MXPA06014687A - Terapia de cancer resistente a platino. - Google Patents

Abstract

La presente invencion es concerniente con un metodo para el tratamiento de cancer de ovarios resistente al platino, carcinoma peritoneal primario o carcinoma de tubo de Falopio con la combinacion de un anticurpo de HER2 que inhibe efectivamente la dimerizacion de HER, tambien como gemcitabina.

Description

TERAPIA DE CÁNCER RESISTENTE A PLATINO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con un método para el tratamiento de cáncer de ovarios resistente a platino, carcinoma peritoneal primario o carcinoma de tubo de falopio, con la combinación de un anticuerpo HER2 que inhibe efectivamente la dimerización de HER también como gemcitabina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Anticuerpos HER La familia de HER del receptor de tirosina cinasas son mediadores importantes del crecimiento, diferenciación y sobrevivencia celular. La familia de receptor incluye 4 elementos distintos en los que se incluyen el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbBl, o HERÍ), HER2 (ErbB2 o pl85neu) , HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2). El EGFR, codificado por el gen er Bl ha sido implicado causalmente en malignidad humana. En particular, se ha observado la expresión incrementada de EGRF en cáncer de pecho, vejiga, pulmón, cabeza, cuello y estómago, también como glioblastomas. La expresión del receptor de EGFR incrementada está frecuentemente asociada con la producción incrementada del ligando EGFR, transformando el factor de crecimiento alfa (TGF-a) , por las mismas células de tumor dando como resultado activación del receptor por una ruta estimulatoria autócrina.

Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994). Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EGFR o sus ligandos, TGF-a y EGF, han sido evaluados como agentes terapéuticos en el tratamiento de tales malignidades. Véase, por ejemplo, Baselga and Mendelsohn., supra; Masui et al. Cáncer Research 44:1002-1007 (1984); y Wu et al. J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995). El segundo elemento de la familia de HER, pl85neu, fue identificado originalmente como el producto de la transformación genética de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La forma activada del neu proto-oncógeno da como resultado una mutación puntual (valina a ácido glutámico) en la región de transmembrana de la proteina codificada. La amplificación del homólogo humano de neu se observa en cánceres de pecho y de ovarios y se correlaciona con una prognosis deficiente. (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); y Patente estadounidense No. 4,968,603). A la fecha, ninguna mutación puntual análoga a aquella en el proto-oncógeno neu se ha reportado para tumores humanos. La sobreexpresión de HER2 (frecuente pero no uniformemente debido a la amplificación de gen) también se ha reportado en otros carcinomas, en los que se incluyen carcinomas de estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroides, páncreas y vejigas. Véase, entre otras, King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet 1:765-767 (1986); Fukushige et al., Mol Cell Biol, 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohén et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cáncer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol Oncol., 38:364(1990); Weiner et al., Cáncer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cáncer Res., 50:5184 (1990); Park: et al., Cáncer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland et al. Br. J. Cáncer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathobiology 59:46-52 (1991); y McCann et al., Cáncer, 65:88-92 (1990) . El HER2 puede ser sobreexpresado en cáncer de próstata (Gu et al. Cáncer Lett. 99:185-9 (1996); Ross et al. Hum. Pathol. 28:827-33 (1997); Ross et al. Cáncer 79:2162-70 (1997); y Sadasivan et al. J. Urol . 150:126-31 (1993)) . Anticuerpos dirigidos contra el pl85neu y productos de proteina de HER2 humano se han descrito. Drebin y colegas han criado anticuerpos contra el producto genético neu de rata, pl85neu. Véase, por ejemplo, Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991); y W094/22478. Drebin et al. Oncogene 2:273-277 (1988) reportan que mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones distintas de pl85neu dan como resultado efectos anti-tumor sinergisticos sobre células NIH-3T3 neu transformadas implantadas en ratones desnudos. Véase también patente estadounidense No. 5,824,311 expedida el 20 de octubre de 1998. Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3) : 1165-1172 (1989) describe la generación de un panel de anticuerpos HER2 que fueron caracterizados utilizando la linea de célula de tumor de pecho humano SK-BR-3. La proliferación celular relativa de las células SK-BR-3 enseguida de la exposición de los anticuerpos fue determinada mediante teñido violeta cristalino de las monocapas después de 72 horas. Utilizando este análisis, se obtiene inhibición máxima con el anticuerpo llamado 4D5 que inhibe la proliferación celular por 56%. Otros anticuerpos en el panel redujeron la proliferación celular a una extensión menor en este análisis. Se encontró además que el anticuerpo 4D5 sensibiliza lineas celulares de tumor de pecho que sobreexpresan HER2 a los efectos citotóxicos de TNF-a. Véase también patente estadounidense No. 5,677,171 expedida el 14 de octubre de 1997. Los anticuerpos HER2 discutidos en Hudziak son caracterizados adicionalmente en Fendly et al. Cáncer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et mal. In Vitro 26(3) :59A (1990); Sarup et al Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol 11 (3) : 117-127 (1991); Kumar et al Mol. Cell. Biol 11 (2 ): 979-986 (1991); Lewis et al. Cáncer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cáncer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Nati. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al Cáncer Research 56:1457-1465 (1996); y Schaefer et al Oncogene 15:1385-1394 (1997). Un versión humanizada recombinante del anticuerpo HER2 murino 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Trastuzumab o HERCEPTIN®; Patente estadounidense No. 5,821,337) es clínicamente activo en pacientes con cánceres de pecho metastático que sobreeexpresan HER2 que han recibido terapia anti-cáncer anterior extensa (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). El Trastuzumab recibió aprobación de comercialización de la Administración de Alimentos y Fármacos en septiembre 25 de 1998 para el tratamiento de pacientes con cáncer de pecho metastático cuyos tumores sobreexpresan la proteina HER2. Otros anticuerpos HER2 con varias propiedades han sido descritos en Tagliabue et al Int. J. Cáncer 47:933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al. Cáncer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cáncer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cáncer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al. Cáncer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. Cáncer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver et al Cáncer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cáncer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol. Chem.267 : 15160-15167 (1992); Patente estadounidense No. 5,783,186; y Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997) .

La selección de homología ha dado como resultado la identificación de otros dos elementos de familia del receptor de HER2; HER3 (patentes estadounidenses Nos. 5,183,884 y 5,480,968 también como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) y HER4 (solicitud de patente Europea No 599,274; Plowman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)). Ambos de estos receptores muestran expresión incrementada en por lo menos algunas lineas celulares de cáncer de pecho. Los receptores de HER son en general encontrados en varias combinaciones y células y se piensa que la heterodimerización incrementa la diversidad de respuestas celulares a una variedad de ligandos de HER (Earp et al. Breast Cáncer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). El EGFR es enlazado mediante seis ligandos diferentes; factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor alfa de crecimiento transformante (TGF-a) , anfiregulina, factor de crecimiento epidérmico que se enlaza a heparina (HB—EGF) , betacelulina y epiregulina (Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994)). Una familia de proteínas de heregulina resultan del empalme alternativo de un solo gen son los ligandos para HER3 y HER4. La familia de heregulina incluye heregulinas alfa, beta y gamma (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); Patente estadounidense No. 5,641,869; y Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)); factores de neu diferenciación (NDF) , factores de crecimiento glial (GGF) ; receptor de acetilcolina que induce actividad (ARIA) ; y factor derivado de neurona sensorial y motor (SMDF). Para una revisión, véase Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996) y Lee et al. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Recientemente, tres ligandos de HER adicionales fueron identificados: neuregulin-2 (NRG-2) que es reportado que se enlaza ya sea a HER3 o HER 4 (Chang et al. Nature 387 509-512 (1997); y Carraway et al Nature 387:512-516 (1997)); neuregulin-3 que se enlaza a HER4 (Zhang et al. PNAS (USA) 94 (18) : 9562-7 (1997)); y neuregulin-4 que se enlaza a HER4 (Harari et al. Oncogene 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina y epiregulina también se enlazan a HER4. En tanto que EGF y TGF-a no se enlazan a HER2, EGF estimula EGFR y HER2 para formar un heterodimero, que activa el EGFR y da como resultado la transfosforilación de HER2 en el heterodimero. La dimerización y/o transfosforilación parece activa el HER2 tirosina cinasa. Véase, Earp et al., supra.

Asimismo, cuando el HER3 es co-expresado con HER2, se forma un complejo de señalización activo y los anticuerpos dirigidos contra HER2 son aptos de alterar este complejo (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269 (20) : 14661-14665 (1994)).

Adicionalmente, la afinidad de HER3 por heregulina (HRG) es incrementada a un estado de afinidad más alta cuando es co-expresada con HER2. Véase también, Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995); y Lewis et al., Cáncer Res., 56:1457-1465 (1996) con respecto al complejo de proteínas HER2-HER3. El HER4 , como el HER3, forma un complejo de señalización activo con HER2 (Carraway y Cantley, Cell 78:5-8 (1994)).

