MXPA96005421A - Metodo de deteccion fluorescente de acidos nucleicos y elementos citoesqueleticos usando aril furanos bis-dicationicos - Google Patents
Metodo de deteccion fluorescente de acidos nucleicos y elementos citoesqueleticos usando aril furanos bis-dicationicosInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a un método de detección fluorescente de unácido nucleico;el método comprende poner en contacto elácido nucleico con un compuesto de arilfurano bis-dicatiónico, tal como 2,5-bis(4,5,6,7-tetrahidro-1H-1,3-diazepin-2-il)fenil]-furano;2,5-bis{[4-(N-isopropil)amidino]fenil}furano;y sales fisiológicamente aceptables de los mismos, y exponiendo elácido nucleico a la luz a una frecuencia para inducir fluorescencia del compuesto;también se describe un método para detección fluorescente de elementos citoesqueléticos y compuestos novedosos de arilfurano bis-dicatiónicos.
Description
MÉTODO DE DETECCIÓN FLUORESCENTE DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y r ELEMENTOS CITOESQUELETICOS USANDO flRIL FURflNOS BIS-DICflTIONICOS
La presente invención se hizo con apoyo dei Gobierno de los E.U.fl. bajo el número UOl-AI-3363 de los i stituto Nacionales de Salud. El Gobierno de los E.U.fl. t.iene cier-tos derechos para esta invención.
COMPO DE Lfl INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método para en Lazar y detectar ácidos nucleicos y elementos ci oesquelét eos. Muy especí icamente, la invención se refiere a un rnetodo para detención fluorescente de ácidos nucleicos y elementos c toes ueléti eos usando compuestos de aplfurano bis- d cation cos.
ANTECEDENTES DE Lfl INVENCIÓN
Muchos tipos de análisis de muestras se basan en Laß propiedades de fluorescencia de un medio de tinción, l fluorescencia ocurre cuando una molécula excitada por La lu de una longitud de onda regresa al estado no excitado (basal) por emisión de luz de una longitud de onda inás larga. La luz de excitación y la luz emitida, siendo de diferentes longitudes de ^pnda, se pueden separar una de otra usando nit os ópt cos. La luorescencia se ha usado para visualizar ciei as moléculas
(importantes estructuras) por microscopía de luz durante muchos años, y también se usa en otras técnicas analíticas, tales corno citoinetpa de flujo. El tipo de sonda fluorescente usada en .análisis fluorescente se puede dividir en dos amplias categorías, aquellas usadas para mar-car covalentemente ot as sondas Ba menudo antibióticos) y aquellas cuya distribución o fluorescencia refleja su ambiente y o lo tanto propiedades particulares de una célula. Entre las últimas, compuestos fluorescentes que se enlazan específicamente a los cidos nucleicos o a estructuras y elementos esqueléticos son particularmente importantes. Una variedad de sondas fluorescentes son conocidas.
Por- ejemplo, medios de tinción de propidio y etidio están disponibles. Estos compuestos, sin embargo, se enlazan dando a ""acido deoxibonucleico (flDN) como ácido vi on?cleico de doble cabina (flRN). Por lo tanto, el ARN tjene q?e ser removido si se va a medir- flDN. El 4 ' ,6-d arn?dmo-2-?henylmdol (DAPI) también se usa corno ?n medio de tinción de flDN para numerosas aplicaciones en citología, análisis biofisico de ácido nucleico y citornetpa de flujo. El DAPI se enlaza preferenc talmente a la r-anura menor de ADN en secuencias de ADN ricas en AT pero también se intercala en secuencias de GC/flT mixtas, y significa ivamente se enlaza l ARN. W.D. Wilson y otros, "The Cff-ects o f* I. ? *nd tructure on Bindmg Mode of Un fused Aroinatic Cations uith DMA" en Molecular- Basis of c >eo? f icity in Nucleic Acid Drug Tnteractaons, Klurnar Acadernic Publishers, A sterdad (1990), pps. 331-353; W.l). Wilson, y otros Biocherm stry 32, 4098- 04
(1993). El DAPI tambi n se enlaza a otros componentes celulares, tales como tubulma, dando resultado la tinci n de ARN y tubuLtna. Un numero de ar ild ainidma se han sinte izado en el pasado con valor como agentes antiprot ozoapos. B.P.. Das y Ü..W.
Boyl-in, 3. ed. Chem. 20, 531-535 (1977). Igual que DAPT, 2,5-b?s(4 -armdiophenyl ) fu rana (también conocido corno 2,5-b s(4~ guanyl phenyl) furano) se enlaza preferencial ente a la ranura menor* de ADN en secuencias de ADN fijas en AT, pero también mter-actua con secuencias de GC/AT mixtas. W.D. Utlson y otros
(L990), supra; W.D. Wilson, y otros (1993), supra. Otro medio de tinción usado en aplicaciones de análisis fluorescente es La bisbenz irní da Hoechst 33250. Loont tens y otros han sugerido que Hoechst 33258, una molécula estrechamente relacionada, se enlaza a secuencias ricas en GC a trav s de un complejo de autoasocí ación en la ranura mayor* de ADN. F.G. Loont ?ens, y otros, Biochernist ry 29, 9029-9039 (L990). Este agente también t iene una asociación significativa con ARN. Wilson, y otros (1993), supra. De esta mane r-a, corno con DAPT y 2 , 5- b?s( 4--arn? dmophenyl ) furano, la tinción significativa de elementos que no son de ADN puede dar corno resultado Hoechst 33258.
BREVE DESCRIPCIÓN DE Lfl INVENCIÓN
Un primer aspecto de la presente invención provee compuestos novedoso de la fórmula ÍT):
en donde: RI y R2 ; seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste de H, alquiLo interior*, cicloalquilo, aplo, hidroxialquilo, a inoalquilo, o alquilola i oalquilo, o Ri y R2 se presentan en alquileno de C2 a Cío o Ri y R2 juntos :,on:
en donde n es un número de 1 a 3, y Rio es H o -CONHR11 R15 Ríe en donde R15 Ri6 cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste de H y alquilo inferior; y R3 es H, alquilo inferior, cicloalquilo, aplo, h droxialqui lo, ^inmoalquilo, o alquilammoa l qui lo; fl es un grupo aroma+ico heterocicl i co seleccionado del grupo que consiste de:
en donde R« , R5 y Rß se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste de H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxianlo, u oxiapalqui lo; R12 es hidrogeno, alquilo inferior, hidroxi, "arnmoalquilo o alquilaminoalquilo. En un modalidad preferida de la invención, Ri y R2 juntos son:
en donde n es un numero de l a 3, y Rio es H o - CONHRuNRis Ríe en donde Ris y Ri6 se seleccionan cada uno del grupo que consiste de H y alq?iLo i tenor ; y cada uno de R3 , RA y R5 son H. En 0+ rc- modalidad preferida <le La invenci n, Ri , R3 , 4 , y Rs son H y R2 es alquLlo inferior.. Un segundo aspecto de \ a presente invención es un rnetodo de detección fluorescente de ácidos nucleicos. El método comprende poner en contacto con el acido nucleico un compuesto de conformidad con la fórmula I, y exponer el ácido nucleico a l a luz para inducir' fluorescencia de ol compuesto de la formula I. Un tercer aspecto de la invención es un rnetodo para la detección fluorescente selectiva de flDN en una mezcla de acido nucleico que contiene ADN y ARN. El método comprende los pasos de (a) poner en contacto una mezcla de ácido nucleico con un compuesto de conformidad con la formula I, y (b) exponer la mezcla de acido nucleico a la Luz par-a inducir* fluorescencia del compuesto de i a formula I. Otro aspecto de la presente invención es un método para la detección fluorescente de una estructura microtubular. El rnetodo comprende poner en contacto con la estructura microtubular un compuesto de conformidad con la formula I, y exponer- la estructura rnicrotubular a la luz para mducpr f1 uorescencia del compuesto de la fórmula T. Otro aspecto mas de la presente invención es un método par-a la detección fluorescente simultánea de una primera estructura celular y una segunda estructura celular- en una ^elula, en donde dicha primera estructura celular y dicha segunda estructuí a celular son diferentes. El m todo incluye (a) poner en contacto la célula con un primer1 compuesto tluorescente y un segundo compuesto fluorescente. El primer y segundo compuesto fluorescente son est ruct?ralrnente diferentes uno de otro, er-o cada uno de los compuestos fluorescentes tiene una estructura de conformidad con la fórmula I. El primer compuesto fluorescente se enlaza selectivamente a la primer estructura y el segundo compuesto se enlaza selec vamen a la segunda estructura. Ademas, el primer y segundo compuesto fluorescente tienen diferentes espectros de emisión fluorescente. Después de que la célula se pone en contacto con el primer y segundo compuestos fluorescentes, (b) la célula se expone a la luz para inducir fluorescencia tanto del primero corno del segundo compuesto fluorescente, por Lo que la primera estructura celular y la segunda est ructura celular fluorecen a diferentes aspectos de emisión fluorescente. =- Como otro aspecto adicional de la presente invención, se provee un equipo para la detección fluorescente de una estructura celular-. El equipo incluye (a) un compuesto de conformidad con la fórmula I, y (b) un solvente en una cantidad suficiente para que se pueda formar una mezcla de un acido nucleico marcado con el compuesto de la for-mula I, cuando el compuesto se pone en contacto con una muestra incluyendo acido nucleico. Aspectos adicionales de la presente invención ^incluyen equipos que incluyen compuestos de la fórmula I, l o Ib, o sus sales fisiol gicamente aceptables, corno un componente del equipo., Los anteriores y otros objetos y aspectos de i a presente invención se explican con detalle en la memori descriptiva que se expone a continuación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE Lfl INVENCIÓN
En la presente se describen compuestos útiles en un método para la detección fluorescente de un acido nucleico. Los compuestos comprenden compuestos de la fórmula I siguientes:
-" - Rl y 2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste de H, alquilo inferior', cicloalqui lo, aplo, hidroxialquilo, arninoalquilo, o al quilami noalqui lo, o Ri y R2 juntos representan un alquileno de 02 a Cío que puede ser- lineal o ramificado, saturado o insaturado, o Ri y 2 son juntos:
j¿t\ donde n es un número de l a 3, y Rio es H o CONHRi i NR15 \& en donde R15 y Ríe se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste H y alquilo inferior. Preferiblemente, Rio es H. Rio se puede ubicar- en cualquiera de las posiciones C-2, C-3, C-4 o C-5 en el anillo. Preferí Lilemente, Rio se ubica en la posición C -3. En una modalidad preferí í de la invención, Ri y R juntos son :
en donde n y Rio son como se definió antes. En otra modalidad preferida, Ri y R2 juntos representan un alquileno saturado lineal de C2 a Cío- Muy preferiblemente, Ri y R2 juntos representan un alqu lleno
X"- "satura o lineal de C2 a Cs . Ln otra modalidad preferida de la invención, Ri es H y R2 es alquilo inferior, preferiblemente isopropí lo. R3 se puede seleccionar del grupo que consiste de H, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, a inoalqui lo, o alq?ilarní noalquilo. Preferiblemente, R3 es H o hidroxialquilo de La fórmula -R14OH, en donde R14 es alquilo inferior. Preferiblemente, 14 es -(CH2)2-. A es un grupo aromático heteociclico seleccionado del LO
,?LruP° iue consiste de:
Los gi upos anteriores ue representan a A pueden ser- orto, meta o par-a sustituidos con R4 y Rs - RA se puede seleccionar del grupo que consiste de H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiaplo, ? ox laplalquilo. Preferiblemente, R4 es H o alquilo inferior. Rs se puede seleccionar del grupo que consi te de H, alquilo inferior, halógeno, oxialquilo, oxiaplo, ? oxiarilalquilo. Preferiblemente, R5 es H. R12 se puede seleccionar del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo inferior, hidroxi, armnoalquilo o alq?ilami noalquilo.
y-* En una modalidad µiefei ida, A #
en donde Ri. y Rs se pueden definir corno se hizo antes, pero preferiblemente R¿, es H, y Rs es OCH3 o 0(Cßl-U)R, en donde R es H o alquilo inferior. Muy preferiblemente, R es alquilo inferior y pre eri lemen e met lo. Tal como se emplea en la presente, el témuño "alquilo inferior" se r-efiere a alquilo lineal o ramificado de Ci a C¿, , tal corno metilo, etilo, propilo, butilo, isopropí lo, secbutilo, y terbutiio. El término "cicloalquilo" tal co o se emplea en la pr-esente se refiere a alquilo cíclico de C3 a Cío , tal corno ciclopropí lo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohex lo.
