MXPA97001384A - Vacuna viva para el tratamiento de enfermedadestumorales - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con la preparación y uso de una vacuna de células tumorales vivas, la cual contiene tres genes adicionales preparados por técnicas de ingeniería genética:a) el gen que codifica para una proteína de la superficie celular con actividad inmunoestimuladora, b) un gen de citosina y c) el gen de timidina cinasa. Los campos de aplicación de la invención son la medicina y la ingeniería genética. La vacuna viva propuesta debe su efecto al hecho de que es inducida una respuesta antitumoral sinérgica por la transferencia múltiple de genes que codifican par ala actividad inmunoestimuladora. Esto conduce a la repulsión confiable de las células de la vacuna que sean inyectadas por células capaces de multiplicarse como una vacuna. Como un marcador seguro adicional, las células de la vacuna son dotadas con los genes de la timidina cinasa, lo cual permite que las células de la vacuna sean eliminadas selectivamente in vivo. La expresión combinada de los genes con actividad inmunoestimuladora mejora el efecto de la vacuna en comparación con las vacunas de células tumorales de la técnica anterior, y una vacuna de células tumorales vivas es más efectiva que una vacuna que consiste de células que son incapaces de multiplicarse. Se pretende que la vacuna sea usada en la terapia genética de los pacientes con cáncer.

