MXPA99009240A - Uso de la lactoferina en el tratamiento de desordenes inducidos por alergenos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas y a usos de las mismas para el tratamiento de desórdenes inflamatorios inducidos por alergenos, incluyendo reacciones inflamatorias de la piel, asma y artritis.

Description

USO DE LA LACTOFERRINA EN EL TRATAMIENTO DE DESORDENES INDUCIDOS POR ALÉRGENOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento de desórdenes relacionados con reacciones inmunes inapropiadas o exageradas en respuesta a un alérgeno, incluyendo reacciones inflamatorias de la piel, asma, y artritis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La lactoferrína (LF) es una glucoproteína -de 80 kilo Daltones (kD) que se fija al hierro, que se encuentra en altas concentraciones en la leche, y en concentraciones más bajas en otras secreciones y fluidos corporales. Esta es una de muchas proteínas que se fijan al hierro, a las que se hace referencia como transferinas, envueltas en la fijación y liberación de hierro en los mamíferos. Montreuil y Mullet, 1960, C. R . Acad. Sci . Paris 250 : 1736-1737 ; Montreuil y colaboradores, 1960, Biochem . Biophys . Acta 45.: 413-421; Johansson, 1960 Acta Chem. Scand. 14^510-512, Blanc e Isliker, 1961, Bull . Soc . Chim . Biol . 43:929-943; Masson y Heremans, 1967, Protides Bíol . Fluids Proc . Colloq. .21:115-124; Querinjenn y colaboradores, 1971, Eur. J. Biochem . 2_Q_:420-425; Leger y colaboradores, 1977, Biol. Anlm . Biochim . Biophys . 17. - 131 - 141 .

La lactoferrina se descubrió originalmente en la leche, en donde ésta puede alcanzar- niveles de 7 gramos/litro en el calostro. Desde entonces, sin embargo, ésta se ha detectado en muchos otros fluidos corporales incluyendo lágrimas, saliva y secreciones mucosas, y también en los granulos secundarios de los leucocitos polimorfonucleares . Biserte y colaboradores, 1963, Exp . Ann . Biochim . Med. 25:85-120; Masson, 1970, in : La Lactoferrine, páginas 93-165, Arscia, Bruxelles. De esta manera, la proteína se expresa principalmente por medio de las células epiteliales glandulares y los neutrófilos asociados con la defensa inmune tanto local como central . Se ha mostrado que la lactoferrina juega papeles importantes en los mecanismos de defensa de los anfitriones debido a sus bien establecidas actividades antimicrobianas. Cuando menos en parte, parece que las acciones antimicrobianas de la lactoferrina son la consecuencia de las propiedades de fijación al hierro de la lactoferrina por medio del secuestro del hierro necesario para el crecimiento microbiano. Se ha mostrado que la producción de lactoferrina se induce por medio de los lipopolisacáridos (LPS) , que son componentes de las paredes de las células bacterianas . Gutteberg y colaboradores, 1990, Sean . J. Clin . Lab . Invest . 50.: 421-427. Existe evidencia en ascenso de que en adición a las actividades antimicrobianas, la lactoferrina puede influir procesos inmunes innatos y adaptativos, incluyendo la función celular eliminadora natural, participar en el curso de la inflamación, y complementar la activación y afectar la producción de citocina. Lash y colaboradores, 1983, Blood 61:885-888; Mansson y colaboradores, 1990, Ann . Rheum . Bis . 49: 594-597; Van Snick y colaboradores, 1974, J. Exp . Med. 140 : 1068 -1084. Con respecto a lo último, se ha demostrado, tanto in vivo como in vi tro, que la lactoferrina puede comprometer la producción del factor de necrosis tumoral (TNF-ce) de manera sistemática (Machnicki y colaboradores, 1993, Int . J. Exp . Pa th . 74_:433-439) , una citocina que juega papeles importantes en inflamaciones, sepsis, y choque endotoxémico (Beutler y colaboradores, 1985, Science 229 : R69 - 871 ; Tracey y colaboradores, 1987, Curr. Opinión Immunol . 1 - 454 -461; aage y colaboradores, 1989, ". Exp . Med. 169:333-338; Kunkel y colaboradores, 1989, Cri t . Rev. Immunol . 9.: 93-117) . En investigaciones previas, sin embargo, la atención se enfocó sobre la regulación de la producción de TNF-ce provocada por lipopolisacáridos . Machnicki y colaboradores, 1993, Int . J. Exp . Path . .74:433-439; Gutteberg y colaboradores, 199?, ArMIS 98.:1027-1032; y Gutteberg y colaboradores, 1991,-APMIS 9_9: 602-608. Puesto que se sabe que la lactoferrina se fija directamente a los lipopolisacáridos, era incierto si la reducción observada en el TNF-a se podía atribuir _a la regulación transcripcional ó post-transcripcional de la - citocina misma, o a la reducción, por medio de la lactoferrina, en la disponibilidad de los lipopolisacáridos debido a la fijación directa y la inactivación de la endotoxina. Ellison y Giehl, 1991, J. Clin . Inves t . 88:1080-1091; Appelmelk y colaboradores, 1994, Infect . I muni ty 62.: 2628-2632. No ha habido una demostración previa de los efectos inducidos por alérgenos de la lactoferrina. Por esta razón, ahora se han realizado experimentos para examinar la capacidad de la lactoferrina recombinante homologa para influenciar la inducción de respuestas biológicas dependientes del TNF-a, en donde la estimulación de la expresión del TNF-a es independiente de los lipopolisacáridos. Conneely y colaboradores en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,571,896, 5,571,697 y 5,571,691 se han descrito el ADNc que codifica la lactoferrina y los métodos para producir de manera recombinante el mismo. En las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 08/453,703, 08/456,106, ambas presentadas el 30 de mayo de 1995, y 08/691,123 presentada el Io de agosto de 1996, se ha descrito la producción de la lactoferrina como un producto de fusión. Por otra parte, en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 08/391,986, presentada el 21 de febrero de 1995 se ha descrito el uso de la lactoferrina para modular o neutralizar la actividad de la heparina. Adicionalmente, en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 08/866,544, presentada el 30 de mayo de 1997, se han descrito los mutantes de la lactoferrina y las variantes de los mismos . Las descripciones de todas las patentes y solicitudes anteriores están incorporadas a la presente como referencia en su totalidad.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La lactoferrina suprime la inducción de respuestas inflamatorias dependientes de alérgenos. La presente invención demuestra que la lactoferrina puede inhibir las respuestas dependientes del TNF-a que no son inducidas por una endotoxina, es decir, el componente lipopolisacárido de la pared celular bacteriana. La lactoferrina es un compuesto ' activo para el tratamiento de una diversidad de desórdenes inflamatorios que son la consecuencia de reacciones inmunes locales iniciadas por agentes alergénicos . Un aspecto de la presente invención caracteriza las composiciones que suprimen las reacciones inflamatorias locales. Las composiciones comprenden una lactoferrina y un portador farmacéuticamente aceptable. Alternativamente, o en adición, estas composiciones pueden incluir análogos funcionales o fragmentos funcionales de lactoferrina que exhiban las actividades inhibidoras deseadas en la inflamación dependiente del TNF-CK, localmente inducida.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar enfermedades caracterizadas por una reacción inmune local en un mamífero, mediante la administración de una cantidad efectiva de una composición que comprenda una lactoferrina y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones útiles para los métodos de tratamiento de la presente invención pueden incluir alternativamente, o en adición, análogos funcionales o fragmentos funcionales de lactoferrina que exhiban actividad inhibidora en las reacciones inflamatorias dependientes del TNF-o;, localmente inducidas. Las composiciones y los métodos de la presente invención son útiles para tratar una diversidad de indicaciones que son la consecuencia de reacciones inmunes locales . Esas indicaciones incluyen desórdenes inflamatorios de la piel, tales como dermatitis alérgica por contacto, psoriasis, inflamación inducida por rayos ultravioleta, rozadura por pañal de infantes, enfermedades inflamatorias pulmonares y acné. Además, las composiciones y los métodos de la presente invención se pueden usar como un suplemento en soluciones cosméticas anti-arrugas, para eliminar los efectos inflamatorios secundarios de los hidroxiácidos, que son el ingrediente activo más frecuentemente usado en esos productos cosméticos . Finalmente, en otro aspecto, las composiciones y los métodos de la presente invención se pueden emplear para el tratamiento de otras indicaciones que envuelvan respuestas inmunes locales que den como resultado la inflamación. Esas indicaciones incluyen, pero no están limitadas a, asma y artritis .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura ÍA ilustra una cascada de migración de células en la piel, que da como resultado una respuesta inmune local e inflamación. La Figura IB ilustra una interacción de citocinas, producida por células de Langerhans y queratinocitos en la epidermis, que dispara una respuesta inmune local en la piel. La Figura 2 ilustra la fijación de la lactoferrína a sus receptores en los queratinocitos que producen el TNF-a; in si tu en piel de ratón neonatal. Los dos paneles superiores muestran las imágenes de campo clara y oscura obtenidas usando solamente lactoferrina etiquetada. Los dos paneles inferiores muestran las imágenes de campo clara y oscura cuando se realizó el ensayo de fijación en la presencia de lactoferrina no etiquetada en exceso. La Figura 3A demuestra que la administración intradérmica de la lactoferrina inhibe la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje, inducida por oxazolona, pero no aquella estimulado por la inyección de TNF-a!.

