NL8702045A - Colorimetrische methode voor het kwantitatief bepalen van magnesium onder toepassing van alfa-glycerofosfaatoxydase. - Google Patents
Colorimetrische methode voor het kwantitatief bepalen van magnesium onder toepassing van alfa-glycerofosfaatoxydase. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8702045A NL8702045A NL8702045A NL8702045A NL8702045A NL 8702045 A NL8702045 A NL 8702045A NL 8702045 A NL8702045 A NL 8702045A NL 8702045 A NL8702045 A NL 8702045A NL 8702045 A NL8702045 A NL 8702045A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- water
- glycerol
- per liter
- peroxidase
- magnesium
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
«J
-1-
87.3053/vdKl/vL
Korte aanduiding: Colorimetrische methode voor het kwantitatief bepalen van magnesium onder toepassing van alfa-glycerofosfaatoxydase
De uitvinding heeft betrekking op de bepaling van magnesium hoeveelheden in waterige vloeistoffen. Meer in het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op methoden voor de bepaling van serummagnesium onder toepassing van a-glycero-5 fosfaatoxydase.
Snelle en nauwkeurige bepaling van bloedserumhoeveelheden en werkzame hoeveelheden van verschillende enzymen en mineralen vormt een belangrijk medisch diagnostisch middel. Magnesium is het tweede, meest overvloedige intracellulaire kation 10 dat aanwezig is in het menselijk lichaam en dient als activator voor veel belangrijke enzymen. Het belang daarvan in de menselijke fysiologie is uitgebreid vastgesteld. Nauwkeurige bepaling van serummagnesium is derhalve een diagnostisch middel van onschatbare waarde.
15 Talrijke spectrofotometrische technieken voor het bepalen van magnesium zijn ontwikkeld onder toepassing van calmagiet, methylthymol blauw, titaan geel of magonsulfonaat. Deze methoden bezitten een beperkte nauwkeurigheid omdat zij zijn gebaseerd op chelaatvormingsreacties en daarom in verschillende 20 mate worden gehinderd door andere kationen die in het monster aanwezig zijn. Atoomabsorptie en neutronactiveringsanalyses bezitten deze fouten niet, doch zijn zeer ingewikkeld en onbetaalbaar duur voor de meeste gewone klinische laboratoria.
Gevonden is dat magnesium zich bindt met adenosinedifos-25 faat (ADP) of adrenosinetrifosfaat (ATP) onder vorming van een moleculair complex. Zoals vermeld in Clinical Chemistry 31, biz. 703-705 (1985), hebben Tabata en medewerkers een enzymatische magnesiumbepaling ontwikkeld onder toepassing van de enzymen hexokinase en glucose-6-fosfaatdehydrogenase. In hun ge-30 stopte reactiebepaling wordt de over een periode van 15 minuten gevormde hoeveelheid (NAD(P)H) bepaald door de hexokinase reactie te stoppen met tetranatrium EDTA en de absorptie te bepalen bij 340 nm. Deze snelheidsafhankelijke uiteindelijke absorptie 870204 5 -2- is evenredig met de hoeveelheid aanwezig Mg.ATP complex en derhalve met de serummagnesiumconcentratie. Deze enzymatische magnesium bepalingsmethode vereist een vóór-incubatie van het monster en langdurige reactieperiode die het ongeschikt maken 5 voor geautomatiseerde instrumentele analyse.
De Tabata-methode bezit een aantal inherente beperkingen. Allereerst vereist het betrekkelijk dure smalle-band spectro-fotometers die in het ultraviolette gebied kunnen meten om de werkelijke absorptie van de coenzymindicator te verkrijgen.
10 Ten tweede wordt de bepaling aanzienlijk gestoord door lipemie omdat de licht verstrooiingseffecten van deze stof aanzienlijk zijn vergroot bij golflengten onder 400 nm. Ten derde is de gevoeligheid van de bepaling beperkt door het betrekkelijk lage molaire absorptievermogen van de toegepaste indicator. Ten 15 vierde gaan de bepalingen vergezeld van blanco's die veel reagens vereisen. Ten vijfde vermindert de noodzaak om de reactie te stoppen de mogelijkheid om de procedure te automatiseren in aanzienlijke mate.
Het is derhalve wenselijk om een methode te ontwikkelen 20 die de snelle en nauwkeurige bepaling van magnesiumhoeveelhe-den in bloedserum kan verschaffen. Het is eveneens gewenst om een methode te verschaffen die een colorimetrische bepaling met verhoogde gevoeligheid kan verschaffen. Het is voorts gewenst om een methode te verschaffen die waarneembare resultaten 25 verschaft bij een golflengte boven 340 nm om de lichtverstrooiings-effecten van serumtroebeling, veroorzaakt door lipemische monsters, te minimaliseren.
Een werkwijze en bijgaande samenstelling voor het bepalen van hoeveelheden magnesium die aanwezig zijn in een waterig 30 medium wordt beschreven. Het waterige medium kan elke stof van biologische of niet-biologische oorsprong zijn. Voorbeelden daarvan zijn volledig bloed, plasma, bloedserum, gebufferde oplossingen, enz..
