NL8401137A - Werkwijze voor het zichtbaar maken van genetisch materiaal. - Google Patents
Werkwijze voor het zichtbaar maken van genetisch materiaal. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8401137A NL8401137A NL8401137A NL8401137A NL8401137A NL 8401137 A NL8401137 A NL 8401137A NL 8401137 A NL8401137 A NL 8401137A NL 8401137 A NL8401137 A NL 8401137A NL 8401137 A NL8401137 A NL 8401137A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- cells
- stained
- dye
- dna
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 70
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 138
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 68
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 37
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 30
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 20
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 14
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 13
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 10
- DOETVZCFKJCYJV-UHFFFAOYSA-N 6-(4,5-dihydro-1h-imidazol-2-yl)-2-[4-(4,5-dihydro-1h-imidazol-2-yl)phenyl]-1h-indole Chemical compound N1CCN=C1C1=CC=C(C=2NC3=CC(=CC=C3C=2)C=2NCCN=2)C=C1 DOETVZCFKJCYJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 101100286286 Dictyostelium discoideum ipi gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 3
- 230000004899 motility Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- -1 bis-benzimidazole compound Chemical class 0.000 claims 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 44
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 25
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 19
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 4
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 4
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical class C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 description 3
- 229960000448 lactic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 3
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- SMNPLAKEGAEPJD-UHFFFAOYSA-N chembl34922 Chemical compound Cl.Cl.Cl.C1CN(C)CCN1C1=CC=C(NC(=N2)C=3C=C4N=C(NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 SMNPLAKEGAEPJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFIIYGZAUXVPSZ-UHFFFAOYSA-N 8-(2,4-dihydroxy-6-methylanilino)-2-(2,4-dihydroxy-6-methylphenyl)imino-7-hydroxy-1,9-dimethyldibenzofuran-3-one Chemical compound CC1=CC(=CC(=C1NC2=C(C3=C(C=C2O)OC4=CC(=O)C(=NC5=C(C=C(C=C5C)O)O)C(=C43)C)C)O)O QFIIYGZAUXVPSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004218 Orcein Substances 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- 241001590989 Syngamia Species 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L calcium lactate Chemical compound [Ca+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 231100000722 genetic damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000003783 haploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 235000019248 orcein Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 1
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Description
• ' t · * * , 'y *
Werkwijze voor het zichtbaar maken van genetisch materiaal
De uitvinding heeft betrekking op kleuringstechnieken voor genetisch materiaal, en in het bijzonder op een werkwijze voor het zichtbaar maken van 1) de pronuclei van levende pronucleaire cellen met inbegrip van ova en eencellige 5 bevruchte eieren, 2} het gecondenseerde DNA in de kop van spermatozoa, en 3) de kernen van embryo's voor implantatie.
Het zichtbaar maken van genetisch materiaal in dit soort levende cellen is van belang voor verder onderzoek en ontwikkeling van in vitro bevruchting en rijping, om genen en 10 kernen te kunnen overbrengen en daarop volgend kloneren van embryo’s van domesticale dieren. Tot nog toe zijn pronuclei' en sperma DNA niet gezien bij levende, levensvatbare zoogdiercellen behalve bij knaagdieren en mensen waarvan het cytoplasma in deze cellen helder is. Bij iets rijpere embryo's kan van de 15 kernen worden gezien maar omdat de cellen kleiner zijn is het niet mogelijk om de afzonderlijke kernen zichtbaar te maken.
In de veeteelt blijft men zoeken naar genetische verbetering en betere selectietechnieken. In het bijzonder bij melkvee bijvoorbeeld is de melkproduktie aanzienlijk toege-20 nomen door op grote schaal gebruik te maken van genetische super - verwekkers en kunstmatige inseminatie. Koeien produceren tegenwoordig twee keer zo veel melk als 30 jaar geleden. Verder kan genetische verbetering worden bereikt door vermenigvuldiging van super- of genetisch behandelde embryo's door kloneren.
25 Embryo's kunnen worden gekloneerd door 1) pronuclei* of nuclei in een bevruchte eicel te vervangen door donorpronuclei Of nuclei van een vroeg veelcellig embryo of 2} overbrengen van een waardevol gen in de pronucleus of nucleus.
Voor het overbrengen van genen is het nodig om de 30 pronucleus of nucleus van de ontvangercel zichtbaar te maken zodat DNA fragmenten die de gewenste gensequenties bevatten, door microteehniek rechtstreeks in een van de pronuclei of 8401137 Τ ϊ - 2 - de nucleus kunnen worden overgebracht. Anderzijds moet voor het overbrengen van nuclei de nucleus of de mannelijke en vrouwelijke pronucleï . zichtbaar worden gemaakt zodat zij uit de bevruchte cel kunnen worden verwijderd om uit gewisseld 5 te worden tegen een nucleus uit de gewenste klonale lijn. Tech nieken zoals deze waarbij genetisch materiaal wordt gemanipuleerd, zijn ontwikkeld bij onderzoek met murine embryo's waarvan het cytoplasms van de pronucleaire en embryo-cel helder is zodat het nucleaire materiaal in levende cellen door lichtmicroscopie 10 zichtbaar kan worden gemaakt.
Bij runder- en varkensgarneten alsook bij pre-implanta-tie embryocellen is de situatie totaal anders. Het cytoplasma van deze cellen is dicht en korrelig en bevat dikke vloeistof-druppeltjes. Het genetisch materiaal wordt verduisterd en kan 15 niet door lichtmicroscopie zichtbaar worden gemaakt. Gebruike lijke nucleaire kleurstoffen zijn niet-vitale kleurstoffen, dat wil zeggen dat de cellen voor het aankleuren gefixeerd en opgehelderd moeten worden. Runder- en varkensgarneten alsook pre-implantatie embryo-cellen zijn dan ook tot nog toe aan 20 gefixeerde, opgehelderde en niet-levende specimina onderzocht.
Zoals boven vermeld moet voor verbetering in genetische technieken zoals het overbrengen van genen en kernen het nucleaire of pronucleaire materiaal in levende pronucleaire of embryocellen selectief worden aangekleurd. De uitvinding verschaft 25 daartoe een werkwijze die op levende cellen kan worden toegepast en de vereiste sèlectiviteit bezit.
Met de werkwijze volgens de uitvinding is het mogelijk om mannelijke en vrouwelijke pronucleï in levende zoogdier-cellen zichtbaar te maken, zelfs in die waarin de dichtheid van 30 het celcytoplasma de pronucleï normaal donker maakt.
Het zichtbaar maken van pronucleï in levende cellen is tot nog toe niet eerder beschreven behalve voor knaagdieren humane cellen.
Verder is het met de werkwijze volgens de uitvinding 35 mogelijk om het nucleaire materiaal van veel cellige embryo's 84 0 1 1 37 w % - 3 - zichtbaar te maken waardoor het mogelijk is om het aantal cellen dat in een zich ontwikkelend embryo na elke deling aanwezig is te tellen, alsook om hét genetisch materiaal te manipuleren voor het overbrengen van genen en kernen.
5 Het zichtbaar maken wordt uitgevoerd door de levende cellen aan te kleuren met een kleurstof die specifiek is voor dubbelstrengig DNA maar zonder de levensvatbaarheid van de cel aan te tasten. Fluorescerende kleurstoffen zoals DAPI of bis-benzimidazoolverbindingen worden gebruikt. De kleurstof 10 wordt toegevoegd aan het cultuurmedium dat gameten, eencellige bevruchte eieren of meercellige embryo's bevat. Na enkele minuten incuberen kan het genetisch materiaal zichtbaar worden gemaakt door expositie aan ultraviolet licht. De pronucleaire of nucleaire strukturen verschijnen dan als gekleurde gebieden 15 in het cytoplasms. De fluorescentie'*intensiteit varieert van zeer zwak tot helder.
