MXPA98000757A - Derivados de amidas de los acidos isoxazolico y crotonico y su utilizacion como medicamentos y agentes de diagnostico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere:Un compuesto de la fórmula I (Ver Fórmula), representando R1 el radical de la fórmula IIóIII, (Ver fórmula);es apropiado para la preparación de un medicamento para el tratamiento de inflamaciones, enfermedades cancerosas o enfermedades autoinmunes. Un compuesto de la fórmula IV (Ver Fórmula) es apropiado para la preparación de anticuerpos específicos contra un compuesto de la fórmula I y para descubrir proteínas que se fijen específicamente a partir de extractos celulares, suero, sangre o líquidos sinoviales, para purificar proteínas, para modificar placas de microtitulación o para preparar un material para cromatografía, especialmente un material para cromatografía de afinidad, y para su empleo en agentes de diagnóstico.

Description

Derivados de amidas de los ácidos isoxazólico y crotónico y su utilización como medicamentos y agentes de diagnóstico El invento concierne a nuevos derivados de amidas de los ácidos isoxazólico y crotónico, a su preparación y a su utilización como medicamentos, así como a su utilización como antígeno para la producción de anticuerpos y a su aplicación en procedimientos de diagnóstico y purificación. Se conocen derivados de amidas de los ácidos isoxazólico y crotónico que tienen un efecto inhibidor de inflamaciones, inmunosupresor o antiproliferativo (documentos de patentes europeas EP 0.013.376; EP 0.217.206; EP 0.527.736). La determinación analítica de estos compuestos en sueros de animales y seres humanos es posible con ayuda de procedimien-tos cromatográficos habituales. La desventaja de estos procedimientos cromatográficos es un alto gasto en aparatos, etapas costosas de preparación de las muestras y un pequeño caudal de paso de las muestras. Los procedimientos inmunológicos de determinación y análisis constituyen una rápida y fiable alternativa respecto a los procedimientos cromatográficos . Para la realización de estos procedimientos alternativos es decisiva la obtención de anticuerpos apropiados. El invento tiene la finalidad d«a, poner a disposición, mediante modificación de derivados de amidas de los ácidos isoxazólico y crotónico, compuestos que sean apropiados para la obtención de anticuerpos, que se puedan acoplar con polímeros y «que sean empleables como trazadores en radioinmu-noensayos . Se descubrió que los compuestos de la fórmula I son apropiados para resolver esta misión, encontrándose en el anillo aromático de la parte de anilina uno o varios grupos funcionales que, como tales, se pueden acoplar a través de una función de espaciador covalentemente con polímeros. El invento concierne, por lo tanto, a compuestos de la fórmula I • y/o a una sal fisiológicamente compatible del compuesto de la fórmula I y/o a una forma eventualmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I, representando R1 el radical de la fórmula II ó III, OH CN y R a) -O- (CH2) n-CH=CH2, en «que n significa el número entero 1, 2 ó 3, b) -O- (CH2)m-CH2-halógeno, en que m significa el número entero 1, 2 ó 3 y halógeno significa flúor, cloro, bromo o yodo, c) el radical de la fórmula V H CH. (V) en que R3 significa l) halógeno ó 2) -NH2 y R4 significa 1) un átomo de hidrógeno 2) el radical de un aminoácido, d) -NH,. Se prefieren los compuestos de la fórmula I, que están caracterizados porque R1 representa el radical de la fórmula II ó III y R2 representa a) -O- (CH2) m-CH2-halógeno, en que m significa el número entero 2 y halógeno significa bromo o yodo, b) -O- (CH2)n-CH=CH2 ó O -NH-C(O) -CH(R3) (R4) , en que R3 significa bromo, -NH2 o cloro y R4 significa un átomo de hidrógeno. Se prefieren especialmente los compuestos de la fórmula I tales como (4-aliloxi-fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-but-2-eno-carboxílico, (4- (3 -yodo-propoxi) -fenil) -amida de ácido 2 -ciano-3-hidroxi-but- 2 -eno-carboxí1ico, (4- (2-amino-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-but-2 -eno-carboxílico, (4- (2-amino-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico, (4- (2-bromo-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-bu -2 -eno-carboxílico ó (4- (2-bromo-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico . El radical R2 en la fórmula I puede estar situado en el anillo de fenilo en la posición meta, orto o para con relación al grupo "NH", preferiblemente en la posición para. Los compuestos de la fórmula I pueden presentarse eventualmente en forma de isómeros ópticos, diastereoisómeros, racematos o como mezclas de los mismos. Por el concepto de "aminoácido" se entienden las formas estereoisómeras, p. ej . las formas D y L, de los siguientes compuestos: asparagina, valina, arginina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, triptófano, 0-alanina, lisina, prolina, glicina, ?-aminobutirato, Ne -acetil-lisina, Nd-acetil-ornitina, N?-acetil-diaminobutirato, Na-acetil-diaminobutira-to, histidina, isoleucina, leucinaT metionina, fenilalanina, serina, cisteína, treonina, alanina y tirosina. Se prefieren los L-aminoácidos . El resto de aminoácido Gly es especialmen-te preferido. Los restos de aminoácidos se derivan de los correspondiente aminoácidos . El modo abreviado de denominar los aminoácidos se efectúa según la nomenclatura generalmente habitual. El radical (R4) representa la cadena lateral del respectivo aminoácido. Apropiadas sales fisiológicamente compatibles del compuesto de la fórmula I son por ejemplo sales de metales alcalinos, alcalino-térreos y de amonio, inclusive las de bases orgánicas de amonio y sales de los restos de aminoácidos protonados . El invento concierne también a un procedimiento para la preparación del compuesto de la fórmula I y/o de una sal fisiológicamente compatible del compuesto de la fórmula I y/o de una forma eventualmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I, que está caracterizado porque a) se hace reaccionar un compuesto de la fórmula VI, representando R6 el radical OH, Cl ó Br, con un compuesto de la fórmula VII representando R7 1) -NH, 2)" -NH-C(O) -CH2-NH-grupo protector, en que el "grupo protector" es un grupo protector de amino, por ejemplo Boc, 3) -NH-C(O) -CH2-halógeno o 4) -OH para dar un compuesto de la fórmula I, en la que R1 representa el radical de la fórmula II y R2 representa -NH,, -NH-C (0) -CH2-NH-grupo protector, -OH o -NH-C(O) -CH, -halógeno, o b) se hace reaccionar un compuesto, preparado según el procedimiento a) , en el que R7 significa -OH, con un halogenuro de alquilo o con un dihalogenoalcano, en el que la parte de alquilo tiene 2, 3 ó 4 átomos de carbono, para dar un correspondiente compuesto de la fórmula I , o i c) se hace reaccionar un compuesto preparado según el procedimiento a) , en el que R7 significa -OH, con un halogenuro de alquilo insaturado, en el que la parte de alquilo tiene 3, 4 ó 5 átomos de carbono, para dar un correspondiente compuesto de la fórmula I, o d) se hace reaccionar un compuesto, preparado según el procedimiento a) , en el que R7 significa -NH2, con un halogenuro de ácido carboxílico, tal como bromuro de bromoacetilo, para dar un compuesto de la fórmula I, en la «que R2 representa el radical de la fórmula V, R3 significa halógeno y R4 significa un átomo de hidrógeno, o e) se hace reaccionar una diamina aromática, tal como p- fenilendiamina, con un aminoácido protegido en el grupo amino para dar un compuesto de la fórmula VII, en la «que R7 representa un radical de la fórmula V, R3 significa -NH2 y R4 significa un aminoácido protegido y, a continuación, se hace reaccionar como en el procedimiento a) para dar un correspondiente compuesto de la fórmula I, f) se elimina el grupo protector en un compuesto de la fórmula i, preparado según el procedimiento a) o e) , o g) se transforma un compuesto de la fórmula I, preparado según los procedimientos a) - f) , en «que R1 representa el radical de la fórmula- II, en un compuesto de la fórmula I, en el que R1 representa el radical de la fórmula III, o h) se aisla el compuesto de la fórmula I, preparado según los procedimientos a) - g) o bien en forma libre o, en el caso de la presencia de grupos ácidos o básicos, eventualmente en sales fisiológicamente compatibles. En la etapa a) del procedimiento se puede transformar por ejemplo un ácido isoxazol-4-carboxílico (R6 significa -OH) según procedimientos conocidos de la bibliografía, p. ej . mediante cloruro de tionilo u oxicloruro de fósforo, en el seno de un disolvente aprótico (p. ej . tolueno, tetrahidrofurano (THF) o un hidrocarburo clorado) en un cloruro de ácido y luego hacer reaccionar éste con una amina aromática, sustituida eventualmente de manera apropiada, mediando adición de una base orgánica, p. ej . con una amina terciaria (p. ej . trietilamina o N-etil-morfolina) , en el seno de un disolvente aprótico dipolar, por ejemplo THF o de un hidrocarburo clorado. Alternativamente, la formación de la amida se puede efectuar directamente a partir del ácido carboxílico mediando adición de un reactivo