MXPA98010799A - Estructura de proposito general de un elemento analitico y su aplicacion para la determinacion delanalito - Google Patents
Estructura de proposito general de un elemento analitico y su aplicacion para la determinacion delanalitoInfo
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Abstract
La invención se refiere a un elemento analítico para la determinación de un analito que contiene en o un material el cual permite el transporte del líquido entre zonas, una zona de aplicación de la muestra y una zona de detección localizada de manera descendente del mismo, caracterizada porque la zona de detección contiene una pareja 1 de un par de enlaces específicos 1 inmovilizados de manera tal que se permite enlazar a la pareja 2 del par de manera tal que se permite enlazar a la pareja 2 del par 1 de enlaces específicos, en los cuales no estáen analito cuando se ponen en contacto, en donde, una pareja 1 marcada de un par 2 de enlaces específicos se presenta descendentemente de la zona de detección y se impregna en un material de manera tal que puede ser desprendida por el líquido y permite enlazar a la pareja 2 del par 2 de enlaces específicos en los cuales no estáel analito cuando se ponen en contacto. Asítambién como un método para la determinación de un analito usando este elemento analítico.
Description
ESTRUCTURA DE PROPOSITO GENERAL DE UN ELEMENTO ANALÍTICO Y SU APLICACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DEL ANALITO.
La invención se refiere a un elemento analítico para la determinación de un analito (substancia que se va a analizar o a determinar) de que lo contiene en o un material el cual permite el transporte del liquido entre las zonas, una zona de aplicación de la muestra y una zona de detección se localiza de manera descendente del mismo, en donde la zona de detección contiene una pareja 1 de un par 1 de enlaces específicos 1 inmovilizados de una manera tal que se permite unir con la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 en el cual el analito (substancia que se va a analizar o a detectar) no está cuando se contactan así también como un método para la determinación de un analito
(substancia que se va a analizar o a detectar) por medio de unos "pares de enlaces específicos. La invención adicionalmente se refiere a un kit para la determinación de un análisis que contiene un elemento analítico.
Los elementos analíticos se conocen a partir de la técnica anterior en el cual los reactivos requeridos para determinar un análisis se presentan en o los materiales portadores. Los Ejemplos son: Patente
REF.: 29056 Norteamericana 4,861,711, Patente Norteamericana 5,591,645 y EP-A-O 291 194. Un rasgo común de los elementos analíticos descritos en estos documentos es que son especialmente adecuados para llevar a cabo un métodos de detección inmunológica. Comprende una muestra de zona de aplicación y una zona de detección de la muestra la cual se localiza de manera descendente del mismo. Una muestra de líquido emigra través de varias zonas entre la muestra de la zona aplicación y la zona de detección como un resultado de las fuerzas capilares dentro de un material de transporte poroso y con ello toma los reactivos que son necesarios para detectar el analito (substancia que se va analizar o detectar) y lo hace reaccionar con el analito (substancia que se va a analizar o a detectar) en la muestra.
Una pareja de enlaces se inmoviliza en la zona de reacción la cual es capaz de enlazar específicamente al analito (substancia que se va a anlizar o a determinar) a determinarse. En el caso de diferentes analitos (substancia que se va a analizar o a determinar) este requiere que diferentes parejas de enlaces para el analito tengan que ser inmovilizados en una fase sólida.
Se sabe también, a partir de la Figura 1 de la Patente Norteamericana US 4,861,711 en conjunto con la descripción, por ejemplo en la columna 5, línea 57 a columna 6 línea 48, que una pareja 1 de un par 1 de enlaces específicos 1 puede ser inmovilizada en la zona de detección la cual no enlaza al analito pero puede ser usada universalmente debido a que enlaza una epítope como pareja 2 del par de enlaces específicos 1 el cual está presente en una substancia la cual enlaza específicamente al analito. Por lo tanto, el complejo móvil de analito y esta substancia enlazante se inmoviliza en la zona de detección durante el curso de la reacción de detección y se separa a partir de los componentes de la reacción móvil sin el complejo .
Una substancia etiquetada o marcada que es especifica para el analito juega un papel muy importante debido a sus enlaces con el analito y la inmovilización posterior del complejo compuesto formado del analito y la substancia etiquetada o marcada dirigida contra el analito en la zona de detección así también como la eliminación de los componentes de la reacción móvil sin reaccionar a partir de la zona de detección permiten indicar la presencia de analito en la muestra líquida. Las substancias marcadas o etiquetadas conocidas a partir de la técnica anterior son especificas para el analito es decir, en el caso de pruebas o ensayos intercalados se marcan las substancias tales como los anticuerpos o antígenos los cuales reaccionan específicamente con el analito a ser determinado (antígeno o anticuerpo) . Sin embargo, esto requiere que dependiendo del analito, que tengan que prepararse diferentes marcadores de pareja enlazantes específicas para el analito.
A partir de la técnica anterior se conocen numerosas substancias para marcar o ser marcadoras. Mientras que en el pasado se usaron los marcadores radioactivos con todas sus desventajas, estos marcadores fueron posteriormente reemplazados principalmente por enzimas marcadoras. Hoy en día, los marcadores particulares, especialmente partículas doradas o látex, son principalmente usadas en los elementos analíticos como se describen en los documentos descritos previamente a partir de la técnica previa. Es complicada la preparación de un compuesto conjugado de un marcador y una substancia específicamente enlazante al analito y tiene que optimizarse para cada pareja enlazante del analito especifico individual si se intenta determinar diferentes analitos. Además, en los elementos analíticos los materiales en los cuales este conjugado se presenta y transporta podrán adaptarse óptimamente a los requerimientos de caso por caso. En esta conexión anterior, todos los problemas de estabilidad se han resuelto ligeramente .
Por lo tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar una estructura de propósito general de un elemento analítico en cual siempre puede ser usado independiente del analito a ser determinado proporcionando este analito o una sustancia derivada a partir del analito y que representa este analito puede ser detectado por el enlace par específico.
Este objeto se alcanza por el tema en la invención como se describe en las reivindicaciones.
La invención en particular, se refiere a un elemento analítico para la determinación de un analito que contiene en o un material el cual permite el transporte líquido entre zonas, una muestra de una zona de aplicación y una zona de detección se localiza en forma descendente del mismo, en donde la zona de detección contiene una pareja 1 de un par 1 de enlaces específicos inmovilizados de manera tal que se permite enlazar una pareja 2 del par 1 de enlaces específicos el cual no es un analito cuando se contacta, caracterizado porque una pareja marcadora 1 de un par de enlaces específicos 2 se presenta de manera descendente de la zona de detección impregnada en un material de manera que pueda ser separada por el líquido y ser capaz de enlazar a la pareja 2 del par de enlaces específicos 2 los cuales no está el analito cuando se contacta, en el cual las parejas 3 del par de enlaces específicos y la pareja 2 del par de enlace especifico 1 están enlazadas especialmente al analito a determinar por la reacción que involucra el analito para determinar son partes de una substancia derivada a partir de y que representan el analito.
La invención también se refiere a un kit para la determinación de un analito que contiene un elemento analítico como se caracterizó anteriormente así también contiene adicionalmente al menos una pareja a partir del grupo de parejas 2 del par de enlaces específicos 1 y la pareja 2 del par de enlaces específicos 2.
Finalmente, la invención también se refiere a un método para la determinación de un analito por medio de unos pares de enlaces específicos caracterizados en que una substancia derivada a partir y que representa el analito comprende 2 parejas de un par 1 de enlaces específicos y 2 parejas de un par 2 de enlaces específicos se ponen en contacto en un elemento analítico de conformidad con la invención para la determinación de un analito con una pareja marcadora del par 2 de enlaces específicos, se elimina por el transporte del líquido en los elementos analíticos hacia la zona de reacción la cual es descendente de la muestra de la zona de aplicación, se enlaza en la zona de detección a la pareja 1 del par 1 de enlaces específicos y se determina en base al marcado de la pareja 1 del par de enlaces específicos 2.