Door de werkwijze volgens de uitvinding worden handelingen in het laboratorium zoals het overbrengen van genen en kernen en het bestuderen van de patronen en voortgang 20 van in vitro rijping van oocyten alsook in vitro bevruchting en kweken van embryocellen vergemakkelijkt.
Met de werkwijze volgens de uitvinding is het mogelijk om de pronucleï van levende pronucleaire cellen zichtbaar te maken, en in het bijzonder om het mannelijke en 25 vrouwelijke DNA of pronucleaire materiaal van levende zoogdier- gameten en eencellige bevruchte eieren van in het bijzonder runderen en varkens zichtbaar te maken. Verder is het mogelijk om het nucleaire materiaal van meercellige embryo's zichtbaar te maken. Voorts om het genetisch materiaal en de cytoplasma-30 inhoud verschillend te kleuren.
En dit alles zonder de gezondheid en levensvatbaarheid van de levende kiemcellen en embryocellen aan te tasten en het genetisch materiaal al te zeer te beschadigen of te veranderen.
Bepaald genetisch materiaal dat met de werkwijze 35 volgens de uitvinding verschillend aangekleurd kan worden, 8401137 » -» - k - is tot nog toe bij levende cellen nooit zichtbaar gemaakt.
De fluorescerende kleurstoffen die bij de werkwij ze volgens de uitvinding worden gebruikt om het genetisch materiaal in de cellen selectief te kleuren, maken het overbodig om de cellen 5 te fixeren en te verhelderen. De selectiviteit van de Heurings- techniek volgens de uitvinding vergemakkelijkt verder onderzoek naar bevruchting, embryologische ontwikkeling en het overbrengen van genen en kernen in embryo’s van domesticale dieren.
Hoewel de werkwijze volgens de uitvinding toegepast 10 kan worden om het genetisch materiaal van elk species selectief te kleuren, is hij bij uitstek geschikt voor die species waarvan het cytoplasmamateriaal (zoals lipiden) het levende pronucleaire of nucleaire materiaal donker maakt. Daardoor is de werkwijze volgens de uitvinding van bij zonder belang voor het fokken van 15 runderen en varkens, hoewel andere domesticale dieren en andere toepassingen ook in aanmerking komen.
De werkwijze volgens deüitvinding berust op de vondst dat bepaalde fluorescerende kleurstoffen selectief kleuren zonder de gezondheid en levensvatbaarheid van cellen aan te tasten of 20 de cellen op andere wijze te beschadigen of te veranderen.
Zo genoemde "vitale kleurstoffen", dat wil zeggen kleurstoffen waarmee het niet nodig is om de cellen te fixeren en helder te maken en die de ontwikkeling van de cel niet storen, kunnen bij de werkwijze volgens de uitvinding als fluorescerende 25 kleurstoffen worden gebruikt. Verder dient de kleurstof in de cel te worden geïncorporeerd en door het dubbelstrengig DM in levende kiemcellen of embryocellen te worden opgenomen.
Bijzonder geschikt zgn fluorescerende bis-benzimidazool kleurstoffen met de formule op het formuleblad. Een aantal 30 daarvan is verkrijgbaar bij Hoechst AG, Frankfurt, Duitsland.
Vxrbeelden van deze verbindingen omvatten: 8401137
* V
- 5 -
Hoechst no. R R* 32020 CE3“liC -Cl 32021 CH^N' -0CH3
33258 CH3-N( -OH
5 333^2 CH3-ÏÏ^ -OC2H5 33662 C-H--NC -OCH- ^ch33
3^580 CH -NC -H J
^®3 38312 H-Cs -Cl 383 it h-c<; -nh2 10 Onderzoekingen door S.A. Latt et al. gepubliceerd onder de titel "Spectral Studies on 33258 Hoechst and Related Bisbenzimidazole Dyes Useful for Fluorescent Detection of Deoxyribonucleic Acid Synthesis" in Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Vol. 23, biz. 2l*-33 (1976) hebben aangetoond 15 dat de boven aangegeven verbindingen soortgelijk zijn en dat zij gebruikt kunnen worden voor het aantonen van DNA synthese in somatische cellen.
Uit de onderstaande voorbeelden blijkt dat de Hoechst kleurstoffen 33258 en 3331*2 geschikt zijn voor toepassing 20 bij de werkwijze volgens de uitvinding. De Hoechst kleurstof no. 33258 is 2-/ 2-(l*-hydroxyfenyl)-6-benzimidazoyl7“ 6-(1 -methyl-l*-piperazyl)-benzimidazool en de Hoechst kleurstof no. 333l*2 is 2-/ 2-(l*-ethoxyfenyl)-6-benzimidazoyl7-6-( 1-eth.yl-l*-piperazyl)-benzimidazool. Verwacht mag worden dat de 25 verwante bis-benzimidazoolverbindingen ook geschikt zijn voor het selectief zichtbaar maken van genetisch materiaal in levende kiemcellen of embryocellen.
Van de twee onderzochte verbindingen bleek de Hoechst kleurstof no. 333l*2 aanzienlijk beter dan de Hoechst 30 kleurstof no. 333258 zodat eerst genoemde kleurstof bij voorkeur bij dewerkvijze volgens de uitvinding wordt toegepast. Het is echter gebleken dat celen van verschillende diersoorten 8401137 f » - 6 - de kleurstoffen in verschillende mate opnemen. Zo wordt bijvoorbeeld de Hoechstkleurstof no. 33258 snel opgenomen door muizen embryocellen maar nogal langzaam door runder embryocellen.
Andere fluorescerende kleurstoffen die aan de 5 boven aangegeven voorwaarden voldoen, dat wil zeggen DNA- bindende fluorchroomkleurstoffen die als vitale kleurstoffen gebruikt kunnen worden, zijn eveneens geschikt voor toepassing bij de werkwijze volgens de uitvinding. Voorbeelden daarvan zijn DAPI (V,6-diamidino-2-fenylindool) en DIPI (een soortgelijke 10 verbinding als DAPI).
De werkwijze volgens de uitvinding om genetisch materiaal in gameten of embryocellen te kleuren wordt in het algemeen uitgevoerd door de cellen met een geschikte fluorescerende kleurstof in aanraking te brengen, te incuberen en daarna 15 te bestralen met ultraviolet licht. De hoeveelheid kleurstof en de incubatietijd zijn afhankelijk van onder andere de . gebruikte kleurstof en de bedoeling van het zichtbaar maken.
Geen valse positieven zijn gevonden, dat wil zeggen dat geen andere materialen dan nucleair of pronucleair DMA aan-20 merkelijk worden aangekleurd. Wel treedt bij overmatig aangekleurde cellen enige achtergrond kleuring op. Valse negatieven zijn wel gevonden, dat wil zeggen dat sommige cellen waarin met andere methoden nuclei of pronucleï werden aangetoond, niet fluoresceerden. Maar dit zal de bruikbaarheid van de werkwijze volgens 25 de uitvinding in het laboratorium of in de industrie niet storen of ongunstig beïnvloeden.