El termino "aplo" tal como se emplea en la presente se refiere grupos aromáticos cíclicos de C3 a Cío tales corno fenilo, naftilo y similares, e incluye grupos arilo substituidos tales co o tol ilo. El termino "hidroxialquilo" tal corno se emplea en la presente se refiere a hidroxialquilo substituido lineal o ramificado de Ci a C4 , es decir, -CH2OH, -(Chfe OH, etc. El término "ammoalquilo" tal corno se emplea on la presente se refiere a arnmoalq?ilo substituido lineal o ramificado de Ci a C4 en donde el termino "arnmo" se refiere al grupo MR', R" , en donde R' y R" se seleccionan independientemente de H o alquilo como se definió antes, es decir, -NH2 , OHOH3 , N(CH3)2, etc. El termino "oxialquilo" t l corno se emplea en la presente se refiere a alquilo substituido con oxígeno de Ci a C« , es decir-, -OCH3 , y el termino "oxiaplo" tal como se emplea en la presente se refiere a grupos arom ticos cíclicos substituidos con oxígeno de C3 a Cío. Los compuestoe que son representativos de Los compuestos novedosos de la fórmula T, y que se preparan en los métodos de la presente invención incluyen pero no se li itan a ,5-b?sU -arnidmofenil ) furano; 2,5-b?sT4-(4 ,5-d?h?dro-lH-??n?dazol-2-?l ) fenil] furano; 2,5- ?sL"4-l,4,5,6-tet rah?drop?prn? ?n-2- ll ) feml] furano; 2 , 5 -b1 s T 4 - ( , 5 , 6 , dtet rah1 dro- 1 Hd , 3 - d 1 aze 1 n- 2 ~ íl ) fe i 1] fura o; 2,5~bisC4- (N-isopropil amidino) fenil furano; y sales fi ioló icamente aceptables de los mismos. El rnetodo de la presente invención se lleva a cabo poniendo en contacto o mezclando un ácido nucleico en una solución substanci lrne te pura del mismo, o en una muestra biológica que contiene el ácido nucleico con un compuesto de la formula T anterior y después exponiendo la muestra biológica a la luz par-a inducir fluorescencia del compuesto de La formula I. El paso de exponer la muestra biológica a la luz fiara inducir la fluorescencia de los compuestos de la for-mula T permite el análisis de a muestra, es decir, detección de la presencia del componente de ácido nucleico contenidos en la jnis a. El método de l a invención es; por ejemplo, on microscopía de luz, citonetpa de flujo, análisis de cariotipo, detección de ácido nucleico y cuant i f icación de acido nucleico, elect rofóreeis y similares. Los compuestos de la invención se ligan a ácidos nucleicos en la muestra, y por lo tanto son adecuados para teñir cualquier muestra biológica que se sospeche que contiene ácidos nucleicos. Tal como se emplea en la presente, el termino "acido nucleico" se refiere tanto a acido deoxipbonucleí co "(ADN) como a acido ribonucleico (ARN). Cualquier acido nucleico puede ser teñido, incluyendo ácidos nucleicos cronosómicos y extracrornosórnicos (v.gr-., un plas ido, un virus de ARN, etc.). Corno resultado, la presencia de ácidos nucleicos en muestras biológicas se puede observar mediante técnicas conocidas para la detección de cidos nucleicos en una muestra por detección fluorescente de un compuesto ligado a los mis os, incluyendo microscopía de luz, microscopía de luz con focal, citometrta de aflujo y similares. Muestras ilustrativas adecuadas para finción de acuerdo con la presente invención típicamente se obtienen en forma de una muestra de un fluido biológico o tejido biol gico. Los expertos en la t cnica apreciaran que se pueden extraer- muestras de cualquier número de fuentes biológicas de los cuales se pueda obtener información útil para diagnóstico, los fluidos biológicos adecuados incluyen pero no se limitan a sangre, saliva, orina, leche, fluido linfático y mucosa oral, ,nas l y bronquial, las muest as de tejidos adecuadas incluyen pero no se limitan a muestras de biopsia de tejido, tales corno de riñon, hígado, nodos linfáticos u otros órganos, y muestras de tejido de piel y otro tejido suave (v.gr., músculo), l s muestras tornadas de sujetos se pueden teñir directamente o se pueden pr-oveer como un crecimiento cultivado del espécimen., La selección apropiada del espécimen biológico y técnicas de cultivo apropiadas serán fácilmente evidentes fiara un experto en La t cnica.. La muestra también puede ser una solución "ßubstancialrnent e pura del acido nucleico que se va a detectar, es decir, una solución de un componente intracelular aislado de un espécimen corno se describió antes. Las muestras se pueden recoger tanto de especies vegetales corno animales. Las especies animales incluyen tanto seres humanos corno especies no humanas (v.gr., perros, gatos, ratas, vacas, caballos, ovejas, monos, etc.). Otros tipos de c lulas tales como bacterias, hongos, protozoarios y otros organismo unicelulares también se pueden tratar de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, las células que se puede usar incluyen tanto células eucapoticas co o procapoticas. Típicamente, las células se tiñen mediante incubación bajo condiciones apropiadas con el compuesto fluorescente de acuerdo con la fórmula I. Por ejemplo, la tinci n por medio de los compuesto de conformidad con la fórmula T se pueden lograr siguiendo protocolos normales conocidos en la técnica para tinción de DAPT corno se describe en 0. Mtller, Principies and J?ract?ces m Medical Genetics (Long an G?-ou? Limited, New York 1983) y D., ilvonen, ACT Cytogenetic Lab Manual (Umversity o California, San Francisco 1980). Alternativamente, La muestra se puede teñir- usando protocolos normales para tinción con bis--bencirnida corno tambi n se conoce en la técnica. Véase v.gr., Human Cytogene íes, Volumen 1, Const itut íonal Analysis, pag. 113 (D. Rooney y B.Czepulkowski , Eds., TRL Press, Oxford Umversi y Press. La muestra se pone en contacto o se mezcla con una cantidad de un compuesto de la fórmula T para ligar el compuesto con ácido nucleico en la muestra. Puesto q?e una molécula del compuesto de la fórmula I generalmente se liga a cuatro pares de bases de ácido nucleico de doble cadena, cualquier- cantidad suficiente para producir* una señal detectable se puede usar. De esta manera, la proporción o r-e Lac ion de la cantidad de un compuesto de la formula T a un objetivo que va a ser detectado puede ser de aproximadamente L:4, 1:8, 1:16, 1:32 o mas, dependiendo entre odas cosas de corno sea detectado el objetivo. Si se desea, cantidades excesivas dei compuesto se pueden lavar opciona mont e despu s de La tinción. Como Lo apreciará un experto en La técnica, no se requiere lavado par-a técnicas analíticas en donde la muestra se provee una succión substancialmente pura en acido nucleico co o se describió antes, se analiza usando por ejemplo un fluonme ro. El compuesto se puede proveer en una solución acuosa LB
? el paso de contacto se puede llevar a cabo sumergiendo simplemente la muestra con la solución. Sin embargo, no hay necesidad de almacenar la muestra en la obscuridad para conservar- la estabilidad de los compuestos, corno se ha reportado como necesario para DAPT. Dicha solución puede tener-una concent ración final mínima de aproxi adamen O.l micromolar (µM), aunque la solución puede tener- una concentración final entre alrededor- de 0.01 y 5, 10 o 25 rnicrornolar o mas. La duraci n de contacto entre la muestra y el "compuesto puede variar ampliamente dependiendo de l a técnica de contacto, pero gener-almente esta entre alrededor de 30 segundos y 2 horas, y preferiblemente esta entre alrededor de 1 y 15 minutos, cuando la muestra es sumergida en una solución en la concentración an eriormente descrita. La muestra también se puede teñir usando combinaciones de fluoroe omos. De esta manera, la fluorescencia de compuestos de conformidad con la fórmula I y de otros •compuestos se puede detectar en forma simultanea para dicha detección fluorescente de compuestos a diferentes longitudes de onda. Co o lo apreciara el experto en la t cnica, cuando se usa rnas de un marcador, se debe tomar para seleccionar f1 uorocrornos con longitudes de onda de misión máximas o espectros de misión máximos que no se traslapan. Además, una combinación de fluoroeromos se puede seleccionar para amplificar la señal fluorescente usando técnicas de transferencia de energía fluorescente. También como lo apreciarán los expertos en la ^técnica, cuando se usa mas de un fluorocromo, se debe tener- cuidado de seleccionar fluorocromos que no interactuen químicamente unos con otros o con los compuestos de conformidad con la formula T. En la aplicación del método de la invención, puede ser- ventajoso modificar los compuestos de la fórmula T para remover- afinidad de enlace de ADN, sin remover sitios de conjuración convenientes a los cuales se pueden fijar otras entidades. Una entidad adecuada a la cual los compuestos de la ?órmula T se pueden conjugar incluyen olí gonucleotí os tanto de ADN como de ARN. Dichos conjugados del compuesto de la formula I pueden ser útiles para reactivos anti detección, sondas para estudios de hibridación, pruebas de cambio de banda de complejos de flDN-protei na, o para iniciadores para sec?enciacion de flDN fluorescente y aplicaciones de PCR. fldi cíonal ente, los compuestos de la fórmula T se pueden conjugar- a numerosos reactivos para estudios de marcado ín ßit?. Reactivos ilustrativos incluyen anticuerpos para mrnunohi stoquirm ca, y moléculas marcadoras de tamaño para medir volumen. Los compuestos de la fórmula I también se pueden conjugar- a reactivos para el propósito de formar substratos para medir actividades de enzima que ya sea ganan o pierden fluorescencia ba o actividad de enzima, v.gr., proteasas, fosfa tasas, cinasas, inactivación de anticuerpos, nucleasas y carbohidratos. Los compuestos conjugados de la fórmula T pueden o no tener q?e ser desconjugados in situ par-a producir fluorescencia. En otras palabras, los compuestos conjugados de ? formula T puede retener fluorescencia a pesar de La conjugación o uede fl?orocer al separarse ^ \G1 conjugado. El paso de exposici n del m todo de la invenci n se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas adecuadas para inducir el compuesto de la fórmula T para producir- una señal detectable. Generalmente esto comprender la exposici n do la muestra biológica a la luz ultravioleta a una frecuencia que inducirá fluorescencia del compuesto de la fórmula I (v.gr., Í10-380 nm). La única limitación es que el componente intracelular que va ser detectado, es decir, acido nucleico, no es destruido por la frecuencia de luz y/o intensidad de luz. Corno lo apreciaran los expertos en la técnica, la longitud de onda seleccionada para inducir fluorescencia del compuesto se conoce en la técnica como la "excitación máxima", es deci -, aquella longitud de onda que es absorbida por una molécula y excita esa molécula a un estado electrónico superior. Co o se indico anteriormente, en la invención, la longitud de onda de excitación esta en la escala de luz ultravioleta. Cuando la molécula pasa del estado electr nico superior a uno inferior-, la molécula emite un tipo de radiaci n visible, es decir, luorescencia, de una longitud íe onda refer-i da como la "emisión máxima". Es l a fluorescencia qu-? es detectada en la presente invención, l.a señal detectable omitida por el compuesto puede ser detectada usando técnicas conocidas, por ejemplo, mediante observación por el o o humano, usando pe io electrónicos para detectar una longitud de onda generada, y si ilar. Ventajosamente, la longitud de onda de fluorescencia es suficientemente remo ida de la la longitud de onda de la luz de excitación para permitir buena separación de las dos longitudes de onda por filtros ópticos. La luz filtrada se puede usar, por ejemplo, para seleccionar la longitud de onda deseada de luz de excitación sobr-e el l do de entrada, y/o para seleccionar la escala apropiada de longitudes de onda de emisión para medir el pico o máximo de fluorescencia. Ot o aspecto de la invención se refiere a métodos par-a enlazar elementos ci oesqueleticos de una célula en una muestr-a y detectar La presencia de los mismos. En este aspecto del método de la invención, un compuesto de conformidad con la fórmula T anterior o una sal fisiológicamente aceptable del mismo se pone en contacto o se mezcla con un elemento citoesqueletico en una solución substancialrnente pura del