de condensación conocido de la «química de los péptidos, p. ej . diciclohexil-carbodiimida. La segunda variante se adecúa especialmente para aminas aromáticas «que tienen otros radicales de amina o alcohol. En las etapas b) o c) del procedimiento se funcionaliza adicionalmente el grupo hidroxi introducido a través de la parte de anilina, haciendo reaccionar ésta 1) con un halogenuro de alquilo o con un dihalogenoalcano, tal como 1, 3-diyodo-propano, mediando adición de una base orgánica o inorgánica, p. ej . carbonato de potasio, para dar un éster sustituido correspondientemente, pudiéndose evitar una dimerización en este último caso mediante un exceso correspondientemente grande del agente de alquilación o por utilización del mismo como disolvente, de tal manera que en el producto quede una función de halogenuro de alquilo para el acoplamiento ulterior del producto con una fase estacionaria, o 2) con un halogenuro de alquilo insaturado, p. ej . un halogenuro de alilo o propargilo, preferiblemente bromuro de alilo, en el seno de un disolvente aprótico dipolar, tal como tetrahidrofurano (THF) , acetona o hidrocarburos clorados en condiciones similares para dar un éter de alilo o propargilo, apareciendo, mediando utilización de acetona como disolvente y de carbonato de potasio como base, simultáneamente la apertura de anillo, descrita en g) , de la parte de isoxazol (el radical de la fórmula II) . En la etapa d) del procedimiento se hace reaccionar el grupo amino con un halogenuro de ácido carboxílico, p. ej . bromuro de bromoacetilo, mediando adición de una base orgánica, tal como una amina aromática terciaria (p. ej . trietilamina o N-etil-morfolina) en un disolvente aprótico dipolar, tal como THF o un hidrocarburo clorado. En la etapa e) del procedimiento, una diamina aromática, p. ej . p-fenilendiamina, se transforma con un aminoácido protegido en el grupo amino, p. ej . N-Boc-glicina, mediando empleo de un agente de condensación, p. ej . diciclohexil-carbodiimida, deliberadamente en la monoamida, luego se lleva a cabo la formación de la anuida tal como se describe en la etapa a) de procedimiento, y finalmente se elimina el grupo protector de amino acarreado, en condiciones clásicas conocidas de la química de los péptidos (etapa f) del procedimiento) . En la etapa g) del procedimiento, un compuesto preparado en a) - f) se somete a una apertura del anillo de la parte de isoxazol, inducida por una base, trabajándose preferiblemente en el seno de una mezcla de disolventes acuoso-orgánicos, por ejemplo, una de THF y agua o de etanol y agua, utilizando un exceso de una base orgánica o inorgánica, p. ej . NaOH, una solución de amoníaco o carbonato de potasio. Si los compuestos de la fórmula general I se presentan en formas diastereoisómeras o enantiómeras y al realizar la síntesis seleccionada resultan en forma de sus mezclas, la separación en los estereoisómeros puros se consigue, o bien por cromatografía en un material de soporte eventualmente quiral, o, si los compuestos racémicos de la fórmula I son capaces de formar sales, por cristalización fraccionada de las sales diastereoisómeras formadas con una base o un ácido, ópticamente activos, como sustancia auxiliar. De manera fundamentalmente igual, los compuestos racémicos de la fórmula I, que contienen un grupo básico tal como un grupo amino, se pueden transformar con ácidos ópticamente activos, tales como el ácido (+) -canfo-10-sulfónico, los ácidos D- y L-tartáricos, los ácidos D- y L-lácticos o los ácidos (+) y ( - ) -mandélicos , en los enantiómeros puros. El invento concierne también a medicamentos, caracteri-zados por un contenido eficaz de por lo menos un compuesto de la fórmula I y/o una forma estereoisómera del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente compatible del compuesto de la fórmula I, junto con materiales de vehículo, aditivos y/o sustancias activas y auxiliares, farmacéutica-mente apropiados y fisiológicamente compatibles. Los medicamentos conformes al invento se pueden administrar por las vías intravenosa, parenteral, tópica, rectal u oral. Los medicamentos conformes al invento se adecúan preferiblemente para la profilaxis y/o terapia de enfermeda-des cancerosas, inflamaciones y enfermedades autoinmunes . A éstas pertenecen por ejemplo enfermedades reumáticas, inflamaciones agudas y crónicas de músculos, articulaciones o del tracto gastro- intestinal, por ejemplo, enfermedades alérgicas de las vías respiratorias, psoriasis o enfermedades autoinmunes, p. ej . lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes de tipo II, miastenia grave, el síndrome de Sjógren, dermatomiositis, esclerodermia o esclerosis múltiple (EM) . A las enfermedades cancerosas pertenecen por ejemplo cáncer de pulmón, leucemia, el sarcoma de Kaposi, cáncer de ovarios, sarcomas, meningioma, cáncer intestinal, cáncer de los ganglios linfáticos, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de próstata o cáncer de la piel . El invento concierne también á un procedimiento para la preparación de un medicamento conforme al invento, que está caracterizado porque se lleva a una forma de presentación apropiada por lo menos un compuesto de la fórmula I con un vehículo farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente compatible y eventualmente otras sustancias activas, aditivas o auxiliares. Las formas de preparaciones galénicas sólidas o líqui-das, apropiadas, son por ejemplo granulados, polvos, grageas, tabletas, (micro) cápsulas, supositorios, jarabes, zumos, suspensiones, emulsiones, gotas o soluciones inyectables, así como preparados con liberación retardada de la sustancia activa, en cuya preparación encuentran utilización las sustancias auxiliares usuales, tales como sustancias de vehículo, agentes disgregantes, aglutinantes, de revestimiento, de hinchamiento, de deslizamiento o lubricantes, materiales saboreantes, edulcorantes y solubilizantes . Como sustancias auxiliares utilizadas frecuentemente se citarán p. ej . talco, almidón, carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manita y otros azúcares, albúmina láctea, gelatina, celulosa y sus derivados, aceites animales y vegetales tales como aceite de hígado de bacalao, aceite de girasol, cacahuete o sésamo, polietilenglicoles y disolventes, tales como por ejemplo' agua esterilizada y alcoholes mono- o plurivalentes, p. ej . glicerol . Preferiblemente, los preparados farmacéuticos se preparan y administran en unidades de dosificación, conteniendo cada unidad como componente activo una dosis determi-nada del compuesto de la fórmula I conforme al invento. En el caso de unidades de dosificación sólidas tales como tabletas, cápsulas, grageas o supositorios, esta dosis puede ser de - ?o -hasta aproximadamente 1.000 mg, pero preferiblemente alrededor de 50 hasta 300 mg y, en el caso de soluciones para inyección en forma de ampollas, de hasta aproximadamente 300 mg, pero preferiblemente alrededor de 10 hasta 100 mg. Para el tratamiento de un paciente adulto, con un peso de aproximadamente 70 kg, son indicadas - dependiendo de la actividad del compuesto de la fórmula I - en seres humanos y animales unas dosis diarias de aproximadamente 50 hasta 3.000 mg de sustancia activa, de manera preferida de aproximadamente 150 hasta 1.000 mg, en el caso de administración por vía oral, y de aproximadamente 50 hasta 1.000 mg, de manera preferida de aproximadamente 100 hasta 300 mg, en el caso de aplicación por vía intravenosa. En ciertas circunstancias pueden ser oportunas, no obstante, también dosis diarias mayores o menores . La administración de la dosis diaria se puede efectuar tanto por toma en una vez en forma de una unidad individual de dosificación, o también de varias unidades de dosificación menores, así como también mediante administración múltiple de dosis subdivididas, a determinados interva-los. El invento concierne además al compuesto de la fórmula I , que está acoplado eventualmente a través de miembros de puente con polímeros o materiales sólidos. Éstos son compuestos de la fórmula IV representando R1 el radical de la fórmula II ó III, O N CN L un miembro de puente tomado del grupo de a) -0-, b) -NR5-, en que R5 significa un átomo de hidrógeno, c) -0- (CH2)n-CH2-, en que n significa el número entero 1, 2 ó 3, d) -NH-C(O) -CH-R3, I, R"1 en que R3 significa a) un enlace covalente o b) -NH y R4 significa a) un átomo de hidrógeno o b) el resto de un aminoácido, o e) un miembro de puente L, definido como en a) hasta d) , el cual dispone de un espaciador, en que el espaciador es un radical del grupo de 1) -NH- (CH2) m-S- , en que m es un número entero de 1 a 12, y X representa un polímero o un cuerpo sólido. El radical "L-X" en la fórmula IV puede estar situado en el anillo de fenilo en posición meta, orto o para con respecto al grupo "NH", preferiblemente en posición para. Por el concepto "polímero" se entienden por ejemplo polímeros sintéticos y naturales del grupo de poliestireno, polipropileno, poli (cloruro de vinilo), látex, polisacáridos, Sepharose, proteínas, lípidos, silicatos o ácidos nucleicos.