Eicellen (oocyten), eencellige bevruchte eieren of pre-implantatie embryo'sworden verkregen uit geslachtsrijpe vrouwelijke dieren volgens gebruikelijke methoden die de 30 gezondheid van de cellen niet aantasten. Spermacellen (sperma- tozoën) worden verkregen uit het ejaculaat van geslachtsrijpe mannelijke dieren of afgezonderde testes, epididymis of een gedeelte van het afvoerkanaal. Kiemcellen of gameten (oo'cyten en spermatozoën) zijn haploïde cellen die met een eicel een bevruchte 35 cel vormen. De bevruchte eicel (die de mannelijke en vrouwelijke 84 0 1 1 3 7 m i.
- T - pronuclel Devat) ondergaat syngamie (vereniging van de mannelijke en vrouwelijke pronucleï tot een zygoot nucleus) gevolgd door een aantal celdelingen. Tijdens een aantal mitotische delingen ontwikkelt het embryo zich via het morula-stadium tot 5 het blastocyst-stadium waarbij weefseldifferentiatie en speciali satie optreden. Dit leidt tenslotte tot de vorming van de foet us en placenta die dan in de uteruswand worden geïmplanteerd.
Het is op het embryo in de pre-implantatiestadia alsook op de kiemcellen en eencellige bevruchte eicellen waarop 10 de werkwijze volgens de uitvinding op de eerste plaats van toepassing is. Deze zeer vroege cellen zijn het onderwerp van intensief onderzoek. Bij het overbrengen van genen en kernen waarvan in het bovenstaande sprake, worden bevruchte eicellen en vroege embryocellen gebruikt. Deze techniek is ook voor 15 ander embryologisch onderzoek geschikt gebleken. Hij heeft bijvoorbeeld onderzoekers in staat gesteld om de ontwikkeling van in vitro bevruchte eicellen, de symmetrie van nucleaire en cytoplasmatische deling, het verschijnen van een eenkem in elk blastomeer, het aantal cellen in het embryo na elke 20 deling, etc. te bestuderen. Daarnaast is deze techniek ook geschikt voor het bestuderen van de gezondheid en motiliteit van spermatozoën.
De kiemcellen of embryocellen worden bij voorkeur in een cultuurmedium gebracht waarin de gezondheid en levens-25 vatbaarheid van de cellen behouden blijven. Dergelijke cultuur- media voor een bepaalde toepassing zoals voor cellen van een bepaalde diersoort en in een bepaald ontwikkelingsstadium zijn algemeen bekend en voorbeelden van geschikte media zijn in de onderstaande voorbeelden gegeven. Sperma kan worden onderzocht 30 in zaad, in zaad met gebruikelijke verdikkingsmiddelen zoals eierdooier of melkstremsel, of in het cultuurmedium.
De kleurstof wordt bij voorkeur als een oplossing gebruikt. Daarmee kan de dosering nauwkeurig worden geregeld en is het mogelijk om zeer verdunde kleurstofoplossingen te 35 gebruiken. Aangenomen wordt dat met lage doses de kans op 8401137 £ ·¥ - 8 - genetische beschadiging van de cel kleiner is,
Een voorraadoplossing van de kleurstof kan worden "bereid met elk geschikt oplosmiddel dat de levende cellen niet aantast. Voorbeelden daarvan omvatten Dulbecco's fosfaat 5 gebufferde zoutoplossing, TALP, Whittens of Eagles medium, of elk ander medium of oplosmiddel waarin de cellen hun levensvatbaarheid behouden. De voorraad oplossing wordt bij voorkeur bij koelkasttemperatuur, in het bijzonder ongeveer 0-^°C, bewaard om de kans op verontreiniging zo klein mogelijk te 10 maken. Vriestemperatuur dient te worden vermeden omdat dan de zouten uit de oplossing kunnen neerslaan.
De voorraad-kleurstofoplossing kan op elke gewenste sterkte worden ingesteld. Met een sterke oplossing wordt het genetisch materiaal in een korte tijd gekleurd terwijl met een 15 zwakke oplossing een langere incubatietijd nodig is voordat het materiaal fluoresceert. Bovendien is de snelheid waarmee de kleurstof wordt opgenomen afhankelijk van de diersoort, waarbij runder- en varkenscellen een veel langere incubatietijd nodig hebben dan murinecellen. Lage doseringen van de kleurstof 20 hebben zoals gezegd de voorkeur omdat dan de gezondheid en levensvatbaarheid van de cellen behouden blijven.
Met bijvoorbeeld een voorraadoplossing van 20 jxg kleurstof per ml Dulbecco's gebufferde zoutoplossing is maar 1 jü. in jOl medium (50 yul totaal volume ) dat eencellige 25 muizen embryocellen bevat, nodig om een scherpe fluorescentie van pronucleï en tenminste een polair lichaampje binnen 15 min. te verkrijgen. Eencellige ruhderembryocellen aangekleurd met 20 ^ig/ml voorraad oplossing in een dosis van 2 jxL· in ^8 yul cultuurmedium dat· de embryocellen bevat, geven binnen 30 min.
30 fluorescerende polaire lichaampjes terwijl de pronucleï niet na eerder dan/1-2 uren zichtbaar worden. Uit de onderstaande voorbeelden blijkt dat de dosering en incubatietijd aan het experiment of aan andere doeleinden kunnen worden aangepast.
De aangekleurde strukturen kunnen microscopisch 35 zichtbaar worden gemaakt door bestralen met ultraviolet licht.
8401137 » ·«.
- 9 -
Licht met een exeitatiegolflengte van ongeveer 350 nm en emissie van ongeveer h60 nm is geschikt. De kernen en pronuclei verschijnen als blauw gekleurde regio's in het celcytoplasma. Spermaceilen hebben geen discrete pronuclei; het DM is 5 verdicht en verzameld in de kop van de spermatozoën waarin het met de werkwijze volgens de uitvinding zichtbaar kan worden gemaakt. Waar sprake is van pronuclei wordt mede bedoeld het sperma-DM tenzij andere vermeld. Afhankelijk van de door het DM opgenomen hoeveelheid kleurstof, die bepaald wordt door 10 de dosis en tijd, varieert de fluorescentieintensiteit van zeer zwak tot helder.
In de hierna volgende voorbeelden werden de volgende voorraadoplossingen en cultuurmedia gebruikt,
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DFGZ) 15 Samenstelling:
Oplossing 1 8,00 g NaCl 0,20 g KC1 1,15 g WagHPO^ 0,20 g KH2P0^ 20 800,00 ml gedeioniseerd gedestilleerd water
Oplossing 2 0,1 g CaClg 100,0 ml gedeioniseerd gedestilleerd water
Oplossing 3 0,1 g MgClg ^ 100,0 ml gedeioniseerd gedestilleerd water
Elke oplossing werd afzonderlijk 20 min. verhit bij 120-125°G en daarna afgekoeld. De drie oplossingen werden in een 1 liter kolf gemengd en het volume werd met in een autoclaaf 30 gedeioniseerd gedestilleerd water aangevuld tot 1 liter.
Hierna werd de DFGZ voorraadoplossing in een koelkast bewaard bij ongeveer k°C.
Alvorens met de DFGZ voorraadoplossing cellen te wassen werd eerst per 100 ml 5 mg (0,1 ml) gentamycine-sulfaat- 35 voorraadoplossing toegevoegd. Deze bevatte 50 mg gentamjrcine- 8401137 4 * - 10 - SQ^/ml NaCl.
Bereiding van voorraadonlossingen Voorraad-kleurstofoplossingen van Hoechst no. 3331+2 werden bereid in de volgende concentraties:
5 10 ^ig/ml DFGZ
20 ^ïg/ml DFGZ 60 ^ig/ml DFGZ
Voorraad-kleurstofoplossingen van Hoechst no. 33258 werden bereid in de volgende concentraties:
10 10 jig/mL DFGZ
20 yj.g/ml DFGZ
De voorraad kleurstofoplossingen werden bewaard bij 1+°C.
