MXPA98000520A - Proceso para replegar proteinas por medio de intercambio de amortiguador usando una fase estacionaria continua capaz de separar las proteinas de la sal - Google Patents

Abstract

Se describe un proceso rápido y eficiente de replegado que utiliza una fase estacionaria, celulósica, enrollada, para separar rápidamente la proteína reducida, desnaturalizada, de la solución de desnaturalización, promoviendo, de este modo, altos rendimientos de replegado de la proteína a mayores concentraciones de la proteína, mientras que disminuye significativamente el volumen necesario para lograr el replegado de la proteína.

Description

PROCESO PARA REPLEGAR PROTEÍNAS POR MEDIO DE INTERCAMBIO DE AMORTIGUADOR USANDO UNA FASE ESTACIONARIA CONTINUA CAPAZ DE SEPARAR LAS PROTEÍNAS DE LA SAL ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un proceso para replegar una proteína, el cual utiliza cromatografía rápida de exclusión de tamaño para separar la proteína reducida, desnaturalizada, de la solución para desnaturalizar. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con un proceso rápido y eficiente que utiliza una fase estacionaria celulósica, enrollada, para promover altos rendimientos del replegado de las proteínas, mientras que disminuye significativamente el volumen necesario para lograr el replegado de las proteínas . La tecnología del ADN recombinante a permitido la expresión de proteínas extrañas ( eterólogas ) en células huésped microbianas y de otros tipos. En muchos casos, la alta expresión de la proteína heteróloga conduce a la formación de agregados de alto peso molecular llamados "cuerpos refractiles" o "cuerpos de inclusión". La recuperación de la proteina deseada que se encuentra en forma de estos cuerpos refractiles a presentado ciertos problemas. Antes que nada, puede ser difícil separar las proteínas refractiles de los otros materiales celulares REP: 26438 del huésped. Segundo, puede ser difícil eliminar posteriormente los contaminantes de la proteína del cuerpo refractil de la proteína deseada del cuerpo refractil. Tercero, y lo más problemático, la proteína del cuerpo refractil a menudo se encuentra en la forma que, mientras pueda identificarse como la proteína deseada, no es biológicamente activa. En la mayoría de los casos, se han usado compuestos desnaturalizantes y detergentes (e.g., hidrocloruro de guanidina, urea, dodeci lsulfato de sodio (SDS), Tritón X-100) para extraer la proteína. La solución resultante que contiene la proteína desnaturalizada con las cadenas pol ipept ídi cas desdobladas, se trata entonces para eliminar el agente de desnaturalización o, por el contrario, invertir las condiciones de desnaturalización y, por lo tanto, permite renatural i zar (volver a naturalizar) la proteína y el plegado de las cadenas pol ipept ídicas en solución, para dar la proteína en forma natural, biológicamente activa. Con proteínas de interés farmacéutico, el uso de estos agentes de desnaturalización puede crear problemas potenciales debido a que es difícil eliminar los agentes desna uralizantes completamente de las proteínas aisladas. Además, cuando se emplean agentes desnaturalizantes fuertes, como la guanidina, el proceso de renaturalización (volver a naturalizar) puede ser difícil, sino imposible. Se han descrito en la técnica diversos protocolos de renaturalización; ver, e.g., US 5,235,043 (Collins et al) y US 4,734,362 (Hung et al), y las referencias que se citan en ellas. Un ejemplo de una proteína que puede expresarse en células huésped microbianas es el inhibidor de la proteasa del leucocito de secreción (SLPI). El SLPI es de interés terapéutico para el tratamiento de estados patológicos que involucran proteólisis mediada por leucocitos, tal como el enfisema y la fibrosis cística. La estabilidad y la actividad completas de esta proteína requiere de un replegado adecuado con 16 residuos de cisteína involucrados en 18 enlaces disulfuro intramoleculares .

El SLPI recombinante (rSLPI) se renaturaliza comúnmente diluyendo la corriente del producto hasta una concentración de 0.2 mg/mL para llevar a las sales y los agentes reductores hasta una concentración aceptable que permita que la proteína se repliegue; Harcu et al., Bi o t ech . Le t t . , 15(9), 943-948 (1993). Este método, mientras que proporciona SLPI biológicamente activo, requiere de una gran dilución y da como resultado volúmenes del proceso muy grandes que no se pueden manejar cuando se inten.ta procesar grandes cantidades de la proteína. Otras proteínas recombinantes utilizan métodos similares de renaturalización/replegado; ver, e.g., Pro t ein Refoldi ng, Georgiou y Bernárdez, Eds., ACS Symposium Serie No. 470 (1991); Jaenicke y Rudolph, Chap. 9 en Pro tein S truc t ure, T. Creighton, ed. (1988). Existe la necesidad de un proceso que reduzca los volúmenes del proceso de replegado asociados con el replegado de estas proteínas y que haga que la producción de grandes cantidades de estas proteínas sea comercialmente más pract icable .