De uitvinding is gebaseerd op de ontdekking dat het uit-35 eindelijke absorberende vermogen, gevormd door de basische reactie waarin glycerol wordt gefosforyleerd en reageert in aanwezigheid van α-glycerofosfaatoxydase snelheidsafhankelijk is en 8702 04 5 -3-.
evenredig kan worden gemaakt aan de hoeveelheid van een complex dat wordt gevormd tussen ATP en magnesium.
De werkwijze voor het bepalen van magnesiumhoeveelheden in waterige monsters omvat dat men 5 I. een afgemeten hoeveelheid monster in aanraking brengt met een afgemeten hoeveelheid van ofwel (a) een reagensoplos-sing of (b) oplossingen die reagentia en enzymen bevatten om een kettingreactie in te leiden die, uiteindelijk een waarneembare stof zal vormen, zoals een chromogeen; en 10 II. de aldus gevormde waarneembare stof meet.
De samenstelling volgens de onderhavige uitvinding bevat α-glycerofosfaatoxydase, peroxydase, glycerolkinase, adenosines' -trifosfaat (ATP), glycerol en specifieke indicator cosub-straten. Gevonden is dat het in aanraking brengen van een mon-15 ster met de opgesomde reagentia en enzymsamenstelling leidt tot een bepaalde reeks reacties die uiteindelijk snelheidsafhankelijk zijn van de concentratie van het in de monsteroplossing aanwezige magnesium.
De bepaalde reactievolgorde vindt als volgt plaats: 20 A. in het monster aanwezig magnesium bindt met ATP uit de reagensoplossing onder vorming van een magnesium-ATP (Mg.ATP) comp1ex; B. het Mg.ATP fosforyleert glycerol dat is gekatalyseerd door glycerolkinase onder vorming van glycerol-3-fosfaat en 25 een magnesium-adenosine 5'-difosfaat (Mg.ATP) complex, waarbij zowel glycerol als glycerolkinase worden gelevérd door de samenstelling van de onderhavige uitvinding; C. het aldus gevormde glycerol-3-fosfaat reageert met zuurstof uit de omgeving ter verkrijging van waterstofperoxyde 30 in een door het α-glycerofosfaatoxydase, dat aanwezig is in de samenstelling van de onderhavige uitvinding, gekatalyseerde reactie; en D. het gevormde waterstofperoxyde kan direkt worden gemeten met bekende technieken of reageert verder met indicator 35 co-substraten in een door peroxydase gekatalyseerde reactie onder vorming van een visueel waarneembaar chromogeen; de co- 870204 5 -4- substraten en peroxydase zijn aanwezig in de samenstelling volgens de uitvinding.
De uitvinding zal nader worden beschreven aan de hand van de volgende beschrijving en voorbeelden.
5 De uitvinding is gebaseerd op de ontdekking dat magnesium dat aanwezig is in biologische media een affiniteit bezit voor, en complexen kan vormen met adrenosinepolyfosfaten. Eveneens is gevonden dat de snelheid van de reactievolgorde die is toegelicht in tabel A, afhankelijk is van de complexvorming van 10 magnesium met ATP; niet alleen van de aanwezigheid van ATP alleen. Het Mg.ATP complex vormt derhalve het beperkende reagens bij de vorming van glycerol-3-fosfaat en alle daaropvolgende reacties in de keten.
De werkwijze ter bepaling van magnesiumhoeveelheden in een 15 waterig monster omvat derhalve dat men: I. een afgemeten hoeveelheid monster in aanraking brengt met een tevoren bepaalde hoeveelheid van ofwel (a) een reagens-oplossing ofwel (b) oplossingen die reagentia bevatten en enzymen om de kettingreactie in te leiden die uiteindelijk een 20 waarneembare stof vormt, zoals een chromogeen; II. de aldus gevormde waarneembare stof meet.
De bepaalde volgorde van de reacties vindt zodanig plaats dat magnesium dat aanwezig is in het monster een complex vormt met ATP. Het Mg.ATP complex draagt een fosfaatgroep bij in de 25 glycerolkinase-gekatalyseerde fosforylering van glycerol tot glycerol-3-fosfaat. Glycerol-3-fosfaat in aanwezigheid van om-gevingszuurstof en α-glycerofosfaatoxydase reageert onder vorming van waterstofperoxyde dat kan worden omgezet tot een waarneembaar chromogeen via een peroxydase-gekatalyseerde reductie.
30 Om de werkwijze volgens de uitvinding uit te voeren wordt een reagenssamenstelling aangeboden die alle reagentia en enzymen, vereist om het in het monster aanwezige magnesium tot een complex te binden, bevat om de reactievolgorde in tabel A te starten en te ondersteunen. De reagenssamenstelling kan des-35 gewenst een ééndelige oplossing of een meerdelige oplossing zijn. De reagenssamenstelling bestaat in hoofdzaak uit: 8702 04 5 -δη) glycerolkinase; b) α-glycerofosfaatoxydase; c) een verbinding met peroxydase werkzaamheid; d) adenosine S'-trifosfaat; 5 e) glycerol; f) een met peroxydase oxydeerbaar co-substraat; g) een indicator co-substraat koppelingsmiddel; h) een buffer die de pH van een oplossing tussen ongeveer 6,0 en ongeveer 8,0 kan handhaven; en 10 i) water.