TALP (Tyróde-Albumine-lactaat-Pyruvaat) medium ^ Samenstelling: hoeveelheid
NaCl 9,210 g/l water KC1 1,237 g/100 ml water
CaClg (211^0) 1,332 g/100 ml water
MgCl2 (6H20) 2,1+36 g/100 ml water 20 NaHC03 1,1+03 g + 1 mg/100 ml water fenolrood glucose 5,310 g/100 ml water
Na lactaat 1,0 ml DL-melkzuur*
NaHgPO^ (H20) 28,0 mg** 2^ *DL-melkzuur, natriumzout als 60 %-ige siroop (Sigma Chemical Co.). 1,0 ml melkzuursiroop werd in 35 ml water geroerd totdat het was opgelost. Eén druppel fenolrood werd toegevoegd. De pH werd met natriumhydroxyde op ongeveer 7,1+ ingesteld (uit schiet en kan worden gecorrigeerd door een klein druppeltje lactaat toe te voegen).
**28 mg NaHgPO^ (ïïgO) werd met 10 ml van de aldus bereide glucose voorraadoplossing gemengd.
De componenten voor elke voorraad oplossing werden gemengd en het mengsel werd over Millipore (0,22 poriengrootte) 8401137 V ^ - 11 - \ gefiltreerd in steriele flessen die bij ongeveer k°C werden weggezet in een koelkast.
Het TALP medium werd bereid door mengen van de volgende hoeveelheden voorraadoplossingen ï 5 Voorraad concentratie concentratie hoeveelheid oplossing voorraadop- in medium _lossing_
NaCl 157,0 mM Πί+,00 mM tot 100 ml KC1 166,0 mM 3,16 mM 1,90 ml'
CaCl0 (2Ho0) 120,0 mM 2,00 mM 1,70 ml 10 d d
MfeGlg (6H20) 120,0 mM 0,50 mM 0,1+1 ml
HaflCO^ 167,0 mM 25,00 mM 15,00 ml ITeHgPO^ (HgO) 20,5 mM 0,35 mM 7 1,70 ml
glucose 295,0 mM 5,00 vMJ
Ha lactaat 150,0 mM 10,00 mM 6,70 ml ^ De aangegeven hoeveelheden werden gemengd samen met voldoende HaCl om het eindvolume op 100 ml te brengen waarna 6,5 mg penicilline (100 I.U./ml) en 1,0 mg fenolrood werden toegevoegd. Het mengsel werd over Millipore (0,22 ji poriengrootte) gefiltreerd in een steriele fles.
20
Op de dag van gebruik werd het TALP medium afhankelijk van het beoogde gebruik als volgt gesupplementeerd: 1) Bevruchtingsmedium 6 mg runderserum albumine (RSA) (afkomstig van Sigma
Chemical Co., vetzuurvrij) en 10 ul natriumpyruvaat·*voorraad- 25 ' oplossing werden per ml TALP toegevoegd waarna werd gefiltreerd over Millipore.
2) Rij ningsmedium
Aan 4,5 ml TALP werden 500 jü. fetaal runderserum (10 %}, 50 jjlL natriumpyruvaat«voorraadoplossing en 10 mg FSH/ml 30 TALP toegevoegd waarna werd gefiltreerd over Millipore.
8401137 - ·> - 12 -
Whittens medium
Samenstelling; Hoeveelheid
NaCl 51M mg KC1 3β,0 mg 5 KHgPO^ 16,0 mg
MgS02 (7H20) 29,0 mg
NaHCO 190,0 mg
Ha Pyruvaat 3,5 mg
Ca lactaat (5H20) 53,0 mg 10 glucose 100,0 mg 1 K penicilline 8,0 mg
Streptomycine-SO^ 5,0 mg
Het medium werd bereid door de componenten in een 100 ml kolf te brengen en 0,37 ml 60 $-ige natriumlactaatsiroop 15 (afkomstig van Sigma Chemical Co.) en 0,1 ml \ % fenolrood toe te voegen. Na aanvullen met gedeioniseerd gedestilleerd water tot 100 ml werd het medium gefiltreerd over Millipore (0,22 jx poriengrootte) en bewaard bij 4°C. Op de dag van gebruik werd het medium gesupplementeerd met 1,5 mg ESA/ml 20 (afkomstig van Sigma Chemical Co.).
Voorbeeld I
In dit voorbeeld werden muizenembryo’s gebruikt om de specificiteit van de kleurstof voor genetisch materiaal in levende eencelembryo's aan te tonen omdat muizepronucleï ' 25 zichtbaar zijn in ongekleurde toestand. De embryo’s werden verkregen uit geslachtsrijpe vrouwtjesmuizen die de nacht te voren waren bevrucht. De dieren werden gedood door cervicale dislokatie en de eierstokken en eierleiders werden verwijderd.
De eierleiders werden open gelegd en eencelembryo’s werden 30 weggenomen door een uitgestulpte regio in de eierleiderwand te punkteren met fijne naalden en scharen. De cumuluscellen werden verwijderd door in de regio van de opengelegde eierleider 100-200 yjl hyaluronidase oplossing (10 mg/ml DFGZ) op te brengen en daar 10 min. te laten zitten. De eencelembryo’s 35 werden gewonnen door pipetteren en 3 keer gewassen met een 84 01 1 3 7 * 5 - 13 - oplossing van 3 mg RSA/mi DFGZ (RSA afkomstig van Sigma Chemical Co.) alvorens toe te voegen aan Whittens medium.
Druppels Whittens medium werden op een kweekplaat van kunststof gebracht en gekrast om ze aan de plaat te laten 5 hechten waarna ze werden bedekt met olie. De êêncelembryo's werden in de druppels gelegd. De pronucleï werden zichtbaar gemaakt met een lichtmicroscoop alvorens met de werkwijze volgens de uitvinding te worden aangekleurd.
Voor het aankleuren werd de voorraadoplossing van 10 Hoechst no. 333½ met een concentratie van 20 jig/ml gebruikt.
De dosering bedroeg 0, 1, 2, 5 en 10 ^il voorraadoplossing bij een totaal volum^ediumrembryo-kleurstof van 50 jiL per druppel. Daarvoor moesten de medium-embryodruppels in verschillende grootte worden verdeeld, dat wil zeggen volumina van k9 jü.
15 medium-embryo voor 1 jil kleurstof, k8 jü. medium-embryo voor 2 ƒ11 kleurstof etc. De embryo's werden in 5 % kooldioxyde bevattende lucht aangekleurd bij 37°C en een pH 7,2. Zij werden in de kleurstof zichtbaar gemaakt.
De pronucleï en polaire lichaampjes van de êêneel 20 muize-embryo's werden zichtbaar gemaakt met behulp van een
Nikon epi-fluorescentiesysteem no. TMD-EF voor Inverted Microscope DIAPHQT-TMP (Nikon). Bij dit systeem wordt een hoge druk kwiklamp gebruikt. De gebruikte uy filters waren van Nikon. Met dit systeem kan tegelijkertijd met licht en 25 door fluorescentie zichtbaar worden gemaakt zodat het mogelijk was om de regio's van fluorescentie positief als pronucleï en polaire lichaampjes te herkennen.
