MXPA97007549A - Vectores virales y su uso para tratar trastornoshiperproliferativos, en particular restenosis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a virus recombinantes defectuosos que contienen por lo menos un gen insertado que codifica toda parte de la proteína GAX o una variante de esta proteína, y a su uso terapéutico, en particular para tratar la restenosis postangioplástica.

Description

VECTORES VIRÓLES Y SU USO PARA TROTAR TRASTORNOS HIPERPRQLIFERATIVOS, EN PARTICULAR RESTENOSIS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a un método novedoso particularmente eficaz para tratar patologías asociadas con trastornos hiperproliferativos por medio de terapia genética. El método de conformidad con la invención consiste , más especialmente, en bloquear específicamente la proliferación de las células vasculares del músculo liso (VSÍ1C) por medio de la transferencia in vivo del gen gax. El método de la invención es particularmente apropiado para tratar la restenosis post-angioplástica por medio de la expresión excesiva del gen gax en la pared vascular. De conformidad con la presente invención, el gen gax puede transferirse por medio de vectores virales. Estos vectores son preferiblemente vectores adenovirales. Se han aislados varios genes que están ligados con la interrupción de la división celular. Así, los genes gas (específico de la interrupción del crecimiento: gas 1-6) y gadd (inductor de daño del ADN y de la interrupción del crecimiento: gadd34, gadd45 y gadd.153) se expresan fuertemente en células inactivas, es decir, células que están bloqueadas en la fase G0 del ciclo celular (Schneider y otros, Cell 1988, 54; 787-793, Del Sal y otros, Cell 1992, 12: 35.14-3521; Cowled y otros, Exp. Cell- Res. 1994, 211: 197-202; Brancolini y Schneider, J. Cell.

Biol. 1994, 124: 743-756; Zhan y otros, Mol. Cell. Biol. 1993, 13: 4242-4250; "Jackrnan y otros, Cáncer Res. 54: 5656-5662, L994). De conformidad con estos hallazgos sobre la expresión genética, la micromyección de la proteina de gas-1 bloquea la síntesis del ADN (DeJ Sal y otros, Cell, 1992, 70: 595-607). A la inversa, la adición de factores del crecimiento tales corno PÜGF (factor de crecimiento derivado de plaque+as) o suero fetal de becerro, disminuye la expresión de es+os genes en modelos ín vitro (Coccia y otros, Mol. Cell. Biol. J992, 12: 3514-3521). Este carácter específico de la expresión en relación al estado de la proliferación celular parece tener también su contraparte ín vivo. Así, el gen gas-1 se expresa fuertemen e en el útero de rata después de ovariectornía (Ferrero y Cairo, Cell. Biol. Int. 1993, 17, 857-862). En este mismo modelo animal, el tratamiento con estrógenos da co o resultado una proliferación celular que se refleja, dentro del útero, en un incremento en la expresión del proto-oncogen c-myc y en una disminución en la expresión del gen gas-1. Asimismo, en un modelo hepático de proliferación/regeneración, la expresión del gen gas-6 disminuye fuertemente cuatro horas después de hepatectomía parcial, es decir, en el período de transición de G0 a Gl; esta expresión se vuelve normal, probablemente una vez que se ha iniciado la división de los hepatocitos (Ferrero y otros, 3. Cell. Physiol. 1994, 158:263-269). El solicitante se ha interesado en un gen novedoso, es decir, el gen gax (gen de horneohloque específico de la interrupción del crecimiento), y ha demostrado ahora que este gen posee propiedades que son particularmente ventajosas para utilizarse en la terapia genética de trastornos hiperproliferativos, en particular restenosis. El gen gax se identificó inicialmente en una geno-teca de ADNc preparada a partir de aorta de rata. Codi ica una roteina de 303 aminoácidos. Su secuencia se ha caracterizado y su ADNc se ha clonado (Gorski y otros, Mol. Cell. Biol. 1993, 6, 3722-3733). El gen gax posee ciertas propiedades que son similares a aquéllas de los genes gas y yadd, ya que parece regular también la transición de GO/Gl en el ciclo celular. De la misma manera, los niveles de ARNrn «leí gen gax disminuyen en las VSMCs de rata por un factor de 10 después de dos horas de exposición a PDGF (Gorski y otros, Mol. Cell. Biol. 1993, 6, 3722-3733). La expresión del gen gax se reprime, por tanto, durante la respuesta rmtógena de las VSMC. Una ventaja del método de conformidad con la invención, estriba principalmente en el carácter específico de la expresión del gen gax. Así, en la rata adulta, el gen gax se expresa principalmente en el sistema cardiovascular (aorta y corazón). Por otra parte, la técnica de northern blotting no ha podido demostrar la presencia de ARNm del gen gax en el hígado, cerebro, estómago o músculo esquelético. La restenosis post-angioplástica es un trastorno hiperprol iterativo localizado, que se desarrolla después de una intervención no quirúrgica en la región de la placa ateroescl erótica. Asi, el tratamiento de una lesión ateróesele ó ica mediante angioplastia resulta muy frecuentemente (en hasta el 50% de los casos en ciertos estudios) en una restenosis consecutiva a lesión mecánica de la pared arterial. Un evento clave de es-te mecanismo es la proliferación y migración de las células vasculares del músculo liso (VSMC) de la túnica media hacia la túnica íntima, en particular debido a la ausencia de protección y/o realimentación provista por las células endoteliales de la túnica íntima. La capacidad para expresar selectivamente un gen antiproliferativo de conformidad con la invención, en las VSMC, representa una ventaja muy substancial. Otra ventaja del método de conformidad con la invención estriba también en el hecho de que el gen gax pertenece a la familia de genes horneo icos. Estos genes codifican factores de transcripción que contienen secuencias consenso (u homeodomimos) que reconocen regiones especificas en el ADN (u ho eobloques) (revisar: Gehpng y otros, Cell, 78: 211-223, 1994). El ho eodorní nio de la proteína del gen gax de rata está contenido en re los aminoácidos 185 y 245. De manera interesante, los genes homeoticos que se han identificado hasta la fecha participan en el control de la diferenciación/crecimiento celulares durante la embnogenesis, reforzando así el potencial terapéutico del método de conformidad con la invención (revisar: La rence y Morata, Cell 78: 181-189, 1994; Krurnlauf, Cell 78: 191-201, 1994).

