dyrkede celler 0,04 x 6 = 0,24.

■: Ra-L-asparaginasens L-asparaginase-bestemmelse foregikk etter metoden fra Cancer Research 26 (1966), side 2013 til 2017.

Den ifølge oppfinnelsen''utvundne L-asparaginase skal anvendes Tsom legemiddel mot slike; tumorer som for sin vekst krever L-asparaginase som vekststoff. Før en slik anvendelse er det hensiktsmessig videre å anrike resp. å rense den ifølge oppfinnelsen utvundne L-asparaginase.

Eksempel

Ved den i det følgende som "base" betegnede forbindelse dreier det seg om et høymolekylært produkt méd den generelle formel

med en•molekylvekt over 1000, som oppstår ved omsetning av di-(3-amino-n-prqpyl)-metylamin med epiklorhydrin. Arbeidsgang. 1 10 % ±g maissvellevannoppløsning (referert til tørrstoff) innstilles med 2-n kalilut til pH 7,0, oppvarmes 20 minutter ved 120°C og klares etter avkjøling i overløpssentrifuge eller ved Seitz-filtrering. 30 liter av denne klare maissvellevannoppløs-ning fortynnes med 170 liter springvann. For fremstilling av den ovenfor omtalte næringsoppløsning 1 tilsettes 1,2 kg natriumlaktat og 0,4 kg ammoniumsulfat, til fremstilling av næringsopp-løsning 2 tilsettes .0,6 kg natriumlaktat, 0,3 kg L-glutaminsyre-Na,. 0,3 kg glykokoll og 0,4 kg ammoniumsulf at.

Den dannede næringsoppløsning steriliseres i en fermen- . terer i 40 minutter ved 110°C, avkjøles deretter og podes deretter med 500 cnr 3 av en 18 timer ved 30 oC dyrket rystekultur av Escherichia coli ATCC 9637 i en næringsoppløsning, bestående, av 1,5 % gjærekstrakt og 0,%natriumlaktat, pH 7,0. Fermenterings-blandingen luftes ved 30°C med 80 liter luft/minutt ved 150 om-dreininger av røreverket pr. minutt.

Arbeidgang 2

Etter en veksttid fra 16 til 18 timer - når kulturens

pH er steget til ca. 8,8 - avkjøles kulturbuljongen til ca. 20°C. Bakteriene som inneholder L-asparaginase, utfnokkes ved en tilsetning av 1,0 liter 2,5 %ig "base"-oppløsning, adskilles i over-løpssentrifuge og resuspenderes til et volum på 20 liter med springvann.

Arbeidsgang 5

I den i arbeidsgang 2 dannede cellesuspensjon lar man omrbring 3

det renne inn under/bO liter aceton, tilsetter 20 cm 2,5 %ig "base"-oppløsning, adskiller de utfelte bakterier i overløps-sentrifuge og resuspenderer cellemassen igjen til 20 liter med springvann.

Arbeidsgang 4

Til ekstrahering av L-asparaginase fra bakteriecellene omrøres den i arbeidsgang 3 fremstilte suspensjon i 4,5 timer ved 30°C. Under denne tid holdes pH ved tilsetning av l-n natronlut resp. 10 %ig eddiksyre ved pH 7,5 til 7,8. Deretter avkjøles til ca. 20°C.

Arbeidsgang 5

I den ifølge arbeidsgang 4 ekstraherte cellesuspensjon lar man det renne inn under omrøring 2,5 liter 2,5 %ig "base"-oppløsning og adskiller den dannede tykke utfelling som består av ekstraherte bakterier og uoppløselig "base"-nukleinsyreprotein-kompeks i overløpssentrifuge. Utfellingen kasseres. Man får ca. 17 liter av en klar oppløsning, hvori det ved siden av andre celle-innholdsstoffer befinner seg L-asparaginase.

Arbeidsgang 6

Fra den i arbeidsgang 5 utvundne oppløsning utfelles rå-L-asparaginase ved tilsetning av 68 liter aceton. Den dannede utfelling isoleres, ettervaskes med aceton og tørkes i vakuum ved 25 til 30 C. Man får ca. 100 g rå-L-asparaginase med en L-asparaginase-aktivitet på ca. 3,3 (ved anvendelse av næringsoppløsning 1), resp. 4,0 til 4,5 internasjonale enheter pr. mg (ved anvendelse av næringsoppløsning 2). Ved anvendelse av næringsoppløsning 3 inneholder rå-L-asparaginasen ca. 2,5 internasjonale enheter pr. mg.

Claims

Fremgangsmåte til utvinning av L-asparaginase fra Escherichia coli, karakterisert ved at man fra næringsmediet hvor Escherichia coli er dyrket, utfeller cellematerialet med organiske baser av den generelle formel

og med molekylvekt over 1000, eller deres salter, oppslutter det f.eks. ved sentrifugering isolerte cellemateriale med aceton eller andre med vann blandbare eller begrenset blandbare organiske oppløsningsmidler, fraskiller cellematerialet og ekstraherer dette med vann, fjerner ekstraherte celler, nukleinsyrer og ballastprotein ved utfelling med ovennevnte organiske baser eller deres salter, og fra den ovenstående oppløsning utfeller og isolerer L-asparaginase med aceton eller andre med vann blandbare eller begrenset blandbare organiske oppløsningsmidler.