La Figura 3B demuestra que la administración intradérmica de la lactoferrina inhibe la acumulación de células dendríticas inducida tanto por oxazolona como por IL-1/3 en los nodos linfáticos de drenaje. La Figura 4 demuestra la influencia de la lactoferrina en la migración de células de Langerhans inducida por TNF-a! y por IL-13. La Figura 5 proporciona los resultados de dos experimentos independientes (paneles A y B) que indican que el tratamiento con oxazolona indujo la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje de ratones tratados previamente con BSA al 0.02 por ciento (ver barra 2, paneles A y B, contra barra 1, control) . La administración local de la lactoferrina de ratón da como resultado una fuerte inhibición de la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos, en respuesta a la oxazolona en ambos experimentos (ver barra 3, paneles A y B) . Los resultados indican que la lactoferrina administrada localmente es altamente efectiva para inhibir la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos, en respuesta a un alérgeno, y en consecuencia la inflamación cutánea inducida por alérgenos .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Regulación de la Producción del Factor de Necrosis Tumoral . (TNF-a!) Mediante la Lactoferrina La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que la lactoferrina y los análogos y derivados de la misma, incluyendo moléculas truncadas, fragmentos biológicamente activos y muteínas que tengan sustituciones y/o supresiones, son capaces de inhibir una diversidad de respuestas que requieren la producción de TNF-a: mediante trayectorias independientes de endotoxinas (LPS) . Los desórdenes inflamatorios frecuentemente son la consecuencia de reacciones inmunes locales, por ejemplo, provocadas por la exposición a productos químicos, incluyendo productos químicos o alérgenos producidos exógena o endógenamente, o disparadas por una respuesta autoinpiune . Esa reacción inflamatoria se provoca mediante el atrapamiento del antígeno por medio de las células "Langerhans" que están localizadas en la epidermis. Una vez que se atrapa el antígeno, las células de Langerhans experimentan un proceso de maduración o diferenciación que les permite disociarse de la epidermis y migrar como células dendríticas (DCs) maduras hacia abajo a través de la dermis de la piel al sistema linfático. Después se pueden llevar éstas, por medio del sistema linfático, a los nodos linfáticos de drenaje, en donde éstas presentan el antígeno procesado en su superficie celular a los linfocitos T. Kimber y Cumberbatch, 1992, T oxi col . Appl . Pharmacol . 117:137-146. Ver, Figura ÍA. Las células T activadas pueden responder por medio de disparar una reacción inmune compleja que da como resultado la invasión de la piel por células sanguíneas blancas para producir una respuesta inflamatoria local. De esta manera, las reacciones inmunes locales, por ejemplo, la inmunidad cutánea, requieren: (1) el reconocimiento y el atrapado de un antígeno por medio de las células de Langerhans, la maduración y migración de las células dendríticas a un nodo linfático; (2) la activación de las células T en el nodo linfático, por medio de un antígeno que presente células dendríticas; y (3) la estimulación subsecuente del reclutamiento de células sanguíneas blancas ala piel. Cada uno de estos procesos es dependiente de una o más citocinas que sirven para regular la función de las células inmunes participantes . Las citocinas que inician una respuesta inflamatoria tal como la cascada de respuesta inflamatoria cutánea, se producen por medio de tanto los queratinocitos como las células de Langerhans de la epidermis. Las células de Langerhans están localizadas en la epidermis en yuxtaposición cercana a las células queratinocitos, como es evidente de la Figura IB. La inducción de la migración de células de Langerhans por alérgenos químicos, y la acumulación subsecuente de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje, depende de la disponibilidad local del TNF-a;, una citocina producida en la epidermis por los queratinocitos en respuesta a la sensibilización de la piel u otras formas de trauma dérmico. Cumberbatch y Kimber, 1992, Immunolog? 75:257-263; Cumberbatch y colaboradores, 1994, Immunology 8.1 : 395-401; Cumberbatch y Kimber, 1995, Immunology 84.: 31-35. La administración sistemática de un anticuerpo de neutralización anti -TNF-a inhibe casi completamente la estimulación de la migración de las células de Langerhans y la acumulación de células dendríticas, inducidas por productos químicos tales como la oxazolona. Cumberbatch y Kimber, 1995, supra . La administración intradérmica de TNF-a; homólogo recombinantes es en sí mismo suficiente para inducir la migración de las células de Langerhans de la piel, y para provocar un incremento en el número de células dendríticas que se encuentran dentro de los nodos linfáticos de drenaje. Cumberbatch y Kimber, 1992, supra ; Cumberbatch y colaboradores, 1994, supra . ?¡a administración intradérmica de lactoferrina y análogos funcionales y fragmentos funcionales de la misma, inhibe la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje inducida por oxazolona, pero no aquella estimulada por la inyección de TNF-a;, como se demuestra por la Figura 3A y los Ejemplos 2 y 3. Estos datos son consistentes con la regulación negativa, mediante lactoferrina, de la producción de TNF-a; mediante queratinocitos, que se sabe que se estimula después de la sensibilización de la piel. Previamente se ha demostrado que la estimulación de la migración de células de Langerhans y la acumulación de células dendríticas depende también de la disponibilidad local de otra citocina epidérmica, la interleucina 13 (IL-1/3) . Enk y colaboradores, 1993, J". I munol . 150.: 3698-3704. Esta citocina se produce constitutivamente en pequeñas cantidades en la epidermis de murino por medio de las células de Langerhans, y su expresión también se regula ascendentemente como resultado de la sensibilización de la piel. Enk y Katz, 1992, Proc . Na ti . Acad. Sci . 89. : 1398; Enk y Katz, 1992, J7 Invest . Derma tol . 9_9:S39-S41. La administración sistemática de un anticuerpo de neutralización anti-IL-1/3 inhibe la migración de células de Langerhans y la acumulación de células dendríticas. Enk y colaboradores, 1993, supra . Está claro, por lo tanto, que la migración efectiva de las células de Langerhans depende de la disponibilidad de IL-13 y la síntesis de novo mediante los queratinocitos del TNF-a;. Esto también se hace evidente por el trabajo previo que demuestra que la administración intradérmica de IL-13 sola induce la migración de las células de Langerhans . Ver, Figura 3B y los Ejemplos 2 y 3. La lactoferrina inhibe la acumulación de células dendríticas tanto inducida por oxazolona como inducida por IL-Iß en los nodos linfáticos de drenaje. De esta manera, la lactoferrina menoscaba la acumulación de células dendríticas inducida por IL-13, pero no aquella inducida por TNF-a; ( ver, Figura 3A) . Esto demuestra que el efecto inhibidor de ] a lactoferrina es corriente abajo de la IL-1/3, y corriente arriba del TNF-a! en la cascada de citocina que dispara la respuesta inmune local . Además, en la presente se demuestra que la lactoferrina se fija a receptores en los queratinocitos, indicando que la fijación de la lactoferrina a los queratinocitos evita la producción de TNF-a:. Específicamente, la Figura 2 demuestra la fijación de la lactoferrina a sus receptores en el TNF-a; que produce queratinocitos in si tu en piel de ratón neonatal. La fijación de la lactoferrina se concentra en la capa epidérmica y en las glándulas sudoríparas, pero no en las células epidérmicas normales. Los resultados experimentales descritos en la presente demuestran que el efecto inhibidor de la lactoferrina sobre la migración de las células de Langerhans y la acumulación de células dendríticas se debe a la regulación negativa de la producción del TNF-a!, más bien que por medio de una influencia en otro aspecto de la función de las células de Langerhans. De esta manera, la lactoferrina es capaz de inhibir la síntesis de novo del TNF-a¡, mediante la fijación en los receptores en los queratinocitos. La evolución de una estructura de dos lóbulos ha dotado a la lactoferrina con propiedades únicas de fijación al hierro, y ha contribuido a otras funciones biológicas de la molécula. En base a la identificación de esos dominios, en la solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 08/866,544, presentada el 30 de mayo de 1997, cuya descripción está incorporada a la presente como referencia, se describen las secuencias y las estructuras en el polipéptido de lactoferrina, que contribuyen a las propiedades de fijación al hierro de la proteína. Esta solicitud proporciona guía para el diseño y la generación de variantes de lactoferrina o porciones de la misma novedosas que tengan una capacidad modificada de fijación al hierro. Típicamente, las variantes de lactoferrina tienen propiedades mejoradas, incluyendo, pero no limitándose a, variantes de lactoferrina con mayor afinidad por el hierro para actividades antimicrobianas mejoradas, variantes de lactoferrina con menor afinidad por el hierro, que tienen propiedades mejoradas de liberación de hierro, o variantes de lactoferrina que tienen un pH o requerimientos de temperatura o rangos modificados para la fijación a, y/o liberación de hierro. De la misma manera, las variantes de lactoferrina útiles en los métodos de la presente invención típicamente proporcionan la inhibición mejorada de la actividad de interleucina, tal como aquella que demuestra la IL-ljß. En adición, la invención permite el diseño de variantes de lactoferrina que tengan características mejoradas de otra manera, por ejemplo, tolerancia terapéutica, inmunorreactividad, o vida biológica media, mientras retienen su actividad biológica. Las variantes de lactoferrina de la invención se pueden derivar a partir de lactoferrina tipo silvestre de una diversidad de especies de mamíferos, incluyendo, pero no limitándose a, lactoferrina de humano, murino, rata, bovino, y porcino. La lactóferrina tipo silves tre se puede mutar mediante una diversidad de métodos generalmente conocidos en la técnica. Ver, entre otros lugares, Sambrook y colaboradores, 1990 Molecular Cloning: A Laboratory Manual . Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York; Kunkel y colaboradores, 1987, Meth . Enzymol . 154:367-382; Kunkel, 1985, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 82:488-42. En una modalidad preferida, las variantes de lactoferrina de la presente invención comprenden cuando menos una mutación en la secuencia de amino ácidos. En otra modalidad preferida, las variantes de lactoferrina de la presente invención comprenden una secuencia de amino ácidos truncada. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la lactoferrina y las variantes de la misma, de conformidad con la presente invención, se pueden insertar en un vector adecuado para expresión en una célula eucariótica, de tal manera que permita la expresión del variante de lactoferrina. De manera alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican porciones de las variantes de lactoferrina de la invención se pueden insertar en vectores que permitan su expresión en células eucarióticas . En otra modalidad preferida, la lactoferrina se produce en un sistema de expresión recombinante. Ver, por ejemplo, Ward y colaboradores, 1995, Biotechnology 13 : 498-503. Con este propósito, los ácidos nucleicos que codifican por la forma deseada de lactoferrina (Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,571,691, incorporada como referencia en su totalidad) se incorpora de manera precisa en un anfitrión celular, que después se cultiva bajo condiciones apropiadas para la expresión de ese péptido o proteína particular. Con este propósito se han adaptado una diversidad de sistemas de expresión de genes, y típicamente accionan la expresión del gen deseado a partir de controles de expresión que usa naturalmente el anfitrión.- seleccionado. Debido a que las variantes de lactoferrina de la invención requieren típicamente, como la lactoferrina que ocurre naturalmente, modificaciones post-traslacionales, tales como la glucosilación en muchos residuos de amino ácidos, muchas de las variantes de lactoferrina- o_ porciones de las mismas necesitan producirse en el anfitrión eucariótico. En las modalidades preferidas, el producto de lactoferrina se produce mediante un sistema de expresión Aspergillus , como lo describen Ward y colaboradores, 1992, Gene 122:219-223 ; y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,571,896 y 5,571,697, cuyas descripciones están incorporadas a la presente como referencia en su totalidad. Si se producen las formas no glucosiladas de las variantes de lactoferrina o porciones de las mismas, sin embargo, se puede conseguir convenientemente su producción en anfitriones bacterianos tales como la E. Coli . Para esa producción, se puede colocar útilmente un ácido nucleico que codifique por el variante de lactoferrina seleccionado o porción del mismo, bajo un control de expresión, por ejemplo, de los genes lac, trp o PL de E. Coli . Como una alternativa a la expresión de ácidos nucleicos que codifiquen por la variante de lactoferrina o la porción de la misma per se, se puede adaptar el anfitrión para expresar el producto de lactoferrina como una proteína de fusión en la que el producto de lactoferrina esté enlazado de manera que se pueda liberar a una proteina portadora que facilite el aislamiento y la estabilidad del producto de expresión. En otra alternativa, la variante de lactoferrina o porción de la misma se puede generar mediante síntesis orgánica. En particular en donde el objetivo es la producción de una porción de variante de lactoferrina, por ejemplo, un péptido de aproximadamente veinte (20) a aproximadamente cincuenta (50) amino ácidos de longitud, se emplean de preferencia las bien establecidas técnicas de síntesis de péptidos automatizada, cuyas descripciones generalmente aparecen, por ejemplo, en J.M. Stewart y J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Edición, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; y en M. Bodanszky y A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, Nueva York; Applied Biosystems 430A Users Manual, 1987, 7ABI Inc., Foster City, California; y Solid Phase Peptide Svnthesis. A Practical Approach, por: E. Atherton & R.C. Sheppard, IRL Press, Oxford (1989) . En estas técnicas, la porción de la variante de lactoferrina se hace crecer desde su residuo con terminal C, conjugado por resina, por medio de la adición secuencial de amino ácidos apropiadamente protegidos, usando los protocolos ya sea Fmox o tBox.