Una característica esencial del elemento analítico de conformidad con la invención es que el líquido puede moverse dentro de los elementos analíticos hacia la zona de detección. Tal como un flujo de líquido es posible por ejemplo por la fuerza gravitacional en un cuerpo hueco apropiadamente preparado. Los 'dispositivos que permiten transportar el líquido por la fuerza centrífuga como un tipo de fuerza gravitacional son conocidos por ejemplo a partir de la Patente EP-B 0 052 769. Sin embargo, los elementos analíticos de conformidad con la invención contienen preferiblemente materiales absorbentes los cuales permiten mover el líquido por fuerza capilar. Los materiales de las zonas individuales del elemento analítico de conformidad con la invención pueden en esta conexión ser los mismos o diferentes. Sería frecuentemente el caso que diferentes zonas están compuestas de diferentes materiales si estos son óptimamente completos en sus funciones.
Los materiales capilares activos de potencial absorbente adecuados son básicamente aquellos lo cuales pueden ser usados para tomar un líquido en así llamados pruebas secas como se describe por ejemplo en la Patente Norteamericana US-A 4,861,711, US-A 5,591,645 o EP-A-O 291 194. Los materiales porosos tales como membranas, por ejemplo membranas de nitrocelulosa se han probado ser ventajosas. Sin embargo, es posible el uso de fibras, materiales de matriz absorbentes tales como lanas, tejidos o tejidos de mallas. Los vellocinos o lanas son particularmente preferidos. Los materiales de matriz fibrosa pueden contener vidrio, celulosa, derivado de celulosa, poliéster, poliamida y también son viscosos, lana artificial y alcohol polivinílico. Los vellocinos o lanas son elaborados de fibras de base de celulosa, las fibras de polímeros en base de poliéster y/o poliamida y un agente enlazante orgánico el cual tiene grupos OH y/o éster como se conoce a partir de la patente EP-B-O 326 135 pueden por ejemplo ser usados de conformidad con la invención. Los materiales de vellocinos o lanas que contiene fibras de copoliéster fundibles además de las fibras de vidrio, fibras de poliéster, fibras de poliamida, fibras de celulosa o fibras derivadas de celulosa como se describe en la Solicitud de Patente Europea 0 571 941 pueden también ser usadas en el elemento analítico de conformidad con la invención. Los papeles tales como los papeles de las bolsitas de té son también adecuados.
A fin de mejorar la manipulación o manejo del elemento analítico de conformidad con la invención, el material capilarmente activo absorbente o los diferentes materiales capilarmente activos absorbentes pueden ser colocados en un material transportador inflexible en cual es así mismo impermeable para el líquido, no se influencia negativamente el flujo del líquido en el material matriz y es inerte con respecto a las reacciones que ocurren en el elemento analítico. La hoja de poliéster puede ser un material portador preferido en el cual se une un material matriz que facilita el transporte líquido.
En el elemento analítico de conformidad con la invención las zonas individuales pueden ser colocadas en el material transportador en la parte superior de cada otro, después de otro o parcialmente en la parte superior de y parcialmente posterior a otro. Un elemento analítico de conformidad con la invención es particularmente preferido en el cual la muestra de la zona de aplicación y la zona de detección se colocan siguiendo unas a otras sugiriendo que estas zonas estén adyacentes y en contacto directo con otra o estén colocadas esencialmente en un plano separado por otras zonas.
La muestra de la zona de aplicación es la región del elemento analítico de conformidad con la invención en la cual la muestra se aplica en la cual se intenta determinar si un analito particular o una substancia derivada de allí y que representa este analito este presente y opcionalmente en el cual una cantidad esta presente.
La zona de detección es la región del elemento analítico de conformidad con la invención la cual está determinada mientras el analito examinado o la substancia derivada de allí y que representa el analito este presente en la muestra aplicada al elemento analítico. Esta determinación puede ser cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa. En esta conexión semicuantitativa se sugiere que un valor de concentración específica no se determine por el analito o por la substancia derivada de allí represente el analito pero preferentemente un rango de concentración se determina en el cual se localiza la concentración analítica.
La pareja 1 de un par de enlaces específicos 1 se inmoviliza en la zona de detección de tal forma que es posible enlazar a la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 en la cual no está el analito -cuando se ponen en contacto. La inmovilización puede realizarse por reacción química, es decir, por la formación de un enlace covalente. Sin embargo, pueden también realizarse por fuerzas adsortivas las cuales incluyen todas las posibilidades para la formación de enlaces covalentes. Una membrana nitrocelulosa se usa frecuentemente para la zona de detección en la cual las proteínas y también los ácidos nucleicos se enlazan estrechamente cuando se impregnan pero sin el enlace covalente.
De conformidad con la invención una pareja marcadora 1 de un par de enlaces específicos 2 podrá también estar en el elemento analítico además de la pareja 1 de un par 1 de enlaces específicos. Esta pareja no podrá ser inmovilizada pero podrá estar presente de una forma impregnada que puede ser separada por el líquido es decir, podrá ser posible transportar esta pareja marcador por el líquido hacia la zona de detección. Ventajosamente deberá ser posible por completamente es decir, cuantitativamente separar esta pareja marcada con tan poco líquido como sea posible a partir del material matriz en el cual se impregnó. Los vellocinos o lanas se han probado ser particularmente convenientes como un material matriz para este como se describe por ejemplo en la patente EP-B-O 326 135.
Los pares de enlaces específicos son conocidos a partir de la técnica anterior e incluyen por ejemplo los pares tales como el hapteno y anticuerpos, antígeno y anticuerpo, lectina y azúcar o sacárido, avidina o estreptavidina y biotina así también como ácido nucleico y ácido nucleico, ligando y receptor. En esta conexión un antígeno puede ser cualquier molécula contra la cual uno pueda experimentalmente producir anticuerpos. Un antígeno puede también ser un anticuerpo o un sitio particular de un anticuerpo el cual se refiere a una epítope y está reconocido y enlazado específicamente por un anticuerpo. Los ácidos nucleicos deberán entenderse como todas las formas posibles de ácidos nucleicos los cuales son capaces de enlazar vía bases complementarias. El DNA, RNA y también los análogos del ácido nucleico tal como ácidos nucleicos péptidos (PNA ver por ejemplo la patente WO 92/20702) están específicamente mencionados pero no son una lista definitiva. El ligado y el receptor completamente se refieren en general a una interacción de enlaces específicos entre dos parejas tales como entre una hormona y un receptor hormona.
En una modalidad preferida del elemento analítico de conformidad con la invención, la pareja 1 de un par de enlace específico 1 es un anticuerpo el cual reconoce una epitope en otro anticuerpo el cual se dirige contra el analito. El epitope con el cual el anticuerpo se dirige corresponde a la pareja 2 del par de enlaces específicos 1. Sin embargo, la avidina o estreptavidina son especialmente preferibles empleadas como parejas 1 del par de enlaces específicos 1 los cuales pueden enlazar específicamente a la biotina. La biotina luego forma parejas 2 del par de enlaces específicos 1.
En una modalidad preferida del ' elemento analítico de conformidad con la invención, la pareja 1 del par de enlaces específicos 2 es un anticuerpo a la pareja 2 del par de enlaces específicos 2. Esta pareja 2 del par de enlaces específicos 2 es preferiblemente un hapteno de conformidad con la invención, ventajosamente un hapteno el cual no está presente en la muestra para ser examinado. La digitoxigenina, digitoxina, digoxigenina o digoxina son usadas particularmente en forma preferida como el hapteno.
