NO122590B

NO122590B -

Info

Publication number: NO122590B
Application number: NO143323A
Authority: NO
Inventors: K Kieslich; U Kerb; G Raspe
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1961-02-22
Filing date: 1962-02-21
Publication date: 1971-07-19
Also published as: CH416608A; GB990384A; SE303283B; FI42958B; BE614196A; BR6236628D0; DE1169444B; US3232839A; FR1916M; DK105157C

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av nye anti-

inflammatorisk virksomme A1'4-16ct-methylsteroider.

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte ved fremstilling av nye /A\ l ' 4-loa-methylsteroider, som er antiinflammatorisk virksomme med reduserte uheldige bivirkninger, og med den generelle formel hvor R<1>er hydrogen eller lavere alkyl, R<2>er hydrogen eller hydroxyl, idet X er Cl O eller CI HOH når R 2 er hydrogen, og C1 H, når R 2 er hydroxyl,

oa' I 5 1

R-J og R er hydrogen eller halogen, og R er hydrogen eller en acyl-gruppe.

Fremgangsmåten erkarakterisert vedat en forbindelse med den generelle formel

hvor R<1>, R^, r^" og R"' er som ovenfor angitt, først behandles med enzymer av Curvularia lunata, hvorefter det dannede 11-hydroxysteroid og det dannede lZf-hydroxysteroid skilles fra reaksjonsblandingen, adskilles og 11-hydroxysteroidet viderebehandles med et 1(2)-dehydro-generingsmiddel i form av enzymer av Corynebacterium simplex eller Bacillus lentus eller et kjemisk dehydreringsiniddel, og om ønskes med et oxydasjonsmiddel eller et acyleringsmiddel i vilkårlig rekke-følge, og l4-hydroxysteroidet viderebehandles med et l(2)-dehydro-generingsmiddel av ovennevnte art og om ønskes med et acyleringsmiddel.

For den biokjemiske hydroxylering av utgangsstoffene kan man f.eks. bruke Curvularia lunata, mutant NRRL 2380.

Som oxydasjonsmiddel for den eventuelle videre-oxydasjon av en lia- eller lip-stillet hydroxylgruppe egner eksempelvis N-bromacetamid seg.

Mikroorganismer som kan brukes for dehydreringen i 1,2-stUl-ingen, er f.eks. Bacillus lentus, mutant MB 284 og Corynébacterium simplex, mutant ATCC 6946.

For acyleringen av hydroxylgruppen i 21-stillingen brukes for-trinnsvis eddiksyre og lavere alifatiske carboxylsyrer eller egnede derivater derav. De nye forbindelser har stor terapeutisk betydning ved behandling av betennelsessykdommer.

Bivirkninger, som f.eks. en påvirkning av mineralstoffskiftet, er tross den strukturelle likhet med mineraloxorticoidene meget små.

VP 50

VD 50 i ovenstående tabell (= "virkningsdose 50") betyr den dose som ved den anvendte betennelseshemningstest ifølge A. Robert og Jo E. Nezamis (Acta Endocrinologica Bd. 25, (1957), s. 105) akkurat reduserer eksudatdannelsen med 50% i sammenligning med ubehandlede kontrolldyr.

DOC = desoxycorticosteron.

Ifølge J. Fried og A. Borman i "Vitamines and Hormones", 16, s. 318 (1958) er den antiinflammatoriske aktivitet og den lever-glycogene aktivitet av corticosteron og hydrocortisonacetat i relasjon til cortisonacetat som følger:

Det angies i publikasjonen at fjernelse av hydroxylgrupper i sidekjeden fører til en progressiv nedgang i forholdet mellom antiinflammatorisk aktivitet og glucocorticoid aktivitet slik at der ikke blir noen påvisbar antiinflammatorisk aktivitet av progesteronderi-vatet til tross for dettes betraktelige glucocorticoide aktivitet.

Av denne publikasjon fremgår det klart at ved fjernelse av 17a-hydroxylgruppen fra molekylet ved corticoid virksomme steroider blir deres antiinflammatoriske aktivitet sterkt avsvekket eller forsvinner endog-helt#l: I lys av denne publikasjon var det følgelig overraskende at 17a-deshydroxyforbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, har en antiinflammatorisk aktivitet som endog overgår den hos det kjente hydrocort isonacetat, dexaioetason og f luorhydrocort isonacetat .

i

En sammenligning av 6a-fluor-l6a-methyl-l,4-pregnadien-lip,21-diol-3,20-dion (I) og 6a-fluor-1,4-pregnadien-llp,21-diol-3,20-dion (II) med hensyn til den ønskelige antiinflammatoriske aktivitet og den uønskede glucogene og katabole bivirkning er foretatt.

Den antiinflammatoriske virkning ble undersøkt ved Granuloma pouchtest: l forsøksdyrene, hanrotter (Sprague-Dawley) av vekt 130 - 160 g ble der innført en luftpose på 25 ml under rygghuden. Gjennom den samme kanyle ble innført 0,5 ml av en crotonoljeoppløs-ning (1%-ig i sesamolje). Testforbindelsen ble administrert i en 30 volumprosentig vandig gummiarabicumsuspensjon med en dagsdose på 3,0, 1,0, 0,3 og0,1 mg hos 10 dyr pr. dose pr. os. På den tredje dag ble luften evakuert fra luftposen med en injeksjonssprøyte. På den femte dag ble dyrene drept ved kloroformnarkose og eksudatmengden i granulomposen ble bestemt efter uttrekning i en injeksjonssprøyte.