El intercambio del amortiguador es una técnica importante de separación utilizada en la producción de compuestos biofarmacéut icos y se ha evaluado métodos comunes, como la filtración por flujo tangencial y la cromatografía de exclusión de tamaño, por su capacidad de separar los agentes desnaturalizantes/reductores de la proteína. El uso de la filtración por flujo tangencial resulta en un gradiente proteico cerca de la membrana, incrustación de la membrana y agregación de proteínas. La cromatografía de exclusión de tamaño, usando geles hidrofílicos, es lenta y difícil, debido a la compresibilidad de estos geles y también resulta en una dilución sustancial de la proteína. Sin embargo, la cromatografía de exclusión de tamaño puede preferirse donde la agregación o desnaturalización proteica sean importantes; Kurnik et al., Bi o t e ch . An d Bi oen g. , 45(2), 149-157 (1995) .

Un método de cromatografía de exclusión de tamaño, basado en un nuevo tipo de fase estacionaria celulósica, facilita las separaciones proteína/sal con velocidades de la fase móvil de 500 a 6000 cm/h. Como consecuencia, es posible eliminar las sales se una proteína desnaturalizada y recuperar la proteína de una manera rápida y eficiente, en volúmenes más pequeños, y con mayores concentraciones de la proteína, haciendo que el uso de la cromatografía de exclusión de tamaño, en un proceso de replegado, sea práctica. Específicamente, este método de cromatografía se basa en un fase estacionaria continua, tejida, que se enrolla en una configuración cilindrica y se empaca en una columna de cromatografía. Esta fase estacionaria se denomina "fase estacionaria enrollada", debido a su configuración.

Las fases estacionarias enrolladas son derivadas o no derivadas, preacondicionadas , embobinadas en forma cilindrica, las telas tejidas y las fibras que forman la matriz tejida son capaces de soportar velocidades de flujo de 6000 cm/h sin compresión del lecho, mientras que mantiene una altura constante del plato.

La presente invención utiliza esta cromatografía rápida de exclusión de tamaño, seguida por el replegado de las proteínas, para proporcionar un proceso que reduce significativamente los volúmenes de proceso asociados con el replegado de las proteínas, como SLPI, que normalmente requiere de grandes diluciones con el fin de crear el ambiente de replegado adecuado. El uso del proceso de la presente invención minimiza significati amente lo requerimientos de tancaje (capacidad total de almacenamiento), los requerimientos de agua y el tiempo del proceso, incrementa la concentración de la proteína, y mejora la viabilidad del procesamiento corriente abajo de grandes cantidades de proteínas. El proceso de la presente invención hace que el escalamiento de la producción de grandes volúmenes de proteínas sea práctico y proporciona una herramienta valiosa para aquellas proteínas de preparación, par icularmente las proteínas producidas con métodos recombinantes , para uso terapéut i co .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un proceso para replegar una proteína, preferiblemente una proteína que se expresa de manera recombinante, el cual utiliza la cromatografía rápida de exclusión de tamaño para separar la proteína desnaturalizada, reducida, de la solución de desnaturalización. En una modalidad preferida, la invención se dirige a un proceso que utiliza tecnología de fase estacionaria enrollada (RSPT™) para separar los agentes desnaturalizantes y los agentes reductores de las proteínas en grandes volúmenes del flujo del producto de la fermentación. Sorprendentemente, las separaciones que se efectuaron de esta manera tardaron solo unos cuando minutos, resultaron en altos rendimientos de recuperación y, cuando fueron seguidos por un pequeño período de incubación, dieron un alto rendimiento de proteína replegada de manera adecuada, a concentraciones más altas de la proteína. Más importante, la técnica de separación reduce sustancialmente los volúmenes del proceso de replegado, demostrando que una combinación de la cromatografía de exclusión de tamaño, seguida por el replegado de la proteína, reforzará significativamente el rendimiento total del proceso.

En una modalidad preferida, un flujo del producto de fermentación, que comprende una mezcla de proteína desnaturalizada y agentes desnaturalizantes, se hace pasar rápidamente sobre un dispositivo de separación para fraccionar parcialmente la proteína de los desnaturalizantes/reductores, seguido por la captura de la proteína para permitir el replegado de la proteína. Preferiblemente, la proteína desnaturalizada es una proteína expresada de manera recombinante y el dispositivo de separación es una fase estacionaria enrollada capaz de efectuar la separación basada en las diferencias de tamaño entre la proteína y la sal. Más preferiblemente, la proteína desnaturalizada es SLPI recombinante y el dispositivo de separación es una columna RSPT™ que consiste de una matriz tejida de 60% algodón/40% poliéster, donde la celulosa es un material DEAE derivado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama esquemático de la columna Superperf ormance® empacada con fase estacionaria enrollada.