Los polímeros deben de ser provistos eventualmente de uno o varios radicales funcionales del grupo que consta de -OH, -COOH, -NH2 y -CO, para que éstos puedan ser acoplados con los compuestos de la fórmula I . Métodos generales para el acoplamiento del compuesto de la fórmula I con materiales sólidos se describen por ejemplo en Bl Aapplication Handbook, edición 1994, Figura 4 . 1 , (Merk AB, Uppsala, Suecia) . El concepto "cuerpo sólido" representa cuerpos insolubles, que pueden presentarse en forma de partículas o en formas de realización geométricas, tales como tubitos, bolas o placas de microtitulación. Se prefieren compuestos de la fórmula IV, estando acoplado un compuesto de la fórmula I con un cuerpo sólido o polímero. Especialmente, se prefieren compuestos de la fórmula IV, estando acoplado un compuesto de la fórmula I, tal como (4- (2-bromo-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico o (4- (2 -bromo-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-but-2-eno-carboxíli-co, con un cuerpo sólido o polímero. Loe compuestos de la fórmula IV se adecúan también para descubrir proteínas que se fijen específicamente a partir de extractos celulares, suero, sangre o líquidos sinoviales, para purificar proteínas, para modificar placas de microtitulación o para preparar un material para cromatografía, especialmente un material para cromatografía de afinidad. Las proteínas apropiadas para la purificación están en interacción directa con los compuestos de la fórmula I unidos al polímero o cuerpo sólido. Los compuestos se adecúan también para su utilización en agentes de diagnóstico. Especialmente, se adecúan como cuerpos sólidos, en el caso de los compuestos de la fórmula IV, un Chip ®BIA core CM5 o una fase estacionaria para investigaciones o separacio-nes cromatográficas, así como placas de microtitulación.

Ejemplo 1 (4- (2-Bromo-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico Etapa a) (4-amino-fenil) -amida de ácido 5-me il-isoxazol- -carboxílico 10,1 g (0,08 moles) de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico y 8,65 g (0,08 moles) de p-fenilendiamina se disuelven en 300 ml de tetrahidrofurano y se añaden 18,05 g (0,088 moles) de diciclohexil-carbodiimida . Después de 5 horas (h) se separa del material precipitado por filtración con succión, se concentra la fase orgánica y el producto se cromatografía en gel de sílice mediante acetato de etilo/éter de petróleo con adición de 1 % de ácido acético glacial y a continuación se cristaliza en acetato de etilo/éter de petróleo. Rendimiento: 6,8 g de la sal acetato con'el punto de fusión de 123 "C hasta 128'C.

Etapa b) (4- (2 -bromo-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 5-me il-isoxazol-4-carboxílico 2,17 g (0,01 moles) del producto de la etapa a) se disponen previamente en común con 1,9 g (0,016 moles) de N-etil-morfolina en 50 ml de tetrahidrofurano y se añade gota a gota al baño de hielo una solución de 2,4 g (0,012 moles) de bromuro de bromoacetilo y a continuación se sigue agitando durante 5 h a temperatura ambiente. Después de haber añadido 5 ml de agua, se acidifica con HCl 1 N hasta un pH de 2, se extrae el producto con acetato de etilo, la fase orgánica se lava con agua, se seca y se concentra. El producto se cristaliza en acetato de etilo/éter de petróleo. Rendimiento: 2,0 g, punto de fusión 179 *C. ^-RMN: (DMSO-dc) : 2,7 (s, 3H) , 4,05 (s, 2H) , 7,5-7,75 (m, 4H) , 9,1 (s, 1H) , 10,1 y 10,45 (cada vez sb, 1H) .

Ejemplo 2 (4- (2-bromo-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-but-2-eno-carboxílico 0,5 g (0,0015 moles) del producto del Ejemplo 1 se disuelven en 10 ml de tetrahidrofurano y se añaden enfriando por hielo 2 ml de NaOH acuoso 1 N. La reacción se vigila mediante cromatografía en capa fina (DC) y después de su terminación (aproximadamente después de 60-90 min) , el producto se precipita por acidificación con 2,25 ml de ácido clorhídrico acuoso 1 N y adición de 100 ml de agua, se filtra, se lava con agua, seguidamente se agita con un poco de acetato de etilo y se seca bajo presión reducida. Rendimiento: 0,28 g, punto de fusión: superior a 210*C. :H-RMN: (DMSO-d : 2,28 (s, 3H) , 4,04 (s, 2H) , 7,4-7,7 (m, 4H) , 8,5-10 (sb, 1H) , 10,4 (sb, 2H) .

