NL7909224A - Kleurstabiele glucoseproef. - Google Patents

Description

* TO 88k0

Titel:Kleurstabiele giucoseproef.

De uitvinding "betreft diagnostische proeven en meer in het "bijzonder proeven voor het kwalitatief of kwantitatief "bepalen van glucose, waarbij de glucose in een peroxide wordt omgezet.

' Glncoseaxidase zet glucose enzymatisch cm in gluconzuur en 5 waterstofperoxide. Dit aldus gevormde waterstofperoxide kan tot water worden gereduceerd door een peroxidatief actieve stof bij aanwezigheid van een indicator, die daarbij wordt geoxideerd en b.v. een kleursverandering geeft. De chranogene indicator a-tolidine is enige tijd in glucosebepalingssystemen gebruikt, maar levert 10 resultaten op, die worden gestoord door een reductie van de geoxideerde indicator door storende stoffen, zoals ascorbinezuur.

Toorts ontmoet o-tolidine ook bezwaren op veiligheidsgronden.

De 3ritse octrooischriften 1.M&.359 en l.U6h.360 die een toepassing van 3,3',5,5'-tetrsmethylbenzidine en overeenkomstige 15 verbindingen weergeven alsmede hun gebruik bij het bepalen en aantonen van waterstofperoxide of verbindingen, die onder vorming van peroxiden worden omgezet. Concentraties aan benzidinederivaten die daarbij worden vermeld, zijn evenwel inconsistent en bedragen 3 gewoonlijk niet meer dan ca. 6 mg/cm gebruikte impregneer-20 oplossing.

De toepassing van de benzidinederivaten bij de concentraties volgens de genoemde Britse octrooischriften resulteert in een betrekkelijk langzame vorming van een kleur of een kleur, die niet lang stabiel blijft. In het laatste geval heeft de gevormde kleur 25 de neiging bij staan te verdwijnen, waardoor de aflezingen moeilijk tot onmogelijk worden door ongeschoold personeel.

De uitvinding betreft nu een verbeterde proef voor het aantonen van glucose, onder toepassing van beslist veilige stoffen.

Daarbij wordt een kleur gevormd, die lange tijd behouden blijft.

30 De uitvinding betreft daartoe een verbeterde proef op het aantonen van glucose in een monster, waarbij het proefmateriaal een glncoseaxidase, een peroxidatief actieve stof en een 3,3^5,1-tetrsalkylbenzidineindicator omvat, welke laatste aanwezig is 7909224 i ft -2- in een voldoende hoeveelheid ara hij contact van het reagens met een tevoren bepaalde hoeveelheid van een glucosehoudend monster snel een stabiel gekleurd reactieprodukt vormen.

De uitvinding wordt nader toegelicht door de tekening.

^ Daarin is: fig. 1 een grafische weergave van de cijfers in tabel 4 onder toepassing van een glucoseproefuitrusting verkregen met een impregneer op los sing met de formule 1 van voorbeeld I, welke weergave is verkregen door een uitzetting van K/S, hieronder nader toegelicht, tegen de glucoseconcentratie; fig. 2 is een grafische weergave van de cijfers in tabel A· onder toepassing van een glucoseproefuitrusting verkregen onder toepassing van de. impregneer oplos sing met de formule 2 van voorbeeld I, welke weergave is verkregen door uitzetten van K/S tegen de glucoseconcentratie; fig. 3 is een grafische weergave van de cijfers van tabel 2L onder toepassing van een glucoseproefuitrusting, verkregen onder toepassing van de impregneer op los sing met de formule 3 van voorbeeld I, welke weergave is verkregen door uitzetten van K/S tegen 2q de glucoseconcentratie; fig. k is een grafische weergave van de cijfers van tabeliL onder toepassing van een glucoseproefuitrusting, verkregen onder toepassing van de impregneeroplossing met de formule k van voorbeeld I, welke weergave werd verkregen door uitzetten van K/S tegen· 2^ de glucoseconcentratie en fig. 5 is een grafische weergave van een percentage aan kleursverandering waargenomen, gedefinieerd als (ΛK/S)/K/S x 100, voor de proefuitrustingen die werden gebruikt voor het verkrijgen van de cijfers weergegeven in de fig. 1-4.

