NO122265B

NO122265B -

Info

Publication number: NO122265B
Application number: NO15160064A
Authority: NO
Inventors: M Trouilhet
Original assignee: Calor App Electro Domestiques
Priority date: 1963-07-30
Filing date: 1964-01-15
Publication date: 1971-06-07
Also published as: FR1371950A; DK111454B; GB1036777A; BE642342A

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av nye steroidforbindelser av 1,4-pregnadienrekken.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av nye steroidforbindelser av 1,4-pregnadienrekken.

I den senere tid er en rekke av steroider av pregnen- og pregnadienrekken, f. eks. hydrocortison og l(2)-dehydro-hydrocortison blitt viktige terapeutiske midler og nyttige som mellomprodukter for fremstilling av andre terapeutisk nyttige steroider. De nye 1,4-pregnadiener som fåes ifølge foreliggende oppfinnelse, er brukbare som anti-inflammasjonsmidler ved behandling av arthritis, asthma, brannsår, bursitis o. 1., og også ved behandling av hudsykdommer og kollagen-sykdommer. Forbindelsene anvendes i forening med fyllstoffer, binde-midler osv. i tabletter, pulver, piller osv. De kan også anvendes parenteralt i en opp-løsning eller i en suspensjon.

I henhold til foreliggende oppfinnelse fremstilles de nye 1,4-pregnadiener, idet en 4-pregnenforbindelse av den alminnelige formel:

hvor X er hydrogen eller halogen, Y en methylen-, hydroxy-methylen- eller carbonyl-gruppe, Z en hydroxymethylen- eller lavere alkanoyloxymethylengruppe, R' er hydrogen eller en hydroxylgruppe og R er hydrogen eller en lavere alkanoylgruppe, påkjent måte utsettes for den fermentative, enzymatiske innvirkning av artene av slekten Nocardia eller arten Corynebacterium simplex, hvoretter det resulterende steroid kan hydrolyseres eller forestres ved hjelp av kjente fremgangsmåter.

De ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen dannede 1,4-pregnadiener svarer til den generelle formel:

hvor de enkelte symboler har den ovenfor angitte betydning.

Ved utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kultiveres en sopp av slekten Nocardia, (Bergey, Manual, 6. Edition), som f. eks. corallina, ATCC 999 og ATCC 4273 (Lederle Culture nr. 13), asteroides, ATCC 3308, keratolyticus, ATCC 12484, transvalensis, ATCC 12485, erythropolis, ATCC 4277, convoluta, ATCC 4275, gardneri, ATCC 9604, leishmanii, ATCC 6855, opaca, ATCC 4276, blackwelii, ATCC 6846, caviae, ATCC 6848, cuniculi, ATCC 6864, globerula, ATCC 9356, polychromogenes, ATCC 3409, sylvodifera, ATCC 7372, farcinica, ATCC 3318, sylvodifera, ATCC 4919 eller andre arter av Nocardia eller fungus Corynebacterium simplex aerobisk i et passende næringsmedium med et 4-pregnenderivat. Under veksten av organismen under gunstige forhold elimineres to hydrogenatomer fra steroidforbindelse ring A, og det fåes herved en dobbeltbinding i 1(2)-stilling. Den nøy-aktige mekanisme for denne dehydrogene-ring er uklar, men er resultatet av enzymer som dannes av organismen under vekstfor-løpet. Et passende næringsmedium inneholder en oppløselig kilde for carbon, nitrogen og mineralstoffer. Carbonkilder omfatter sukkerarter, som f. eks. glucose, sucrose, maltose, dextrose, xylose og galac-tose, og også alkoholer som glycerol eller mannitol, maisstivelse, organiske syrer som citronsyre, eplesyre og eddiksyre og forskjellige naturprodukter, som inneholder carbohydrater, som f. eks. maisutlutningsvæske, sojabønnemel, bomullsfrømel og mange andre tilgjengelige materialer som er blitt anvendt tidligere som carbonkilde ved fermenteringsprosesser. Vanligvis kan en variasjon av ovennevnte anvendes i mediet med gode resultater.

Egnede kilder for nitrogen omfatter enkelte av de ovennevnte stoffer, som f. eks. maisutlutningsvæske, sojabønnemel, bom-ullsfrømel og lignende, og forskjellige andre slags substanser som f. eks. kjøtteks-trakt, casein, gjær, enzymatisk nedbyggede proteiner og andre nedbygningsprodukter, innbefattet peptoner, aminosyrer og mange andre tilgjengelige proteinholdige materialer som har vist seg å være skikket til å understøtte veksten av sopper o. 1. Anorganiske kilder for nitrogen, omfattende urin-stoffer, ammoniumsalter, nitrater, og lignende kan anvendes i mediet som en kilde for assimilert nitrogen for å tilveiebringe et gunstig vekstmedium for organismen.

Mineralkravene for fermenteringen tilveiebringes vanligvis i råmaterialene, som ofte anvendes som kilder for carbon og nitrogen eller forekommer også i vannet som anvendes ved prosessen. Det er imid-lertid vanligvis tilrådelig å supplementere de mineraler som vanligvis er til stede, med tilsatte mengder for å få en maksimal vekst av Nocardia. Kationer og anioner som kan være ønskelige i de tilsatte mengder, omfatter natrium, calcium, kalium, magnesi-um, fosfat, sulfat, klorid, kobolt, mangan og forskjellige andre. Anvendelse av spor-elementer som f. eks. bor, kobber, kobolt, molybden og krom er ofte ønskelige.

Veksten av Nocardia fungus eller av Corynebacterium simplex fungus finner sted under aerobiske forhold og luftingen i kolber kan f. eks. oppnåes ved omrøring på en reciproserende eller roterende rysteinnretning eller i flasker eller tanker, ved å tvinge stabil luft gjennom fermenterings-blandingen. Det er ønskelig at den stabile luft tvinges gjennom mediet i en mengde av fra y3 til 2 volumdeler luft pr. volum av medium pr. minutt. Omrøring i flasken eller

fermenteringsbeholderen bevirkes ved hjelp

av et mekanisk røreapparat. Nocardia fungus vil vokse eller gro ved temperaturer

mellom 5 og 45° C, men det er å foretrekke å utføre prosessen under anvendelse av en temperatur fra 25° C til 37° C. Corynebacterium simplex vil vokse ved temperaturer mellom 10° C og 45° C, men fortrinsvis anvendes en temperatur fra 25° C til 38° C.