Composiciones Farmacéuticas que Contienen Lactoferrina Lactoferrina y Productos de Lactoferrina . El término "lactoferrina" se refiere colectivamente en la presente a formas de lactoferrina producidas natural o recombinantemente, paiticu.armente formas mamíferas, a menos que se especifique de otra manera. El término "productos de lactoferrina" como se usa en la presente se refiere colectivamente a la lactoferrina y los análogos funcionales y los fragmentos funcionales de la misma, que pueden ser útiles para practicar la invención.

Específicamente, el término abarca, por ejemplo, la lactoferrina truncada y la lactoferrina que tiene uno o más amino ácidos sustituidos o suprimidos. "Análogos funcionales y fragmentos funcionales" de la lactoferrina se refieren a mutantes y derivados de lactoferrina, y péptidos derivados de lactoferrina, respectivamente, que tienen la capacidad para inhibir la producción del TNF-a: en una célula. Generalmente, la lactoferrina, los análogos funcionales de lactoferrina y los fragmentos funcionales de los mismos que abarca la invención son capaces de inhibir una respuesta inmune local inapropiada o exagerada que envuelve la producción de TNF-a?. Se pueden probar los análogos de lactoferrina o los péptidos derivados de la lactoferrina para la identificación de los análogos funcionales o los fragmentos funcionales por medio de, por ejemplo, el modelo de ratón descrito en la presente en el Ejemplo 2. Ver también, Cumberbatch y Kimber, 1992, Immunology 75:257-263. Brevemente, esta prueba envuelve la inducción de una respuesta inmune local mediante la administración de un alérgeno, por ejemplo, oxazolona, en la piel rasurada de ratones. Una hora después, los ratones se inyectan intradérmicamente en el sitio tratado con oxazolona, con aproximadamente del 0.002 por ciento a aproximadamente el 0.5 por ciento del análogo o fragmento de lactoferrina que se va a probar en solución salina. Un segundo y un tercer grupo de animales se inyectan con lactoferrina y BSA, respectivamente, al mismo rango de concentraciones y en el mismo regulador del pH. Después de aproximadamente 12 horas, se puede matar a los animales, y recuperar los nodos linfáticos de drenaje. La comparación de los números de células dendríticas acumuladas, el cual se puede determinar como se describe en Cumberbatch ? Kimber, supra , revelará la eficacia de un análogo o fragmento de lactoferrina, y su utilidad para las composiciones y los métodos de la presente invención. Generalmente, se puede emplear útilmente en esta invención cualquier sustitución, adición o supresión de lactoferrina, que no destruya sus efectos inhibidores mediados por el receptor, sobre la producción de TNF-a! como parte de una respuesta inmune inapropiada o exagerada. Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica puede hacer esas sustituciones, adiciones y supresiones, sin experimentación indebida. En las modalidades preferidas, los análogos de lactoferrina funcionales o los fragmentos funcionales son sustancialmente tan efectivos como la lactoferrina humana nativa. En las modalidades más preferidas, los análogos de lactoferrina funcionales o fragmentos funcionales han mejorado la actividad reguladora descendente del TNF-a; en comparación con la lactoferrina humana nativa. Por ejemplo, esos análogos funcionales o fragmentos funcionales pueden exhibir estabilidad de suero mejorada, fijación al receptor mejorada, y actividad de transducción de señal mejorada. Otras modificaciones a la lactoferrina y a los análogos de lactoferrina funcionales y a los fragmentos funcionales, que se pueden emplear útilmente en esta invención son aquellas que producen la molécula más rápidamente biodisponible a los sitios de inflamación. Por ejemplo, en casos en donde el producto de lactoferrina se administra localmente, el análogo de lactoferrina funcional o el fragmento funcional pueden exhibir absorción percutánea mejorada . Los productos de lactoferrina particulares de conformidad con la presente invención ' se pueden preparar mediante una diversidad de técnicas bien conocidas para generar productos de proteína. Aquellas formas de lactoferrina que ocurren naturalmente se pueden obtener, por supuesto, mediante la extracción a partir de la fuente natural, por ejemplo, leche de mamífero, de preferencia humana, usando una combinación apropiada de técnicas de aislamiento de proteína. Por ejemplo, como se describe en C eron y colaboradores, 1977, C. R . Acd . Sci . Paris 284 : 585-588 , el aislamiento de la lactoferrina se consigue mediante extracción secuencial y purificación con Sephadex G-25, G-50, G-75, y G-100. Como una alternativa a la extracción, aquellas formas de lactoferrina que incorporan solamente amino ácidos L, se pueden producir de manera reproducible y en cantidades comerciales mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante. Ver, por ejemplo, Ward y colaboradores, 1992, Biotechnology 10.: 784-789 ; Ward y colaboradores, 1995, Bictechnology 13:498-503. Con este propósito, los ácidos nucleicos que codifican por la forma deseada de lactoferrina [ ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,571,691, incorporada como referencia en su totalidad) se pueden incorporar de manera expresiva en un anfitrión celular que después se cultiva bajo condiciones apropiadas para la expresión de ese péptido o proteína particular. Con este propósito se han adaptado una diversidad de sistemas de expresión de genes, y típicamente accionan la expresión del gen deseado a partir de controles de expresión que usa naturalmente el anfitrión seleccionado. Debido a que la lactoferrina en su forma natural requiere modificaciones post-traslacionales, tales como glucosilación en muchos residuos amino ácidos, muchas de las lactoferrinas, análogos funcionales, o fragmentos funcionales de las mismas, de conformidad con la presente invención, necesitan ser producidos en un anfitrión eucariótico. En las modalidades preferidas, el producto de lactoferrina se puede producir mediante un sistema de expresión Aspergillus, como lo describen Ward y colaboradores, 1992, Gene 122 -.219-223 ; y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,571,896 y 5,571,697, incorporadas a la presente como referencia en su totalidad. Si se usan las formas no glucosiladas , los análogos funcionales, o los fragmentos funcionales de la lactoferrina, sin embargo, su producción se puede conseguir convenientemente en anfitriones bacterianos tales como la E. coli . Para esa producción, se puede colocar un ácido nucleico que codifique la lactoferrina, el análogo funcional, o el fragmento funcional de la misma seleccionado, bajo un control de expresión de, por ejemplo, los genes lac, trp o PL de E. coli . Como una alternativa a la expresión de un ácido nucleico que codifique la lactoferrina, el análogo funcional, o el fragmento funcional de la misma per se, se puede adaptar un anfitrión para expresar el producto de lactoferrina como una proteína de fusión en la que el producto de lactoferrina esté enlazado de manera que se pueda liberar a una proteína portadora que facilite el aislamiento y la estabilidad del producto de expresión. En otra alternativa, el producto de lactoferrina se puede generar mediante síntesis orgánica. En particular en donde el producto de lactoferrina es un fragmento funcional, por ejemplo, un péptido de aproximadamente veinte (20) a aproximadamente cincuenta (50) amino ácidos de longitud, se emplean las bien establecidas técnicas de síntesis automatizada de péptidos. Las descripciones generales de las síntesis de péptidos ejemplares aparecen por ejemplo, en J.M. Stewart y J.D. Young, Solid Phase Peptide Svnthesis, 2a Edición, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; y en M. Bodanszky y A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, Nueva York; Applied Biosystems 43OA Users Manual, 1987, ABI Inc., Foster City, California; y Solid Phase Peptide Svnthesis - A Practical Approach, por: E. Atherton y R.C. Sheppard, IRL press, Oxford (1989) . En estas técnicas, se puede hacer crecer el fragmento de lactoferrina desde su residuo con terminal C, conjugado por resina, por medio de la adición secuencial de amino ácidos apropiadamente protegidos, usando los protocolos ya sea Fmox o tBox. En un planteamiento alternativo, los fragmentos de lactoferrina funcionales útiles para los métodos y las composiciones de la presente invención se pueden obtener mediante la digestión de peptidasa o la hidrólisis de una lactoferrina o productos de lactoferrina purificados. Por supuesto, los fragmentos de lactoferrina también se pueden producir mediante expresión recombinante en un anfitrión adecuado como se declara, supra . La invención también abarca el uso de productos de lactoferrina químicamente modificados, incluyendo metilaciones , carboxilación, etcétera.

