NL8201649A - Werkwijze voor de bereiding van lysine-tryptofaan oligopeptiden, alsmede fysiologisch bruikbare en voor therapeutische toepassing geschikte derivaten en zouten daarvan. - Google Patents

Description

ƒ « * - ι -

José Maria JORBA PUIGSUBIRA te Madrid/Spanje r

Werkwijze voor de bereiding van lysine-tryptofaan oligopep-tiden, alsmede fysiologisch bruikbare en voor therapeutische toepassing geschikte derivaten en zouten daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van uit lysyl- en tryptofyIresten bestaande oligopep-tiden met de algemene formule 1 van het formuleblad, welke formule alle mogelijke combinaties en sequenties bevat die 5 met deze aminozuren kunnen worden gevormd, zowel van de d-serie als van de 1-serie of met alle mogelijke combinaties van sequenties van de d-serie en de 1-serie, waarbij als enige voorwaarde geldt, dat wanneer bij het ontstaan van de peptidebinding, -CONH-, een aminogroep van lysine is be-10 trokken, deze groep de op de alfa-plaats ten opzichte van de carboxylgroep aanwezige aminogroep moet zijn die aan de vorming van de bedoeldé binding deelneemt.

De uitvinding heeft tevens betrekking op fysiologisch bruikbare derivaten en zouten van de verbindingen met de algemene 15 formule 1, en in het bijzonder diegenen, die voor mogelijke therapeutische toepassingen in aanmerking komen.

De onderhavige uitvinding is gekenmerkt door de navolgende drie reactiestappen: le stap: Reactie van een verbinding met de algemene formule 20 2 (zie formuleblad) met een zout met de formule 3 (zie formuleblad), bij voorkeur een hydrochloride of p-tolueen-sulfonaat, in een inert aprotisch oplosmiddel, zoals tetra-hydrofuraan, acetonitril, Ν,Ν-dimethylformamide of mengsels van deze oplosmiddelen, in aanwezigheid van een aprotische 25 base, zoals triethylamine,N-methylmorfoline, 2,6-lutidine, etc., gedurende 1 tot 2 uur. In de bedoelde formules kunnen ..... " ................\ ............. ............

- 8201649 \ - 2 - / Crt'i, ) elk een ƒ> -methyleenindool ^ j/ J of een

'Xvv/ H

fc>-aminobutylgroep voorstellen, waarin deo*-aminogroep beschermd is door een groep P, (PHN-(CH2)3~CH2~), welke groep P de betekenis heeft van een in de chemie van aminozuren 5 en proteïnen voor de bescherming van aminen gebruikelijke groep, zoals (gesubstitueerd) carbobenzyloxy, carbo-tert-butoxy, trityl, tosyl etc., of een rest van een willekeurige peptidesequentie (Lys)c-(Trp)d (c^O en/of d^O) met als enige voorwaarde dat of R2 tenminste een β -methyleen-10 indool- of beschermde cJ-aminobutylrest bevat. R3 betekent alkyl, aryl of aralkyl.

Men verkrijgt aldus, zonder dat er racemisatie optreedt, een verbinding met de algemene formule 4 van het formuleblad, waarin R^, R£ en R^ de eerder genoemde betekenis bezitten.

15 De verbindingen met de algemene formule 2 kunnen worden verkregen door reactie van o-nitr.obenzeensulfenylchloride met "Leuch,,-anhydriden (N-carboxy-anhydriden van OC-aminozuren of peptiden) volgende de werkwijze beschreven door H.R. Kricheldorf, Angew.Chem. 85, 86 (1973), Chem.Ber. 107, 3553 20 (1974) en R. Katakai, J.Ogr.Chem. 40 (19), 2697 (1975).

2e stap: Reactie van de verbinding met de algemene formule 4 van het formuleblad onder milde reactieomstandigheden met de in de literatuur bekende reagentia voor de verwijdering van de o-nitrobenzeensulfenylgroep, zoals thiolen in inerte, 25 niet-waterige oplosmiddelen, halogeen waterstoffen in verdunde dioxaanoplossing bij lage temperaturen, t^0°, etc.