La Figura 2 muestra una curva de distribución de la porosidad. El eluyente fue agua desionizada, con una inyección de 100 µL de muestra de 10 mg/mL de PEG, dextranos, y otros compuestos de prueba de peso molecular disueltos en agua. La velocidad de flujo fue de 10 mL/min .

La Figura 3 es el perfil experimental de elución de la proteína para una muestra de 2 mL de BSA (2 mg/mL) en amortiguador Tris 50 mM (pH 8.0) que contenía NaCl 500 mM. La velocidad de flujo fue de 2 mL/min. Exploración en UV a 280 nm, a 0.5 AU .

La figura 4 es el perfil experimental de elución de la proteína para una inyección de 2 mL de la Muestra 1.

La velocidad de flujo fue de 2 mL/min. Exploración en UV a 280 nm, a 0.5 AU .

La Figura 5 es el perfil experimental de elución de la proteína para una inyección de 2 L de la Muestra 1 inyectada en dos columnas conectadas en serie. La velocidad de flujo fue de 1 mL/min. Exploración en UV a 280 nm, a 0.5 AU .

DESCRIPCIÓN DETALLA DE LA INVENCIÓN Los procesos mediante los cuales puede usarse la cromatografía de exclusión de tamaño para facilitar los procesos de replegado de la proteína se describen con mayor detalle en la discusión siguiente y sin ilustrados por el Ejemplo que se proporciona más adelante. El ejemplo muestra diversos aspectos de la invención e incluye resultados del uso de RSPT"" para separar SLPI recombinante de los agentes desnaturalizantes y de los agentes reductores. Los resultados fueron sorprendentes en que el uso de RSPT" para la separación resultó en altos rendimientos de replegado de la proteína, con volúmenes del proceso sustancialmente reducidos y mayores concentraciones de la proteína.

Incluidas en los procesos de la presente invención se encuentran cualquier tipo de proteínas, preferiblemente las proteínas que se expresan mediante la tecnología del ADN, en cualquier microorganismo huésped, donde estas proteínas deben ser aisladas de los desnaturalizantes y renaturali zarse/replegarse . En particular, aquella proteínas que requieren ambientes de replegado que involucran bajas concentraciones de desnaturalizantes, y por lo tanto grandes volúmenes, pueden todavía replegarse en concentraciones relativamente altas de proteína, sin formar agregados. Ejemplos de proteínas que pueden ser útiles en la presente invención incluyen SLPI, el factor de crecimiento derivado del cerebro (BDNF), el factor de crecimiento derivado de la glia (GDNF), el factor de crecimiento de los nervios (NGF) , y el factor neurot rópico-3 (NT-3).

En general, el SLPI útil en la presente invención tiene la secuencia del SLPI humano, o de los análogos íntimamente relacionados del mismo. El SLPI puede ser producido por las células de los mamíferos afuera del cuerpo, o puede aislarse de fuentes naturales. Preferiblemente, el SLPI es SLPI recombinante (rSLPI) producido tal como se describe por Seely y Young, Capítulo 16 en ACS Symposium Series No, 470, Pro t ei n Re fol di n g; Georgiou y Bernárdez, Eds., ACS: Wash D.C., 206-216 (1991). Mientras que los procedimientos de Seely y Young son el método preferido para producir rSLPI, pudieron hacerse modificaciones y cambios a ese proceso tal como se conoce en la técnica.

Los dispositivos de separación contemplados para usarse en la presente invención incluyen el uso de cualquier fase estacionaria continua, fase estacionaria particulada, o membrana capaz de (1) fraccionar rápidamente la proteína desnaturalizada de los desnaturalizantes/reductores; y (2) promover la renaturalización/replegado hasta una forma biológicamente activa. Tal como se utiliza aquí, "que se fracciona rápidamente" se define como una separación suficiente de la proteina desnaturalizada de los desnaturalizantes/reductores para permitir que la proteína se repliegue, pero lo suficientemente rápido de modo que la proteína se elimine del dispositivo de separación antes de que el replegado de la proteína desnaturalizada exceda el 10%.