Den glycogene aktivitet ble bestemt ved glycogeneogenesetesten på utvoksne mus: Dyrene ble forbehandlet i 4 dager med eggehviterikt for og melk ad libitim. Efter adrenalectomi på den feate dag fikk dyrene det samme for og til drikke 0,9%-ig koksaltoppløsning inneholdende 5% glucose. På den sjette dag fikk de det samme for, men til drikke bare koksaltoppløsning. På den syvende dag ble dyrene fra klokken 17°° fratatt foret og på den åttende dag også fratatt drikken. Forsøksdyrene sultet og tørstet til utgangen av forsøket. På den åttende dag ble der begynt med injeksjonene.

Fremstilling av testoppløsningen: Testforbindelsen ble opp-løst i 10 ml ethanol (ren og udenaturert), og denne stammoppløsning ble oppfylt med 5,5%-ig glucoseoppløsning. Videre fortynninger ble gjort med 10%-ig alkoholisk glucoseoppløsning (5,5%). Av de enkelte fortynninger ble der pr. dyr tilsammen innsprøytet 1,4 ml.

Injeksjonene skjedde med en halv times mellomrom tilsammen

7 ganger, hver gang med 0,2 ml. Følgende doser ble prøvet: 0,1, 0,03, 0,01 og 0,003 mg.

En halv time efter den siste injeksjon ble dyrene drept ved halshvirvelluksasjon, og glycogenet ble bestemt i den friske og hurtig uttatte lever ved anthron-metoden.

Den katabole virkning ble undersøkt i infantile hunrotter (Sprague-Dawley) av vekt ca. 60 g. Forsøksdyrene ble efter en enukes forperiode (iakttagelse av vekstforløp og utsjalting av ekstremt langsomt- og ekstremt hurtig-voksende dyr) i 14 dager daglig behandlet med testmaterialet.

Fremstilling av testmaterialet: Der ble fremstilt en stamm-oppløsning i benzylbenzoat-ricinusoljeblanding på en slik måte at 0,1 ml inneholdt den ønskede steroiddose. Av stammoppløsningen ble der fremstilt fortynninger i forholdet 1:1. I foreliggende tilfelle ble følgende dagsdoser pr. lOO g kroppsvekt administrert: 0,016, 0,032, 0,064 og 0,128 mg. Som mål for den katabole virkning gjelder den nedsatte vektøkning i forhold til ubehandlede kontrolldyr.

De på denne måte erholdte verdier ble satt i relasjon til hydrocortisonacetat (III) som standardforbindelse:

Resultatene i ovenstående tabell viser klart at den ifølge foreliggende fremgangsmåte fremstilte forbindelse I har en 500 ganger sterkere antiinflammatorisk aktivitet enn den tilsvarende l6-des- methylforbindelse II. Dette er absolutt overraskende. Dessuten var det ikke nærliggende å fremstille forbindelsen I, da det er fjernt for enhver fagmann å nedlegge forskningsarbeide i forbindelser som, som II, er svakere med hensyn til sin aktivitet enn de ålment aner-kjente standardforbindelser, som f.eks. III. En fagmanns arbeids-måte er tvert imot det motsatte: han forsøker å forbedre en bedre forbindelse enda mere.

Betydningen av forbindelsen I fremgår ikke bare av den bestemte overlegne absolutte verdi av den ønskelige antiinflammatoriske aktivitet, men bestemmes i det vesentlige av forholdet mellom den antiinflammatoriske aktivitet og den uønskede bivirkning, særlig den glycogene og katabole bivirkning. Det viser seg at den glycogene virkning av forbindelse I og II er praktisk talt lik. På'grunn av den overraskende høye antiinflammatoriske aktivitet er den glycogene virkning for forbindelsen I virkelig bare å anse som ekte bivirkning, mens forbindelse II er belastet med en uforholdsmessig høy glycogen virkning (se virkningskvotienten).

Enda langt gunstigere er det med den katabole bivirkning. Mangelen på l6-methylgruppen i forbindelse II har til følge en dår-ligere antiinflammatorisk aktivitet og en forsterkning av den katabole "bivirkning" sammenlignet med forbindelse III. Dette gir seg uttrykk rent tallmessig i den ugunstig høye katabole virkningskvotient (3,13). Ved forbindelse I er imidlertid økningen i den uønskelige katabole bivirkning i forhold til den ønskelige økning i

antiinflammatorisk aktivitet bare meget liten, hvilket gir seg uttrykk i den meget lave katabole virkningskyotient for forbindelse I (0,05). Kvotienten er så gunstig at man her virkelig kan tale om en absolutt underordnet katabol bivirkning.

Det er ovenfor påpekt at den ønskede antiinflammatoriske virkning ikke var forutsebar i lys av den Fried'ske publikasjon. Likeså overraskende og dermed ikke nærliggende var imidlertid også den meget lave glycogene og katabole bivirkning, da det er kjent at ved en oppnådd virkningsøkning i ønsket retning må der som regel også taes med på kjøpet en tilsvarende økning i de uønskede bivirkninger.