For å tilveiebringe et inokulat anvendes 1,0 ml av en vasket vegetativ cellesuspensjon av fungi av slekten Nocardia eller av Corynebacterium simplex for å inokulere 100 ml av en steril Trypticase-soja-dyrkningsvæske i en 500 ml Erlenmeyerkolbe. Trypticase-sojavæsken inneholder 3 pst. av tryptisk nedbrutte sojaproteiner som et dehydratisert pulver (Baltimore Bacte-riological Laboratories), glycerin — 5 pst., kjøttekstrakt (Armour) — 0,3 pst., og denne blanding steriliseres i 15 minutter ved en temperatur av 120° C ved et damptrykk av 1,1 kg/cm<2>. Etter sterilisering er pH i området 7,4 til 7,7. Den inokulerte eller podete kolbe inkuberes ved 37° C på en rysteinnretning i ca. 4—8 timer. Et slikt inokulat kan anvendes for å pode større charger av sterilt medium i flasker, og slike flaskekul-turer kan etter fermentering anvendes for å pode store charger av medium i fermen-teringstanker. Istedenfor den ovenfor be-skrevne Trypticase-sojavæske kan det anvendes andre medier, slik som det fremgår av følgende eksempler.

De ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendbare, i 4-stilling umettede forbindelser av pregnanrekken omfatter bl. a.: 4-pregnen-ll|3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion, 4-pregnen-9a,fluor-ll(3,16a,17a,21-tetraol- 3,20-dion og 4-pregnen-16a,17a,21-triol-3,ll,20-trion samt estere og lignende derivater av disse forbindelser. Ved anvendelsen av de ovennevnte steroidsubstrater ved fermenteringen, dannes de frie steroidforbindelser. Disse steroider tilsettes generelt til fermenteringen i oppløsning eller i findelt form. En fortrinsvis anvendt fremgangsmåte er å oppløse steroidet i ethanol eller et annet vann-blandbart oppløsningsmiddel, og tilsette det til fermenteringsmediet på et øn-sket trinn i fremgangsmåten. Skjønt steroidet kan utfelles fra oppløsningen når det tilsettes på denne måten, dispergeres det i mediet som en fin suspensjon og blir lett tilgjengelig for organismen for å bevirke oxydasjon. Mengden av steroid som tilsettes til dyrkningen kan variere ganske betrak-telig, men er generelt av størrelsesordenen 1/10 til 1 gram pr. liter av mediet.

Under dyrkningsprosessen kan det være ønskelig å tilsette anti-skumnings-midler, som f. eks. siliconer, glyceridolj er og lignende. Disse forbindelser tilsettes fra tid til annen og i de krevete mengder.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inkuberes vanligvis 10 ml's charger av podet medium i 100 ml's rysterør i en periode av ca. 16 til 40 timer ved en temperatur av ca. 32° C. Ved dette tidspunkt tilsettes 2 mg sterilt substrat (4-pregnenforbindelse) oppløst i 0,2 ml ethanol til hvert rør, og dyrkingen eller fermenteringen fortset-tes ved ca. 32° C. Dyrkingen får anledning til å fortsette i en periode som er tilstrekke-lig til å oppnå en maksimal omdannelse av 4-pregnen til 1,4-pregnadien. Denne tids-periode kan variere fra 1 til 72 timer eller lenger.

Ved avslutningen av dyrkingsprosessen utvinnes det ønskede 1,4-pregnadien ved hjelp av den følgende fremgangsmåte, som beskriver som eksempel en 10 ml fermentering. Dette er en generell fremgangsmåte, og kan utføres for dyrkinger av forskjellig størrelse.

Innholdet i dyrkingsrøret ekstraheres fire ganger med 4 volum methylenklorid. De fire ekstrakter forenes og den resulterende oppløsning vaskes derpå én gang med 2 pst.s vandig natriumbicarbonat mettet med natriumklorid, og vaskes derpå to ganger med mettet natriumkloridoppløsning. Den vaskete methylenkloridoppløsning kan tørkes over vannfritt magnesiumsulfat og filtreres. Filtratet konsentreres på dampbad ved atmosfærisk trykk til et lite volum og konsentratet overføres til en 10 ml's målekolbe og fylles med methylenklorid. Denne oppløsning anvendes for bestem-melse av steroidinnholdet, som beskrevet i det følgende.

Ved dyrkingsprosesser i stor målestokk kan det rå produkt eller produktene utvinnes fra dyrkingsmaterialet ved hjelp av en enkel ekstraksjon med et oppløsningsmid-del, idet det anvendes et egnet oppløsnings-middel, som ikke er blandbart med vann, som f. eks. klorerte lavere hydrocarboner, alkoholer, estere, ketoner osv. Ytterligere rensning og utskillelse av steroidprodukter fra ekstraktene kan utføres ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagfolk på området. Utvinningen og rensningen av steroidblandingen krever ofte anvendelse av kromatografi.

Den fremgangsmåte som anvendes for å identifisere de steroider som er til stede i det ekstraherte dyrkingsmateriale, som foran nevnt, er papirstrimmelkromatogra-fien. Oppløsningsmiddelsystemet som anvendes, er vann-methanol-benzen frem-stillet ved rystning av ca. 50 pst. vann — 50 pst. metnanol med benzen i en skille-trakt, hvorpå man lar de to lag skille seg fra hverandre. En del av det nedre lag an-bringes i en åpen skål på bunnen av en stor glass-sylinder. Det øvre lag er oppløsnings-fasen og anvendes til å fylle den traufor-mete del inne i sylinderen. Det fremstilles en standard steroid-oppløsning ved å opp-løse 10 mg av hver av de følgende steroider i 10 ml methylenklorid: 4-pregnen-lip,17a,21-triol-3,20-dion, 4-pregnen-ll|3,21-diol-3,20-dion, 4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion, 4-pregnen-lla,17a,21-triol-3,20-dion, 4-pregnen-ll|3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion, 4-pregnen-lip,16a,17ni,21-tetraol-3,20- dion-16,21-diacetat,

4-pregnen-9a-fluor-ll|3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion,

4-pregnen-9a-fluor-ll(5,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion-16,21-diacetat.

