NO115207B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av insulinkrystaller av i hovedsaken ens størrelse.

Det er kjent at injiserfaare insulinpre-parater, hvis protraherte virkning uteluk-kende eller i hovedsaken beror på tilstede-værelsen av insulinkrystaller i vandig .suspensjon. Det er også kjent at det er av betydning for en regelmessig og pålitelig klinisk virkning av sådanne preparater, at de suspenderte insulinkrystaller er av ho-vedsakelig ens størrelse.

Den foreliggende oppfinnelse tar sik-te på en fremgangsmåte til fremstilling av insulinkrystaller av i hovedsaken ens stør-relse under selve krystallisasjonen, således at særlige foranstaltninger til tilveiebrin-gelse av en ensartet størrelse av krystalle-ne etter krystallisasjonen blir unødvendig-Ved krystalisasjon av insulin gås det som kjent i hovedetrekkene frem på den måte at et insulinholdig vandig medium, som også inneholder et krystallisasjonsfremmende metall, fortrinsvis sink, i en tilstrekkelig mengde, innstilles på en pH-verdi mellom 5 og 7. Til fastleggelse av pH-verdien anvendes det vanligvis tilsetning av et pufferstoff, og til fremskyndelse av krystalldannelsen har det vært foreslått å sette noen få insulinkrystaller til krystallisasjonsmediet.

De kjente krystallisasjonsmetoder re-sulterer imidlertid i krystaller av meget forskjellig størrelse, idet det ikke er truf-fe noen som helst foranstaltninger til oppnåelse av krystaller av ensartet størrelse. Sådanne foranstaltninger ville 'heller ikke hatt noe formål, idet de fremstilte insulinkrystaller som sådanne ikke var bestemt til å utgjøre en bestanddel av kiniske in-sulinpreparater.

Det har nå ifølge oppfinnelsen vist seg at man ved krystallisasjonen kan komme til krystaller av i hovedsaken ens størrelse, når det anvendes podekrystaller av i hovedsaken ens størrelse i en mengde svarende til ligningen

hvor P er mengden i gram av de benyttede podekrystaller, I mengden i gram av det krystalliserbare insulin i mediet, dp stør-relsen 1 u av podekrystallene og d; den størrelse i i hvilken hovedmengden av insulinet ønskes utkrystallisert.

Ved størrelsen av en insulinkrystall skal forstås lengden i u av krystallens lengste diagonal.

Selv om det er kjent ved krystallisasjon av andre stoffer, som sukker og visse uorganiske salter, til regulering av de frem-komne krystallers størrelse å tilsette podekrystaller av i hovedsaken samme stør-relse, kunne det ikke forutsees at den oven-for anførte ligning ville gjelde i forbindelse med et proteinstoff av en så komplisert sammensetning som insulin.

Hvis det ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for eksempel ønskes at insu-linkrystallene skal ha en størrelse på ca.

30 /(, og der foreligger 100 g insulin til krystallisasjon, skal podekrystallene anvendes i en mengde av ca. 30 mg, hvis podekrystallene har en størrelse på ca. 2 «, og i en mengde av ca. 240 mig, såfremt podekrystallene ihar en størrelse av ca. 4 //.

Ved den praktiske gjennomførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det naturligvis ikke mulig å oppnå at alle in-sulinkrystallene får nøyaktig samme stør-relse, idet hver krystall ikke vokser med samme hastighet. Noen krystaller blir noe større og andre noe mindre enn den ønskede størrelse. Avvikelsene fra den ønskede ens størrelse avhenger av tilbøyeligheten til dannelse av krystaller ved spontan krystallisasjon .