Der er dessuten utført et ytterligere sammenligningsforsøk mellom 6a,9a-difluor-l6a-methyl-l,4-pregnadien-llp,21-diol-3,20-dion (IV) og 6a,9a-difluor-l,4-pregnadien-lip,21-diol-3,20-dion (V). Den anvendte forsøksahordning var som ovenfor angitt for forbindelsene I og li, og standardforbindelsen, hydrocortisonacetat, er også her betegnet med III.

Av ovenstående tabell fremgår at fremgangsmåteforbindelsen IV

er 341 ganger sterkere aktiv enn den tilsvarende l6-desmethylfor-bindelse V. Dessuten fremgår der av tabellen at den uønskede glycogene og katabole virkning i forhold til den ønskede antiinflammatoriske virkning i tilfelle av fremgangsmåteforbindelse IV bare er av underordnet betydning (den tilsvarende virkningskvotient er mindre enn 1), hvorimot man for den tidligere kjente forbindelse V klart ser at den glycogene og katabole virkning i forhold til forbindelse III er øket sterkere enn den ønskede antiinflammatoriske virkning (virkningskvotienten er større enn 1).

Eksempel 1

a)Fremstilling av l6a- methyl- 4- pregnen- ll[ 3 , 21- diol- 3. 20- dion

(= l6a-methylcorticosteron)

En fermenter av rustfritt stål med volum 50 liter ble påsatt

30 liter av følgende næringsoppløsning 4,4% glucose (stivelsesukker)

1,0% maltekstrakt

0,3% NaN03

0,1% KH2P0^

0,05% KC1

0,05% MgSO^

0,002% FeSO^

0,5% maisstøp

Oppløsningen ble sterilisert ved oppvarmning i 1/2 time ved 120°C, og efter avkjøling ble oppløsningen podet med en sporesuspensjon av Curvularia lunata erholdt ved utvaskning av en 7-døgns maiskultur (15 g mais) med ca. lOO ml fysiologisk koksaltoppløsning.

Efter 2 døgns formering ved 25°C under omrøring (220 omdr./min.) og luftning (1,65 m^/h) ble 1,8 liter av den erholdte kultur uttatt under sterile betingelser og overført tii en like stor fermenter sammen

med 28,2 liter av følgende næringsoppløsning

4,4% glucose (stivelsesukker)

1,0%, maltekst rakt

0,3% NaN03

0,1% KH2P0^

Efter 24 timer under omrøring og luftning som ovenfor, ble 7,5 g l6a-methyl-desoxycorticosteron i 200 ml ethanol tilsatt og fermentert under samme betingelser i 28 timer.

Fermentasjonens forløp ble kontrollert ved uttagning av prøver, hvilke ble ekstrahert med methylisobutylketon. Ekstraktene ble analysert papir kromatografisk i systemet dioxan pluss toluen/propylen-glycol.

Efter endt fermentasjon (28 timer) ble kulturen avsuget på nutsch.Mycelium-resten ble vasket gjentagende ganger med vann. Filtratet ble ekstrahert med 3 ganger 10 1 methylisobutylketon. Eks-traktet ble inndampet i en omløpsfordamper under vakuum og forsiktig inndampet til tørrhet i en rundkolbe under vakuum. Residuet ble omkrystallisert fra aceton/isopropylether.

Smeltepunkt: 157 - 158°C (fermentasjonsutbytte 6o%).

Utbyttet av renset produkt efter to gangers krystallisasjon og kromatografering av morlutene på kiselsyregel: 53% av det teoretiske.

Analyse: C^H^O^(6360,5) € 2^0<=>15 400

Beregnet: 73,3 9,0 17,7

Funnet: 73,1 9,2 17,2

b) Fremstilling av l6a- methyl- lt4- pregnadien- ll[ 3. 21- diol- 3. 20- dion

(= l6a-méthyl-l-dehydrocorticosteron)

En fermenter av rustfritt stål på 50 liter ble påsatt 30 liter av en næringsoppløsning av 1% glucose og 0,2% maisstøp, hvorpå der sterilisertes som beskrevet i eksempel 1. Man podet med en bakteriesuspensjon av Sorynebacterium simplex erholdt ved utvaskning av en buljongagar-bverflate på o 64 cm 2 med 7 ml fysiologisk koksaltoppløs-ning.

i i

Efter 24 timers formering under de i eksempel 1 angitte betingelser ble 1,8 liter av den fremstilte kultur uttatt under sterile betingelser og overført til en fermenter sammen med 28,2 liter av det samme mediunu Samtidig tilsatte man en oppløsning av 7,5 g 16a-methylcorticosteron fra eksempel la i 150 ml ethanol og fermenterte under samme betingelser i 16 timer ved 25°C.

Fermentas jonens forløp (14 timer) ble kontrollert ved uttagning av prøver, hvilke ble ekstrahert med methylisobutylketon. Ekstraktene ble analysert polarografisk.

Kulturmediet ble uten avsugning ekstrahert tre ganger med IO 1 methylisobutylketon. Ekstraktenble opparbeidet som angitt under eksempel 1. Residuet ga efter to gangers omkrystallisasjon fra aceton/isopropylether 4,5 g krystallinsk produkt. Sm.p. 191/192 - 193,5°.

Ved kromatografering av morlutene erholdtes ytterligere 2 g.

(Utbyttet gjaldt: 87% av det teoretiske.)