Het valt binnen het kader der uitvinding om chemicaliën en enzymen afzonderlijk of in elke combinatie toe te voegen die de reactieketen, toegelicht in tabel A, zullen starten. Verschillende chemicaliën en enzymen kunnen anderzijds in af-15 zonderlijke gebufferde oplossingen worden gehouden en indien gewenst worden toegepast. In een uitvoeringsvorm worden glycerol en het indicator co-substraat in een gebufferde oplossing, gescheiden van een gebufferde oplossing die de overige bestanddelen bevat, gehouden. In deze uitvoeringsvorm wordt de oplos-20 sing die de resterende bestanddelen bevat gemengd met het monster om de vorming van het Mg.ATP complex mogelijk te maken.
De reagentia en het monster laat men reageren bij een temperatuur tussen ongeveer 25°C en ongeveer 45°C gedurende een periode tussen ongeveer 5 seconden en ongeveer 10 minuten. Om innig 25 contact te waarborgen kan het mengsel worden geroerd. De gebufferde glyceroloplossing wordt daarna toegevoegd aan het mengsel. De toevoeging van glycerol zal de bepaalde reactievolgor-de inleiden en de bepaling van de magnesiumconcentratie van het monster mogelijk maken.
870 2 04 5 -6-
CM
O
CM
K
O
+ CM
K
•P
(d + (d 04 <p d Q cn cu
<3 0 <U
• m Cn
Cn d 0
g 0 S
+J 0
+ CU P
0 Λ 4-)(0 0 cd >1 rd X! >ö
m 0 P
(AMP
0 Ό CU
4H >i H
<J| ,Ü rM
co -Η cu 1 'd Gn
PI H CU
o cn . cu
H P rd i' tn A
CU Ό cd tq o -H Td
>i X! -H
C H O XI
Cn O
H -PP
. fti CU
Λ (d Cu (U cp cn cn d cd o cu
d m-ι -P
•p HP (d
M 0 0 P
H P-P -P
o cu cn cn P OP P3 cu Xd d o h d cn >i Cn n i
iH O
Cn + O
-P P
04 <d o
Eh (d -P
<; m cd • cn o
Cn o -η 5 ip Ό 1 d -} co Ή
H r—I ΊΟ O
P P CM
(U (U O
O O CM
>1 >1 id
i—I rH
Cn &i cm 870 2 04 5 · -7-
Wanneer alle bestanddelen zijn gemengd met het monster wordt de absorptie van het verkregen mengsel gecontroleerd gedurende een interval van tot ongeveer 5 tot ongeveer 15 minuten bij een bepaalde golflengte, tussen ongeveer 450 en 650 nm, 5 bij voorkeur bij ongeveer 510 nm, afhankelijk van de toegepaste indicator co-substraten. Een reagens blanco met een afgemeten hoeveelheid water kan eveneens worden bereid om de basis absorptie van het water, toegepast ter bereiding van de reagens-oplossingen, te bepalen. De verandering in de absorptie over 10 de tijd (ΔΑ/min) is evenredig met de magnesiumconcentratie van het monster.
De samenstelling volgens de onderhavige uitvinding bevat ATP in een concentratie tussen ongeveer 0,05 en ongeveer 2,0 millimol per liter. ATP in dit concentratiegebied zal een com-15 plex vormen met magnesium dat aanwezig is in een monster van de biologische vloeistof om de doelmatige bepaling van magne-siumhoeveelheden in het monster tot ongeveer 2,5 millimol magnesium per liter te verschaffen. Magnesiumconcentraties groter dan 2,5 millimol/liter kunnen worden bepaald door afgemeten 20 verdunning van het monster met bekende magnesiumvrije normale zoutoplossingen en opnieuw te analyseren. Geschikte ATP is in de handel verkrijgbaar bij Sigma Chemical Corp., St. Louis, Missouri.
Wanneer het Mg.ATP complex is gevormd in de waterige op-25 lossing zal aanraking met glycerol in aanwezigheid van glycerolkinase leiden tot de fosforylering van glycerol onder vorming van glycerol-3-fosfaat en Mg.ADP. In de werkwijze en samenstelling volgens de onderhavige uitvinding wordt glycerol toegepast in een concentratie tussen ongeveer 0,05 en ongeveer 30 20 millimol/liter, waarbij concentraties tussen ongeveer 0,2 en ongeveer 7 millimol/liter de voorkeur verdienen. Glycerol kan in de handel worden verkregen bij Sigma Chemical Corp.,
St. Louis, Missouri.
In het algemeen kan glycerolkinase uit elke bron worden 35 toegepast in de succesvolle praktijk van de onderhavige uitvinding, hoewel glycerolkinase, afkomstig van Streptomyces canus 8702045 -8- (E.C. 2.7.1.30) de voorkeur verdient. Deze glycerolkinase kan worden verkregen bij Finnsugar Biochemicals, Ine. in Elk Grove Village, Illinois. In de onderhavige methode wordt glycerolkinase in hoeveelheden van ongeveer 10 U tot ongeveer 150 U 5 per liter buffer succesvol toegepast.