In tegenstelling tot bekende preparaten zijn de onderhavige nagenoeg vrij van het probleem van j kleursverloop. Dit onverwachte kenmerk wordt waargenomen bij het doen toenemen van de concentraties aan de 3,3r ,5,5itetraalkylbenzidine-indicator. De uitvinding verschilt dus van de bekende methoden, doordat snel een kleur wordt verkregen, die na zijn vorming stabiel blijft. Men 7909224 -3- hoeft dus niet te wachten tot de indicatorkleur zich stabiliseert, noch rekening te houden met een continue verandering van de kleur na de aanvankelijke kleursvoiming. Volgens de uitvinding zijn nu een preparaat en een uitrusting beschikbaar onder toepassing van 5 een 3,3'>5i5,-tetraalkylbenzidine, die bij contact met een glucose-houdend manster- binnen het traject van kleine maar nog toonbare hoeveelheden tot tenminste ca. UOO mg/dl snel een stabiele kleur opleveren.

De uitvinding betreft dus een proefuitrusting, zoals een 10 preparaat, een analysevoorwerpje, een werkwijze voor het maken van dit soort uitrustingen en een werkwijze voor het bepalen van glucose in een monster. Meer in het bijzonder betreft het onderhavige reagens een glucoseoxidase, een peroxidatief actieve stof, zoals een peroxidase en een 3,3',5>'-tetraalkylbenzidine-indicator in 15 een voldoende hoeveelheid cm bij contact van het reagens met een tevoren bepaalde hoeveelheid van een glucosehoudend monster snel een stabiel gekleurd reactieprodukt op te leveren, dat waarschijnlijk bestaat uit gereduceerde en geoxideerde vormen van de indicator in een stabiel evenwicht. Het stabiele gekleurde reactie-20 produkt wordt binnen ten hoogste 60 seconden bereikt en meestal tussen 30 en ö0 seconden na contact van het reagens met het te onderzoeken monster.

De concentratie aan 3,3', 5,5'-tetraalkylbenzidine in verhouding tot de hoeveelheid aan glucose-oxidaseactiviteit in het 25 reagens is critisch. Overeenkomstig de uitvinding is het 3,3' ,5,5'-tetraalkylbenzidine in het reagens aanwezig in een concentratie van tenminste ca. 2,5 mmol per 1000 Internationale Eenheden glucoseoxidaseactiviteit.

De 3,3's5j5’-tetraalkylbenzidineverbindingen zijn bijzonder 30 gunstig omdat ze beslist geen kankerverwekkende eigenschappen bezitten.

Tevens betreft de uitvinding een proefvoorwerp voor het bepalen van glucose, bestaande uit een drager of matrix met daarin het reagens volgens de uitvinding. Een dergelijk voorwerp kan 35 de vorm hebben van een tablet of liever nog van een proefstrook.

7909224 » •'i -U-

Verlengde stroken dragermateriaal, met daarin verwerkt het reagens volgens de uitvinding worden als zodanige voorwerpen "beschouwd.

Bij het vervaardigen en verdelen van deze verlengde stroken kunnen zij de vorm. hehben van rollen, h.v. van filterpapieimateriaal.

5 Het voorwerp wordt h.v. verkregen door een drager met een oplossing van het onderhavige reagens te impregneren en vervolgens de geïmpregneerde drager te drogen. Een werkwijze voor het bepalen van glucose in een vloeistofmonster wordt verkregen door een dergelijk monster met het reagens of voorwerp volgens de uitvinding in con-10 tact te brengen en vervolgens een eventuele kleursverandering waar te nemen.