Description

VACUNA VIVA PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES TUMORALES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una vacuna viva contra enfermedades tumorales, su producción y su uso. Los campos de aplicación son la medicina y la ingeniería genética. Las vacunas contra enfermedades tumorales se conocen desde hace mucho tiempo. Las vacunas clásicas que han sido usadas con mucha frecuencia únicamente están compuestas de una mezcla de células tumorales irradiadas y adyuvantes tales como, por ejemplo, usados de Bacillus Calmette-Guerin (BCG) o Corynebacterium parvum. Después de dos décadas de evaluación clínica puede resumirse que esas vacunas no muestran un efecto reproducible (véase al artículo de revisión: Oettgen, H. y Oíd, L., La Historia de la Inmunoterapia del Cáncer, en: Biological Therapy of Cáncer, Eds. V. deVita, S. Hell an y S. Rosenberg, J. B. Lippincott Company 1991, p. 87-119) . Resultados recientes en modelos animales han mostrado que la transferencia y expresión de algunos genes de la citocina (por ejemplo, IL2, IL4, IL7, TNF, INF?) pueden suprimir el crecimiento de células tumorales modificadas genéticamente in vivo pero no in vi tro. Esta inhibición del crecimiento tumoral es el resultado de REP: 24192 una respuesta inmune inducida por la citocina transfectada. En muchos casos el tumor transfectado genéticamente es rechazado completamente (véase el artículo de revisión: Blan estein, Eur. J. Cáncer, 1994, en press) . De manera similar la expresión de la molécula B7, una proteína de la superficie celular con actividad coestimuladora para los linfocitos T, puede inhibir el crecimiento tumoral. Sin embargo, la cuestión terapéuticamente importante es si el rechazo del tumor transfectado genéticamente conduce a una memoria inmunológica persistente a largo plazo para las células tumorales. Esto podría ser reconocido por el hecho de que los animales que rechazaron un tumor transfectado genéticamente pueden finalmente también rechazar las células tumorales que no han sido administradas por transfección genética. Esto es también el caso en un grado limitado y actualmente se están llevando a cabo varios estudios clínicos basados en este descubrimiento en el cual las células tumorales irradiadas proporcionadas con un solo gen de la citocina están siendo usadas como vacunas (véase el artículo de revisión: Tepper, R. y Mulé, J., 1994 Hu . Gene Therapy 5, 153-164) . Se hace referencia estudios como estudios de terapia genética. En la DE-OS ""8 06 565 se describe una vacuna específica para un tumor, modificado con virus, la cual está comprendida de células tumorales de una preparación de operación de un paciente quien fue tratado tardíamente, las cuales habían sido inactivadas por irradiación y con virus NDV bajo condiciones estériles. La aplicación de esta vacuna se mejoró de acuerdo a la DE-OS 39 22 444 mediante el uso de esta junto con citocinas administradas sistémicamente y opcíonalmente con factores estimulantes de la hematopoyesis y/o agentes antisupresores. Una desventaja de las vacunas usadas anteriormente es su baja efectividad. Esta aseveración se basa por un lado en los primeros descubrimientos que han mostrado que el efecto de la vacuna de una célula tumoral transfectada con un solo gen de la citocina no es mejor que el que se logra con una mezcla de célula tumoral/adyuvante (Hock et al., 1993, Cáncer Res. 53, 714-716). Como se mencionó anteriormente las mezclas de célula tumoral/adyuvante han mostrado clínicamente no ser efectivas. Por otro lado ni la expresión de una sola citocina ni la expresión de la molécula B7 sola conduce a un rechazo confiable del tumor. Es decir que un cierto porcentaje de los ratones que han sido inyectados con células transfectadas genéticamente desarrollan un tumor después del periodo de latencia, el cual con frecuencia se asocia con la pérdida de la producción de citocina (Hock et al., 1993, PNAS 90, 2774-2778). Esto prohibe él uso de las células tumorales que han sido transfectadas con un solo gen que codifica para la actividad inmunoestimuladora como vacunas para células tumorales vivas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de la invención es eliminar las desventajas de las vacunas conocidas, es decir su efectividad inadecuada junto con La necesidad de tener que inyectar células tumorales que son incapaces de proliferar. Se pretende desarrollar una vacuna viva por ingeniería genética la cual estimule el sistema inmune hacia las células tumorales que ya están en el cuerpo. Este objeto se logra mediante una vacuna de acuerdo a la reivindicación 1; las subreivindicaciones son variantes preferidas. Esta se produce en sistemas autólogos o alogénicos como se reivindica en la reivindicación 12 y se usa como se reivindica en las reivindicaciones 13 a 15.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La vacuna viva de acuerdo a la invención para el tratamiento de enfermedades tumorales con células tumorales modificadas genéticamente comprende un gen de citocina y un gen de proteína de membrana inmunoestimulador. Se usaron células tumorales autólogas o alogénicas capaces de proliferar, las cuales pueden adicionalmente contener uno o varios genes suicidas. Debe comprenderse que las citocinas son sustancias que inducen la diferenciación, proliferación y activación de las células inmunes . De acuerdo a la invención la vacuna viva puede comprender el gen para la interleucina-2, interleucina-4, interleucina-7, interferón o factor estimulador de la colonia de macrófagos granulocíticos (GM-CSF) como gen de la citocina; los genes de la proteína de membrana inmunoestimuladora son proteínas que activan las células T en particular el gen para la molécula coestimuladora de las células T B7. Los genes suicidas son sustancias las cuales convierten las sustancias activas en un producto tóxico; el gen de la timidina cinasa del virus del herpes simple (gen HSV-TK) o el gen de la citocina desaminasa son particularmente preferidos. La vacuna viva se usa como agente terapéutico especialmente para el tratamiento de enfermedades tumorales. El punto de partida para la vacuna puede ser cualquier célula tumoral deseada ( autóloga o alogénica). Se introdujeron tres genes terapéuticos en esta célula; esta transferencia genética puede ser por medio de cualquier método deseado (por ejemplo transferencia del gen retroviral) . Cada uno de los tres genes terapéuticos se acopló a un promotor (por ejemplo, repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney, factor de alargamiento 1, citomegalovirus) , los cuales actúan de manera constitutiva. Los tres genes se integran de manera estable y aleatoria al genoma de la célula tumoral. Los tres genes terapéuticos pueden opcionalmente estar presentes en uno o distribuidos en dos vectores. La transferencia genética exitosa se establece mediante marcadores de selección positivos (por ejemplo el gen de la neomicina, gen de la hidromicina) que están adicionalmente presentes en los vectores. El primer gen es un gen de la citocina (por ejemplo IL4, IL7) . La mayoría de la citocinas tiene numerosas funciones e induce la diferenciación, proliferación y activación de varias células inmunes. La secreción local de el gen de la citocina transfectada para las células tumorales in vivo conduce a una reacción inflamatoria y a una activación de las células inmunes (entre otras los linfocitos T) contra el tumor. El resultado es el rechazo del tumor en la mayoría pero no en todos los casos. Únicamente algunos de los animales que han rechazado el tumor transfectado por el gen de la citocina son inmunes hacia el tumor. El segundo gen codifica para la proteína superficial de la célula con actividad inmunoestimuladora (por ejemplo B7) . B7 usualmente se expresa sobre células presentadoras de antígenos y sirven, vía la interacción con sus ligandos CD28 o CTLA-4, como señal coestimuladora para la activación de los linfocitos T. En ausencia de B7 los linfocitos T estimulados vía el receptor de células T son dirigidos hacia un estado de anergía. Las células tumorales transfectadas con el gen B7 estimulan in vivo una respuesta inmune mediada por las células T la cual, sin embargo, solo algunas veces conduce a un rechazo del tumor y da como resultado un efecto de vacuna moderado. El tercer gen es uno de los llamados genes suicidas (por ejemplo el gen de la timidina cinasa o el del virus del herpes simple, HSV-TK) . El HSV-TK puede convertir el Gancyclovir no tóxico en un producto tóxico. Esto permite a las células tumorales que expresan el HSV-TK ser eliminadas selectivamente por la administración sistémica de Gancyclovir sin dañar el tejido normal. El gen HSV-TK sirve como un marcador seguro adicional para inactivar la vacuna viva contra células tumorales. La vacuna contra células tumorales de acuerdo a la invención producida por ingeniería genética pierde su efectividad si se usan células que son incapaces de proliferar (por ejemplo por irradiación o tratamiento con mitomicina C) . En las vacunas que han sido probadas anteriormente en humanos las células tumorales habían sido irradiadas puesto que el crecimiento de las células de la vacuna como un tumor representaba un riesgo de seguridad. En contraste con las células tumorales transfectadas con un solo gen, la doble transferencia genética de un gen de citocina y el gen B7 conduce a un rechazo tumoral del 100%. Este efecto sinérgico sorprendente de dos genes que codifican para la actividad inmunoestimuladora que puede lograrse por la invención, permite el uso de una vacuna de células vivas, la cual puede ser adicionalmente salvaguardada por la opción de activar el gen HSV-TK por Gancyclovir. Una característica distintiva adicional de la vacuna se debe a que la transferencia del gen de la citocina y B7 adquiere una mayor efectividad en comparación con las células que han sido transfectada únicamente con uno de los dos genes. Se pretende dilucidar la invención con mayor detalle mediante los siguientes ejemplos de aplicación.

