NL7908082A

NL7908082A - Werkwijze voor het in kringloop brengen en opnieuw gebruiken van cellulase-bestanddelen.

Info

Publication number: NL7908082A
Application number: NL7908082A
Authority: NL
Original assignee: Gulf Oil Corp
Priority date: 1979-04-27
Filing date: 1979-11-05
Publication date: 1980-10-29
Also published as: US4220721A; JPS55144885A; NO793101L; DE2943684A1; FR2455081B1; CA1128884A; BE882926A; FR2455081A1; GB2047709B; SE443802B; FI792997A; GB2047709A; SE7907773L; DK104280A

Description

Η.0.28.218 ' ^ *

Werkwijze voor het in kringloop brengen en opnieuw gebruiken van oellulase-bestanddelen.

Het opnieuw gebruiken van afvalcellulose door versuikering tot suikers en gelijktijdige bereiding van eencellig proteïne en door versuikering-fermentatie tot alcoholen, zuren en dergelijke heeft geleid tot een onderzoek naar nieuwe, actievere en goedkopere 5 bronnen van het enzym cellulase.

•Een van de toegepaste methoden is het onderzoek naar fungi en mutanten van fungi, die op natuurlijke wijze grote opbrengsten van het enzym voortbre.ngen, wanneer deze op geselecteerde voedings-milieus groeien.

10 Een andere methode is het opnieuw gebruik van enzym, dat reeds een of meer versuikeringsreacties katalytisch heeft bevorderd door het in kringloop brengen van het enzym. Het Amerikaanse octrooi-schrift 4*009*075 beschrijft een werkwijze voor een gelijktijdige destillatie onder een verminderde druk van een versuikering- 15 fermentatiereactie voor het winnen van de vluchtige produkten, in dit geval ethanol-water, beneden het ontledingspunt voor het enzym en het opnieuw gebruiken van de achtergebleven reactie-oplossing, die het enzym bevat, bij daaropvolgende versuikering-fermentatie-reacties. Deze laatste methode is aan te passen voor het in kring- 20 loop brengen van cellulase uit een reactie, die een vluchtig produkt geeft, dat verwijderd kan worden uit het reactiereservoir bij temperaturen waarbij het enzym stabiel is, dat wil zeggen lager dan 35°0» zoals bijvoorbeeld de werkwijze volgens het Amerikaanse oc-trooischrift 3,990.045* 25 Echter is de energie, noodzakelijk om de ethanol uit het reactiemengsel onder een verminderde druk te destilleren bij een voldoende lage temperatuur om de enzymen niet te ontleden, van een voldoende grootte, dat andere methoden gezocht moeten worden om het actieve enzym-systeem of een gedeelte ervan in kringloop te brengen.

30 Het is reeds eerder aangetoond, dat cellulase bestaat uit ten minste drie voornaamste werkzame bestanddelen, die geschikt zijn voor de afbraak van cellulose tot glucose-eenheden. Deze bestanddelen worden gemakshalve hier cellobiohydrolase, endoglucanase en β-glucosidase genoemd. Tan deze bestanddelen wordt het cellobio- 35 hydrolase (E.C.3.2.I.91) beschouwd als verantwoordelijk te zijn voor de hydrolyse van cellulose met de gelijktijdige voortbrenging van cellobiose-resten, endoglucanase (E.C.3*2.1.4) is verantwoor- 7908082 2

J

delink voor de inwendige splitsing van cellulose op willekeurige punten met de gelijktijdige voortbrenging van oligosacchariden met een lager molecuulgewicht en β-glucosidase (E.C.2.2.1 .21) dat, hoewel het geen cellulose af brekend enzym is in de zin van de hier-5 voor vermelde produkten, de ontleding van oellobiose tot glucose katalytisch bevordert.

Het is eveneens aangetoond dat zuivere cellulose, zoals bijvoorbeeld Avioel, zal adsorberen en binden tot cellobiohydrolase en dai endoglucanase deze daarbij concentreert uit water bevattende 10 mengsels.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het in kringloop brengen en opnieuw gebruiken van cellulase-bestanddelen bij de gelijktijdige versuikering-fermentatie van afvalcellulose bevattende produkten.