Wanneer men gebruik maakt van halogeenwaterstoffen dient men de kortst mogelijke reactietijd toe te passen (de reactie verloopt in het algemeen onmiddellijk) en vervolgens de iso-30 latie van het reactieprodukt snel uit te voeren, op grond van de reactiviteit in zuur imilieu van het o-nitrobenzeen-sulfenylchloride ten opzichte van in het peptide aanwezige tryptofaanresten.

82 0 1 6 4 9 - 3 -

ff V

Op de aangegeven wijze verkrijgt men bij toepassing van HC1 of HBr/dioxaan als reagens de verbinding met de algemene formule 5 van het formuleblad als hydrohalogenide, waarbij R^, R^ en R3 de reeds genoemde betekenis hebben.

5 3e stap: Behandeling van de in de 2e stap: verkregen verbinding met de algemene formule 5, in een stikstofatmosfeer of in aanwezigheid van een antioxidant, met een der -reagentia die in de chemie van peptiden en aminozuren voor de verwijder!".; ring van amine beschermende· groepen gewoonlijk worden gebruikt, 10 zoals waterstof op bepaalde katalysatoren in geschikte· oplosmiddelen, halogeenwaterstoffen in azijnzuur-, etc. Men verkrijgt aldus een van het produkt met de algemene formule 1 afgeleide ester. Door de behandeling met een base in een i:.,:*-inert oplosmiddel volgens in de organische chemie gebruike— 15 lijke methoden voor de hydrolyse van esters, gevolgd, door neutralisatie van de alkalische oplossing, bij voorkeur door de genoemde oplossing door een kolom met een zure ionenwisselaar te leiden,- levert de bedoelde ester het uit de aminozuren lysine en tryptofaan samengestelde vrije peptide 20 met de algemene formule 1 van het formuleblad.

De volgende methylester 1-Lys-l-TrpOMe, afgeleid van de verbinding met de algemene formule 1 waarin a = b- = 1, was in de vorm van het mono-en dihydrochloride reeds eerder beschreven door'M Szekerke, J» Erchegyi en J. Sagi, Acya chim* 25 Acad.Sci.Hung.' '80, 193 (1974) ,- de aldaar beschreven werkwijze voor de synthese daarvan is echter verschillend van de onderhavige.

Bij al deze reacties worden goede opbrengsten verkregen ( ^ 90%) terwijl er geen racemisatie plaatsvindt.

30 De volgende voorbeelden die de werkwijze van de uitvinding illustreren dienen als niet limitatief te worden beschouwd.

In al deze voorbeelden worden de volgende afkortingen gebruiktr NPS, NCA en Z, die de hieronder aangegeven betekenis bezitten; 8201649 - 4 - « » deze afkortingen zijn in de chemie aminozuren en peptiden algemeen gebruikelijk om de desbetreffende groepen aan te geven en zij zijn bij de deskundigen op dit gebied welbekend.

5 NPS= o-nitrobenzeensulfenyl NCA= «<, -N-carboxy-anhydride Z = carbobenzyloxy.

VOORBEELD I

l-Lys-l-TrpQMe, HC1 10. 1. NPS- i -Z-l-Lys-l-TrpOMe

Aan een suspensie van 38,2 g methyl-l-tryptofanaat hydro-chloride in 300 mL droge tetrahydrofaan voegt men 21 ml triethylamine toe, waarna het gevormde triethylamine hydrochloride wordt afgefiltreerd. Aan het filtraat worden 15· 72,6 g NPS — £ -Z-l-Lys-NCA toegevoegd en het mengsel, wordt gedurende 2 uur geroerd.. De oplossing wordt ingedampt onder verminderde druk bij een badtemperatuur niet hoger dan 35°, waarna, het verkregen residu, wordt opgelost in 600 ml ethyl— acetaat, de oplossing achtereenvolgens gewassen met een 20 5%s waterige oplossing van wijnsteenzuur, 5%s natriumbi carbonaat en water. De organische fase wordt op natriumsulfaat gedroogd en in vacuo ingedampt waardoor een dikke siroop wordt verkregen die in de hierna volgende reactiestap wordt gebruikt, en waarvan de struktuur werd bepaald op grond van 25 de spectroscopische en analytische data.