Til undertrykkelse av spontan krystallisasjon kan man ifølge oppfinnelsen enten anvende insulin stammende fra svinepankreaskjertler eller gjennomføre krystallisa-sj onen i nærvær av -halogen i ionogen form i en konsentrasjon over 0,2 mol pr. liter. Halogenionekonsentrasjonen oppnås hensiktsmessig ved tilsetning av en tilstrekkelig mengde av et halogensalt av et alkali-metall, ammoniakk eller et av de alkaliske jordarters metaller eller en blanding av sådanne salter. Til oppnåelse av maksimale krystallutbytter er det hensiktsmessig ikke å benytte høyere ihalogenionekonsentra-sjoner enn omkring 1 mol. pr. liter. Det skal bemerkes at patent nr. 85.075 om-handler en fremgangsmåte til fremstilling av krystallinsk insulin, ved hvilken insulinet 'bringes til å krystallisere fra et vandig medium som inneholder 'halogenider, ved forskyvning av mediets pH-verdi til i nær-heten av insulinets iso-elektriske punkt, og at det karakteristiske ved fremgangsmåten består i at det vandige krystallisasjons-medium inneholder halogen i ionogen form i en konsentrasjon over 0,2 mol pr. liter. Formålet med halogenionetilsetnin-gen ifølge dette patent er imidlertid å fremstille insulinkrystaller i form av skarpkantede rhomboedere med plane kry-stallflater.

Ut fra et terapeutisk og farmasøytisk synspunkt er det ifølge oppfinnelsen hensiktsmessig at podekrystallene og det insulin som skal krystalliseres, anvendes i en slik mengde at hovedmengden av insulinet utkrystalliserer i form av krystaller av i hovedsaken ens størrelse innenfor området 15—40 //. Ved undertrykkelse av spontan krystalisasjon er det ifølge oppfinnelsen f. eks. mulig å få 90 vekt-pst. av de dannede insulinkrystaller i en størrelse på 28—36

Ved den praktiske utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan det insulinholdige vandige krystallisasjonsme-dium fremstilles på i og for seg kjent må-te. Det alminneligste er, at man fremstiller en sur vandig insulinoppløsning med det fornødne innhold av ett eller flere krystal-lisasjonsf remmende metaller (sink, kobolt, nikkel, kadmium, kopper, mangan og jern, blant hvilke det nesten alltid gjøres bruk av sink) og eventuell ønskede pufferstof-fer, og innstiller på den for krystalisasjonen

nødvendige pH-verdi, men man kan også felle insulinet amorft i vandig medium

uten tilstrekkelig metallinnhold og derpå overføre insulinet til krystallinsk form ved senere tilførsel av den nødvendige metall-mengde, f. eks. i form av en vandig oppløs-ning av et metallsalt. Endelig kan man og-så nærme seg krystallisasjons-pH fra den basiske side ved benyttelse av ibasitske in-sulinoppløsninger.

Podekrystallene tilføres enten i form av en vandig suspensjon, f. eks. suspendert i det vandige medium, i hvilket podekrystallene er fremstilt, eller i tørr, f. eks. fry-setørret form. Foreligger insulinet utfelt i amorf form uten tilstrekkelig metallinnhold i krystallisasjonsmediet, kan podekrystallene tilføres sammen med det mang-lende metallinnhold, idet f. eks. den vandige suspensjon av podekrystallene i seg selv kan utvise et tilstrekkelig metallinnhold.

Krystallisasjonen foregår som nevnt ved en pH-verdi mellom 5 og 7, og innenfor dette intervall er det hensiktsmessig å benytte en pH-verdi mellom 5,3—6,5 i avhen-gighet av krystallisasjonsmediets sammensetning.

De benyttede podekrystaller kan f. eks. fremstilles ved at insulin på i og for seg kjent måte bringes til å krystallisere i et vandig medium, hvortil det settes fryse-tørret insulin, før krystalldannelsen begynner.

Nedenstående lutførelseseksempler tje-ner til nærmere belysning av oppfinnelsen, og anvendelsen av den omtalte formel. I eksemplene er det gjort bruk av en vandig podekrystallsuspenisjon, i hvilken krystalle-ne har en størrelse av 2,6 som har føl-gende sammensetning:

0,03 % insulinkrystaller,

2,5 mg % sink (som slnkklorid),

2,5 mg % sitronsyre,

0,08 o/oo p-oksybenzoesyremetalester og NaOH til pH = 7,2—7,4.

Eksempel 1.

I = 500 mg, dp = 2,6 og d. = 25 (x.

Herav fås ifølge formelen P = 500 x 2,6<:>i : (25<:!>—2,6<:1>) = 0,56 mg svarende til 1,9 ml 2 ml av podekrystalLsiuspensjonen.