(Andre steroider kan anvendes i standard-oppløsningen når dette er ønskelig.)

I det minste en standard steroid-opp-løsning kromatograferes samtidig hver • gang man undersøker en ukjent oppløs-ning. Nøyaktig 0,025 ml av standard-ster-oidprøveoppløsningen påføres papirstrim-len ved startlinjen, 10 cm fra den øvre ende av strimlen, som foldes over kanten av trauet og neddykkes i oppløsningsmiddel-fasen i dette. Strimlen fremkalles derpå i 2—4 timer ved ca. 37° C. På lignende måte påføres 0,1 ml av den ukjente oppløsning på en annen strimmel, som derpå foldes inn i det samme trau og fremkalles samtidig med standard steroidstrimlen. Trauet muliggjør at det kan fremkalles mange strimler samtidig. Etter passende fremkal-ling av papirstrimlene, fjernes disse fra ap-paratet og tørkes med luft ved ca. 37° C. Etter tørkingen påsprøytes strimlene en alkalisk oppløsning av blått Tetrazolium, som fremkaller farve på de steder hvor det er til stede steroider. Farvefremkalte strim-t ler legges opp ved siden av i det minste en standard strimmel og det foretas en sam-menligning. De forskjellige steroider kan da identifiseres ved deres rekkefølge eller plasering på strimlene.

De ønskede, i 1- og 4-stilling umettede steroider er mer polare enn de tilsvarende i 4-stilling umettede steroider. Det skal vi-dere nevnes at når de ønskede i 1,4-stilling umettede steroidforbindelser er blitt iso-lert og bestemt, kan de selv anvendes i en standard-steroidoppløsning for å forbedre fremgangsmåten.

I de følgende eksempler er det i detalj beskrevet dehydrogeneringen av i 4-stilling umettede forbindelser av pregnenrekken under dannelse av de tilsvarende i 1- og 4-stilling umettede steroider av pregnadienrekken.

Eksempel 1.

l, 4- pregnadien- 9a- fluor- l lfi, l 6a, l 7a, 21 -

tetraol- 3, 20- dion.

En med gjærekstrakt tilberedt reagens-glass-skråkultur av Nocardia sp. (ATCC 12483) ble vasket med 7 ml steril saltopp-løsning, og den erholdte vegetativcellesus-pensjon ble anvendt for å inokulere 100 ml av en steril (som beskrevet ovenfor) Trypticase-sojabuljong i en 500 ml Erlenmeyerkolbe. Kolben ble inkubert i 7 timer ved 37° C. Dette inokulat ble derpå anvendt for å inokulere sterilt Trypticase-sojabuljongmedium i 100 ml's rysterør. 1 ml av inoku-latet ble anvendt for å inokulere hver 10 ml av et medium som inneholder melasse (Grandma's) 2 pst., kjøttekstrakt (Difco) 1 pst. og glucose 1 pst. i 100 ml rysterør. Rørene ble inkubert ved 32° C i 40 timer. Derpå ble det til hvert rør tilsatt 2 mg 4-pregnen-9a-fluor-lip,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion oppløst i 0,2 ml ethanol. Inkube-ringen ble derpå fortsatt i ytterligere 24 timer.

10 ml av dyrkingsproduktet fra et av de ovennevnte rør ble ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid hver gang. Ekstraktene ble forenet og inndampet til tørrhet under vakuum. Residuet ble opptatt i 2 ml aceton, og en passende prøve ble analysert ved hjelp av den foran be-skrevne papirstrimmelteknikk. Papirstrim-

melkromatogrammet viste tilstedeværelsen av l,4-pregnadien-9a-fluor-ll(3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 2.

l, 4- pregnadien- llfi, 16a, 17a, 21- tetraol-3, 20- dion.

En potetdekstrose-agarskråkultur av Nocardia gardneri (ATCC 9604) ble vasket med 5 ml av en steril saltoppløsning, og 1 ml's porsjoner av den resulterende vegetative cellesuspensjon ble anvendt for å inokulere 10 ml's porsjoner av det sterile medium nr. 13, regulert til pH7, i 100 ml's rysterør. Rørene ble rystet på en reciproserende rysteinnretning ved 32° C i 40 timer, og derpå ble der til hvert rør tilsatt 2 mg 4-pregnen-ll[3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion oppløst i 0,2 ml 70 pst.s vandig ethanol. Rørene ble høstet etter 6, 24 og 72 timers inkubering etter tilsetning av substrat.

Den dyrkede mesk ble ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid. Ekstraktene fra hver mesk ble forenet og konsentrert til et tørt residuum under redusert trykk. Hvert residuum ble opptatt i 2 ml pyridin, og 0,5 ml eddiksyreanhydrid ble tilsatt. Disse blandinger ble opphetet på et dampbad i 10—15 minutter, og derpå ble de konsentrert til tørre residuer under vakuum. Hvert residuum ble oppløst i 2 ml aceton, og passende volumer av de resulterende oppløsninger ble kromatografert. Kromatogrammene viste at substratet var blitt omdannet til l,4-pregnadien-ll|3,16a, 17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 3.

1, 4- pregnadien- ll [3,2 6a, l 7a, 21 - tetraol-3, 20- dion.

En potetdekstrose-agar-skråkultur av Nocardia leishmanii (ATCC 6855) ble vasket med 5 ml av en steril saltoppløsning, og 1 ml's porsjoner av den resulterende vegetative cellesuspensjon ble anvendt for å inokulere 10 ml's porsjoner av det sterile medium nr. 13, regulert til pH 7, i 100 ml rysterør. Rørene ble rystet på en resiprose-rende rysteinnretning ved 32° C i 40 timer, og på dette tidspunkt ble det til hvert rør tilsatt 2 mg av substratet, 4-pregnen-lip, 16a,17a,21-tetraol-3,20-dion, oppløst i 0,2 ml 70 pst.s vandig ethanol. Rørene ble høstet etter 6, 24 og 72 timers inkubering etter tilsetning av substrat.