Formulación Farmacéutica y Rutas de Administración. Para uso terapéutico, el (os) producto (s) de lactoferrina de conformidad con la presente invención se puede administrar mediante cualquier medio convencional disponible para usarse en conjunción con productos farmacéuticos, ya sea como agentes terapéuticos individuales, o en una combinación de agentes terapéuticos. Cada uno se puede administrar solo pero generalmente se administra con un portador farmacéutico seleccionado sobre la base de la ruta de administración seleccionada y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden adaptar para administración oral, parenteral, local o rectal, o como un inhalador, y puede ser en forma de dosis unitaria, de una manera bien conocida para aquellos expertos en la técnica farmacéutica. La administración parenteral incluye, pero no está limitada a, inyección subcutánea, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular. El tratamiento con el ingrediente activo puede empezar en cualquier momento después de que se diagnostique la indicación que se vaya a tratar, por ejemplo, psoriasis, dermatitis por contacto, inflamación inducida por rayos ultravioleta, rozadura por pañal de infantes, asma, artritis, y similares. De preferencia, el tratamiento se comienza como un profiláctico o en etapas tempranas de 1 enfermedad, con el objeto de evitar la inflamación masiva en primer lugar. Típicamente, el tratamiento continuará hasta que se cure la inflamación. En casos de enfermedades crónicas, tales como psoriasis, asma o artritis, o en casos de exposición continua a un alérgeno, pudiera tener que extenderse el tratamiento hasta después de la curación de los síntomas. Puesto que la lactoferrina es una proteína no tóxica, naturalmente ocurrente, no se esperan efectos secundarios aún en casos de un tratamiento a largo plazo. La dosis administrada variará, por supuesto, dependiendo de factores conocidos, tales como (1) las características farmacodinámicas del producto de lactoferrina particular y su modo y ruta de administración, (2) la edad, salud, altura y peso del receptor, (3) la naturaleza y el grado de los síntomas, (4) la clase de tratamiento (s) concurrente (s) , (5) la frecuencia del (os) tratamiento (s) , y (6) el efecto deseado. Se puede esperar que una dosis diaria de ingrediente activo sea de aproximadamente 1 miligramo a aproximadamente 1.2 gramos por kilogramo de peso corporal, la dosis preferida siendo de 50 miligramos a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo de peso corporal. Cuando se administra localmente el ingrediente activo a la piel o en un inhalador, el ingrediente activo se aplica típicamente en el 0.005 por ciento a aproximadamente el 5 por ciento mezclado con el portador, de preferencia el ingrediente activo siendo de aproximadamente el 0.05 por ciento a aproximadamente el 0.5 por ciento mezclado con el portador. Las formas de dosis (composiciones adecuadas para administración) contienen desde aproximadamente el 0.005 por ciento hasta aproximadamente el 0.5 por ciento del ingrediente activo por unidad. En estas composiciones farmacéuticas el ingrediente activo está presente ordinariamente en una cantidad de aproximadamente el 0.5-95 por ciento en peso, en base al peso total de la composición. Típicamente, el ingrediente activo se administrará localmente, como inhalador, o como inyección en coyunturas o cartílagos inflamados. Sin embargo, alternativamente los productos de lactoferrina se pueden administrar oralmente en formas de dosis sólidas o semi-sólidas, tales como cápsulas duras o de gelatina suave, tabletas, o polvos, o en formas de dosis líquidas, tales como elíxires, jarabes, o suspensiones. Este también se puede administrar parenteralmente, en formas de dosis líquidas estériles. Son potencialmente posibles otras formas de dosis tales como parches o ungüentos o administración transdérmica . Los productos de lactoferrina de la invención también se pueden formular como un dispositivo de implantación de liberación lenta, para la administración extendida y sostenida deí producto de lactoferrina. Los ejemplos de esas formulaciones de liberación sostenida incluyen compuestos de polímeros biocompatibles , tales como ácido poli (láctico) , ácido poli (láctico-co-glucólico) , metilcelulosa, ácido hialurónico, colágeno, y similares. En muchas publicaciones se han revisado la estructura, selección y uso de polímeros degradables en vehículos de aplicación de fármaco, incluyendo, A. Domb y colaboradores, Polymers for Advanced Technologies 2:279-292 (1992) . Se puede encontrar guía adicional para seleccionar y usar polímeros en composiciones farmacéuticas en el texto de M. Chasin y R. Langer (eds.), "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", Volumen 45 de "Drugs and the Pharmaceutical Sciences", M. Dekker, Nueva York, 1990. También se pueden usar liposomas para proporcionar la liberación sostenida de un producto de lactoferrina. Los detalles concernientes a cómo usar y hacer formulaciones liposomales de fármacos de interés se puede encontrar en, entre otros lugares, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,944,948; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,008,050; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,921,706; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,927,637; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,452,747; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,016,100; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,311,712; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,370,349; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,372,949; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,529,561; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,009,956; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,725,442; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,737,323; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,920,016. Las formulaciones de liberación sostenida son de interés particular cuando es deseable proporcionar una alta concentración local de un producto de lactoferrina. Las cápsulas de gelatina o las cápsulas de gelatina suave llenas de líquido pueden contener el ingrediente activo y portadores en polvo o líquido, tales como lactosa, almidón de lecitina, derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, y similares. Se pueden usar diluyentes similares para hacer tabletas comprimidas. Tanto las tabletas como las cápsulas se pueden fabricar como productos de liberación sostenida, para proporcionar la liberación continua del medicamento durante un período de horas. Las tabletas comprimidas pueden estar recubiertas de azúcar o recubiertas de una película para enmascarar cualquier sabor desagradable, y para proteger a la tableta de la atmósfera, o pueden estar entéricamente recubiertas para la desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosis líquidas para administración oral pueden contener colorantes y/o saborizantes para incrementar la aceptación del paciente. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen adicionalmente en Remjngton's Pharmaceutical Sciences, 17° edición, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990) , un texto de referencia estándar en este campo, que está incorporado a la presente como referencia en su totalidad. En las modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas que comprenden productos de lactoferrina se pueden administrar localmente para el tratamiento de desórdenes alérgicos de la piel, como un inhalador par el tratamiento de enfermedades inflamatorias pulmonares tales como asma, en la forma de un rocío nasal para rinitis y sinusitis, o en la forma de inyecciones para el tratamiento de artritis. Aparte del producto de lactoferrina, estas composiciones pueden comprender componentes activos adicionales, incluyendo, pero no limitándose a, hidrocortisona, ácido retinóico, o auxiliares convencionales que se usen para terapias locales en curso. Se pueden ilustrar las formas de dosis farmacéuticas preferidas para la administración de los productos de lactoferrina de esta invención, como sigue: Formulación Local En los casos en donde se desea el tratamiento de desórdenes inflamatorios de la piel, la ruta de administración preferida típicamente será local. A medida que se secreta la lactoferrina, por ejemplo, mediante las glándulas sudoríparas (Masson y colaboradores, 1966, Clin . Chem. Axta 14 : 735-739) , general.,?ente se puede esperar que los productos de lactoferrina entren a través de los poros de la piel cuando se administran localmente. La disponibilidad de la sustancia activa para su sitio de acción se aliviará adicionalmente por el hecho de que 1 inflamación típicamente está acompañada por la rotura de la superficie de la piel. Alternativamente, se pueden añadir a la formulación sustancias que mejoren la penetración a través de la piel. Generalmente, para la administración local, se pueden formular los productos de lactoferrina como una solución, gel, loción, ungüento, crema, suspensión, pasta, linimento, polvo, tintura, aerosol, sistema de liberación de fármacos transdérmico, y similares, en una forma farmacéuticamente aceptable, mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos actuales para preparar formulaciones locales son conocidos o evidentes para aquellos expertos en la técnica, y se describen con detalle en Reminqton's Pharmaceutical Sciences , 17° edición, Mack Publishing Company, Easton, PA .(1990) , y Pharmaceutical Dosage Forms and Druq Delivery System, 6o edición, Williams & Wilkins (1995) . Con el objeto de mejorar la absorción percutánea de los ingredientes activos, se pueden añadir muchos agentes en las formulaciones tópicas, incluyendo, pero no limitándose a, dimetilsulfóxido, dimetilacetamida, dimetilformmida, tensoactivos, azona, alcohol, acetona, glicol de propileno y glicol de polietileno. En adición, también se pueden usar métodos físicos para mejorar la penetración transdérmica, tales como iontofóresis o sonofóresis. Las composiciones farmacéuticas se pueden aplicar directamente a la piel. Alternativamente, éstas se pueden liberar mediante diversos sistemas de liberación de fármacos transdérmicos, tales como parches.

Formulaciones Para Inhaladores En particular para el tratamiento de enfermedades inflamatorias pulmonares tales como asma y bronquitis, las composiciones que comprenden producto de lactoferrina se administrarán típicamente como un inhalador. Generalmente, el producto de lactoferrina se puede administrar usando un inhalador convencional. El producto de lactoferrina se puede administrar solo, o éste se puede coadministrar con otros aerosoles de inhalación, incluyendo, pero no limitándose a, agonistas beta-adrenérgicos, por ejemplo, aerosoles de inhalación de albuterol, aerosoles de inhalación de xinafoato de salmeterol, aerosoles de inhalación de sulfato de terbutalina; esteroides adrenocorticales, por ejemplo, aerosoles de inhalación de diproprionato de beclometasona; antihistamínicos , antialérgicos, o estabilizadores de célula mástil, por ejemplo, aerosoles de inhalación de sodio de cromolina; aerosoles antiinflamatorios, por ejemplo, aerosol local de acetonuro de triamcinolona; agentes anticolinérgicos, por ejemplo, aerosoles de inhalación de bromuro de ipratropio; o sustancias simpatomiméticas, por ejemplo, aerosoles de inhalación de mesilato de isoetarina, y aerosol de inhalación de sulfato de metaproterenol . Para mayor referencia, se proporcionan enseñanzas adicionales a estos respectos en Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, de: Ansel y colaboradores, Williams & Wilkins, PA (1995) .