Alle aldus aangekleurde 66 embryo's vertoonden duidelijke fluorescentie van zowel pronucleï als tenminste 30 éên polair lichaampje binnen 15 min. na het begin van aan kleuren ongeacht de dosis. In de meeste gevallen was slechts êên polair lichaampje te zien omdat het tweede met verloop van tijd degenereert.
Hierna werden 2k êéncel muizen-embryo' s op dezelfde 35 wijze aangekleurd met alleen de kleinste dosis kleurstof· 8401137 - 1U - V * van 1 ƒx1 op U9 ƒx1 medium-embryodruppel. Binnen 5 min. vertoonden 23 van de 2b fluorescentie.
Voorbeeld II
Voorbeeld I werd herhaald met êencel hamsterembryo’s 5 die werden aangekleurd met 10yxl kleurstof oplossing per 50 ƒx1 totaal druppelvolume. Het eerste gekleurde polaire lichaampje na verscheen/15 min. De pronucleï fluoresceerden pas na 30 min.
Voor het volledig zichtbaar maken van de twee pronucleï en tenminste êén polair lichaampje in elke cel waren b5 min.
10 npdig. Evenals in voorbeeld I kleurden beide polaire lichaampjes
niet altijd.-Voorbeeld III
Voorbeeld I werd herhaald met gerijpte runderoocyten in het eencel en tweecel stadium. De eierstokken kwamen uit een 15 slachthuis. De oocyten werden uit de follifeels gezogen. De cumuluscellen werden verwijderd alvorens aan te kleuren met hyaluronidase en pipetteren zoals in voorbeeld I.
Enkele oocyten werden gebruikt voor aankleuren en enkele voor in vitro bevruchting. De oocyten werden 2b uren 20 geincubeerd bij 39°C in TALP rijpingsmedium en daarna geincubeerd met stiere-ejaculaat in TALP bevruchtingsmedium.
Eencellige bevruchte cellen werden 2b uren na het incuberen gewonnen, gewassen met DFGZ-gentamycine-oplossing en opnieuw gesuspendeerd in vers TALP bevruchtingsmedium.
25 Tweecel embryo’s werden op dezelfde wijze geprepareerd maar k8 uren na incuberen met sperma in bevrucht ingsmedium gewonnen en daarna gewassen en opnieuw gesuspendeerd in vers bevruchtingsmedium.
Voor het aankleuren werd de voorraadoplossing van 30 Hoechst no. 333^2 met een concentratie van 20 ^ig/ml DFGZ gebruikt.
De dosering bedroeg 2 en 5 ƒx1 per 50 ƒx1 totaal volume medium-embryp-kleurstof. De kleurstof-cultuurmengsels werden geincubeerd bij 39°C, opgebracht op glasplaatjes en afgedekt, en zichtbaar gemaakt onder omgevingsomstandigheden.
35 Binnen 30 min, na het aankleuren werden polaire 8401137 3 ·.
- 15 - lichaampjes zichtbaar. De pronucleï van de oocyten en ééncel embryo's en de nuclei van de tweecel embryo's werden na 1-2 uren of langer zichtbaar.
Voor een controle op het aanwezige chromatine werden 5 de gekleurde cellen gefixeerd en opgehelderd. De plaatjes met de gekleurde embryo's en oocyten werden in Coplinflessen gebracht die ongeveer Uö ml van een 1:3 (vol./vol.) mengsel van azijnzuur en ethanol bevatten en 'snaehts bij kamertemperatuur werden weggezet om de cellen te laten ophelderen.
10 Chromatine werd aangekleurd met 1 gew./vol. % aceto-orcexne (1 % orceine kleurstof in een kO:6o oplossing van azijnzuur in water). Het chromatine werd zichtbaar gemaakt met een lichtmicroscoop onder gebruikmaking van ïlemarsky en fase-optiek.
Vastgesteld werd dat ongeveer 15 % oocyten en vroege 15 eencelembryo*s metafaseplaatjes of pronucleï bevatten hoewel zij na het aankleuren niet hadden gefluoresceerd. De tweecel embryo's daarentegen vertoonden allen fluorescentie van de nucleus. De kleurstof gaf geen enkel vals positief; Blijkens het onderzoek volgens de tweede methode bevatten alle fluores-20 cerende embryo's chromatine.
Het chromatine was in êén van de volgende vormen aanwezig: 1) verstrooid of als metafaseplaatjes voor oocyten (met inbegrip van germinalqAresicae voor de onrijpe oocyten), 2) pronucleï voor bevruchte eicellen, 3)nucleï voor ernbryo-25 cellen, of ^gecondenseerde spermakoppen die de oocyt waren binnengedrongen maar geen normale deeondensatie hadden ondergaan tot de mannelijke pronucleus.
Voorbeeld IV
Voorbeeld III werd herhaald met varkens-oöcyt en, 30 eencellige bevruchte eieren en tweecel-/viercelembryo's.
De oocyten waren verkregen uit bevruchte zeugen door chirurgisch spoelen van de eierleiders en werden gesuspendeerd in TALP rijpingsmedium. Voor het aankleuren werd de voorraad-oplossing van Hoechst no. 333^2 met een concentratie van 35 60 yig/ml gebruikt overeenkomstig voorbeeld I in doses van 840 1 1 37 - 16 - 0, 1, 5 en 1Q yul per 50 yul totaal volume medium- embryo-kleurstof. De mengsels werden 3 uren bij 39°C geincubeerd.
De metafaseplaatjes en polaire lichaampjes in de niet-bevruchte en bevruchte oocyten kleurden zeer duidelijk 5 maar de pronuclei minder duidelijk. Bovendien fluoresceerden de spermakoppen die in de oocyten waren binnengedrongen. De nuclei v in de tweecel- en viercelembryo's vertoonden zeer duidelijke fluorescentie. De dosis van 10 yul gaf een sterke acht ergrondkleur ing.
10 De gekleurde cellen werden gefixeerd en opgehelderd zoals in voorbeeld III maar opgehelderd in een mengsel van azijnzuur en ethanol gedurende U8 uren. De resultaten waren soortgelijk als in voorbeeld III. Ongeveer Uo % oocyten en éêncelembryo's fluoresceerden niet, hoewel geen valse positieven 15 werden waargenomen. De meercelembryo’s werden routinematig met de Hoechstkleurstof aangekleurd.
Voorbeeld V
De in vitro ontwikkeling van met de Hoechst kleurstof no. 333k2 aangekleurde embryo's werd onderzocht aan muizen-20 embryo's in het tweecelstadium en morulastadium. De embryo's varen verkregen en geprepareerd zoals in voorbeeld I. Voor het aankleuren werd een dosis gebruikt van 10 yiL kleurstof-oplossing (20 ug/ml concentratie, resulterend in een dosis van 0,2 yug per 50 yul totaal druppelvolume).
25 De embryo's werden 15 min. met de kleurstof in aanraking gehouden. Hierna werden zij 3x met DFGZ-gentamycine-oplossing gewassen en vervolgens gekweekt in Whittens medium.
Van de 2β aangekleurde tweecel muize-embryo's ontwikkelden er zich 16 (65 %) tot het morula-stadium. Dit laat 30 zich vergelijken met 21 van 26 niet-aangekleurde controles (80 %), dat wil zeggen 15 min. geincubeerd met 10 yul alleen DFGZ.
Bij aankleuren van embryo's in het morulastadium ontwikkelden zich 23 van de Uk (51 %) tot blastocysten tegen 35 23 van de 31 (7k %) controles (alleen DFGZ).