La cromatografía rápida de exclusión de tamaño contemplada para utilizarse en la presente invención se efectúa preferiblemente sobre columnas con tecnología de fase estacionaria enrollada (RSPT'"). Estas columnas fueron desarrolladas luego del descubrimiento de que los materiales sólidos sorbentes, celulósicos, especialmente las fases estacionarias continuas (que anteriormente han demostrado separaciones excelentes y rápidas a velocidades lineales del eluyente en exceso de 5000 cm/h (Yang et al., Adv . Bi ochem . Eng . , 49, 148-160, 1993)), pudieron tratarse con enzimas celulasas para mejorar significativamente la capacidad de adsorción de la proteína del material sólido sorbente.

Las enzimas celulasas son producidas por, y pueden ser obtenidas de, microorganismos adecuados, tales como hongos, usando técnicas convencionales, o pueden ser obtenidas a partir de fuentes comerciales. Se prefiere que la enzima celulasa empleada tenga un peso molecular desde aproximadamente 20,000 hasta aproximadamente 100,000, más preferiblemente de aproximadamente 50,000 o más .

El material sorbente preferido es a base de celulosa y puede ser particulado, fibroso, o, preferiblemente, una fase continua que comprende una tela tejida o no tejida. Además, el material sorbente puede ser derivado para introducir grupos funcionales iónicos o no iónicos, como es bien sabido y usado en la técnica de la cromatografía, para introducir el intercambio de cationes, el intercambio de aniones, y/o el carácter de afinidad al sorbente. El material sorbente derivado es preferiblemente un material con función amino, tal como una dialquilaminoalqui 1 celulosa, e.g., celulosa DEAE, aunque también pueden prepararse otras celulosas que contengan grupos funcionales, tales como sulfato, alquilsulfato, carboximet i lo , fosfato, sales cuaternarias u otros grupos benéficos, de acuerdo con la invención. Los grupos alquilo en estos grupos funcionales típicamente contienen desde 1 hasta aproximadamente 5 átomos de carbono. Como un ejemplo, para preparar un material de celulosa DEAE preferido, una tela de algodón puede sumergirse en una mezcla de NaOH y DEAE durante un periodo de varias horas, por ejemplo, aproximadamente 6 a 10 horas. En este proceso, la relación de tela a líquido se encuentra preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1:25 hasta aproximadamente 1:50 p/v, y la concentración de DEAE es preferiblemente de hasta aproximadamente 1M.

De acuerdo con la presente invención, el material sólido sorbente puede incluir fibras de dos materiales diferentes. Por ejemplo, el sorbente puede incluir una tela que comprenda fibras de celulosa derivadas, combinadas con otro tipo de fibra diseñada para reforzar y mejorar las propiedades mecánicas totales de la fase estacionaria. Por ejemplo, las fibras de celulosa derivada y fibras sintéticas, como las fibras de poliamida aromática del nailon de poliéster, o Kevlar®, pueden ser mezcladas para dar una fase estacionaria ventajosa. La fase estacionaria puede también incluir fibras de celulosa que se han derivado por separado, con diferentes agentes de derivación, e.g., fibras de celulosa derivadas con DEAE y sulfato, que se han mezclado en una tela.

Como se indicó anteriormente, la invención contempla la hidrólisis de un material sorbente, a base de celulosa, con una enzima celulasa durante un tiempo suficiente para formar el material sorbente modificado con una mayor capacidad de adsorción de proteína. De acuerdo con una modalidad para preparar el material, el material sorbente es tratado con la enzima de celulosa durante hasta aproximadamente 6 horas, a un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8, más pre eriblemente un pH desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6. Las temperaturas durante estos tratamientos pueden variar mientras la temperatura empleada no desnaturalice o, por otro lado, inactive la enzima. Las temperaturas desde aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 80°C son típicas, y caen más preferiblemente en el intervalo desde aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 60°C. Un protocolo preferido de hidrólisis en inves igación hasta ahora ha incluido la exposición del material de celulosa a la enzima celulasa durante aproximadamente 1 hora a un pH desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 6 y a una temperatura de aproximadamente 50°C.

Las concentraciones de la enzima también pueden variar ampliamente al tratar el material celulósico, por ejemplo, en el intervalo de hasta aproximadamente 50 GCU/mL, o más. Las concentraciones de la enzima celulasa más preferidas se encuentran en el intervalo desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 GCU/mL. En esta aspecto, una GCU se define como una unidad Genecor, que es equivalente a 1 FPU, un nivel estandarizado de actividad enzimática que se basa en las velocidades a las cuales las tiras de papel filtro son hidrolizadas por las enzimas de celulosa.