Glycerol-3-fosfaat, gevormd in de enzym-gekatalyseerde reactie van Mg.ATP met glycerol, reageert in aanwezigheid van het enzym α-glycerofosfaatoxydase ter vorming van dihydroxy-aceton en waterstofperoxyde.
10 Het toegepaste α-glycerofosfaatoxydase kan afkomstig zijn van een groot aantal microbiële soorten die afkomstig zijn van een groot aantal bronnen. De eigenschappen van dit enzym, dat afkomstig is van bepaalde bronnen, zijn wenselijker dan van andere in de werkwijze der onderhavige uitvinding. Enzym, ver-15 kregen uit Aerococcus viridans verdient de voorkeur omdat het een grotere werkzaamheid bezit over een breder pH-gebied dan enzym, dat is verkregen uit andere bronnen, a-glycerofosfaat-oxydase, verkregen uit deze bron, kan succesvol worden toegepast in de onderhavige uitvinding in hoeveelheden tussen onge-20 veer 2,0 kü en ongeveer 10,0 kü per liter. Voor hanteringsge-mak kan het α-glycerofosfaatoxydase aanwezig zijn in de oorspronkelijke oplossing die het ATP bevat.
Om de door de kettingreactie, die oorspronkelijk is ingeleid door creatinekinase, gevormde produkten kwantitatief te 25 bepalen, wordt het gevormde waterstofperoxyde direkt gemeten of kan men verder laten reageren onder vorming van een waarneembaar chromogeen in een door een peroxydase of een stof met peroxydase werkzaamheid gekatalyseerde reactie.
Peroxydasen zijn geconjugeerde proteïnen die ijzerporfy-30 rine bevatten. Peroxydase dat voorkomt in mierikswortel, aardappels, vrijgeboomsap, rapen, melk, witte bloedlichaampjes en microorganismen kan succesvol worden toegepast in de onderha- zoals vige uitvinding. Bepaalde synthetische peroxydasen, beschreven door Theorell en Machly in Acta Chem. Scand., Vol. 4, 35 blz. 422-434 (1950), zijn eveneens bevredigend. Minder bevredigend zijn stoffen zoals hemine, methemoglobine, oxyhemoglobine, 870 2 045 -9- hemoglobine, hemochromogeen, alkalische hernatine, heminederi-vaten en bepaalde andere verbindingen die peroxydase of peroxy-dase-achtige werkzaamheid bezitten, namelijk het vermogen om de oxydatie van een andere stof door middel van waterstofper-5 oxyde of andere peroxyden te katalyseren.
Andere stoffen die geen enzymen zijn doch peroxydasewerk-zaamheid bezitten, die kunnen worden toegepast in de onderhavige uitvinding, zijn: ijzersulfocyanaat, ijzertannaat, ferro-ferrocyanide, chromizouten (zoals kaliumchromisulfaat) geab-10 sorbeerd in silicagel, etc.. Deze stoffen zijn niet zo bevredigend als peroxydase op zichzelf doch zijn eveneens bruikbaar.
In de werkwijze der onderhavige uitvinding verdient peroxydase, afkomstig van mierikswortel (E.C. 1.11.1.7), verkrijgbaar bij Finnsugar Biochemicals, de voorkeur. In de werkwijze 15 der onderhavige uitvinding kunnen peroxydase-enzymhoeveelheden tussen ongeveer 0,5 kü en 20 kü per liter worden toegepast.
Omdat het gevormde waterstofperoxyde direkt wordt gereduceerd in aanwezigheid van een peroxydase laat men het reageren met een peroxydase-oxydeerbaar substraat of co-substraat 20 en een koppelingsco-substraat om een waarneembaar chromogeen te verschaffen. Het peroxydase en peroxydase-oxydeerbare co-substraat zijn bij voorkeur aanwezig in de gebufferde ATP oplossing. Het koppelingsco-substraat kan aanwezig zijn in de glycerolbevattende oplossing om niet-specifieke autokoppeling 25 of auto-oxydatie tijdens opslag te minimaliseren.
De peroxydase-oxydeerbare co-substraten, die succesvol kunnen worden toegepast, zijn in het algemeen die welke reageren onder vorming van een waarneembaar chromogeen. Het peroxydase-oxydeerbare co-substraat kan oxydatieve condensatie ondergaan 30 met koppelingsmiddelen zoals die welke fenolische groepen bevatten. Kenmerkende voorbeelden van dergelijke oxydeerbare verbindingen zijn benzideen en zijn homologen, p-fenyleendiaminen, p-aminofenolen, 4-amino-anti-pyrine, 3-methyl-2-benzothiazoli-monhydrazon, etc., en mengsels daarvan.