Básicamente todos los marcadores los cuales se conocen a partir de ensayos inmunes en la técnica anterior son adecuados como marcadores de la pareja 1 del par de enlaces específicos 2. Estos son en particular marcadores radioactivos o enzimas marcadoras tales como la peroxidasa, fosfatasa alcalina o galactosidasa o fluoroforos. Sin embargo, los marcadores así llamados directos son usados preferiblemente, es decir, marcadores cuyo color puede ser reconocido por el ojo sin etapas adicionales de manipulación. Los marcadores ventajosos de este tipo son por ejemplo las partículas que son insolubles en agua tal como partículas de metal o látex y también pigmentos tales como el silicato, carbón negro, o selenio. Las partículas de metal en particular se usan preferiblemente como un marcador de conformidad con la invención. Se usa de manera particularmente preferida el oro coloidal como un marcador. El marcador puede ser covalentemente o adsortiva ente enlazado a la pareja 1 del par de enlaces específicos 2 en el que el adsortivo incluye todas las posibilidades excepto para el enlace covalente. En el caso de las partículas de látex coloreadas como un marcador directo, se presenta preferiblemente un enlace covalente. Los enlaces adsortivos se usan preferiblemente para metales coloidales como marcadores directos en particular para el oro coloidal.
La preparación de conjugados de anticuerpos dorados se conoce por ejemplo a partir de Roth, J. El sistema de marcado de oro coloidal ligero y en citoquímica microscópica del electrón, en Bullok, G.R. y Petrusz, P-Eds. Techinique in Immunocytochemistry, vol. 2, New York, Academic Press, 1983, p. 216-284.
La pareja marcada 1 del par de enlaces específicos puede localizarse a diferentes sitios del elemento analítico de conformidad con la invención. Esto depende por ejemplo del procedimiento de reacción intentado, de la cantidad de la muestra disponible o depende de la concentración analítica si el elemento analítico es para la determinación de muestras líquidas.
Además, la pareja marcada 1 del par de enlaces específicos 2 puede localizarse en la muestra de la zona de aplicación, puede colocarse descendente de la zona de aplicación de la muestra entre la zona de aplicación de la muestra y la zona de detección o puede también ser localizada descendente de la zona de aplicación de la muestra. Un pre-requisito de la menos el último caso es que el elemento analítico de conformidad con la invención tiene una zona de aplicación del agente de elución además de la zona de aplicación de la muestra. Tal zona de aplicación del agente de elución es entonces localizada descendentemente de la región en donde la pareja marcada 1 del par de enlaces específicos 2 se localiza o esta región donde la pareja marcada 1 del par de enlaces específicos 2 está presente es idéntica con la zona de aplicación del agente de elución. Por lo tanto, se puede presentar una zona de aplicación del agente de elución descendente de la zona de aplicación de la muestra o el sitio de la zona de aplicación de la muestra en el elemento analítico de conformidad con la invención. Tal zona de aplicación del agente de elución está entonces siempre provista independiente de donde se localiza la pareja marcada 1 del par de enlaces específicos 2 cuando la muestra a ser examinada no es líquida o no representa suficiente líquido para la determinación del analito es decir, para el transporte del analito y los reactivos que se requieren en la zona de detección.
Se describe arriba una estructura de un elemento analítico de conformidad con la invención, universalmente adecuada para la determinación de cualquier analito el cual pueda ser detectado por enlaces pares específicos. Para esto, se pone en contacto una substancia derivada de allí y que representa al analito el cual comprende la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 y la pareja 2 de un par de enlaces específicos 2, con la pareja marcada 1 de un par de enlaces específicos 2 en un elemento analítico de conformidad con la invención, se mueve por el transporte del líquido en el elemento analítico hacia la zona de detección la cual se localiza descendente de la zona de aplicación de la muestra, se enlaza en a zona de detección a la pareja 1 del par de enlaces específicos 1 y se determina en base del marcador de la pareja 1 de par de enlaces específicos 2. Para esta determinación es particularmente ventajoso cuando los componentes de la reacción móvil que no son inmovilizados en la zona de detección, son eliminados a partir de la zona de detección por el líquido. Si en el caso de una muestra de líquido, el líquido muestra no es suficiente para eliminar el móvil, el componente de la reacción no se inmoviliza a partir de la zona de detección, se puede aplicar líquido adicional al elemento analítico en este caso esta aplicación puede ser en la zona de aplicación de la muestra o en una zona de aplicación del agente de elución.
La substancia que representa el analito puede ser producida de diferentes formas. En el caso de un antígeno como el analito, es posible por ejemplo hacer reaccionar el analito con dos anticuerpos los cuales enlazan al analito. En este caso una de las dos parejas 2 porta el anticuerpo del par de enlace específico 1 y las otras parejas 2 portan el anticuerpo del par de enlaces específicos 2. Si en análisis por ejemplo, contiene varias copias de una epitope particular es posible que los dos anticuerpos sean idénticos. De conformidad con la invención no es absolutamente necesario que la mezcla del analito, el anticuerpo con la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 y el anticuerpo con la pareja 2 del par de enlaces específicos no se pongan en contacto con la pareja 1 del par de enlaces específicos 2 en el elemento analítico de conformidad con la invención hasta que el complejo intercale los dos anticuerpos y el analito se haya formado completamente. Últimamente es importante que la zona de detección contenga un enlace del complejo intercalado en la-pareja 1 del par de enlaces específicos al mismo tiempo de la determinación del resultado analítico. Esta formación intercalada puede ampliamente completarse cuando la mezcla del analito y los dos anticuerpos intercalados formados se apliquen al elemento analítico de conformidad con la invención, pueden sin embargo, también aún llevarse a cabo durante el transporte líquido del reactivo entre la zona de detección y la zona de aplicación. En el caso extremo la terminación de la reacción intercalada toma lugar en la zona de detección. El término "substancia derivada de allí y que representa el analito" por lo tanto, también incluye una mezcla de componentes que producen una substancia provista de estos componentes que resulta en la substancia derivada a partir de allí y que representa el analito en la zona de detección.
Si se determina un anticuerpo como un analito, los antígenos o oligopéptidos que representan el antígeno epitope pueden ser usados como el analito por ejemplo de los dos anticuerpos en analogía como la reacción previamente descrita en el caso parte de la molécula de antígeno porta la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 y la otra parte de la molécula del antígeno porta la pareja 2 del par de enlaces específicos 2. Para la determinación un complejo intercalado de doble antígeno del anticuerpo a ser determinado y cualquier caso un antígeno con la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 y un antígeno con la pareja 2 del par de enlaces específicos 2 se forma por la previa descripción para la determinación del antígeno análogamente aplicado.
La estructura de la propuesta general del elemento analítico de conformidad con la invención es también extremadamente adecuada para la determinación de los ácidos nucleicos. Para esto el ácido nucleico a ser determinado podrá frecuentemente amplificarse a fin de tener cantidades adecuadas disponibles para una detección. Este caso por ejemplo se realizará por medio de la reacción de cadena polimerasa (PCR) o reacción de cadena ligasa (LCR) conocida por un experto en la técnica. En el caso de ana amplificación por medio del PCR, en el cual, se inicia con un oliogonucleósido que es usado como iniciador, los nucleotidos se unen a un ácido nucleico que es complementan al ácido nucleico a ser determinado y unido al iniciador, la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 o la pareja 2 del par de enlaces específicos 2 pueden por ejemplo incorporarse en la copia del en lace de ácido nucleico para tal nucleotido o un iniciador. Si la amplificación del producto obtenido de esta manera es hibrizado con ácido nucleico el cual porta la pareja 2 del par enlazante, en el cual el ácido nucleico amplificado complementaria mente no tiene, una sustancia derivada de allí y que representa el analito adecuado que se fija a la pareja inmovilizada 1 del par de enlaces específicos 1 en la zona de detección en el elemento analítico de conformidad con la invención y ha sido determinada por la pareja marcada del par de enlaces específicos 2.
Además, es posible omitir la amplificación si las cantidades adecuadas de ácido nucleico están disponibles o realizan la amplificación del ácido nucleico sin la pareja 2 de los pares de enlaces específicos 1 y 2. Subsecuentemente, la substancia que representa el analito se produce por hibridación de las dos pruebas en las cuales en cada caso la pareja 2 transporta el par de enlaces específicos 1 y la pareja 2 del par de enlaces específicos 2.