15 Meer in het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrek king op een werkwijze voor het in kringloop brengen en opnieuw gebruiken van cellulase-bestanddelen bij de gelijktijdige versuikering-fermentatie van afvalcellulose bevattende produkten, die de adsorptie inhouden van ten minste twee bestanddelen van het cellulase 20 enzym-systeem op een pas bereid gedeelte van afvalcelluloseprodukt en het gebruik van de enzym-afvalcellulose combinatie als een deel van de toevoer naar een verdere gelijktijdige versuikering-fermentatie reactie.

Tijdens de versuikering van cellulose bij aanwezigheid van 25 het enzym cellulase in water bevattende suspensie, worden de vaste celluloseprodukten vloeibaar gemaakt en in water opgelost. Afhankelijk van de kristaltoestand en de ontvankelijkheid van de cellulose ten opzichte van afbraak, zullen ongeveer 20 tot ongeveer 80 % van de vaste stoffen uit de suspensie verdwijnen. Yan de drie hoofd-50 bestanddelen van het cellulase enzym-systeem binden twee,, cellobiohydrolase en endoglucanase, aan vast cellulose en worden tijdens de afbraak en het vloeibaar maken afgegeven aan de water bevattende oplossing. Het derde bestanddeel, β-glucosidase, bindt niet aan de cellulose en blijft op alle tijdstippen in de water bevattende fase. 55 Derhalve zijn bij of nabij de voltooiing van een versuikerings-reactie de bestanddelen van cellulase in oplossing en beschikbaar voor een geschikte terugwinningsmethode.

Gebleken is, dat de cellulase-bestanddelen hun activiteit behouden en ook in oplossing zijn na een gelijktijdige versuikering-40 fermentatie reactie, die afbraak van de cellulose tot ethanol ver- 7908082 3 oorzaakt. Bovendien remt de aanwezigheid van ethanol niet het terugwinnen van cellobiohydrolase en endoglucanase uit de oplossing.

Toorts werd gevonden, dat vergroting van de concentratie van endoglucanase en cellobiohydrolase alleen bij een gelijktijdige 5 versuikering-fermentatie reactie de snelheid en opbrengst van de ethanol-terugwinning kan verbeteren. Tijdens de gelijktijdige versuikering-fermentatie wordt de met enzym katalytisch bevorderde afbraaksnelheid van cellulose verbeterd tot een punt, dat het glucosegehalte van het produkt sneller toeneemt dan de gist het kan 10 verbruiken door omzetting tot ethanol. Derhalve kan men door terugwinning en opnieuw gebruik van de aan cellulose adsorbearbare enzym-bestanddelen niet alleen de enzymbestanddelen conserveren, maar tevens de opbrengst en terugwinsnelheid van ethanol uit een daarop volgende gelijktijdige versuikering-fermentatiereactie verbeteren.

15 De adsorptie wordt bij voorkeur tot stand gebracht door fil tratie van het reactiemengsel ter verwijdering van de vaste stoffen en vervolgens de enzymen uit het filtraat te adsorberen door de reactie-oplossing te leiden door een los verpakte prop van een deel van het cellulose bevattende uitgangsprodukt, dat gebruikt zal wor-20 den voor de daaropvolgende gelijktijdige versuikering-fermentatie-reacties.

Deze prop, die het teruggewonnen endoglucanase en cellobiohydrolase bevat, kan gecombineerd worden met extra uitgangsprodukt, dat extra enzym inoculum bevat, om de initiële concentratie van 25 β-glucosidase tot stand te brengen en het geheel kan op de gebruikelijke wijze aan een versuikering-fermentatie worden onderworpen. Ook wordt voldoende vers inoculum toegevoegd om de gebruikelijke initiële concentratie van cellobiohydrolase en endoglucanase tot stand te brengen. Dit zou een tekort aan β-glucosidase, het cellu-30 lose hydrolyserende enzym, geven. Hei tekort aan β-glucosidase- concentratie beïnvloedt niet wezenlijk nadelig de opbrengstsnelheid van ethanolvorming, hoewel de gebruikelijk toegepaste gisten, die glucose tot ethanol fermenteren, zoals bijvoorbeeld Saccharomyces cerevisiae , Candida brassioae en Hhizopus javanicus niet wezenlijk 35 cellobiose tot ethanol fermenteren.

Als een aanvullende methode kan de water bevattende ebhanol-oplossing, waaruit het endoglucanase en cellobiohydrolase verwijderd is, gefiltreerd worden door een prop van een oligosaccharide van 6 of meer glueose-eenheden in lacton-vorm. Het oligosaccharidelacton 40 bindt de β-glucosidase-fractie, die ook kan worden toegevoegd aan 7908082 j - 4 de volgende versuikeringsreactie. Ook kan het β-glucosidase geadsorbeerd worden aan conconavaline A, een haemagghrbinerend proteïne geïsoleerd uit de "jack bean" (Canavalia ensiformis). Conconavaline A is verkrijgbaar bij Pharmacia Pine Chemicals, Piscataway, New Jersey, 5 08854> als Con A en Con A sepharose.