Ejemplo 3 Hidrocloruro de (4- (2-amino-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 2-metil-isoxazol-4-carboxílico Etapa a) 2-t-butoxicarbonilapdno-acetilanr no-p-fenilendiamina 8,65 g (0,08 moles) de p-fenilendiamina se disuelven, junto con 15,3 g (0,088 moles) de N-Boc-glicina, en 300 ml de tetrahidrofurano absoluto (THF) y se añaden en porciones 18,05 g (0,088 moles) de diciclohexil -carbodiimida . Después de 5 h, se separa del material precipitado por filtración con succión, se concentra, se purifica el producto por cromatografía en gel de sílice con acetato de etilo/metanol/ácido acético y luego se cristaliza en acetato de etilo/éter de petróleo. Rendimiento 13,5 g, punto de fusión 144 *C.

Etapa b) Cloruro de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico 127,1 g (1,0 mol) de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxíli-co se disponen previamente en 1 1 de tolueno, se añaden gota a gota 129,8 g (1,1 moles) de cloruro de tionilo y luego se calientan a 80 *C durante 6 h. Se concentra el volumen bajo presión reducida hasta aproximadamente la mitad y la solución en tolueno se utiliza directamente para otras reacciones.

Etapa c) (4- (2-t-Butoxicarbonilamino-acetilamino) -fenil) - amida de ácido 4-metil-isoxazol-4-carboxílico 13,5 g (0,05 moles) del producto de la etapa a) se disponen previamente, junto con 7,6 ml (0,06 moles) de N-etil-morfolina, en 100 ml de THF y se añaden gota a gota 30 ml de la solución de la etapa b) (correspondientes a 0,06 moles) a 0*C. Se sigue agitando todavía durante 5 h a temperatura ambiente, se hidroliza con ácido cítrico acuoso y se extrae el producto con acetato de etilo, se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra bajo presión reducida. Rendimiento: 12 g, punto de fusión: 139 "C.

Etapa d) Hidrocloruro de (4- (2 -amino-acetilamino) -fenil) - amida de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico 6 g (0,017 moles) del producto de la etapa c) se disuelven en 180 ml de diclorometano y se añaden 18 ml de ácido trifluoroacético. Se agita durante 1 h a temperatura ambiente, se concentra y se transforma el producto en el hidrocloruro por disolución en etanol, adición de un exceso de HCl etanólico, concentración y extracción del residuo por I agitación con acetato de etilo. Rendimiento: 2/5 g, punto de fusión 210'C. ^-RMN: (DMSO-dc) : 2,7 (s, 3H) , 3,7-3,9 (m, 2H) , 7,6-7,72 (cada vez 2H, AA'BB'), 8,25 (sb, 2H) , 9,3, 10,2 y 10,75 (cada vez s, 1H) Ejemplo 4 Trifluoroacetato de (4- (2-amino-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-but-2-eno-carboxílico 6 g (0,017 moles) del producto del Ejemplo 3, etapa c) , se disuelven en 20 ml de lejía de sosa 1 N/2 ml de etanol, y se agita a temperatura ambiente hasta «que se haya completado la apertura del anillo (aproximadamente 3 h) . Al acidificar con ácido cítrico acuoso precipita el producto protegido con Boc en forma sólida, y se filtra con succión y se seca (punto de fusión 189 'C, rendimiento 5,5 g) . 5 g de este producto intermedio se tratan en diclorometano con ácido trifluoroacético análogamente al Ejemplo 3 d) y el producto se cristaliza como trifluoroacetato en etanol con acetato de etilo y éter de petróleo. Rendimiento: 5,0 g, punto de fusión 209* C. ^-RMN (DMSO-d6) : 2,15 (s, 3H) , 3,7-3,85 (m, 2H) , 7,49 (s, 4H) , 8,1 (sb, 3H) , 10,3 y 11,2 (cada vez sb, 1H) .

Ejemplo 5 (4- (3-Yodo-propoxi) -fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-but-2-eno-carboxílico Etapa a) (4- (3 -Yodo-propoxi) -fenil) -amida de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico 6,5 g (0,03 moles) de (4-hidroxi-fenil) -amida de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico se disuelven en 57 ml (0,5 moles) de 1, 3-diyodo-propano y mediando intensa agitación se añaden 26,2 g (0,19 moles) de carbonato de potasio finamente molido. La reacción está terminada después de aproximadamente 4 h. El tratamiento se efectúa mediante filtración, concentración y cromatografía en gel de sílice mediante acetato de etilo/éter de petróleo 1:1 con adición de 1 % de ácido acético glacial. Rendimiento: 6,7 g.

Etapa b) (4- (3-Yodo-propoxi) -fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-bu -2-eno-carboxí1ico 5,5 g del producto de la etapa a) se tratan en 200 ml de una solución metanólica de amoníaco aproximadamente 1 N hasta «que se haya completado la apertura del anillo, se concentra, se recoge con ácido acético diluido y se cromatografía mediante acetato de etilo/éter de petróleo y con adición de 1 % de ácido acético glacial, luego se cristaliza en acetato de etilo/éter de petróleo. Rendimiento: 2,3 g, punto de fusión 149"C. XH-RMN (DMSO-dg): 2,1-2,4 (m, 2H y s, 3H a 2,3 ppm), 3,4 y 4,02 (cada vez t, 2H) , 6,92 y 7,42 (cada vez 2H, AA'BB'), 7,2-8,5 (ssb, 1H) , 10,2 ' (s, 1H) .

Ejemplo 6 (4-Aliloxi-fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-bu -2-eno-carboxílico 1,5 g (0,0068 moles) de ( -hidroxi-fenil) -amida de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico se disuelven en acetona, se añaden 5,8 ml (0,068 moles) de bromuro de alilo y mediando intensa agitación se añaden 9,3 g (0,068 moles) de carbonato de potasio finamente molido, luego se agita durante una noche a temperatura ambiente. Se filtra, el material filtrado se concentra, el residuo se recoge en agua y se recristaliza en acetato de etilo/éter de petróleo. Rendimiento: 0,8 g, punto de fusión 162°C hasta 164*C XH-RMN (DMS0-dr) : 2,3 (s, 3H) , 4,45-4,63 (m, 2H) , 5,15-5,38 (m, 2H) , 5,9-6,2 ( , 1H) , 6,95 y 7,42 (cada vez 2H, AA'BB'), 10,0 (Sb, 1H) , 12,5-14,5 (ssb, 1H) .

Pruebas farmacológicas Como ensayo de actividad de los compuestos de la fórmula I se hace uso del ensayo de proliferación in vi tro de cultivos celulares .

Ejemplo 7 Experimento de proliferación Una mezcla de medios de Clicks y RPMI 1640 (50:50) con L-glutamina sin NaHCO, en forma de polvo para 10 1 (Seromed, Biochrom, Berlín, Alemania) , se disuelve en 9 1 de agua bidestilada y se filtra en condiciones estériles en botellas cada una de 900 ml de capacidad. Medio de lavado 900 ml de medio de base se tamponan con 9,5 ml de una solución de hidrogenocarbonato de sodio al 7,5 % y 5 ml de HEPES (ácido N-2-hidroxietil-piperazina-N-2-etanosulfónico) (Gibco, Eggenstein, Alemania) . Medio de uso 90'0 ml de medio de base más 19 ml de una solución de NaHC03 (al 7,5 %; 10 ml de solución de HEPES y 10 ml de solución de L-glutamina (200 mM) ) . Como medio para la proliferación de linfocitos inducida por mitógenos sirve el medio de uso, «que está enriquecido con 1 % de suero de ternero fetal (FCS) desactivado por calor (30 min, 56'C) .

