NL1005947C2 - Werkwijze voor de verestering van koolhydraten. - Google Patents

Description

Werkwijze voor de verestering van koolhydraten

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de enzymatische verestering van koolhydraten.

Vetzuuresters van koolhydraten, zowel van mono,- di- en oligo-sachariden als 5 van polysachariden, hebben nuttige eigenschappen zoals oppervlakte-actieve, emulgerende en in enkele gevallen geneeskrachtige eigenschappen. Van oudsher werden dergelijke esters gewoonlijk langs chemische weg, in het bijzonder door base gekatalyseerde reactie met vetzuurderivaten, bereid.

De chemische verestering van koolhydraten is echter weinig selectief. Boven-10 dien zijn daarbij drastische omstandigheden vereist, waardoor het koolhydraat zelf kan worden aangetast. Daardoor ontstaan talrijke ongedefinieerde en/of ongewenste bijproducten. Verder zijn voor voedingstoepassingen chemische behandelingen minder gewenst.

Enzymen zoals lipasen blijken ook in staat de verestering van koolhydraten te 15 katalyseren, en wel met meer selectiviteit, in hoofdzaak alleen primaire hydroxylgroepen, en onder mildere omstandigheden. Wanneer een dergelijke enzym-gekatalyseerde verestering van koolhydraten in een watermedium wordt uitgevoerd, ligt het evenwicht sterk aan de kant van de hydrolyse, en zijn de opbrengsten aan esters bijgevolg laag. Verschillende enzymen, zoals lipasen en proteasen, blijken echter ook in organische 20 oplosmiddelen werkzaam te zijn. Veel gebruikte oplosmiddelen voor enzym-gekatalyseerde veresteringen zijn pyridine, dimethylformamide, tetrahydrofuran e.d.. Door Woudenberg c.s. (Biotechn. Bioeng. 49, 328-333 (1996)) is onlangs de selectieve verestering van disachariden met C4/C12-acylgroepen onder invloed van lipase van Candida antarctica in tert-butylalcohol beschreven. De esters van maltose en trehalose 25 worden daarbij in goede opbrengst verkregen, maar sucrose en lactose worden onder die omstandigheden nauwelijks veresterd.

Leiden de bekende enzymatische veresteringen dus niet altijd tot de gewenste opbrengst, een bijkomend nadeel van deze werkwijzen is het gebruik van organische oplosmiddelen. Het gebruik van organische oplosmiddelen gaat doorgaans gepaard met 30 afvalproblemen en met residuen in het veresteringsproduct, hetgeen zeker voor levens-middel-toepassingen ongewenst is. Enzymatische verestering zonder oplosmiddel lukt 1005947 2 NO 41257 alleen voor sorbitol en fructose in enige bruikbare mate (Ducret et al. Biotechn. Bioeng. 48, 214-221 (1995); Guillardeau et al. Tenside Surf. Det. 49, 342-344 (1992)). Andere, vooral de grotere, koolhydraten mengen onvoldoende met de vetzuurderivaten, zeker wanneer die lange ketens hebben, zodat nauwelijks of geen resultaat wordt verkregen.

5 Uit EP-A-268461 is een werkwijze voor de bereiding van vetzure esters van geëpoxideerde suikers bekend, waarbij men een enzymatisch verkregen epoxide-adduct chemisch omzet met een vetzuur. Bij deze werkwijze worden di- en polysachariden gesplitst in monosachariden, zoals galactose uit lactose. Bovendien wordt de epoxide-groep altijd aan het anomere centrum ingevoerd.

10 Gevonden is nu dat men koolhydraten doelmatig met lange acylgroepen kan veresteren, onder behoud van de ketenlengte van het koolhydraat, wanneer men het koolhydraat vooraf langs chemische weg modificeert door reactie met een epoxyalkaan. Bij koolhydraten met korte keten, met een DP (degree of polymerisation) tot ongeveer 4-6, is hiervoor in het geheel geen organisch oplosmiddel nodig. Deze werkwijze zonder 15 oplosmiddel is geschikt voor de verestering van monosachariden en vooral van di- en oligosachariden, zoals sucrose, lactose, maltose, isomaltose, lactulose, raffinose, stachyose, verbascose, kortketenig inuline, amylodextrinen e.d., in het bijzonder sucrose en lactose. Ook suikeralcoholen, in het bijzonder van disachariden zoals lactitol en maltitol, kunnen langs deze weg worden veresterd.