Particularmente preferible un nucleotido realiza la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 o pareja 2 del par de enlaces específicos 2 mezclados con nucleótidos no marcados se usan para amplificar un ácido nucleico a determinarse y el ácido nucleico amplificado transporta la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 o pareja 2 del par de enlaces específicos se hibridiza con un ácido nucleico el cual porta la pareja 2 de manera que el par de enlaces específicos no se presenta en la mezcla nucleótida usada para la amplificación. Además, un ácido nucleico de doble ' hebra se obtiene en el cual cada hebra porta diferentes parejas de pares de enlaces específicos. Por ejemplo, un nucleótido portador de la pareja 2 del par de enlaces específicos o la pareja 2 del par 2 de enlaces específicos, es también posible para usar un oligonucleótido que porte justo estas parejas como un iniciador junto con nucleótidos no marcados. Se usa particularmente preferible la biotina como la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 y un hapteno tal como la fluoresceina, rodamina, digoxina o digoxigenina preferiblemente completa se usan como la pareja 2 del par de enlaces específicos 2. Cuando se usan los iniciadores, estos se han comprobado ser particularmente ventajosos los cuales son bioadelgazados . Puesto que los nucleótidos y los iniciadores están comercialmente disponibles o los kits se disponen para permiten la preparación de tales substancias similares al ácido nucleico o fragmentos de ácido nucleico que transportan haptenos tales como la fluoresceína, rodamina, digoxina o especialmente la digoxigenina, un experto en la técnica puede muy fácilmente obtener substancias derivadas de allí, y que representa los ácidos nucleicos a ser determinados especialmente para los propósitos de búsqueda y rápidamente y simplemente detectados por medio del elemento analítico de conformidad con la invención. Es posible por supuesto, proporcionar un kit para la determinación del analito (substancia que se va a analizar o a detectar) el cual no contiene solamente el elemento analítico de propósito general de conformidad con la invención sino también la pareja 2 del par 1 del enlace específico o la pareja 2 del par 2 de enlace específico o ambas parejas. Estas parejas están por ejemplo conjugadas a nucleótido, oligonucleótidos, un ácido nucleico, un anticuerpo, un hapteno o un antígeno o un epitope o a una lectina o a un receptor para un ligando. Estas substancias tienen el significado que se ha aclarado previamente. Además es posible proporcionar un individuo interesado con componentes o todos los reactivos adicionales necesarios para la determinación de un analito (substancia que se va a analizar o a detectar) además del elemento analítico de propósito general. En esta conexión no es tan importante mientras la pareja 2 del par 1 de enlace específico y la pareja 2 del par de enlaces específicos se presenten en contenedores separados o juntos en un contenedor. Esto aplica particularmente a tales sistemas en los cuales el analito (substancia que se va a analizar o a detectar) a ser determinado se detecta por medio de dos anticuerpos o por medio de antígenos vía un complejo sandwich (o intercalado) . Se intenta armar un kit para la determinación de un ácido nucleico, es ventajoso que los nucleótidos o iniciadores transporten la pareja 2 dei par 1 de enlaces específicos o las parejas 2 del par 2 de enlace específico se almacenan separadamente a partir de un ácido nucleico complementario al ácido nucleico a determinarse los cuales transportan las parejas 2 del par de enlace específico el cual es diferente de la pareja la cual se conjuga con el nucleótido o con el iniciador.
El elemento analítico de propósito general descrito de conformidad con la invención, es particularmente ventajoso para determinaciones de analitos (substancia que se va a analizar o a detectar) en la búsqueda y desarrollo en donde el analito (substancia que se va a analizar o a detectar) puede ser muy diferente. El elemento analítico de conformidad con la invención puede ser usado particularmente de manera especial en forma ventajosa para la determinación de ácidos nucleicos. Una amplia variedad de nucleótidos y oligonucleótidos los cuales son conjugados con la pareja 2 de un par 1 de enlaces específicos o pareja 2 de un par 2 de enlaces específicos están comercialmente disponibles. Los mismo también aplican a las pruebas de ácido nucleico que transportan la pareja 2 de un par 1 de enlace específico o parejas 2 de un par 2 de enlace específico el cual puede ser fácilmente preparado con kits comercialmente disponibles. En particular las pruebas de ácido nucleico transportan biotina y/o digoxina o digoxigenina pueden ser fácilmente obtenidos de esta manera.
La estructura de propósito general del elemento analítico de conformidad con la invención es también ventajosa porque la pareja de enlace marcada usualmente representa un componente crítico en ensayos inmunes con parejas de enlace marcados del analito (substancia que se va a analizar o a detectar) . Previamente es común practicar para preparar una pareja de enlace marcada correspondientemente dependiendo del analito (substancia que se va a analizar o a detectar) por el que las condiciones óptimas para la reacción y almacenamiento tienen entonces que ser creadas en el elemento analítico. En el pasado esto requería una gran cantidad de trabajo. El elemento analítico de conformidad con la invención proporciona ahora un elemento el cual puede ser usado universalmente. Los reacitvos específicos pueden ser preparados a cortas noticias y a bajos costos como reactivos líquidos. El trabajo de optimización no es necesario especialmente con respecto a la vida media de tales reactivos en los elementos analíticos.
Además, esto es, sin embargo, también posible, si esto se desea, no solamente usar el elemento analítico de conformidad con la invención como un elemento analítico universal junto con los reactivos específicos como reactivos líquidos sino también producen un elemento analítico iniciador con el elemento analítico de conformidad con la invención el cual contiene la totalidad requerida de todos los reactivos para la detección específica de un analito (substancia que se va a analizar o a detectar) . Así, para una prueba de antígeno por medio de la formación de un complejo sandwich los anticuerpos requeridos pueden estar presentes integrados en un elemento analítico de conformidad con la invención proporcionando un conjugado con la pareja 2 de un par 1 de enlace específico y el otro es conjugado con la pareja 2 de un par 2 de enlace específico. El mismo también aplica a un elemento analítico de conformidad con la invención el cual se pretende para la detección de un anticuerpo por medio de la formación de un complejo sandwich ( o de intercalado) . En este caso, una parte del antígeno requerido se presenta integrada en el elemento analítico conjugado con la pareja 2 de un par 1 de enlace específico y la otra parte del antígeno está conjugada con la pareja 2 de un par 2 de enlace específico. Tales conjugados pueden ser colocados o dispuestos en una zona común o en zonas del elemento analítico de conformidad con la invención en los cuales están adyacentes unos de otros, en la parte superior de otro o siguiendo uno a otro. En este caso los dos conjugados pueden estar acomodados en la zona de aplicación de la muestra o uno de los conjugados puede ser acomodado en la zona de aplicación de la muestra y el otro en la zona entre la zona de aplicación de la muestra y la zona de detección o ambos conjugados pueden ser acomodados separadamente o juntos en una zona entre la zona de aplicación de la muestra y la zona de detección. Si una zona de agente de elución se coloca descendentemente de la zona de aplicación de la muestra, es también posible, además a las posibilidades previamente descritas, que los antígenos o anticuerpos transportan la pareja 2 de los pares 1 y 2 de enlace específico son dispuestas separadamente o juntas entre la zona del agente de elución y la zona de aplicación de la muestra. Tales elementos analíticos contienen todos los reactivos necesarios para la determinación de un analito (sustancia que se va a analizar o a detectar) tiene las ventajas de la estructura simple y universal de conformidad con la invención y son extremadamente simples para manipular por el usuario puesto que solamente una muestra tiene que ser aplicada pero de otro modo no son necesarias etapas de manipulación adicionales antes el resultado es la lectura en la zona de detección.