84 0 1 1 3 7 ® - 17 -
Voorbeeld VI
Voorbeeld I werd herhaald met de Hoechst kleurstof 33258 met concentraties van 10 en 20 yig/mlvoor het aankleuren van êêncel muizeembryo's. De doses bedroegen 0, 5 en 10 jjI per 5 50 yul totaal volume mediumrembryo-kleurstof. Het aankleuren van de embryo’s werd 30 min. onder omgevingsomstandigheden uitgevoerd.
Bij het zichtbaar maken fluoresceerden de pronucleï en polaire lichaampjes en dat deze het waren kon worden bevestigd door lichtmicroscopie zoals in voorbeeld I. Verder gaf bij routine-10 /matig aankleuren de dosis van 10 jü. geen achtergrondkleuring. Voorbeeld VII
Hunderspermatozoën werden aangekleurd met de Hoechst kleurstof no. 333^2*om de sperma mobiliteit en het patroon van de sporen te volgen. Vers stiere-ejaculaat werd gewassen met 15 DFGZ en gecentrifugeerd. De gevormde pellet werd gesuspendeerd •in TALP medium en aangekleurd met de Hoechst kleurstof 333^2 met een concentratie van 20 ^ig/ml in een dosis van 3 yul/50 yUl.
Het mengsel van medium, sperma en kleurstof werd 15 min. geincubeerd bij 39°C.
20 Ha het aankleuren werd het sperma zichtbaar gemaakt met het Nikon fluorescentiesysteem zoals beschreven in voorbeeld I. Het kleur-tijdsverloop werd met een camera in het optisch gedeelte van de microscoop vastgelegd bij een expositie-tijd van ongeveer 10-20 sec. De door het fluorescerend DM 25 gevormde sporen op de ontwikkelde foto’s werden onderzocht op snelheid en patroon van sperma-motiliteit. De procedure werd herhaald onder toevoeging van cumulus-oóeytcomplexen aan het medium en de foto ’ s werden onderzocht op liet effekt van deze cellen op de snelheid en het patroon van sperma motiliteit.
30 Voorbeeld VIII
In dit voorbeeld werd de deling van varkenembryo ’ s in verschillende stadia onderzocht. De embryo's waren verkregen uit de reproduktieve tractus van zeugen met superovulatie 18-120 uren na het begin van oestrus. De na 35 slachten verkregen reproduktieve tractus werd gespoeld in het 8401137 - 18 - laboratorium om de embryo's te verwijderen. Het stadium waarin een deze verkeerden varieerde van /: cel (48 uren) tot meercel morula (120 uren). Na 2x wassen met een DFGZ-RSA oplossing werden de embryo's aangekleurd en gekweekt in Whittens medium 5 en ter controle zonder aankleuren gekweekt in voomoemd medium.
Voor het aankleuren werd de Hoechst kleurstof no. 333^2 met een concentratie van 60 yag/ml gebruikt.
De embryo's werden 1 uur bij 39°C geincubeerd in 1, 5 en 10 ^lL kleurstofoplossing per 50 jü. totaal volume embryo-,10 medium-kleurstof. Hierna werden zij 3x 30 min. gewassen met schoon DFGZ (1,5 mg/RSA/ml) en daarna 2b uren gekweekt in Whittens medium (1,5 mg/RSA/ml). Na afloop werd onderzocht hoe zij zich hadden ontwikkeld (voltooiing splijting-deling).
De resultaten zijn in de onderstaande tabel vermeld.
15 Tabel
Stadium Dosis_ controle 1 ^1 5 yol 10 ^il éêncel of tweecel 6/12(50 %) - ' 2/llj-(ll$) 1/12(8,3$) viercel 28/36(Tt%) 17/27(62$) 1^/37(37$) 20 meercel 15/16(9^) 13/23(56$) 84 0 1 1 3,7
Claims (36)
1. Werkwijze voor het aankleuren van DNA in levende kiemcellen, eencellige bevruchte eicellen en pre-inplantatie embryoeellen, met het kenmerk dat, de cellen worden aangekleurd 5 met een fluorescerende kleurstof en geincübeerd totdat het DNA fluoresceert bij bestralen met ultraviolet licht.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de cellen zich in een cultuurmedium bevinden.
3· Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk 10 dat, het aankleuren wordt uitgevoerd met DAPI, DIPI of een bis-benzimidazoolverbinding. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk dat, het aankleuren wordt uitgevoerd met een oplossing van de kleurstof. 15 5· Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk dat, het aankleuren wordt uitgevoerd met een hoeveelheid kleurstof van ongeveer 0,001-10 ^ig per 50 yal cultuur van de cellen.
6. Kiemcellen, eencellige bevruchte eicellen en 20 pre-implantatie embryoeellen, met het kenmerk dat, het DNA in de cellen is aangekleurd met de werkwijze volgens conclusie 1. 7» Cellen volgens conclusie 6, met het kenmerk dat, het DNA in de cellen is aangekleurd met DAPI, DIPI of een bis-benzimidazoolverbinding.
8. Cellen volgens conclusie 7, met het kenmerk dat, het DNA in de cellen is aangekleurd met een oplossing van de kleurstof. 9» Cellen volgens conclusie 7S met het kenmerk dat, het DNA in de cellen is aangekleurd met ongeveer 0,001 - 10yug 30 kleurstof per 50 yul cultuur van de cellen.
10. Levende cel of kloon, met het kenmerk dat, deze af stamt van een cel volgens conclusie 6.
11. Werkwijze voor het aankleuren van pronucleï in levende pronucleaire zoogdiercellen, met het kenmerk dat, 8401137 / ^ - 20 - de cellen worden aangekleurd met een fluorescerende kleurstof en geincubeerd totdat de pronucleï fluoresceren,
12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk dat, eencellige bevruchte eicellen van runderen of varkens 5 worden aangekleurd.
13. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk dat, de cellen zich in een cultuurmedium bevinden.
14. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk dat, de cellen worden aangekleurd met DAPI, DIPI of een 10 bis-benzimidazoolverbinding.
15· Werkwijze volgens conclusie 1^, met het kenmerk dat, de cellen worden aangekleurd met een oplossing van de kleurstof.
16. Werkwijze volgens conclusie 1^+, met het kenmerk 15 dat, de cellen worden aangekleurd met ongeveer 0,0Q1-10^ug kleurstof per druppel van 50 jxL cultuur van de cellen.
17· Levende pronucleaire zoogdiercel, met het kenmerk dat, de pronucleus daarin is aangekleurd met de werkwijze volgens conclusie 11,
18. Levende cel of kloon, met het kenmerk dat, deze afstamfc van een cel volgens conclusie 17·
19. Werkwijze voor het verwijderen van genetisch · materiaal uit levende kiemcellen, eencellige bevruchte eicellen pf pre-implantatie embryocellen, met het kenmerk dat, 25 a) de cellen worden gesuspendeerd in een medium, b) de suspensie in aanraking wordt gebracht met een fluorescerende kleurstof, c) de cellen worden geincubeerd totdat het genetisch materiaal fluoresceert bij bestralen met ultraviolet licht, en d) het genetisch materiaal uit de cellen wordt verwijderd.
20. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk dat, de pronucleaire cellen eencellige bevruchte eicellen van runderen of varkens zijn.
21. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk dat, de cellen worden aangekleurd met DAPI, DIPI of een 35 bis-benzimidazoolverbinding. 8401137 -21 - «r. \ »
22. Werkwijze volgens conclusie 21, met het kenmerk dat, de cellen worden aangekleurd met een oplossing van de kleurstof.
23. Werkwijze volgens conclusie 21, met het kenmerk 5 dat, de cellen worden aangekleurd met ongeveer 0,001-10yug kleurstof per druppel van 50 jlL cultuur van de cellen. 2k. Genetisch materiaal, met het kenmerk dat, het materiaal is geïsoleerd met de werkwijze volgens conclusie 19.