Cáncer de Ovarios El cáncer de ovario es la causa más común de muerte de malignidad del sistema reproductor femenino. Hay un valor estimativo de 24,000 nuevas diagnosis por año en los Estados Unidos de América con aproximadamente 13,000 muertes de la enfermedad. Los pacientes con cáncer de ovario avanzados son frecuentemente tratados con quimioterapia a base de platino, frecuentemente combinada con un taxano. Después que estos agentes han fallado, hay pocas opciones terapéuticas. Los pacientes con enfermedad sensible al platino son frecuentemente re-tratados con platino, pero una proporción sustancial de pacientes tienen una duración corta de respuesta después del re-tratamiento. Para aquellos con enfermedad resistente al platino el resultado es menos favorable. El topotecan está aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) para pacientes que han fallado la quimioterapia inicial o subsecuente; la doxorubicina liposomal está aprobada solamente para pacientes con cáncer de ovarios que es refractario tanto a regímenes de quimioterapia a base de platino como a regímenes de quimioterapia a base de paclitaxel. El topotecan y doxorubicina liposomal han mostrado una velocidad de respuesta parcial de 6% y 15% respectivamente en pacientes con enfermedad resistente al platino, con una sobrevivencia libre de avance promedio de 14-18 semanas. Más recientemente, resultados promisorios con gemcitabina se han reportado en cáncer de ovarios resistente al platino con respuestas parciales a 18%, conduciendo al uso incrementado de este agente como terapia de segunda linea. Sin embargo, hay una necesidad clara por nuevas y mejoradas opciones terapéuticas para pacientes con cáncer de ovarios avanzado para quienes las terapias existentes han fracasado. El ErbB o familia del receptor de crecimiento epidérmico humano (HER) del receptor tirosina cinasa son implicados en la patogénesis de cáncer de ovarios. Para apuntar la ruta de señalización de HER, el pertuzumab (rhuMAb 2C4) fue desarrollado como un anticuerpo humanizado que inhibe la dimerización de HER2 con otros receptores de HER, inhibiendo mediante esto la fosforilación impulsada por liando y la activación y la activación corriente abajo de las rutas RAS y AKT. La gemcitabina ha sido usada en una variedad de tumores y es indicada para uso en cáncer pancreático y cáncer de pulmón. Las toxicidades más comunes con el uso de un solo agente de gemcitabina incluye citopenia, con una incidencia de anemia y neutropenia de 68% y 63%, respectivamente. Otra toxicidad común es náusea y vómitos, con una incidencia combinada de 69%, con una incidencia de 13% grado III y una incidencia de 1% grado IV. La diarrea ocurre menos frecuentemente a 19%. La erupción ocurre más frecuentemente a 30%, con solamente una incidencia de 1% de grado III. La gemcitabina ha sido combinada con muchos otros agentes quimioterapéuticos, tales como taxanos, antraciclinas y platinos sin ningún incremento significativo o toxicidades inesperadas . El Trastuzumab ha sido combinado con gemcitabina en varias combinaciones de diferentes quimioterapias en pruebas de fase II y fue también bien tolerado sin ninguna toxicidad cardiaca o inesperada observada. Safran et al. Proc Am. Soc. Clin. Oncol. 20:130a (2001), Miller et al. Oncology 15(2): 38-40 (2001). Véase también, Zinner et al. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20:328a (2001), Nagourney et al. Breast Cáncer Res. Treat. 57:116, Abstract 475 (1999), Bun et al. Proc. Am. Assoc. Canc. Res. 41:719, Abstract #4571 (2000), Konecny et al. Breast Cáncer Res Treat 57: 114, Abstract 467 (1999), O'Shaugnessy et al. Sem. Oncol 2 (suppl3) : 22-26 (2004), Sledge et al. Sem. Oncol. 2(suppl3): 19-21 (2003), Zinner et al. Lung Cáncer 44(1):99-110 (2004), Gatzemeier et al. Ann of Oncol. 15:19-27 (2004), concerniente con la combinación de trastuzumab y gemcitabina . En un estudio de fase I de Omnitarg como un solo agente para tratamiento de tumores sólidos, tres sujetos con cáncer de ovarios avanzados fueron tratados con pertuzumab. Uno tuvo una respuesta parcial durable y un sujeto adicional tuvo enfermedad estable durante 15 semanas. Agus et al. Proc Am Soc Clin Oncol 22: 192, Abstract 771 (2003) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente, en un primer aspecto con un método para el tratamiento de cáncer resistente a platino seleccionado del grupo que consiste de cáncer de ovarios, carcinoma peritoneal primario y carcinoma de tubo de falopio, que comprende administrar a un paciente un anticuerpo de HER2 que inhibe la dimerización de HER más efectivamente que el trastuzumab y un agente quimioterapéutico anti-metabolitos, cada uno en cantidades