Analyse: Z22<H>30°k(358,48)

Beregnet: C 73,75 H 8,4 0 17,85

Funnet: C 73,7 H 8,9 0 18,0 * 2k2~15 100

c)Fremstilling av l6a-methyl-l ,4-pregnadien-llf3 ,21-diol-3,20-dion-21- acetat

(= l6a-methyl-l-dehydrocorticosteron-21-acetat)

500 mg l6a-methyl-l-dehydrocorticosteron fra eksempel 1 b) i

3 ml pyridin og 1,5 ml acetanhydrid ble gitt 2 timers henstand ved romtemperatur og derefter innrørt i 20 ml 8%-ig svovelsyre ved 0°C. Efter 1 time ble det krystallinske produkt avsuget, vasket med vann og tørket. Man fikk 558 mg råprodukt, som ble omkrystallisert fra en liten mengde ethanol.

492 mg (87% av det teoretiske). Sm.p. 204 - 205°C

Analyse: C^^ O^ (<40>0,5)

Beregnet: C 72,0 H 8,1 0 19,95

Funnet: C 71,7 H 8,4 0 20,4 £2/f2= 15 020

Eksempel 2

a) Fremstilling av l6a- methyl- 4- preqnen- 21- ol- 3. 11. 2Q- trion

2 g l6a-methylcorticosteron fra eksempel la) ble oppløst i

120 ml aceton (96%), tilsatt 1,4 g N-bromacetamid og gitt henstand i 3 timer ved romtemperatur. Efter innrøring i 6oo ml vann ekstra-hertes fire ganger med lOO ml methylenklorid. Ekstrakten ble vasket nøytral, tørket over natriumsulfat og inndampet i vakuum. Residuet (2,1 g) ble kromatografert på kiselsyregel. Ved eluering med CH2C12: CHClg (1:1) og CHClg erholdtes 1,49rå 11-ketoforbindelse. Efter omkrystallisasjon fra kloroform-isopropylether erholdtes 900 mg (44% av det teoretiske). Sm.p. 176/179 - l8l°.

Anaiyse: C^H^O^ (358,5)

Beregnet: C 73,7 H 8,4 O 17,9

Funnet: C 71,7 H 8,5 O 17,6<=>15 120

b) Fremstilling av l6a-methyl-l,4-pregnadien-21-ol-3,11,20-trion fra l6a- methyl- 4- preqnen- 21- ol- 3. 11, 20- trion

l6a-mexhyl-4-pregnen-21-ol-3,11,20-trion fra .eksempel 2a) ble dehydrogenert som beskrevet i eksempel lb) med Corynebact. simplex, hvorved man fikk l6a-methyl-l,4-pregnadien-21-ol-3,11,20-trion som var identisk med det ifølge eksempel 2c fremstilte produkt.

c) Fremstilling av l6a-methyl-l,4-pregnadien-21-ol-3,11,20-trion fra l6g- methyl- l, 4- pregnadien- lip. 21- diol- 3, 20- dion 1 g l6a-methyl-l-dehydrocorticosteron (se eksempel lb) ble i 6o ml 9-6%-ig aceton oxydert med 720 mg N-bromacetamid i 3 timer og opparbeidet som angitt i eksempel lb. Man fikk 1,2 g råprodukt, hvilket efter kromatografisk rensning på kiselsyregel og omkrystallisering fra eddiksyreester-hexan ga 430mg (43% av det teoretiske) ren 11-ketoforbindelse.

Sm.p. 160/I6I - 163°C.

Analyse:<C2>2^28°4(356,46)

Beregnet: C 74,2 H 7,9 O 17,9

Funnet: C 73,5 H 8,2 O 17,8 £237<1>5 120

d) Fremstilling av l6a-methyl-l,4-pregnadien-21-ol-3,11,20-trion-21-acet at

550 mg l6a-methyl-l-dehydrocorticosteron-21racetat fra eksempel lc) ble oppløst i 92 ml 96%-ig aceton, oxydert med 1,1 g N-bromacetamid i 3 timer ved romtemperatur og opparbeidet som angitt i eksempel lb). Man fikk 550 mg råprodukt, hvilket ble kromatografert på kiselsyregel.Methylenklorideluatene ga 390 mg krystallinsk materiale, hvilket efter omkrystallisasjon fra en liten mengde ethanol ga 286 mg av det rene produkt. Sm.p. 207/209 - 210°C.

Analyse: C^Hg^ (398,5)

Beregnet: C 72,3 H 7,6 0 20,1

Funnet: C 71,6 H 7,9 0 20,1 £237= lZf 820

Eksempel 3

a) Fremstilling av l6a.- methyl- 4- pregnen- l4a. i21 . diol- 3. 2Q- dion

En fermenter av rustfritt stål på 50 1 ble påsatt 30 liter av

en næringsoppløsning av

^5% sacoharose

1% roesukkermelasse

0,2% NaHC03

0,1% KH2P0^

0,05% KC1

0,001% FeSO^

0,05% MgSO^

0,5% maisstøp (pH 7)

Oppløsningen ble sterilisert ved en 1/2 tines oppvarmning ved 120°C og efter avkjøling podet med en sporesuspensjon av Curvularia lunata, erholdt ved vaskning av en 7-døgns maiskultur (15 g mais) med ca, 100 ml fysiologisk koksaltoppløsning.