Ejemplo de aplicación 1. Expresión de los genes de la citocina, B7 y HSV-TK en células tumorales Los ADNc para los genes de la citocina, B7 y HSV-TK pueden aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores adecuados y clonando en vectores apropiados (retrovirales) . Los retrovirus se producen con la ayuda de linajes similares de empaque conocidos (Pa317, Psi2) y las células tumorales de ratón se infectan con esos (plasmacitoma J558L y carcinoma de mammaadeno TSA) . La trasferencia genética exitosa se asegura con marcadores de selección (gen de la neomicina, gen de la hidromicina), los cuales se localizan en los vectores. La expresión de los genes de la citocina se detecta con ELISA comercialmente disponible o un ensayo biológico. El IL4 puede por ejemplo ser determinado por la proliferación dependiente de IL4 de las células CT.4S, el IL7 por la proliferación dependiente de IL7 del linaje celular IXN. La expresión de B7 se determinó tiñiendo las células tumorales con un anticuerpo anti-B7 marcado con fluorescencia. La expresión del gen HSV-TK se verificó adicionando Gancyclovir (1 - 10 µg/ml) al medio de cultivo durante un periodo de 10 - 14 días y determinando la muerte de las células tumorales. También se produjeron linajes celulares los cuales expresan ya sea únicamente IL4/IL7 o B7 o ambos genes juntos. Las células adicionalmente contienen el gen HSV-TK. 2. Rechazo de la vacuna de células tumorales por IL4/IL7 y B7 Se inyectaron cuatro millones de células tumorales J558L, J558-IL4, J558-B7, J558-IL4/B7 y 1 millón de TSA, TSA-IL7, TSA-B7 y TSA-IL7/B7 subcutáneamente en ratones BALB/c singeneicos de 6-8 semanas y el crecimiento del tumor se verificó durante un periodo de tiempo de al menos 6 meses. La células tumorales no transfectadas genéticamente o transfectadas con mock crecieron en todos los casos como un tumor. Entre el 17.6 y el 65% de los- ratones que recibieron únicamente células tumorales transfectadas con un solo gen también desarrollaron un tumor. Ninguno de los dos modelos tumorales (J558L y TSA) las células tumorales o transfectadas con IL4/IL7 y B7 fueron capaces de crecer como un tumor, ni aún en un solo caso. Se analizaron un total de 100 ratones. Los resultados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Rechazo de las células tumorales modificadas genéticamente en ratones BALB/c Células tumorales Número de ratones en % inyectadas con tumor/ratones en el experimento J558L 20/20 100 J558-IL4 6/34 17.6 J558-B7 14/59 23.7 J558-IL4/B7 0/80 0 TSA 20/20 100 TSA-IL7 6/20 30 TSA-B7 13/20 65 TSA-IL7/B7 0/20 0 3. Rechazo de la vacuna de células tumorales por Gancyslovir Puesto que las células tumorales transfectadas con el gen de la citocina/B7 son rechazadas de manera confiable, se probó el marcador del gen HSV-TK como marcador de seguridad en las células TSA que únicamente habían sido marcadas con el gen HSV-TK. Se inyectó un millón de células TSA o TSA-TK subcutáneamente en ratones BALB/c. Un día después los ratones fueron tratados intraperitonialmente durante un periodo de 5 días con 150 mg/kg de peso corporal de Gancyclovir o solución salina. El tratamiento con Gancyclovir no tuvo influencia sobre el crecimiento tumoral de las células TSA de origen (10/10 ratones con tumor), las células TSA-TK crecieron como un tumor en los ratones no tratados (10/10 ratones con tumor) pero se eliminaron en la mayoría de los casos en los ratones tratados con Gancyclovir (2/10 ratones con tumor) . De este modo el gen HSV-TK actúa ya como un marcador de seguridad y junto con el efecto sinérgico de la cítocina/B7 descrito anteriormente deberá asegurar una desactivación confiable de la vacuna de células tumorales vivas. 4. Efectividad de la vacuna de células tumorales modificadas genéticamente Se inmunizaron subcutáneamente ratones BALB/c con 4 millones de células. Esos grupos se inmunizaron con células J558L, J558-IL4, J558-B7, J558-IL4/B7 y un grupo se inmunizó con J558L/adyuvante de C. parvum. Con la excepción de las células J558L las cuales habían sido incapaces de proliferar por irradiación, todas las células se inyectaron vivas. Tres semanas después los ratones se inyectaron contralateralmente con 4 millones de células tumorales precursoras (desafío tumoral) y se verificó el crecimiento tumoral. Los resultados como se muestran en la Tabla 2 muestran que el efecto de la vacuna de las células J558-IL4/B7 fue mayor que el de las células J558-IL4 o J558-B7 o la mezcla de células tumorales/adyuvante .