efectivas para tratar el cáncer. En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de cáncer resistente a platino, seleccionado del grupo que consiste de cáncer de ovarios, carcinoma peritoneal primario y carcinoma de tubo de falopio, que comprende administrar a un paciente un anticuerpo HER2 que se enlaza a un sitio de enlace heterodimérico, sobre HER2 y gemcitabina, en cantidades efectivas para tratar el cáncer. En todavía un aspecto adicional, la invención es concerniente con un para tratamiento de cánceres resistente a platino seleccionado del grupo que consiste de cáncer de ovarios, carcinoma peritoneal primario y carcinoma de tubo de falopio, que comprende administrar a un paciente un anticuerpo HER2 que se enlaza al dominio II de HER2 y gemcitabina, cada uno en cantidades efectivas para tratar el cáncer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1A y IB ilustran el mapeo de epitopos de residuos 22-645 dentro del dominio extracelular (ECD) de HER2 (secuencia de aminoácidos, que incluye la secuencia de señales, mostrada en la figura 1A; SEQ ID NO: 13) como se determina mediante análisis de mutante de truncación y mutagénesis dirigida al sitio (Nakamura et al. J of Virology 67(10) :6179-6191 (1993); y Renz et al. J. Cell Biol. 125 ( 6) : 1395-1406 (1994)). Las varias truncaciones HER2-ECD o mutaciones puntuales fueron preparadas a partir de cADN utilizando tecnología de reacción en cadena de polimerasa. Los mutantes de HER2 fueron expresados como proteínas de fusión GD en un plásmido de expresión mamífero. Este plásmido de expresión utiliza el promotor/mejorador de citomegalovirus con terminación SV40 y señales de poliadenilación localizadas corriente abajo del cADN insertado. El ADN de plásmido fue transfectado a 293 células. Un dia después de la transfección, las células fueron marcadas metabólicamente durante toda la noche en metionina y DMEM de bajo contenido de glucosa, libre de cisteina, que contiene 1% de suero bovino fetal dializado y 25 µCi cada uno de 35S metionina y 35S cisteina. Los sobrenadantes fueron cosechados y ya sea los anticuerpos monoclonales HER2 o anticuerpos de control fueron agregados al sobrenadante e incubados 2-4 horas a 4°C. Los complejos fueron precipitados, aplicados a un gel de gradiente de tricina SDS 10-20% y sometidos a microforésis a 100 V. El gel fue electroabsorbido sobre una membrana y analizado mediante autoradiografía . Como se muestra en la figura IB, los anticuerpos de HER2 7C2, 7F3, 2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 Y 3H4 se enlazan a varios epitopos de HER2 ECD. Las figuras 2A y 2B muestran el efecto de anticuerpos monoclonales de HER2 2C4 y 7F3 sobre la activación de hHRGßl de células MCF7. La figura 2A muestra las curvas de dosis-respuesta para la inhibición 2C4 ó 7F3 de estimulación de HRG de tirosina fosforilación. La figura 2B muestra las curvas de dosis-respuesta para la inhibición de rHRGß? 7-24 125I marcado que se enlaza a células MCF7 mediante 2C4 ó 7F3. La figura 3 ilustra la inhibición de rHRGßi77-244 125I marcado que se enlaza un panel de lineas celulares de tumor humanas mediante los anticuerpos monoclonales HER2 2C4 o 7F3. Los anticuerpos-controles monoclonales son anticuerpos monoclonales murinos que se hacen coincidir en isotipo que no bloquean enlace de rHRG. El enlace de rHRGßl 125I marcado no especifico fue determinado a partir de incubaciones en paralelo efectuadas en presencia de rHRGßl 100 nM. Los valores para el enlace de rHRGßl?77_?44 125I marcado no especifico fueron menores del 1% del total para todas las lineas celulares probadas. Las figuras 4A y 4B muestran el efecto de anticuerpos monoclonales 2C4 y 4D5 sobre la proliferación de MDA-MB-175 (figura 4A) y células SK-BR-3 (figura 4B) . Células MDA-MB-175 y SK-BR-3 fueron sembradas en placas de 96 cavidades y se le permite que se adhieran durante 2 horas. El experimento se llevó a cabo en un medio que contiene 1% de suero. Anticuerpos de HER2 o medio solo fueron agregados y las células fueron incubadas durante 2 horas a 37 °C. Subsecuentemente rHRGßl (1 nM) o medio solo fueron agregados y las células fueron incubadas durante 4 dias. Las monocapas fueron lavadas y teñidas/fijas con 0.5% de violeta cristal. Para determinar la proliferación celular se midió la absorbancia a 540 nm. Las figuras 5A y 5B muestran el efecto del anticuerpo monoclonal 2C4, anticuerpo de trastuzumab o un anticuerpo EGFR sobre la asociación dependiente de heregulina (HRG) de HER2 con HER3 en células de MCF7 que expresan niveles bajos/normales de HER2 (figura 5A) y células SK-BR-3 que expresan altos niveles de HER2 (figura 5B) ; véase Ejemplo 2 posteriormente en la presente .