De dyrkete meskprodukter tale hver ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid. Ekstraktene av hver mesk tale forenet og konsentrert til et tørt residuum under redusert trykk. Hvert residuum ble opptatt i 2 ml pyridin, og der ble tilsatt 0,5 ml eddiksyreanhydrid. Disse blandinger ble opphetet på et dampbad i 10—15 minutter, og derpå konsentrert til tørre residuer under vakuum. Hvert residuum ble oppløst i 2 ml aceton, og passende volumer av de resulterende oppløsninger ble kromatografert. Kromatogrammene viste at substratet var blitt omdannet til 1,4-pregnadien-lip, 16a,17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 4.

1, 4- pregnadien- 11^, 16a, l 7a, 21 - tetraol-3, 20- dion.

En potetdekstrose-agarskråkultur av Nocardia caviae (ATCC 6848) ble vasket med 5 ml av en steril saltoppløsning, og 1 ml's porsjoner av den resulterende vegetative cellesuspensjon ble anvendt for å inokulere 10 ml's porsjoner av det sterile medium nr. 13, regulert til pH 7, i 100 ml's rysterør. Rørene ble rystet på en reciproserende rysteinnretning ved 32° C i 40 timer, og derpå ble det til hvert rør tilsatt 2 mg av substrat, 4-pregnen-ll(3,16a,17a, 21-tetraol-3,20-dion, oppløst i 0,2 ml 70 pst.s vandig ethanol. Rørene ble høstet etter 6, 24 og 72 timers inkubering etter tilsetning av substrat.

Den dyrkete mesk ble ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid hver gang. Ekstraktene av hver mesk ble forenet og konsentrert til et tørt residuum under redusert trykk. Hvert residuum ble opptatt i 2 ml pyridin, og det ble tilsatt 0,5 ml eddiksyreanhydrid. Disse blandinger ble opphetet på et dampbad i 10—15 minutter, og derpå konsentrert til tørre residuer under vakuum. Hvert residuum ble oppløst i 2 ml aceton, og passende volumer av de resulterende oppløsninger ble kromatografert. Kromatogrammene viste at substratet var blitt omdannet til 1,4-pregnadien-lip,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 5.

1, 4- pregnadien- ll$, 16a, 17 a, 21- tetraol-3, 20- dion.

En potetdekstrose-agarskråkultur av Nocardia convoluta (ATCC 4275) ble vasket med 7 ml av en steril saltoppløsning og 1 ml av den resulterende vegetative cellesuspensjon ble anvendt for å inokulere 10 ml av det sterile medium nr. 13, regulert til pH 7, før autoklavatehandling (pH etter autoklavbehandling var 6,75) i et 100 ml's rysterør. Røret ble rystet på en reciproserende rysteinnretning i 16 timer ved 32° C. En ml's porsjoner av den resulterende vekst ble anvendt for å inokulere fem 10 ml's porsjoner av det sterile medium nr. 13 i 100 ml's rysterør. Disse rør ble inkubert på den reciproserende rysteinnretning i 16 timer ved 32° C, og deretter ble tilsatt 2 mg av substrat, 4-pregnen-lip, 16a,17a,21-tetraol-3,20-dion, oppløst i 0,2 ml 70 pst.s vandig ethanol, til hvert rør. Rørene ble høstet etter på hinannen føl-gende inkuberingsperioder av y2, 2, 7, 24 og 72 timer.

Den dyrkete mesk ble ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid hver gang. Ekstraktene av hver mesk ble forenet og konsentrert til et tørt residuum under redusert trykk. Hvert residuum ble opptatt i 2 ml pyridin, og der ble tilsatt 0,5 ml eddiksyreanhydrid. Disse blandinger ble opphetet på et dampbad i 10—15 minutter og derpå konsentrert til tørre residuer under vakuum. Hvert residuum ble oppløst i 2 ml aceton, og passende volumer av de resulterende oppløsninger ble kromatografert. Kromatogrammene viste at substratet var blitt omdannet til 1,4-pregnadien-lip,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 6.

l, 4- pregnadien- llfi, l 6a, l 7a, 21- tetraol-3, 20- dion.

En gjæreekstrakt-agar-skråkultur av Nocardia corallina (ATCC 999) ble vasket med 7 ml av en steril saltoppløsning. Den resulterende suspensjon ble tilsatt til 100 ml av et Trypticase-sojabuljongmedium uten glycerol i en 500 ml Erlenmeyerkolbe. Blandingen ble inkubert under rystning ved 37° C i 8 timer. 1 ml av dette inokulat ble anvendt for å inokulere hver av 15 Erlenmeyerkolber, idet hver kolbe inneholdt 100 ml av det sterile medium nr. 13. Kolbene ble inkubert under rystning ved 32° C i 40 timer. 20 mg 4-pregnen-ll[3,16a, 17a,21-tetraol-3,20-dion oppløst i 2 ml ethanol ble tilsatt hver flaske. Kolbene ble derpå inkubert under rystning ved 32° C i 8<1>/2 time. Innholdene av kolbene ble forenet og man fikk en mesk med pH 7,3. Det forente produkt etter høstning ble ekstrahert på vanlig måte, og man fikk 352 mg rå krystaller. Krystallisering fra aceton-petrol-ether ga 145 mg, smeltepunkt 216— 218°C. Rekrystallisering fra aceton-petrolether økte smeltepunktet til 229—231° C. Det infrarøde spektrum var identisk med spektret av en autentisk prøve av 1,4-pregnadien-ll(3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 7.

l, 4- pregnadien- llfi, 16a, 17a, 21- tetraol-3, 20- dion.

En potetdekstrose-agar-skråkultur av Nocardia globerula (ATCC 9356) ble vasket med 5 ml av en steril saltoppløsning, og 1 ml porsjoner av den resulterende vegetative cellesuspensjon ble anvendt for å inokulere 10 ml's porsjoner av det sterile medium nr. 13, regulert til pH 7, i 100 ml rysterør. Rørene ble rystet på en reciproserende rysteinnretning ved 32° C i 40 timer, på hvilket tidspunkt det ble tilsatt 2 mg substrat, 4-pregnen-ll|3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion. Rørene ble høstet etter 6, 24 og 72 timers inkubering etter tilsetning av substrat.