500 mg krystallinsk insulin fra svine-pankreas oppløses i 50 ml vann, inneholdende 6 ml 0,1 n HC1. 16 ml aceton tilsettes og derpå 10 ml av en pufferoppløsning, som inneholder 10 pst. sitronsyre, 0,4 pst. Zn ( som sinkklorid) samt så meget NaOH at pufferoppløsningen får en pH-verdi på ca. 6,3. Derpå tilsettes vann til et totalvolum på 100 ml. pH reguleres inn på ca. 6,2. Før den spontane krystallisasjon begynner, tilsettes 2 ml av podekrystallsuspensjonen. Etter noen timers forsiktig omrøring er krystallisasjonen tilendebrakt, og hoved-parten av insulinet viser seg å være utkrystallisert i form av krystaller av en stør-relse på 20—25 /(.

Eksempel 2.

I = 1600 mg, dp = 2,6 \ i og d, = 30„. Herav fåes P = 1600 x 2,6<:1> : (30<:!>—2,6:<i>) = 1,04 mg svarende til 3,5 ml podekrystall-suspemsjon.

1,6 g krystallinsk insulin fra oksepan-kreas oppløses i 50 ml vann, inneholdende 10 mg Zn (som sinkklorid) og 2 ml 1 n HC1 Derpå tilsettes 50 ml pufferoppløsning, inneholdende 1,36 g OHiCOONa, 3H.-0, 7 g NaCl og 1 ml 1 n NaOH. Straks etter tilsettes 3,5 ml av podekrystallsuspensjonen. pH innstilles på 5,4 til 5,6. Etter omrøring i 15—20 timer er krystallisasjonen tilendebrakt, og hovedmengden etter vekt av insulinet viser seg å være utkrystallisert i form av krystaller av en størrelse av ca. 30 //.

Eksempel 3.

I = 1120 mg, dp = 2,6 og d; = 30 /<. Herav fåes P = 1120 x 2,6<:>i : (30:<i>—2,6<M>) = 0,73 mg svarende til 2,43 ml 2,5 ml podekrystallsuspensjon.

1,12 g krystallinsk insulin fra oksepan-kreas oppløses i 50 ml vann, inneholdende 10 mg Zn (som sinkklorid) og 2 ml 1 n HC1. Deretter tilsettes 50 ml av en- vandig opp-løsning, inneholdende 1,36 g CHiCOONa, 3H-0, 11,9 g KB r og 1 ml 1 n NaOH. Straks etter tilsettes 2,5 ml av podekrystallsuspensjonen. pH innstilles på 5,4—5,6. Etter om-røring i 15—20 timer er krystallisasjonen tilendebrakt. Hovedmengden etter vekt av insulinet viser seg å være utkrystallisert i form av krystaller av en størrelse på ca. 30 u.

Eksempel 4-

I = 1600 mg, dp = 2,6 (.i og d; = 35 til 40 <( = 37,5 |.i. Herav fåes p = 1600 x 2,6'<!> : (37,5{—2,6<:i>) = 0,53 mg svarende til 1,8 ml podekrystallsuspensj on.

1,6 g krystallinsk insulin oppløses i 500 ml vann, inneholdende 100 mg Zn (som sinkklorid) og 20 ml 1 n HC1. Deretter tilsettes 500 ml pufferoppløsning, inneholdende 13,6 g OH:iCOONa,3HL.O, 70 g NaCl og 10 ml 1 n NaOH. Derpå tilsettes 1,8 ml av

podekrystallsuspensjonen. pH innstilles på 5,4—5,6. Etter omrøring i 15—20 timer er krystallisasjonen tilendebrakt. Hovedmengden etter vekt av insulinet viser seg å være utkrystallisert i form av krystaller av en størrelse på ca. 40 u (35 til 40 (.i).

Eksempel 5.

I = 3200 mg, dp = 2,6 u og d; = 15 [j-Herav fåes P = '3200 x 2,6<3>': (15i<i>—2,6<3>) = 16,8 mg svarende til 56 ml podekrystallsuspensj on.