Hoewel bepaalde specifieke termen hieronder voor de duidelijkheid worden gebruikt, beperken deze specifieke termen, de uitvinding niet.

15 Het proefreagens volgens de uitvinding kan vele fysische vormen hebben en diverse specifieke 3,3r,5,5’-tetraalkylbenzidinen bevatten, onverschillig de toegepaste vorm. Deze zijn tezamen met bekende toeslagstoffen, zoals stabilisatiemiddelen, die desgewenst als extra's kunnen worden toegepast, beschreven. Het reagens wordt 20 gebruikt voor het aantonen van glucose, door het met een monster, zoals urine, bloed, serum, cerbrospinaalvloeistof, 0f een bovenstaande vloeistof . van weefselculturen in contact te brengen.

De diverse benzidineindicatoren anvatten de 3,3',5,5*-tetraalkylbenzidinen, waarin de alkylgroep 1-h koolstofatomen telt en 25 waarbij 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine de meeste voorkeur verdient. Andere benzidinen kunnen evenwel ook worden gebruikt, zoals 3-methyl-3ƒ-methyl,5-ethyl, 5'-ethylbenzidine en 3,3',5,5'-tetra-etbylbenzidine. Zoals blijkt uit deze voorbeelden kunnen de vier alkylgroepen gelijk of verschillend zijn.

30 Glucose-enzymen, die daarnaast kunnen worden gebruikt, zijn die, die reageren met een glucosehoudende vloeistof onder vorming van een tevoren bepaald reactieprodukt, zoals waterstofperoxide.

B.v. kan een uit schimmels verkregen glucoseoxidase worden gebruikt. Deze worden gewoonlijk aangeduid als te behoren tot het 35 flavoproteïnetype, aangezien ze als prosthetische groep of coënzym 7909224 -5- er ~i een flavine of isoallaxazine "bevatten.

.. . . . . //

Bij voorkeur is een tweevoudig enzymsysteem aanwezig: een enzym transformeert- de glucose onder vorming van waterstofperoxide en het volgende enzym heeft een peroxidatieve activiteit. Stoffen ^ met een peroxidatieve activiteit, die hij de uitvinding "bruikbaar zijn, kunnen worden gekozen uit diverse organische en anorganische bronnen. Plantenperoxidasen, b.v. uit rammenas of aardappels kunnen worden gebruikt. Anorganische stoffen met een peroxidaseactiviteit zijn jodiden, zoals natrium- of ammcniumjodiden, en molybdaten, zoals kalium- en ammoniummolybdaten. Bovendien kunnen urohemine en een aantal andere porfyrinestoffen met een peroxidatieve activiteit worden gebruikt. Andere stoffen, die geen enzymen zijn, maar wel. een peroxidatieve activiteit bezitten omvatten verbindingen als ij zersulfocyanaat, ijzertannaat, ferro-ferrocyanide., kaliumchrocm-^ sulfaat e.d.

Aangezien de gebruikte preparaten voor het meten van glucose in bloed b.v. op een pH tassen k en ca. 7,5 moeten worden gehouden, is een "buffersysteem b.v. uit tris(hydroxymethyl)amincmethaan, malon-zuur en dinatriummalanaat bijzonder bruikbaar voor dit doel.