Den fermenterte mesk ble ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid hver gang. Ekstraktene av hver mesk ble forenet og konsentrert til et tørt residuum under redusert trykk. Hvert residuum ble opptatt i 2 ml pyridin og det ble tilsatt 0,5 ml eddiksyreanhydrid. Disse blandinger ble opphetet på dampbad i 10—15 minutter og derpå konsentrert til tørre residuer under vakuum. Hvert residuum ble oppløst i 2 ml aceton og passende volumer av de resulterende oppløsninger ble kroma-tografért. Kromatogrammene viste at substratet var blitt omdannet til 1,4-pregnadien-ll(3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 8.

1, 4- pregnadien- ll (3,2 6a, l 7a, 21 - tetraol-3, 20- dion.

En gjærekstrakt-agarskråkultur av Nocardia corallina (ATCC 999) ble vasket med 7 ml av en steril saltoppløsning, og den resulterende suspensjon ble anvendt for å inokulere 100 ml av det sterile medium nr. 13 i en 500 ml Erlenmeyerkolbe. Blandingen ble inkubert under rystning i 7y2 time ved 37° C. 1 ml's porsjoner av denne kultur ble anvendt for å inokulere 10 ml's porsjoner av det sterile medium i

100 ml's rør. Rørene ble inkubert ved 32° C i 40 timer, og derpå ble 2 mg 4-pregnen-llfi,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion, oppløst i 0,2 ml ethanol, tilsatt til hvert rør. Rørene ble derpå inkubert i 24 timer. Innholdet av et rør (10 ml) ble ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid hver gang. Ekstraktene ble forenet og konsentrert til et tørt residuum under redusert trykk. Residuet ble opptatt i 2 ml pyridin, og 0,5 ml eddiksyreanhydrid ble tilsatt. Blandingen ble opphetet på dampbad, i 10—15 minutter og derpå konsentrert til et tørt residuum under vakuum. Residuet ble oppløst i 2 ml aceton, og et passende volum av den resulterende oppløsning ble kromatografert. Kromatogrammet viste at substratet var blitt omdannet til l,4-pregnadien-ll|3,16a, 17d,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 9.

l, 4- pregnadien- ll$, 16a, 17a, 21- tetraol-3, 20- dion.

Et dyrkingsforsøk som beskrevet i eksempel 6 ble utført under anvendelse av Nocardia sp. (ATCC 12 483) istedenfor Nocardia corallina. Produktet, når det ble prøvet på et papirstrimmelkromatogram, ga l,4-pregnadien-lip,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion, som var identisk med produktet i henhold til eksempel 6.

Eksempel 10.

1, 4- pregnadien- l 1 (3,2 6a, l 7a, 21 - tetraol-3, 20- dion.

En potetdekstrose-agar-skråkultur av Nocardia polychromogenes (ATCC 3409) ble vasket med 5 ml av en steril saltopp-løsning, og 1 ml's porsjoner av den resulterende vegetative cellesuspensjon ble anvendt for å inokulere 10 ml's porsjoner av det sterile medium nr. 13, regulert til pH 7, i 100 ml's rysterør. Rørene ble rystet på en reciproserende rysteinnretning ved 32° C i 40 timer, på hvilket tidspunkt 2 mg av substrat, 4-pregnen-ll|3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion, oppløst i 0,2 ml 70 pst.s vandig ethanol, ble tilsatt til hvert rør. Rørene ble høstet etter 6, 24 og 72 timers inkubering etter tilsetning av substratet.

Den dyrkete mesk ble ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid hver gang. Ekstraktene av hver mesk ble forenet og konsentrert til et tørt residuum under redusert trykk. Hvert residuum ble optatt i 2 ml pyridin, og 0,5 ml eddiksyreanhydrid ble tilsatt. Disse blandinger ble opphetet på et dampbad i 10—15 minutter og derpå konsentrert til tørre residuer under vakuum. Hvert residuum ble oppløst i 2 ml aceton, og passende volumer av de resulterende oppløsninger ble kromatografert. Kromatogrammene viste at substratet var blitt omdannet til l,4-pregnadien-ll|3,16a, 17a,21 -tetraol-3,20 -dion.

Eksempel 11.

1, 4- pregnadien- 9a- fluor- llfi, l 6a, l 7a, 21 -

tetraol- 3, 20- dion.

En gjærekstrakt-agar-skråkultur av Nocardia corallina (ATCC 999) ble vasket med 7 ml av den sterile saltoppløsning, og den resulterende suspensjon ble vasket for å inokulere 100 ml av medium nr. 13 i en 500 ml Erlenmeyerkolbe. Blandingen ble inkubert under rystning ved 37° C i iy2 time. 1 ml's porsjoner av denne kultur ble derpå anvendt for å inokulere 10 ml's porsjoner av det sterile medium nr. 13 i 100 ml's dyrkningsrør. De inokulerte rør ble inkubert i 40 timer ved 32° C. Derpå ble tilsatt til hvert rør 2 mg 4-pregnen-9a-fluor-ll|3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion, oppløst i 0,2 ml ethanol. Rørene ble inkubert i 72 timer. Deretter ble innholdet av et rør ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid hver gang. Ekstraktene ble forenet og konsentrert til et tørt residuum under vakuum. Residuet ble opptatt i 2 ml pyridin, og der ble tilsatt 0,5 ml eddiksyreanhydrid. Denne blanding ble opphetet på et dampbad i 10—15 minutter og derpå konsentrert til et tørt residuum under vakuum. Residuet ble opløst i 2 ml aceton, og et passende volum av den resulterende oppløs-ning ble kromatografert. Kromatogrammet viste vesentlige mengder 1,4-pregnadien-9a-fluor-ll(3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion-16,21-diacetat. Således viste det seg at 1,4-pregnadien-9a-fluor-ll(3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion var blitt dannet i betydelige mengder under dyrkingen.