Después del tratamiento con la enzima, la enzima se desactiva, por ejemplo, sumergiendo la fase estacionaria en agua caliente para desnaturalizar la enzima. En este aspecto, cuando se llevan a cabo los métodos de la presente invención, es importante que la hidrólisis mediada con celulasa se termine antes de completar el rompimiento o la fragmentación del material a base de celulosa, puesto que esto proporcionará materiales que tengan propiedades mecánicas pobres y/o que conducirán a la recuperación de partículas finas que afectan nocivamente el comportamiento de la columna. Se efectuarán métodos preferidos de modo que se logre que las fases estacionarias tengan fuerzas de rompimiento de al menos aproximadamente 5 lbf.

Los métodos de la presente invención también incluyen una etapa de acondicionamiento de la celulosa, que incluye el hinchamiento de la tela u otro material celulósico en el agua o en una solución de un agente de hinchamiento, como una base orgánica o inorgánica, e.g., amoniaco, etilendiamina, o sosa cáustica. Se prefieren las soluciones de hidróxido de sodio (NaOH) para estos propósitos. El pretratamiento con los agentes de hinchamiento, como el hidróxido de sodio, incrementa la reactividad con respecto a la hidrólisis enzimática. Se piensa que esto resulta en una mayor porosidad interna y una área superficial accesible a la proteína ya sea directamente (a través del hinchamiento) o indirectamente (facilitando el ataque de la enzima).

De manera opcional, la etapa de acondicionamiento de la celulosa también puede incluir una etapa de prederivación . La prederivación de la celulosa puede efectuarse, por ejemplo, sumergiendo un material a base de celulosa en una mezcla de NaOH y un agente de derivación, tal como cloruro de 2- (dietilamino ) et i lo (DEAE-C1). Después del acondicionamiento y/o la prederivación, la tela puede lavarse, por ejemplo, con agua desionizada, antes de un tratamiento posterior con la enzima celulasa.

Una vez preparadas las fases estacionarias de la invención pueden empacarse en columnas de metal, plástico, vidrio o cualquier otro material adecuado para utilizarse en cromatografía líquida u otras técnicas de cromatografía. Por ejemplo, para empacar una fase continua enrollada, modificada, de la invención, puede troquelarse o taladrarse una abertura en el extremo de la fase, y una cuerda, fabricada de un material que tiene una elevada resistencia al esfuerzo de tracción, e.g., la fibra de poliamida aromática Kevlar®, puede roscarse a través de la abertura. La cuerda puede entonces ser roscada a través de la columna y usarse para jalar la fase hacia la columna.

Las columnas preferidas tendrán densidades de empacado de al menos aproximadamente 0.5 g/cc, generalmente en el intervalo de 0.5 a 0.6 g /ce. También, las columnas preferidas tendrán fracciones vacías tan bajas como aproximadamente 0.4 y aún en el intervalo de hasta aproximadamente 0.3, o menos. Estas columnas RSPT" se caracterizan adicionalmente en las Solicitudes Copendientes de Patente Norteamericana Nos. 08/260,022, presentada en Junio 15, 1994; y 08/260,021, también presentada en Junio 15, 1994, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia, en su totalidad.

La nueva combinación de cromatografía y replegado, descrita en la presente invención, permite un control externo de parámetros como la temperatura, la concentración de proteína, el tiempo y la concentración de los desnatural i zantes/ reductores . Es bien sabido por aquellos entrenados en la técnica que estos parámetros afectan las eficiencias de replegado.

La temperatura puede controlarse colocando una camisa a la columna de cromatografía y controlando la temperatura del amortiguador de elución. La concentración de la proteina (y la concentración de los desnaturalizantes/reductores) puede ser controlada ajustando el tamaño de la muestra, la longitud de la columna, y la concentración inicial de la muestra que se va a inyectar en el dispositivo de separación. Las propiedades únicas de flujo de las fases estacionarias enrolladas, i.e., la característica de una altura constante del plato, sin importar la velocidad del eluyente, permite que la velocidad del flujo cambie según sea necesario sin afectar la eficiencia de la columna y sin encontrar la caída de presión asociada con otros tipos de medios de permeabilidad del gel y de exclusión de tamaño. La presente invención combina estos factores en un nuevo proceso donde los parámetros operacionales de tamaño de la muestra, características de la fase estacionaria y longitud de la columna, son usadas en lugar de un amortiguador de dilución para lograr el replegado de la proteína en volúmenes del proceso grandemente reducidos.

Aunque la invención ha sido descrita e ilustrada con respecto a ciertos procesos de replegado de la proteína, los cuales utilizan cromatografía rápida de exclusión de tamaño para separar los desnaturalizantes/reductores de la proteína antes del replegado, será aparente para cualquiera entrenado en la técnica que pueden existir modalidades adicionales sin salirse del alcance de la invención.

Los siguiente ejemplos ilustrarán con más detalle los diversos aspectos de la presente invención.