Las figuras 6A y 6B comparan las actividades del anticuerpo monoclonal murino intacto 2C4 (mu 2C4) y un fragmento de Fab 2C4 quimérico. La figura 6A muestra la inhibición del enlace de 125I-HRG a células MCF7 mediante Fab 2C4 quimérico o anticuerpo monoclonal murino intacto 2C4. Células MCF7 fueron sembradas en placas de 24 cavidades (1 x 10 células/cavidad) y cultivadas a aproximadamente 85% de confluencia durante dos dias. Experimentos de enlace se efectuaron como se describe en Lewis et al., Cáncer Research 56:1457-1465 (1996). La figura 6B ilustra la inhibición de la activación de rHRGßl de pl80 tirosina fosforilación en células MCF7 efectuada como se describe en Lewis et al. Cáncer Research 56:1457-1465 (1996) . Las figuras 7A y 7B ilustran alineaciones de las secuencias de aminoácidos de los dominios ligero variable (VL) (figura 7A) y pesada variable (VH) (figura 7B) del anticuerpo monoclonal murino 2C4 (SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente); dominios VL y VH de versiones 2C4 humanizadas 574 (SEQ ID NOs : 3 y 4, respectivamente), y estructuras de consenso VL y VH humanos (hum ?l, ++++ light kappa subgroup I, HumIII, heavy subgroup III) (SEQ ID NOs: 5 y 6, respectivamente). Los asteriscos identifican diferencias entre el anticuerpo de versión 2C4 humanizado 574 y anticuerpo monoclonal murino 2C4 o entre la versión 2C4 humanizada 574 y la estructura humana. Las regiones que determinan la complementareidad (CDR) están en corchetes . Las figuras 8A a 8C muestran el enlace Fab 2C4 quimérico (Fab. vi) y varias variantes 2C4 humanizadas al dominio extracelular de HER2 (ECD) tal como se determina por ELISA en el ejemplo 3. La figura 9 es un diagrama de bandas de los dominios de VL y VH del anticuerpo monoclonal 2C4 con la cadena fundamental CDR blanca marcada (Ll, L2, L3, Hl, H2, H3) . Las cadenas laterales de VH evaluadas mediante mutagénesis durante la humanización (véase ejemplo 3, Tabla 2) son también mostradas . La figura 10 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal 2C4 o trastuzumab sobre EGF, TGF-a o activación moderada por HRG de la proteina cinasa mitógeno-activada (MAPK) . Las figuras HA y 11B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de trastuzumab (SEQ ID NO: 14) y la cadena pesada de trastuzumab (SEQ ID NO: 15) , respectivamente . Las figuras 12A y 12B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de pertuzumab (SEQ ID NO: 16) y cadena pesada de pertuzumab (SEQ ID NO: 17), respectivamente. La figura 13, ilustra esquemáticamente, el enlace de 2C4 en el sitio de enlace heterodimérico de HER2, impidiendo mediante esto la heterodimerización con EGFR activado o HER3.