Eksempel 12.

1, 4- pregnadien- 9a- fluor- l 1 (3,2 6a, l 7a, 21 -

tetraol- 3, 20- dion- 16, 21 - diacetat.

7 ml av en steril saltoppløsning ble anvendt for å vaske en gjærekstrakt-agar-skråkultur av Nocardia corallina (ATCC 999), og den resulterende suspensjon ble

anvendt for å inokulere 100 ml av det sterile medium nr. 13 i en 500 ml Erlenmeyerkolbe. Blandingen ble inkubert i 8 timer ved 37° C, og 1 ml's porsjoner av denne vekst ble anvendt for å inokulere 100 ml's porsjoner av det sterile medium i 32 500 ml's kolber. Disse kolber ble inkubert ved 32° C i 40 timer, og derpå ble 25 mg 4-pregnen-9a-fluor-ll(3,16«,17a,21-tetraol-3,20-dion-16,21-diacetat oppløst i 2,5 ml aceton, tilsatt til hver kolbe. Kolbene ble inkubert i 53 timer. Innholdet av flaskene ble forenet og et like volum av aceton ble tilsatt. Oppløsningen ble filtrert gjennom diatomé jord og acetonet ble avdampet under redusert trykk. Den vandige fase ble mettet med salt og ekstrahert fem ganger med 500 ml n-butanol. Butanolekstrakten ble inndampet under redusert trykk til tørrhet. Residuet ble oppslemmet med om-trentlig 1 liter kokende aceton for å fjerne det organiske residuum fra de anorganiske salter og derpå filtrert gjennom diatoméjord. Acetonet ble inndampet og residuet ble oppløst i pyridin og acetylert med eddiksyreanhydrid (romtemperatur over natten). Methanol ble tilsatt og oppløsningen ble inndampet under redusert trykk til tørr-het (vekt 1,17 g). Ved fordelingskromato-grafi under anvendelse av oppløsningsmid-delsystemet: 3 deler eddiksyreethylester, 2 deler petrolether (kokeområde 90 til 100° C), 3 deler methanol og 2 deler vann, ble oppnådd 0,50 g av det ønskede råprodukt, l,4-pregnadien-9a-fluor-ll(3,16a,17a,21-tetraol-16,21-diacetat. Krystallisering av residuet fra aceton-petrolether ga 341 mg substans, smeltepunkt 153—233° C under forutgående fuktning. Det vide smelte-punktområde er sannsynligvis et resultat av solvatisering.

Eksempel 13.

1, 4- pregnadien- llfi, l 6a, l 7a, 21 - tetraol-3, 20- dion.

En potetdekstrose-agar-skråkultur av Nocardia asteroides (ATCC 3308) ble vasket med 5 ml av en steril saltoppløsning, og 1 ml's porsjoner av den resulterende vegetative cellesuspensjon ble anvendt for å inokulere 10 ml's porsjoner av det sterile medium nr. 13, regulert til pH 7, i 100 ml rysterør. Rørene ble rystet på en reciproserende rysteinnretning ved 32° C i 40 timer, og derpå ble det til hvert rør tilsatt 2 mg av substratet, 4-pregnen-ll(3,16a,17a,

21-tetraol-3,20-dion oppløst i 0,2 ml 70 pst.s vandig ethanol. Rørene ble høstet etter 6, 24 og 72 timers inkubering etter tilsetning av substrat.

Den dyrkete mesk ble ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid hver gang. Ekstraktene av hver mesk ble forenet og konsentrert til et tørt residuum under redusert trykk. Hvert residuum ble optatt i 2 ml pyridin, og 0,5 ml eddiksyreanhydrid ble tilsatt. Disse blandinger ble opphetet på et dampbad i 10—15 minutter og derpå konsentrert til tørre residuer under våkum. Hvert residuum ble oppløst i 2 ml aceton, og passende volum av de resulterende oppløsninger ble kromatografert. Kromatogrammene viste at substratet var blitt omdannet til l,4-pregnadien-ll|3, 16a,17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 14.

l, 4- pregnadien- llfi, 16a, 17a, 21- tetraol-3, 20- dion.

En potetdekstrose-agar-skråkultur av Nocardia cuniculi (ATCC 6864) ble vasket med 7 ml av en steril saltoppløsning, og 1 ml av den resulterende vegetative cellesuspensjon ble anvendt for å inokulere 10 ml av det sterile medium nr. 13, regulert til pH 7, for autoklavbehandling (pH etter autoklavbehandling var 6,75) i et 100 ml rysterør. Røret ble rystet på en reciproserende rysteinnretning i 16 timer ved 32° C. 1 ml's porsjoner av den resulterende vekst ble anvendt for å inokulere fem 10 ml's porsjoner av det sterile medium nr. 13 i 100 ml's rysterør. Disse rør ble inkubert på den reciproserende rysteinnretning i 16 timer ved 32° C, og derpå ble tilsatt til hvert rør 2 mg av substrat, 4-pregnen-ll(3,16a,17a,21-tetraol-3,2-dion, oppløst i 0,2 ml 70 pst.s vandig ethanol. Rørene ble høstet etter på-følgende inkuberingsperioder av y2, 2, 7, 24 og 72 timer.

Den dyrkete mesk ble ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid hver gang. Ekstraktene av hver mesk ble forenet og konsentrert til et tørt residuum under redusert trykk. Hvert residuum ble opptatt i 2 ml pyridin, og det ble tilsatt 0,5 ml eddiksyreanhydrid. Disse blandinger ble opphetet på et dampbad i 10—15 minutter og derpå konsentrert til tørre residuer under vakuum. Hvert residuum ble oppløst i 2 ml aceton, og passende volum av de resulterende oppløsninger ble kromatografert. Kromatogrammene viste at substratet var blitt omdannet til 1,4-pregnadien-11 (3,16a, 17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 15.

l, 4- pregnadien- llfi, l 6a, l 7a, 21 - tetraol-3, 20- dion.