35 Het koppelingsco-substraat wordt gekozen uit de groep be staande uit het ammonium of alkalimetaalzout van 2-hydroxy-3,5- 870204 5 -10- dichloorbenzeensulfonaat (HDCBS), of andere aromatische alcoholen, aminen en mengsels daarvan. Bij voorkeur is het koppe-lingsco-substraat HDCBS, aanwezig in een concentratie tussen ongeveer 0,1 millimol en ongeveer 5,0 millimol per liter.
5 Het chromogeen dat ontstaat door de koppeling van HDCBS
en 4-aminoantipyreen is een stabiel rood gekleurd molecuul met een absorptie tussen ongeveer 450 en 525 nm met een maximum bij 510 nm. Gevonden is dat het molaire absorptievermogen van het verkregen chromogeen viermaal dat van bekende indicators 10 is. Het gebruik van de langere golflengte bezit het extra voordeel dat de licht verstrooiende effecten, veroorzaakt door troebeling in lipemische monsters, is geminimaliseerd.
De reactievolgorde vindt optimaal plaats bij een pH tussen ongeveer 5,5 en ongeveer 9,2. Bufferingsmiddelen kunnen 15 derhalve worden toegepast in de samenstelling der onderhavige uitvinding om de pH in dit gewenste gebied en bij voorkeur tussen ongeveer 6,5 en ongeveer 7,2, te handhaven.
Het toegepaste bufferingsmiddel moet een middel zijn dat de reactievolgorde van tabel A niet zal hinderen. Geschikte 20 buffers zijn Ν,Ν-bis-(2-hydroxyethyl)-2-amino-ethaan-sulfon- zuur (BES); 3-(N-morfolino)-2-hydroxy-propaansulfonzuur (MOPSO); 3-N-morfolinopropaansulfonzuur (MOPS); N-(2-aceetamido)-2-amino-ethaansulfonzuur (ACES); piperazine-N,N-bis(2-ethaansulfonzuur) (PIPES); 1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]-propaan(bis-25 trispropaan), tris-(hydroxymethyl)-aminoëthaan/zoutzuur (Tris/ HC1), imidazool/zoutzuur, alkalifosfaat, imidazool/zoutzuur of mengsels daarvan. Bij voorkeur wordt Tris/HCl toegepast in een concentratie ter verkrijging van ongeveer 0,01 tot ongeveer 0,1 mol per liter in de samenstelling volgens de onderhavige 30 uitvinding.
De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe. Deze voorbeelden dienen alleen ter toelichting en niet ter beperking van de onderhavige uitvinding.
Voorbeeld I
35 Bepaling_van_de_magnesiumconcentratie
Een reeks magnesiumwerkstandaards met concentraties van 8702 04 5 -II- 0,5, 1,0, 1,5 en 2,0 mmol/L zijn bereid door geschikte verdunning van een 10 mmol/L voorraadoplossing van magnesiumacetaat.
Om een grafiek van de Mg++ concentratie tegen de verandering in de absorptie met de tijd te verkrijgen werd elke werk-5 oplossing geanalyseerd volgens de volgende methode.
Een hoeveelheid van 0,9 ml van het Mg.ATP reagens, toegelicht in tabel BI, werd gebracht in een 12 x 75 mm proefbuis en geïncubeerd in een waterbad van 37°C gedurende twee tot drie minuten. Een hoeveelheid van 5,0 ^uL van de te analyseren 10 oplossing werd in de buis gebracht en wervelend gemengd. Daarna werd een hoeveelheid van 0,1 ml van de glyceroloplossing, die is toegelicht in tabel Bil (voorverhit op 37°C), toegevoegd en wervelend gemengd. De inhoud werd daarna overgebracht in een cuvet en de absorptieverandering bij 510 nm gemeten gedurende 15 één tot tien minuten tegen een reagens blanco met 5,0 ^uL water. De absorpties werden gemeten in een Gilfordmodel 300-N door-stroomspectrofotometer.
De resterende standaards en monsters worden evenzo onderzocht en de verandering in de absorptie ten opzichte van de 20 tijd is weergegeven op de in figuur 2 weergegeven grafiek. Lineaire regressie-analyse van de kenmerkende standaardkromme in figuur II van vier standaards in triplo voor 0 tot 2 mmol/L Mg++ leverde de vergelijking: y = 0,0195x + 0,00125, r = 0,9988.
25 Voorbeeld II
Serummonsters werden verzameld en geprepareerd voor de analyse binnen 24 uren na het verzamelen. Sera werden bevrijd van stolsels door 10 minuten centrifugeren om valse verhoging van serummagnesium uit gecomplexeerde erythrocyten te voorkomen. 30 Zichtbaar gehemolyseerde serummonsters werden weggeworpen.
Elk monster werd onderzocht volgens de in voorbeeld I weergegeven procedure. De verandering in absorptie over de tijd werd berekend voor elk monster uit het lineaire gedeelte van de kromme. Gevonden werd dat, met een naloopfase van 2 tot 35 3 minuten, de reactiesnelheden lineair waren voor tenminste 10 minuten. De analyse zelf was lineair tot een magnesiumcon- 870104 5 ’ -12- centratie van tenminste 2,0 mmol/L. Magnesiumconcentratie groter dan deze kunnen worden verdund met magnesiumvrije normale zoutoplossing en succesvol opnieuw geanalyseerd.