"nisrno, o en una muestra biológica que contiene el elemento citoesqueletico. Co o se describió antes, despu s de mezclar el compuesto de la formula I con un elemento citoesquelet ico, la muestra se expone a la luz a una frecuencia que induce fluorescencia del compuesto de La fórmula I para permiti - el an lisis de La muestra, es decir, la detección de la presencia de componentes de elementos citoesquelét icos contenidos en la misma. Este aspecto de la invención es util, por ejemplo, en microscopía de luz, incluyendo microscopía de luz con focal, prueba bioquímicas y similares. Este aspecto del m todo de ía invenci n se puede conducir como se describió antes con mas detalles con respecto a la detección fluorescente de cidos nucleicos. Corno se usa en La presente, el término "elementos citoesq?eléticos" se refiere a fibras proteí nicas que consisten del marco estructural de una célula. La presente invenci n es particularmente preferida para su uso con estructuras rnicrotubulares co o eL elemento citoesquelético, el cual es particularmente sensible a este método. Corno sera apreciado por' el experto en la técnica, la tubulina es una proteina principal de los microtubulos. De esta manera, eete aspecto de la invención puede proveer- técnicas para determinar el trastor-no del pol írnepzado de la tubulina formando estructuras rnicrotubulares. Para la microscopía de luz, las muestras son pre eri lemente ininobiJ izadas en un soporte solido antes de la introducción de los compuestos de la invención (los reagentes de tinción). Cualquier soporte sólido puede ser usado, con soportes solidos ejemplares que incluyen portaobjetos, superficies de pared de pozos de reacción, tubos de ensayo, tubos de espectrofotornetría, y esferas. El soporte sólido puede ser formado por- cualquier material conocido adecuado fiara aquellos expertos en esta técnica, incluyendo vidrio, poliestireno, polietileno, polipropileno, y polisacap das entrelazadas. Preferiblemente, la muestra se fija a un portaobjetos de vidrio. La muestra se puede fijar al soporte solido mediante cualquier procedimiento adecuado, corno el secado al ai re , tratamiento químico o tratamiento con calor-, que no interfiere con la observación subsecuente de la muestra. Es preferido que el portaobjetos se inmovilice de una forma tal que pueda ser observado mediante microscopía de luz. Para la microscopía de luz, la muestra se puede teñir con los compuestos de conformidad con la fór-mula 1 siguiendo los protocolos normales conocidos en la técnica de tinción de DAPT O de bis-benzirnida, co o se menciona anteriormente. De forma ventajosa, la muestra se lava después de la tinción para remover las cantidades excesivas del compuesto de la fórmul 1 para remover la interferencia antecedente y mejorar la resolución de la muestra. El proceso de tinción es iniciado contactando la muestra con un compuesto de conformi ad con la fórmula 1 en una cantidad suficiente para vincular acido nucleico o elementos citoesqueleticos en la muestra, por t-jemplo, sumergiendo la muestra en una soluci n acuosa del compuesto. La cantidad de compuesto de la fórmula 1 y duración del contactado puede ser corno se describe anteriormente. Las muestras de portaobjeto preparadas de esta forrna pueden ser analizadas usando técnicas fluorescentes, corno la microscopía fluorescente. Por ejemplo, en la muestra puede ser- observada usando un fotomicroscopio equipado con una fuente ultravioleta (UV) como una lámpara de zenon o mercurio y filtros apropiados, y las imágenes fotografiadas usando técnicas convencionales. Las células son iluminadas con una fuente de luz ultravioleta, la cual es la fuente de excitaci n, y de-be ser capaz de producir longitudes de onda específicas que puedan ser- usadas para excitar los compuestos fluorescentes de la invención. El rnetodo de La invención puede ser usado con ot as técnicas analíticas, como citometría de flujo. La citometpa de flujo es una t cnica para hacer mediciones r pidas on partículas o células mien as estas fluyen una por- una en una fe Comente de flujo a trav s de un punto de sensibilizado. Ll propósito de la preparación de la muestra es producir- una suspensión de partículas dispersas teñidas en una forma específica, las cuales pasaran a través del sistema sin t anstornar el flujo suave de fluido o bloquear tubos u orificios. La preparación de la muestra es de conformidad con las t cnicas conocidas para citóme» na de flujo. Para teñir la muestra, ésta ee contactada con un compuesto de la formula I, siguiendo los protocolos establecidos anteriormente, en referencia a concentraciones y duración del contacto. La muestra es contactada con el compuesto de la formula 1 antes de inyectar- o liberar la muestra a la corriente de flujo del sistema de citornetría de flujo par'a proveer- una suspensión de partículas dispersas. Como será apreciado por el experto en la técnica, los flujos corporales, como la sangre q?e contiene células individuales, pueden ser teñidas y procesados irectamente en el ci me tro de flujo par-a medi el contenido celular absoluto de la macromolécula en cuesti n. I a preparación de tejidos solidos puede ser- directa, es decir-, el cor-te y desgarrado simple del órgano, seguido del centrifugado de gradiente de densidad y de perforaci n. Otros tejidos pueden requerir digestión enzimá ica. Para liberar partículas de ?na suspensión t idimensional aleatoria una por una hacia un punto especifico en espacio mterseccionado por el rayo de iluminación, ¡generalmente la suspensión de muestr-a se inyecta en ei centro de un canal cerrado a través del cual el líquido fluye. Las células pasan a través del punto de detección, en donde la célula es iluminada. Como con la microscopía de luz, la luz es la fuente de excitación, y la fuente de luz debe ser capaz de producir- longitudes de onda especificas que puedan ser usadas par-a excitar los compuestos luorescentes de la invención, la luz fluorescente y dispersa generada por las células que pasan ••i tr-aves del haz iluminador es recogida por fotodetectores que convierten los pulsos de fotón en señales electrónicas. L"l procedimiento electrónico y co putacional posterior resulta en una disposición gráfica y un análisis estadístico. Los compuestos empleados para llevar a cabo la presente invención pueden ser preparados de conformidad con las técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica (ver- en, por ejemplo, B.P. Das y D.LJ. Tioyl-- 1 nm 3. Med. Chem. 20, 531-536 (1977), ia completa descripción de lo que está incorporado en a presente por referencia), mediante las técnicas ejemplificadas en los ejemplos L-4 y 6-8 a conti uac ón, o variaciones de las mismas, Las cuales serán apar-entes para aquellos expertos en la técnica. Ademas, los compuestos pueden ser- sintetizados mediante una variación del método expuesto en
B.P. Das y D.U. Boyl-'jn, supra, como se ejempli fica en el ejemplo 5 a continuación. Los compuestos de la fórmula T son preparados generalmente como se indica en el esquema de reacción a continuación, mediante: (a) furanización ciclodehí dra tante de
1 , ~d?cetonas (1) de conformidad con el procedimiento enseñado por R.E. Lutz, et al., D.flrn, Chem. Soc, 56, 2698 (1934) para formar 2 ,5-b?s-(4-br-omofen? l ) furano (2); (b) nitnlizacion de 2,5-b?s(4-bromofen? 1 ) f?rano (2) usando Cu2ÍCN)2 para producir el bis-nitplo 2 ,5-b?sd 4-c?anofen?l ) f?rano (3) correspondiente, y (c) conversión del tusnitrilo (3) al a ilfurano bis dicatónico de la fórmula T (4) mediante la conversión en estrés de irnidato int errnedios seguida por- la reacción de estos intermedios con amonio o la diarni a apropiada, por ejemplo, etildeniarnina, 1, 3-pro?and?arnma, etc., corno se ejemplifica en los ejemplos a continuación. Los pasos (a) y (b) se describen en más detalle en el ejemplo 1, y el paso (c) se describe en más detalle en los ejemplos 2 a 8.
s~ ESQUEMA DE RE ACC TON
De manera alternativa, el paso (c) anterior puede ser sustituido por un paso de terrnolisis, en donde el bismtplo (3) es transformado en un compuesto de la fórmula I usando calor para fusionar una eal de diarnina, es decir, hidrocloruro de amina, directamente con el bismtplo, corno se ejemplifica mediante el ejemplo 5 a continuación. Este procedimiento alter-nativo está limitado a la preparación de compuestos de la for-mula T, en donde Ri y R2 juntos forman ?na porción cíclica. Como se indica, los compuestos usados en la presente invención pueden estar presentes corno sales fisiológicamente aceptables (vr.g., sales que no son tan indebidamente trastornantes de la muestra para que el compuesto no sea capaz de ser detectado). Dichas sales incluyen las sales de glauconita, lactato, acetato, tartrato, citrato, maleato, f urina rat o, fosfato, borato, nitrato, sulfato, y clorhidrato. Las sales de la presente invención pueden ser preparadas, en general, llevando a reacción dos equivalentes del compuesto base de amidina con el acido deseado, en solución. Después de q?e se completa la reacción, las sales son cristalizadas de solución mediante la adición de una cantidad apropiada de y--olvente en el cual la sal es insoluble. Lae propiedades espectroscopicas y utilidades de los compuestos de conformidad con la fórmula I como tintes fluorescentes, son similares a DAPI y Hoechst 33258. los compuestos de conformidad con la formula I, sin embargo, pueden vincular fuertemente ADN de doble cadena y con alta especificidad, con esencialmente ningún vinculo hacia ARN.. Por ejemplo, el 2 ,5-b?sr4- ( , 5 , 6 , -t etrahí ro-lH-1 , 3- iazepi n 2- íDfen ll furano tiene esencialmente ninguna afinidad detectable con ARN. Además, los compuestos de la formula T emiten un color azul de una longitud de onda ligerament diferente que el emitido por DAPI, y puede haber menor dispersión de luz q?e la observada con DAPT. Esto puede resultar- en un delineado de rnas detalle. La presente invención puede ser ventajosamente provista al usuario en la forma de un equipo. Típicamente un equipo de tinción consiste de reagentes en cantidades suficientes para llevar a cabo los pasos anteriormente mencionados, es decir, un compuesto de la formula 1. Los reagentes deben ser provistos en una forrna adecuada para su almacenamiento a largo plazo, como polvo cristalino o una solución acuosa. Ademas, el equipo generalmente incluirá, entre otros, vías para almacenar los reagentes, recipientes de mezclado, y una ho a de instrucciones q?e establece los pasos anteriormente mencionados. Los reagentes pueden también incluir- agentes ancillapos como los agentes estabilizadores de pH y sirní lares. El equipo puede también incluir, cuando sea necesario, agentes para reducir la interferencia antecedente en una prueba, reagentes de control, aparatos para llevar- a cabo u na p rué ba , y s i rn 11 a re s . La presente invención sera ademas ilustrada mediante los siguientes ejemplos no limitantes, en donde "g" significa gramos, "rng" significa miligramos, "ug" significa mi crogramos, "rnrnol" significa ilirnoLes, "h" significa horas, "ml" significa rniLilitro, "M" significa molar, "rnM" significa milirnolar, "µM" significa rnicrornolar, "UV" significa ultravioleta, "HCl" significa clorhidrato, "pf" significa punto de fusión, "HCN" significa ácido cianhídrico y "°C" significa grados centígrados. Excepto cuando se mencione lo contrario, el detalle experimental que se refiere a la síntesis de los compuestos de conformidad con la fórmula I, es el procedimiento sintético de conformidad con aquel establ ecido en B.P. Das y D.U. Boy in, J. Med.Chen. 20, 531-536 (1977) .