EJEMPLO 1 Este ejemplo describe la preparación de las columnas RSPT*" y las preparaciones de la muestra de proteína usadas en los experimentos.

Preparación de la columna RSPT" En la presente invención, la columna RSPT"* consistía de una matriz tejida de 60% algodón/40% poliéster, enrollada en un cilindro e insertada en una columna de vidrio de 10 mm de d.i. Superperformance® (E. Merck, Darmstadt, Alemania). La mezcla de tela algodón/poliéster , 60/40, fue suministrada por Cotton, Inc. (Raleigh, N.C.) y se derivó como sigue: (1) la tela se almacena en un cuarto de acondicionamiento a una temperatura de 67°F a 73°F y con una humedad relativa del 60% a 70% durante al menos 3 días antes de que se corte y se pese para el tratamiento; (2) la tela se pretrató con DEAE-Cl 0.5 M (Sigma Chemical Corp.. St . Louis, MO) en NaOH 18% a 22°C durante 6 horas, y luego se enjuagó repetidamente con agua desionizada; (3) el agua se exprimió a mano de la tela pretratada y la tela se sumergió en una solución de enzima (precalentada a 50°C y la relación del volumen total de la solución enzimática al peso de la tela es de 30:1 (mL:g)) que contenía 9 GCU de celulasa (solución obtenida mezclando 9 partes de amortiguador de citratos (pH 4.8) con 1 parte de Cytolase" 123 (Genencor Inc.)) durante una hora, y luego se enjuagó repetidamente con agua desionizada; (4) la tela se colocó en agua hirviendo durante 5 minutos para desactivar la enzima y luego se enjuagó repetidamente en agua desionizada a temperatura ambiente; (5) se repite el paso ( 2 ) .

El aparato de la columna se ilustra en la Figura 1. La porosidad de este tipo de columna fue caracterizada utilizando moléculas de prueba de D20, glucosa, polietilen glicol, y dextran, disueltas en agua desionizada a concentraciones de 2 mg/mL. El eluyente fue agua desionizada. Las moléculas de prueba tenían pesos moleculares en el intervalo desde 20xl06 hasta 2xl06. La curva resultante de la distribución de porosidad se da en la Figura 2.

Se utilizaron dos columnas RSPTm en los experimentos. La columna uno consistía de tela enrollada para ajustarse a la columna de vidrio de 10 mm de d.i. y tenía una altura del lecho de 105 mm y un volumen de lecho empacado de 8.4 mL . La columna dos era una columna de 10 mm de d.i. con una altura del lecho de 114 mm y un volumen de lecho empacado de 9.0 mL .

Preparación de la muestra La solución de proteína rSLPI purificada, usadas para estos experimentos, fue preparada como se describe por Seely y Young, s upra . La concentración de la proteína era de 2 mg/mL.

Muestra 1. Se adicionó guanidina-HCl a la solución de proteína para obtener una concentración final de guanidina-HCl 3 M. Después de 30 minutos se adicionó ditiotreitol (DTT) para dar una solución 5 mM . Después de 60 minutos el pH se ajustó a 8.0 y se adicionó NaCl hasta una concentración de 500 M . La concentración de la proteina fue de 2 mg/mL.

EJEMPLO 2 Este ejemplo describe (1) las separaciones por cromatografía de exclusión de tamaño donde se usó RSPT'" para separar rSLPI de los agentes desnaturalizantes y reductores; y (2) el análisis de replegado de las preparaciones de proteína fraccionada.

Cromatografía de exclusión de tamaño El objetivo era separar rSLPI que contenía guanidina 0.3 M, puesto que esta concentración de guanidina había sido usada en métodos previamente publicados.

Todos los procesos de cromatografía fueron efectuados usando una Unidad Pharmacia Biopilot LCC-500 Plus (Piscataway, N.J.) con un detector UV (Unidad Óptica ISCO Tipo 6, Modelo 228). La proteína fue detectada a 280 nm, mientras que se utilizó un detector de conductividad (Colme Parmer, V R Módulo 1052) para detectar la emergencia del pico de la sal. El monitor UV también detectó DTT y por consiguiente dio una indicación de la resolución del DTT de la proteína. La señal de los detectores fue registrada simultáneamente en un graficador Linseis Chart (Tipo 7045A). Una deflección a toda la escala del detector de conductividad correspondía con 12.9 mhos. Esto fue determinado mediante la inyección de soluciones estándar de guanidina-HCl en el amortiguador de elución directamente en el detector.

Las muestras fueron inyectadas a la columna usando un inyector Rheodyne adaptado con lazos de muestra de 100 µL, 2.0 L, 3.0 mL o 4.0 mL . El inicio del cromatograma fue medido como el tiempo en el cual la muestra entró por primera vez a la columna.