Medio de células tumorales Para el cultivo de las células tumorales y células de hibrido'ma se formula el medio de uso con 5 % de FCS . Medio de cultivo para las líneas de células Para el cultivo de las líneas de células se mezclan 900 ml del medio de uso con 10 % de FCS, 10 ml de una solución de NEA (non -essentia2 amino acids, aminoácidos no esenciales) (Gibco) , 10 ml de una solución de piruvato de sodio (100 mM, Gibco) y 5 ml de mercaptoetanol 10"2 M.

Obtención y tratamiento de las células esplénicas para la proliferación de linfocitos inducida por mitógenos Los ratones son sacrificados mediante dislocación cervical y los bazos son extraídos en condiciones estériles. Sobre un tamiz estéril que tiene una anchura de mallas de 80 "mesh" se despedazan los bazos y se hacen pasar con el émbolo de una jeringa de plástico (10 ml) cuidadosamente a una cápsula de Petri que contiene el medio de uso. Para eliminar los eritrocitos desde la suspensión de células esplénicas, se incuba la mezcla durante aproximadamente 1 min, mediando sacudimiento esporádico en una solución hipotónica 0,17 M de cloruro de amonio, a temperatura ambiente. Los eritrocitos son lisados de este modo, mientras que no se influye ni sobre la vitalidad ni sobre la reactividad de los linfocitos. Después de centrifugar (7 min/340 xg) , se desecha el material lisado, las células se lavan dos veces y luego se recogen en el respectivo medio de ensayo.

Proliferación de linfocitos inducida por itógenos 5xl05 células esplénicas tratadas procedentes de ratones NMRI femeninos se pipetean junto con diferentes mitógenos y el preparado (compuesto de la fórmula I) en 200 µl de medio de ensayo por pocilio en placas de microtitulación de fondo plano. Se utilizan las siguientes concentraciones de mitóge-nos y preparado: Concanavalina A [Serva]: 0,5-0,25-0,12 µg/ml Lipopolisacárido [Calbiochem] : 1,0-0,5-0,1 µg/ml Fitohemaglutinina [Gibco]: 0,5-0,25-0,12 % de solución original Mitógeno de hierba carmín 50, 25, 10, 7,5, 5, 2,5, 1, [Gibco] compuesto 1 ó 2: 0,5, 0,1 µmol Como testigos positivos se define el grupo con adiciones de mitógenos sin preparado. En el caso de los testigos negativos se trata de células en medio de cultivo con preparado y sin adiciones de mitógenos. Cada concentración de mitógenos se ensaya cuatro veces con todas las concentraciones del preparado. Después de incubación durante 48 h a 37*C/5 % de CO,, se añaden a las células 25 µl/pocillo de tritio-timidina (Amersham) con una actividad de 0,25 µCi/ pocilio (9,25xl02 Bq) . Sigue otra incubación en las mismas condiciones durante un período de tiempo de 16 h. Para la evaluación de la tanda de ensayo, las células se cosechan mediante un aparato cosechador de células (Flow Laboratories) sobre papel de filtro, recogiéndose la timidina que no ha sido incorporada en una botella de desechos dispuesta por separado. El papel de filtro se seca, se troquela y se introduce en común con 2 ml de agente escintilador (Rotiszint 22, entidad Roth) en recipientes de escintilación, que luego son enfriados a 4"C todavía durante 2 h. La cantidad de las radiactividades incorporadas por las células se mide en un contador de partículas beta (entidad Packard, Tricarb-460c) .

Tratamiento de las células tumorales y líneas de células para el ens yo de proliferación Las células tumorales o líneas de células utilizadas en el ensayo se sacan del cultivo original en la fase logarítmica de crecimiento, se lavan dos veces con el medio de lavado y se suspenden en el correspondiente medio.

Realización y evaluación de los ensayos de proliferación El ensayo de proliferación se lleva a cabo en placas de microtitulación de fondo redondo. Los compuestos de la fórmula I y las interleuquinas se disuelven en sendos 50 µl/pocillo del correspondiente medio y se ajusta el número de células (5xl05) con 100 µl/pocillo, de tal manera que resulte un volumen final de 200 µl/pocillo. En todos los ensayos se 'determinan cuatro veces los valores. Las células sin preparado con factor de crecimiento proporcionan los valores para el testigo positivo. El valor del testigo negativo se resta de todos los valores determinados, y la diferencia del testigo positivo menos el testigo negativo se establece como 100 %.

Las placas de microtitulación se incuban durante 72 h a 37*C/5 % de CO, y se determina el régimen de proliferación correspondientemente a como en el caso de la proliferación de linfocitos inducida por mitógenos. Las líneas de células han sido tomadas de la colección de cepas, American Type Culture Collection (ATCC) .

La Tabla 1 muestra las concentraciones con las que se presenta una inhibición de 50 %: Ejemplo' 8 Procedimiento para la fijación del compuesto según el Ejemplo 2 a la matriz ®BIAcore CM5 El material de partida es un chip CM5 de la entidad Pharmacia Biosensor «que tiene una superficie de carboximetil- dextrano {Bl Aapplication Handbook, edición 1994 , Merk AB, Uppsala, Suecia) . Todas las etapas de acoplamiento se efectúan., con un caudal de 5 µl/min. Todas las etapas se llevan a cabo a 25° C con una solución salina tamponada con HEPES (HBS) , de pH 7,4, como tampón de elución.

Ia etapa: 35 µl de una mezcla 1:1 de NHS (N-hidroxi-succinimida) 0,05 M y EDC (N-etil-N' - (dimetila inopropil) carbodiimida 0,2 M para activar la superficie del chip. 2a etapa: 35 µl de una solución 40 mM de dihidrocloruro de cistamina en tampón de borato de sodio 0,1 M, de pH 8 , 5. 3" etapa: 35 µl de hidrocloruro de etanolamina, de pH 8,5, para saturar las estructuras de matriz no cubiertas. 4a etapa: 35 µl de ditiotreitol 0,1 M en tampón de borato de sodio 0,1 M, de pH 8,5. 5a etapa: 35 µl de una solución que contiene el compuesto según el Ejemplo 2 (10 mg/ml) en tampón de borato de sodio, de pH 7,5.

Ejemplo 9 Método ®BIAcore aplicado para los análisis La realización de los análisis se efectuó esencialmente como se describe en Current Biology (tomo 3 , N' 12, 1993 , páginas 913 -915) . Sistema: ®BIAcore 2000 con el software correspondiente, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia Chip: chip sensor CM5 , Pharmacia Biosensor AB Cubrimiento: según el Ejemplo 8 Tampón de elución: tampón HBS, certificado por BIA, Pharmacia Biosensor AB Caudal: 10 µl/min Inyección: sendos 50 µl de la muestra a analizar, fase de asociación con una duración de 5 min. Tiempo de enjuagado: 180 segundos, fase de disociación con una duración de 3 min Regeneración: 2 x 15 segundos con 0,05 % de dodecilsulfato de sodio A) Fijación de diversas albúminas de suero El concepto "unidades de resonancia" representa la unidad cuantitativa que es proporcional a la cantidad de proteína fijada .