Por lo tanto, la invención se refiere inicialmente a un virus recombinante defectuoso que contiene por lo menos un gen insertado que codifica toda o parte de la proteína GAX o de una variante de esta proteína. La invención se refiere también al uso de dicho virus para tratar patologías hiperproliferativas. En los virus de la invención, el gen insertado puede ser un fragmento de ADN complementario (ADNc) o de ADN genómico (ADNg), o una construcción híbrida que consiste, por ejemplo, de un ADNc en el que uno o más intrones se han insertado. El gen puede consistir también de secuencias sintéticas o semisintéticas. Como se indicó anteriormente, el gen puede ser un gen que codifica toda o parte de la proteina GAX, o puede ser una variante de esta proteína. Dentro del significado de la presente invención, el término variante denota cualquier mutante, fragmento o péptido que posee por lo menos una propiedad biológica de GAX, asi como también cualquier homólogo de GAX que se obtiene a partir de otras especies. Estos fragmentos y variantes pueden obtenerse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica, en particular mediante modificaciones genéticas y/o químicas y/o enzimáticas, o mediante hibridación o clonación de la expresión, lo cual. permite seleccionar las variantes de acuerdo con su actividad biológica. Las modificaciones genéticas incluyen supresiones, deleciones, mutaciones, etc.. Dentro del significado de la invención, el gen insertado es preferiblemente el gen que codifica toda o parte de la proteína GAX de rata o de su homologo de humano. Es más preferiblemente un flDNc o un ADNg. En general, el gen insertado incluye también secuencias que permiten que sea expresado en la célula infectada. Estas secuencias pueden ser secuencias que son naturalmente responsables de la expresión de dicho gen, si estas secuencias son capaces de funcionar en la célula infectada. Las secuencias pueden ser también secuencias de un origen distinto (responsables de expresar proteínas distintas o incluso proteínas sintéticas). En particular, las secuencias pueden ser secuencias de genes eucarióticos o virales, o secuencias derivadas que estimulan o reprimen La transcripción de un gen en una manera específica o no específica y en una manera inducible o no inducible. Como ejemplo, pueden ser secuencias promotoras que derivan del genoma de la célula que se desea infectar o del genoma de un virus, en particular los promotores de los genes adenovirales ElA y MLP, el CMV o el promotor LTR-RSV, etc.. Promotores eucarióticos que también pueden citarse son promotores ubicuos (HPRT, vimentina, actina, tubulina, etc.), promotores de filamento intermedios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP, etc.), promotores genéticos terapéuticos (tipo MDR, CFTR, fac+or VIII, etc.), promotores específicos de tejidos (promotor de actina en células de músculo liso), promotores que se activan preferencialmente en células en división, o también promotores que responden a ?n estímulo (receptor de hormona esteroide, receptor de ácido retinoico, etc.). Además, estas secuencias de expresión pueden modificarse mediante la adición de secuencias de activación, secuencias reguladoras, etc.. De otro modo, cuando el gen insertado no incluye secuencias de expresión algunas, puede insertase en el genoma del virus defectuoso hacia el extremo 3' de dicha secuencia. Además, el gen insertado incluye generalmente, hacia el extremo 5' de la secuencia de codificación, una secuencia de señal que dirige al polipéptido sintetizado en las vías secretorias de la célula objetivo. Aun cuando esta secuencia de señal puede ser la secuencia de señal GAX natural, puede ser también cualquier otra secuencia de señal funcional (aquella del gen p>ara la timidina cinasa, por ejemplo), o una secuencia de señal artificial. Los virus de conformidad con la presente invención son defectuosos, es decir, incapaces de duplicarse de manera independiente en la célula objetivo. En general, el. genoma de los virus defectuosos que se utilizan dentro del alcance de la presente invención carecen así de por lo menos las secuencias que son necesarias para la duplicación de dicho virus en la célula infectada. Estas regiones pueden eliminarse (totalmente o en parte), hacerse no funcionales, o substituirse mediante otras secuencias, en particular mediante el gen insertado. Preferiblemente, el virus defectuoso retiene no obstante las secuencias de su genoma que son necesarias para incorporar las partículas virales. El virus de conformidad con la invención puede derivarse de un adenovirus, de un virus adenoasociado (AAV) o de un retrovirus. De conformidad con una modalidad preferida, el virus es un adenovirus. Existen varios serotipos de adenovirus, cuya estructura y propiedades varían un poco. De estos serotipos, se da preferencia, dentro del alcance de la presente invención, a usar adenovirus de humano tipo 2 o tipo 5 (Ad 2 o Ad 5) o adenovirus de origen animal (véase la solicitud U094/26914) . Aquellos adenovirus de origen animal que pueden utilizarse dentro del alcance de la presente invención y que pueden citarse son adenovirus de origen canino, bovino, rnurino (ejemplo: Mavl, Beard y otros, Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, de ave o de simio (ejemplo: ?AV). Preferiblemente, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más preferiblemente un adenovirus CAV2 [cepa Manhattan o A26/61 (ATCC VR-800), por ejemplo]. Preferiblemente se utilizan, dentro del alcance de la invención, adenovirus de origen humano, canino o mixto. Preferiblemente, los adenovirus defectuosos de la invención comprenden los ITRs, una secuencia de incorporación y el ácido nucleico de interés. Todavía más preferiblemente, en el genoma de los adenovirus de la invención, por lo menos la región El es no funcional. El gen viral bajo consideración puede hacerse no funcional mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica, en particular mediante remoción total, substitución, deleción parcial, o la adición de una o más bases al(los) gen(s) bajo consideración. Dichas modificaciones pueden lograrse in vitro (en el ADN aislado) o in situ, por ejemplo utilizando las técnicas de manipulación genética o mediante tratamiento con agentes rnutagénicos. Otras regiones pueden modificarse también, en particular la región E3 (UO95/02697), la región E2 (UI094/28938 ) , la región E4 (U094/28152, 094/1.2649 y IO95/02697 ) y la región L5 (UO95/02697) . De conformidad con una modalidad preferida, el adenovirus de conformidad con la invención contiene una deleción en las regiones El y E4. De conformidad con otra modalidad preferida, contiene una deleción en la región El en la que la región E4 y la secuencia que codifica a GAX se insertan (véase FR94 13355). En los virus de la invención, la deleción en la región El se extiende preferiblemente a partir de los nucleótidos 455 a 3329 en la secuencia del adenovirus Ad5. Los adenovirus recombinantes defectuosos de conformidad con la invención pueden prepararse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica (Levrero y otros, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO 3. 3 (1984) 2917). En particular, pueden prepararse mediante recombinación homologa entre un adenovirus y un plásmido que lleva, entre otras cosas, la secuencia de ADN de interés. La recombinación homologa se efectúa después de cotransfectar ín dichos adenovirus y plásmido en una linea celular apropiada. Preferi lemente, la línea celular que se utilice debe (i) ser transformada por dichos elementos, y (ii) contener las secuencias que sean capaces de complementar la parte del genorna del adenovirus defectuoso, preferiblemente en forma integrada para evitar los riesgos de recombinación. Ejemplos de líneas celulares que pueden mencionarse son la línea celular 293 de riñon embrionario humano (Graham y otros, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) que contiene, en particular, integrada en su genorna, la parte izquierda del genoma de un adenovir?s Ad£> (12%), o también líneas celulares que sean capaces de complementar las funciones de El y E4 co o se describe, en particular, en las solicitudes Nos. W094/26914 y UO95/02697. Subsecuentemente, los adenovirus que se han multiplicado, se recuperan y purifican utilizando técnicas moleculares biológicas patrón, como se muestra en los ejemplos. Los virus adenoasociados (AAV) son virus de ADN de tamaño relativamente menor a la escala que se integran, en una forma estable y específica de sitio, en el genoma de las células que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir efecto alguno sobre el crecimiento, morfología o diferenciación celulares. Además, no parecen intervenir en patologías humanas. El genoma de los AAV se ha clonado, determinado su secuencia y caracterizado. Abarca aproximadamente 4700 bases y contiene una región de repetición terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que sirve como un origen de duplicación