Sen interpolymeer van methylvinylether en maleïne zuur anhydride is eveneens bruikbaar voor de vorming van glucoseindicatoren volgens de uitvinding. Een dergelijk interpolymeer wordt verkocht onder de naam Gantrez ΑΙΓ-139 door GAF Corporation. Wanneer dit interpolymeer wordt opgelost in een alcohol vormt het een gedeelde- telijk esterderivaat, en wanneer het internolymeer in water wordt 25 cpgelost wordt het een zuurderivaat. Aangezien proefreagentia volgens de uitvinding meestal uit water/alcoholoplossingen worden bereid, zullen de preparaten in hun uiteindelijk produkt een zuurderivaat, een gedeeltelijk esterderivaat of een mengsel van __ beide derivaten bevatten. De aanwezigheid van deze intemolymeer-30 derivaten tezamen met polyvinylpyrrolidon (PVF) met b.v. een gemiddeldmolecuulgewicht van ca. UO.OOO, verhoogt de gevormde kleur, indien kieurvormende indicatoren bij aanwezigheid van peroxidasen door warerstof peroxide worden geoxideerd. Deze versterking van de „ kleur is een hult bij het schemer definiëren van verschillende 35 - 7903224 -6- kleumuances voor verschillende gehalten aan glucosen in het gegeven manster. Dit is in het bijzonder van belang voor een dokter bij de diagnose van de aanwezigheid van een beginnende diabetes.

Tevens betreft de uitvinding proefuitrustingen met daarin 5 het reagens volgens de uitvinding en een werkwijze voor het vervaardigen van dit soort uitrustingen door een drager met reagens te verwerken. Behalve impregneren als hierboven vermeld, kan het reagens ook op een andere wijze, b.v. door drukken, of sproeien van reagens worden voorzien.

10 Bij voorkeur wordt de proefuitrusting verkregen door een . k o b drager met een eerste oplossing met ca. k x 10 tot ca. o x 10 . 5 I.E. glucose-axidaseactiviteit en ca.. 22 x 10 I.E. peroxidase-activiteit per liter te impregneren en deze drager vervolgens na drogen te impregneren .met een tweede oplossing met tenminste ca.

15 6 g 3,3',5,5'-tetraalkylbenzidine per liter voor elke 10.000 I.E.

glucose-oxidaseactiviteit per liter in de eerste oplossing. De geïmpregneerde drager wordt, na deze tweede impregnering opnieuw gedroogd.

Met dragers worden matrices bedoeld, die onoplosbaar zijn 20 in en hun integrale structuur behouden bij contact met fysiologische of andere te onderzoeken vloeistoffen. Passende matrices omvatten b.v. papier, cellulose, hout, vliezen van synthetische hars, glasvezels, geweven of niet geweven textiel, gelatine, diverse organische polymeren, zoals polypropeen, en andere als filmvormers 25. bekende organische materialen. Desgewenst kan de drager ook de vorm hebben van een geslagen of gevormd tablet met een gebruikelijk dragermateriaal. Bij voorkeur wordt de drager bevestigd op een onoplosbare houder of handle, die b.v. kan zijn vervaardigd van polystyreen.

30 Wanneer het reageqs wordt gebruikt voor het aantonen van glucose in bloed, wordt het oppervlak van de geïmpregneerde drager-matrix bij voorkeur bedekt met een semi-permeabele transparante bekleding of film van ethylcellulose of een ander passend materiaal. Dit kan worden bereikt door een laag ethylcellulose, opgelost in 35 benzeen, b.v. op het oppervlak van de geïmpregneerde dragermatrix 7909224 -7- aan te ‘brengen en -vervolgens het oplosmiddel door verdampen te verwijderen. Ook kan de ethylcellulose deel uitmaken van de tweede impregneeroplossings zoals hij het voorbeeld is weergegeven.

Gluc oseproefuitrustingen in de vorm van behandelde drager-5 matrices worden veelal lange tijd voor gebruik opgeslagen, en het is daar cm gewenst, dat de gebruikte reagentia niet gemakkelijk door lucht worden geautaxideerd. De· proefuitrustingen moeten daaran. bij voorkeur tegen licht worden beschermd en in sommige gevallen hermetisch in. een vochtafstotend, pakket worden opgesloten, dat 10 pas wordt geopend kort voordat de uitrustingen werden gebruikt.