Efter 2 dagers formering ved 25°C under omrøring (220 o/min) og luftning (1,65 m^/t) ble 1,8 liter av den erholdte kultur uttatt under sterile betingelser og overført til en 50 liters fermenter sammen med 30 liter av en næringsoppløsning av

5% saccharose

1% roesukkermelasse

0,2% NaN03

0,1% KH2P0^

Efter 24 timer under omrøring (110 o/min) og luftning (8 m /t) ble 7,5 g l6a-methyl-4-pregnen-21-ol-3,20-dion i 200 ml ethanol tilsatt og fermentert i 28 timer under samme betingelser.

Fermentasjonens forløp ble kontrollert ved uttagning av prøver, som ble ekstrahert med methylisobutylketon. Ekstraktene ble analysert papirkromatografisk i systemet dioxan pluss toluen/propylen-glycol.

Efter endt fermentasjon ble kulturmediet avsuget og ekstrahert med methylisobutylketon. Ekstrakten ble inndampet i vakuum og residuet kromatografisk skilt i den lip- og l4a-hydroxylerte forbindelse på kiselsyregel. Fraksjonene med l6a-methyl-4-pregnen-l4a,21-diol-3,20-dion ble acetylert som råprodukt: 6 g råprodukt i 20 ml pyridin tilsatt 10ml acetanhydrid fikk stå i 3 timer ved romtemperatur og ble derpå innrørt i 120 ml 8%-ig svovelsyre ved 0°C. Efter 1 time ble det krystallinske produkt avsuget, vasket med vann og tørket og derpå omkrystallisert fra isopropylether. Produktet veiet 1,7 g, sm.p. 192/193 - 194°C.

Analyse:C^H^C^(402,5)

Beregnet: C71,7 H 8,5 0 19,9

Funnet: C 70,4 H 9,0020,1 £ 2l\ 0~15 200

b) Fremstilling av lég- methyl- l. 4- preqnadien- l4a. 21- diol- 3. 20- dion l6a-methyl-4-pregnen-l4a,21-diol-3,20-dion dehydrogeneres som

beskrevet i eksempel lb) med Corynebact. simplex og gir l6a-methyl-1,4-pregnadien-l4a,21-diol-3,20-dion.

Eksempel 4

a)Fremstilling av l6g- methyl- 6a- klor- 4- pregnen- llg. 21- diol- 3. 2Q- dion l6a-methyl-6a-klor-4-pregnen-21-ol-3,20-dion hydroxyleres i

110-stillingen, analogt den i eksempel la) beskrevne fremgangsmåte. Det her anvendte utgangsmateriale l6a-methyl-6g-klor-4-pregnen-21-ol-3,20-dion, sm.p. 171 - 173°C, 21-acetatet, 144 - 145,5°C, som hittil ikke er beskrevet, erholdes av l6<g->methyl-5-pregnen-30-ol-20-on-acetat ved addisjon av klor ved 5:6-dobbeltbindingen, forsåpning av 3-acetoxygruppen, bromering av det 21-stillede methyl, omsetning av det innførte 21-bromatom med kaliumacetat, oxydasjon av det 3~

stillede hydroxyl til en ketogruppe, og tilslutt avspaltning av klorhydrogen og om ønskes, forsåpning av 21-acetoxygruppen. Foreliggende patent omfatter ikke beskyttelse av fremstillingen av dette utgangsmateriale.

b) Fremstilling av l6a-methyl-6a-klor-l,4-pregnadien-110,21-diol-3, 20- dioh

l6a-methyl-6a-klor-4-pregnen-lip,21-dio1-3,20-dion dehydrogeneres med Corynebact. simplex som beskrevet i eksempel lb), hvorved man får l6<g->methyl-6a-klor-l,4-pregnadien-110,21-diol-3,20-dion.

Eksempel 5

a) l6g- methyl- 6g- fluor- 4- preqnen- llg, 21- diol- 3. 20- dion l6<g->methyl-6g-fluor-4-pregnen-21-ol-3,20-dion-21-acetat (sm.p.

132/134 - 138°C, UV £236= 15000) hydroxyleres efter ovenstående ferment as jonsmetode (la) medCurvularia lunata i ll|3-st illingen, hvorved 21-acetatgruppen samtidig forsåpes. Det som utgangsmateriale anvendte, hittil ikke beskrevne l6<g>-methyl-6g<->fluor-4-pregnen-21-ol-3,20-dion-21-acetat fremstilles av l6g-methyl-5-pregnen-3p ,21-diol-20-on-21-acetat (sm.p. 152 - 154°C) ved addisjon av bromfluor (fra N-bromacetamid og fluorhydrogen) ved 5:6-dobbeltbindingen, oxydasjon av 3P-hydroxylgruppen med kromsyre, innføring av 4-dobbeltbindingen ved avspaltning av bromhydrogen og sur isomerisering av 6|3-fluorsub-1 1

stituenten til l6<g->raethyl-6g<->fluor-4-pregnen-21-ol-3,20-dion-21-acetat,

Ved kromatografisk rensning på kiselsyregel isoleres l6a-methyl-6a-fluor-4-pregnen-110,21-diol-3,20-dion og omkrystalliseres fra eddiksyreester.

Sm.p. 166/167 -171°C, £23614 400.

b) l6g- methyl- 6g- fluor- 4- pregnen- llg. 21- diol- 3. 20- dion- 21- acetat

Ved omsetning med acetanhydrid i pyridin ved romtemperatur ble

acetatet fremstilt og omkrystallisert fra eddiksyreester, som beskrevet i eksempel lc).