B) Fijación de diversas deshidrogenasas DH representa la denominación enzimátiea de deshidrogenasa Las intensidades relativas de fijación de las deshidro-genasas investigadas se pudieron comparar entre sí a una concentración definida de la proteína. Con una concentración 1 µM de la proteína se manifestó que la fijación de la dihidroorotato-DH era la más fuerte, seguida por la lactato-DH, la gliceraldehídofosfato-DH y la piruvato-quinasa.

Ejemplo 10 Cromatografía de afinidad El compuesto según el Ejemplo 1 se acopla con una matriz de soporte a través de su grupo de bromo reactivo. Como material de soporte se emplea Fractogel® EMD-SH (entidad Merck, KGaA, Darmstadt) . La unión covalente se efectúa según un protocolo normalizado de acuerdo con el documento DE-43.10.964. El gel obtenido se carga en una columna con Superformance® (1 cm x 5 cm) (entidad Merck KGaA) y se conecta con una instalación de cromatografía de líquido a alta presión (HPLC) .

Obtención de las proteínas celulares solubles La cepa RAW 264.7 (colección de cepas ATCC) se cultiva durante 48 horas (h) hasta alcanzar la confluencia y se lava tres veces con tampón de PBS frío a 4*C hasta quedar libre de medio de cultivo, las células se transfieren al tampón de PBS y se centrifugan a 200 xg durante 10 min. El tratamiento de las células se lleva a cabo a 4*C. El sedimento de células se vuelve a suspender en el tampón A, que consta de la base Tris 20 mM, MgCl2 x 6 H20 2 mM y ditiotreitol (DTT) 1 mM. Se añade una mezcla de diversos inhibidores de proteasas, para impedir una protolisis por proteasas propias de las células. A continuación, se homogeneiza en un Potter de vidrio. La suspensión se centrifuga seguidamente a 4'C durante 30 min con 22.000 xg para la obtención de las proteínas solubles.

El material sobrenadante se utiliza inmediatamente para la cromatografía de afinidad. Se retiene una parte alícuota del material sobrenadante como referencia, el resto se bombea a la columna de afinidad.

HPLC Para la cromatografía de afinidad se empleó un equipo de la entidad Kontron Instruments, Milán, Italia. El sistema consta de los componentes Automuestreador 465, Bomba de HPCL 422 y 422S, una Válvula de mezcladura a alta presión M800, una Válvula con motor Besta y un Detector de Diodos Agrupados 440. El registro de los datos y la evaluación se efectúan con el Data System 450-MT2/DAD series. El material sobrenadante celular se diluye con agua a un volumen de 30 ml y se bombea con un caudal de 1 ml/min. Se recoge el material que ha pasado y se almacena a 4°C al igual que las fracciones hasta la finalización de la cromatografía. Para la elución en gradiente de las proteínas se utilizan los siguientes tampones .

Composición del tampón de PBS: NaCl 8, 00 g/1 KCl 0,20 g/1 KH2P04 0,20 g/1 Na2HP04x7H20 2,16 g/1 Composición de los tampones utilizados en la Tabla 2: Tampón Composición 1 PBS 2 PBS + NaCl 0,5 M 3 PBS + A 77 1726b 150 mM (sal de sodio de amida de ácido N- (4-trifluorometil-fenil) -2-ciano-3-hidroxi- crotónico) 4 H20 5 ' urea 6 M 6 acetonitrilo al 60 % + ácido trifluoroacético al 0,1 % (TFA) Después de haber bombeado la solución de proteínas se comienza con un caudal de 3 ml/min del gradiente según la Tabla 2.

Tabla 2 Los números entre paréntesis se refieren al tampón utilizado .

Las fracciones se recogen, se dializan durante 48 h a 4*C frente a H20 límite de exclusión de la membrana de diálisis utilizada, 6.000-8.000 Da) (exceptuando la fracción de acetonitrilo) y seguidamente se liofiliza.

Determinación de proteínas Después de la liofilización se disuelven las proteínas en 1 ml de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1 % y se diluye con agua a 0,5 % de SDS. De esta solución se toma una parte alícuota y se emplea para la determinación de las proteínas con el ensayo BCA (Pierce) . Las proteínas se concentran por evaporación (UNIVASPO 150H, UniE«quip Power Heater, Martins-ried, Alemania) y a continuación se recogen en un volumen apropiado de un tampón de muestra, que consta de 10 g de sacarosa, 9 ml de Tris 0,25 M/solución de glicina 1 M, 7,8 ml de SDS al 10 %, 2,5 ml de azul de bromofenol (al 0,1 %) , 4 ml de /3-mercaptoetanol y 1,7 ml de agua .- SDS-PAGE Para la preparación de un SDS-gel con un gradiente de poliacrilamida de 10-17 %, se formulan 1-as siguientes soluciones .

A: B: 5 ml de acrilamida (30%, 0,5%) 8,5 ml de acrilamida (30%, 0, 5%) 3,75 ml de Tris (3 M, pH 8,8) 3,75 ml de Tris (3 M, pH 8,8) 6, 1 2 mi de agua 3,275 ml de glicerol 0, 1 5 ml de SDS 0, 1 5 ml de SDS La polimerización se comienza mediante adición de 100 µl de APS al 10 % y 12,5 µl de TEMED. El gel de recogida se prepara a partir de 3 ml de acrilamida (10 %, 0,5 %) , 1,36 ml de agua, 1,45 ml de Tris 0,5 M (pH 6,8), 60 µl de SDS al 10%, 106 µl de APS al 10 % y 9 µl de TEMED. Para la preparación de los geles analíticos, se cargan aproximadamente 10 µg de proteína por cada pista, para geles preparativos 100 µg . La determinación de los pesos moleculares se efectúa mediante comparación con mezclas patrones de proteínas.

Secuenciación Las fracciones de proteínas, que presentan en el gel analítico bandas de proteínas enriquecidas, se separan en la escala preparativa y las proteínas separadas se inmovilizan mediante transferencia de borrones sobre una membrana de PVDF (Millipore) . Las proteínas se hacen visibles mediante tinción con Coomassie y luego se someten directamente a la degradación de Edman. Las proteínas, cuyo extremo de N está bloguea-do, se recortan cuidadosamente después de la electroforesis desde los geles teñidos con Coomassie y se lavan a neutrali-dad con agua. Los trocitos de gel se prensan con dos tamices de acero dispuestos uno detrás de otro, con una anchura de mallas de 100 µm y 32 µm, y se homogeneizan así. La masa a modo de pomada se seca en el UNIVAPO 150 H (UniEquip Power Heater, Martinsried, Alemania) hasta una pequeña humedad residual. Las proteínas así obtenidas se disocian en péptidos por incubación durante 7 h a 37 "C con la enzima endoproteinasa LysdC (Boehringer Mannheim) (relación de enzima a proteína aproximadamente 1:10) en un tampón de Tris-HCl 25 mM, de pH 8,5 y EDTA 1 mM . Los péptidos obtenidos se eluyen dos veces, cada vez con 1 ml de acetonitrilo al 60 %, TFA al 0,1 % durante 4 h a 37 'C. Los materiales eluidos reunidos se concentran por evaporación en el UNIVAPO y los péptidos obtenidos se separan por cromatografía de fase inversa. La cromatografía se lleva a cabo en 70 min sobre una columna con LiChroCART" 125-2 Superspher con un gradiente lineal (1 %/min) de A: TFA al 0,1 % en agua hasta B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo. La secuenciación de aminoácidos de los péptidos purifi-cados se lleva a cabo según el principio de la degradación de EDMAN en un secuenciador en fase gaseosa 477 A (Applied Biosystems) . La identificación del PTH-AA se efectúa en un analizador de feniltiohidantoína (PTH) -aminoácidos (AA) 120A (Applied Biosystems) a 269 nm.