En potetdekstrose-agar-skråkultur av Nocardia sylvodifera (ATCC 4919) ble vasket med 5 ml av en steril saltoppløsning, og 1 ml's porsjoner av den resulterende vegetative cellesuspensjon ble anvendt for å inokulere 10 ml's porsjoner av det sterile medium nr. 13, regulert til pH 7, i 100 ml's rysterør. Rørene ble rystet på en reciproserende rysteinnretning ved 32° C i 40 timer, og derpå ble tilsatt til hvert rør 2 mg av substrat, 4-pregnen-ll|3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion, oppløst i 0,2 ml 70 pst.s vandig ethanol. Rørene ble høstet etter 6, 24 og 72 timers inkubering etter tilsetning av substrat.

Den dyrkete mesk ble ekstrahert fire ganger med 40 ml methylenklorid hver gang. Ekstraktene av hver mesk ble forenet og konsentrert til et tørt residuum under redusert trykk. Hvert residuum ble opptatt i 2 ml pyridin, og 0,5 ml eddiksyreanhydrid ble tilsatt. Disse blandinger ble opphetet

på et dampbad i 10—15 minutter, og derpå

konsentrert til tørre residuer under vakuum. Hvert residuum ble oppløst i 2 ml aceton, og passende volumer av de resulterende oppløsninger ble kromatografert. Kromatogrammene viste at substratet var blitt omdannet til l,4-pregnadien-ll|3,16a, 17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 16.

l, 4- pregnadien- llfi, l 6a, l 7a, 21 - tetraol-3, 20- dion.

En gjærekstrakt-agar-skråkultur av Nocardia corallina (ATCC 999) ble vasket med en steril saltoppløsning. Den resulterende vegetative cellesuspensjon ble inn-ført i en 500 ml Erlenmeyerkolbe som inneholdt 100 ml av det sterile medium nr. 13. Denne kolbe ble anbrakt på en reciproserende rysteinretning ved 37° C i 7y2 time. 1 ml av den resulterende vekst ble inokulert i fem 100 ml's rysterør, inneholdende 10 ml av det sterile medium nr. 13. Rørene ble inkubert på en reciproserende rysteinnretning ved 32° C i 40 timer, og derpå ble 2 mg 4-pregnen-ll|3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion-16,21-diacetat oppløst i 0,2 ml ethanol tilsatt til hvert rør. Rørene ble høstet etter 2, 7y2, 24, 48 og 72 timer. Papirstrim-melforsøk på den ekstraherte dyrknings-væske viste at en vesentlig mengde av ut-gangsmaterialet var blitt omdannet til 1,4-pregnadien-ll|3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 17.

1, 4- pregnadien- ll p,2 6a, l 7a, 21 - tetraol-3, 20- dion.

En Trypticase-sojaagar-skråkultur ble vasket med 5 ml sterilt vann, og den resulterende cellesuspensjon av Corynebacterium simplex ble anvendt for å inokulere 100 ml sterilt Trypticase-soja-bulj ongmedium i en 500 ml Erlenmeyerkolbe. Denne blandingen ble inkubert under rystning ved 37° C i 8 timer. Fem og tyve 500 ml Erlenmeyerkolber, hver inneholdende 100 ml av det sterile Trypticase-sojabulj ongmedium uten glycerol, ble hver inokulert med 1 ml av det 8 timer gamle inokulat. Disse kolber ble inkubert ved 32° C i 40 timer. Derpå ble tilsatt til hver kolbe 40 mg 4-pregnen-ll(3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion oppløst i 4 ml ethanol, og dyrkingen ble fortsatt i 8 timer ved 32° C. Innholdet av alle 25 kolber ble forenet, og man fikk en mesk av pH 8,1.

Den forente mesk ble ekstrahert én gang med 3 liter methylenklorid og tre ganger med 2-liters porsjoner av methylenklorid. Den forente ekstrakt ble vasket én gang med mettet saltoppløsning og inndampet til tørrhet under redusert trykk. Dette ga 509 mg av et oljeaktig residuum, som ble oppløst i 1,5 ml av den stasjonære fase fra systemet, 3 deler ethylacetat, 2 deler petrolether (90—100° C), 3 deler methanol og 2 deler vann, og blandet med 3 g diatoméjord. Denne impregnerte diatoméjord ble derpå innført på toppen av en 1,5 x 35 cm glasskolonne som inneholdt 25 g diatoméjord, impregnert med 12,5 ml av den stasjonære fase fra det ovennevnte system. Den ønskede forbindelse ble derpå eluert med den mobile fase fra det ovennevnte system, så at man fikk 207 mg av et fast råprodukt. Dette ble krystallisert fra aceton-petrolether (60—70° C), så at man fikk 56 mg, smeltepunkt 195—200° C (Kofler blokk). Omkrystallisering fra det samme oppløsningsmiddelpar økte smeltepunktet til 202—205° C (blokk); smeltepunkt 229— 231° C (kapillarmetode). Ultrafiolett spektrum: 1maks<1>= 241 m|A (e = 14500)-

De fysikalske og kjemiske egenskaper av forbindelsen tilsvarte egenskapene for 1,4-pregnadien-ll(3,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion.

Eksempel 18.

1, 4- pregnadien- ll p,2 6a, l 7a, 21 - tetraol-3, 20- dion.

Den forente væske fra en dyrkning som beskrevet i eksempel 17 ble ekstrahert med syv 2-liter porsjoner methylenklorid, og de forente ekstrakter inndampet til tørrhet under redusert trykk. Dette ga 1,585 g av en rå halv-fast substans, som ble kromatografert. Fraksjonene som inneholdt den ønskede forbindelse, ble forenet og inndampet til tørrhet så at man fikk 601 mg krystallinsk residuum. Krystallisering fra aceton-petrolether ga 278 mg, smeltepunkt 229—231° C. Omkrystallisering fra det samme opløsningsmiddelpar hevet smeltepunktet til 231—232° C.

Analyse: C21<H>28<O>0 (376,44)

Beregnet: ..... 67,00 % C, 7,50 % H Funnet: ...... 66,82 % C, 7,27 % H.

Produktet var identisk med en prøve av l,4-pregnadien-lip,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion erholdt i henhold til eksempel 17.

Eksempel 19.