20 De uitgangsstoffen voor de werkwijze kunnen natuurlijke koolhydraten zijn, zoals sucrose, lactose, raffinose, zetmeel, inuline, cellulose e.d., of voorbewerkte natuurlijke koolhydraten. De eventuele voorbewerking kan bij voorbeeld een hydrolyse, in het bijzonder een enzymatische hydrolyse zijn, zoals een ketenverkorting van zetmeel (amylase), cellulose (cellulase), hemicellulose (xylanase) en inuline (inulinase). Ook 25 (semi)synthetische koolhydraten kunnen worden gebruikt.

Onder verestering zonder oplosmiddel wordt verstaan een verestering waarbij geen noemenswaardige hoeveelheden van een niet reagerend oplosmiddel - dit ter onderscheiding van het vetzuur of derivaat daarvan - wordt toegepast.

De voorafgaande reactie met een epoxyalkaan leidt tot een hydroxyalkylderivaat 30 van het koolhydraat. Deze hydroxyalkylering kan op op zichzelf bekende wijze plaats vinden, bij voorbeeld door reactie van het koolhydraat met een overmaat epoxyalkaan, in aanwezigheid van een base, zoals natriumhydroxide, natriumbicarbonaat, kalium- 100 5947 3 NO 41257 carbonaat of triethylamine. Deze hydroxyalkylering vindt hoofdzakelijk niet aan een eventueel aanwezig anomeer centrum plaats. Als epoxyalkaan kan een monofunctioneel epoxide zoals ethyleenoxide worden toegepast, maar bij voorkeur heeft het epoxide nog een tweede functie, zoals een hydroxy-, epoxy-, amino- of thiol-groep, die later kan 5 worden geacyleerd. Voorbeelden zijn glycidol, epichloorhydrin en butaandiepoxide.

Bij wijze van voorbeeld kan de volgende algemene werkwijze voor de voorafgaande reactie met een epoxyalkaan worden gegeven. Aan 100 mmol (monosacharide-eenheden) koolhydraat in 100 ml basisch water (bijvoorbeeld 0,01-1 M loog) wordt 100 tot 800 mmol glycidol toegevoegd. Na enige uren (gewoonlijk 1 tot 5 uur, afhankelijk 10 van de temperatuur, gewoonlijk tussen 40 en 100°C) is de reactie voltooid en wordt het reactiemengsel geneutraliseerd. Het mengsel wordt ingedampt en is gereed voor enzymatische verestering.

De uiteindelijke verestering kan, in geval van hydroxyalkyl-koolhydraten, chemisch of enzymatisch geschieden. De chemische verestering vindt op gebruikelijke 15 wijze plaats, door reactie van een reactief derivaat van het vetzuur, zoals het chloride, het anhydride of een alkylester, gewoonlijk in overmaat, in aanwezigheid van een base en eventueel een katalysator. Bij voorkeur vindt de verestering echter enzymatisch plaats.

De enzymatische verestering geschiedt met een lang vetzuur of derivaat daar-20 van, zoals een ester. De ethylester heeft daarbij voorkeur, omdat deze, anders dan bij voorbeeld de methylester, niet storend werkt op het veresteringsenzym. In het algemeen is de werkwijze geschikt voor het invoeren van acylgroepen, in het bijzonder acyl-groepen met ten minste 6 koolstofatomen, waarbij de voorkeur gaat naar acylgroepen met ten minste 10 koolstofatomen, tot ongeveer 24 koolstofatomen. Een product met 25 bruikbare eigenschappen wordt al verkregen met gemiddeld 0,2 lange acylgroepen per monosacharide-eenheid of met ten minste 1 lange acylgroep per molecule. In het bijzonder bereidt men een product met 0,5-1,0 C6-C20-acylgroepen per monosacharide-eenheid. Bij de disachariden bij voorbeeld bereidt men bij voorkeur een mono-C6 ~c20~ acyl- of een di- C6 C24 -acyl-derivaat of een mengsel daarvan. De lange acylgroepen 30 worden in hoofdzaak op de primaire posities ingevoerd, bij sucrose het eerst op de 6-positie van de fructose-eenheid. In de hydroxyalkyl-koolhydraten kunnen de acylgroepen ook op de hydroxyalkylgroep worden ingevoerd.