Análisis por transferencia de borrones Western Después de la transferencia de proteínas desde el SDS-gel a la membrana de PVDF (Millipore) , se bloquea la superficie no cubierta mediante incubación durante 2 h con albúmina de gallina al 2,5 % (Sigma) en TBS, que consta de 45 g de NaCl, 30,3 g de base Tris en 5 1 , de pH 7 , 4. El primer anticuerpo se diluye con tampón de bloqueo en una relación apropiada y se incuba durante 1 h. El borrón transferido se lava a continuación tres veces durante 5 min con TBS y Tween 20 al 0,1 % y se incuba durante 1 h con el segundo anticuerpo marcado con POD. Se repite el proceso de lavado y el anticuerpo fijado se hace visible con una solución de 60 mg de 4-cloro-l-naftol , 20 ml de metanol, 100 ml de TBS y 200 µl de peróxido de hidrógeno (al 30 %) . Las proteínas, que se obtuvieron en la fracción de NaCl (3) y A 771726b (5) (véase la Tabla 2) , pudieron ser identificadas con ayuda de péptidos con una longitud de siete a catorce aminoácidos. En el caso de la proteína con un tamaño de 22 kDa, la secuencia de aminoácidos determinada pudo ser asignada a dos proteínas, MSP23 y NKEF-A. La causa de ello se halla en la alta homología de secuencias de las dos proteínas, que es de 93 %. Los resultados de la secuenciación de la cromatografía por afinidad se recopilaron en la Tabla 3.

Tabla 3 En la columna de "Fracción" se encuentra entre paréntesis el número de la fracción según la Tabla 2.

Descripción de las proteínas identificadas La proteína con un tamaño de 18 kDa, enriquecida en la fracción (3) fue identificada como ciclofilina A. La ciclofi- lina A pertenece a la gran familia de las peptidilpropil-cis- trans-isomerasas, que participan en el mecanismo de acción de una serie de preparados inmunosupresores, p. ej . ciclosporina A. Adicionalmente, en la fracción (3) se identificó la lactato-deshidrogenasa, una enzima de la glicolisis anaerobia, que cataliza la reacción de piruvato para formar lactato. La lactato-deshidrogenasa se presenta en el tejido animal en por lo menos cinco formas isoenzimáticas diferentes. La isoenzima que predomina en el músculo del esqueleto contiene cuatro cadenas A y la enzima que predomina en el corazón contiene cuatro cadenas B. En el presente caso se ' identificó un péptido procedente de la cadena A de la lactato-deshidrogenasa. En la fracción (5) se identificaron dos proteínas, que pertenecen a la familia de las proteínas de choque térmico. La proteína de choque térmico HSP70, que predomina en organismos eucarióticos, es miembro de una familia de multigenes. La proteína de choque térmico HSP90 es una proteína citosólica, que es expresada constitutivamente también en condiciones normales. Ésta consta de dos productos génicos separados, HSP84 y HSP86, «que poseen una homología de secuencias de 86 % entre ellas. De la HSP90 se sabe que forma un complejo con receptores de hormonas esteroides e interviene de esta manera en la transcripción de determinados genes . En la fracción (5) se encontraron, junto con gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) , piruvatoqui- nasa M2 y fosfoglicerato-mutasa, además tres proteínas de la glicolisis. Estas tres enzimas proceden del tramo inferior de la glicolisis y se presentan bajo condiciones naturales en un complejo multienzimático . Una banda, que también se enriqueció muy intensamente en la fracción 5, pudo ser identificada como el faGtor de elongación (EF-la) . El EF-la es un factor eucariótico de traducción. Éste es comparable en su función con el factor procariótico de elongación EF-Tu y transporta durante la biosíntesis de proteínas, en un proceso dependiente de GTP, los aminoacil-tARN' s desde el citosol a su sitio de aceptor en el ribosoma. Adicionalmente, se pudo detectar actina en la fracción (5) . La actina es una proteína que se presenta casi en todas partes y en grandes cantidades en eucariotas . Es el componente principal de la musculatura, así como del citoesqueleto. La familia de multigenes de actina codifica por lo menos cuatro formas de actina de músculos, así como dos formas citoplasmáticas de actina {ß- y ?-actina) . En el caso de la actina aquí presente se trata de la cadena ? de la forma citoplasmática de actina. Además, se identificó una enzima del ciclo del ácido cítrico y de la lanzadera (s uütle) de malato-aspartato, la malato-deshidrogenasa . La malato-deshidrogenasa se presenta en el tejido animal en una isoforma citosólica y en una isoforma mitocondrial . Ambas isoenzimas desempeñan un papel importante, en cooperación con la aspartato-aminotransferasa, en la lanzadera de malato-aspartato entre el citosol y la mitocondria . La proteína con un tamaño de 22 kDa de la fracción (5) pudo ser asignada, basándose en el fragmento peptídico secuenciado, a dos proteínas: la proteína de estrés de macrófagos con un tamaño de 23 kDa (MSP23) , también conocida como el factor 3 específico de osteoblastos (OSF-3) y el "factor A intensificador de células asesinas naturales" (NKEF-A) . Los macrófagos activados producen compuestos oxigenados reactivos tales como H202 y 02. Puesto «que ellos mismos resisten al estrés oxidativo, tienen que poseer un eficaz sistema de defensa, para poder protegerse de estos compuestos reactivos. En el caso del NKEF se trata de una proteína citosólica de glóbulos rojos humanos, que refuerza la actividad de las células asesinas naturales. Éstas se cuentan entre los linfocitos y, después de una estimulación por citoquinas, están en situación de reconocer y destruir a un gran número de células tumorales. El "factor intensificador de células asesinas naturales" tiene un peso molecular de 44 kDa y se compone de dos subunidades con" igual tamaño (NKEF-A y NKEF-B) , que poseen una buena homología de secuencias entre sí de 88 %.

Ejemplo 11 Cromatografía por afinidad comparativa de extractos de citosoles de RAW 264.7 no estimulados, estimulados con LPS y estimulados con LPS y tratados con leflunomida. Como modelo in vi tro de procesos inflamatorios se utilizó la estimulación de la línea de células de macrófagos RAW 264.7 con un lipopolisacárido . El lipopolisacárido (LPS) es un componente estructural esencial de la membrana celular externa de bacterias gram-negativas y, como tal, es reconocí -do por células inmunes de casi todos los organismos. Especialmente los macrófagos son incitados por estimulación con LPS a sintetizar determinadas citoquinas, tales como TNF-a, IL-l e IL-6. Unas modificaciones potenciales en el cuadro proteínico, que va aparejado con esta estimulación, deberían ser impedidas por la administración simultánea del preparado inmunorregulador leflunomida. Células RAW 264.7 fueron incubadas durante 24 horas con ng de LPS/ml de medio de cultivo. En el caso de las células estimuladas con LPS y tratadas con leflunomida, se incubó simultáneamente durante 24 horas con A 77 1726B 60 µM. Las células se trataron y los extractos citosólicos se investigaron mediante cromatografía por afinidad con la columna Fractogel® derivatizada según el Ejemplo 10. Las fracciones con preparado de estas tres tandas, se aplicaron seguidamente sobre un gel de gradiente analítico y se compararon entre sí. Es especialmente llamativo el aumento de una banda en 35 kDa, que ya había sido identificada por secuenciación como la malato-deshidrogenasa. En comparación con las demás bandas proteínicas, que eran tendencialmente más débiles en su intensidad al incubarlas con LPS y A 77 1726 B, aumentó .claramente la intensidad de esta banda.