870204 5 - -13- \\ \ 'ν.'χ.
η \ ο ο § § ^ ^ ο 0 0 « oil “ i I I « jj c φ Φ
4J g o m δ ο M
d *· - v ΦΦ ο η o in h in ο h in •h o o oi o
+> d M
nj o !-i O +> d Φ 0 d o 0 g •3 ί m n φ 2 c 0 cn 7i nJ it ε φ o
in -H
© 4-> (0 Ό 'Ο Φ Ό 1 cn! (0 -H ^ e - Ή x
Φ tPt in o ^ +J
j > £ Ο-P 1 ra
M ? -H - fi «Η Id >? S
M Bi Ό Φ-PIÖ KC
CC 54 Φ 54 >44 ^00 οα-Η·Η φ 54 +J to Φ ® 5j 4-4 Η Λ 44 >ι 1 Ο ω <£ © i-j 44 Pj- 44 fd 4j 3 Ο. φ 2 ·Η m Ο d d .d öl
Ε-ιΦ> rQJ-> Μ Φ Ή Λ I C
η C φ φ Μ® r-4 <ö d Ο Φ Ή Η φ «Η Μ U Ο ·* ^¾ Ο ο Β Ν Ο φ Β d 01 Η -Η (4 Κ 2 d 54 4-1 \-r4 0tTiX054 \ -Η φ φ 54 cn£C Ο ϋ Φ 10 54 Λ Ο Φ
ld Ή S Φ 54 >!-Ρ ' -H+J
·γ4 541¾ φ Η © 54(lJr4rö 4-i Β © Λ Cn £ E4 d Cn £ d Φ tri © Φ 54 d w H d
IQ O
d d ^ φ Φ £ r4 cn ® Φ © 54 Ό Φ
Ό 54 H
d O
Iff CU 54 •P B ® w < o Φ >1 CQ tT* *“* g u » ·
Η H
H
8702046 ’ -14-
Voorbeeld III
Honderd patiënt seraraonsters werden geanalyseerd met zowel de onderhavige methode als met een methylthymol blauw methode zoals toegepast met de DuPont ACA analysator en een met 5 de hand bediende magonsulfonaat methode zoals is toegelicht door Baginski en medewerkers, Magnesium in biologische vloeistoffen, Selected Methods of Clinical Chemistry, Vol, 19 (1982) biz. 277-281 en Baginski en medewerkers, Microbepaling van magnesium en biologische vloeistoffen, 27 Microchem (1982), 10 biz. 141-150.
De monstergegevens werden vergeleken. Uitstekende correla-tiedata werden verkregen met beide methoden, zoals uiteengezet is in figuur III. Geschikte lineaire regressiedata zijn: voorgestelde (y) = 0,981 (ACA) - 0,01 (mmol/L),(r=0,961) 15 voorgestelde (y) = 1,007 (magon) - 0,03 (mmol/L),(r=0,952).
8702 04 6
Claims (20)
1. Samenstelling voor de bepaling van magnesiumhoeveelheden in een waterig medium dat voornamelijk bestaat uit: glycerolkinase ? a-glycerofosfaatoxydase; 5 een stof met peroxydase-achtige werkzaamheid; adenosine-51-trifosfaat; glycerol; een peroxydase oxydeerbaar co-substraat; een indicator co-substraat koppelingsmiddel; 10 een buffer die de pH van een oplossing kan handhaven tus sen ongeveer 5,5 en ongeveer 9,2; en water.
2. Samenstelling volgens conclusie 1, m e t het kenmerk dat de buffer tris(hydroxymethyl)aminomethaan-chloor- 15 waterstofzuur.
3. Samenstelling volgens conclusie 2, met het kenmerk dat de samenstelling twee waterige reagensoplossingen omvat, waarbij de eerste reagensoplossing voornamelijk bestaat uit: 20 tussen ongeveer 0,01 en ongeveer 1,0 mol van de buffer per liter water; tussen ongeveer 0,05 en ongeveer 2,0 millimol adenosines' -trif osf aat per liter water; tussen ongeveer 0,05 en ongeveer 10,0 millimol van het 25 peroxydase oxydeerbare co-substraat per liter water; tussen Ongeveer 1 kU en ongeveer 10 kU a-glycerofosfaat-oxydase per liter water; tussen ongeveer 0,5 kü en ongeveer 20 kü van de stof met peroxydasewerkzaamheid per liter water; en 30 tussen ongeveer 10 U en ongeveer 150 U glycerolkinase per liter water.
4. Samenstelling volgens conclusie 3, met het kenmerk dat de tweede reagensoplossing voornamelijk bestaat uit: 870204 5 * -16- 9 tussen ongeveer 0,05 en ongeveer 1 mol buffer per liter water; tussen ongeveer 0,01 en ongeveer 5,0 millimol indicator co-substraat koppelingsmiddel per liter water; en 5 tussen ongeveer 0,05 en ongeveer 20,0 millimol glycerol per liter water.