1005947 NO 41257 4

Bij de enzymatische verestering wordt een geschikt enzym toegepast, in het bijzonder een lipase. Een voorbeeld van een bruikbare lipase is die van Candida antarctica, die in de handel onder de naam Novozym 435 verkrijgbaar is. Ook andere enzymen, waaronder bepaalde proteasen zoals subtilisine, kunnen voor de enzymatische verestering 5 worden toegepast.

Indien men voor de enzymatische verestering een oplosmiddel gebruikt, kan dat een polair organisch oplosmiddel zijn, zoals een alcohol, ether, keton, amide, nitril, chloride, sulfon, sulfoxide, nitril of nitroverbinding. Bij voorkeur gebruikt men een tertiaire alcohol, zoals t-butylalcohol, of bij voorbeeld dichloormethaan of dimethyl-10 formamide. Bij voorkeur is weinig of geen water aanwezig.

De uitvinding heeft ook betrekking op geacyleerde, gehydroxyalkyleerde koolhydraten, die per monosacharide-eenheid 0,5-2,0 acylgroepen en 0,5-4,0 hydroxyalkyl-groepen bevatten. Daarbij kunnen de acylgroepen zowel met hydroxylgroepen van het koolhydraat zelf, als met hydroxylgroepen van de hydroxyalkylgroepen zijn veresterd. 15 Aldus voldoen de esters volgens de uitvinding aan de formule: (Acy1)n-pSach(Hyal)m-p(HyalAcy1)p waarin Sach de koolhydraatrest, Acyl de acylgroep en Hyal de hydroxyalkylrest voorstelt, m het totaal aantal aan het koolhydraat gekoppelde hydroxyalkylgroepen, n het totaal aantal aan het koolhydraat gekoppelde acylgroepen en p het aantal via een 20 hydroxyalkylgroep aan het koolhydraat gekoppelde acylgroepen voorstelt, waarbij p een getal tussen 0 en het kleinste van m en n kan voorstellen. Ook kunnen twee of meer hydroalkylgroepen aan elkaar zijn gekoppeld zoals in het geval van 2,3-dihydroxy-propylgroependestructuurSach-0-(CH2-CHOH-CH20)-(CH2-CHOH-CH20)q-Acyl oplevert, waarin q 0-10, in het bijzonder 0-2 is.

25 De acylgroepen kunnen bij voorbeeld alkanoyl-, alkenoyl, alkynoyl, alkapoly- enyl-, aroyl-, arylalkanoyl- of cycloalkylalkanoyl-groepen of gesubstitueerde varianten daarvan, zoals met hydroxy, alkoxy, carboxy, amino, alkoxycarbonyl e.d. gesubstitueerde groepen zijn. Voorbeelden zijn acetyl, propionyl, caproyl, decanoyl, lauroyl, palmitoyl, stearoyl, ricinoleoyl, acryloyl, propiolyl, oleoyl, linoleyl, benzoyl, phenylacetyl, p-30 methoxycinnamoyl, nicotinoyl, cyclohexylcarboxyl, kamferoyl, en mengsels daarvan zoals mengsels van C10-C18-acylgroepen. De voorkeur gaat naar C6-C20-alkanoyl-groepen. De hydroxyalkylgroepen kunnen hydroxyethyl, hydroxy propyl, 2,3-dihydroxy- 1005947 5 NO 41257 propyl, 2,3,4-trihydroxybutyl en dergelijke zijn, in het bijzonder 2,3-dihydroxypropyl, waarbij deze groepen, naast of in plaats van de hydroxylgroepen van het koolhydraat zelf, kunnen zijn geacyleerd.

De uitvinding heeft verder betrekking op nieuwe tussenproducten in de vorm 5 van gehydroxyalkyleerde di- of polysachariden, die per monosacharide-eenheid 0,5-4,0 2,3-dihydroxyalkylgroepen of andere 0,5-4,0 polyhydroxyalkylgroepen bevatten, in hoofdzaak of uitsluitend op andere posities dan een eventueel aanwezige anomere positie. De di- of polysachariden zijn in het bijzonder sucrose, lactose, maltose, isomaltose, cellobiose, en hogere homologen zoals maltotriose en raffinose.

10 De uitvinding levert oppervlakte-actieve en emulgerende verbindingen die enerzijds zijn verkregen uit hernieuwbare grondstoffen, namelijk suikers, glycerol en vetzuren, en die anderzijds biologisch afbreekbaar zijn. Daardoor zijn deze zowel wat betreft de productie als wat betreft bij de uiteindelijke verwerking milieuvriendelijk. Bovendien zijn de stoffen geschikt voor toepassing in voedingsmiddelen.