Tabla 2. Efecto de vacuna de la vacuna de células tumorales modificadas genéticamente Células de la Ratones con desafio en % vacuna tumoral/ratones en el experimento ninguna 20/20 100 J558L, irradiada 20/20 100 J558-IL4 12/28 43 J558-B7 18/48 38 J558-IL4/B7 11/50 22 J558/adyuvante 5. Efecto de la vacuna viva comparada con las células tumorales irradiadas Todas las vacunas de células tumorales que habían sido usadas anteriormente en pacientes habían sido usadas en una forma irradiada por razones de seguridad puesto que las células tumorales transfectadas con un solo gen o las células tumorales mezcladas con un adyuvante con frecuencia crecen como un tumor. El descubrimiento de que las células tumorales transfectadas genéticamente tres veces descritas anteriormente son rechazadas de manera confiable les permite ser usadas como una vacuna viva. Como resultado la efectividad de la vacuna se incrementa. Si se inmunizan principalmente ratones BALB/c con 4 millones de células J558-IL4/B7 vivas o irradiadas y se inyectan contralateralmente tres semanas más tarde con 4 millones de células J558-pxßcsoras 60 % (6/10) de los ratones inmunizados con células irradiadas desarrollan un tumor pero el 0 % (0/10) de los ratones inmunizados con células vivientes desarrollan un tumor. 7. Efectividad de la vacunación La efectividad de la vacunación de las células que coexpresan IL-7/B7.1 es mayor que la de las células transfectadas con únicamente un gen individual y mayor que una mezcla de célula tumoral/adyuvante (C. parvum) . Para comparar la fuerza de la vacunación de las células TSA cotransfectadas con IL-7/B7.1 con la del adyuvante de C. parvum probado extensiva clínicamente o con células TSA no proliferantes, se inmunizaron grupos de ratones con 2.5xl05 células TSA-IL7, TSA-B7.1, TSA-IL7/B7.1 o precursoras viables con C. parvum. Adicionalmente se inmunizaron ratones con células TSA o TSA-IL7/B7.1 irradiadas (5000 o 10000 rad) o células TSA las cuales habían sido tratadas con mitomicina C (60 µ/ml) . Como una contraverificación se inyectaron ratones libres de tumor dos semanas más tarde en otro sitio con 2.5xl05 células no modificadas (tumor 'desafiante'). La Figura 1 muestra la frecuencia de los tumores y principalmente aquellos que crecieron de células de vacuna y aquellos que crecieron de las células de origen administradas más tarde. El crecimiento tumoral de las células de vacuna se evitó únicamente en todos los ratones cuando las células fueron irradiadas con 10000 rad o cuando las células cotransfectadas con IL-7/B7 habían sido usadas para la inmunización. 80% (8/10) de los ratones que habían sido inmunizados con células de origen irradiadas con 10000 rad y 30 % (3/10) de los ratones que habían sido inmunizados con células precursoras irradiadas con 5000 rad desarrollaron un tumor de las células de origen administradas más tarde. En el último grupo 20 % (2/10) desarrollaró un tumor de las células de vacuna. De manera análoga 80 % (8/10) de los ratones que habían sido inmunizados con células TSA tratadas con mitomicina C desarrollaron un tumor (20 % tumor primario, 60 % tumor esafiante' ) . En el grupo de células tumorales/C. parvum 25 % (5/20) de los ratones desarrollaron un tumor de las células de la vacuna y 5 % (1/20) de las células desafiantes. De aquellos ratones que rechazaron las células de vacuna TSA-B7.1 (60 %, 12/20), 5 % (1/20) desarrollaron un tumor esafiante' . En contraste los ratones pretratados con TSA-IL7 desarrollaron un tumor 'desafiante' en 25 % de los casos (5/20) y 5 % (1/20) desarrollaron un tumor de las células de la vacuna. En otras palabras el B7 expresado por las células tumorales condujo a un rechazo tumoral comparativamente pobre pero un efecto bueno de la vacuna mientras que IL-7 dio como resultado un rechazo mejorado de las células de la vacuna pero un efecto de vacuna más pobre. B7.1 e IL-7 por lo tanto activan el sistema inmune en forma diferente y complementaria. Puesto que únicamente las células de vacuna TSA-IL7/B7.1 fueron rechazadas completamente en todos los ratones y protegidos nuevamente contra el crecimiento tumoral de las células precursoras que fueron administradas más tarde en 19/20 (95 %) de los ratones, IL-7 y B7 actúan de manera sinérgica.