del virus. El resto del genorna se divide en dos regiones esenciales que llevan a cabo las funciones de incorporación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep que interviene en la duplicación viral y la expresión de los genes virales; y la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las proteínas de la cápside del virus. Se ha descrito en la literatura el uso de vectores derivados de los AAVs para transferir genes in vitro e in vivo (véase, en particular, U091/18088; UO93/09239; US 4,797,368, US5, 139, 941 y EP 488 528). Estas solicitudes describen varias construcciones derivadas de AAV en las que los genes rep y/o cap se eliminan y son substituidos por un gen de interés, y el uso de estas construcciones para transferir dicho gen de interés in vitro (en células cultivadas) o in vivo (directamente en un organismo). Los AAVs recombinantes defectuosos de conformidad con la invención pueden prepararse cotransfectando un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico de interés flaqueada por dos regiones de repetición terminales invertidas (ITR) de AAV, y un plásmido que lleva los genes de incorporación de AAV (genes rep y cap), en una linea celular que se infecta con un virus auxiliar de humano (por ejemplo, un adenovirus). Los AAV recombinantes que se producen se purifican después mediante técnicas patrón. La invención se refiere también, por lo tanto, a un virus recombinante derivado de AAV cuyo genoma abarca una secuencia que codifica a GAX flanqueado por las ITRs de AAV. La invención se refiere también a un plásrnido que abarca una secuencia que codifica a GAX flanqueado por dos ITRs de un AAV. Dicho plásmido puede utilizarse, ya que transfiere la secuencia de GAX, con el plásmido, donde sea apropiado, siendo incorporado en un vector liposo al (pseudo-virus) . La construcción de vectores ret ovírales recornbinant.es se ha descrito ampliamente en la literatura: véase, en particular, EP 453242, EP178220, Bernstein y otros, Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCor ick, BioTec nology 3 (1985) 689, etc. En particular, los retrovirus son virus de integración que infectan a células en división. EL genoma del retrovirus abarca principalmente dos LTRs, una secuencia de incorporación y tres regiones de codificación (gag, pol y env). En los virus recombinantes derivados de retrovirus, los genes gag, pol y env generalmente se pierden, totalmente o en parte, y son substituidos por una secuencia heteróloga de ácido nucleico de interés. Estos vectores pueden construirse a partir de diferentes tipos de retrovirus tales como, en particular MoMuLV ("virus de la leucemia de murinoe Moloney" ; también designados MoMLV), MSV ("virus del sarcoma de rnurinos Moloney"), HaSV ("virus del sarcoma de Harvey"), SNV ("virus de la necrosis del bazo"); RSV ("virus del sarcoma de Rous") o también virus Friend. En general, para construir retrovirus recombinantes que contengan una secuencia que codifique GAX de conformidad con la invención, se construye un plásmido que contenga, en particular, las LTRs, la secuencia de incorporación y dicha secuencia de codificación, y que se utiliza después para transfectar lo que se denomina como línea celular de incorporación, cuya línea celular es capaz de proveer en trans las funciones retrovi rales que son deficientes en el plásmido. En general, las líneas celulares de incorporación son asi capaces de expresar los genes gag, pol y env. Dichas lineas celulares de incorporación se han descrito en la técnica anterior, en particular la línea celular PA317 (USA, 861,719); la línea celular PsiCRIP (UO90/02806) y la línea celular GP+envArn-12 (UO89/07150) . Además, los retrovirus recombinanteß pueden contener modificaciones dentro de las LTRs para suprimirla actividad de transcripción, así co o también secuencias extensas de incorporación que incluyen una parte del gen gag (Bender y otros, J. Virol. 61 (1987) 1639). Los retrovir?s recombinantes que se han producido se purifican después por medio de técnicas patrón. Es particulármente muy ventajoso utilizar un adenovirus recombinante defectuoso para tratar la restenosis. Así, los adenovirus poseen una gran capacidad para infectar a las células vasculares proliferativas del músculo liso. Esto permite que cantidades relativamente bajas del principio activo (adenovirus recombinante) sean usadas, y también da como resultado una acción efectiva y muy rápida en los sitios que van a tratarse. Los adenovirus de la invención también son capaces de expresar el gen gax introducido a altos niveles, confiriendo asi en ellos una acción terapéutica muy eficiente. Además, debido a su naturaleza episó ica, los adenovirus de la invención sólo persisten por un tiempo limitado en las células proliferativas y, por lo tanto, tienen un efecto transitorio que está perfectamente adaptado al efecto terapéutico deseado. La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende uno o más virus recombinantes defectuosos tal corno se describió anteriormente. Dichas composiciones pueden formularse con vistas a administrarlos mediante las vías tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, etc. Preferiblemente, la composición de conformidad con la invención comprende excipientes que son farmacéuticamente aceptables para una formulación inyectable, en particular para una inyección en la pared vascular. Estos excipientes pueden, en particular, ser soluciones salinas isotónicas estériles (fosfato onosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, etc., o mezclas de dichas sales), o excipientes secos, en particular composiciones liofilizadas que, por medio de la adición, según pueda ser el caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permite que las soluciones inyectables sean constituidas. El excipiente puede ser también un hidrogel que se prepara a partir de cualquier polímero biocompatible o polímero no citotóxico (hornopolimero o heteropolimero) . Dichos polímeros se han descrito, por ejemplo, en la solicitud IO93/08845. Algunos de ellos corno, en particular, aquellos obtenidos a partir de oxido de etileno y/o propileno, se obtienen en el comercio. En su uso para tratar patologías que est n ligadas a trastornos hiperproliferati vos, los adenovirus recoinbmante defectuosos de conformidad con la invención pueden administrarse en formas distintas, en particular por medio de inyección. Preferiblemente, para tratar la restenosis, los adenovirus de la invención se administran directamente a la pared del vaso sanguíneo por medio de un balón de angioplastía que se recubre con una p>elícula hidrofílica (por ejemplo un hidrogel) que se satura con los adenovirus, o por medio de cualquier otro catéter que contenga una cámara de infusión para la solución adenoviral, la cual puede aplicarse asi en una manera precisa al sitio que va a tratarse y permite que los adenovirus sean liberados localnente y eficientemente en ei nivel de las c lulas que van a tratarse. De manera ventajosa, este método de administración permite infectar un alto porcentaje (hasta 9.6%) de las células de la túnica media, que constituyen el objetivo preferido para trata la restenosis, mientras que los métodos de administración normales (inyección intravenosa, por ejemplo) no permiten que estas células sean infectadas a algún grado muy significativo. El método del tratamiento de la invenci n consiste ventajosamente en introducir una composición que comprende un hidrogel saturado con adenovirus recombinantes en el sitio que va a tratarse. El hidrogel puede depositarse di ectamente sobre la superficie del tejido que va a tratarse, por ejemplo, durante una intervención quirúrgica. De manera ventajosa, ei hidrogel se introduce en el sitio que va a tratarse por medio de un catéter, por ejemplo, un catéter de balón, en particular* a la hora de la angioplastía. En una manera particularmente ventajosa, el hidrogel saturado se introduce en el sitio que va a tratarse por medio de un catéter de balón. Las dosis del virus que se utilizan para la inyección pueden ajustarse de conformidad con parámetros distintos, en particular de conformidad con el método de administración utilizado y la duración deseada del tratamiento. En general, los virus recornbina tes de conformidad con la invención se formulan y administran en la forma de dosis de entre 10* y ÍO1* pfu/ml. En el caso de AAVs y adenovirus, pueden utilizarse también dosis de 106 a ID10 pfu/ml. El término pfu ("unidad de formación de placa"), corresponde a la capacidad infecciosa de una suspensión de vi nones, y se determina infectando un cultivo apropiado de células y midiendo, generalmente después de 48 horas, el numero de placas de células infectadas. Las técnicas para determinar el título de pfu de una solución viral están bien documentadas en la literatura. La presente invención ofrece medios novedosos y muy eficientes para tratar o prevenir patologías ligadas a trastornos hiperproliferativos tales como la restenosis.