Claims (10)

1. Reivindicaciones 1. - Compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente compatible del compuesto de la fórmula I y/o una forma eventualmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I, representando R1 el radical de la fórmula II ó III,
2. OH y R^ a) -O- (CH2) n-CH=CH2, en que n significa el número entero 1, 2 ó 3, b) -0- (CH2) ra-CH2-halógeno, en que m significa el número entero 1, 2 ó 3 y halógeno significa flúor, cloro, bromo o yodo, c) el radical de la fórmula V H i O en que R3 significa 1) halógeno ó 2) -NH2 y R4 significa 1) un átomo de hidrógeno 2) el radical de un aminoácido, d) -NH, 2.- Compuesto de la fórmula I, que está caracterizado porque R1 representa el radical de la fórmula II ó III y R representa a) -O- (CH2) m-CH2 -halógeno, en que m significa el número entero 2 y halógeno significa bromo o yodo, b) -O- (CH2)n-CH=CH2 ó O -NH-C (O) -CH(R3) (R4) , en que R3 significa bromo, -NH2 o cloro y R4 significa un átomo de hidrógeno.
3. 3. - Compuesto de la fórmula I según la reivindicación 1 ó 2 caracterizado porcjue el radical R2 en la fórmula I se encuentra en la posición meta , orto o para con respecto al grupo "NH" en el anillo de fenilo, preferiblemente en la posición para .
4. 4.- Compuesto de la fórmula I según la reivindicación 1, tal como (4-aliloxi-fenil) -amida de ácido 2 -ciano-3 -hidroxi-but-2-eno-carboxílico, (4- (3-yodo-propoxi) -fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-but- 2 -eno-carboxílico, (4- (2-amino-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 2--ciano-3-hidroxi-but-2 -eno-carboxílico, (4- (2-amino-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 5-metil-isoxazol -4 -carboxílico, (4- (2-bromo-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 2-ciano-3-_ hidroxi-but- 2 -eno-carboxílico ó (4- (2-bromo-acetilamino) -fenil) -amida de ácido 5-metil-isoxazol -4-carboxílico .
5. 5. - Procedimiento para la preparación del compuesto de la fórmula I según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a) se hace reaccionar un compuesto de la fórmula VI, representando R6 el radical OH, Cl ó Br, con un compuesto de la fórmula VII representando R7 1) -NH2 2) -NH-C(O) -CH2-NH-grupo protector, en que el "grupo protector" es un grupo protector de amino, por ejemplo Boc, 3) -NH-C(O) -CH2-halógeno o 4) -OH para dar un compuesto de la fórmula I, en la que R1 representa el radical de la fórmula II y R2 representa -NH2, -NH-C (O) -CH2-NH-grupo protector, -OH o -NH-C(O) -CH2-halógeno, o b) se hace reaccionar un compuesto, preparado según el procedimiento a) , en el que R7 significa -OH, con un halogenuro de alquilo o con un dihalogenoalcano, en el que la parte de alquilo tiene 2, 3 ó 4 átomos de carbono, para dar un correspondiente compuesto de la fórmula I , o c) se hace reaccionar un compuesto preparado según el procedimiento a) , en el que R7 significa -OH, con un halogenuro de alquilo insaturado, en el que la parte de alquilo tiene 3, 4 ó 5 átomos de carbono, para dar un correspondiente compuesto de la fórmula I, o d) se hace reaccionar un compuesto, preparado según el procedimiento a), en el que R7 significa -NH2, con un halogenuro de ácido carboxílico, tal como bromuro de bromoacetilo, para dar un compuesto de la fórmula I, en la que R2 representa el radical de la fórmula V, R3 significa halógeno y R4 significa un átomo de hidrógeno, o e) se hace reaccionar una diamina aromática, tal como p- fenilendiamina, con un aminoácido protegido en el grupo I amino para dar un compuesto de la fórmula VII, en la «que R7 representa un radical de la fórmula V, R3 significa -NH2 y R4 significa un aminoácido protegido y, a continuación, se hace reaccionar como en el procedimiento a) para dar un correspondiente compuesto de la fórmula I, f) se 'elimina el grupo protector en un compuesto de la fórmula I, preparado según el procedimiento a) o e) , o g) se transforma un compuesto de la fórmula I, preparado según los procedimientos a) - f) , en que R1 representa el radical de la fórmula II, en un compuesto de la fórmula I, en el que R1 representa el radical de la fórmula III, o h) se aisla el compuesto de la fórmula I, preparado según loe procedimientos a) - g) o bien en forma libre o, en el caso de la presencia de grupos ácidos o básicos, eventualmente en sales fisiológicamente compatibles, o i) un compuesto de la fórmula I, preparado según los procedimientos a) - h) , que se presenta por causa de su estructura «química en forma diastereoisómera o enantió- mera, se separa en los estereoisómeros puros por cromatografía en un material de soporte eventualmente quiral, o un compuesto racémico de la fórmula I, que está capacitado para formar sales, se separa por cristalización fraccionada de las sales diastereoisómeras formadas con una base o un ácido, ópticamente activo, como sustancia auxiliar, o un compuesto racémico de la fórmula I , que contiene un grupo básico tal como un grupo amino, se transforma con ácidos ópticamente activos, tales como el ácido (+) -canfo-10-sulfónico, los ácidos D- y L- artáricos, los ácidos D- y L-lácticos o los ácidos (+) y ( - ) -mandélicos, en los enantiómeros puros.
6. 6.- Medicamento que contiene un compuesto de la fórmula I según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente compatible.
7. 7.- Utilización del compuesto de la fórmula I según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades cancerosas, inflamaciones o enfermedades autoinmunes.
8. 8.- Compuesto de la fórmula IV representando R1 el radical de la fórmula II ó III, OH CN un miembro de puente tomado del grupo de a) -0-, b) -NR5-, en que R5 significa un átomo de hidrógeno, c) -0- (CH2) n-CH2- , en que n significa el número entero 1, 2 ó 3, d) -NH-C(O) -CH(R4) (R3) , en que R3 significa a) un enlace covalente o b) -NH y R4 significa a) un átomo de hidrógeno o b) el resto de un aminoácido, o un miembro de puente L, definido como en a) hasta d) , el cual dispone de un espaciador, en que el espaciador es un radical del grupo de -NH- (CH 2' , en que m es un número entero de 1 a 12, y X representa un polímero o un cuerpo sólido.
9. 9.- Utilización del compuesto de la fórmula IV según la reivindicación 8 para descubrir proteínas que se fijen específicamente a partir de extractos celulares, suero, sangre o líquidos sinoviales, para purificar proteínas, para modificar placas de microtitulación o para preparar un material para cromatografía, especialmente un material para cromatografía de afinidad.
10. 10.- Utilización del compuesto de la fórmula IV según la reivindicación 8 en agentes de diagnóstico.