NMR (dimethylsulfoxide-dg, S) 7-8,5 (m,14,5 indool,5 groep Z, 4 NPS); 5,l(s,2 CH2 groep Z); 3,4 (s,3, C02CH3)

Analyse:Berekend voor C32H35N5°7S . c,60,65 % ; H, 5,56%; N,11,05 % ; S, 5,04% 30 Gevonden....................: C,61,03 % ; H, 5,89%; N, 10,88 % ; S, 5,29% 2. £ —Z -1-Lys-L-TrpOMe, HC1 88,3 g van het hierboven verkregen NPS- £-Z—1-Lys-l-TrpOMe 8201649

r C

- 5 - worden opgelost in 350 ml van een op -5°C afgekoelde oplossing van chloorwaterstof in dioxaan. Vervolgens verdampt men de oplossing onder verminderde druk totdat een droog rubberachtig residu wordt verkregen, dat door de behandeling 5 met benzeen onder roeren vast wordt , en waarvan de struktuur werd bepaald op grond van de spectroscopische en analytische data. NMR (dimethylsulfoxide-dg, S) 5,1 (s, 2 CH2 groep Z; 3,5 (s,3, C02CH3).

Analyse berekend voor C26H33N4°5C1‘2H20 : C,56,47%; H,6,69% 10 N,10,13 %C1,6,42 %.

gevonden C, 56,28 %; H, 6,90%; N, 9,97%, Cl.6,68% 3. 1-Lys-l-TrpOMë, HCl

Een oplossing van 8 g van het in de voorgaande reactiestap verkregen 6-Z-l-Lys-l-TrpOMe, HCl in 40 ml van met chloor— 15 waterstof verzadigd zaijnzuur wordt gedurende 1 uur in een stikstofatmosfeer op 100°C verhit. Men verdampt de oplossing in vacuo totdat een droge siroop wordt verkregen, die door wassen met aceton een rubberachtige consistentie aanneemt.

Hoewel kristallisatie niet mogelijk bleek werd de identi-20 teit bevestigd op grond van de spectroscopische data, terwijl de optische draaiing analoog was aan die beschreven in de literatuur; (o()D = +8° (c = 1/5 H20) ; (^)D literatuur = +6,2° (c = 1,1 H20). ?

VOORBEELD II

25 1-Lys-1-Lys-l-TrpOMe, HCl 1. NPS-£-Z-l-Lys- £-Z-1-Lys-1-TrpOMe 62 g £-Z-l-Lys—1-TrpOMe, HCl, verkregen volgens het voorgaande Voorbeeld, worden gesuspendeerd in 600 ml droge tetra-hydrofuraan, en er worden 16,8 ml triethylamine toegevoegd.

30 De ontstane neerslag wordt gefiltreerd en aan het filtraat worden 50,4 g NPS-£-Z-l-Lys-NCA toegevoegd. Men roert het mengsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. De oplossing „ 8201649 \ ' ...........

' - 6 - wordt onder verminderde druk verdampt en het droge residu wordt opgelost in 2 1 ethylacetaat, waarna achtereenvolgens wordt gewaasen met een 5%s waterige oplossing van wijnsteenzuur, 5%s natriumbicarbonaat en water, 5 De organische fase wordt op natriumsulfaat gedroogd en de droge ethylacetaatoplossing wordt verdampt tot een droog rubberachtig residu dat door behandeling met hexaan overgaat ‘ in een amorfe vaste stof, die op grond van spectroscopische (NMR) en analytische gegevens werd gekarakteriseerd7 NMR 10 (dimethylsulfoxide-dg, $) 7,8,5 (m, 19; 5 indool 10 groepen Z, 4 NPS); 5,1 (s,4, CH2 groepen Z); 3,5 (s,3, C02CH3).