25. Werkwijze voor het overbrengen van genetisch materiaal in pronucleï van levende pronucleaire zoogdiercellen, met het kenmerk dat, a) de cellen worden aangekleurd met een fluorescerende kleurstof, b) worden geincubeerdtotdat de pronucleï fluoresceren, en c) het genetisch materiaal wordt 15 overgebracht in een pronucleus of pronucleaire cel.
26. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk dat, de pronueelaire cellen eencellige bevruchte eicellen van runderen of varkens zijn.
27. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk 20 dat, de cellen zich in een cultuurmedium bevinden.
28. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk dat, de cellen worden aangekleurd met DAPI, DIPI of een bis-benzimidazoolverbinding.
29. Werkwijze volgens conclusie 28, met het kenmerk 25 dat, de cellen worden aangekleurd met een oplossing van de kleurstof.
30. Werkwijze volgens conclusie 28, met het kenmerk dat, de cellen worden aangekleurd met ongeveer 0,001 - 10yig kleurstof per druppel van 50 ^il cultuur van de cellen.
31. Levende cel met veranderd genetisch materiaal, met het kenmerk dat, in de cel genetisch materiaal is gebracht met de werkwijze volgens conclusie 25.
32. Levende cel of kloon, met het kenmerk dat, deze af stamt van een cel volgens conclusie 31.
33. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk 8401137 ί - 22 - dat, het genetisch materiaal is geïsoleerd door a) de cellen die het genetisch materiaal bevatten aan te kleuren met een fluorescerende kleurstof, b) te incuberen totdat het genetisch materiaal fluoresceert, en c) het genetisch materiaal uit de 5 cellen te verwijderen. 3U. Werkwijze volgens conclusie 33, met het kenmerk dat, de cellen worden aangekleurd met DAPI, DIPI of een bis-benzimidazoolverbinding.
35. Werkwijze volgens conclusie 3^, met het kenmerk 10 dat, de cellen worden aangekleurd met een oplossing van de kleurstof.
36. Werkwijze volgens conclusie 3^, met het kenmerk dat, de cellen worden aangekleurd met ongeveer 0,001 - 10 jig per 50 jü. cultuur van de cellen die het genetisch materiaal 15 bevatten. 37« Fluorescerend DNA in levende kiemcellen, eencellige bevruchte eicellen en pre-implantatie embryocellen, met het kenmerk dat, de cellen zijn aangekleurd met een fluorescerende kleurstof en geincubeerd totdat het DNA 20 fluoresceert bij bestralen met ultraviolet licht.
38. Fluorescerend DNA volgens conclusie 37 > met het kenmerk dat, voor het prepareren van het fluorescerend DNA levende eencellige bevruchte eicellen van runderen of varkens zijn gebruikt en dat het fluorescerend DNA de pronucleï 25 van de cellen bevat.
39· Fluorescerend DNA volgens conclusie 37, met het kenmerk dat, het fluorescerend DNA is verkregen door de cellen aan te kleuren met DAPI, DIPI of een bis-benzimida-zoolverbinding. 30 ho. Fluorescerend DNA volgens conclusie 39, met het kenmerk dat, het fluorescerend DNA is verkregen door de cellen aan te kleuren met een oplossing van de kleurstof. M. Fluorescerend DNA volgens conclusie 39, met het kenmerk dat, het fluorescerend DNA is verkregen door 35 de cellen aan te kleuren met ongeveer 0,001 - 10 yag per 8401137 \ - 23 - 50 pl. cultuur van de cellen.
42. Werkwijze voor het fotografisch weergeven van de beweging en het patroon van sporen van spernatozoën» met het kenmerk dat, a) spermacellen worden aangekleurd met 5 een fluorescerende kleurstof, b) worden geincubeerd totdat het DNA in de spermakoppen fluoresceert bij bestralen met ultraviolet licht, en c) het kleur- tijdsverloop in de fluorescerende sperma fotografisch wordt vastgelegd.
43. Werkwijze volgens conclusie 42, met het kenmerk 10 dat, de spermacellen worden aangekleurd met DAPÏ, DIPI of een bis-benzimidazoolverbinding.
44. Werkwijze volgens conclusie 43, met het kenmerk dat, de spermacellen worden aangekleurd met een oplossing van deKLeurstof. 15 45· Werkwijze volgens conclusie 43, met het kenmerk dat, de spermacellen worden aangekleurd met ongeveer 0,001-10 yug kleurstof per 50 pl zaad, verdikt zaad of cultuursuspensie van het zaad.
46, Werkwijze voor het vergelijkingsgewijs onder-20 zoeken van de motiliteit en het patroon van sporen van spermatozoën, met het kenmerk dat, het onderzoek wordt verricht aan een fotografische weergave verkregen met de werkwijze volgens conclusie 42 om de kwalitatieve of kwantitatieve aspecten van het sporenpatroon vast te stellen. 25 4j. Werkwijzen en daarbij verkrijgbare of verkregen materiële resultaten zoals beschreven in de werkwijze en voorbeelden. 8401137 1-· R N—r^Jf V ^·Ν\ λ-^ VO-*’ H w H 8401137 Neal Lloyd First, Madison, Wisconsin, Yer.St.v.Amerika Elizabeth Shea Critser, Madison, Wisconsin, Ver.St.v.Amerika Jan Karlotta Lohse, Madison, Wisconsin, Ver.St.v.Amerika
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52062983A | 1983-08-05 | 1983-08-05 | |
| US52062983 | 1983-08-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8401137A true NL8401137A (nl) | 1985-03-01 |
Family
ID=24073420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8401137A NL8401137A (nl) | 1983-08-05 | 1984-04-10 | Werkwijze voor het zichtbaar maken van genetisch materiaal. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPH07104341B2 (nl) |
| AU (1) | AU581409B2 (nl) |
| CA (1) | CA1271716A (nl) |
| CH (1) | CH669670A5 (nl) |
| DE (1) | DE3427553C2 (nl) |
| FR (1) | FR2550218B1 (nl) |
| GB (1) | GB2144542B (nl) |
| MX (1) | MX161889A (nl) |
| NL (1) | NL8401137A (nl) |
| NZ (1) | NZ207393A (nl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3636991A1 (de) * | 1986-03-03 | 1987-09-24 | Transgene Gmbh | Verfahren zur uebertragung organischer und/oder anorganischer substanzen auf ei- und/oder somazellen von tieren sowie entsprechende zusammensetzungen |
| GB2214518A (en) * | 1988-01-28 | 1989-09-06 | Innofinance Altalanos Innovaci | Process and equipment for the rapid determination of the spermium cell count and/or living spermium count |
| NZ239893A (en) * | 1990-09-25 | 1993-11-25 | Hoechst Japan | A method for introducing a foreign dna into a cell |
| ATE298084T1 (de) | 1997-01-31 | 2005-07-15 | Horticulture & Food Res Inst | Optische vorrichtung und methode |
| US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| DE19829495A1 (de) * | 1998-07-02 | 2000-01-05 | Jacques Paysan | Reagenzien und deren Anwendung zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen zellulären Molekülen und deren Lokalisation in Zellen |
| FR2800736B1 (fr) * | 1999-11-05 | 2002-08-23 | Aventis Pharma Sa | Derives d'oligobenzimidazoles, les compositions les contenant et leurs utilisations |
| DK1230223T3 (da) * | 1999-11-05 | 2004-06-14 | Aventis Pharma Sa | Oligobenzimidazolderivater og deres anvendelse som midler til DNA-transfektion |
| US7208265B1 (en) | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Xy, Inc. | Method of cryopreserving selected sperm cells |