EJEMPLO 1 Preperación de compuestos precursores
2,5-Bis(p-bromofenil)furano. Se empleo un procedimiento de literatura corno el conocido en la técnica fiara la preparaci n de trans- d?-p-pro obenzoi letileno de brornobenzeno y cloruro de fuñíanlo. 3.1). Conant and R. E. Lutz,
J. Arn. Chem. Soc. 47, 881 (1925). El compuesto de etiieno se ¿•edujo con Zn-HOAc fiara preparar 1 , 4- dip-p-bromofem 1 - L , 4- utandiona. E. Ca paigne and UI.O. F"oye, LJ.Org.Chem. 17, 1405 (1952). La disetona de 1,4 saturada (7.9 g, 0.02 mol) se suspendió en 80 rnl de AC2O y la mezcla fue calentada a reflujo. H2SO4 (4-5 gotas) concentrado se a adió y el reflujo se continuo durante 5 minutos, l a solución se vacio en agua con hielo (l litro), se agito bien y se filtro: producto crudo 7 g (93%). La recpstalización del acido acético dió 5.6 g (75%), pf 198-199°C (lit. (R.E. Lutz and U.M. Eisner, .1. Arn.Chein. Soc . *56, 2698 (1934)) pf 200-201°C. 2, 5-Bis(p-cianofenil) furano. Una mezcla de 7.5 g (0.02 rnol) de 2 ,5~b?s-(4- romo fe ni 1 ) f?rano y 4 g (0.045 mol) de Cu(CN) en 45 ml de quinolma se llevó a reflujo durante 2 horas. La mezcla se vacio en 300 ml de solución de HCl diluida (precaución, se libera HCN) y filtrada. El sólido se lavo con
H2O, NaOH diluido, HCl diluido, y nuevamente con H2O. EL bisnitplo solido se disolvió en acetona, se filtro para remover el residuo inorg nico, y se paso a trav s de una columna de alúmina corta fiara remover rastros de sales de cobre. Las sales de cobre deben de ser removidas ya que llevan a las bisamidinas, de las cuales son difíciles de purificar. Un rnetodo conveniente para detectar' la presencia de sales do cobre es una prueba de Llama.. La evapop zación del eluyente de la columna de alúmina y recristalizacion del etanol dió 3.5 g (65%) , pf 294-295°C.
X EJEMPLO 2 Preparación de diclorhidrato de 2,5-Bis(4-amidinofen?l) furano
2, 5-J3?s( 4-c?anofen?l) furano (3 g, 0.011 mol) (prepar-ado como se describe en el ejemplo 1) en ?na mezcla de 100 mi de dioxano y 25 rnl de etanol absoluto se saturo con gas seco de HCl a 5°C. La soluci n se colocó en una botella de presión y se agito durante 3 días (temperatura aintuente). Un producto intermedio, un clorhidrato de ester de imi ato, precipitado como ?n solido amarillo, se filtro y se seco al vacío a temperatura ambiente dur-ante la noche. El espectro IR del clorhidrato de éster de nnidato estuvo libre «le absorci n de nitplo y fue usado directamente sin ?na caracterización posterior. Una suspensión de clorhidrato de éster de i mi dato (3.5 g) en 100 nl de etanol absoluto se saturó a 5°C con amonio anhidro, l.a suspensión (botella de presión) se agitó durante 1 días a temperatura ambiente. La mezcla de reacci n se filti y el sólido se secó y se disolvió en etanol absoluto caliente (ca. 1.5 1). La solución fue acidificada con HCl anhidro a 5°C, concentrada al vacio a temperatura ambiente, y se obtuvieron 2.5g (60%) de cristales amarillos. La recp stalizacion de etanol absoluto dió pf 400~40l°C dec.
EJEMPLO 3 Preparación de 2,5,-BisL"4-(4,5-dihidro-lH-imidazol-2-il) fenil f?rano
Una solución de ?n clorhidrato de éster de írnidato intermedia sintetizada como se describe en el ejemplo 2, 2.1 g (0.005 mol), y 0.6 g (0.0.1 mol) de etilendiarni na en 50 ml de etanol absoluto se levaron a reflujo durante la noche. Fl „ solido que se formó se filtró y recp stal izo de etanol absoluto saturado con HCl anhidro para producir 2 , 5--B? sCd ( 2- irnidazolinil ) fem 11 f?rano, 1.9 g (90%), pf 409-410°C dec.
EJEMPLO 4 Preparación de 2,5,-Bis[4-(l,4,5,6-tetrahidro-pirimidin-2-il) fenil] furano
- ' De una forma similar corno la mencionada en el ejemplo
3, un clorhidrato de éster de ímidato sintetizado como se describe anteriormente en el ejemplo 2, se llevó a reacción con 1 ,3-pro?and? amina para producir (90%) del 2 ,5-BisL"4 - ( 1 ,4 , 5 , ñ- tetrahidr-op?prnic1?n-2--? 1) feni llfur-ano, pf 430-431 °C dec.
^ EJEMPLO 5 Preparación de diclorhidrato de 2,5-Bis[4-(4,5-dihidro-lH- imidazol-2-il) enil] urano dihidratado
Este compuesto se obtuvo mediante un método alternativo de 2,5-b?s(4-c?anofen? 1 ) furano. Para esta reacci n se usaron dinitplo (0.5 g, 1.9 rnol), y diclorhi drat o de et ilediaintna (4.9 g, 37 mol), y et i lendiamina (2.5 ml, 37
? mmol). Una mezcla del dimtplo, diclorhi drato de et ilendiaini na y et ilendiarnma se mantuvo a 300-310°C durante LO minutos y después se di solvió en agua calient-?. Los cristales amarillos se separaron mediante enfriamiento. Fl compuesto fue recp stal izado de agua hirviendo. Producto, 208 mg (24%). Cromatografía de capa delgada (CHCI3 ) :CH3?H: 25% NH4OH -- 11:4:1, un punto), pf >360°C, Anal. Calculado fiara: C22H20N40- 2H2O
(465.37): C, 56.78; H, 5.60; N, 12. Od Se encontró: C, 56. (o9;
_H, 5.63; N, 12.07. 1H-RMN (DMSO-de, TMS), 6 4.01 (s, 8H), 7.4
(s, 2H), 8.08 (d, 4H, 3=8.3 Hz ) , 8.15 (d, 4H, 3=8.3 Hz), 8.15
(d, 4H, 3^8.3 Hz), 10.50 (brs, 4H) . 13C-RMN (DMSO-dß, TMS), d 45.5, 113.2, 121.6, 125.3, 130.1, 135,8, 153.4, 165.8. IR (KBr): v 3412, 3123, 2971, 1608, 1580, 1491, 1367, 1287, 1033, 850, 745, 673. MS, m/z: 356 (base libre).
EJEMPLO 6 Preparación de diclorhidrato de 2,5-bisL"4-(4,5,6,7-tetrahidro- lH-l,3,-diazepin-2-il) fenil] furano he iheptahidratado
El éster de un J dato de bis-rnetoxietanol (1 g, 0.002 mol), y 1,4-d?am?nobutano (0.5 g, 0.0057 mol) en 10 i de 1,2- dirnet oxietano se llevaron a reflujo durante 2 días. El solvente se removió al vacío y se anadio agua.. Fl precipitado se filtro,
.se lavo con agua y se seco en un horno al vacio (p. f . >300°C). r El producto de reacción de base libre del éster de mu dato de bisrnetoxi etanol y 1 , 4-diam?nobutano se convirtió en el clorhidrato (p.f. >300°C) por cloruro de hidrógeno en metanol. El filtrado fue neutralizado usando hidróxido de sodio de 2N y se obtuvo otra porción de la base libre. EL producto total de base libre fue 51%. Anal, calculado para C26H2ßN«0- 2HC1 • 3.5H2O
(548.50): C, 56.93; H, 6.80; N, 10.22. Se obtuvo: C, 56,99; H,
_6.B0; N, 10.26. 1H-RMN (DMSO-dß ), 6 2.02 (s, 8H), 3.71 (s, OH),
'.38 (s, 2H), 7.86 (d, 4H, J = fl.3 H ) , 8..04 (d, 4H, d8„3 H ) , v.,77 (s, 4H). 13 c- RMN ( D20 ( OH3 )3 SiCH2 CH2 C02 Na ) , 628.0, 47..0 113.9, 126.5, 129.7, 131.2, 137.0, 154.5, 167.1. TR (KBr), v
687, 747, 814, 930, 1331, 1364, 1459, 1597, 3008, 3164, MS (El), rn/z (% reí int.), 412 (100) (base libre), 384 (23), 354 (9), 340 (13, 298 (11), 284 (23).
EJEMPLO 7 Preparación de 2,5-bis{C4-(N-isopropil)-amidino]fenil}furano
Tsopropí lamina seca (0.47g, 0.008 mol) se añadió a una suspensión de un ester de nnidato como el descrito en eL ejemplo 2 (1.3 g, 0.003 mol) en 45 mi de etanol absoluto.
Dentro de 0.5 horas el ester de irnidato se disolvió y la mezcla del éster de imidato e i sopropí lamí na se coloreo,. Después <lo k a. 3 hr- se precipito un solido blanco; la suspensión se agito durante la noche a temperatura ambiente. El solvente se removió bajo presión reducida, se diluyó con agua, se filt ó y se lavo con agua. Después de q?e el sólido se secó, se recrist alizo de una mezcla de éter/etanol fiara producir un sólido blanco 0.9 g
(78%), p. f. 233-4°C, 1H RMN ( DMSO - d6 )/60°C) 7.79 (brs, 8H), 7.11 (s, 2H), 6.25 (br, 4H, 3.81 (br, 2H), 1.14 (d, 6H, J-^5.9).
13C RMN (DMSO-d6/60°C) 152.4, 142,0, 136.6, 130.4, 126.8,
122.8, 108.7, 43.5, 22.8.
EJEMPLO 8 Preparación de diclorhidrato de 2.S-bist^-N- isopropiDamidino) fenil] furano
0.78 g (0.002 rnol) de la base libre preparada como se descr'ibe en el ejemplo 7 se disolvieron en 10 mi de etanol absoluto y se trataron con 10 rnl de etanol saturado con cloruro de hidrogeno y se calentaron durante 2 horas. La mezcla fue re ucid en volumen a 5 mi. la adición de 20 ml de éter seco produjo un precipitado aman Lio brillante el cual se filtro, se lavo con 3x5 ml de éter seco y se secó al vacio a 65°C durante 2 horas para producir o.8 g (87%). Pf. 276 - 7°C( dec) . IR (KBr). III RMN (DMSO-dß) 9.72 (s, 1H) 9.69 (s, IH), 9.57 (s, 2H) , 9.24
(s, 2H), 8.06 (d, 4H, J-8.1) 7.06 (d, 4H, 3=8.1), 7.42 (s, 2H), 4.14 (s, 2H, 3=6.6), 1.29 (d, 12H, 3=6.5). 13 C RMN ( DMSO-dß ) 161.1 , 152.3, 133.6, 129,2, 127.7, 123.5, 111.3, 45.1, 21.1. Anal., calculado para: C24H28N4O 2HC1 1.25 H2O: C, 59.57; H. 6.79; N, 11.57. Se encontró: C, 60.00; H, 6.80; N,
11.52.