Desgewenst kan een dragennatrix ook worden behandeld met een achtergrondskleurstof met een specifieke kleur,zoals geel, waardoor de kleur verkregen door de reactie met glucose wordt gemengd met de achtergrondskleur,. waardoor verschillende tinten ent-15 staan, die corresponderen met bepaalde concentraties aan glucose aanwezig in de vloeistof of het te onderzoeken monster. Het kan bijzonder gewenst zijn de matrix geel te verven, indien het gekleurde reactieprodukt blauw is.

De proef uitrusting wordt liefst gebruikt door hem even in 20 een proefmonster te dompelen of een proefmonster in de dragermatrix te brengen, waarbij een aantoonbare kleursverandering optreedt, indien glucose aanwezig is. De volumetrische capaciteit van de drager begrenst de hoeveelheid monster die wordt opgenemen, en waaraan het reagens wordt blootgesteld. Eventueel overmaat monster 25 kan worden verwijderd door wassen of de drager te betten, waardoor de hoeveelheid monster die inderdaad de dragermatrix binnentreedt, wordt beperkt. De proefuitrusting kan cp dezelfde wijze worden toegepast wanneer monsters plasma, serum of andere lichaamsvloeistoffen worden onderzocht.

30 Heflectantieaflezingen van de kleur verkregen door de reactie van glucose in het monster kunnen worden verkregen met handels-spectrofotemeters, zoals de Beekman DK-2 of de speetrocolorimeter 5CF-1 van Israel Electro-Optical Industry Ltd.

Yoor zeer nauwkeurige bepalingen van glucoseconcentraties 35 kunnen fotoëlectrische, colorimetrische of specurofotcmetrische 7909224 -8- methoden worden gebruikt bij het bepalen van. de kleur.. De Eyetone reflectantiecolorimeter van Mes Company is een draagbaar instrument, bestemd voor het kwantitatief meten van glucose in geheel bloed bij toepassing in combinatie met dextrostix reagensstroken van 5 Mes Company. De Eyetone reflectantiecolorimeter meet het. licht dat wórdt, gereflecteerd van het oppervlak van de omgezette proef-matrix en zet deze meting via een electronisch circuit cm in een aflezing op een nauwkeurig gecalibreerde. schaal, waarbij het instrument het. bloedglucosegehalte kan weergeven binnen het tra-10 ject van 10 tot 1*00 mg per 100 cm' . Hoe hoger de bloedglucose-spiegel, hoe donkerder de strook en hoe. minder licht wordt gereflecteerd. Omgekeerd hoe lager het bloedglucosegehalte des te lichter de strook, en des.-te. meer licht, wordt gereflecteerd.

De kleurvormende reagentia of uitrustingen volgens de uitvinding 15 zijn bijzonder bruikbaar omdat ze een unieke kleurresponsie geven, die kan worden bepaald door de Eyetone reflectantiecolorimeter op een zelfde wijze als bij Dextrostix reagensstroken. Desgewenst kunnen ook semi—kwantitatieve resultaten worden verkregen onder toepassing van de onderhavige glucoseindicator door de verkregen 20 kleur te vergelijken met een reeks standaardkleuren, verkregen met bekende glucoseconcentraties onder toepassing van dezelfde glucose-indicator.

De verhouding tussen K (de absorptiecoëfficiënt van het monster) en de concentratie van het absorberende materiaal (glucose) 25 wordt gegeven door de Kubelka-Monkvergelijking, die nader wordt toegelicht in Kortumi: Reflectance Spectroscopy, Springer-Verlag Inc., New York, 19^9.

De term K/S, die wordt gebruikt in het voorbeeld, is een verhouding die wordt gedefinieerd door de formule (l-R) /2R, 30 waarin R de reflectantie en S de strooiïngscoëfficiënt van de gebruikte drager voorstellen. Zodoende is K/S evenredig met de hoeveelheid chrcmogeen gevormd door de reactie. Aflezingen bij het voorbeeld vonden plaats bij de genoemde golflengten.