Ademas, este tratamiento puede aplicarse tanto a humanos corno a animales tales co o ovejas, ganado, animales domésticos (perros, gatos, etc.), caballos, peces, etc.. La presente invención se describe de forma más completa utilizando los ejemplos que siguen y que deben considerarse co o ilustrativos y no como limitantes.

LEYENDAS DE FIGURAS Figura 1 : Representación del plásmido pCol. Figura 2 : Representación del plasrnido ?XL-CMV-Ga?HA . Figura 3 : Localización nuclear de la oteina GAX-HA en las VSMCs transfectadas con pXL-CMV-Ga?HA . Figura 3A : VSMCs transfectadas con vector pCGN (ausencia de inserto GAX). Figura 3B : VSMCs transfectadas con vector pXL-CMV-G xHA . Figura 4 : Localización nuclear de la protema GAX-HA en VSMCs tratadas con Ad-CMV-Gax. Figura 5 : Efecto de Ad-CMV-GAX sobre la proliferación de VSMCs (t=24 horas). - Las VSMCs se cuentan 24 horas después de haber sido tratadas con Ad-CMV-Gax (1000 p u/célula) o con un adenovirus control (Ad-RSV-ßGal, 1000 pfu/célula) . El crecimiento celular se bloquea (FCS a 0.5%) o estimula (FCS a 20%). Figura 6 : Efecto de Ad-CMV-GAX sobre la proliferación de VSMCs (t=48 horas).

- Las VSMCs se cuentan 48 horas despu s de haber sido tratadas con Ad-CMV-Gax (1000 p u/ célula) o con un adenovi ?s control (Ad-RSV-ßGal, 1000 pfu/célula). El crecimiento celular se bloquea (FCS a 0.5%) o estimula (FCS a 20%) Figura 7 : Efecto de Ad-CMV-Gax sobre la viabilidad de VSMCs que se incuban en presencia de suero fetal de becerro (FCS a 20%). - Condiciones experimentales, véase figura 6. Figura 7A : Células que no se tratan con adenovirus. Figura 7B : Células que se tratan con Ad-RSV-ßGal. Figura 7C : Células que se tratan con Ad-CMV-Gax. Figura 8 : Efectos de Ad-CMV-Gax y Ad-RSV-ßGal sobre arterias carótidas de rata después de lesión con un catéter de balón. Figura 8A : Medición del área de superficie intima. Figura 8B : Medición de la relación de la superficie intima respecto de la superficie media. Figura 8C : Medición del estrechamiento lummal. Figura 9 .- Secciones transversales arteriales de vasos control y tratados. Figura 9A : Vasos control tratados con Ad-RSV-ßGal. Figura 9B : Vasos tratados con Ad-CMV-Gax.