Afvalprodukten, die cellulose bevatten, die hiervoor zijn beschreven als potentiële bronnen voor afbraak tot eenvoudige organische moleculen met de gelijktijdige bereiding van een proteïne, geschikt in diervoeders, zijn eveneens geschikt als adsorptie-10 middelen voor een enzym-kringloopproces. Tot bronnen van dit afval-materiaal behoren gemeentelijk afval, afval van papierfabrieken, afval van zagerijen, afval van katoen-ontkorrelingsmachines en dergelijke. Yan bijzondere geschiktheid zijn afvalpapier en karton, die vooraf kunnen zijn gezwollen of tot pulp verwerkt en een los 15 verpakte prop zullen vormen, die geschikt is voor filtratie of voor ' suspensie-adsorptie en die voldoende oppervlakteplaatsen bevat voor enzym-adsorptie.

Ook kan een gezuiverd celluloseprodukt gezuiverd worden als adsorptiemiddel, dat vervolgens wordt toegevoegd aan de uitgangs-20 produkten. Een dergelijke gezuiverde cellulose wordt in de handel gebracht door American Yiscose Division, PMC Corporation, Newark, Delaware, onder de handelsnaam Avicel.

Na voltooiing van een gelijktijdige versuikering-fermentatie-reactie, dat wil zeggen na reactie tot in hoofdzaak evenwicht, be-25 vat het reactiemilieu niet omgezette cellulose, vaste oligosaccha-riden, lignocelluloseachtige produkten en andere niet gedefinieerde vaste afbraakprodukten, alsmede alcohol, voedingsstoffen, cellulase-enzymbestanddelen en gisten en gistcellen.

Filtratie ter verwijdering van de vaste produkten is gewoonlijk 50 de eerste trap bij de zuivering van het gewenste ethanolprodukt.

Het filtraat wordt vervolgens onderworpen aan een stripbehandeling onder verminderde druk om de ethanol te verwijderen. Yolgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding wórden de enzymen u±t de versui-keringsreactie behouden en in kringloop gebracht voorafgaande aan 35 de stripbehandeling van ethanol.

Yolgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding wordt elk cellulose bevattend vast produkt met een voldoende specifiek oppervlak voor het verschaffen van bindingsplaatsen voor het enzym, in aanraking gebracht met het enzym bevattende filtraat uit een gelijk-40 tijdige versuikering-fermentatiereactie, diede gelegenheid heeft 7908082 5 gekregen vrijwel het reactie-evenwicht te bereiken. De werkwijze voor het in aanraking brengen kan zijn door toevoeging van de vaste bestanddelen van de cellulose voor het vormen van een suspensie en snelle filtratie van de suspensie voor het winnen van het enzym-5 cellulose vaste stof en door het enzym bevattende filtraat door een prop van los verpakte vaste bestanddelen van cellulose te leiden.

Om de snelle binding, noodzakelijk voor deze werkwijze, te doen plaats hebben is vastgesteld, dat het contact gemaakt dienfcte worden bij een pH groter dan 5 en bij een ionensterkte groter dan 0,05 M.

10 Bij ionensterkten van 0,05 M tot 0 zullen de enzymen niet binden en heeft elutie plaats. Bereden een pH van ongeveer 4>8 zullen de enzymen niet binden en heeft elutie plaats. Aangezien echter bij de werkwijze van de onderhavige uitvinding de enzymen geadsorbeerd • worden op een substraat, dat zij zelf tot vernietiging kunnen bren-15 gen gegeven geschikte reactie-omstandigheden en daarbij kunnen worden af gegeven aan de milieus, wordt de werkwijze van de onderhavige uitvinding voorts tot stand gebracht door combinatie van het geadsorbeerde enzym-cellulosemengsel met verse cellulosetoevoer bij een daaropvolgende gelijktijdige versuikering-fermentatiereactie zonder 20 elutie.

Bij een pH groter dan 8 gaat de endoglucanase-activiteit verloren door denaturering van het proteïne. Om deze reden dient de adsorptie plaats te hebben tussen een pH van ongeveer 5 en 8 en bij voorkeur bij een ρΞ tussen ongeveer 5 en 7.