Aanalyse berekend voor C46H53H7°iqS: C,61,.67%; H,5,92%; N,10,94%r S,3,57% gevonden ............... — ..: C,61,48%; H,6,16% 15 N, 10,69%; S,3,72% 2 .. έ -Z—1-Lys— ζ -Z-l-Lys-l-TrpOMe, HCl 102 g van het. in de voorgaande stap verkregen NPS- £-Z-l-Lys-^ -1-Lys-l-TrpOMe worden opgelost in een op -5°C afgekoelde 1.-N oplossing van chloorwaterstof in dioxaan. Vervolgens 20 verdampt men de oplossing onder verminderde druk tot een droge, dikke siroop, die door toevoeging van ethylether vast wordt. De vaste stof wordt met ether gewassen en uit tetrahy— ; 1 O ' drofuraan-ethylether gekristalliseerd; smp. 120-121 .

Analyse berekend voor C4gH51NgÖgCl.2H20; C, 58,93%; H,6,70%; N, 10,31%; Cl,4,35% gevonden...................... : C,58,59%; H,6,31% N, 10,27% ; Cl,4,72% 3. 1-Lys-l-Lys-l-TrpOMe, HCl

Een oplossing van in de voorgaande reactiestap verkregen 8201649 ♦ ^ - 7 - £ -Z-l-Lys- £ -Z-l-Lys-1-TrpOMe, HC1 in 300 ml met chloor-waterstof verzadigd azijnzuur wordt gedurende 1 uur onder een stikstofatmosfeer op 100°C verhit.

Vervolgens verdampt men de oplossing in vacuo totdat een 5 droog residu wordt verkregen. Men wast met aceton onder roeren totdat de textuur van een amorfe vaste stof wordt bereikt.

Hoewel deze niet kon worden gekristalliseerd, werd hij geïdentificeerd op grond van de spectroscopische en analytische data. NMR (dimethylsulfoxide-dg, tf) 1*1-1,19 (m,l2, 10 lysines niet aansluitend aan de aminogroep), 3,50 (s,3, CC^CH^) 6,85-7,90 (m,s, tryptofaan).

Analyse berekend voor ^24^39^6^^: C,56,41%; H,7,64%; N,16,45%; 01,6,95% gevonden . C,-56,73%r H,7,28%- 15 N,16,09%; 01,80,2% VOOEBEELD III - _

L-Lys-l-Lys»l-Lys-l-TrpOMe en 1-Lys-l-Lys-l-Lys-TrpOH

1.. NPS- i -Z-l-Lys- £ -Z-l-Lys- £ -Z-l-Lys-l-TrpOMe 79 g £ -Z-l-Lys- £ -Z-l-Lys-l-TrpOMe, HOI, verkregen volgens 20 het Voorbeeld II, worden gesuspendeerd in 600 ml droge tetra-hydrofuraan, en er worden 14,6 ml tetraethylamine toegevoegd.

De ontstane neerslag worden afgefiltreerd, en aan het filtraat worden 46 g NPS- £-Z-Lys-NCA toegevoegd. Men roert het . mengsel gedurende 1¾ uur bij kamertemperatuur. Daarna wordt 25 in vacuo verdampt, en men verkrijgt een dikke siroop die bij behandeling met ethylacetaat overgaat in een gele vaste stof die uit ethylacetaat kristalliseert; smp. 172-174°.

NMR (Dimethylsulfoxide)-dg, cf ) 7-8,5 (m,24 ; 5 indool, 15 groep Z, 4 NPS); 5,1 (s,6, groepen Z) ; 3,4 (s,3, CC^CH^) .