Rammenas-peroxidase en glucoseoxidase werden verkregen van 35 Miles Laboratories te Elkhart, Indiana. Een copolymeer van methyl- 79 0 9 2 2 4 -9- vinylether en malelnezuuranhydride (Gantrez AS-139) en polyvinyl-pyrrolidon (FTP) werden geleverd door GAP Corn., Chemical Products, New York. Het hij het bereiden van de oplossingen gebruikte oplosmiddel kan water zijn, maar ook een fysiologische zoutoplossing, 5 een organisch oplosmiddel, zoals methanol of mengsels van deze oplosmiddelen .

Het volgende voorbeeld licht de uitvinding nader toe. Voorbeeld I:

Uitrustingen werden vervaardigd ter opname van preparaten 10 voor een kwantitatieve bepaling van glucose. De gebruikte reagentia hadden elk een verschillende concentratie aan indicator 3,3'»5*5*·-tetramethylbenzidine (TMB). Het effect van dit verschil op de stabiliteit bij bewaren van de gevormde kleur werd nagegaan.

Een eerste impregneercplossing werd bereid uit de volgende 15 bestanddelen:

Cramonenten hoeveelheid eindeoncentratie ethanol 25 ml 25 % (v/v) H„0 50,5 ml 2 h glucose-oxidase 1,6 ml 8 x 10 IE/liter 20 (5 x 103 IE/ml) rammenasperoxidase 250 mg (90,8 IE/mg) 22 x 105 IE/liter citraatbuffer 25 ml' 0,36 molair (M) (1,8 Mi ?H U,8) 25 Gantrez AN-139 in HgO 12 ml l,2$(g/v) (10% w/v) FTP 300 mg 3% (g/v)

Een tweede impregneeroplossing werd bereid y.oor elk van de 30 te onderzoeken YMB-concentraties door 10, 25 9 50 en 75 g TMB

resp. toe te voegen aan vier 1,0 liter chloroformoplossingen met daarin 17,5 g ethylcellulose elk. De eindconcentratie aan TMB in deze impregneeroplossingen bedroeg 4l,9, 10U, 208 resp. 312 mM; terwijl de formules van deze oplossingen werden aangeduid als 35 I, II, III en 17. Zo is de verhouding van de molhoeveelheden TMB

7908224

-~L

-10 in de impregneeroplossingen I-IV tot het aantal Internationale Eenheden glucose-oxidase in de eerste impregneer oplos sing resp..

0. 52, 1,30, 2,60 en 3,90 mM per 1000 I.E. Overeenkomstig "bedragen de verhoudingen van het gewicht aan TMB in dmpregneeroplossingen 5 I-IV tot het aantal Internationale Eenheden glucosa-oxidase in de eerste impregneeroplossing 0,125» 0,313» 0,625 en 0,938 g/1000 1. E. Al deze verhoudingen zijn weergegeven in tahel A.

Vier stroken Eaton-Dikeman 20h (E. & D) filtreerpapier werden tot verzadiging geïmpregneerd met de eerste impregneeroplossing 10 en hij 80°C gedroogd. Elk van de aldus geïmpregneerde stroken werd vervolgens tot verzadiging in de tweede impregneeroplossing geïmpregneerd en hij 60°C gedroogd.

De aldus verkregen stroken papier, werden in stukjes van 0,5 x 1,0 cm gesneden tot proef strookjes. Deze strookjes werden 15 vervolgens aan de achterkant voorzien van aan heide zijden plakkend plakpapier en daarmede gehecht op een. plastic drager. Elk verkregen stukje papier bevatte ongeveer 1,7 I.E. glucose-oxidase en 5,^ I.E. peroxidase. De uiteindelijke hoeveelheden MB in de stroken met de preparaten I-IV bedroegen ca. 0,22, 0,55, 1,10 20 en 1,6 mg.