Un elemento analítico de conformidad con la invención puede también ser usado para determinar al menos uno de varios analitos (substancia que se va analizar o a determinar) . Por ejemplo, cuando las muestras son actualmente examinadas por una infección de VIH es necesario determinar si uno o varios tipos de anticuerpos es decir, anticuerpos contra HIV 1, contra HIV 2 o contra HIV 1 subtipo 0 están presentes, La presencia de un anticuerpo contra un tipo es suficiente para valorar una muestra como positiva. Contra en el cual el tipo de anticuerpos encontrados exactos dirigido es solamente de importancia secundaria al menos en los métodos de pantallas. Un elemento analítico de conformidad con la invención el cual es adecuado para tal una determinación contiene en cada caso un par del antígeno conjugado contra cada anticuerpo por el cual una muestra es examinada. Cada par contiene antígeno conjugado con la pareja 2 del para 1 del enlace específico y el antígeno conjugado con la pareja 2 del par 2 de enlace específico en el caso el antígeno enlaza específicamente a un tipo de anticuerpo particular. Los conjugados de antígeno pueden en cada caso estar presentes de manera separada. Esto es sin embargo, también posible mezclar todos los conjugado de antígeno y acomodarlos juntos en una zona. Las explicaciones generales previas para los conjugados de los antígenos o anticuerpos con las parejas 2 de los pares 1 y 2 de enlaces específicos aplica a la localización de tales conjugados en un elemento analítico de conformidad con la invención.
Un elemento analítico análogo para la determinación de la influenza puede detectar la presencia del virus de la influenza A y/o virus de la influenza B.
Los conjugados de los anticuerpos contra los virus de la influenza A con la pareja 2 de los pares 1 y 2 de enlaces específicos así también como los conjugados de los anticuerpos contra los virus de la influenza B con las parejas 2 de los pares 1 y 2 de enlaces específicos se usan para esto. Si al menos uno de los dos tipos de virus presentan el elemento analito (substancia que se va a detectar- o analizar) de conformidad con la invención muestra un resultado positivo en la zona de detección.
Además, es también posible que un elemento analítico de conformidad con la invención contiene zonas funcionales adicionales. Por ejemplo se ha probado ser ventajoso para la examinación de sangre completa para proporcionar una zona en el elemento analítico de conformidad con la invención en el plasma o el suero se separa como un líquido claro a partir de células de sangre y sangre completa son retenidas . Solamente el líquido claro es entonces transportado en la zona de detección. Los vellocinos o lanas de fibra de vidrio como se describe en la Patente EP-A-O 045 476 son por ejemplo adecuados para la preparación del plasma o suero a partir de la sangre completa. Tal medio es adecuado para la separación del plasma o suero a partir de la sangre completa puede por ejemplo localizarse en la zona de aplicación de la muestra o entre la zona de aplicación de la muestra y la zona de detección.
La estructura de propósito general del elemento analítico de conformidad con la invención, proporciona una base la cual simplifica en gran manera el desarrollo de elementos analíticos los cuales transportan todos los reactivos para la detección de uno o varios analitos (substancia que se va a analizar o a detectar) comparado con el trabajo desarrollado previamente requeridos y por lo tanto se pueden acortar los tiempos de desarrollo.
Dos elementos analíticos particularmente preferidos de conformidad con la invención se muestran en la Figura 1 y 2.
Figura 1. Muestra un elemento analítico de propósito general de conformidad con la invención el cual contiene una hoja transportadora (6), una zona de aplicación del agente de elución (4), una zona que contiene una pareja 1 marcada del par 2 del enlace específico (3) , una zona de aplicación de la muestra (1) , una zona de detección (2) con una línea de detección sin color (7) que contiene una pareja 1 inmovilizada del par 1 de enlace específico y una línea de control sin color (8) que contiene un anticuerpo contra la pareja 1 del par 2 de enlace específico, así también una zona de colección del líquido (5) . Las zonas son colocadas siguiendo unas a otras esencialmente en un plano en la hoja transportadora (69 en la cual "siguiendo uno a otro" en este caso incluye un ligero traslape en cualquier lado de la zona previa en la dirección del transporte líquido con la zona siguiente de manera que se asegura transferir el líquido a partir de una zona a la otra.
El elemento analítico de conformidad con la invención el cual se muestra en la Figura 2, es un elemento analítico integrado es decir, tiene todos los reactivos requeridos para transportar una determinación del analito (substancia que se va a analizar o a detectar) . Es también adecuado para la determinación de la sangre completa. Colocados siguiendo unos a otros en una hoja transportadora (6) están una zona de aplicación de la muestra (1), una zona que contiene las parejas 2 de los pares de enlaces específicos 1 y 2 (9), una zona que contiene la pareja 1 marcada del par de enlace específico 2 (3) , una zona de separación del plasma o suero (10), una zona de detección (2) con una línea de detección sin color (7) que contiene la pareja inmovilizada 1 del par 1 del enlace específico y una línea de control sin color (8) la cual contiene una pareja 1 contra el anticuerpo del par 2 de enlace específico. Así también como una zona de colección del líquido (5) .
La invención es elucidada adicionalmente por los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 1 Determinación del ácido nucleico
A) Elemento analítico Se elaboró una tira de prueba de conformidad con la Figura 1 se preparó. Los siguientes se unieron siguiendo uno a otro y ligeramente traslapados a 5 mm de amplitud y 10 cm de longitud de la hoja de transporte (6) elaborado de poliester (Melinex®, 350 µm de espesor a partir de Industriáis Químicas Imperial, Gran Bretaña) usando un adhesivo de mezcla caliente (Dynapol®S 1358 a partir de Hüls AG, Alemania) . un vellocino o lana de 1.5 mm de espesor y 1.5 cm de longitud compuesto de 100 partes de fibras de vidrio
(diámetro 0.49 a 0.58 µm, de longitud 1000 um, ) y 5 partes de fibras de alcohol de polivinilo (Kuralon®VPB 105-2 de
Kuraray) con un área de peso de 180/m2 como la zona de colección del líquido (5), una membrana de nitrato celulosa de 1.5 cm de longitud (tipo CN 11301 de Sartorius, Alemania) como la zona de detección (2) , un vellocino o lana de 8 m de longitud que contiene 80 partes de fibras de poliéster, 20 partes de lana artificial y 20 partes de alcohol polivinílico con un espesor de 0.32 mm y un área de peso de 80 g/m2, la manufactura del cual se describe en el Ejemplo 1 del documento de Patente Europea 0 326 135 como la zona de aplicación de la muestra (1) , un vellocino o lana de 8 mm de longitud compuesto de 80 partes de fibras de poliéster, 20 partes de lana artificial y 20 partes de fibras de alcohol polivinilico con un espesor de 0.32 mm y un área de peso de 80 g/m2, la manufactura del cual se describe en el ejemplo 1 del documento de la Patente Europea 0 326 135 que contiene el conjugado dorado como la zona con la pareja marcada del par de enlaces específicos 2 (3) y un vellocino o lana de 30 mm de longitud (tipo Binzer TI 05 de Binzer, Alemania) como la zona de aplicación del agente de elución (4)
Respecto a la zona de detección (2) : Una solución de estreptavidina acuosa (7 mg/ml) se aplicó por línea dosificada a la membrana de nitrato celulosa descrita previamente. Para este propósito la dosificación se selecciona de manera tal que una línea con una amplitud de aproximadamente 0.5 mm se forme. La línea (7) sirve para detectar un analito (substancia a ser analizada o detectada) a ser determinado. La membrana es subsecuentemente secada en aire.
Una solución acuosa de un anticuerpo policlonal de conejo IgG contra IgG de ratón (fuente: DAKO Diagnóstica GmbH; Hamburgo, Alemania) (0.5 mg/ml) se aplicó por una línea de dosificación a una distancia de aproximadamente 4mm a partir de la línea de estreptavidina. También en este caso la dosificación se selecciona de manera que una línea con una amplitud de aproximadamente 0.5 se forme. Esta línea (8) sirve como un control de la función de la tira de prueba. La membrana es subsecuentemente secada en aire.
Respecto al vellocino o lana conjugada dorado (3) - el coloide dorado con un diámetro de partícula promedio de aproximadamente 40 nm se preparó de conformidad con el método de Frens (Frens, G., Preparación de dispersiones doradas de tamaño de partículas variantes: nucleación controlada para la regulación del tamaño de partícula en las suspensiones doradas monodispersas en Nature: Physical Science 241 (1973), 20-22) por la reducción de un 0.01 por ciento de peso de la solución de tetracoroáurica con citrato trisódico mientras se someta a calentamiento .
el anticuerpo conjugado se preparó de conformidad con el Método de Roth J. El sistema marcador de oro coloidal para la citoquímica microscópica de haz y electrón en Bullock, G.R. y Petrusz, P., eds., Techniques in Immunocytochemistry, vol. 2, New York, Academic Press, 1983, 216-284.