EJEMPLO 9 Preparación de 2,5-bisL"(4-(4,5-dihidro-lH-imidazol-2-il) fenil) ]-3-(4-toliloxi) furano
_____ 1 - ( 4-t ol 1 Loxi ) -1 , 2--b?s ( -bromobenzoi l )et 1 leño. A una solución de 1 , 2-d? romo- l , 2-d? ( 4-bromobenzo?l )et ano (11.1 g, 0.02 mol) en 35 mi de THF se añadió una suspensión de fenoxido de 4-met ilo de sodio ["preparada de 0.92 g( 0.04 mol) Na y 4.32 g (0.04 mol) 4 -rnetil fenol en 30 mi THF llevando a reflujo durante 4 a 5 horas]. La mezcla amarilla fue llevada a reflujo dur-ante 2 a 3 horas (seguida por cromatografía de capa delgada) después de lo cual el THF se removió bajo presión reducida. El residuo se trató con agua, y el solido se filtró, se lavo con agua, se secó con (N 2 0.d y se disolvió en cloroformo.. La polución de cloroformo se pasó a < raves de una columna de sílice (elución con ? 5% de éter en hexano). El resultado fue un solido cristalino Illanco, 4.95g (50%), p f L37-8°0. TR (KBr) 3087, 3035, 2868, L687, 1646, 1587, 1572, 1557, 1502, 1399, 1364, L194, 1068, 10(39, 971, 076, 815, 772, 526. 1H RMN (CDC13/35°C) 7.92 (d, 2H, 3=8.8), 7.65 di, 2H, 3=8.8), 7.55 (d, 2H, 3=8.8), 7.48 (d, 2H, 3=8.8), 7.27 (d, 2H, 3=8.3), 7.11 di, 2H, 3=8.3), 6.32 (s, 1H), 2.4 (s, 3H). 3 C RMN (CDCl3/35°C) 189.4, 187.6, 168.4, 150.9, 136.6, 136.0, 133.4 132.3, 131.8, 130.9, 130.3, 129.6, 129.2, 128.2, 120.6, 101.8, 20.95. MS rn/e 500 (M+). 2, 5 -bis (4-brornofen?l ) -3-(p-tol?lox ) furano. Una solución de 5.0 g (0.01 mol) de 1 - ( -tol?lox? ) -1 , 2-b?s- ( - bromobenzoi 1 )et? leño en 10 ml de t icLoruro fosfórico se calentó bajo reflujo durante 3-4 horas (seguido por cromatogr f ía de capa delgada). El PCI3 en exceso se removió mediante des ilación y el residuo fue triturado con agua/hielo (reacción exotérmica). La soluci n se extrajo con diclorometano (75 mi) y la capa de di clorometano se lavo con una solución de bicarbonato de sodio saturado, agua, y se seco con (Na2S? ). El solvente se removió ba o presión reducida. El solido residual fue croma* ografiado sobre gel de sílice usando éter': hexano (2:8 a 1:1) corno eluyente. Un solido cristalino blanco se obtuvo, 2.78 g (56%), pf. 92-3°C. TR (KBr) 2923, 2851, 1560, 1506, 1467, 1390, 1209, 1072, 1066, 945, 825, 707, 486. 1H RMN (CDCl3/35ßC) 7.69 (d, 2H, 3=8.8), 7.46-7.43 (m, 6H), 7.12 (d, ^H, 1 = 8.3), 7.0 (d, 2H, 3=8.3) 6.47 (s, 1H), 2.31 (s, 3H). 13Q K N (CDCÍ3)/135°C) 150.8, 150.1, 142.8, 139,3, 133.0, 131 ,9, 131.7, 130.3, 129.1, 128.6, L25.L, 125.0, 121.8, 120.5, 117.1, L02d, 20.6. MS ?n/e 484 (M+). 2,5 -b?s(4 -cianofenil ) -3-( 4- toliloxi ) furano. Una mezcla del compuesto de di bromo preparado anteriormente (2.5 g, 0.0051 rnol) y cianuro cuproso (1.81 g, 0.02 mol) en 8 rnl de N- metil- 2-fu rrolidona seca se calentó a ca. 200°C bajo una atmosfera de nitrógeno durante 2.5 hr (seguida por cromatografía de capa delgada), enfriada, y vaciada en 200 rnl de agua. Fl solido precipitado se filtró, se resuspendio en 100 rnl de agua, se añadieron 100 ml de NaCN al 10%, y la mezcla se agito durante 3-4 hr. Fl sólido se filtró, se lavo con agua y se coloco en un dispositivo extractor de solidos usando acetona por ca. 24 hr. El extracto de acetona fue reducido en volumen y pasado a tr-avés de una columna corta de aluminio neutral, ol eluato se evaporó y el solido resultante se recpstalizo de 0HCl3=eter (2:8) para dar un solido cristalino amarillo 1.2 g (62%), p.f. 198-9°C. TR (KBr) 3067, 2223, 1618, 1303, 1505, 1402, 1220, 1169, 1008, 926, 840, 320, 668, 546 cpr 1. 1H RMN
(CDC13/35°C) 7.98 (d, 2H, 3=8.8) 7,75 (d, 2H, 8.3), 7.68 8d, 2H, 3=8.8), 7.65 (d, 2H, 3=8.8), 7.19 (d, 2H, 3=8.3), 7.05 ( , 2H, 3=8.3), 6.66 8s, 1H), 2.36 (s, 3H). 13c RMN (CDC13 /35°C ) 154.3, 150.3 145.8, 139.1, 134,0, 133.6, 133.3, 132.7, 132.6, 130.5, 124.2, 123.8, 119.0, 118.6, 117.8, 111.5, 110.0, 104.5,
.7. Anal, calculado para C25H16N2O2: C, 79.76; H, 4.28; N, d-44; Se encontró: C, 79.68; H, 4.31; M, 7.39 MS m/e 376 ( + ) . 2,5-b?sr (4-(4,5~d?h?dro- 1 H- irnidazol - 2- 11 )feml )M- (4-tol?lox?) furano. El bi nitplo preparado anteriormente f l g (0.0026 mol)] se coloco en 20 rnl de e anol absoluto y 50 rnL de dioxano absoluto, el cual se saturó con gas de HCl seco a
0°C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 días. Se formó ?n precipitado amarillo delgado, 100 mi de éter- seco se añadieron y el solido fue filtrado, lavado con 100 mi de éter seco y secado al vacio a 25°C durante 5 horas para producir 0.78 g (66%) de clorhidrato de ester de irnidato. El ester de inidato fue resuspendido en 25 ml de etanol seco y calentado a reflujo suave con 0.31g (0.0053 mol ) de etilendia ia durante 12 horas. El etanol en exceso se removi mediante destilación y el residuo se trato con agua, se basificó con NaOH de 1M (agitado y enfriado) . El precipitado amarillo fue filtrado, lavado con agua; secado y recp stal izado de etanol hirviendo para producir 0.6 g (74%) , pf. 156- PT,. IR (KBr) 3128, 2927, 2862, L609, L506, 1398, 1218, 1105, 987, 848, 669 cm-l . 1H RMN ( DMSO-dß /50°C ) 7.94-7.84 (rn, 8H) , 7.2L (d , 2H, 3=8.3) , 7.12 (s, 1H) , 7.08 (d, 2H, 3=8.79) , 3.63 (s, 4H) , 3.62
(s, 4H) , 2,28 (S, 3H) . 13C RMN (DMSO-d6/50ßC ) 163..0, 162.9, 154.3, 150.4, 142. R, 139.0, 132.4, 130.8, 130,4, 130.1 , 129, 7, 128.5, 127.5, 127.4, 123.2, 122.6, 116.5, 104.0, 49,3, 49.2, 19.9. MS rn/e 462 (M+ ) La base libre C0.5 g (0.001 mol)] en 10 ml de HCl etanólico se calentó a reflujo 3 hr y se añadió a 50 ml de éter -seco diluido. Fl precipi ado amar illo resultante se filtro, se lavo con éter- seco y se seco al vacio a 80°C durante 24 horas, 0.48 g (90%) pf >300°C. Anal, calculado fiara: C2 H2ßN ? - 2 HCl : C, 65.04; H, 5.27; N, 10.46. Se encontró: C, 64.83; H, 4.99; N, 10.22. TR (KBr) 3422, 3235, 2964, 2775, 1609, 1506, 1370, 12Ü9,
1206, 848, 667 cpr l . H RMN (DMSO-dß8D2O/TSP/60°C) 7.98-7.06 (rn, 8H), 7.19 (d, 2H, 3 = 9.79) 7.09 (s, 1H), 7.03 d:l, 2H, 3 = 8.3) , 3.88 (s, 4H) , 3.76 (s, 4H), 2.24 (s, 3H) . «o RMN (DMSO-dß/D2?/TSP/60°C) 165.3, 165,3, 154.7, 151.2, 145.7, 139.5, 134.3, 134.2, 135,1. 131.2, 129.6, 129.5, 124 ,8, 124.1 ,
123.3, 121.6, 117.7, 106.0, 45.8, 45.6, 20.7.
EJEMPLO 10 Preparación de 2,5-bisC4-(2-tetrahidropirinimidil) fenil]3-(4- tolioxi) furano
Una mezcla agitada de éster de irnidato (1.08 g, 0.002 mol) y 1,3-d?am?nopropano destilado frescamente (0.43 g, 0.006 rnol) en 30 mL de etanol absoluto fue suavemente calentada bajo reflujo (protegida de la humedad) durante 12 horas. El exceso de etanol se removió bajo presión reducida y el residuo se filtro con 50 rnl de agua destilada. La mezcla se hizo básica con NaOH de 1M (pH 10) mientras se enfriaba y agitaba; la base libre precipitada se filtro, se lavo con agua, se seco y se recrist l izó de etanol caliente para producir 0.80 g (81.6%) ; pf. 190-191°C. TR(KBr-): 3257, 2931, 2858, 1609, 1505, 1369, 1216, 846, 666 cur 1. 1H RMN ( DMSO- ß/50°C ) 7.88-7.78 ( ?n , OH), f . 7 (d, 2H, 3=8.0), 7.12 (s, 1H), 7.07 (d, 2H, J--8.8), 3.38 (», OH, 3=5.1), 2.28 (s, 3H) , 1.75 (tt, 4H, 3=5.1): 13_C RMN (DMSO dß/50°C) 154.4, 153.8, 153,4, 150.5, 142.8, 139.0, 134.5, 132.9, 132.4, 130.6, 130.3, 130.3, 126.8, 126.7, 123.1, 122.5, 116.6, 104.1, 41.0, 40.8, 20.0, 19.8; MS m/e 490 (11+ ) . Una suspensión de 0.5 g (0.00 l mol) de la base libre en 5 ml de etanol absoluto se trato con 10 rnl de HCl etanol ico y se calentó bajo reflujo suave durante 2 hr. Se añadieron 50 níl de éter seco y el precipitado amarillo obtenido de esta manera se filtró y se lavó con éter seco y se secó al vacío a 60°C durante 12 hr-. El producto de sólido amarillo 0.46 g (82%). Pf>320°C. IR (KBr): 3423, 3117, 3002, 1638, 1609, 1507, 1375, 1315, 1202, 846, 669 cpr ; H RMN ( DMSO-dß /D20/TSP/65°C) 8.12 (d, 2H, 3=7.8), 8.08 (d, 2H, 3=7.3), 7.88 (d, 4H, 3=8.3), 7.32 (d, 2H, 3=8.3), 7.22 (s, 1H), 7.16 (d, 2H, 3=8.3), 3.6 (br, m, 8H), 2.37 8s, 3H) , 2.1 (b m, 4H) . 13C RMN (DMSO-dß/D2?/TSP/65°C) : 159.5, 154.8, 151.1, 145.1, 140.9, 139.6, 134.1, 133.9, 133.9, 133.5, 133.2, 128.7, 128.5, 127.2, 124. B, 117.6, 105.9, 41.5, 41.4, 20.6, 18.2. Anal. calculado para: C3?H3?N4?2- 2HC1. C, 66.06; H, 5.36; N, 9.94 Se encontró: 0, 65.91; H, 5.21; N, 9.88.