Sm.p. 248/249- 25i°c, e23614OOO.

c) l6g- methyl- 6g- fluor- 1, 4- pregnadien- llg, 21- diol- 3. 20- dion

Som i eksempel lb) dehydrogeneres l6a-methyl-6g<->fluor-4-pregnen-ll|3,21-diol-3,20-dion med Corynebacterium simplex. Ekst raksjons-residuet kromatograferes på kiselsyregel og gir efter omkrystallisasjon fra methylenklorid-isopropylether l6<g>-methyl-6g-fluor-1,4-pregnadien-110,21-diol-3,20-dion.

Sm.p.l80/l8l - 182°C, £2lil 15 320.

d) l6g- methyl- 6g- f luor- 1 , L \- r>ieqnad±en - 116. 21 - diol - 3, 20- dion- 21 - acetat l6<g>-methyl-6g-fluor-1,4-pregnadien-ll6,21-diol-3,20-dion

acetyleres som beskrevet under eksempel lc) og omkrystalliseres fra methylenklorid-isopropylether.

Sm.p. 232/233 - 235°C, £2ZfQ15 860.

Eksempel 6

a) l6g- methyl- 6g- fluor- 4- pregnen- l4ai21- diol- 3. 2Q- dion

Fra morlutene i eksempel 5a) isoleres l6<g->methyl-4-pregnen-l4a,

21-diol-3,20-dion ved gjentatt kromatografisk separasjon. Efter om-krystallisas jon fra eddikester er smeltepunktet 250/252 - 253°C,

e235lZf 000 •

b) l6g- methyl- 6g- fluor- 4- preqnen- l4ay21- diol- 3. 20- dion- 21- acetat l6a-methyl-6a-fluor-4-pregnen-l4a^21-diol-3,20-dion acetyleres

som beskrevet under lc og omkrystalliseres fra ethanol/isopropylether.

Sm.p. 179/180 - 182°C, £23614 400.c) l6a- methyl- 6a- fluor- 1, 4- pregnadien- l4a. 21- diol- 3, 20- dion l6a-methyl-6a-fluor-4-pregnen-l4a,21-diol-3,20-dion dehydrogeneres med Corynebacterium simplex som i eksempel lb. Ekstraksjons-residuet kromatograferes på kiselsyregel og gir efter omkrystallisasjon fra eddiksyreester l6a-methyl-6a-fluor-1,4-pregnadien-l4a,21-diol-3,20-dion.

Sm.p, 241/242 - 243°C, £2^216 500.

d) 16a- methyl- 6g- fluor- 1, 4- pregnadien- 14a. 21- diol- 3, 20- dion- 21- acetat 1

16a -met hy l-6a-f luor-1,4-pregnadien-l4a,21-diol-3,20-diori acetyleres og omkrystalliseres fra eddiksyreester som beskrevet under eksempel lc.

Sm.p. 220/223 - 236°C, * 21* 1 15 50°*

Eksempel 7

a) l6a- methyl- l. 4- pregnadien- l4a. 21- diol- 3. 20- dion

Analogt eksempel lb) poder man en 30 liters steril næringsopp-løsning av 0,1% gjærekstrakt, 0,5% maisstøp og 0,2% glucose med en bakteriesuspensjon avBacillus lentus mutant MB 284. Efter 24 timers formering blir 1,8 liter av dette kulturmedium overført til 28,2 liter av et sterilt medium med samme sammensetning. Samtidig blir 7,5 g l6a-methyl=4-pregnen-l4a,21-diol-3,20-dion i 150 ml ethanol tilsatt og fermenteres i 30 timer ved 25°C Kulturmediet opparbeides som beskrevet i eksempel lb), hvorved man får 5»2 g krystallinsk råprodukt, som omkrystalliseres fra eddiksyreester.

3,7 g: Sm.p. 242/244 - 246°C.

Analyse: C22<H>3D°k (358»5)

Beregnet: C 73,8 H 8,4 o 17,8 6^ 15 750

Funnet:C73,6h8,50 18,5

b) l6a- methyl- 1. 4- pregnadien- l4ai21- diol- 3. 2Q- dion- 21- acetat

320 mg l6a-methyl-l,4-pregnadien-l4a,21-diol-3,20-dion acetyleres i 3 ml pyridin med 1,5 ml eddiksyreanhydrid i 2 timer ved romtemperatur og opparbeides som beskrevet i eksempel lc). Råproduktet omkrystalliseres fra eddiksyreester.

Sm.p. 208/209 - 2lO°C.

Analyse:,C<2>4<H>32°5 (4CO,52)

Beregnet: 72,1 8,06 19,84 €24515 830

Funnet: 71,96 9,97 19,95

Eksempel 8

a) l6q- methvl- 9a- fluor- 4- preqnen- llp. 21 - diol- 3, 20- dion

På den i eksempel la) beskrevne måte blir 7,5 g l6a-methyl-9a-fluor-4-pregnen-21-ol-3,20-dion fermentert i 36 timer med Curvularia lunata (mutant NRRL 2380) og opparbeidet. Residuet av methylisobutylketon -ekst r akt en kromatograferes på kiselsyregel, hvorefter man eluerer med en blanding av kloroform og eddiksyreester i forholdet 2:1, hvilket gir 110-hydroxylforbindelsen, som i form av råproduktet anvendes for den videre dehydrogenering.