Después del enfriamiento la solución dorada descrita previamente a temperatura ambiente, el valor de pH del coloide dorado se ajustó con 0.2 M de K2C03 de manera que fuera aproximadamente 0.5 a 1.0 unidad de pH arriba del punto isoeléctrico del anticuerpo. La densidad óptica (OD) del coloide dorado (absorbencia a 525 nm y 1 cm vía haz) fue típicamente 1.0. Una solución dializada de un anticuerpo IgG monoclonal contra digoxigenina (MAB (digoxigenina) IgG) (fuente Boehringer Mannheim GmbH, Alemania) se agregó a la solución dorada. La cantidad de la solución del anticuerpo se seleccionó de manera tal que su concentración en la solución dorada fue típicamente 2 µg/ml. Después de' 30 minutos de agitación a temperatura ambiente el conjugado de oro se saturó por la adición de una solución de albúmina de suero bovino altamente concentrado (concentración de la solución en la solución del conjugado: 1 mg/ml) .
El conjugado dorado se concentró por la ultrafiltración contra 20 mM de amortiguador Tris a pH 8.0 a una densidad óptica de típicamente 20. La solución conjugada subsecuentemente se mezcló con una concentración final de 100 µm Brij® y 0.05 % en peso de NaN3.
El conjugado dorado preparado de esta manera
(densidad óptica, OD = 20) se ajustó con una impregnación de amortiguador a una proporción de volumen 1:1 a una densidad óptica, OD = 10. La impregnación del amortiguador contenía los siguientes componentes:
1% en peso de sucrosa 200 mM de HEPES 100 mM NaCl 140 mM urea 6 mM N-acetilcisteína 2 mM de EDTA 0.1% por peso de Tween®20
El alcohol de polivinilo de lana artificial de poliéster mezclado el vellocino se pulió a una velocidad constante primeramente a través de un tanque que contiene la solución de impregnación, subsecuentemente sacudido entre dos rodillos de acero inoxidable separados a una distancia de 250 µm y subsecuentemente secado por medio de un secador de aire circulatorio. Bajo las condiciones descritas la impregnación actual del vellocino es típicamente aproximadamente 270 ml/m2.
b) Determinación de un producto de amplificación de Chlamydia trachomatis.
Un fragmento del plasmidio críptico (7.5 Kb) de la Chlamydia tachomatis con 143 pares base de amplificó. Para esto los iniciadores del iniciador de Chlamydia trachomatis y el set de prueba de captura (Boehringer Mannheim, Alemania) fueron usados (iniciador l:20-mer, posición 274-295; iniciador 2: 24-mer, posición 393-416 rev).
La marcación se realizó con DGlI-dUTP (DIG stands para la digoxigenina) y 5' prueba de captura bioadelgazada (Boehringer Mannheim GmbH, Alemania) .
La mezcla principal PCR que contiene 2.5 U Tag polimerasa, 10 µl 10-fold de amortiguador OCR incluye 25 mm de cloruro de magnesio, 0.2 µ molar de ambos iniciadores, 0.1 molar de cada desoxinucleotido y 0.02 mmolar DGI-11-Dutp. Este resulta en una marcación estoiquiométrica de 1:5 DGI-11-dUTP para los desoxinucelotidos. La mezcla se relleno hasta 100 µl por la adición en pipeta de 10 µl de una solución 1 cual contiene aproximadamente 100 copias/µl de fragmentos del plasmidio críptico y agua destilada. La mezcla se mezcló por 10 minutos a 94 °C y através de 35 ciclos en los cuales cada vez se mantuvo por 40 segundos a 94 °C, 30 segundos a 52 °C y 45 segundos a 72 °C. El producto PCR se verificó en un gel de agarosa al 2.5% el cual se tino con bromuro de etidio.
Para la hibridación 1 µl de un 5' de prueba de captura biotina marcado (posición 354 - 374) se agregó a una concentración de 30 µmolar a 50 µl del producto de amplificación. La prueba de captura marcada fue presente además a una concentración de 0.6 µmolar. La muestra fue mezclada subsecuentemente por 5 minutos a 95°C y subsecuentemente hibrizada por 15 minutos a 3°C.
A fin de determinar el ácido nucleico en la tira de prueba descrita previamente de conformidad con la Figura 1, 5 µl del producto de hibridación se aplicaron a la zona de aplicación de la muestra (1). Posteriormente la zona de aplicación del agente de elución (4) de la tira de prueba se sumergió por 5 segundos en un amortiguador de cromatografía mientras podían ser cuidadosamente tomados de la zona (3) que contiene el conjugado dorado no está inmerso en el líquido. El amortiguador de cromatografía tiene la siguiente composición: 0.9% en peso de cloruro de sodio, 50 mM de fosfato de potasio, 0.09% en peso de azida de sodio, 2% en peso de albúmina de plasma de bovino y 0.25% en peso de Tween 20.
Después de 10 minutos el amortiguador de cromatografía ha migrado de la zona de aplicación del agente de elución
(4) en la zona de colección del líquido (5) . 2 líneas rojas eran claramente visibles en la zona de detección (2), mientras la línea roja de detección (que contiene estreptavidina) indica un resultado positivo y la línea de control roja (contiene PAB (RATÓN Fcy) indica la función correcta del elemento analítico.
EJEMPLO 2 Detección de los virus A/B de la influenza
a) Elemento analítico Se preparó una tira de prueba de conformidad con la figura 1. Todos los componentes del elemento analítico corresponden al elemento analítico descrito en el ejemplo 1 para la determinación de ácido nucleico.
b) Inmunoreactivos de la influenza específicos Los anticuerpos para la detección de la nucleoproteína de los virus de la influenza A y de la influenza B se obtuvieron a partir de Fitzgerald Industries Int., Concord, Massachusetts, USA.
A fin de preparar un anticuerpo monoclonal de bio marcado de ratón IgG contra la nucleoporteína de la influenza A, un deirvado de éster de succinimida de la biotina se agregó en un exceso molar de 6-fol a una solución de un anticuerpo 20 mg/ml en 0.1 M de fosfato de potasio a pH 8.5. La mezcla se incubó por 90 minutos a 2.5°C mientras se agitaba. La reacción se detuvo por el complemento de la solución con la lisina para una concentración final de 10 mm. El reactivo de bioadelgazamiento en exceso se eliminó por diálisis y la solución se refrigeró.
Un anticuerpo monoclonal bioadelgazado contra la nucleoptroteína de la influenza B se preparó de una manera similar.
- Para la preparación de un anticuerpo monoclonal digoxigneilado contra la nucleoproteína de la influenza A de disolvió un derivado de succinimida de éster de digoxigenina en dimeltil sulfóxido (DMSO) se agregó en un exceso molar de 4 - pliegues a una solución de 10 mg/ml del anticuerpo monoclonal en 0.1 M de fosfato de potasio de manera tal que la concentración final del DMSO en la solución fue de 5% de volumen. La mezcla se incubó por 30 minutos a 25°C mientras se agitaba. La reacción se detuvo por la adición de una solución de lisina acuosa 1 molar de manera que la concentración final de lisina fue de 10 mM. El exceso del reactivo de digoxigenilación se eliminó por diálisis contra un amortiguador de fosfato de potasio 20 mM a pH 8.0 y la solución se enfrió hasta su uso.
Un anticuerpo monoclonal contra la nucleoproteína de la influenza B se preparó similarmente a la dexosigenilación previamente descrito del anticuepro monoclonal contra la nucleoproteína de la influenza A.