Formulaciones Para Rocío En particular para el tratamiento de rinitis, sinusitis y quemadura de sol, la composiciones que comprenden el producto de lactoferrina se administrarán típicamente como un rocío . Generalmente, el producto de lactoferrina se puede administrar usando un dispositivo rociador convencional, tal como aquellos comercialmente disponibles . El producto de lactoferrina se puede administrar solo, o éste se puede coadministrar con otras sustancias, incluyendo, pero no limitándose a, antihistaminas, agentes simpatomiméticos y antibióticos. Por otra parte, el producto de lactoferrina se puede administrar en rocío medicados tales como solución nasal de cloruro de sodio (solución Salinex (Muro) ) o solución nasal de hidrocloruro de Xilometazolina (Sine-Off (SmithKline Beecham) ) o rocío funcionalmente análogos. Para mayor referencia, se proporcionan enseñanzas adicionales a estos respectos en Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems , supra .

Formulaciones Para Inyecciones En particular para el tratamiento de artritis y celulitis, las composiciones que comprenden un producto de lactoferrina se pueden administrar mediante inyección, por ejemplo, localmente dentro de la coyuntura o cartílago enfermo, o sistemáticamente. En general, el agua, aceite, solución salina, dextrosa acuosa (glucosa) , polisorbato y soluciones de azúcar relacionadas y glicoles tales como glicol de propileno o glicoles de polietileno, son portadores adecuados para las soluciones parenterales. Las soluciones o emulsiones para administración parenteral contienen de preferencia aproximadamente el 5-15 por ciento de polisorbato 80 o lecitina, agentes de estabilización adecuados, y si es necesario, sustancias reguladoras del pH. Los agentes antioxidantes, tales como, pero no limitándose a, bisulfito de sodio, sulfito de sodio, o ácido ascórbico, ya sea solo o combinados, son adecuados como agentes de estabilización. También se usan el ácido cítrico y sus sales y el EDTA de sodio. En adición, las soluciones parenterales pueden contener conservadores, incluyendo, pero no limitándose a, cloruro de benzalconio, metil- o propil -parabeno, y clorobutanol . En Remington's Pharmaceutical Sciences, supra , se describen otros portadores farmacéuticos adecuados para administración parenteral.

Indicaciones Como se describió anteriormente, el TNF-a juega papeles importantes en la patogénesis y/o progreso de una diversidad de procesos de enfermedad inflamatorios agudos y crónicos. Como una consecuencia, ha habido considerable interés en el diseño de inhibidores sintéticos de 1 producción de TNF-0!, que se puedan usar terapéuticamente. La evidencia citada en la presente indica que los productos de lactoferrina proporcionan un medio para regular la producción de TNF-a;. Las aplicaciones terapéuticas potenciales de la lactoferrina que se derivan de estos datos son muchas e incluyen, pero no están limitadas a, el tratamiento de los siguientes desórdenes inflamatorios descritos en un mamífero, en particular un humano con necesidad de éste.

Dermatitis Por Contacto La dermatitis por contacto es una dermatitis eccematosa provocada por la exposición a sustancias en el ambiente. Esas sustancias actúan como irritantes o alérgenos y pueden provocar inflamación eccematosa aguda, subaguda, o crónica. La dermatitis irritante por contacto, es decir, la irritación de la piel, es la forma más común de la dermatitis por contacto. Los irritantes suaves pueden provocar resequedad, agrietamiento, y eritema, cuando la exposición es continua. Por ejemplo, la exposición continua a la humedad en áreas tales como la mano, el área del pañal, por ejemplo, la rozadura por pañal de infantes, o la piel alrededor de una colostomía eventualmente puede provocar inflamación eccematosa. Los productos químicos fuertes pueden producir una reacción inmediata. Ver, T.P. Habif, en: Clinical Dermatology, Mosby, Missouri (1996) y The Textbook of Medicine, editores: J.B. Wyngaarden y L.H. Smith, W., W.B. Saundres Company, Philadelphia (1985) . La dermatitis alérgica por contacto, en contraste con la dermatitis irritante por contacto, es una reacción de hipersensibilidad retardada que afecta a un número limitado de individuos después de una o unas pocas exposiciones a una sustancia que exhiba actividad antígena en ese .individuo particular. Se cree que las dermatitis por contacto tanto irritante como alérgica se activan por una cascada inmune local que envuelve la expresión de novo del TNF-a! en los queratinocitos como se explicó, supra .

Métodos De Tratamiento Actuales Y Sus Inconvenientes .

La dermatitis aguda por contacto se trata actualmente con vendajes húmedos fríos, acompañados por la administración de esteroides, por ejemplo, hidrocortisona, prednisolona, metilprednisona, y, en casos severos, corticosteorides fluorados, que son poderosos agentes antiinflamatorios a concentraciones muy bajas. Para casos menos severos se usan hidrocortisona, prednisolona y metilprednisona menos potentes que los esteroides fluorados. Dependiendo de la severidad de la inflamación, los esteroides se aplican local o sistemáticamente. Sin embargo, se han reportado muchos efectos adversos para los esteroides, especialmente en el caso de los poderosos esteroides fluorados. Por ejemplo, la atrofia epidérmica y dérmica puede ser un efecto adverso pronunciado, y la síntesis de colágeno disminuida y el soporte estromal reducido para los vasos sanguíneos puede llevar a la telangiectasia, púrpura, y estrías. También se ha reportado una dermatitis perioral con los esteroides fluorados, así como la agravación del eritema facial, restringiendo absolutamente el uso extendido de estos compuestos para la cara. Además, la posible presión intraocular elevada garantiza una fuerte proscripción contra la aplicación prolongada de cualesquier esteroides locales cerca de los ojos. La realidad de la absorción sistemática de los esteroides locales presenta un peligro adicional . Se ve una reducción del nivel de cortisol del plasma con tan poco como el 20 por ciento del cuerpo bajo oclusión. No se puede pasar por alto el riesgo de rebote después de la descontinuación de los esteroides es aquellas enfermedades de la piel caracterizadas por el fenómeno . Sobre todo, es evidente una necesidad de métodos de tratamiento de baja toxicidad para la dermatitis por contacto.

Métodos de Tratamiento Mejorados Proporcionados Por La Presente Invención. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas novedosas que comprenden un producto de lactoferrina, para el tratamiento de dermatitis por contacto. En una modalidad preferida, las composiciones se formulan para aplicación local. Específicamente, el producto de lactoferrina se puede aplicar en la forma de lociones, cremas, ungüentos y similares, en concentraciones de aproximadamente el 0.005 por ciento a aproximadamente el 5 por ciento, en las modalidades preferidas en concentraciones de aproximadamente el 0.01 por ciento a aproximadamente el 0.5 por ciento de la sustancia activa. Típicamente, la composición comprenderá auxiliares que se usan convencionalmente para administración local. Ver, supra . En las modalidades alternativas, las composiciones se formulan para inyecciones intradérmicas . Las composiciones de la presente invención interfieren directamente con la producción del TNF-a! mediante los queratinocitos, evitando de esta manera la respuesta inmune local exagerada que es la causa subyacente de ]a irritación, así como de la dermatitis alérgica por contacto. Puesto que se sabe que la lactoferrina es una proteína no tóxica, las composiciones proporcionadas no tendrán ningún efecto secundario detectable.

Psoriasis La psoriasis es un desorden inflamatorio crónico de la piel que experimenta la reincidencia y remisión, y afecta del uno (1) al tres (3) por ciento de la población del mundo. En los Estados Unidos de Norteamérica más de un millón de personas tienen psoriasis, y de éstas más del once (11) por ciento han experimentado la incapacidad de esa severidad como para comprometer el empleo y la efectividad. La enfermedad puede comenzar a cualquier edad, y tiene su aparición pico en la tercera década. Su severidad, por supuesto, y sus remisiones son impredecibles . Ver, T.P. Habif, en: Clinical Dermatology, Mosby, Missouri (1996) y The Textbook of Medicine, editores: J.B. Wyngaarden y L.H. Smith, W., W.B. Saundres Company, Philadelphia (1985) . Se pueden dividir en dos grupos a los pacientes con psoriasis, aquellos con una predisposición genética, y aquellos que responden a factores epigenéticos, es decir, ambientales. La forma más común es la psoriasis de placa crónica, y está caracterizada por la hiperplasia de la epidermis y la inflamación de la dermis y la epidermis. Estos cambios surgen debido a la activación de la reacción inmune dérmica mediada por células de linfocito T, en ios nodos linfáticos regionales, en respuesta a estímulos antigénicos no identificados. Las células T activadas provocan que las células queratinocitas proliferen y asuman un fenotipo de psoriasis. La reacción inflamatoria la provocan las proteínas de citocina proinflamatorias, que se inducen en respuesta a los estímulos ambientales, y que dan como resultado la infiltración de la dermis y la epidermis por parte de las células sanguíneas blancas inflamatorias .

Estrategias Terapéuticas Actuales y Sus Inconvenientes. No hay cura para la psoriasis, y las estrategias terapéuticas en uso actualmente buscan suprimir la severidad y la extensión de la enfermedad. La primera línea de terapia para los pacientes con menos del 10 por ciento del cuerpo afectado es un agente antiinflamatorio administrado localmente. Los agentes más ampliamente usados en los Estados Unidos de Norteamérica son los corticosteroides (hidrocortisona y análogos) , debido a su alto grado de eficacia a corto plazo y el costo relativamente bajo. Los corticosteroides sistemáticos, por ejemplo, pueden inducir la pronta resolución de las lesiones psoriáticas, pero la supresión requiere dosis siempre en incremento. Cuando se disminuye la terapia, hay un fenómeno de rebote, con la extensión de las lesiones posiblemente hasta la exfoliación. Si se usan esteroides sistemáticos por otras razones válidas en paciente con psoriasis, se debe reconocer y sopesar el riesgo de la psoriasis agravada en la" decisión para iniciar la terapia. Aunque la psoriasis responde a tratamientos que pueden inducir la remisión durante un período de tiempo, con administración repetida, la tolerancia se desarrolla a la acción antiinflamatoria del tratamiento, y el beneficio no persiste por más de unos pocos meses. Además, se han observado efectos secundarios serios que envuelven la supresión del extracto pituitario-adrenal en infantes, cuando se usan dosis de hidrocortisona (1 por ciento) estándares no inscritos. James y colaboradores, 1967, Lance t 2: 1059-1061; Turpeinen, 1991, Br. J. Dermatol . 124.: 358-360. También se han consignado otros efectos secundarios de los esteroides, supra . En suma, existe una clara necesidad de métodos de tratamiento de la psoriasis, que sean efectivos mientras tengan efectos secundarios menos severos .