15 Voorbeelden Voorbeeld 1

Verethering van sucrose met glycidol 10 g sucrose wordt opgelost in 0,15 M natriumhydroxide-oplossing en bij 80-85°C worden hieraan 3 equivalenten glycidol (t.o.v. sucrose) toegedruppeld. Na 2 uur 20 wordt het reactiemengsel afgekoeld en geneutraliseerd met verdund zoutzuur. Het reactiemengsel wordt hierna ingedampt. Onder deze condities is volgens GC-analyse op molbasis 51% glycerylsucrose gevormd en 19% van een digesubstitueerd product. Het restant is niet-omgezette sucrose.

Indien minder glycidol wordt gebruikt, bijvoorbeeld 1 of 2 equivalenten, daalt 25 de hoeveelheid glycerylsucrose tot respectievelijk 31% en 42%, terwijl bij een grotere hoeveelheid glycidol, bijvoorbeeld 4 of 5 equivalenten, het digesubstitueerde product het hoofdproduct wordt met respectievelijk 45% en 48%. Indien de reactie met 1,5 M natronloog wordt uitgevoerd, is de hoofdreactie de vorming van glycerol.

Bij alle hierboven beschreven reacties is glycerol een nevenproduct. Aangezien 30 dit in de veresteringsstap glycerolesters als bijproduct zal geven, wordt de glycerol verwijderd door middel van kolomchromatografie over een kolom van Norit ROX 0.8.

1005947 6 NO 41257

Glycerol wordt geëlueerd met water, waama met een gradiënt van aceton in water (tot 10%) sucrose en koppelingsproducten van glycidol en sucrose worden geëlueerd.

Voorbeeld 2

Enzymatische verestering van glycerylsucrose met ethylpalmitaat 5 Glycerylsucrose (2 g) dat is gesynthetiseerd met 3 equivalenten glycidol en gezuiverd van glycerol (zie voorbeeld 1) wordt gesuspendeerd in 10 ml tert-butylalcohol en 4 g ethylpalmitaat. Nadat hieraan 1 g zeoliet 5A is toegevoegd ter verwijdering van water en ethanol, wordt het reactiemengsel tot reflux verwarmd en geroerd. De reactie wordt geïnitieerd met 100 mg geïmmobiliseerde lipase van Candida antarctica. Na 24 10 uur is de conversie circa 30% met als hoofdproduct de monoesters van glycerylsucrose.

1005947

Claims (10)

1. Geacyleerd, gehydroxyalkyleerd koolhydraat, dat per monosacharide-eenheid 0,5-4,0 hydroxyalkylgroepen op niet-anomere posities en 0,5-2,0 acylgroepen bevat.

2. Geacyleerd, gehydroxyalkyleerd koolhydraat volgens conclusie 1, waarbij de 5 acylgroepen C6-C^q alkanoylgroepen zijn.

3. Geacyleerd, gehydroxyalkyleerd koolhydraat volgens conclusie 1 of 2, waarbij de hydroxyalkylgroepen eventueel geacyleerde 2,3-dihydroxyalkylgroepen zijn.

4. Gehydroxyalkyleerd mono-, di- of polysacharide, dat per monosacharide-eenheid 0,5-4,0 2,3-dihydroxyalkylgroepen op niet-anomere posities bevat.

5. Werkwijze voor de verestering van koolhydraten met een vetzuur of actief derivaat daarvan, met het kenmerk dat men het koolhydraat voorafgaande aan de verestering hydroxyalkyleert met een epoxyalkaan.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij men bij de hydroxyalkylering 0,2-4,0 hydroxyalkylgroepen, in het bijzonder 2,3-dihydroxypropylgroepen per monosacharide- 15 eenheid invoert.

7. Werkwijze volgens conclusie 5 of 6, waarbij men bij de verestering 0,5-1,0 C6-C2o-acylgroepen per monosacharide-eenheid invoert.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 5-7, waarbij men de verestering enzymatisch uitvoert, bij voorkeur met een ethylester van het vetzuur.

9. Werkwijze volgens een der conclusies 5-8, waarbij het koolhydraat een mono-, di- of oligo-sacharide is, in het bijzonder sucrose of lactose is.

10. Werkwijze volgens een der conclusies 5-9, waarbij men de verestering uitvoert zonder oplosmiddel of met een tertiaire alcohol als oplosmiddel. 1005947