30 Analyse bérekend voor ^50^72^^13^: c'62,18%; H,6,22%; N,10,88% gevonden................... C,62,42%; H,5,93%; N,10,58% 82 0 1 6 4 9 - 8 - 2. t -Z-l-Lys-£-Z-l-Lys- £ -Z-l-Lys-l-TrpOMe, HCl 107 g van het in de voorgaande stap verkregen NPS-£ -Z-l-Lys-- £ -Z-l-Lys- £ -Z-l-Lys-l-TrpOMe worden opgelost in een op -5°C afgekoelde 1-N oplossing van chloorwaterstof in 5 dioxaan. Vervolgens verdampt men onder verminderde druk bij een badtemperatuur beneden 35° tot een droog vast residu dat herhaaldelijk met ethylether wordt gewassen. Men verkrijgt aldus een produkt dat uit tetrahydrofuraan-ethylether kristalliseert; smp. 170-171°.

10 Analyse berekend voor ^^HggNgO^Cl.2^0 :C',60,20%; H,6,78% N,10,40%? Cl,3,30% gevonden.^♦.......:C,60,54%? H,6,48% N, 10',76%; Cl,3,45%

3.. 1-Lys-L-Lys-l-Lys-TrpOMe, HC1 en 1-Lys-l-Lys-l-Lys-TrpOH

15 Een oplossing van het in de voorgaande stap verkregen £ -Z-L-Lys-£ -Z.-l-Lys-<£ -Z-l-Lys-l-TrpOMe, HCl in 400 ml met chloorwaterstof verzadigd azijnzuur wordt gedurende 1 uur in een stikstofatmosfeer op 100°C verhit. Vervolgens verdampt men in vacuo totdat een droog rubberachtig residu wordt 20 verkregen dat door wassen met aceton onder roeren de consistentie van een amorfe vaste stof aanneemt.

Hoewel men deze stof niet kon kristalliseren, werd hij geïdentificeerd als 1-Lys-l-Lys-l-Lys-TfpOMe, HCl op grond van de. spectroscopische en analytische data.

25 NMR (dimethyIsulfoxide)-dgd ) 1,1-1,9 (m,18, C^ lysines niet aansluitend aan de aminogroep 3,52 (s,3, CC^CHg), 6,85-7, 90 (m,5,tryptofaan).

Analyse berekend voor CggH^NgO^Cl : C, 57,28%; H,6,52%; N,17,82%; Cl,5,64% 2Q gevonden .................. C,57,49%; H,6,78%; N, 17",51%; Cl,5,82% 82.0 1 6 4 9 - 9 -

Dit produkt wordt vervolgens opgelost in 575 ml ethanol, en aan de oplossing voegt men langzaam onder roeren 80 ml 4-N natriumhydroxide toe. Het mengsel wordt nog gedurende 1½ uur bij kamertemperatuur geroerd, en in vacuo verdampt totdat een 5 droog residu ontstaat dat men vervolgens in water oplost, en neutraliseert door de oplossing door een kolom met de zure ionenwisselaar IR-120 te laten lopen. De waterige, verdunde oplossing uit de kolom wordt in vacuo verdampt, en men verkrijgt aldus een droge vaste stof die uit methanolaceton 10 kristalliseert,, smp. 187-188°, en die overeenkomt met het vrije tetrapeptide 1-Lys-l-Lys-l-Lys-TrpOH.

NMR{dimethylsulf oxide,-dg $) 1,1-1,9 (m, 18, CH2 lysines niet aansluitend aan de N^-groep) , 6,85-7,90 (m,5, triptofaan)

Analyse berekend voor C,60,20%; R,6,57%; N,19,37% 15 gevonden ..............C,59,97%; H,6,53%; N,19,08%.