Todos los experimentos de inmunización mencionados anteriormente con células tumorales transfectadas se llevaron a cabo con células vivas. Además se comparó el efecto de la vacunación de las células TSA-IL-7/B7 vivas que habían sido usadas para la inmunización con las mismas células que habían sido irradiadas con 10000 rad antes de la inyección. 95 % (19/20) de los ratones que habían sido inmunizados con células vivas pero únicamente 30 % (3/10) de los ratones que habían sido inmunizados con células irradiadas fueron capaces de rechazar el tumor 'desafiante' (Figura 1) . Por lo tanto la efectividad de la vacuna descrita se debe al efecto sinérgico de IL-7 y B7 y el uso de células que son capaces de proliferar. 8. Descripción fenotípica de los linfocitos T en tumores transfectados y el crecimiento de los linajes celulares tumorales en ratones desnudos y SCID Para investigar el mecanismo celular del rechazo tumoral inducido por IL-7/B7.1, se llevó a cabo un análisis inmunofluorescente de las células T que infiltran tumores. Para estas células TSA precursoras, se inyectaron células TSA-IL7, células TSA-B7.1 y células TSA-IL7/B7.1 subcutáneamente en ratones Balb c y 6, 8 y 10 días después se aislaron los nodulos tumorales, se preparó una sola suspensión celular y las células se tiñiercn usando inmunofluorescencia con Acm contra CD4, CD8, CD25 y CD28. Los porcentajes de células CD4+ y CD8+, entre las células infiltrantes se muestran en la Tabla 4, mientras que los porcentajes de células CD4+ y CD8+ se coexpresaron con CD28+ y CD25+ (receptor p55 IL2) se muestran en la Tabla 5. Las células T CD4+ y CD8+ se multiplicaron ambas en el TSA-B7 en comparación con los tumores precursores. En los tumores de TSA-IL7 se observó un incremento de células T CD4+. Las células T (CD4+ y CD8+) no se incrementaron más en los tumores transfectados con IL7/B7. Sin embargo, la doble tinción fluorescente para el marcador del subtipo de células T CD4 y CD8 así como los marcadores de activación CD28 y CD25 reveló células T fenotípicamente diferentes en los tumores transfectados con IL7 o B7. En los tumores de TSA-B7 con alto porcentaje de las células T (CD4+ y CD8+) son CD28+ pero la mayoría de las células T son CD25". En contraste las células T en los tumores de TSA-IL7 son principalmente células CD25+ y las células CD8" están esencialmente ausentes. En comparación únicamente unas cuantas células T CD28+ y casi ninguna CD25+ se detectaron en los tumores de origen. Es importante que en los tumores TSA-IL7/B7 la mayoría de las células CD4+ y CD8* son CD25+ y CD28+. Tomadas en conexión con el hecho de que únicamente las células cotransfectadas con IL7/B7 rechazaron de manera confiable e indujeron una inmunidad tumoral sistémica muy fuerte (véase más arriba) , la secreción de IL-7 local y la expresión de B7 por las células tumorales es particularmente adecuada para la activación de los linfocitos que infiltran el tumor. Para demostrar que la actividad de supresión tumoral concertada de IL7 y B7 se deben únicamente a las células T, se inyectaron células TSA transfectadas con IL-7, B7, IL-7/B7 y en comparación con las células TSA transfectadas parenteralmente o con un vector control en ratones desnudos y SCID se comparó la cinética de crecimiento del tumor. Como puede observarse en la Tabla 6 ni la secreción de IL-7 ni la expresión de B7 por las células tumorales ni ambas en conjunto son capaces de retrasar el crecimiento tumoral en una de las cepas de ratón inmunodeficientes, lo cual prueba que las células T son absolutamente necesarias para la respuesta inmune antitumoral inducida por IL-7 y B7.