5. Samenstelling volgens conclusie 1, met het kenmerk dat het peroxydase oxydeerbare co-substraat wordt gekozen uit de groep bestaande uit benzideen, p-fenyleendiaminen, 10 p-aminofenolen, 4-aminoantipyreen, 3-methyl-2-benzothiazolimon, en mengsels daarvan.
6. Samenstelling volgens conclusie 1, met het ken merk dat het indicator co-substraat koppelingsmiddel wordt gekozen uit de groep bestaande uit ammoniumzouten van 2-hydro- 15 xy-3,5-dichloorbenzeensulfonaat, alkalimetaalzouten van 2-hy-droxy-3,5-dichloorbenzeensulfonaat, en mengsels daarvan.
7. Samenstelling volgens conclusie 1, met het ken merk dat het glycerolkinase magnesium afhankelijk is en afkomstig is van Streptomyces canus.
8. Samenstelling volgens conclusie 1, met het ken merk dat het glycerolkinase magnesium afhankelijk is en afkomstig is van Bacilus Stearothemophilis.
9. Samenstelling volgens conclusie 1, met het ken merk dat het a-glycerofosfaatoxydase afkomstig is van
25 Aerococcus viridans.
10. Werkwijze ter bepaling van magnesium in een vloeibaar monster waarbij men (a) een monster van het waterige medium in aanraking brengt met een samenstelling die voornamelijk bestaat uit: 30 (1) glycerolkinase; (2) a-glycerolfosfaatoxydase; (3) peroxydase; (4) adenosine-5'-trifosfaat; (5) glycerol; 35 (6) een peroxydase oxydeerbaar co-substraat; (7) een indicator co-substraat koppelingsmiddel; 8702 04 5 -17- ? (8) een buffer die de pH van een oplossing kan handhaven tussen ongeveer 6,0 en ongeveer 8,0; en (9) water; en (b) de aanwezigheid van een in (a) gevormd reactieprodukt 5 kwantitatief bepaalt.
11. Werkwijze volgens conclusie 10,met het kenmerk dat gevormde reactieprodukt waterstofperoxyde is.
12. Werkwijze volgens conclusie 10, m e t h e t ken merk dat het reactieprodukt een gekleurd chromogeen is.
13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het ken merk dat het gevormde chromogeen een absorptie bezit tussen ongeveer 450 en ongeveer 650 nm.
14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het ken merk dat voorts de vorming van het reactieprodukt over een 15 periode van tot ongeveer 5 tot 15 minuten plaatsvindt.
15. Werkwijze volgens conclusie 10, met het ken merk dat het in aanraking brengen in trap a plaatsvindt bij een pH tussen ongeveer 6,5 en ongeveer 7,5.
16. Werkwijze volgens conclusie 10, met het ken- 20. e r k dat de in de aanr'akingstrap toegepaste samenstelling een tweedelige reagens is, bestaande uit: een eerste reagensoplossing die voornamelijk bestaat uit glycerolkinase, adenosine 51-trifosfaat, het peroxydase oxy-deerbare co-substraat, α-glycerofosfaatoxydase, de stof met 25 peroxydasewerkzaamheid, glycerolkinase, water en een buffer die de pH kan handhaven tussen ongeveer 6,0 en ongeveer. 8,0; en een tweede reagensoplossing die voornamelijk bestaat uit het indicator co-substraat koppelingsmiddel, glycerol, water en een buffer die de pH van de oplossing kan handhaven tussen 30 6,0 en 8,0.
17. Werkwijze volgens conclusie 16, met h e t k e n -merk dat de eerste reagensoplossing voornamelijk bestaat uit: a) water; 35 b) adenosine 51-trifosfaat in een hoeveelheid tussen onge veer 0,1 en ongeveer 1,0 millimol per liter water; 670 2 04 5 -18- c) 4-aminoantipyreen in een hoeveelheid tussen ongeveer 0,5 en ongeveer 2,0 millimol per liter water; d) α-glyCerofosfaatoxydase in een hoeveelheid tussen ongeveer 2,0 en ongeveer 10 ü/L; 5 e) peroxydase in een hoeveelheid tussen ongeveer 0,5 kü en ongeveer 2 kU/L; f) glycerolkinase in een hoeveelheid tussen ongeveer 10 ü en ongeveer 35 U/L; en g) een bufferingsmiddel in een voldoende hoeveelheid om 10 de pH te handhaven tussen ongeveer 6,0 en ongeveer 8,0.
18. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk dat de tweede reagensoplossing voornamelijk bestaat uit: a) water; 15 b) natrium 2-hydroxy-3,5-dichloorbenzeensulfonaat in een hoeveelheid tussen ongeveer 0,05 en ongeveer 20 millimol per liter water; c) glycerol in een hoeveelheid tussen ongeveer 0,2 en 10 millimol per liter; en 20 d) een bufferingsmiddel in een hoeveelheid voldoende om de pH tussen ongeveer 6,0 en ongeveer 8,0 te handhaven.