— E—JE—M—P——L—O — 1 —1 Preparación de 2,5-bisC4-(2-imidazolinil) fenil]-3-metoxi-furano
l , 2-B? s( -br-omobenzoi 1 ) - 1 -rnetoxiotano. A una solución de 1 ,2-d?bromo- 1 , 2- d?( -brornobenzoil ) etano (lid g, 0„02 mol) en 150 rnl de metanol seco se añadió una solución de metóxido de sodio en metanol (0.92 g de sodio en 50 L de rnetanol),. La mezcla café amarillenta se llevó a reflujo durante 1-1.5 hr. Fl solvente se removió por destilación, el residuo se suspendi en agua y la mezcla se extrajo con 100 mL de cloroformo. EL extracto de cloroformo se lavó con agua, se seco con (Na2 Q.») y se concentró. Fl residuo obtenido se tituló con eter-metanol seco (3:1) para producir sólido cristalino blanco, 5.6 g (78%), pf. 153-154°. IR (KBr): 3106, 3062, 2932, 1689, 1649, 1583, 1556, 1403, 1223, 1202, 1182, 1086, 1010, 1000, 857, 814, 738,
618, 472 crn- . H (DI1SO-dß/40ßC) : 7.95 (d, 2H, 3=7.8), 7.77 (4H, 3=8.8), 7.72 di, 2H, 3=7.8), 6.89 (s, JH), 4.08 (s, 3H). ¿3c (DMSO~dß/40°C) : 189.9, 187.2, 168..8, 139.9, 135.9, 133.1, 132.2, 131.8, 130,3, 128.1, 127.4, 98.6, 58.5. MS m/e 424 (M+) 2, 5-BIS-C -bromofenil] -3-rnetox?- furano El rnetoxi-etano preparado anteriormente se disolvi en 5 mL PCI3 y se calentó a reflujo dur-ante 3 horas. El PCI3 en exceso se removió por- destilación. Cuando se t ató con hielo y agua, el residuo formó una masa gomosa. La mezcla se extrajo con cloroformo y la capa orgánica se lavó con agua, se seco con (Na2 0ü ) y se purifico mediante cromatogra ía colurnnar sobre gel de sílice -tusando hexano: éter (4:1 a 2:1). Un solido blanco en 62% de producto se obtuvo, pf 112-L13°C Clit. pf 113°C; R.E. Lutz, 3. Arn. Chem. Soc. 51, 3008 (1929)]. TR (KBr) 3062, 2908, 2877,
16L7, 490, L391 , 1211, 1160, 1099, 1073, 1034, 1006, 925, 827, 787. 1H RMN (CDC13.) f.,69 (d, 2H, 3=8.8) , 7.67.5 (rn, 4H), .47
(d, 2H, 3=8.8), 6.64 (s, 1H), 3.9 (s, 3H) . 3C RMN (CDCI3) 149.7, 147.5, 135.5, 131.9, 131.5, 129.4, 129.3, 125.0, 124.5, 121.5, 119.3, 98.6, 58.6. MS ?n/e 408 (M+ ) .. 2,5 -B?s(4 - c?anofen?l)-3-rnetox? furano. Una mezcla de 2,5-tus (bromofeml)-3-rnetox? f?rano (4.08 g, 0.01 mol) y cianuro cuproso (3.09 g, 0.035 mol) en 10 ml_ de N-met íl -2- pirrolidona seca se calentaron ca. 200°C bajo N2 durante 2.5 hr. La mezcla se enfrio y se vacio en 200 mL de agua y el sólido café amarillento precipitado se filtro y se lavo a conciencia con agua. El sólido se resuspendio en agua (50 rnL) y
LOO mi. de NaCN al 10% y se agitó durante 2 hr. La suspensi n se
^f litro, se lavó con agua, se secó y se suspendió en 250 mL do acetona y se pasó a través de una columna de alumina neutral.
En la elución con acetona resultó un sólido amarillo. Fn la recristalización de CHC12:éter (1:1) dio (1.8 g, 60%) pf 257- 258°C. TR (KBr) 3128, 2223, 1608, 1599, 1501, 1409, 1174, 1163, 1027, 924, 836, 815, 651, 537 crn- 1. 1H RMN (DMSO/45°C) 8.03 (d, 2H, 3=8.3), 7.95 (d, 2H, 3=8.79), 7.91 (d, 2H, 3=8.3), 7.85 (d, 2H, 3=8.79), 7.62 (s, IH), 4.0 (s, 3H). 13c RMN (DMSO/45°C) 150.0, 149.8, 134.6, 133.4, 133.2, 132.7, 132.5, 124.0, 1227.
118.9, 118.5, 110.0, 107.6, 102.4, 59.0 MS rn/e 300 (M+ ) . Anal.
^calculado para: C19H12N2O (300.31): C, 75.98; H, 4.03; N, 9.33; ~(- encontró- C, 76.02; H, '+.04; N; 9.36. 2,5 -Bi sT4 - ( 2 -irní dazol mil) f n? 1 ] - 3 -met 0x1 --furano E L bis nitr-ilo preparado ant er-iormente (0 9 g, 0.003 mol) se suspendió en 70 mL de etanol seco, se saturó con gas de HCl seco a 0-5°C y se agitó bajo condiciones secas durante 3-4 días. La mezcla se diluyo con 200 rnL de éter seco y el ester de arnidato amarillo se filtró y se Lavo con éter seco y el solido se secó al vacio durante 5-6 hr para producir 1.2 g (86%) . El solido fue resuspendido en 30 L de etanol seco y llevado a reflujo suavemente con 0.46 g (0.008 rnol) de etiJendiamina seca durante 12 hr-. El solvente se removió por destilación. El re Lduo se suspendió con 50 ml_ de agua fría y se hizo básico con NaOH de 1M. El precipitado se filtro, se lavo con agua y se seco. La recp talizacion de la mezcla de etano L -éter produjo 0.74 g (75%) pf 186-L07°C (dec.). TR (KBr-) 344, 3245, ^2931, 2857, 1601, 1512, 1397, 1366, 1277, 1162, 1104, 1031, 926, 842, 743, 670 cpr . H (DMSO- dß/60°C) 7.93-7.86 fin, BH), 7.32 (s, 1H), 3.98 (s, 3H) , 3.69 (s, 4H), 3.67 (s, 4H) . 13Q RMN (DMSO-dß/60°C: 163.3, 163,1, 126.1, 123.0, 121.9, 100.6, 50.7, 49.0, 48.5. MS m/e 386 (M+). La base libre 0.58 g 80.0015 mol) se disolvió en 10 rnL. de etanol caliente y se trato con 10 mL de HCl etanólico saturado. La mezcla se calentó a reflujo durante 30 minutos. Cl volumen se redujo al vacío a 5-6 L. L.a mezcla resultante se -•-liLuyo a 60 L de éter seco. El solido cristalino amarillo obtenido se filtro, se lavo con eier seco y se seco al vacio a hO°C durante 12 hr' para producir 0.62 g (83%) , pf 189-190°C (dec) . TR (KBr) : 3422, 3128, 2975, 1599, 1510, 1405, L363, 1285, 1207, 1028, 845, 666 cpr 1. *H ( D2 O/TSP/50°C) 7.52- .43
(m, 8H), 6.87 (s, LH) , 3.92 (s, 3H) , 3.86 (s, 8H) . 13C (D20/TSP/50°C) 167.2, 153.1, 152.4, 137.6, 137.5, 137.2, 130.9, 130.7, 126.5, 125.4, 122.1, 119.8, 104.2, 61,5, 47.0, 46.9, Anal . calculado para: C23H22M4O2 -0.5 H2O-HCI : 0, 58.97; l-l, 5.38; N, 11.96. Se encontró: C, 59.16; H, 5.35; N, 11.00.
EJEMPLO 12 Preparación de 2,5-BisC4(N-ciclo-propilguanil) fenil furano
Una mezcla de éster' de i ida to (1.3 g, 0..003 mol), cicloprop lamino (0.43 g, 0.0075 mol) en 35 L de etanol seco se agitó durante la noche. El solvente se removió al vacio y se añadió agua para formar una solución amarilla. La solución se hizo básica con NaOH de 1M enfriando y agitando. El solido entonces formado ee filtro, se lavo con agua y se seco. Fl solido se disolvió en cloroformo, se seco sobr-e Na^SO.; y el solvente se removió. El residuo se recpstalizó de eter:CHCl3 (5:1) para dar- un sólido amarillo pálido 0.8 g (709%) pf 185- 186ßC (dec.). IR (KBr-): 3464, 3320, 3080, 1610, 1510, 1364, 1022, 348, 791 cprl . H RMN (COC13 ) : 7.71 (br s, 8H), 6.78 (s,
2H), 5.3 (v br, 4H), 2.6 (br ?n, 2H), 0.87-0.81 (m, 4H), 0.67- j- b? (m, 4H). 13C RMN (CDC13 • DMSO-dß: 159.6, 152.2, 134.8, Í30.7, 126.4, 122.6, 107.7, 25.7 6.04. MS m/e 388 (M+) La base li re (0.6 g, 0.0015 rnol) se suspendi en 3 rnL de etanol seco y se trato con 6 mi. de HCl etanol ico y se calentó suavemente a 65°C durante una hora. La solución amarilla se diluyó con 50 mi. de éter- seco y se filtro, se Lavo con éter seco y se seco al vacio a 75°C durante 12 horas. El pr-oducto de sólido amarillo fue 0.55 g (80%), pf>310°C (dec.). IR (KBr): 3369, 3181, 3037, 1665, 1607, 1502, 1032, 782, 674 cm-1. H RMN (DMSO-dß): 10.24 (s, 2H), 9.86 (s, 2H), 9.27 (s, 2H), 8.06 (d, 4H, 3=7.94), 7.95) (d, 4H, 3=8.54), 7.42 (s 2H), 2.87 (br , 2H), 1.09-0.85 (m, 8H) . 13C RMN (DMSO-dß: 163.9, 152.3, 133.7, 129.1, 126.6, 123.5, 111.3, 24.7, 6.5. Anal, calculado para: C24H2-4N4O-2HCI : Cal.C, 53.02; H,5.73; N, 12.25. Se encontró: C, 62.89; H, 5.95; N, 12.00.
Ejemplo 13 Preparación de muestras para detección fluorescente
Químicos. DAPT Hoechst 33258, y distanuci a fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. Fuentes de muestras. Se cul ivaron gia dia larnblia mediante métodos normales como se describe previamente (C.A.