La figura 14 ilustra el acoplamiento de HER2/HER3 a las rutas MAPK y Akt. La figura 15 compara la actividad de trastuzumab y pertuzumab. La figura 16 ilustra esquemáticamente los varios dominios de HER2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS I . Definiciones Un "receptor HER" es un receptor de proteina tirosina cinasa que pertenece a la familia del receptor HER e incluye los receptores EGFR, HER2, HER3 y HER4 y otros miembros de esta familia a ser identificados en el futuro. El receptor de HER comprenderá en general un dominio extracelular, el cual se puede enlazar a un ligando HER; un dominio de transmembrana lipofilico; un dominio de tirosina cinasa intracelular conservado y un dominio de señalización carboxilo-terminal que alberga varios residuos de tirosina los cuales pueden ser fosforilados . El receptor de HER puede ser un receptor de HER de "secuencia natural" o una "variante de secuencia de aminoácidos" del mismo. Preferiblemente, el receptor de HER es el receptor de HER humano de secuencia natural. El dominio extracelular de HER2 comprende cuatro dominios, dominio I (residuos de aminoácidos de aproximadamente 1-195) , dominio II (residuos de aminoácidos de aproximadamente 196-320) , dominio III (residuos de aminoácidos de aproximadamente 321-488) y dominio IV (residuos de aminoácidos de aproximadamente 489-632) (numeración de residuos sin péptido de señal) . Véase Garrett et al Mol. Cell. 11:495-505 (2003), Cho et al. Nature 421: 756-760 (200J) , Franklin et al. Cáncer Cell 5:317-328 (2004), o Plowman et al. Proc. Nati. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993), y Fig. 16 en la misma. Los términos "ErbBl", "HERÍ", "receptor de factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR" son usados intercambiablemente en la presente y se refieren a EGFR, como se revela, por ejemplo, en Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), en los que se incluyen formas mutantes que se presentan de manera estable en la naturaleza de los mismos (por ejemplo, un EGFR mutante de cancelación como en Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)) . erbBl se refiere al gen que codifica el producto de proteina de EGFR. Las expresiones "ErbB2" y "HER2" son usados intercambiablemente en la presente y se refieren a la proteina HER2 humana, descrita, por ejemplo en Semba et al. , PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (++++ Genebank accession number X03363) . El término "erbB2" se refiere al gen que codifica el ErbB2 humano y "neu" se refiere al gen que codifica pl85neu de rata. El HER2 preferido es HER2 humano de secuencia natural. "ErbB3" y "HER3" se refieren al receptor polipéptido, como se revela, por ejemplo en las patentes estadounidenses Nos. 5,183,884 y 5,480,968 también como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989) . Los términos "ErbB4" y "HER4" se refieren en la presente al polipéptido receptor como se revela, por ejemplo en la solicitud de patente Europea No. 599,274; Plowman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), en las que se incluyen isoformas de los mismos, por ejemplo como se revela en W099/19488, publicado el 22 de abril de 1999. "Ligando HER" significa un polipéptido que se enlaza a y/o activa un receptor de HER. El ligando de HER de interés particular en la presente es un ligando de HER humano de secuencia natural tal como factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a) (Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)); amfiregulina también conocida como schwanoma o factor de crecimiento autócrino de queratinocito (Shoyab et al. Science 243: 1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348:257-260 (1990); y Cook et al. Mol Cell Biol 11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); y Sasada et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); factor de crecimiento epidérmico de enlace de heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); y Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)); a heregulina (véase posteriormente en la presente); neuregulin-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); neuregulin-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)); neuregulin-4 (NRG-4) (Harari et al Oncogene 18:2681-89 (1999)) o cripto (CR-I) (Kannan et al. J. Biol Chem. 272 ( 6) : 3330-3335 (1997)). Los ligandos de HER que se enlazan a EGFR incluyen EGF, TGF-a, amfiregulina, betacelulina, HB-EGF y epiregulina. Los ligandos de HER que se enlazan a HER3 incluyen heregulinas. Ligandos de HER capaces de enlazar HER4 incluyen betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y heregulinas. "Heregulina" (HRG) cuando se usa en la presente se refiere a un polipéptido codificado mediante el producto genético de heregulina como se revela en la patente estadounidense No. No.5,641,869 o Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Ejemplos de heregulinas incluyen heregulin-alfa, heregulin-ßl, heregulin-ß2 y heregulin-ß3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); y Patente estadounidense No. 5,641,869); factor de diferenciación neu (NDF) (Peles et al., Cell 69: 205-216 (1992)); receptor de acetilcolina-inductor de actividad (ARIA) (Falls et al. Cell 72:801-815 (1993)); factor de crecimiento glial (GGFs) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); factor derivado de neurona sensorial y motor (SMDF) (Ho et al. J. Biol Chem. 270:14523-14532 (1995)); ?-heregulin (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). El término incluye fragmentos biológicamente actividades y/o variantes de secuencias de aminoácidos de un polipéptido de HRG de secuencia natural, tal como un fragmento de dominio semejante a EGF del mismo (por ejemplo HRGbl?77-244) • Un "dimero de HER" es un dimero asociado no covalentemente que comprende por lo menos dos receptores de HER diferentes. Tales complejos pueden formarse cuando una célula que expresa dos o más receptores de HER es expuesta a un ligando de HER y pueden ser aislados mediante inmunoprecipitación y analizados mediante SDS-PAGE como se describe en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994), por ejemplo. Ejemplos de tales dimeros de HER incluyen heterodimeros EGFR-HER2, HER2-HER3 y HER3-HER4. Además, el dimero de HER puede comprender dos o más receptores HER2 combinados con un receptor de HER diferente, tal como HER3, HER4 o EGFR. Otras proteínas, tal como una sub-unidad de receptor de citocina (por ejemplo gpl30) pueden estar asociadas con el dimero. Un "sitio de enlace heterodimérico" sobre HER2, se refiere a una región en el dominio extracelular de HER2 que se pone en contacto o se interconecta con una región en el dominio extracelular de EGFR, HER3 o HER4 después de la formación de un dimero con el mismo. La región es encontrada en dominio II de HER2. Franklin et al. Cáncer Cell 5:317-328 (2004).