b) l6a- methvl- 9a- fluor- l, 4- pregnadien- lip, 21- diol- 3, 20- dion

Det under a) ovenfor erholdte rå l6a-methyl-9a-fluor-4-pregnen-11p,21-diol-3,20-dion ble fermentert med Bacillus lentus i 30 timer og opparbeidet som beskrevet i eksempel 7a). Residuet av methylisobutylketon -ekst rakten gir l6a-methyl-9a-fluor-1,4-pregnadien-lip,21-diol -3,20-dion som råprodukt.

c) l6a- methyl- 9a- fluor- 1. 4- pregnadien- 110, 21- diol- 3. 20- dion- 21- acetat l6a-meth<y>l-9a.-fluor-1,4-pregnadien-lip,21-diol-3,20-dion i

form av råproduktet acetyleres og opparbeides som beskrevet i eksempel lc). Det erholdte rå-acetat omkrystalliseres fra isopropylether/methylenklorid.

Sm.p. 220 - 226°C.

uv: e 239 15 600.

Eksempel 9

a) 6a. 16a- dimethy1- 4- pregnen- lip. 21- diol- 3. 20- dion

6a,l6<g>-dimethy1-4-pregnen-21-ol-3,20-dion-21-acetat (sm.p.

120 - 121°C) hydroxyleres i lip-stillingen efter ovenstående fermentas jonsmetode (la) med Curvularia lunata, hvorved 21-acetatgruppen samtidig forsåpes. Det herved anvendte, hittil ikke beskrevne utgangsmateriale , 6a,l6<g->dimethyl-4-pregnen-21-ol-3,20-dion-21-acetat

fremstilles av 6p,l6<g->dimethylpregnan-3P,5a-diol-20-on (R. P. Graber, Chem. and Ind. 1960, 1478) ved innvirkning av brom i ether, omsetning av den dannede 21-bromforbindelse med kaliumacetat, oxydasjon av 3p-hydroxylgruppen med kromsyre og innføring av A^-dobbeltbindinqen ved vannavspaltning ved hjelp av klorhydrogen-iseddik under samtidig isomerisering av 6p-methylgruppen.

Ved kromatografi på kiselsyregel isoleres 6a,l6a-dimethyl-4-pregn en-11p,21-dio1-3,20-dionet.

I i

b) 6a. l6g- dimethyl- 4- pregnen- 110. 21- diol- 3. 20- dion- 21- acetat Ved omsetning med acetanhydrid i pyridin ved romtemperatur

fremstilles acetatet som beskrevet i eksempel lc).

c) 6a. 16a- dimethy1- 1. 4- pregnadien- 110. 21- dio1- 3. 20- dion

Som i eksempel lb) blir 6a,l6<g->diarethyl-4-pregnen-110,21-diol-3,20-dion dehydrogenert med Corynebacterium simplex.. d) 6a. 16a- dimethy1- 1. 4- pregnadien- 110. 21- dio1- 3, 20- dion- 21- acetat Man acetylerer 6a,l6a-dimethyl-l,4-pregnadien-110,21-diol-3,20-dion som beskrevet under eksempel lc).

Eksempel IO

a) Fremstilling av l6a-methyl-6a,9a-difluor-4-pregnen-HØ,21-diol-3, 2Q- dion

En fermenter av rustfritt stål med volum 50 liter påsettes

30 liter av følgende næringsoppløsning:

4*4%:glucose

1,0% maltekstrakt

0,1% KH2P0^

0,03% KC1

0,05% MgSO^

0,002% FeSO^

0,50% maisstøp

Oppløsningen steriliseres ved oppvarmning i 1/2 time ved 12o°C, og efter avkjøling podes oppløsningen med en sporesuspensjon av Curvularia lunata erholdt ved utvaskning av en 7-døgns maiskultur (15 g mais) med ca. lOO ml fysiologisk koksaltoppløsning.

Efter ,2 døgns formering ved 25°C under omrøring (220 omdr./min) og luftning (1,65 m<3>/h) taes 1,8 liter av den erholdte kultur ut under sterile betingelser og overføres til en like stor fermenter sammen med 28,2 liter av følgende næringsoppløsning:

4f4% glucose

1,0% maltekstrakt

0,3% NaN03

0,1% KH2PO^

Efter 24 timer under omrøring og luftning som ovenfor, tilsettes 7,5 g l6a-methyl-6a,9a-difluor-4-pregnen-21-ol-3,20-dion-21-acetat i 200 ml ethanol og der fermenteres under samme betingelser i 28 timer.

Fermentasjonens forløp kontrolleres ved uttagning av prøver, hvilke ekstraheres med methylisobutylketon. Ekstraktene analyseres papirkromatografisk i systemet dioxan/toluen/propylenglycol.