Los anticuerpos de la influenza A y la influenza B usados son de tipo específico, es decir, el anticuerpo de la influenza A solamente reconoce la nucleoproteína del virus de la Influenza A mientras el anticuerpo monoclonal de la influenza B solamente reconoce la nucleoproteína del virus de la influenza B. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales no son subtipos específicos, es decir, el anticuerpo monoclonal contra la influenza A reconoce todos los subtipos de la influenza A.
c) Determinación de los virus de la influenza A y/o los virus de la influencia B. Se usaron los sobrenadantes del cultivo de los virus diluidos como un material muestra para demostrar la sensitividad del elemento analítico de conformidad con la invención. Los virus de cultivaron en células MDCK, una cepa permanente de célula de riñon de perro. La incubación se realizó en el medio de cultivo usual por aproximadamente 7 días a 33 °C el subtipo N3N2 (EBR Beijin 32/92) se cultivó como un representativo de la influenza A y la hebra B/harbin 7/94 se cultivaron como un representativo de la influenza B. Los sobrenadantes del cultivo se diluyeron con el medio de cultivo en etapas de dos pliegues.
El del cultivo del sobrenadante a partir de cada dilución diferente, 15 µl de amortiguador lisis (6% Zwittergent ®3-10 en una solución salina fisiológica que contiene albúmina de suero de bovino) y en cada caso 5 µL de una solución de anticuerpo monoclonal bioadelgazada contra la influenza A y anticuerpo monoclonal digoxigenilado contra la influenza A se pipetearon en un recipiente Eppendorf para la detección de la influenza A o -5 µl de una solución de anticuerpo monoclonal bioadelgazado contra la influenza B y 5 µl de anticuerpo monolconal digoxigenilado contra la influenza B se pipeteron en un recipiente Eppendor (la concentración del anticuerpo conjugado de la soluciones stock fue en cada caso 20 µg/ml) . La muestra Usada fue brevemente homogeneizadas por sacudimiento y subsecuentemente 80 µl se pipetearon en el vellocino conjugado dorado (3) del anterior paso de conformidad con la figura 1. Subsecuentemente la zona de aplicación del agente de elución (4) de las tiras de pruebas se inmersaron por aproximadamente 5 segundos en un amortiguador de cromatografía (0.9% en peso de cloruro de sodio, 50 mM de fosfato de potasio, 0.09% en peso de azida de sodio, 2% en peso de albúmina de plasma de bovino y 0.25% en peso de
Tween® 20) . El resultado de la prueba en la zona de detección (2) se leyó después de 10 minutos.
Una línea de detección roja indicó un resultado positivo observado en el caso del sobrenadante del cultivo de la influenza A hasta una dilución del cultivo de 1:64. En el caso del sobrenadante del cultivo del virus de la influenza B las diluciones se reconocieron como positivas hasta el paso 1:128. En todos los casos el color rojo de la línea de control indicó la función correcta de la tira de prueba.
EJEMPLO 3 Detección de anticuerpos de VIH
a) Elemento analítico Se preparó una tira de prueba de conformidad con la figura 2. Después de unieron siguiendo uno a otra ligeramente traslapados a una amplitud de 4mm y 10 cm de longitud de la hoja de transporte (6) elaborada de poliéster (Melinex, 350 m de espesor de Imperial Chemistry Idustries, GranBretaña) usando adhesivos de mezcla caliente (Dynapol®S 1358 a partur de Hüls AG, Alemania) un vellocino o lana de espesor de 0.9 mm y 1.4 cm de longitud compuesto de 100 partes de fibra de vidrio
(diámetro 0,49 a 0,58 µm, longitud 1000 µm) y 5 partes de fibras de alcohol de polivinilo (Kuralon® VPB 105-2 de
Kuraray) con un área de peso de 100 g/m2 como la zona de colección del líquido (5) , una membrana de nitrato celulosa de 1.5 cm de longitud (tipo CN 11301 de Sartorius, Alemania) como la zona de detección (2) , un vellocino o lana de 1.2 mm de longitud que contiene 100 partes de fibras de poliéster, (diámetro 0.49 a 0.58 µm, longitud 100 µm) y 5 partes de fibras de alcohol polivinilico (Kuralon® VOB 105-2 de Kuraray) con un área de peso de 100 g/m2 el cual se impregna con BrijR (1% en peso) como una zona de separación del suero o plasma (10) un vellocino o lana de 12 mm de longitud que contiene 80 partes de fibras de poliéster, 20 partes de lana artificial y 20 partes de fibras de alcohol de polivinilo con un espesor de 0.32 mm y un área de peso de 80 g/m2, la manufactura del cual se describe en el ejemplo 1 del documento de la Patente Europea 0 326 135 que contiene el conjugado dorado como la zona que contiene la pareja marcada del par de enlaces específicos 2 (3) y un vellocino o lana de 12 mm de longitud que contiene 80 partes de fibras de poliéster, 20 partes de lana artificial y 20 partes de fibras de alcohol de polivinilo con un espesor de 0.32 mm y un área de peso de 80 g/m2, la manufactura del cual se describe en el ejemplo 1 del documento de la Patente Europea 0 326 135 que contiene los antígenoes digoxigenilados y bioadelgazados VIH como una zona que contiene las parejas 2 de los pares 1 y 2 del enlace específico 1 y 2 (9) y una tela de poliéster de 8 mm de longitud (PE 280 HC de Seidengaze Thai, Switzerland) impregnada con un agente humectante como la zona de aplicación de la muestra (1)
Referente a la zona de detección (2) Una solución acuosa de estrepatavidina (4mg/ml) se aplicó por línea de dosificación a la membrana de nitrado de celulosa descrita previamente. Para este propósito la dosificación se selecciono de manera que una línea con una amplitud de aproximadamente 0.4 mm se formo. Esta línea sirve para detectar los anticuerpos de VIH. La membrana es subsecuentemente secada en aire.
Una solución acuosa de un anticuerpo monoclonal de conejo IgG contra IgG de ratón (fuente: DALO Diagnostico GmbH, Hamburgi Akeania) (0.5 mg/ml se aplicó por la línea de dosificación a una distancia de aproximadamente 4mm de la línea de estreptavidina. También en este caso las dosificaciones se seleccionaron de manera que una línea con una amplitud de aproximadamente 0.4 mm de se formo. Esta línea () sirve como un control de la función de la tira de prueba. La membrana se secó en aire subsecuentemente.
Respecto al vellocino o lana conjugada dorada (3) : el coloide dorado con un diámetro promedio de partícula de aproximadamente 40 nm se preparó como se describe en el ejemplo Ia.
- el conjugado del anticuerpo dorado se preparó también como se describe en el ejemplo la.
El conjugado dorado preparado de esta manera
(densidad óptica, OD = 20) se ajustó con una impregnación de amortiguador a una densidad óptica, OD = 3. La impregnación del amortiguador contenía los siguientes componentes :
100 mM de HEPES 50 mM NaCl 0.5 % en peso de sucrosa 70 mM urea 3 mM N-acetilcisteína 1 mM de EDTA 0.1% por peso de Tween® 20
El alcohol de polivinilo de lana artificial de poliéster mezclado el vellocino se pulió a una velocidad constante primeramente a través de un tanque que contiene la solución de impregnación, subsecuentemente sacudido entre dos rodillos de acero inoxidable separados a una distancia de 250 µm y subsecuentemente secado por medio de un secador de aire circulatorio. Bajo las condiciones descritas la impregnación actual del vellocino o lana es típicamente aproximadamente 270 ml/m2.
Respecto al vellocino (9) que contiene los antígenoes de VIH digoxigenilados y bioadelgazados
La preparación de los péptidos digoxigenilados y los péptidos biotinilados de la región gp 41 del VOH se describen en el Ejemplo 1 de la Solicitud de Patente Internacional PCT/EO95/02921. Los péptidos respectivos se usaron en cada caso en forma de pares como derivados de digoxigenina y biotina. Sus concentraciones de mezclado en la slución de impregnación fueron entre 07.10-7 mol/1 y 3.10-7 mol/. Además de la solución de impregnación contenía
100 mM de amortiguador MES, ph 6.0 50 mM de NaCl 2% en peso de sucrosa 1% en peso de albúmina de suero bovino 3 mM de N-acetilcisteína 0.06% en peso de Tween® 20 1 mM de EDTA.