8201649

Claims (12)

1. Werkwijze voor de bereiding van lysine-tryptofaan oligopeptiden met de algemene formule 1 van het formuleblad, alsmede fysiölogsch bruikbare derivaten en zouten daarvan, waarbij de weergegeven formule de mogelijke 5 combinaties en sequenties omvat die met lysine en trypto-faan van de serie d en/of 1 kunnen worden gevormd, met als enige voorwaarde dat wanneer bij het ontstaan van de peptidebinding - CONH- een aminogroep van lysine is betrokken, de aminogroep op de d.-plaats ten opzichte van het carboxyl 10 degene dient te zijn die aan de bedoelde binding deelneemt, met het kenmerk, dat de_ werkwijze de volgende drie reactie-stappen omvat.: (1) Reactie van een verbinding met de algemene formule 2 van het formuleblad, met een zout van een verbinding met 15 de algemene formule 3 van het formuleblad in een geschikt inert oplosmiddel en in aanwezigheid van een aprotische base, in welke formules R^ en R2 elk β -methyleenindool of Cd -aminobutyl met beschermde U -aminogroep voorstelt of een of andere rest van een willekeurige peptide- 20. sequentie (Lys) - (Trp) ^ (c en/of d 0) , met dien verstande dat R1 of R2 tenminste een β -methyleenindool of beschermde Ui -aminobutylrest bezit, en waarin R^ alkyl, aryl of -- aralkyl voorstelt; (2) Reactie van de in de boven beschreven reactiestap (1) 25 verkregen verbinding met de algemene formule 4 van het formuleblad met een verdund zuur in een geschikt inert oplosmiddel; (3) Reactie van de in de voorgaande reactiestap (2) gevormde verbinding met de algemene formule 5 van het formuleblad 30 waarin R^, R2 en R^ de eerder genoemde betekenis hebben, met een oplossing van een waterstofzuur in azijnzuur in aanwezigheid van een katalysator; waarna de aldus gevormde ester van het produkt met de algemene formule 1 desgewenst aan een hydrolyse met een 35 oplossing van een base in water of alcohol/water wordt 82.0 1 6 4 9 - 11- ΐ Λ onderworpen, gevolgd door neutralisatie van het resulterende mengsel onder vorming van het vrije peptide met de algemene formule 1.

2. Werkwijze volgens conclusie. 1, met het kenmerk, dat de in 5 reactiestap (1) bedoelde reactie wordt uitgevoerd in tetrahydrofuraan bij kamertemperatuur.

3* Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de in reactiestap (1) toegepaste aprotische base triethylamine is.

4. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de in reactiestap (2) bedoelde reactie: wordt uitgevoerd met 1-N HC1 in dioxaan bij een temperatuur van 0° + 5°.

5. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het 15 kenmerk, dat de beschermende groep van de eindstandige aminogroep van lysine de carbobenzylo ygroep is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de afsplitsing van de carbobenzyloxygroep in reactiestap (3) ^ wordt teweeggebracht door middel van een verzadigde op- 20 lossing van chloorwaterstof in azijnzuur bij 80-100°C gedurende 30 tot 60 minuten.

7. Werkwijze volgens êën der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de hydrolyse van de in reactiestap (3) gevormde ester wordt uitgevoerd met een alkalimetaal- of 25 aardalkalimetaalhydroxide in een waterig of water/alcohol milieu.

8. Werkwijze voor de bereiding van een middel met therapeutische werking, met het kenmerk, dat men fysiologisch bruikbare derivaten en zouten van lysine-tryptofaan 30 oligopeptiden met de algemene formule 1 van het formule- 8201649 V «- - 12 - blad, verkregen volgens de werkwijze van één der voorgaande conclusies, in een voor therapeutische doeleinden geschikte toedieningsvorm brengt.

9. Gevormd therapeutisch middel verkregen onder toepassing 5 ran de werkwijze volgens conclusie 8.

10. l-Lys-l-Lys-l-Trp-O-CH^ hydrochloride.

11. l-Lys-l-Lys—l-Lys-l-Trp-O-CH^ hydrochloride.

12. 1-Lys-l-Lys-l-Lys-l-Trp-OH. 8201649