| US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| US7094527B2 (en) | 2000-11-29 | 2006-08-22 | Xy, Inc. | System for in-vitro fertilization with spermatozoa separated into X-chromosome and Y-chromosome bearing populations |
| EP1545203B1 (en) | 2002-08-01 | 2016-10-19 | Xy, Llc | Low pressure sperm cell separation system |
| US8486618B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
| AU2003265471B2 (en) | 2002-08-15 | 2009-08-06 | Xy, Llc. | High resolution flow cytometer |
| US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
| DE10305768A1 (de) * | 2003-02-11 | 2004-08-19 | Justus-Liebig-Universität Giessen | Verfahren zum Färben von lipophilen Zellbestandteilen einer biologischen Probe |
| EP3511693B1 (en) | 2003-03-28 | 2022-08-24 | Inguran, LLC | Apparatus for detecting the breakoff point of a droplet generation system |
| AU2004242121B2 (en) | 2003-05-15 | 2010-06-24 | Xy, Llc. | Efficient haploid cell sorting for flow cytometer systems |
| WO2005095590A2 (en) | 2004-03-29 | 2005-10-13 | Monsanto Technology Llc | Sperm suspensions for sorting into x or y chromosome-bearing enriched populations |
| CA2574499C (en) | 2004-07-22 | 2016-11-29 | Monsanto Technology Llc | Process for enriching a population of sperm cells |
| CN102944456A (zh) * | 2012-11-07 | 2013-02-27 | 西北农林科技大学 | 一种观察早期胚胎体内发育时空分布的组织切片的制备方法及应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4094745A (en) * | 1973-06-22 | 1978-06-13 | John Scholefield | Method of staining microscopic organisms |
| US3872312A (en) * | 1973-07-02 | 1975-03-18 | Block Engineering | Method and apparatus for detecting and classifying nucleic acid particles |
| JPS5262080A (en) * | 1975-11-15 | 1977-05-23 | Particle Tech Inc | Method of and apparatus for classifying organism cell |
| DE2651060C3 (de) * | 1976-11-09 | 1980-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Differential-diagnostische Spermauntersuchung |
| CA1155041A (en) * | 1980-04-21 | 1983-10-11 | Michael E. Jolley | Fluorescent nucleic acid stains |
| CA1197186A (en) * | 1982-03-19 | 1985-11-26 | Robert A. Hoffman | Method of enumerating serologically selected cell populations |
-
1984
- 1984-03-06 NZ NZ207393A patent/NZ207393A/en unknown
- 1984-04-10 NL NL8401137A patent/NL8401137A/nl not_active Application Discontinuation
- 1984-07-13 CA CA000458836A patent/CA1271716A/en not_active Expired
- 1984-07-23 JP JP59151469A patent/JPH07104341B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-25 AU AU31159/84A patent/AU581409B2/en not_active Ceased
- 1984-07-26 DE DE3427553A patent/DE3427553C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-07-27 GB GB08419143A patent/GB2144542B/en not_active Expired
- 1984-08-02 MX MX202236A patent/MX161889A/es unknown
- 1984-08-03 CH CH3760/84A patent/CH669670A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-08-03 FR FR8412355A patent/FR2550218B1/fr not_active Expired
-
1994
- 1994-02-28 JP JP6052567A patent/JPH0751059A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0751059A (ja) | 1995-02-28 |
| JPH07104341B2 (ja) | 1995-11-13 |
| AU581409B2 (en) | 1989-02-23 |
| JPS6044869A (ja) | 1985-03-11 |
| CH669670A5 (nl) | 1989-03-31 |
| CA1271716A (en) | 1990-07-17 |
| MX161889A (es) | 1991-02-26 |
| DE3427553A1 (de) | 1985-02-14 |
| NZ207393A (en) | 1987-03-31 |
| FR2550218B1 (fr) | 1989-01-20 |
| DE3427553C2 (de) | 1994-04-14 |
| AU3115984A (en) | 1985-02-07 |
| FR2550218A1 (fr) | 1985-02-08 |
| GB2144542A (en) | 1985-03-06 |
| GB2144542B (en) | 1987-05-07 |
| GB8419143D0 (en) | 1984-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL8401137A (nl) | Werkwijze voor het zichtbaar maken van genetisch materiaal. | |
| Westhusin et al. | Viable embryos and normal calves after nuclear transfer into Hoechst stained enucleated demi-oocytes of cows | |
| Kishikawa et al. | Fertility of mouse spermatozoa retrieved from cadavers and maintained at 4 C | |
| Maxwell et al. | The relationship between membrane status and fertility of boar spermatozoa after flow cytometric sorting in the presence or absence of seminal plasma | |
| Wall et al. | Development of porcine ova that were centrifuged to permit visualization of pronuclei and nuclei | |
| Hewitt et al. | Nuclear staining and culture requirements for in vitro maturation of domestic bitch oocytes | |
| Yoshida et al. | Confocal and fluorescence microscopic study using lectins of the distribution of cortical granules during the maturation and fertilization of pig oocytes | |
| Conover et al. | Pre-loading of mouse oocytes with DNA-specific fluorochrome (Hoechst 33342) permits rapid detection of sperm–oocyte fusion | |
| Thundathil et al. | The use of in vitro fertilization techniques to investigate the fertilizing ability of bovine sperm with proximal cytoplasmic droplets | |
| Saraf et al. | Sperm functional attributes and oviduct explant binding capacity differs between bulls with different fertility ratings in the water buffalo (Bubalus bubalis) | |
| EP1255812A1 (en) | Process for the production of non-human embryos of high-genetic value and of predetermined sex | |
| US5858354A (en) | Repopulation of testicular Seminiferous tubules with foreign cells, corresponding resultant germ cells, and corresponding resultant animals and progeny | |
| Chrenek et al. | Effect of body condition and season on yield and quality of in vitro produced bovine embryos | |
| Báez et al. | Effect of season on germinal vesicle stage, quality, and subsequent in vitro developmental competence in bovine cumulus-oocyte complexes | |
| Niwa et al. | Transplantation of blastula nuclei to non‐enucleated eggs in the medaka, Oryzias latipes | |
| 刀禰重信 et al. | A method of vital staining of mouse eggs using Hoechst dye. | |
| Velilla et al. | Effect of Hoechst 33342 staining on developmental competence of prepubertal goat oocytes | |
| Daigneault et al. | Novel and traditional traits of frozen-thawed porcine sperm related to in vitro fertilization success | |
| Polge | How does embryo manipulation fit into present and future pig reproduction | |
| Van Soom et al. | Sucrose-induced shrinkage of in vitro produced bovine morulae: effect on viability, morphology and ease of evaluation | |
| Ismail et al. | Effect of Different Cryoprotectant Agents on Mitochondrial Distribution and Oocyte Developmental Competence in the Buffalo (Bubalus Bubalis) | |
| Pursel et al. | Cleavage of pig embryos after labeling with fluorescent dyes | |
| Bartsch | Influence of protein source in culture media for IVM, IVF and embryo culture on the development of domestic cat oocytes | |
| Raseona | Comparative evaluation of different extenders of bull semen stored under different conditions | |
| CN111280163B (zh) | 牛活体采卵用的抽卵液及其制备方法和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: GRACE & CO.-CONN. W.R. - |
|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: ABS GLOBAL, INC. |
|
| BV | The patent application has lapsed |