Tabla 3 Porcentajes de células CD4+ y CD8+ entre las células que infiltran el tumor Linaje de la célula tumoral % de células positivas* CD4+ CD8+ TSA 15.7 +/- 4.0 9.7 +/- 5.0 TSA-B7.1 46.3 +/- 2.1 24.0 +/- 3.6 TSA-IL7 30.0 +/- 7.2 10.0 +/- 1.7 TSA-IL7/B7.1 28.6 +/- 4.0 14.3 +/- 9.3 Tabla 4 Porcentajes de células CD4+ y CD8+ que expresaron el marcador CD28+ y CD25* % de células CD4+* % de células CD8+* Linaje de la CD28+ CD25+ CD28 + CD25+ célula tumoral TSA 14.3+/-6.0 0.0+/-0.0 14.0+/-12.0 0.0+/-0.0 TSA-B7.1 48.0+/-20.2 13.7+/-3.5 65.3+/-37.8 22.0+/-11.0 TSA-IL7 7.6+/-0.6 39.0+/-7.5 4.3+/-7.5 56.3+/-31.5 TSA-IL7/B7.1 67.0+/-21.6 55.3+/-25.0 67.6+/-28.0 67.7+/-15.6 *E1 tumor infectado por células se tiñió con Acm usando inmunofluorescencia. Para cada experimento se inyectaron 5 ratones con 2.5 x 105 de las células respectivas y los tumores se aislaron 8 días después. Se ejecutaron 3 experimentos independientes por cada grupo. +/- SD del grupo la desviación estándar.