Voorbeelden van elke samenstelling werden onderzocht door ze resp. met telkens een van vier waterige glucoseoplossingen in aanraking te brengen. De glucoseconcentraties in deze oplossingen bedroegen 93, 201,9, 302,^ en 372,2 mg/dl. Na verzadiging 25 van de drager van elk strookje met monster liet men de reactie 60 seconden verlopen. Eventueel overmaat monster op de strook werd vervolgens weggewassen door het strookje in een waterstroom te brengen en eventueel overmaat vloeistof met weefsel weg te dippen. Het strookje werd vervolgens in een reflectantie-30 spectrofotcmeter ondergebracht en de kleurverandering afgelezen bij 550 nm en wel 20 seconden en 60 seconden na het wassen.

De reflectantiewaarden werden ongezet in K/S waarden als boven weergegeven en de resultaten zijn weergegeven in tabel A.

35 7909224 -11-

Tabel A

Formule I - 0,52 mM (0,125 g) 0MB per 1000 I.E. glucose-oxidase (GOD).

Glucosespiegel K/S

5 (mg/dl)_ 20 sec. 60 sec.

93 0,219 0,215 201.9 0,677 0,558 302, 1; 1,W>0 1,000 372.2 1,710 1,150

10 Formule II - 1,30 mM (0,313 g) 0MB per 1000 I.E. GOD

glucosespiegel K/S

-fag/gU- 20 sec. f-P-SgC-j.

93 0,238 0,239 201.9 0,651 0,6U0 15 302,k 1,200 1,100 372.2 1,560 1,310

Formule III - 2,60 mM (0,625 g) TMB per 1000 I.E. GOD

glucosespiegel K/S

(mg/dl) 20 sec. 60 sec.

20 93 0,278 0,283 r 201,9 0,630 0,63¼ 302,1; 1,170 1,160 372,2 1,550 1,530

Formule 17 - 3,90 mM (0,938 g) TMB per 1000 I.E. GOD 25 glucosespiegel K/S

(mg/dl)_ 20 sec. 60 sec.

93 0,279 0,281 201,9 0,716 0,715 302,1; 1,280 1,210 30 372,2 1,U80 1,1;30

De fig. 1*1; geven de cijfers van tabel A grafisch veer voor stroken met de preparaten I-I7. De doorlopende lijnen geven de K/S-aflezingen veer 20 sec. na vassen en de stippellijnen de S/S-aflezingen na 60 sec. Fig. 5 geeft het percentage aan 35 kleursvisseling grafisch veer als gedefinieerd (JK/S)/K/S x 100), 7903224 ψ -«* ..........-12-' voor stroken van elk van de preparaten I-IV.

Een stabiele kleur werd nagenoeg onmiddellijk na verwijderen van de overmaat monster van de stroken met de preparaten III en IV waargenomen, terwijl afname van de kleur met als re-5 sultaat een fout in de waargenomen glucosespiegel, optrad bij de stroken met preparaten I en II. De stroken met de preparaten III en IV met de hogere TMB-concentraties geven nagenoeg onmiddellijk een kleurseindpuntdat vervolgens stabiel blijft.

De fig. 1 en 2 tonen aan, dat er een duidelijke verandering 10 bestaat tussen de aflezingen na 20 sec. en na 60 sec. Deze aflezingen waren evenredig met de gevormde hoeveelheid chrcmogeen.

De hoeveelheid glucose, weergegeven door dit soort stroken is dus absoluut onbetrouwbaar. Daarentegen tonen de nagenoeg identieke aflezingen bij de fig.. 3 en aan, dat in dit geval de 15 gevormde kleur duidelijk stabiel was. Fig. 5 geeft het percentage kleursverschil weer tussen de aflezing na 20 sec. en die na 60 sec. welk percentage meer dan 30$ bedroeg bij preparaat I en minder dan 3$ bij preparaat III.

De uitvinding levert dus een 10-voudige verbetering ver-20 geleken met de stand van de techniek.

De volgende conclusies bakenen de uitvinding af.