Métodos De Tratamiento Mejorados Proporcionados Por La Presente Invención. Los avances recientes en nuestro entendimiento del papel central de las reacciones inmunes en la patogénesis de la psoriasis, ha llevado a una intensa investigación de la aplicación de la inmunoterapia para aliviar la enfermedad. Específicamente, la psoriasis ha mostrado que es provocada por respuestas inmunes locales inapropiadas, que envuelven la producción de novo del TNF-a; por los queratinocitos. Gilhar y colaboradores, 1996, Clin . Exp . Immunol . 106 : 134-142. De conformidad con lo anterior, en una modalidad, la presente invención proporciona composiciones que interfieren directamente con la producción del TNF-a! por parte de los queratinocitos, evitando de esta manera la respuesta inmune local inapropiada que provoca la psoriasis. Más específicamente, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas novedosas que comprenden un producto de lactoferrina para el tratamiento de la psoriasis. En una modalidad preferida, las composiciones se formulan para aplicación local en aproximadamente el 0.5 por ciento a aproximadamente el 5 por ciento de portador. En modalidades alternativas, las composiciones se formulan para inyecciones intradérmicas . Como se consigna anteriormente, se cree que la psoriasis es una enfermedad incurable, por lo tanto pudiera requerir terapia a largo plazo. Una ventaja" importante de las composiciones de la presente invención sobre los métodos de tratamiento actuales es de esta manera, la baja toxicidad (o no toxicidad) de los productos de lactoferrina.

Inflamación Inducida Por Rayos Ultravioleta La exposición a los rayos ultravioleta es otra fuente predominante de reacciones y enfermedades locales de la piel, incluyendo el fotoenvejecimiento por eritema solar de la piel, y cáncer.

Métodos De Tratamiento Preventivo Actual y Sus Inconvenientes . Actualmente se aplican protectores solares con fotoprotectores, por ejemplo, ácido p-aminobenzoico, como ingredientes activos, para reducir la penetración de la radiación no ionizante fotoactiva a las células epidérmicas viables por debajo de la queratina, es decir, para evitar las reacciones adversas a la radiación ultravioleta. Estos fotoprotectores están diseñados típicamente para proteger contra los rayos quemantes más cortos de la luz ultravioleta en el rango de longitud de onda de 290 a 320 nm, UVB . Los protectores solares proporcionan de esta manera un bloque incompleto para permitir la producción de melanina con relación a la radiación transmitida, y la capacidad inherente de la piel parcialmente protegida para responder con bronceado. Los rayos quemantes más largos en el rango de 320 a 400 nm, UVA, contra los cuales los fotoprotectores típicos no proporcionan protección, provocan, sin embargo, muchas reacciones inflamatorias de la piel, así como el envejecimiento de la piel. Si se desea protección contra los UVA, entonces se necesitan protectores solares físicos tales como dióxido de titanio, u óxido de zinc, que están disponibles como cremas o pastas pesadas. Sin embargo, estos protectores opacos no son ni con mucho tan aceptables como las lociones claras y lechosas que protegen contra los UVA, y además éstos no permiten una reacción bronceadora autoprotector de la piel. Ver, T.P. Habif, en: Clinical Dermatology, Mpsby, Missouri (1996) y The Textbook of Medicine, editores: J.B. Wyngaarden y L.H. Smith, W. , W.B Saundres Company, Philadelphia (1985) .

Métodos De Tratamiento Curativo Actuales Y Sus Inconvenientes. Una vez que ha ocurrido la inflamación de la piel, es decir el eritema solar, inducida por los rayos ultravioleta, ésta se trata usualmente con compresas frías y tiempo. Los casos más severos se tratan con prednisona, la cual puede provocar severos efectos secundarios, tales como atrofia epidérmica y dérmica, telangiectasia adicional, púrpura, y estrías, como se explicó, supra . En pocas palabras, existe una necesidad de sustancias que tanto prevengan como curen la inflamación de la piel inducid por rayos ultravioleta 5.

Métodos De Tratamiento Preventivos Y Curativos Mejorados Proporcionados Por La Presente Invención. La presente invención proporciona composiciones y métodos mejorados para el tratamiento y la prevención de la irritación de la piel inducida por rayos ultravioleta. Más específicamente, en una modalidad, la invención proporciona composiciones protectoras novedosas contra los rayos ultravioleta, que comprenden una base de protector solar convencional y un producto de lactoferrina que previene la inflamación, como un aditivo. Estas composiciones farmacéuticas novedosas están inclinadas a evitar la inflamación de la piel inducida por rayos ultravioleta, incluyendo la inflamación inducida por UVA, mientras permiten el bronceado de la piel. En una modalidad alternativa, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un producto de lactoferrina para el tratamiento de la inflamación de la piel inducida por rayos ultravioleta.

Piel Fotoenvejecida Como se describió anteriormente, uno de los efectos adversos de la exposición a la luz ultravioleta es el envejecimiento de la piel, al que también se hace referencia como fotoenvejecimiento .

Métodos De Tratamiento Actuales De la Piel Fotoenvejecida Con Tretinoina Y Sus Inconvenientes .

Actualmente, ia aplicación local de tretinoina proporciona alguna marcha atrás de la piel fotodañada . WÍSS y colaboradores, 1988, J. AMA 259 :527-532. Sin embargo, la mayoría de los pacientes experimentan dermatitis inducida por tretinoina como un efecto secundario, la cual puede durar de semanas meses. Ver, T. P. Habif, en: Clinical Dermatology, Mosby, Missouri (1996) y The Textbook of Medicine, editores: J.B. Wyngaarden y L.H. Smith, W. , W.B. Saundres Company, Philadelphia (1985) . Por lo .tanto, existe una necesidad de productos mejorados para el tratamiento de la piel fotoenvejecida .

Composiciones Mejoradas Proporcionadas Por La Presente Invención. La presente invención proporciona composiciones y métodos mejorados para el tratamiento de la piel fotoenvejecida. Más específicamente, en una modalidad, la invención proporciona composiciones de tretinoina convencionales, que comprenden un producto de lactoferrina como protección contra los efectos secundarios de una inflamación inducida por tretinoina.

Productos Antiarrugas En años recientes han entrado en el mercado muchos productos cosméticos "antiarrugas" para aplicación local. Estos productos, que usan frecuentemente individuos que quieren evitar el envejecimiento facial de la piel, o hasta invertir el proceso de envejecimiento que ya ha ocurrido, contienen hidroxiácidos como ingredientes activos. Aunque estos productos en verdad parecen tener la actividad "desarrugadora" deseada, éstos frecuentemente provocan la inflamación de la piel como un efecto secundario. De conformidad con lo anterior, existe una necesidad de modificaciones a los productos antiarrugas que se usan actualmente, que aminoren sus efectos secundarios inflamatorios.

Composiciones Mejoradas Proporcionadas Por La Presente Invención. De conformidad con la presente invención, se pueden añadir productos de lactoferrina a las cremas, lociones, y otros productos antiarrugas convencionales, como un aditivo para proteger contra los efectos secundarios inflamatorios inducidos por los hidroxiácidos .

Acné Otro desorden provocado por, o asociado con la inflamación de la piel es el acné, un desorden de la piel que interfiere con la calidad de vida de muchos individuos. Ver, T.P. Habif, en: Clinical Dermatology, Mosby, Missouri (1996) y The Textbook of Medicine, editores: J.B. Wyngaarden y L.H. Smith, W. , W.B. Saundres Company, Philadelphia (1985).

Métodos De Tratamiento Actuales De La Piel Fotoenvejecida Con Tretinoina Y Sus Inconvenientes. Para forms más ligeras de la enfermedad, frecuentemente se prescriben preparaciones antimicrobianas, por ejemplo, peróxido de benzoilo, o clindamicina, tetraciclina, o eritromicina, para aplicación local. De manera alternativa, la enfermedad se puede tratar con antimicrobianos sistemáticos de amplio espectro. Sin embargo, a pesar de la terapia local más efectiva, esos métodos de tratamiento frecuentemente no dan como resultado el éxito deseado, y además, éstos están asociados con serios efectos secundarios. Por ejemplo, las tetraciclinas , aunque se usan comúnmente, llevan un riesgo de descoloración dental, fotosensibilidad, y -.asta embarazos inesperados por la interacción del fármaco con los anticonceptivos orales. Debido a que éstas se incorporan dentro de los huesos y dientes en crecimiento, éstas no se deben prescribir desde el cuarto mes fetal hasta la edad de 12 años. También hay la posibilidad de la movilización subsecuente del hueso bajo tensión, como en el embarazo, con el riesgo consecuente de hepatitis materna o absorción fetal. La eritromicina es una alternativa útil, sin embargo, ésta frecuentemente da como resultado" aflicción gastrointestinal . - - El acné más severo puede requerir procedimientos quirúrgicos más extensos, dosis más elevadas de antimicrobianos, esteroides intralesionales, o hasta esteroides sistemáticos. Se han usado estrógenos en mujeres seleccionadas con acné severo pertinaz, con buenos resultados, pero usados como terapia de progestina de estrógeno cíclica todos ellos tienen el riesgo concomitante de las preparaciones anovulatorias que se dan para la anticoncepción. En suma, los métodos de tratamiento actuales para el acné usualmente dejan al paciente sin una cura satisfactoria, mientras tienen más bien severos efectos secundarios. De esta manera, existe una necesidad de terapéuticos efectivos de baja toxicidad.