Bell, et al., Agents and Chemother. 37, 2668-2673 (1993)), liberados de los tubos de cultivo mediante enfriamiento, y lavados con r-egulador de pH HB?S (solución de sal balanceada -tí nl- s disponible de Sigma Chemical Co.). Los organismos fuer-on entonces incubados con el tinte durante 5 minutos y lavados una vez con regulador de pH HBSS antes de montarse {¡ara La microscopía. Los esparcidos de cromosoma de meta fase fueron preparados de linfocitos humanos mediante métodos norma Les. La tinción de todos Los colorantes siguió los protocolos normales usados para DA (distarm c?na)/tmc?ón de DAPT de bandas C (0. Miller, Principies and Practices in Medical Genetics (I ong an Group Limited, Nueva York 1983) y D. Silvonen, ACT Cytogenotic ?_ab Manual (Universidad de California, San Francisco (1980)). Específicamente, cuando se tifió con DAPT, el portaobjetos fue impregnado de una solución de regulador de pH, regulador de pH de Macllvaine (pH 7.5), durante 10 minutos (el r-egulador- de pH de MacTlvame se preparó como se conoce mezclando una solución de ácido cítrico anhidro (0.2M, 19.2 g/litro) y una solución dibásica de fosfato de sodio anhidro
(Na2HP0«) (0.2M, 28.4 g/litro). El portaobjetos fue teñido jsando DAPI 0.2 ug/ml ) durante 10 minutos y enjuagado con regulador de pH de MacTlva e. Este mismo procedimiento de tinción se sigui para teñir con los compuestos de la formula 1, excepto que el portaobjetos fue teñido usando 0.02 µg/rnl del compue to.
s~ Ejemplo 14 Detección de ácido nucleico.
Los tejidos se montaron en el regulador de pH HBSS o en glicerol sobre un portaobjetos y se cubrieron con una cubierta delgada de vidrio. No se necesitaron materiales especiales. Las muestras fueron observadas bajo un fotomicroscopio Nikon equipado con ópticos UV (filtros con excitación de 360 n y emisión de 460 nrn) y lentes de neofluor. Las imágenes fueron fotografiadas con película Ektachrorne 1600 ASA o con pelicula blanco y negro Technical Pan 400 ASA. Los tiempos de exposición fueron de O.L a 5 segundos. Las fotografías muestran una comparación de tinción nuclear de G. lambí i por los tintes de la fórmula I en comparación con DAPI y Hoechst 33258,, El tinte altamente especifico de AUN. El 2 , S-his - ( 4 , 5 , 6 , 7- tet rahi dro-lH-1 , 3- ___ d?aze??n-2-?l) feni l] furano no tuvo una tinción antecedente del citoplasma giardial, i dicando que no ocurre vinculación a ARN o a elementos ci oesq?eléti eos. Para DAPI, Hoechst 33258, y 2, 5- b?s(4-am?d?nofen? 1 ) furano, se observó la tinción significativo del citoplasma giardial. Par-a DAPT y 2,5-b?s(4- arm dinofeni 1) furano, hubo una tinción aparente de estructuras rnicrotubulares o filamentosas también. Se ha reportado que el DAPT puede teñir- tubulina y microtúbulos (D. Bonne, et al., 3. Biol. Chem. 260, 2819-2825 (1985)), pero los autores reportaron que esta tinción no puede ser' observado en fibroblastos intactos. Estas fotografías sugieren que en giardia, el DAPT ti e un elemento estructural que puede ser tubulina corno también la tinción intensa de cidos nucleicos. Ademas de gi rd , los cromosomas de eta fase humanos teñidos con los compuestos de la fórmula I fueron examinados en comparación con el DAPI ya que este es ampliamente usado fiara examinar* marcas de regiones ricas en AT de cromosomas que producen "bandas C" en cromosomas 1,9,15,16 y Y (0. Miller, Principies and Practices in Medical Genetics (Longman Group Limited, Nueva York 1983)). Los tintes de furano 2,5-b?sL"4~ (4,5,6, 7-tetrahidro-lH-l , 3 -d?aze??n-2-i 1 ) fenil ] furano ; 2,5- b?s{C4~ (N-isoproiL )am?d?no] fen?l3 urano; y 2,5-bas(4- arní diño feni 1) f?r-ano, produjeron patrones de tinción substancialuiente similares a aquellos del DAPT. Los tintes de furano emiten un color- azul de una long ud de onda ligeramente diferente que la emitida por el DAPT. Esto puede resultar- en una menor dispersión ligera que la observada con el DAPT, y de esta manera existe el potencial de delinear con más detalle. Ademas, un manejo especial y/o protocolos de almacenamiento no son necesarios con los tintes de furano. Los r uranos dicat iónicos han sido también examinados en muchos otros tipos de tejidos corno bacteria, levadura, plantas, y células de cultivo de tejidos. En cada caso, su sensibilidad a la detección de ADN es comparable a aquella del DAPT con la ventaja de que su color rnas azul y propiedades específicas de ADN pueden elucidar- más detalle.
9" Ejemplo 15 Mediciones de vinculación de ácido nucleico
Las afinidades de vinculación para los tintes con ácidos nucleicos han sido previa ente descritas (U.D. Uilson, et al., Biochernistry 3, 4098-4104 (1993); U.D. Uilson, et al., Molecular Basis of Specificity m Nucleic Acid-Drug Inter-actions (Kl? er Academic P?blishers, Arnster-dam 1990), pp. 331-353) excepto para los compuestos de la formula la y Ib. Los parámetros de vinculación de acido nucleico fueron determinados fiara estos compuestos de la misma for-rna que los anteriores. Específicamente, los parámet os de vinculación de acido nucleico fueron determinados usando estudios de fusión térmica (Trn) usando un eepectrofotomet ro Cary 219 en ínter fase con una rnicroconputadora Apple lie. La temperatura del Cary se controlo mediante un prograrnador de tern fiera tura Haake PG20 conectado a un baño de ref pgerado Haake A81, el cual fue puesto fiara r " incrementar La temperatura a 0.5°C por minuto. Un tepnistor fijo en un tubo para espectrometría fue usado para moni torear la temperatura. Las comparaciones de Tm fueron conducidas con el polímero de ARN poli (A) pol?(U) y la secuencia de ADN correspondiente ?ol?(dA) pol?(dT). Los polímeros fueron añadidos a 1 mL de regulador- de pH en células de cuarzo de volumen de longitud reducido de trayectoria de 1 cm, y la concentración se determino midiendo la absorbencia a 260 nrn. Los experimentos fueron generalmente conducidos a una concentración de 5xl0~5M de pares base de ADN y a una relaci n de par base/compuesto de 0.6. Los compuestos fueron comparados mediante el aumento en Tin (Trn = Trn del complejo - Tin del aci o nucleico libre) que éstos produjeron. El cuadro I compara las afinidades de ADN y ARN de los tintes fluorescentes 2, 5 -b?s( 4-am?d?no feru l ) furano (DB75); 2,5-b?sL"4-(4,5,6,7-tetrah?dro-LH-l,3~diazep?n-2- iPfeml] furano (DB161) ; 2,5-b?s{L"4-(N-!soprop?l)amidino]fen?l}furano (ÜB181) ; y 2 , 5-b?s( 4- (1,4,5,6, -tetrahí dropirirnidin- 2-?l ) fenil ] fur ano (DB103), en comparación con los compuestos de DAPl y Hoechst 33258.
CUADRO I Estructuras de los tintes y su vinculación de ácido nucleico determinadas según temperaturas de fusión.
Estructura Tm(A-U) Tm(dA-dT) DAPT 3.9 >25 Hoechst 33258 17.5 >25 DB75 5.7 24 ,6 ÜB103 2.5 >25 DB161 0 >26 DB181 1.5 >26 y.. Ejemplo 16 Mediciones espectrales
Los tmtes, ya sea con o sin ADN o ARN presente, fueron examinados por absorción maxirna en un espect rofotóme* ro de doble haz Shimadzu. La determinación de su excitación fluorescente y emisión máxima fueron det rminadas en un fluorimetro LKB. la absorbencia máxima, coeficie tes de excitaci n, excitación máxima y emisi n m xima son mostrada1' en el cuadro II a continuación.
Cuadro II
Ul
59
^ . Ejemplo 17 Detección del elemento citoesquelético
Las muestras fueron preparadas y observadas corno se describió anteriormente en los ejemplos 9 y 10, excepto que las muestras fueron teñidas usando los siguientes compuestos: DB 99, DB 154, y ÜB 155. Las fotografías muestran que par'a los compuestos DB 99, DB 154, y DB155, ocurre la tinción fiara los elementos citoesqueleticos, es decir, de estructuras mi crotubulares o filamentosas de G. lambí ?a. Los ejemplos anteriores son ilustrativos de la presente invención, y no deben ser considerados corno limitantes de la misma. La invención se define por las siguientes reivindicaciones, con equivalentes de las reivindicaciones para ser incluidos en la misma.
Claims (13)
1.- Un método para la detección fluorescente de un acido nucleico que comprende, a) poner en contacto dicho acido nucleico con un compuesto según la fórmula (I)„
en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H, alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a C¿ , cicloalquilo de C3 a Ce, aplo de C3 C-10, hidrox lalquilo lineal o ramificado de Ci a Q¿, , aminoal qui lo iineal o ramificado de Ci a C<j o alquila oalquilo lineal o ramificado de Ci a Ct, ; o R y R2 juntos representan alquileno de C2 a Cío; o RI y R3 juntos son:
54+
t n donde n es de 1 a 3 y Rio es H o CONHRn NR15R16, en donde R11 es un alquilo inferior lineal o ramificado do Ci a O4 y R15 y Ríe se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H y alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA ; R3 es H, alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a C¿, , cicloalquilo de C3 a Ce , aplo de C3 a Cío hidroxialquilo lineal o ramificado de Ci a CA , am oalquilo lineal o ramificado de Ci a CA , o alquila inoalquilo; y A es un grupo aromático heterocicl ico seleccionado del grupo que consiste de:
en donde R4 , R5 V R& se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H, alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a C4 , halógeno, oxialquLlo, oxia ilo, u ox larilalqui lo; R12 es hidrogeno, alquilo inferior- lineal o ramificado de Ci a C4 , hidroxilo, arní noalquilo lineal o * unif icado de Ci a C4 o alqui lar inoalqui 1 o lineal o ramificado de Ci a C¿ ; con la condici n de que cuando íl es
Rl , R
2 , R4 y Rs son H, R3 no sea H; o una sal fisiológicamente aceptable de los mismos; y b) exponer' dicho acido nucleico a la luz para inducir fluorescencia de dicho compuesto de formula (1). 2.- Un m todo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado ademas porque dicho acido nucleico es ADN.
3.- Un rnetodo de conformidad con la reivindicación l, caract en zado ademas porque dicho acido nucleico es ARN..