7909224

Claims (11)

1. Pr oef reagens voor het "bepalen van glucose in een monster lichaamsvloeistof met daarin een giucose-cxidase, een peroxida-tief actieve stof en een 3,3' ,5,5'-tetraalkylbenzidine-indicator in een hoeveelheid voor het snel produceren bij contact van dit 5 reagens met een tevoren bepaalde hoeveelheid van een glucose-houdend monster, van een stabiel gekleurd reactieprodukt.

2. Froefreagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het reactieprodukt gereduceerde en geaxydeerde vormen van de indicator in een stabiel evenwicht bevat.

3. Froefreagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de 3,3*,5,5’-tetraalkylbenzidine-verbinding aanwezig is in een concentratie van tenminste 2,5 mmoh per 1000 I.E.. glucose-axidase-activiteit. ii. Froefreagens volgens conclusies lr-3, met het kenmerk, dat 15 het 3,3',5,5’-tetraalkylbenzidine het 3,3',5,5’-tetramethylben-zidine is.

5. Froefreagens volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het 3,31,5,51-tetr aalkylbenzidine het 3-methyl-3’-methyl, 5-ethyl, 5'-ethylbenzidine is.

6. Froefuitrusting voor het bepalen van glucose in een lichaamsvloeistofiaonster, met het kenmerk, dat dit bestaat uit een drager met daarin een proefreagens volgens de conclusies 1-3. 7· Froefui trusting voor het bepalen van glucose in een monster lichaamsvloeistof, met het kenmerk, dat dit bestaat uit 25 een drager met daarin een reagens volgens conclusie k.

8. Froefui trusting voor het bepalen van glucose in een monster lichaamsvloeistof, met het kenmerk, dat dit bestaat uit een drager met daarin een reagens volgens conclusie 5·

9. Froefui trusting voor het bepalen van glucose in een 30 monster lichaamsvloeistof, met het kenmerk, dat dit materiaal bestaat uit een dragermatrix waarbij elke 0,5 x 1,0 cm ürager-matrix ca. 1,7 I.E. glucose-cxidase, ca. 5Λ I.E. peroxidase en tenminste ca. 1,1 mg tetramethylbenzidine bevat. 7009224 -111·- •a?*· -*

10. Werkwijze voor het vervaardigen van een uitrusting voor het bepalen van glucose in een lichaamsvloeistof, met het kenmerk, dat men in een drager een reagens volgens conclusies 1-3 verwerkt .

11. Werkwijze voor het vervaardigen van een uitrusting voor het bepalen van glucose in een monster lichaamsvloeistof, met het kenmerk,, dat men in een drager een reagens, volgens conclusie ïl· verwerkt.

12. Werkwijze voor het vervaardigen van een uitrusting voor 10 het bepalen van glucose in een monster lichaamsvloeistof, met het kenmerk, dat. men in een drager een reagens volgens conclusie 5 verwerkt.

13. Werkwijze voor-het bepalen van glucose in. een monster lichaamsvloeistof, met het kenmerk, dat men een tevoren bepaalde 15 hoeveelheid van dit monster in contact brengt met een reagens volgens conclusies 1-3 en vervolgens de resulterende kleurs-verandering waarneemt. lU. Werkwijze voor het bepalen van glucose in een monster lichaamsvloeistof, met het kenmerk, dat men een tevoren bepaalde 20 hoeveelheid van dit monster in contact brengt met een reagens volgens conclusie k en vervolgens de kleursverandering waarneemt. 15· Werkwijze voor het bepalen van glucose in een lichaamsvloeistof , met het kenmerk, dat men een tevoren bepaalde hoeveelheid van dit monster in contact brengt met het reagens 25 volgens conclusie 5 en vervolgens de kleursverandering waarneemt . l6. Werkwijze voor het bepalen van glucose in een lichaamsvloeistof, met het kenmerk, dat men dit monster in contact brengt met een proefuitrusting volgens conclusie 6 en vervolgens de 30 waargenomen kleursverandering daarop waarneemt. 7909224