Tabla 5 Análisis del crecimiento tumoral de los linajes de células tumorales TSA en ratones inmunodeficientes Linajes de las nu/nu SCID células tumorales TSA 5/5 (19 +/- 2) 5/5 (20 +/- 2) TSA-TK 5/5 (19 +/- 1) 5/5 (20 +/- 1) TSA-B7.1 5/5 (21 +/- 2) 5/5 (20 +/- 2) TSA-IL7 5/5 (22 +/- 3) 5/5 (22 +/- 1) TSA-IL7/B7.1 5/5 (22 +/- 0) 5/5 (21 +/- 1) Las células (2.5x10 ) se inyectaron subcutáneamente en las sepas de ratones. Se estableció la incidencia tumoral en la latencia tumoral (entre paréntesis) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna viva para el tratamiento de enfermedades tumorales con células tumorales modificadas genéticamente, caracterizada porque comprende un gen de citosina y un gen de proteína de membrana inmunorregulador .

2. La vacuna viva de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las células tumorales contienen adicionalmente uno o varios genes suicidas.

3. La vacuna viva de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque las células tumorales contienen un gen de citosina un gen de proteína de membrana inmunorregulador y - un gen suicida.

4. La vacuna viva de conformidad con una de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque se usan células tumorales autólogas o alogénicas capaces de proliferar como células tumorales.

5. La vacuna viva de conformidad con una de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el gen de la citosina se obtuvo por transfección.

6. La vacuna viva de conformidad con las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque las citosinas son sustancias que inducen la diferenciación, proliferación y activación de las células inmunes.

7. La vacuna viva de conformidad con las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque las células tumorales comprenden el gen para la interleucina 2, interleucina 4, interleucina 7, interferón o factor estimulante de la colonia de los macrófagos granulocíticos (GM-CSF) como el gen de citosina.

8. La vacuna viva de conformidad con las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque el gen de membrana inmunoestimulador codifica para proteínas que activan las células T.

9. La vacuna viva de conformidad con las reivindicaciones 1, 3 y 8, caracterizada porque el gen de proteína de membrana inmunoestimulador es el gen de la coesti uladora de las células T B7.

10. La vacuna viva de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque los genes suicidas son sustancias que convierten la sustancias activas en un producto tóxico.

11. La vacuna viva de conformidad con una de las reivindicaciones 1-3 ó 10, caracterizada porque el gen suicida es el gen de la timidina cinasa del gen del virus del herpes simple (HSV-TK) o el gen de la citosina desaminasa.

12. El proceso para la producción de una vacuna viva de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en sistemas autólogos o alogénicos.

13. La vacuna viva de conformidad con una de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque se usa como agente terapéutico.

14. El uso de una vacuna viva de conformidad con una de las reivindicaciones 1-11 para el tratamiento de enfermedades tumorales.

15. El proceso para la producción de vacunas vivas de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 11 para el tratamiento de enfermedades tumorales.