25 Anngezien, zoals hiervoor vermeld, de enzymbestanddelen snel werken bij het veroorzaken van afbraak en vloeibaar maken van het cellulose-adsorbeermiddel, een reactie, die plaats heeft boven ongeveer 30°0, is het gewenst de adsorptie uit te voeren bij temperaturen bij of beneden omgevingstemperatuur voor het remmen van de af-50 braak van het cellulose-adsorbeermiddel. Temperaturen van ongeveer 5°G tot ongeveer 20°C verdienen de voorkeur.

Na de voltooiing van de versuikering-fermentatiereactie zullen enkele vaste produkten achterblijven en hiertoe kunnen behoren niet-omgezette cellulose en vaste afbraakprodukten, lignocelluloseproduk-35 ten, niet-omgezette vaste bestanddelen van het uitgangsafvalprodukt en dergelijke. Aangezien een gedeelte van de cellulase zal achterblijven op deze accumulatie van niet-reactieve produkten is de opbrengst aan geregenereerde cellulase niet theoretisch en extra vers enzym dient eveneens te worden gebruikt. Deze behoefte aan extra 40 enzym hangt af van de hoeveelheid en de aard van de vaste stoffen 7908082 .y 6 in het reactiemengsel en kan slechts -worden vastgesteld door analyse van het teruggewonnen enzym.

Deze methode wordt doelmatig gebruikt voor het doen toenemen van de cellulose-hydrolyse snelheidsbepalende enzymen door toevoe-5 ging van vers inoculum tot een standaard β-glucosidase-activiteit of de werkwijze kan gebruikt worden om te bezuinigen op het gebruik van vers inoculum voor het verschaffen van een standaard endogluca-nase of cellobiohydrolase niveau.

Cellulase inoculum, dat voor de onderhavige uitvinding geschikt 10 is, kan in de handel gekocht worden bij Meiji Seika Kaisha Ltd.

Tokyo, Japan als Meicelase P of kan vervaardigd worden als een metaboliet van het groeiprodukt van Trichoderma viride, Triohoderma koningii, Fusarium solani, Fusarium javanicum, en dergelijke. De bereidingswijze van de water bevattende cultuurmassa, die het cellu-15 lolytische enzymcomplex bevat, is gebruikelijk, waarbij de cellulo-lytische micro-organismen op een bekende wijze gekweekt worden in een water bevattend voedingsmiddel-milieu bij aanwezigheid van een celluloseachtig produkt in schudflessen of in een ondergedompelde · cultuur. Geschikte methoden zijn vermeld in het artikel van Mandeis & 20 Weber, Advances in Chemistry Series, ACS 95, (19^9) 39-414·

Bij voorkeur wordt de water bevattende cultuurmassa of een gedeelte daarvan direct toegepast in het cellulose-versuikeringsproces zonder verdere behandeling, behalve om de pH te regelen, wanneer dat noodzakelijk is, zoals beschreven volgens de werkwijze van het Ame-25 rikaanse ootrooischrift 3.990.945·

Als het alcohol producerende micro-organisme, dat gelijktijdig met de cellulase gebruikt wordt, kunnen micra-organismen worden toegepast zoals bijvoorbeeld Sacoharomyces cerevisiae en Rhizopus java-nicus, die tot dusverre zijn toegepast voor de omzetting van glucose 30 tot ethanol.

De methode voor het in kringloop brengen van cellulase-bestand-delen is geschikt voor ladingsgewijze toepassing, zoals meer in het bijzonder beschreven zal worden injaet hierna volgende voorbeeld. Zorgvuldigheid moet in acht genomen worden bij de adsorptie van het 55 enzym op cellulose en overdrachten dienen met redelijke spoed te worden uitgevoerd, aangezien de .geadsorbeerde enzym-bestanddelen de cellulose tamelijk snel zullen oplossen door hun katalytische effect op de hydrolyse. Wanneer eenmaal oplossing heeft plaats gevonden zal het enzym, hoewel nog geadsorbeerd op de oplosbare oligo-40 sacchariden, verloren gaan aan de bovenstaande laag. De werkwijze 7908082 7 lev

Van ook worden aangepast voor semi-continue uitvoering door toepassing van adsorptie in een kolom in tegenstroom, waarbij het versuikering-fermentatieprodukt na filtratie in tegenstroom gebracht wordt door een geconcentreerde suspensie van een gedeelte 5 van het uitgangscellulose bevattende produkt. Bij deze techniek is het van belang de contacttijd te beperken om de hoeveelheid ver-suikering, die in de overdrachtsruimte kan plaatsvinden, tot een minimum te beperken. Zoals hiervoor beschreven kan oplossing van de cellulose zonder volledige afbraak tot glucose plaatsvinden in 10 de adsorptieruimte, die plaatsen voor adsorptie van het enzym zal verwijderen.