La fase móvil consistía de amortiguador Tris 50 mM (pH 8.0), con NaCl 500 mM. La combinación del amortiguador y la sal fue elegida basados en experimentos previos en los cuales se mostró que el NaCl 500 mM suprime el BSA que se une sobre la celulosa DEAE. Por consiguiente, tanto la fase móvil como la muestra de rSLPI contenían NaCl 500 mM.

Las columnas fueron calibradas con la proteína albúmina de suero bovino (BSA) a 2 mg/mL (Sig a Chemical Corp., St. Louis, MO) disuelto en amortiguador Tris 50 mM (pH 8.0), que contenía NaCl 500 mM . El perfil de elución de la proteína para una muestra de 2 mL se muestra en la Figura 3.

Análisis de replegado La cromatografía analítica fue efectuada en una columna SynChropak RP-8 (Synchrom, Inc., Linden NJ) . Se inyecta una muestra de 100 µL a 0.2 mg/mL. El amortiguador A es agua w/ácido t ri fluoroacét ico (TFA) 0.1% y el amortiguador B es acetonitrilo (100%) w/0.1% TFA. La columna se corre a temperatura ambiente y se usa un gradiente del 19% al 34% de acetonitrilo a 1%/minuto para resolver de manera correcta el rSLPI plegado (eluye a 13.8 minutos) de la forma no plegada (eluye a 17.9 minutos). La recuperación de la proteína fue calculada dividiendo el área del pico a 13.8 minutos, por el área total de todos los picos.

Corridas experimentales Corrida 1. 2 mL de la muestra 1, preparada como se describe en el Ejemplo 1, fueron cargados en la columna 1. Esto representó el 25% del volumen total del lecho, o 83% de la fracción vacía accesible al rSLPI. Se utilizó una velocidad de flujo de 2 mL/minuto. El pico de la proteína, que eluyó entre 2.5 mL y 5 mL del volumen de elución, fue recuperado. Esta recuperación se basó en el perfil de elución de BSA. El perfil de elución de la proteína para la Corrida 1 se muestra en la Figura 4. Los datos de la Figura 4 demuestran que puede utilizarse RSPT™ para separar efectivamente rSLPI de los otros constituyentes. La fracción recuperada se mezcló rápidamente luego dejó incubar durante 4 horas a 20°C, seguido por el análisis de replegado. Los resultados de la Corrida 1 se resumen en la Tabla 1.

Corrida 2. Esta corrida fue similar a la Corrida 1, excepto porque se recuperó el pico de la proteína, la cual eluyó entre 2.5 mL y 5.5 L del volumen de elución. La fracción recuperada se dejó entonces incubar durante 4 horas a 20°C, seguido por el análisis de replegado. Los resultados de la Corrida 2 se resumen en la Tabla 1.

Corrida 3. Esta corrida fue similar a la Corrida 1, excepto porque se recuperó el pico de la proteína, la cual eluyó entre 2.5 mL y 6 mL del volumen de elución. La fracción recuperada se dejó entonces incubar durante 4 horas a 20°C, seguido por el análisis de replegado. Los resultados de la Corrida 3 se resumen en la Tabla 1.

Corridas 4-5. 3 mL de la Muestra 1, preparada como se describe en el Ejemplo 1, fueron cargados a la Columna 1. Esto representó el 37.5% del volumen total del lecho, o 125% de la fracción vacía accesible al rSLPI . Se utilizó una velocidad de flujo de 2 mL/minuto. Se recuperó el pico de la proteína, el cual eluyó entre 2.5 L y 5.5 L del volumen de elución. La fracción recuperada se dejó entonces incubar durante 4 horas a 20°C, seguido por el análisis de replegado. Los resultados de las corridas 4-5 se resumen en la Tabla 1.

Corridas 6-8. Estas corridas son las mismas que las Corridas 4-5, excepto porque la recuperación del pico de la proteína fue entre 2.5-6.0, 2.5-6.6 y 2.5-6.1 mL, respecti amente. Las fracciones recuperadas se dejaron, entonces, incubar durante 4 horas a 20°C, seguido por el análisis de replegado. Los resultados de las Corridas 6-8 se resumen en la Tabla 1.

Corrida 9. En esta corrida, la columna 1 y la Columna 2 fueron conectadas en serie, y se inyectaron 2 L de Muestra. Se utilizó una velocidad de flujo de 1 mL/minuto. El perfil de elución de la proteína para la Corrida 9 se muestra en la Figura 5. Los datos de la Figura 5 demuestran que puede obtenerse una mayor resolución conectando las columnas en serie. La recuperación del pico de la proteína inició a un volumen de elución de 6 mL y terminó a 10.5 L . La fracción recuperada se dejó entonces incubar durante 4 horas a 20°C, seguido por el análisis de replegado. Los resultados de la Corrida 4 se resumen en la Tabla 1.