Composiciones Mejoradas Proporcionadas Por La Presente Invención . La presente invención proporciona composiciones efectivas que comprenden un producto de lactoferrina para la terapia de la inflamación asociada con el acné. Generalmente, las composiciones se formulan de manera similar a aquellas que se usan para el tratamiento de la dermatitis por contacto.

Artritis La artritis, es decir, la inflamación de los cartílagos de las coyunturas, está asociada con muchas causas, y se sabe que tiene una diversidad de manifestaciones. Por ejemplo, la artritis puede ser un desorden autoinmune, o, alternativamente, ésta puede ser inducida por un alérgeno. Ver, The Textbook of Medicine, editores: J.B. Wyngaarden y L.H. Smith, W. , W.B. Saundres Company, Philadelphia (1985) . Métodos De Tratamiento Actuales Y Sus Inconvenientes . Actualmente, la artritis se trata típicamente de manera sistemática con corticosteroides u otros esteroides. Se han descrito los problemas relacionados con el tratamiento con esteroides, supra . Además, ninguno de los métodos de tratamiento actuales para la artritis pueden detener el progreso de la enfermedad, lo que puede dar como resultado la deformación del esqueleto. "Por lo tanto, existe una necesidad imperiosa de composiciones y métodos mejorados para el tratamiento de la artritis.

Composiciones Mejoradas Proporcionadas Por La Presente Invención. La presente invención proporciona composiciones novedosas que comprenden un producto de lactoferrina que inhibe la inflamación mediada por alérgenos, útiles para el tratamiento de muchas formas de artritis. Además, puesto que la mediación de una respuesta autoinmune parece depender de mecanismos similares a 'las respuestas inmunes relacionadas con alérgenos, es decir, ambas están mediadas por el TNF-a!, se puede asumir que las composiciones proporcionadas también son de valor para el tratamiento de formas de artritis relacionadas con desórdenes autoinmunes. En una modalidad de la invención, las composiciones que comprenden un producto de lactoferrina como un ingrediente activo, se inyectan directamente en las coyunturas enfermas. Se pueden usar otros agentes antiinflamatorios, tales como salicilatos, como auxiliares. En otras modalidades de la invención, los productos de lactoferrina se pueden administrar sistemáticamente mediante inyección, o en la forma de productos de liberación sostenida. Las ventajas de las composiciones de la presente invención sobre cualesquier productos previamente conocidos para la terapia de la artritis son (1) la efectividad, interfiriendo directamente con la fuerza impulsora de la enfermedad, es decir, la inflamación de las coyunturas, evitando mediante lo mismo el progreso de la enfermedad, y (2) la no toxicidad, es decir, como se declaró, supra, los productos de lactoferrina han mostrado que no exhiben ningún efecto tóxico en humanos y otros mamíferos.

Enfermedades Inflamatorias Pulmonares Las Enfermedades Inflamatorias Pulmonares tales como el asma y la bronquitis alérgicas son desórdenes caracterizados por la responsividad incrementada de la tráquea y los bronquios a diferentes estímulos, es decir, alérgenos, dando como resultado un estrechamiento extendido de las vías respiratorias. Por ejemplo, el asma es una reacción inflamatoria del sistema respiratorio, en respuesta a estímulos externos. En casos severos, el asma puede provocar la muerte por la falta del suministro de oxígeno, y puede afligir a tanto como el cinco por ciento de la población de los Estados Unidos de Norteamérica. En más de la mitad de los casos, el asma se diagnostica entre las edades de dos (2) y diecisiete (17) años, y en este grupo ésta es la causa principal de enfermedad e incapacidad. Ver, The Textbook of Medicine, editores: J.B. Wyngaarden y L.H. Smith, W. , W.B. Saundres Company, Philadelphia (1985) .

Métodos De Tratamiento Actuales Y Sus Inconvenientes .

Los métodos de tratamiento actuales incluyen la administración de fármacos simpatomimét icos , met ilxantinas , y corticosteroides. Los fármacos simpatomiméticos, incluyendo la epinefrina y el isoproterenol, tienen un efecto beta-adrenérgico. Su utilidad está limitada por sus acciones sobre el corazón, además, se desarrolla tolerancia después del uso repetido. Las metilxantinas, de las que se cree que provocan la relajación de los músculos suaves por su acción sobre la enzima citoplásmica fosfodiesterasa, en muchos casos provocan anorexia, náuseas, malestar gastrointestinal, e irritabilidad del sistema nervioso central. Los corticosteroides son muy efectivos en el tratamiento del asma, sin embargo, éstos tienen severos efectos secundarias como se describió, supra . Por lo tanto, existe una necesidad de nuevas composiciones y métodos para el tratamiento del asma, que sean efectivos y que tengan a la vez baja toxicidad.

Composiciones Mejoradas Proporcionadas Por La Presente Invención. La presente invención proporciona nuevas composiciones que comprenden un producto de lactoferrina, y métodos para el tratamiento del asma. Típicamente, las composiciones se administrarán como un inhalador. Alternativamente, las composiciones que comprenden el producto de lactoferrina se pueden administrar sistemáticamente mediante inyección, o en la forma de tabletas, cápsulas, o en formas de liberación sostenida. Hasta a dosis elevadas, las composiciones de la invención no tendrán efectos secundarios significativos, debido a que la lactoferrina es una proteína natural, no tóxica. Los ejemplos a continuación explican la invención con más detalle. Las siguientes preparaciones y ejemplos se dan para habilitar á aquellos expertos en la técnica para entender más claramente, y para practicar la presente invención. La presente invención, sin embargo, no está limitada en alcance por las modalidades ejemplificadas, las cuales se pretenden como ilustraciones de los aspectos individuales de la invención solamente, y los métodos que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. De hecho, para aquellos expertos en la técnica serán evidentes diferentes modificaciones de la invención, en adición a aquellas descritas en la presente, por la descripción precedente y los dibujos acompañantes. Se pretende que esas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas .

EJEMPLOS DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS EJEMPLO 1 Fijación De La Lactoferrina A Receptores Localizados En Los Queratinocitos Productores De TNF-a El siguiente ejemplo es un ensayo de fijación de ligando in si tu, que muestra la fijación de la 125J.-lactoferrina a los queratinocitos en la capa epidérmica de piel de ratón neonatal .

Procedimiento Experimental . Se obtuvieron aproximadamente 2 milímetros cuadrados de muestras de piel trasera de ratón tipo silvestre recién nacido, y se enjugaron brevemente dos veces con PBS a 37°C, y se incubaron por duplicado a 37°C en 0.5 mililitros de PBS/albúmina de suero de bovino al 1 por ciento, que contenía: (A) 1.0 x 108 de 125J-lactoferrina; y (B) 1.0 x 108 de 125I-lactoferrina más 50 veces de lactoferrina recombinante saturada con hierro no etiquetado en exceso . Se lavaron las muestras seis (6) veces durante diez (10) minutos, cada una en PBS/albúmina de suero de bovino al 1 por ciento frío, y se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento, durante tres (3) horas, sin agitar, y después se enjugaron dos veces durante diez (10) minutos en PBS frío. Inmediatamente se congelaron las muestras. Se usaron las muestras para hacer secciones de 10 µm, y después se deshidrataron las secciones, usando concentraciones ascendentes de etanol. Se colocaron las secciones en emulsión de NTB-2, y se expusieron durante siete (7) y catorce (14) días a 4°C. Después del desarrollo se mancharon las secciones con hematoxilina y se montaron con Permount .

Fijación De La Lactoferrina A Los Queratinocitos.

Como revela el experimento de la hibridación in si tu, la lactoferrina se acumula en la membrana de los queratinocitos. Ver, por ejemplo, la Figura 2. Específicamente, la Figura 2 muestra la fijación de la lactoferrina a sus receptores en los queratinocitos productores de TNF-a! in si tu en piel de ratón neonatal . Los dos paneles superiores muestran las imágenes de campo clara y oscura obtenidas usando solamente lactoferrina etiquetada (1.0 x 108 de 125I -lactoferrina) . Los dos paneles inferiores muestran las imágenes de campo clara y oscura cuando se realizó el ensayo de fijación en la presencia de lactoferrina no etiquetada en exceso (exceso de 50 veces) . La fijación de la lactoferrina se concentró en la capa epidérmica y en los folículos pilosos, pero no se observó en la capa dérmica normal. Estos resultados indican la fijación de la lactoferrina a sus receptores en la superficie de los queratinocitos en la epidermis. Se sabe que los queratinocitos producen el TNF-a.

EJEMPLO 2 Influencia De La Lactoferrina En La Acumulación De Células Dendrí icas En Los Nodos Linfáticos De Drenaje El siguiente ejemplo muestra que la lactoferrina inhibe la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje, inducida por oxazolona e IL-1/3, mientras que la lactoferrina no afecta la acumulación de células dendríticas inducida por la administración de TNF-a;.

Procedimiento Experimental . Grupos de ratones (n=10) recibieron 30 µl de inyecciones intradérmicas en ambos pabellones de las orejas de ya sea lactoferrina de murino (LF) al 0.02 por ciento o albúmina de suero de bovino (BSA) al 0.02 por ciento, cada una suspendida en solución salina regulada en su pH de fosfato (PBS; pH de 7.2) . Dos (2) horas después, los ratones recibieron una segunda inyección intradérmica en el mismo sitio, de 50 ng (30 µl) de citocina, es decir, TNF-a; ó IL-1/3, suspendida en BSA ai 0.1 por ciento/PBS, o se expusieron localmente en el dorso de ambas orejas a 25 µl de oxazolona (Ox) al 0.5 por ciento, disuelta en acetona : aceite de oliva (4:1) . Los ratones de control no se trataron. Se removieron los nodos linfáticos de drenaje (auriculares) en diferentes momentos después de la exposición, dependiendo de la cinética de la acumulación de células dendríticas inducida para cada tratamiento, es decir, cuatro (4) horas para el TNF-a', diecisiete (17) horas para la IL-1/3, y dieciocho (18) horas para la oxazolona, respectivamente. Subsecuentemente se evaluó el número de células dendríticas por nodo, como se describió previamente. Cumberbatch y Kimber, 1992, Immunology 75:257-263.