7908082 Μ 8

Voorbeeld I

Aan twee duplokolven van 1 liter (gemerkt A en B) werden toegevoegd: 229 g van een water bevattende suspensie van door water 5 verpulpte fijne bestanddelen van een pulpfabriek, die 6 % cellulose bevatten; 200 ml van een cellulase-oplossing van de volgende analyse:

Filtreerpapier reducerende suikeractiviteit volgens de methode van Mandeis en Weber, "The Production of Cellulases" 10 Advances in Chemistry Series, ACS 95» 391-414 2δ.20χ10~^, β-glucosidase volgens de methode van Emert, Purification and Characterization of Cellobiase from Trichoderma viride, University of Microfilms 74-12,343, Virginia Polytechnic Institute en State University 1973» biz. 28-29, 1θ6.6θχ10~ en proteïne volgens de 15 methode van Emert (zie hiervoor) blz. 34, 4,50 rag/ml; 250 ml van een voedingsmilieu, bestaande uit de volgende bestanddelen per liter oplossing: ΚΗ2Ρ0^ 2,2 g, MgSO^ . 7H20 0,5 g, KCl'1,7 g, K-citraat-monohydraat 4,0 g, citroenzuur monohydraat 0,8 g, CaCl2 0,25 g, 20 ureum 2,5 g, gistextract 1,0 g FeSO^ · 7H20 10 mg, MnSO^ · H20 10 mg, ZnSO^ . 7H20 10 mg, CuSO^ 1 mg; 21 ml water en 25 ml van een suspensie van Saccharomyces cerevisiae ATCC 4132 met een celtelling van 200 - 250x10 cellen/ml, die vooraf 25 18 uren zijn gekweekt. De inhoud van de kolven werd 72 uren bij 40°C en 150 omwentelingen/minuut geroerd.

Tijdens de hiervoor vermelde reactie werden additionele duplomonsters (elk 229 g) van de hiervoor beschreven fijne bestanddelen van de pulpfabriek gedrenkt in een oplossing van 0.,04- M ace-30 taatbuffer bij een pH van 5 gedurende 5 minuten en gefiltreerd om ten minste het volume vloeistof, dat de buffer voorstelt, te verwijderen. De inhoud van de kolven A en B werd gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistof werd toegevoegd aan de gebufferde monsters van de fijne bestanddelen van de pulpfabriek en 15 minuten bewaard, 35 vervolgens gefiltreerd om ten minste de hoeveelheid, toegevoegde vloeistof te verwijderen· De verkregen mengsels (gemerkt 3 en 40 en twee controle-mengsels (gemerkt 1 en 2), die elk 229 g van de fijne bestanddelen van de pulpfabriek bevatten, werden op de volgende wijze behandeld: Aan elk werden 25 ml van het hiervoor beschre-40 ven voedingsmilieu, 200 ml van de hiervoor beschreven cellulase- 7908082 9 *** oplossing, 25 g van de hiervoor beschreven gistoplossing en voldoende water toegevoegd voor het verkrijgen van een totaal gewicht van 500 g. De mengsels werden 168 uren bij 40°C en 150 omwentelingen/ minuut omgezet. Glucose en ethanol concentraties en omzettingen 5 werden bepaald na 4-8, 72, 96, 144 en 168 uren.

Kolf Monster EtOH Glucose Percentage _ na h mg/ml mg/ml omzetting 1 48 17,80 0,33 52,76 72 18,31 0,31 54-,86 96 18,51 0,59 54,86 144 19,00 0,15 56,32 168 21,20 0,14 62,84 2 48 15,92 0,36 47,19 72 17,27 0,30 . 51,19 96 18,46 0,30 54,72 144 19,51 1,29 57,83 168 21,02 0,14 62,30 3 48 20,70 0,64 61,35 72 21,65 0,83 64,17 96 23,41 1,52 69,39 144 25,08 2,86 74,33 168 25,79 3,14 76,44 4 48 21,44 0,64 63’, 55 72 23,27 1,24 68,97 96 25,49 2,77 75,55 144 25,83 4,51 76,56 168 26,98 5,2 79,97

De monsters 3 en 4, die met de bovenstaande vloeistof, verkregen bij een eerdere reactie in contact waren gebracht, vertoonden een toegenomen ethanol-opbrengst en omzettingssnelheid tot 168 uren reactietijd.