19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk dat de aanrakingstrap omvat dat men: een afgemeten gedeelte van de eerste reagensoplossing in- 25 cubeert bij een temperatuur tussen ongeveer
20°C en ongeveer 45°C; een afgemeten monster van de te bepalen vloeistof toevoegt; de twee materialen vermengt; een afgemeten hoeveelheid van de tweede reagensoplossing 30 toevoegt. 8702 04 5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/882,072 US4818691A (en) | 1986-07-03 | 1986-07-03 | Colormetric method for quantification of magnesium using α-glycerophosphate oxidase |
| US88207286 | 1986-07-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8702045A true NL8702045A (nl) | 1989-03-16 |
Family
ID=25379837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8702045A NL8702045A (nl) | 1986-07-03 | 1987-08-31 | Colorimetrische methode voor het kwantitatief bepalen van magnesium onder toepassing van alfa-glycerofosfaatoxydase. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4818691A (nl) |
| JP (1) | JPS6469956A (nl) |
| DE (1) | DE3731876A1 (nl) |
| FR (1) | FR2620732A1 (nl) |
| NL (1) | NL8702045A (nl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4992344A (en) * | 1989-05-11 | 1991-02-12 | Eveready Battery Company, Inc. | Cell circuit interrupter |
| US5334507A (en) * | 1991-09-20 | 1994-08-02 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Composition for measurement of potassium ion concentration and composition for elimination of ammonium ions |
| JP4168557B2 (ja) * | 1999-11-25 | 2008-10-22 | 三浦工業株式会社 | 硬度測定用指示薬および硬度測定方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4241178A (en) * | 1978-01-06 | 1980-12-23 | Eastman Kodak Company | Process and composition for the quantification of glycerol ATP and triglycerides |
| US4547461A (en) * | 1983-01-18 | 1985-10-15 | Eastman Kodak Company | Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase |
| US4657854A (en) * | 1983-05-05 | 1987-04-14 | Ivan Endre Modrovich | Assay systems based on magnesium-responsive enzymes |
-
1986
- 1986-07-03 US US06/882,072 patent/US4818691A/en not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-08-25 JP JP62211215A patent/JPS6469956A/ja active Pending
- 1987-08-31 NL NL8702045A patent/NL8702045A/nl not_active Application Discontinuation
- 1987-09-17 FR FR8713238A patent/FR2620732A1/fr not_active Withdrawn
- 1987-09-18 DE DE19873731876 patent/DE3731876A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4818691A (en) | 1989-04-04 |
| DE3731876A1 (de) | 1989-03-30 |
| FR2620732A1 (fr) | 1989-03-24 |
| JPS6469956A (en) | 1989-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4350762A (en) | Aminopyrine improved Trinder's reagent and dosing process for hydrogen peroxide from enzymatic oxidation of metabolic substrata with the same | |
| KR920010312B1 (ko) | 유체중 칼륨이온의 측정 | |
| Matsubara et al. | Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide with titanium 2-((5-bromopyridyl) azo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino) phenol reagent and its application to the determination of serum glucose using glucose oxidase | |
| JP5646323B2 (ja) | 溶血させた全血を用いる血中成分の測定方法及びそのキット | |
| EP0200540B1 (en) | Analytical element and method for determination of creatine kinase isoenzyme | |
| CS228127B2 (en) | Reagencni cinidlo | |
| EP0116307B1 (en) | Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase | |
| GB1601771A (en) | Kinetic method for determination of glucose concentrations with glucose dehydrogenase | |
| Nagaraja et al. | Development of quantitative enzymatic method and its validation for the assay of glucose in human serum | |
| Wimmer et al. | A kinetic colorimetric procedure for quantifying magnesium in serum. | |
| CS199692B2 (en) | Method of photometric determination of hydrogen peroxides | |
| US5962248A (en) | Quantitative determination method for chloride ions | |
| EP0639646A1 (en) | High precision determination of d-glucose-6-phosphate and composition therefor | |
| NL8702045A (nl) | Colorimetrische methode voor het kwantitatief bepalen van magnesium onder toepassing van alfa-glycerofosfaatoxydase. | |
| EP0200541B1 (en) | Immunochemical method and analytical composition and element for determination of creatine kinase-mb | |
| JP5017614B2 (ja) | 試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬、非特異的発色を抑制する方法、並びに非特異的発色抑制剤 | |
| CA1156949A (en) | Inhibition of lactate oxidase | |
| WO2005029038A2 (en) | Detection of potassium ions using ion-sensitive enzymes | |
| JP4577863B2 (ja) | カルシウムイオン測定用組成物および測定方法 | |
| da Fonseca-Wollheim | Haemoglobin interference in the bichromatic spectrophotometry of NAD (P) H at 340/380 nm | |
| BE1000913A3 (fr) | Composition et procede pour determiner le taux de magnesium de liquides. | |
| US5919644A (en) | Method for assaying sulfate-conjugated bile acid and therefore | |
| US5447847A (en) | Quantitative determination of pyruvic acid and quantitative analysis for component of living body making use of such determination | |
| IE47123B1 (en) | Analytical device | |
| US7407774B2 (en) | Method for reducing influence of hemoglobin with albumin in an assay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BV | The patent application has lapsed |