Resul tados. Como se ilustra en la TABLA I y la Figura 3A, el tratamiento con oxazolona indujo la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje (barra 4, en comparación con el grupo de control ilustrado como la barra 1) . La administración intradérmica de la lactoferrina a los animales inducidos por oxazolona, sin embargo, dio como resultado una inhibición de la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje en un 75 por ciento (Oxazolona/lactoferrina: 13,774 células dendríticas por nodo (sobre el nivel base), oxazolona/+lactoferrina : 3,394 células dendríticas por nodo (sobre el nivel base) , ver, TABLA I) , indicando la supresión de una respuesta inmune local en estos animales, mediante la lactoferrina. Como se ilustra también en la TABLA I y las Figuras 3A, la administración de TNF-a indujo la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje (ver, Figura 3A, barra 2) . Como se indica por los resultados reflejados por la barra 3 de la Figura 3A, la lactoferrina no tiene ningún efecto en la respuesta inmune local inducida por TNF-a, es decir, la administración de TNFa;/- lactoferrina dio como resultado 4,753 células dendríticas por nodo (sobre el nivel base) , mientras que la administración de TNF-a/+lactoferrina dio como resultado 4,802 células dendríticas por nodo (sobre el nivel base) . Estos resultados indican que la lactoferrina actúa corriente arriba del TNF-a; en la cascada de la respuesta inmune.

Como se ilustra en la TABLA I (B) y como se ilustra también en la Figura 3B, la administración intradérmica de la IL-13 dio como resultado la estimulación de la migración de células de Langerhans y la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje (Figura 3B, barra 1) . La administración de la lactoferrina dio como resultado una inhibición de la respuesta inmune . Como se indica en la Figura 3B, barra 2, la inyección intradérmica de la lactoferrina dio como resultado la inhibición de la acumulación de células dendríticas en un 56 por ciento ( IL-13/-lactoferrina : 7,569 células dendríticas por nodo (sobre el nivel base) , oxazolona/+lactoferrina : 3,342 células dendríticas por nodo (sobre el nivel base) , ver, TABLA I) . Éstos resultados indican que: (1) la acumulación de células dendríticas depende de los incrementos en los niveles de IL-13, y (2) la IL-1/3 actúa corriente arriba del TNF-a;, puesto que la lactoferrina no afecta una respuesta inmune inducida por TNF-a!. Por lo tanto, la IL-13 estimula la síntesis de novo del TNF-a; por parte de los queratinocitos. Además, estos datos demuestran que el efecto inhibidor de la lactoferrina en la migración de células de Langerhans y la acumulación de células dendríticas, se deben a la regulación negativa de la producción de TNF-a!, más bien que por medio de una influencia en otro aspecto de la función de las células de Langerhans . Por lo tanto, la lactoferrina es capaz de inhibir la síntesis de novo del TNF-a!.

TABLA I INFLUENCIA DE LA LACTOFERRINA EN LA ACUMULACIÓN DE CÉLULAS DENDRITICAS EN LOS NODOS LINFÁTICOS DE DRENAJE EJE1-PLO 3 Influencia De La Lactoferrina En La Migración De Células De Langerhans Inducida por TNF-c. E IL-1/3 El siguiente ejemplo demuestra que la lactoferrina inhibe la migración de células de Langerhans inducida por IL-Iß , mientras que ésta no afecta la migración de células de Langerhans que se induce por el TNF-a!.

Procedimiento Experimental Grupos de ratones (n=3) recibieron 30 µl de inyecciones intradérmicas en ambos pabellones de las orejas de ya sea lactoferrina de murino (LF) al 0.005 por ciento o albúmina de suero de bovino (BSA) al 0.005 por ciento, cada una suspendida en solución salina regulada en su pH de fosfato (PBS; pH de 7.2) . Dos (2) horas después, los ratones recibieron una segunda inyección intradérmica en el mismo sitio, de 50 ng (30 µl) de citocina, es decir, TNF-a; ó IL-13, suspendida en BSA al 0.1 por ciento/PBS . Los ratones de control no se trataron. Se removieron las orejas 30 minutos después del tratamiento con TNF-a; o 17 horas después del tratamiento con IL-13, y se prepararon hojas epidérmicas preparadas como se describió previamente. Cumberbatch y colaboradores, 1994, Immunology 81:395-401. Se midió la frecuencia de las células de Langerhans (LC) mediante inmunofluorescencia indirecta. Los resultados se expresan como el número medio de células/milímetro cúbico (±SE) , derivado del examen de 10 campos/muestra para cada una de las 4 muestras. Se calculó el significado estadístico de las diferencias entre los grupos experimentales usando el prueba t de Student . p.<0.005.

Resul tados . Como se ilustra en la TABLA II y la Figura 4, la administración intradérmica de la IL-13 dio como resultado la estimulación de la migración de células de Langerhans, que se inhibió mediante la lactoferrina. Además, la administración de TNF-OJ dio como resultado la migración de células de Langerhans, sin embargo, la lactoferrina no inhibió la migración inducida por TNF-a;. Estos resultados confirman que la IL-1/3 actúa corriente arriba del TNF-a; en la cascada de la respuesta inmune local, y que la lactoferrina actúa corriente abajo de la IL-1/3, pero corriente arriba del TNF-a;.

TABLA II INFLUENCIA DE LA LACTOF?RRINA EN LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS DE LANGERHANS INDUCIDA POR TNF-A E IL-ljS Tratamiento Células de Langerhans por mm2 -2 horas 0 horas - - 938.9 ± 22.2 BSA TNF-Cü 766.5 ± 36.9 LF TNF-a 701.2 ± 21.2 BSA IL-13 615.6 ± 16.1 LF IL-1/3 858.9 ± 28.9 EJEMPLO 4 Influencia de la lactoferrina en la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje El siguiente ejemplo muestra que la lactoferrina, cuando se administra localmente, inhibe la acumulación de células dendríticas, inducida por oxazolona, en los nodos linfáticos .

Procedimiento Experimental . Grupos de ratones (n=6) recibieron localmente una solución al 0.02 por ciento de lactoferrina disuelta en loción Lubriderm o albúmina de suero de bovino (BSA) al 0.02 por ciento disuelta de manera similar, en el dorso de ambas orejas. Después se expusieron los ratones localmente en los mismos sitios, a 25 µl de oxazolona (Ox) al 0.5 por ciento disuelta en acetona : aceite de oliva (4:1) . Los ratones de control no se trataron. Se removieron los nodos linfáticos de drenaje 18 horas después de la exposición, y se evaluó el número de células dendríticas por nodo, como se describió anteriormente. Cumberbatch y colaboradores, 1992, Immunology 75 : 257-263.

Resultados. Como se ilustra en la Figura 5, los resultados de dos experimentos independientes (paneles A y B) indican que el tratamiento con oxazolona indujo la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje de los ratones tratados previamente con BSA al 0.02 por ciento (ver barra 2, paneles A y B, contra la barra 1 de control) . La administración local de lactoferrina de ratón dio como resultado una fuerte inhibición de la acumulación de las células dendríticas en los nodos linfáticos, en respuesta a la oxazolona en ambos experimentos (ver barra 3, paneles A y B) . Los resultados indican que la lactoferrina administrada localmente es altamente efectiva para inhibir la acumulación de células dendríticas en los nodos linfáticos, en respuesta a un alérgeno, y en consecuencia la inflamación cutánea inducida por alérgenos. La Figura 5 muestra el efecto inhibidor de la lactoferrina en la acumulación de células dendríticas, inducida por oxazolona, en los nodos linfáticos de drenaje cuando se aplica la lactoferrina localmente a la superficie de la piel. Todas las referencias citadas dentro del cuerpo de la presente especificación están incorporadas a la presente como referencia en su totalidad. Los ejemplos que se proporcionan en la presente son simplemente ejemplares. Se pretende que la invención esté limitada solamente por el alcance de las reivindicaciones anexas .

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. El uso de un producto de lactoferrina para la producción de un medicamento para inhibir la actividad inflamatoria de la IL-l/S.

2. Una composición que comprende (a) un compuesto terapéutico o cosmético que produce una reacción inflamatoria local, y (b) un producto de lactoferrina.

3. Una composición, de conformidad con la reivindicación 2, en donde el compuesto de (a) se selecciona a partir del grupo que consiste de tretinoina, un fotoprotector, y un hidroxiácido.

4. Una composición, de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, caracterizada porque también comprende un portador farmacéuticamente aceptable o un portador cosmético.

5. El uso de un producto de lactoferrina para la producción de un medicamento para tratar un desorden inflamatorio inducido por alérgenos en un mamífero.

6. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con la reivindicación 5, en donde el mamífero es un humano .

7. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 y 6, en donde el desorden inflamatorio inducido por alérgenos caracteriza una respuesta inmune local caracterizada por la producción incrementada del TNF-a.

8. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, y 5-7, en donde el producto de lactoferrina es una lactoferrina naturalmente ocurrente .

9. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, y 5-7, en donde el producto de lactoferrina es una lactoferrina producida recombinantemente, o un análogo biológicamente activo de la misma.

10. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, y 5-7, en donde el producto de lactoferrina es un fragmento biológicamente activo de la lactoferrina.

11. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, en donde el desorden inflamatorio se selecciona a partir del grupo que consiste de artritis y una enfermedad inflamatoria pulmonar.

12. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera ae ias reivinaicaciones 1, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, en donde el desorden inflamatorio es un desorden inflamatorio dérmico.

13. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, en donde el desorden inflamatorio se selecciona a partir del grupo que consiste de dermatitis por contacto, psoriasis, inflamación inducida por rayos ultravioleta, rozadura por pañal de infantes, y acné.

14. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, en donde el producto de lactoferrina se administra en una composición que también comprende un agente antiarrugas, y el desorden inflamatorio es envejecimiento facial de la piel.

15. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, en donde la enfermedad inflamatoria es asma.

16. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, en donde la enfermedad inflamatoria es sinusitis.

17. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, en donde la enfermedad inflamatoria es rinitis.

18. El uso de un producto de lactoferrina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, en donde la enfermedad inflamatoria es bronquitis.