EL alcohol de polivinilo de la lana artificial de poliéster mezclado se impregno en esta solución de impregnación y se secó subsecuentemente por medio de un secador de aire recirculante. La impregnación actual es típicamente de aproximadamente 270 ml/m2.
b) Determinación de una infección VIH Aproximadamente 60 µl del volumen de la muestra (plasma o suero) se aplicó a la zona de aplicación de la muestra (1) de la tira de prueba descrita previamente de conformidad con la figura 2. Después de 15 minutos de tiempo de espera, la zona de detección (2) se evaluó visualmente. Una línea rojo violeta en la posición del la línea de control (8) indicó que la muestra no reaccionó (no se detecto infección VIH) . Las dos líneas rojo violetas, una en la posición de la línea de control (8) y una en la posición de la línea de detección (7) indican una muestra reactiva (infección de VIH detectable.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.
Claims (21)
- REIVINDICACIONES 1. Un elemento analítico para la determinación de un analito que contiene en o un material el cual permite el transporte del líquido entre zonas, una zona de aplicación de la muestra y una zona de detección localizada de manera descendente del mismo, caracterizado porque la zona de detección contiene una pareja 1 de un par de enlaces específicos 1 inmovilizados de manera tal que se permite enlazar a la pareja 2 del par 1 de enlaces específicos, en los cuales no está en analito cuando se ponen en contacto, en donde, una pareja 1 marcada de un par 2 de enlaces específicos se presenta descendentemente de la zona de detección y se impregna en un material de manera tal que puede ser desprendida por el líquido y permite enlazar a la pareja 2 del par 2 de enlaces específicos en los cuales no está el analito cunado se ponen en contacto.
- 2. Un elemento analítico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las parejas que están juntas de los pares de enlaces específicos se seleccionan a partir del grupo que consiste de hapteno y anticuerpo, antígeno y anicuerpo, lectina y azúcar, ligando y receptor, avidina/estreptavidina y biotina, ácido nucleico y ácido nucleico.
- 3. Un elemento analítico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la pareja 1 del par 2 de enlaces específicos es la avidina o estreptavidina.
- 4. Un elemento analítico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la pareja 1 del par 2 de enlace especifico es un anticuerpo contra la pareja 2 del par 2 de enlace especifico.
- 5. Un elemento analítico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la pareja 1 del par de enlaces específicos 2 es un anticuerpo contra la digoxigenina o digoxina.
- 6. Un elemento analítico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que la pareja 1 del para 2 de enlace especifico está marcada con una enzima o un marcado directo .
- 7. Un elemento analítico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se usan partículas de metal o látex como el marcado directo.
- 8. Un elemento analítico de conformidad con una de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la pareja 1 marcada del par 2 del enlace específico se localiza en una zona descendente de la zona de aplicación de la muestra si una zona de aplicación del agente de elución está también localizada de manera descendente de la zona que contiene esta pareja marcada o la zona que contiene la pareja marcada es también una zona de aplicación del agente de elución.
- 9. Un elemento analítico de conformidad con una de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la pareja marcada 1 del par 2 de enlace especifico se localiza en una zona descendente de la zona de aplicación de la muestra si una zona de aplicación del agente de elución se localiza descendentemente de la zona que contiene esta pareja marcada o la zona que contiene la pareja marcada es también una zona de aplicación del agente de elución.
- 10. Un elemento analítico de conformidad con una de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la zona de aplicación de la muestra es también una zona de aplicación del agente de elución.
- 11. Un elemento analítico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la pareja 1 marcada del par 2 del enlace especifico se localiza descendente de la zona de aplicación de la muestra y la zona de aplicación del agente de elución.
- 12. Un elemento analítico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la pareja marcada 1 del par de enlaces específicos 2 se localiza en la zona de aplicación de la muestra y la zona de aplicación del agente de elución.
- 13. Un elemento analítico de conformidad con una de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque adicionalmente contiene un conjugado de un anticuerpo contra un antígeno o hapteno para ser determinado con la pareja 2 del par de enlace específico 1 y un conjugado de anticuerpo contra el mismo antígeno o hapteno con la pareja 2 del par de enlace específico 2.
- 14. Un elemento analítico de conformidad con una de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque adicionalmente contiene un conjugado o antígeno, un hapteno o oligopéptido contra un anticuerpo a ser determinado con la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 y un conjugado de antígeno o hapteno o oligopétido contra el mismo anticuerpo a ser determinado con la pareja 2 del par de enlaces específicos 2.
- 15. Un método para la determinación de un analito por medio de pares de enlaces específicos, caracterizado porque, una sustancia derivada de allí y que representa el analito el cual comprende la pareja 2 de un par de enlaces específicos 1 y la pareja 2 de un par de enlaces específicos 2 se pone en contacto con la pareja marcada del par 2 de enlace específico en un elemento analítico para la determinación de un analito de conformidad con las reivindicaciones de patente 1-14, se mueve por el transporte líquido en el elemento analítico hacia la zona de detección que está localizada descendentemente de la zona de aplicación de la muestra, se enlaza en la zona de detección a la pareja 1 del par de enlaces específicos 1 y se determina en base al marcado de la pareja 1 del par de enlaces específicos 2.
- 16. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque los anticuerpos que enlazan al analito se agregan al analito en donde la parte del anticuerpo transporta la pareja 2 del par 1 del enlace específico y la otra parte del anticuerpo transporta la pareja 2 del par de enlaces específicos a fin de preparar la substancia derivada de allí y que representa al analito.
- 17. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque los antígenos, haptenos o oligopéptidos se agregan al analito en donde una parte de los antígenoos, haptenos o oligopeptidos transportan la pareja 2 del par 2 de enlace específico, a fin de preparar la substancia derivada de allí o que representa el analito.
- 18. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el analito es un ácido nucleico el cual está amplificado con la pareja 2 del par 1 de enlaces específicos o pareja 2 del par 2 de enlaces específicos enlazados a un nucleótido o a un oligonucleótido se incorporan en la copia del ácido nucleico y el producto de la amplificación es hibridizado con un ácido nucleico que transporta la pareja 2 del par de enlaces los cuales no han sido complementarios al ácido nucleico.
- 19. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el analito es un ácido nucleico el cual es hibrizado con una prueba de 2 ácidos nuecléicos los cuales contienen 2 parejas del par 1 de enlaces específicos y los otros contienen la pareja 2 del par de enlaces específicos del par 2 del enlace específico.
- 20. Un kit para la determinación de un analito que contiene un elemento analítico de conformidad con las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque al menos una pareja del grupo comprende las parejas 2 del par 1 de enlaces específicos y la pareja 2 del par 2 de enlaces específicos .
- 21. Un kit de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 y el par de enlaces específicos 2 del par de enlace específico 2 se almacenan juntos en un contenedor. 23. Un kit de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 20-22, caracterizada porque la pareja 2 del par de enlaces específicos 1 está conjugada a un nucleótido, oligonucleótido, un ácido nucleico, un anticuerpo, un hapteno o antígeno o un epitope que representa un antígeno o una lectina o un receptor para un ligando. 24. Un kit de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la pareja 2 del par 1 de enlaces específicos es la biotina. 25. Un kit de conformidad con una de las reivindicaciones 20-22, caracterizado porque la pareja 2 del par 2 de enlaces específicos está conjugada a un nucleótido, oligonucleótido, un ácido nucleico, un anticuerpo, un hapteno o un antígeno o un epitope que representa un antígeno o una lectina o un receptor para un ligando. 26. Un kit de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la pareja 2 del par de enlaces específicos 2 es un hapteno, preferiblemente digoxigenina o digoxina.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19757980.9 | 1997-12-24 | ||
| DE19816550.1 | 1998-04-15 |
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| MXPA98010799A true MXPA98010799A (es) | 2001-05-17 |
Family
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