TABLA 1 Corrida # % da [] de la % de replegado recuj seraci «ina (mg/mL) la pro te 1 87.5 1.43 45.2 2 96.0 1.28 45.7 3 100 1.34 37.8 4 80.0 1.60 25.1 5 78.0 1.55 24.1 6 88.0 1.52 0.2 7 103 1.54 0.2 8 96.0 1.64 0.5 9 106 0.94 41.0 Como se muestra en la Tabla 1, el mayor rendimiento de la proteína replegada fue obtenido para una fracción de 3 mL recuperada 3 minutos después de que la muestra de 2 mL había sido inyectada en la Columna 1. Esta fracción contenía 96% del rSLPI inicial, inyectado a una concentración de 1.28 mg/mL. Esto representa un incremento de 6.4 veces en la concentración de la proteína sobre un método publicado anteriormente, Seely y Young supra, donde se efectúa el replegado diluyendo la mezcla de proteína, desnaturalizantes y agentes reductores por un factor de 10. Después de la incubación de 4 horas, el 46% de la proteína se había replegado a su forma activa. Este rendimiento se encuentra en línea con los rendimientos de replegado reportados para el método anteriormente publicado.

Y aunque uno puede obtener separaciones que tienen mayor resolución duplicando la longitud de la columna, los resultados de replegado no mejoraron debido a que las concentraciones de los reductores y desnaturalizantes fueron infraóptimas . La Corrida 9 todavía proporciona, sin embargo, una mejora 4.7 veces mayor que el método publicado previamente.

En resumen, los resultados mostrados en la Tabla 1 demuestran que la separación del rSLPI, de los agentes desnaturalizantes y agentes reductores, usando RSPT'", promueve el replegado del rSLPI a una forma activa. Las separaciones tardan menos de 5 minutos, dan excelentes rendimientos y minimizan significativamente el volumen del material que se va a procesar posteriormente. Por lo tanto, los datos demuestran que la combinación de la cromatografía rápida de exclusión de tamaño con las condiciones adecuadas de almacenamiento y renaturalización de la proteína, mejoran significativamente el rendimiento total del proceso, en un proceso de replegado de la proteína.

Se hace constar que, con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o sustancias a que la misma se refiere.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para el replegado y renaturalización de proteínas, donde las proteínas logran su forma activa, y donde el proceso está caracterizado porque comprende: (a) hacer pasar una mezcla de la proteína desnaturalizada y de los agentes desnaturalizantes sobre un dispositivo de separación, donde el dispositivo de separación es capaz de fraccionar rápidamente la proteína de los agentes desnaturalizantes; y ;b) permitir que la proteína se repliegue

2. El proceso, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dispositivo de separación comprende una fase estacionaria, continua, capaz de efectuar la separación, basada en las diferencias en tamaño entre la proteína y las sales.

3. El proceso, de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque la fase estacionaria, continua, es una fase estacionaria enrollada.

4. El proceso, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la fase estacionaria enrollada comprende un material sorbente a base de celulosa.

5. El proceso, de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el material sorbente a base de celulosa es derivado.

6. El proceso, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la fase estacionaria enrollada comprende DEAE 60% algodón/40% poliéster derivado.

7. El proceso, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dispositivo de separación comprende una fase estacionaria particulada, capaz de efectuar la separación, basada en las diferencias de tamaño entre la proteina y las sales.

8. El proceso, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dispositivo de separación comprende una membrana capaz de llevar a cabo la separación, basada en la retención de la proteína, basados en el tamaño.

9. Un proceso para replegar y renaturalizar una proteína, donde la proteína logra su forma activa, y donde el proceso está caracterizado porque comprende: (a) hacer pasar una mezcla de proteína desnaturalizada y los agentes de desnaturalización, sobre una fase estacionaria enrollada; y (b) dejar que la proteína se repliegue.

10. El proceso, de conformidad con la reivindicación 1 o 9, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de rSLPI, BDNF, GDNF, NGF y NT-3.

11. El proceso, de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína es rSLPI.

12. Un proceso para replegar y renaturalizar rSLPI, donde el rSLPI logra su forma activa, y donde el proceso está caracterizado porque comprende: (a) hacer pasar una mezcla de la proteína rSLPI desnaturalizada y los agentes de desnaturalización, sobre una fase estacionaria enrollada, donde la fase estacionaria enrollada comprende DEAE 60% algodón/40% poliéster derivado; y (b) dejar que la proteína rSLPI se repliegue