3,2 g krystallinsk insulin oppløses i 50 ml av en vandig oppløsning, inneholdende 20 mg Zn (som sinkklorid) og 3 ml 1 n HC1. Deretter tilsettes 50 ml av en vandig oppløsning, inneholdende 1,36 g CHsCOONa, 3H-0, 7 g NaCl og 2 ml 1 n NaOH. Derpå tilsettes 5 ml av en podekrystallsuspensjon, som er 10 ganger så konsentrert som den i eksempel 1—4 benyttede med hensyn til alle komponenter. Etter ca. 20 timer er krystallisasjonen tilendebrakt. Hovedmengden etter vekt av insulinet viser seg å være utkrystallisert i form av krystaller av en størrelse på ca. 15 /(• i Eksempel 6.

Krystallisasjonen utføres som beskre-vet i eksempel 2, men i stedet for å tilsette 3,5 ml av podekrystallsuspensjonen, tilsettes det en ekvivalent mengde som fryse-tørret pulver. Herved oppnås samme kry-stallstørrelse som i eksempel 2.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan finne anvendelse til fremstilling av in-sulinkrystallsuspensjoner, som er 'anvende-lige som injiserbare insulinprepareter med protrahert virkning, i hvilket tilfelle den ifølge oppfinnelsen utføres under sterile betingelser i et injiserbart krystallisasjons-medium. Herved overflødiggjøres en separat fremstilling av sterile insulinkrystaller av i hovedsaken ens størrelse og etterføl-gende suspendering av disse krystaller i et separat fremstilt, sterilt injiserbart su-spensjonsmedium.

Nedenstående eksempel toelyser denne

utførelsesform for fremgangsmåten ifølge

oppfinnelsen.

Eksempel 7.

Det gås frem på liknende måte som i

eksempel 2.

1,6 g krystallinsk insulin oppløses i 50

vann inneholdende 10 mg sink (som sinkklorid) og 2 ml 1 n HO. Oppløsningen ste-rilfiltreres, og filteret utvaskes med 25 ml

vann. Til de 75 ml filtrat settes 25 ml av

en aseptisk tilberedt pufferoppløsning inneholdende 1,36 g CHtCOONa, 3H:;0, 7 g

NaCl og 1 ml 1 n NaOH. Deretter tilsettes

3,5 ml av en aseptisk tilberedt podekrystallsuspensjon av samme sammensetning som

anvendt i eksempel 1. pH innstilles på 5,5.

Etter omrøring i 15—20 timer er krystallisasjonen tilendebrakt. Hovedmengden etter

vekt av insulinet er utkrystallisert i form

av krystaller av en størrelse på ca. 30 u-Krystallsuspensjonen omdannes til

bruksferdig injeksjonspreparat ved fortyn-ning med 900 ml av en aseptisk tilberedt

oppløsning inneholdende 70 mg sink (som

sinkklorid), 1,1 o/oo p-oksybenzoesyre-metylester samt 2,7 ml 1 n NaOH, pH skal

være ca. 7,3, og suspensjonen innstilles her-på med 0,1 n NaOH eller HO.

Det ferdige preparat inneholder 40 i. e.

insulin pr. ml.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av insulinkrystaller av i .hovedsaken ens 'stør-

relse, ved hvilket insulinet bringes til å krystallisere fra et vandig medium med en pH-verdi mellom 5 og 7 i nærvær av et krystallisasjonsfremmende metall og under podning med insulinkrystaller, karakterisert ved at det anvendes podekrystaller av i hovedsaken ens størrelse i en mengde svarende til ligningen

hvor P er mengden i gram av de benyttede podekrystaller, I mengden i gram av det krystalllserbare insulin i mediet, dn størrel-sen i av podekrystallene og d, den stør-relse i u i hvilken hovedmengden av insulinet ønskes utkrystallisert.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at det til undertrykkelse av spontan krystalisasj on anvendes insulin fra svinepankreaskjertler.

3. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at krystallisasjonen til undertrykkelse av spontan krystallisasjon foregår i nærvær av halogen i ionogen form i en konsentrasjon over 0,2 mol pr. liter.

4. Fremgangsmåte ifølge en hvilken som helst av påstandene 1—3, karakterisert ved at podekrystallene og det insulin som skal krystalliseres, anvendes 1 en slik mengde at hovedmengden av insulinet utkrystalliserer i form av krystaller av i hovedsaken ens størrelse Innenfor området 15—40 /(.