TÉCNICAS BIOMOLECULARES GENERALES Los métodos patrón que se utilizan en biología molecular, tales como extracciones preparativas de ADN de plasri os, centrifugación de ADN de plásridos en un gradiente de cloruro de cesio, electroforesis sobre geles de agarosa o de acrilarnida, purificación de fragmentos de ADN mediante electroelucion, extracción de proteínas con fenol o con fenol/cloroformo, precipitación de ADN en un medio salino utilizando etanol o utilizando isopropanol, transformación en Eschericia coli, etc., son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen ampliamente en la literatura CMa iatis T. y otros, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1 82; Ausubel F.M. y otros, (eds), "Current Protocois in Molecular Biology", John liley a Sons, New York, 19871. Los plásmidos del tipo ?BR322 y pUC y los fagos de la serie M13 se obtuvieron comercialmente (Bethesda Research Laboratories) . Para ligaciones, los fragmentos de ADN pueden separarse de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, extraerse con fenol o con una mezcla de fenol/cloroformo, precipitarse con etanol e incubarse después en presencia de ADN ligasa de T4 (Biolabs) de conformidad con las recomendaciones del proveedor. Los extremos salientes 5' pueden cubrirse utilizando el fragmento Klenow de la ADN poli erasa I de E. coli (Biolabs), de conformidad con las especificaciones del proveedor*. Los extremos salientes 3' se destruyen en presencia de ADN polimerasa de T4 (Biolabs), que se utiliza de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Los extremos salientes 5' se destruyen mediante tratamiento cuidadoso con SI nucleasa. La rnutagenesis dirigida al sitio ?n-v?tro utilizando oligodesoxmucleótidos sintéticos, puede llevarse a cabo de conformidad con el método desarrollado por Taylor y otros, CNucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] utilizando el equipo distribuido por Amersham. La amplificación enzimatica de fragmentos de ADN por medio de la técnica denominada PCR F reacción en cadena catalizada por polirneraea] , Sai i R.K. y otros, Science 230 (1985) 1350-1354; Mullís K.B. y Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350], puede efectuarse utilizando un ciclizador térmico de ADN (Perkm Elrner Cetus) de conformidad con las especificaciones del fabricante. La secuencias de nucleótidos pueden averiguarse por medio del método desarrollado por Sanger y otros, CProc. Nati.

Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] utilizando el equipo distribuido por Amersham, EJEMPLO 1 Construcción del vector pxL-CMV-Gax"* , que lleva el gen que codifica para la proteína gax de rata bajo el control del promotor CMV Este ejemplo describe la construcción de un vector que contiene el ADNc que codifica para la proteina gax (eepiecie: rata) y la secuencias adenovirales que permiten que la recombinación ocurra. El epítope de la hernaglutinina del virus de la influenza (epítope HA1), que abarca 18 aminoácidos, se añade al extremo N-terminal de la proteína gax (Field y otros, Mol.Cell. Biol. 8 : 2159-2165, 1988). La adición del epítope de esta manera permite seguir la expresión de gax, en particular mediante técnicas de inmunofluorescencia, utilizando anticuerpos que se dirigen contra el. epítope HA1. Además de su sensibilidad, este método, al mismo tiempo, permite eliminar, tanto in vivo como in vitro, el ruido del fondo que corresponde a la expresión de las proteínas gax endógenas. 1.1. Construcción del plás ido pCol. A - Construcción del plásmido pCE. De todos los fragmentos clonados, el fragmento EcoRl/Xbal que corresponde al extremo izquierdo del genorna del adenovirus Ad5, fue el primero que pudo clonarse entre los sitios EcoR y Xba del vector pIC19H. Esto genera el plásmido 2 pCA. El plásmido pCA fue cortado después con Hinfl, y sus extremos salientes 5' fueron cubiertos utilizando el fragmento KLenow de la ADN poli e asa I de E. coli; después fue cortado con Ecorl. El fragmento del plásmido pCA que fue así generado, y que contiene el extremo izquierdo del genoma del adenovirus Ad5, se clonó después entre los sitios EcorL y Smal del vector PIC20H (Marsh y otros, Gene 32 (1984) 481). Esto genera el plásmido pCB. El plásmido p>CB fue cortado después con EcoRI y sus extremos salientes 5' fueron cubiertos utilizando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli; después fue cortado con BamHI. El fragmento del plásmido pCB que fue asi generado, y que contiene el extremo del Lado izquierdo del genoma del adenovirus Ad5, se clonó después entre los sitios NruI y BglII del vector pIC20H. Esto genera el plásmido pCE una característica ventajosa del cual es que posee los 382 primeros pares de base del adenovirus Ad5 seguido de un sitio de clonación múltiple.

B - Construcción del plásmido PCD' Los fragmentos (3346)/SstI (3645) y Sstl (3645)/NarI (5519) del genoma del adenovirus Ad5 se ligaron en primer lugar entre sí y se clonaron entre los sitios Clal y BarnHI del vector pIC20H, generando así el plásmido pPY53. El fragmento Sall/Taql del plásmido pPY53 (preparado a partir de un fondo madre), que contiene una parte del genoma del adenovirus Ad5 entre los sitios Sau3A (3346) y Taql (5207), se clonó después entre los sitios Salí y Clal del vector plC20H, generando asi el plásmido pCA'. El fragmento Taql (5207)/NarI (5519) del genoma del adenovirus Ad5, preparado a partir de un fondo madre, y el fragmento Sall-Taql a partir del plásmido pCA' se ligaron después entre sí y se clonaron entre los sitios Salí y NarI del vector ?IC20H. Esto genera el plásmido pCC. El fragmento NarI (5519)NruI (6316) del genoma del adenovirus Ad5, preparado a partir del fondo madre, y el fragmento SalI/NarI del plásmido PCC se ligaron después entre si y se clonaron entre los sitios Salí y NruI del vector pIC20R. Esto genera el plásmido pCD'.

C - Construcción del plásmido pCOl La digestión parcial del plásmido pCD' con Xhol y la posterior digestión completa con Salí genera un fragmento de restricción que contiene la secuencia del adenovirus Ad5 del sitio Sau3A (3446) al sitio NruI (6316). Este fragmento se clonó al sitio Salí del plásmido pCE. Esto genera el plásrnido pCOl (Figura 1), que contiene la parte del lado izquierdo del adenovirus Ad5 hasta el sitio Hinfl (382), sitio de clonación múltiple y el fragmento Sau3A (3446)/NruI (6316) del adenovi us Ad5. 1.2. Construcción del vector pXL-CMV-Ga?HA ( compárese la Figura 21 Se clonó el ADNc de Gax entre los sitios Xbal y BarnHI del vector pCGN (Tanaka y Herr, Célula 60 : 375-386, 1990). El vector resultante, pGCN-Gax, contiene la secuencia promotora y rnejoradora temprana del cito egalovirus (CMV) (-522, +72; Boshart y otros, Célula, 41 : 521-530, 1985), la secuencia principal de la tirnidina quinasa del virus del herpes simplex, incluyendo el codón de iniciación AUG, asi como los tres primeros aminoácidos (+55, +104; Rusconi y Ya arnoto, EMBO J., 6 : 1309-1315, 1987), la secuencia que codifica el epítope de HA1 CY P Y D V P D Y A S L 66 P (ID DE SEC. No. 1)], el ADNc de gax de rata y, finalmente, la secuencia de poliadenilación del. gen de ß-globina de conejo (Pábo y otros, Célula, 35 : 445-453, 1983). Se cortó después el vector pCGN--Gax con Xrnnl y Sfil, y el fragmento resultante, que contenia el promotor, la secuencia de ADNc y la de poliadenilación, se introdujo, después de tratarse primero con Klenow, al sitio de EcoRV del vector promiscuo pCOl, que contenia las secuencias adenovi ales requeridas para la recombinación. El plásmido que se obtuvo fue designado ?XL-CMV-Ga?HA (compárese la Figura 2).