7908082

Claims

1. Werkwijze voor het in kringloop brengen van de endoglu-canase (E.C.3.2.1.4) en cellobiohydrolase (E.C.3*2.1.91) activi-teitsgedeelten van cellulase enzym, dat gebruikt is als het cellu- 5 lose hydrolyserende enzym bij een gelijktijdige versuikering-fer-mentatie-reactie van cellulose tot ethanol, met het kenmerk, dat men a£- (1) de vloeibare fractie ui± het reactiemengsel^scheidt, (2) dit enzym en de alcohol bevattende vloeibare fractie in aan-10 raking brengt met een cellulose bevattende vaste stof, die geschikt is voor de gelijktijdige versuikering-fermentatie-reactie bij een pH van ongeveer 5 tot ongeveer 8 en bij een ionensterkte van meer dan 0,05 M om de enzymen daarop te adsorberen, (3) de vaste fractie, die de geadsorbeerde enzymen bevat, af-15 scheidt en (if) de vaste enzym-cellulose-combinatie gebruikt als een gedeelte van de toevoer aan een verdere g-eli jkti jdige versuikeripg-fermen-tatie-reactie.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, dat men het enzym en de 20 alcohol bevattende vloeibare fractie en de cellulose bevattende vaste stof met elkaar in aanraking brengt bij een temperatuur van ongeveer 5°C tot ongeveer 20°C.

3· Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men het enzym en de alcohol bevattende vloeibare 25 fractie en de cellulose bevattende vaste stof met elkaar in aanraking brengt door de vaste stof toe te voegen aan de vloeistof voor het vormen van een suspensie. if. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het enzym en de alcohol bevattende vloeistof-frac-30 tie en de cellulose bevattende vaste stof in aanraking brengt door de vloeistof te gieten door een los gepakte prop van de vaste stof.

5· Werkwijze voor het uitvoeren van een reeks gelijktijdige versuikering-fermentatie-reacties ter bereiding van ethanol uit cellulose, met het kenmerk, dat men een gelijktijdi-35 ge versuikering-fermentatie-reactie uitvoert tot in hoofdzaak reac-tie-evenwicht, de vloeibare fractie daarvan afscheidt, de vloeibare fractie in aanraking brengt met cellulose geschikt voor een daarop volgende gelijktijdige versuikering-fermentatie-reactie bij een pH tussen ongeveer 3 en ongeveer 8 en bij een ionensterkte van ten min-kO ste 0,05 M om de endoglucanase (E.C.3*2.1*k) en cellobiohydrolase 7908082 11 * 4* (E.C.3»2.1.91) gedeelten van cellulase activiteit daaruit te adsorberen, de va'ste fractie afscheidt, de vaste fractie toevoegt aan een daarop volgende gelijktijdige versuikering-fermentatie-reactie en vers cellulase inoculum toevoegt om het cellobiohydrolase en 5 endoglucanase op het standaard-niveau te brengen.

6. Werkwijze voor het uitvoeren van een reeks gelijktijdige versuikering-fermenfcatie-reacties ter bereiding van ethanol uit cellulose, met het kenmerk, dat men een gelijktijdige versuikering-fermentatie-reactie uitvoert tot in hoofdzaak reac-10 tie-evenwicht, de vloeibare fractie daarvan afscheidt, de vloeibare fractie in aanraking brengt met cellulose geschikt voor een daarop volgende gelijktijdige versuikéring-fermentatie-reactie bij een pH tussen ongeveer 5 en 8 en bij een ionensterkte van ten minste 0,05 M voor het adsorberen van de endoglucanase (E.C. 3·2·1·4) en 15 cellobiohydrolase (E.C. 3.2.1.91) gedeelten van cellulase-activi-teit daaruit, de vaste fractie afscheidt, de vaste fractie toevoegt aan een daarop volgende gelijktijdige versuikering-fermenta-tie-reactie en vers cellulase inoculum toevoegt om de β-glucosidase (E.C.3.2.1.21) enzym activiteit op het standaard-niveau te brengen. 20 ******** 7908082