4.- Un método de conformidad con la reivi dicación l, caracterizado ademas porque A tiene la fórmula estructural
5.-- Un método (ie conformidad con la reivindicac ón l, caracterizado ademas porque A tiene la formula estructural
h . - Un método de conformidad con la reivindicación 1, "Caracterizado ademas porque A tiene la formula estructural
7.- Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque A tiene la fórmula estructural
0.- Un método de conformidad con la reivindicación l, caracteri ado ademas porque A tiene la fórmula estructural
9.- Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque A tiene la fór-mula estructur-al
10.- Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque A tiene la fórmula estructural
11.- Un método de conformidad con la reivindicación , caracterizado ademas porque A tiene la formula estructural
12.- Un método de conformidad con la reivindicación , caracterizado ademas perqué A tiene la fórmula es ructural
13.- Un método de conformidad con la reivindicación , caracterizado ademas fiorque Ri y R2 juntos representan
en donde n es de 1 a 3 y Rio es H o -CONHRn NRis Ri6 , en donde Rll es un alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a C y R15 y Ri6 se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H y alquilo inferior- lineal o ramificado de Ci a A - 14.- Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque Ri y R3 representan juntos un aJquileno de C2 a C¿ y R3 es H. 15.- Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque Ri y R2 representan juntos un alq?ileno de C¿ , y R3 es H. 16.- Un m todo de conformidad con la reivindicación ., caracterizado además porque Ri y R3 son H y R2 es alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a C . 17.- Un método de conformidad con la reivindicación
16, caracteri ado ademas porque R2 es isopropí lo. 18.- Un método de conformidad con la reivindicación
1, caracterizado además porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consisto de 2 , 5-b?sC4 - ( 4, -d?hi dro-lH- ímidazoil -2-il ) fen 11 ] fu rano; 2,5-b? C4- (1,4,5,6-t e rahidropip m 1 i n-2 -ll ) feml] fu -ano, 2 , 5 -fu sil 4- ( 4 , 5 , ñ , 7-tet ahí dro-lH-1 , 3-d?azefu n- f>0
X -li ) fen 111 furano, y 2, 5-b?sC4- (N-isopropilami o) fenil f?rano, ? las sales fisiológicamente aceptables de ios mismos. 19.- Un método de con ormidad con la reivindicación 1, caracterizado ademas porque dicho compuesto de formula I es 2,5-b? C4-(4 ,5,6,7-tetrah?dro- IH-l , 3-d?aze?? n-2-?l) feml] furano o una sal fisiológicamente aceptctble de los mismos. 20.- Un método de conformidad con la reivindicación l, caracterizado además porque dicho compuesto de fórmula T es 2 ,5 - b?sC4--(M- isopropilamidino) feni 13 furano, o una sal fisiol gicamente aceptable del mi mo. 21.- Un compuesto que tiene la fórmula T
en donde Ri y R2 repr-esentan juntos un alquileno de C2 a C3 ; R3 es H; A es
hl
<en donde RA es H, y Rs es OCH3 o 0(C6H )R, en donde R es H o alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA ,- o una ,ai fisiológicamente aceptable de los mismos. 22.- Un compuesto que tiene la fórmula (I)
en donde Ri y R2 juntos representan un alq?ileno satur-ado lineal de C2 ; R3 es -RIAOH en donde RÍA es alquilo inferior- lineal o ramificado de Ci a CA ; A es
en donde RA y Rs son cada uno H; o una sal fisiológicamente aceptable de los mismos. 23.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque RÍ es -(CH2)2-- 24.- Un compuesto de conformidad con la fórmula (I)
en donde Ri y R2 representan juntos un alquileno de CA ; R3 es H, alquilo infer-ior lineal o ramificado de Ci a CA , ci cloal (jui lo de C3 a Cg , aplo de C3 a Cío, hidroxialqui lo lineal o ramificado de Ci a CA , aminoal qui lo lineal o ramificado de Ci a CA o alq?ilaminoal quilo lineal o ramificado de Ci a CA ; A es:
en donde RA y Rs se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste de H, alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA , halógeno, oxilalquilo, oxiaplo, oxiarilalquilo; o una sal fisiológicamente aceptable de los mismos. 25.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 24 caracteri ado además porque R3 , RA y Rs son H. 26.- Un compuesto que tiene la fórmula (T)
en donde Ri y R2 son H; R3 es isopropí lo, A es:
en donde RA y Rs son cada uno H; o una sal fisiológicamente aceptable de los mismos. 27.- Un compuesto que tiene la fórmula (D
en donde R y R2 son H; R3 es - (CH2 )3 N(CH3 )2 ; A e<
/» don<Je RA y Rs son cada uno H; o una sal fisiológicamente «aceptable de los mismos. 28.- Un compuesto que t iene la formula (D
en donde Ri y R2 son juntos
en donde n es de 1 a 3 y Rio es H o CONHR11NR15 Ríe , en donde R11 es un alquilo inferior lineal o ta i icado de Ci a CA y Ris y Ríe se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H y alquilo inferior- lineal o rami icado de Ci a CA ; R3 es H; A es
en donde R y Rs son H o una sal fisiológicamente aceptable de *io mismos. 29.- Un método para la detección fluorescente selectiva de ADN en una mezcla de ácido nucleico que contiene ADN y ARN, dicho método comprendiendo a) poner en contacto dicha mezcla de acido nucleico con un compuesto según la formula (T)
en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H, alquilo inferior- lineal o ramificado de Ci a CA , ci cloalq?ilo de C3 a Ce, aplo de C3 a C-10, hidroxialqui lo lineal o ramificado de Ci a CA , ami noalq? 11 o lineal o ramificado de Ci a CA ; o Ri y R2 juntos representan alquileno de C2 a Cío; o Ri y R2 juntos son:
en donde n es de 1 a 3 y Rio es H o CONHR11NR15R16 , en donde R11 es un alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA y Ris r*. Ris se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H y alquLlo inferior lineal o ramificado de Ci a
CA ; 3 es H, alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA , cicloalquilo de C3 a Ce, arilo de C3 a Cío hidroxialquilo lineal o ramificado de Ci a CA , o arní noalq?ilo lineal o ramificado de Ci a CA ; y A es un grufio aromático heterocicli co selecciona
en donde RA , Rs y Rß se seleccionan inde nte cada uno del grupo que consiste de H, alquilo inferior lineal o rami icado de Ci a CA , halógeno, oxialquilo, oxiaplo, u ?xiaplalquilo; R12 es hidrogeno, alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA , hidroxilo, o a moalquilo lineal o ramificado de Ci a CA ; con la condición de que '-'lando A es
b?
^ Ri , R2 , Rs son H, R3 no sea H; o una sal fi iológicamente aceptable de los mismos; y b) exfioner dicha mezcla de acido nucleico a la luz fiara inducir fluorescencia de dicho compuesto de fórmula (I). 30.- Un rnetodo para la detección fluorescente de una estructur-a microtubular- que compr-ende a) poner en contacto dicha estructura microtubular con un compuesto según la formula (T)
en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H, alquilo inferior' lineal o ramificado de Ci a CA , cicloalquilo de C3 a Ce, aplo de C3 a Cío, /- hidroxial qui lo lineal o ramificado de Ci a CA , o ami oalquilo lineal o ramificado de Ci a C ; o Ri y R2 juntos representan alquileno de C2 a Cío; o Ri y R2 juntos son:
<?n donde n es de l a 3 y Rio es H o -CONHRi 1NR15 íe , e donde -rtn es un alquilo inferior lineal o lamificado de Ci a CA y Ris y Ríe se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H y alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA ; 3 es H, alquilo inferior- lineal o ramificado de Ci a CA , cicloalquilo de C3 a Ce , arilo de C3 a Cío hidroxialquilo lineal o ramificado de Ci a CA , o aminoalqui lo lineal o ramificado de Ci a CA , y A es un grupo aromático heterocicl ico seleccionado del grupo que consiste de:
en donde RA , Rs y Rß se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H, alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA , halógeno, oxialquilo, oxiaplo, u oxiaplalq?ilo; R12 es hidrogeno, alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA , hidroxilo, o ammoalquilo lineal o ,»-ramificado de Ci a CA ; con la condición de que cuando A o
y Ri R2 , RA y Rs son H, R3 no sea H; o una sal fisiológicamente aceptable de los mismos; y b) exponer- dicha estructura microt ubular a la luz para inducir- fluorescencia de dicho compuesto de formula (I). 31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la estructura microtubular reside en un citoesqueleto celular. 32.- Un método para la detección fluorescente simultanea de una primera estructura celular y una segunda estructur-a celular- en una célula, caracterizado porque dicha primera estructura celular y dicha segunda estructura celular son diferentes, dichos rnetodo comprendiendo a) poner en contacto dicha célula con un primer compuesto fluorescente y un segundo compuesto fluorescente, en donde dicho primer compuesto fluorescente se une selectivamente a dicha primer-a estructura y dicho segundo compuesto se une selectivamente a dicha segunda estructura; en donde dicho primer compuesto fluorescente y dicho segundo compuesto fluorescente tienen diferentes espectros de emisión fluorescentes, en donde dicho segundo compuesto fluor-escente es est ructuralmente diferente del ''iencionado primer- compuesto fluor-escente, y on donde cada uno de dichos compuestos fluorescentes tienen una estructura según la formula (T)
en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H, alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA , cicloalquilo de C3 a Ce, arilo de C3 a Cío, hidroxialqui lo lineal o ramificado de Ci a CA , o ami no lqui lo lineal o ramificado de Ci a CA ; o Ri y R2 juntos representan alquileno de C2 a Cío; o Ri y R2 juntos son:
en donde n es de 1 a 3 y Rio es H o -CONHR11NR15 Ríe , en donde R11 es un alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA y Ris y Ríe se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H y alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a -^ ; R3 es H, alquilo inferior, eicloalqui lo , arilo, h?drox?al(|u? lo, o ami noalqu 11 o; y A es un grupo arom tico het erocí cl 1 co seleccionado del gr-upo que consiste de:
en donde RA , Rs y Rß se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H, alquilo inferior- lineal o ramificado de Ci a CA , halógeno, oxialquilo, oxiari lo, u oxiarilalquilo; R12 es hidrogeno, alquilo infer-Lor lineal o ramificado de Ci a CA , hidroxilo, o a inoal quilo lineal o ramificado de Ci a CA ; con la condición de que cuando A es
y Ri, R2 , RA y Rs son H, R3 no sea H; o una sal isiológicamente aceptable de los mismos; y b) la exposición de dicha célula a la luz para inducir fluorescencia de ambos compuestos fluorescentes primero y segundo, de modo que la primera estructura celular y la segunda estructura celular fluorescan a diferentes espectros de emisión fluorescente. 33.- Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado ademas porque dicha primera estructur-a celular y dicha segunda estructura celular se seleccionan del grupo que consiste de ADN, ARN y estructuras microtubulares. 34.- Un equipo par-a detección fluorescente de una estructura celular que comprende a) un compuesto según la fórmula (I)
en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H, alquilo inferior lineal o ramificado de Ci a CA , cicloalquilo de C3 a Ce, aplo de C3 a Cío, hidroxialquilo lineal o ramificado de Ci a CA , o aminoalquil? lineal o ramificado de Ci a CA ; o Ri y R2 juntos representan alquileno de C2 a Cío ; o Ri y R2 juntos son:
en donde n es de 1 a 3 y Rio es H o -CONHR11NR15 Ríe , en donde Rll es alquilo inferior y Ris y Ríe se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H y alquilo inferior; R3 es H, alquilo inferior lineal, o ramificado de Ci a C , cicloalquilo de C3 a Ce , arilo de C3 a Cío hidroxialquilo lineal o ramificado de Ci a CA , o aminoalquilo lineal o ramificado de Ci a CA ; y A es un grupo aromático heteroclclico seleccionado del grupo que consiste le:
en donde RA , Rs y Rß se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste de H, alquilo inferior lineal o 7 k
¿•-.arnificado de Ci a CA , halógeno, oxialq?ilo, oxidrilo, u ox íap lal qui lo; con la condici n de que cuando A es
y Ri , , RA y Rs son H, R3 no sea H; o una sal fisiológicamente aceptable de los mismos; y b) un solvente en una cantidad suficiente par-a formar una mezcla de un acido nucleico marcado con dicho compuesto de fórmula (T), cuando dicho compuesto hace contacto con una muestra q?e incluye un acido nucleico, dicho compuesto de fórmula (I) siendo capaz de detección fluorescente cuando se expone a la luz par-a inducir- fluorescencia de dicho compuesto de fórmula (I).
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| US08238766 | 1994-05-06 | ||
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MXPA96005421A true MXPA96005421A (es) | 1998-02-01 |
| MX9605421A MX9605421A (es) | 1998-02-28 |
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ID=39165090
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| MX9605421A MX9605421A (es) | 1995-05-05 | 1995-05-05 | Metodo de deteccion fluorescente de acidos nucleicos y elementos citoesqueleticos usando aril furanos bis-dicationicos. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| MX (1) | MX9605421A (es) |
-
1995
- 1995-05-05 MX MX9605421A patent/MX9605421A/es unknown
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