EJEMPLO 2 DEMOSTRACIÓN DE LAS PROPIEDADES INHIBIDORAS DE PROLIFERACIÓN DEL PLASMIDO pXL-CMV-gax-HA.

Este ejemplo describe procedimientos comparativos que pueden usarse para demostrar, in vitro y al único y al mismo :*R tiempo, la calidad de los vectores homólogos de recomendación (compárese el Ejemplo 1) en lo que respecta a la expresión (detección de la proteína gax y el etítope HA) y en Lo que respecta a la actividad (efecto en la proliferación celular). Se cultiva en las células de los músculos suaves vasculares ((VSMCs) digeriendo enzi áticamente la aorta de conejo de NZU usando un método adaptado de Charnley y otros, (Cell Tissue Res. 177 : 503-522 1977). Brevemente, una vez que se ha removido, se incuba la aorta de conejo a 37°C durante 45 minutos en presencia de colagenasa (CoLLagenase II, Cooper Bionedical). Se lleva a cabo una segunda digestión aproximadamente durante dos horas en presencia de colagenasa y elastasa (Biosys), dando lugar asi a una suspensión celular. Se mantienen las células en presencia del 20% de suero de ternera fetal y se usan para todas las pruebas (compárese ás adelante) antes de la décima pasada. En todos esos experimentos, las células de los músculos lisos se caracterizan por su inmunoetiquetamiento por medio de un anticuerpo de actina anti-aSM (F-3777, Sigma). A fin de verificar la calidad de los vectores de expresión (compárese el Ejemplo 1), se monitorea la presencia y la ubicación de la proteína gax por inmunofluorescencia para cada construcción. Para hacer esto, las células de los músculos lisos o las células 3T3 se transfectan con los plásmidos pXL-CMV-Ga?HA y pCGNgax en presencia de una mezcla de DOSPA/DOPE (Lipofectamme, Gibco BRL). Se incuban las células en presencia de un complejo de ADN/liposo a de un medio de cultLvo que carece de suero de ternera fetal durante 4 a 8 horas (duración óptima : 8 horas para los SMCs). Después de encubar durante 24 horas en presencia de suero de ternera fetal, las células se cultivan en un portaobjetos de microscopio (Titertek), con miras a la inmunofluorescencia, durante otras 24 horas. Se fijan después las células en presencia de paraformaldehido al 4% y se permeabilizan subsecuentemente añadiendo tritón al 0.1%. Después de saturar- las células en presencia de albúmina de suero bovino (BSA, Sigrna), se añaden en sucesión anticuerpo anti-HA (12CA5, Boehringer Mannhei ) y después anticuerpo conjugado con fluoresceina. Los experimentos de inmuno luorescencia llevados a cabo simultáneamente en células NIH3T3 y en cultivo primario de VSMCs de conejo demuestran que tanto el plásmido pCGNgax como el plásrnido "promiscuo" pXL-CMV-Ga?HA no codifican en efecto una proteína que está ubicada en el núcleo (compárese con la Figura 3A : plásmido de control; 3B : plásmido ?XL-CMV-Ga?H ) . Además, después de la extracción de las proteínas nucleares de las células transfectadas con pXL~CMV-GaxH , se puede demostrar, por medio del análisis Western Blotting, una proteína que se detecta con anticuerpos dirigidos contra el epitope HA. Se determinó después el efecto de los vectores anteriores en la proliferación celular. A fin de hacer esto, se usó un método indirecto que se basa en medir la formación de colonias. Brevemente, se emplean las células e briónicas de ratón NIH3T3 para llevar a cabo las pruebas de formación de colonias usando un método que se adaptó de parte de Schweighoffer y otros, (Mol. Cell. Biol. 1993, 13 : 39-43). Brevemente, se cotransfectan las células con ?n plásrnido que tiene el gen para la resistencia a la neomicina y con ?n exceso del vector de interés (pCGNgax o pXL-CMV-Ga?HA ) . Después de un período de selección en G418, se manchan las colonias de una solución de carbolfucsina (Diagnostica, Merck) y se cuentan. Los resultados del experimento representativo, que se dan en el. Cuadro I, demuestran una disminución en el número de colonias en el caso de las células transfectadas con pCGNgax.

CUADRO 1 (i) vector de control pCGN: ausencia del inserto de gax (*) p<0.01 EJEMPLO 3 CONSTRUCCIÓN DE UN ADENOVIRUS RECOMBINANTE Ad-CMVqax El vector pXL~CMV-Ga?HA f que se preparó en el Ejemplo 1, se lianealizó y se contransfectó subsecuentemente, para su recornbinación, con un vector adenoviral deficiente a las células auxiliares (línea celular 293) que suministró en trans la funciones codificadas por las regiones El (ElA y AlB) del adenovirus. Se obtuvo el Ad-CMVgax por medio de la recornbmación homologa m vivo entre el adenovirus Ad.RSVßgal (Atrat ord Perricaudet y otros, 3. Clin Invest 90 (1992) 626) y el vector pXL-CMV-GaxHA de acuerdo con el siguiente protocolo: vector pXL-CMV~GaxH , linealizado con la enzima X nl y el adenovirus Ad.RSVßgal, linealizada con Clal, se contransfectaron a la línea celular 293 en presencia de fosfato de calcio a fin de hacer posible que tenga lugar la recombínación homologa. Los adenovirus recombmantes que se generaron de esta manera fueron seleccionados por purificaci n de placa. Después del aislamiento, se amplifica el adenovirus recombmante en la linea celular 293, dando por resultado un sobrenadante de cultivo que cont-iene el adenovirus defectuoso recombínante no purificado que tiene un título de aproximadamente 10*° pfu/ml. Ci.ei purifican las partículas virales por centrifugación en un gradiente de cloruro de cesio de acuerdo con las técnicas conocidas (véase, en particular, Graharn y otros, Virology 52 (1973) 456). Se almacena eL adenovirus Ad-CMVgax a -80°C en glicerol al 20%.