1, 4- pregnadien- l lfi, 16a, l 7a, 21 - tetraol-3, 20- dion- l 6, 21 - diacetat.

En blanding av 100 mg 1,4-pregnadien-lip,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion i 10 ml pyridin inneholdende 2 ml eddiksyreanhydrid lot man henstå natten over ved romtemperatur, hvorpå oppløsningen ble inndampet til tørrhet under redusert trykk. Det faste residuum ble krystallisert fra ethyl-åcetatpetroleumether (90—100° C), og man fikk 105 mg (86 pst.) 1,4-pregnadien-lip, 16a,17a,21-tetraol-3,20-dion-16,21-diacetat, smeltepunkt 147—150° C. Omkrystallisering fra det samme oppløsningsmiddelpar økte smeltepunktet til 161—163° C.

Eksempel 20.

l, 4- pregnadien- 9a- fluor- llfi, 16a, 17a, 21-tetraol- 16, 21- diacetat.

En agar-skråkultur ble vasket med 5

ml av en steril saltoppløsning, og den resulterende sporesuspensjon av Corynebacterium simplex ble tilsatt til 100 ml av det sterile Trypticase-sojabuljongmediet i en 500 ml Erlenmeyerkolbe. Blandingen ble inkubert ved 32° C i 8 timer. 1 ml av denne kultur ble anvendt for å inokulere hver av lO kolber, og hver kolbe inneholdt 100 ml av det sterile Trypticase-sojabuljongmediet.

De ti kolbene ble inkubert under rystning

ved 32° C i 16' timer. 20 mg 4-pregnen-9a-fluor-lip,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion-16,21-diacetat oppløst i 2 ml ethanol ble tilsatt til hver kolbe, og kolbeinnholdene ble forenet. Den forenete oppløsning ble ekstrahert flere ganger med et stort volum methylenklorid, vasket med mettet salt-oppløsning og inndampet under redusert trykk. Residuet ble oppløst i methanol, be-handlet med' aktivt kull, filtrert gjennom diatoméjord og påny inndampet så at man fikk 277 mg av en olje og acetylert natten over. Papirstrimmelkromatografi viste om-trentlig like mengder av substrat og et mer polert produkt (l,4-pregnadien-9a-fluor-ll|3,16cc,17a,21-tetraol-3,20-dion-16,21-di-

acetat) sammen med meget små mengder av to mindre polare produkter. Fordelings-kromatografi av 0,25 g av residuet (diato-méjordkolonne; system: 2 deler ethylace-

tat, 3 deler petrolether (90—100° C), 3 de-

ler methanol og 2 deler vann) atskilte de mindre polare produkter og substratet. Det ønskede mest polare produkt forble på kolonnen og ble eluert med 500 ml methanol. Residuet (90 mg) fra den inndam-

pete methanol ble påny fordelt på diatomé-

jord'. (system: 3 deler ethylacetat, 2 deler petrolether (90^-100° C), 3 deler methanol'

og 2 deler vann), og den delen som inne-

holdt, det ønskede produkt (bestemt ved ultrafiolett absorpsj.onsspektrum)- ble inndampet under redusert trykk og man fikk 18 mg av et fast stoff. Krystallisering. fra

aceton-petrolether ga 13 mg fargeløse nå-

ler av l,4-pregnadien-9a-fluor-lip,16a,17a, 21-tetraol-3,20-dion-16,21rdiacetat, smeltepunkt (Kofler blokk) ca. 150—240° C med betydelig, tap av oppløsningsmiddel ved 150° C. Omkrystallisering fra aceton-petrolether endret ikke smeltepunktet.

2,4-bis-dinitrof enylhydrazonet av den ovennevnte forbindelse ble fremstilt og dets ultrafiolette absorpsj onsspektrum bestemt:

CHCL

maks = 258>300 (infleksjon), 312 (inflek-

sjon.). og 400 •m(x.

Eksempel 21.

1, 4- pregnadien- 9a- fluor- l 1$, 16a, 17a, 21-tetraol- 3, 20- dion.

En oppløsning av 100 mg 1,4-pregnadien-9a-fluor-lip,16a,17a,21-tetraol-3,20-dion-16,21-diacetat ble oppløst i 10 ml methanol og avkjølt til 0° C. Etter spyling-med nitrogen- ble det tilsatt eni oppløsning av 35 mg' kaliumhydroxyd i 2 ml- methanol til

den steroide oppløsning. Etter henstand'

ved romtemperatur i 1 time ble- oppløsnin-

gen nøytralisert, iseddiksyren inndampet under nitrogenatmosfære til et hvitt fåst stoff. Vann ble tilsatt, og etter avkjøling ble- produktet filtrert og vasket med' vann så at man fikk 52 mg l,4-pregnadien-9a-fluor-np,16a-,l'7a,21-tetraol-3!,20-dion- av smeltepunkt 246—249° C: Tre omkrystallr-seringer fra acetonpetroleumether ga129 mg tetrol, smeltepunkt 260—262,5 <0> C.

Analyse: C21H|7O0F

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av steroider av 1,4-pregnadienrekken med føl-gende generelle formel:

hvor X er hydrogen eller halogen, Y er methylen, hydroksy-methylen eller kar-bonyl, Z er hydroksymethylen eller lavere alkanoyloksymethylen, R' er hydrogen eller hydroksyl, og R er hydrogen eller lavere alkanoyl, karakterisert ved at en tilsvarende 4-pregnen-forbindelse av den generelle formel: hvor X, Y, Z, R og R' har samme betydning som ovenfor, på kjent måte utsettes for den fermentative, enzymatiske innvirkning av artene av slekten Nocardia eller arten Corynebacterium simplex, hvoretter det resulterende steroid om ønskes kan hydrolyseres eller forestres ved hjelp av kjente fremgangsmåter.

2. Fremgangsmåte som angitt i påstand 1, karakterisert ved at man som organisme av slekten Nocardia anvender en av følgende arter: corallina, asteroides, keratolyticus, transvalensis, erthropolis, convoluta, gardneri, leishmanii, opaca, blackwelii, caviae, cuniculi, globerula, polychromogenes, sylvodifera eller farcinica.