Efter endt fermentasjon (28 timer) avsuges kulturen på en stor nutsch. Mycelium-resten vaskes gjentatte ganger med vann. Filtratet ekstraheres med 3 ganger 10 liter methylisobutylketon. Ekstrakten inndampes i en omløpsfordamper under vakuum og inndampes forsiktig til tørrhet i en rundkolbe under vakuum. Residuet kroma-tograf eres på kiselsyregel, hvorved man får eddiksyre-kloroform(1:3)-eluatet av det ønskede l6a-methyl-6a,9a-difluor-4-pregnen-llp,21-diol -3,20-dion, hvilket efter omkrystallisering fra eddiksyre-ether smelter ved 200/202 - 20'5°C;' t233= 15 8°°*b) Fremstilling av l6a-methyl-6a,9a-difluor-4-pregnen-llp,21-diol-3. 20- dion- acetat

3 g l6a-methyl-6a,9a-difluor-llp,21-diol-3,20-dion oppløses i

9 ml pyridin, får stå i 3 timer med 4,5 ml acetanhydrid ved romtemperatur og innrøres til slutt i 6o ml iskold 8%-ig svovelsyre. Det utfelte bunnfall avsuges og omkrystalliseres fra eddikester efter tørring. Det rene produkt erholdt i ca. 90% utbytte, smelter ved 229/232 - 24o (spaltes)aD= +133,8°C.

(CHClg); £233= 16OOO.

c) Fremstilling av 16a-methyl-6a,9a-difluor-1,4-pregnadien-llØ,21-djol- 3. 20- dion

16a-met hy 1 - 6a, 9a -dif luo r -4 -p re gnen -110,21 -dio 1 -3,20 -dion -21 - acetat (sm.p. 229/232 - 234°C spaltes) dehydreres i 1,2-stillingen med Bacillus lentus, mutant MB 284, hvorved samtidig 21-acetatgruppen forsåpes.

Dette ble tilsatt til en fermenter av rustfritt stål på 50 1 sammen med 30 1 næringsoppløsning inneholdende 0,1% gjærekstrakt, 0,5% maisstøp og 0,2% glucose. Efter sterilisering ved oppvarmning i en halv time ved 120°C og efterfølgende avkjøling ble det podet med en bakteriesuspensjon av Bacillus lentus MB 284.

Efter 24 timers formering ved 28°C under omrøring (220 omdr./ min) og luftning (1,65 m<3>/h) taes 1,8 liter av den fremstilte kultur ut under sterile betingelser og overføres til en like stor fermenter saaaan ped 28 liter av den samme steriliserte næringsoppløsning.

Saatidig tilsettes 6 g l6a-methyl-6a,9a-difluor-4-pregnen-lip,21-diol-3,20-dion-21-acetat til 200ml dimethylformamid og fer-

menteres linder samme betingelser i 50 timer.

Fermentasjonens forløp kontrolleres ved uttagning av prøver, hvilke ekstraheres med methylisobutylketon. Ekstraktene analyseres ad tynnskiktskromatografisk vei (system: benzen/eddiksyre 4:1)*

Ved opparbeidelse som i eksempel 10a, erholdes et oljeaktig-krystallinsk residuum, hvilket kromatograferes på kiselsyregel. l6a-methyl-6a,9a-difluor-1,4-pregnadien-lip,21-diol-3,20-dion ekstraheres med! eddikester-kloroform 1:2 og omkrystalliseres fra eddikester/ether, hvorefter det smelter ved 240/242 - 244°C (utbytte 6o%)j £ 237 = 16 600.

d) l6a-methyl-6a,9a-difluor-1,4-pregnadien-lip,21-diol-3,20-dion.-21-acetat

200 mg l6a-methyl-6a,9a-difluor-1,4-pregnadien-lip,21-diol-3,20-dion acetyleres i pyridin med eddiksyreanhydrid ved romtemperatur samt opparbeidelse som i eksempel 10b. Efter omkrystallisering fra eddikester erholdes l6o mg med smeltepunkt 259/260 - 26l°C;

e2yj= i6 5oo.

Det kreves her ingen beskyttelse for den hittil ikke beskrevne fremgangsmåte til fremstilling av det som utgangsmateriale anvendte l6a-methylr-6a, 9a-difluor-^^-<p>re<g>nen-21-ol-<3>,20-dion-21-acetat f ra 16a-methyl-6a-fluor-4-pregnen-lia,21-diol-3,20-dion-21-acetat ved dehydratisering av lla-hydroxygruppen til den tilsvarende /a\ 9 ' 11-forbindelse med efterfølgende addisjon av hydrogenfluorid i pyridin til den oppståtte 9,11-dobbeltbinding.

Claims

Fremgangsmåte ved fremstilling av ^"'^-léa-raethylsteroider, som er antiinflammatorisk virksomme med reduserte uheldige bivirkninger, og med den generelle formel

hvor R 1 er hydrogen eller lavere alkyl, R 2er hydrogen eller hydroxyl, i I 2 '2 idet X er CO eller CHOH når R er hydrogen, og CH^ når R er hydroxyl, RJ og R er hydrogen eller halogen, og R er hydrogen eller en acyl-gruppe, karakterisert ved at en forbindelse med den generelle formel

hvorR<1> ,R<3> ,R ^ og R"* er som ovenfor angitt, først behandles med enzymer av Curvularia lunata, hvorefter det dannede 11-hydroxysteroid og det dannede 14-hydroxysteroid skilles fra reaksjonsblandingen, adskilles og 11-hydroxysteroidet viderebehandles med et l(2)-dehydro-generirigsmiddel i form av enzymer av Corynebacterium simplex eller Bacillus lentus eller et kjemisk dehydreringsmiddel, og om ønskes med et oxydasjonsmiddel eller et acyleringsmiddel i vilkårlig rekkefølge, og lif-hydroxysteroidet viderebehandles med et l(2)-dehydrogenerings-middel av ovennevnte art og om ønskes med et acyleringsmiddel.