EJEMPLO 4 DEMOSTRACIÓN DE LAS PROPIEDADES INHIBIDORAS DE PROLIFERACIÓN DEL ADENOVIRUS Ad-CMVgax Este ejemplo describe los procedimientos experimentales que pueden usarse para demostrar, al único y al mismo tiempo, la calidad del adenovirus recornbinante en términos de la producción de la proteína gax y en términos de la actividad biológica (efecto en la poliferación celular). Se incuban los VSMCs de la aorta de conejo en presencia del adenovirus Ad-CMCgaxHA y un adenovirus de control (ad~RSVßGal : adenovirus reco binante que expresa la ß-galactocidasa bajo el control del promotor RSV), que se diluye en el medio de cultivo (DMEM, 0.5% FCS). Después de aproximadamente una hora a 37°C en una atmósfera húmeda, el medio que contiene la solución adenoviral se separa aspirando y es reemplazado por el medio de cultivo (DMEM, 0.5% FCS) por un periodo de 18 a 24 horas. Se añade después el medio rico en FCS (concentración final de FC?: 20%) a fin de estimular la proliferación celular y se cuentan las células 24 horas y 48 horas después. Además, a 24 después de añadir la solución adenoviral, se momtorea la expresión de la proteina gax por los VSMCs mediante las técnicas descritas en el Ejemplo 2 , es decir la etiquetación nuclear por medio de inmunofluorescencia (ubicación de la proteína) y también mediante el análisis Western Blotting. La proteína producida por el adenovirus reco binante es detectado eficazmente por anticuerpos que reconocen el epitope HA y poseen la misma movil dad electroforética que la proteína gax que se detecta en el núcleo de los VSMCs que se transfectan con pCGNgax o pXL-CMV-GaxH . La Figura 4 ilustra la ubicación de la proteína Gax en los VSMCs que se incuban en presencia de Ad-CMVgaxHA. Los resultados de un experimento representativo, que se muestran en la Figura 4, demuestran una disminución notable en el numero de células después de la adición del virus Ad-CMVgaxHA. Por otro lado, no se observa esta reducción en el numero de células después del tratamiento con el adenovirus de control usado a la misma concentración (M.O.I. 1000). Hemos verificado en paralelo, por medio de in unofluorescencia, que esta alta multiplicidad de infección haga posible ya sea que el gel marcador ß-gal (uso de anti-E.Coli. anticuerpo ß-gal, Monosan) o la proteína gax (uso del anticuerpo anti-HArn compárese con el Ejemplo 2) se exprese en más del 90% de la población de VSMCs de conejo. La adición del virus ad-RSV-ßgal se asocia con el efecto citoestatico débil (-13%) después de cultivar durante 24 horas en presencia de suero de ternera fetal (20%). En las mismas condiciones experimentales, el tratamiento con Ad-CMVgaxHA conduce a una disminución del 57% en el numero de células (compárese con la Figura 5). La actividad biológica del virus Ad-CMVgaxHA se acentúa muy obviamente después de 48 horas de cultivo y podrían asociarse incluso con la muerte celular* (compárese con las Figuras 6 y 7). Por lo tanto, la obstrucción de la poliferacion que es causada por Ad-CMVgaxHA se asocia con una reducción pronunciada en el numero de células que puede detectarse después de cultivar por un período de 24 horas (compárese la Figura 5). Interesantemente, se observa este efecto de Ad-CMVgaxHA en células que se estimulan con una alta concentraci n de FCS (20%) pero no en células que se privan de FCS (0.5%) (compárese con la Figura 6). Este ejemplo demuestra por lo tanto que un adenovirus reco binante que codifica la proteína gax pueden obstruir la división celular eficazmente sin tener algún efecto significante en la vialidad de las células que son obstruidas en la fase GO de su ciclo. Se ilustra también en la Figura 7 en efecto del adenovirus Ad-CMVgaxHA en la viabilidad de las VSMCs en cultivo. Se confirman las propiedades inhibitorias del Ad~ CMVgxHA en la síntesis del ADN mediante los experimentos de incorporación de bromodeoxiundina (BrdU)-. Brevemente, a 24 horas después de haber añadido el adenovi ?s, se i cuban las VSMCs en presencia de FCS (LO a 20%) y BrdU (10 µM), que se incorpora en lugar de ti ma a las células en la fase de síntesis del ADN y puede detectarse con anticuerpos específicos. Se cuantifica la incorporación de BrdU por medio de citometna de flujo. Puede emplearse la misma metodología de citornetría de flujo para contemplar el progreso hecho por las VSMCs de conejo tratadas con Ad-CMVgaxHA- en su ciclo celular. El tratamiento con Ad-CMVgaxHA va acompañado por la obstrucción del ciclo celular en La fase G0/G1.

EJEMPLO 5 INHIBICIÓN IN VIVO DE LA HIPERCLASIA INTIMA USANDO UN GAX DE ADENOVIRUS Este ejemplo muestra la eficacia de los adenovirus reco binantes en un modelo de patología vascular. Este modelo de lesión arterial que se usa se apoya en La raspadura de la carótida de rata (Clows y otros, Lab Inverst 49 (1983) 327-333). En este modelo, las VSMCs se desdiferencian, proliferan y migran para formar una neoíntima que puede ocluir parcialmente la arteria dentro de las dos semanas del daño. Se anestesiaron ratas de Sprague-Dawley por inyección intraperitonial de pentobarbital (45 rng/mk). Después de la arterioto ia externa de la carótida, se desnudaron las arterias carótidas con un catéter de balón y se expusieron a 1.1Q5 pfu de Ad-CMVgaxHA o Ad-RSVß-Gal . Se usa el adenovirus en una solución que contiene poloxa a 407 al 15%, que facilita la transferencia del ge.l del adenovirus. Después de una incubación de 20 minutos, se retiró la solución de virus y se removieron las ligaduras para restaurar- la circulación. Se sacrificaron las ratas dos semanas después y se realizaron análisis morfonétrieos cualitativos sobre secciones transversales de los vasos tratados. Se presentan los resultados en las Figuras 8 y 9. Los resultados obtenidos muestran que todas las nueve arterias carótidas transfectadas con Ad-RSVß-Gal tuvieron una fuerte proliferación de VSMCs y desarrollaron considerable espesamiento no intimo. El área de la neoíntima fue de 0.186 +/- 0.02 mm2 (SEM) con un intervalo de 0.10 a 0.28. La patentencia lu inal fue limitada correspondientemente por 40 +/- 4% intervalo de 21 a 63), Figura 8C. La relación intima : medio fue de 1.51 +/- 0.1 intervalo de 0.87 a 2.17). Estos resultados son similares a los obtenidos previamente de los vasos de control tratados con solución salina. En contraste, el tratamiento con Ad-CMVgaxHA produjo marcadamente la respuesta patológica al daño con balón. Para los vasos tratados con Ad-CMVgaxHA, el área media de las lesiones neoíntimas fue de 0.076 +/- 0.02 rnrn2 , (intervalo de 0 a 0.19), el estrechamiento lurninal se redujo a se redujo a 17.5 +/- 5%. El análisis estadístico confirmó que el tratamiento con Ad-CMVgaxHA inhibía significantemente el desarrollo del esp>esarniento intimo respecto a los controles de Ad-RSVß-Gal. Específicamente, el tratamiento con Ad-CMVgaxHA disminuyó la relación íntima : medio en un 69%, el área íntima en ?n 59% y el estrechamiento luminal en un 56% (Figuras 8A y BB). El notable efecto en La hiperplasia íntima es acentuado aún más por los resultados obtenidos con secciones transversales de animales de control (Figura 9A) o tratados (Figura 9B). Este ejemplo demuestra la actividad muy eficaz de la detención del crecimiento in vivo de la construcción de Ad-CMVgaxHA. Esta actividad es muy específica y no se observa en los animales de control. Los resultados presentados muestran claramente la actividad terapéutica del Ad-CMVgaxHA en la morfología vascular y, en particular, en la hiperplasia que se asocian con la restenosis de post-angioplastia. El uso de ?n virus, tal como un adenovirus para transferir el gen de Gax in vivo es particularmente eficaz. Este método es además ventajoso ya que se basa en el procedimiento de reemplazo de genes. Este método es único en el sentido de que combina tanto la eficacia de suministro como el gen terapéutico que despliega dos propiedades terapéuticas: detención del crecimiento y expresión constitutiva en el sistema vascular. La transferencia del gen de Gax de acuerdo con la invención induce a una regresión específica de desorden hiperproliferativo en el vaso vascular- y normaliza asi las funciones arteriales. La transferencia local del gen de Gax de la invención es también particularmen e ventajosa en el sentido de que no interfiere con el proceso de reendotelización después de la lesión de la arteria. Por otro lado, además del impacto directo en la proliferación celular y la morfología vascular, la transferencia del gen de Gax de acuerdo con la invención puede ejercer también ?n efecto indirecto benéfico en la síntesis de la matriz extracelular y en la remodelación. Estos resultados muestran claramente que la transferencia del gen de Gax de acuerdo con la invención es ?n enfoque nuevo poderoso para el tratamiento de las lesiones vasculares después de la angioplastia.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: NOMBRE: CASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY CALLE: CIUDAD: Cleveland ESTADO: Ohio PAÍS: E.U.A. CÓDIGO POSTAL: 441.06 (i) SOLICITANTE: NOMBRE: BRABELLEC, Didier CALLE: 1, Rué Saint-Benoit CIUDAD: 94210 La Varenne-Saint Hilaire ESTADO: PAÍS: Francia CÓDIGO POSTAL: (i) SOLICITANTE: NOMBRE: WALSH, Kenneth CALLE: 207 Judy Farm Road CIUDAD: Carlisle ESTADO: Massach?setts PAÍS: E.U.A. CÓDIGO POSTAL: (i) SOLICITANTE: NOMBRE: ISNER, Jeffrey M. CALLE: 34 Brenton Road CIUDAD: Weston ESTADO: Massachusetts PAÍS: E.U.A. CÓDIGO POSTAL: 02193 (Ü) TITULO DE LA INVENCIÓN: VECTORES VIRALES Y SU USO PARA TRATAR TRASTORNOS HIPERPROLIFERATIVOS, EN PARTICULAR RESTENOSIS (Üi) NUMERO DE SECUENCIAS: 1 (iv) DIRECCIÓN PARA ENVIAR CORRESPONDENCIA (A) DESTINATARIO: Rhone-Poulenc Rorer Inc. (B). CALLE: 500 Areola Rd. 3C43 (C) CIDUDAD: Collegeville (D) ESTADO: PA (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 19426 (v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC COMPATIBLE (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: PCT (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (O CLASIFICACIÓN (Vil) (A) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: FR 95-04234 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-MAR-1995 (vill) INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTF (A) NOMBRE: Savitsky, Martin F. (B) NUMERO DE REGISTRO: 29,699 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: ST95022-US (IX) INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES (A) TELEFONO: (610) 454-3816 (B) TELEFAX: (610) 454-3808 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA MO. 1: (l) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: amino cido (C) TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA: pep+ido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA MO: 1: Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Virus recombinante defectuoso que contiene por lo menos un gen insertado que codifica toda o parte de la proteina Gax o de una variante de esta proteína.

2.- Virus de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque carece de las regiones de su genoma que son necesarias para su replicación en la célula infectada.

3.- Virus de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque es un adenovirus, preferiblemente del tipo Ad 5 o Ad 2.

4.- Virus de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque es un adenovirus de origen animal, preferiblemente canino.

5.- Virus de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque el gen insertado codifica toda o parte de la proteína Gax de rata o de una variante de esta proteína.

6.- Virus de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el gen insertado codifica la proteína Gax de rata o su homólogo humano.

7.- Virus de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque el gen insertado es un ADNc.

8.-- Vi us de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque el gen msert do es un ADNg.

9.- Virus de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque el gen insertado incluyen secuencias que le permiten expresarse en la célula infectada.

10.- Virus de conformidad con una de las reivindicaciones l o 2, caracterizado además porque el gen insertado incluye una secuencia de señales que dirige el polipeptido sintetizado a las vías secretorias de la célula objetivo.

11.- Adenovirus de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque contiene una supresión de toda o parte de la región El.

12.- Adenovirus de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado ademas porque contiene también una supresión de toda o parte de la región E4.

13.- Virus de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque es un virus adeno -asociado (AAV).

14.- Virus de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque es un retrovirus.

15.- Uso de un virus de conformidad con una de las reivindicaciones l o ?, para preparar una composición farmacéutica que está destinada al tratamiento o la prevención de patologías que estén relacionadas con desórdenes hiper*?roli erativos .

16.- Uso de conformidad con la reivindicación 15, para preparar una composición farmacéutica que está destinada al tratamiento de la restenosis.

17.- Composición farmacéutica que comprende uno o rnás virus recombinantes defectuosos de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2.

18.- Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque se presenta en forma inyectable y porque contiene de 10* a 1.01* pfu de adenovirus/rnl .

19.- Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además por-que contiene un adenovirus recombinante que se satura a un hidrogel.