"Activación de HER" o "activación de HER" se refiere a la activación o fosforilación, de cualquiera de uno o más receptores de HER o receptores de HER2. En general, la activa de HER da como resultado la transducción de señal, por ejemplo, aquella provocada por un dominio de cinasa intracelular de un receptor de HER que fosforila residuo de tirosina en el receptor de HER o un polipéptido sustrato) . La activación de ER puede ser moderada mediante el enlace de ligando de HER a un dimero de HER que comprende el receptor de HER de interés. El enlace de ligando de HER a un dimero de HER puede activar un dominio de cinasa de uno o más de los receptores el HER en el dimero y mediante esto da como resultado la fosforilación del ácido de tirosina en uno o más de los receptores de HER y/o fosforilación de residuos de tirosina en polipéptido (s) de sustrato adicional (es) , tales como Akt o cinasas intracelulares MAPK. Un polipéptido de "secuencia natural" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácidos como un polipéptido (por ejemplo, receptor de HER o ligando de HER) derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos de secuencia natural pueden ser aislados de la naturaleza o pueden ser producidos mediante medios recombinantes o sintéticos. Asi, un polipéptido de secuencia natural puede tener la secuencia de aminoácidos del polipéptido humano que se presenta de manera estable en la naturaleza, polipéptido murino o polipéptido de cualquier otra especie de mamíferos. El término "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren a una extensión de un polipéptido de secuencia natural. Ordinariamente, las variantes de secuencias de aminoácidos poseerán por lo menos aproximadamente 70% de homología con por lo menos un dominio de enlace de receptor de un ligando de HER natural o con por lo menos un dominio de enlace de ligando de un receptor de HER natural y preferiblemente, será por lo menos aproximadamente 80%, más preferiblemente por lo menos 90% homólogo con tal receptor o dominios de enlace de ligando. Las variantes de secuencias de aminoácidos poseen sustituciones, cancelaciones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos natural. "Homología" es definida como el porcentaje de residuos en la variante de secuencia de aminoácidos son idénticos después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para obtener el por ciento de homología máximo. Métodos y programas de computadora para la alineación son bien conocidos en el arte. Uno de tales programas de computadora es "Align 2", cuyo autor es Genentech, Inc., que fue presentado con documentación del usuario en la oficina de derechos reservados de los Estados Unidos de América, Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de 1991.

El término "anticuerpo" como se usa en la presente en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos, (por ejemplo, anticuerpos biespecificos) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se enlazan al mismo epitopo, excepto por posibles variante que pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes en general están presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen comúnmente anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante sobre el antigeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo ya que es obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no será interpretado que requiere la producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden ser fabricados mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden ser fabricados mediante métodos de ADN recombinantes (véase por ejemplo, Patente estadounidense No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden también ser aislados de bibliotecas de anticuerpo de fago utilizado las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581- 597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, en tanto que el resto de la(s) cadena (s) es (son) idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o sub-clase de anticuerpos, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la afinidad biológica deseada (Patente estadounidense No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de enlace de antigeno de dominio variable derivadas de secuencias de región constante primate no humanas (por ejemplo, Oíd World Monkey, Ape etc.) y secuencias de región constante humanas . "Fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente la región de enlace de antigeno o región variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmento (s) de anticuerpo. Un "anticuerpo intacto" es uno que comprende una región variable de enlace de antigeno también como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de secuencia natural humana) o una variante de secuencia de aminoácidos de las mismas. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras. "Funciones efectoras" de anticuerpo se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región de Fe (una región de Fe de secuencia natural o región de Fe variantes de secuencia de aminoácido) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen enlace de Clq; citotoxicidad dependiente de complemento; enlace de receptor Fe; citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor célula B; BCR) , etc. Dependiendo de la secuencia de aminoácido de dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden ser asignados a "clases" diferentes. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, y varios de estos pueden ser divididos adicionalmente en "sub-clases" (isotipos), por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, y IgAl. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las clases diferentes de anticuerpos son llamados a, d, e, y, y µ, respectivamente. Las estructuras de sub-unidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. "Citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción moderada por la célula en la cual células citotóxicas no especificas que expresan receptores Fe (FcR) (por ejemplo, células exterminadoras naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo enlazado sobre una célula objetivo y provocan subsecuentemente lisis de la célula objetivo. Las células primarias para moderar ADCC, células NK, expresan Fc?RIII solamente, mientras que los monocitos expresan Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII. La expresión de FcR sobre células hematopoyéticas es resumida en la Tabla 3 en página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, un análisis de ADCC in vitro, tal como aquel descrito en las patentes estadounidenses No. 5,500,362 o 5,821,337 puede ser efectuado. Células efectoras útiles para tales análisis incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células exterminadoras naturales (NK) . Alternativa o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser determinada in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como aquel revelado en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998) . "Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan una o más FcR y efectúan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan por lo menos Fe y efectúan la función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que moderan ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células exterminadoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, células PMBC y NK son preferidas. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente natural de las mismas, por ejemplo de sangre o PBMC como se describe en la presente. Los términos "receptor Fe" o "FcR" son usados para describir un receptor que se enlaza a la región de Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR es uno que se enlaza a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las sub-clases Fc?RI , Fc?RII, y FcyRIII, en los que se incluyen variantes alélicas y formas alternativamente divididas de estos receptores. Los receptores Fc?RII incluyen Fc?RIIA (un "receptor de activación") y Fc?RIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación Fc?RIIA contiene una porción de actividad a base de tirosina inmunoreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor Fc?RIIB contiene una porción de inhibición a base de tirosina inmunoreceptora (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase, M. in Daéron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). Los FcR son revisados en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR incluyen aquellos a ser identificados en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgG maternal al feto (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)). "Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula par someter a lisis un objetivo en presencia de complemento. La ruta de activación de complemento es iniciada por el enlace del primer componente al sistema del complemento (Cía) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) acomplejada con un antigeno cognato. Para determinar la activación del complemento, un análisis de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), puede ser efectuado. "Anticuerpos naturales" son usualmente glucoproteinas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, que consisten de dos cadenas ligera idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H) . Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada mediante un enlace de disulfuro covalente, en tanto que el número de enlaces de disulfuro varia entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulina diferentes. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro de intracadena espaciado regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares fueron una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y son usados en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular por su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida igualmente en todos los dominios variables de anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamadas regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como en los dominios variables de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables son llamadas regiones de estructura (FR) . Los dominios variables de cadenas pesada y ligeras naturales comprenden cada una cuatro FR, que adoptan extensamente una configuración de hoja beta, conectada mediante tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y en algunos casos forman parte de, la estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas conjuntamente en proximidad estrecha por los FR y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sito de enlace de antigeno de anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables del enlace de antigeno. La región hipervariable comprende en general residuos de aminoácidos de una "región que determina la complementareidad" o "CDR" (por ejemplo residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) . "Región de estructura" o residuos de "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se definen en la presente. La digestión de papaina de anticuerpo produce dos fragmentos de enlace de antigeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de enlace de antigeno y un fragmento de "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar rápidamente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento de "Fe" que tiene dos sitios de enlace de antigeno y todavía es apto de reticular el antigeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antigeno y enlace de antigeno completo. Esta región consiste de un dimero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación no covalente estrecha. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúa para definir un sitio de enlace de antigeno sobre la superficie del dimero VH-VL. En conjunto, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace de antigeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un solo dominio variable (o mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables especificas por un antigeno) tienen la capacidad para reconocer y enlazar antigeno, aunque a una afinidad más baja que todo el sitio de enlace. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de Fab' difieren de fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio de CH1 de cadena pesada en los que se incluyen una o más cisteinas de la región de articulación de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en el cual el (los) residuo (s) de cisteina de los dominios constantes llevan por lo menos un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente eran producidos como pares de fragmentos de Fab' que tienen cisteinas de unión o engozne entre ellas. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo son también conocidos. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie de vertebrados puede ser asignada a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (K) y lambda (?) , en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Fragmentos de anticuerpo de "Fv de una sola cadena" o "scFv", comprenden los dominios de VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido de Fv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios de VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para el enlace de antigeno. Para una revisión de scFv véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Fragmentos de scFv de anticuerpo de HER2 son descritos en W093/16185; Patente estadounidense No. 5,571,894; y Patente estadounidense No. 5,587,458. El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace de antigeno, tales fragmentos comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (V ) en la misma cadena de polipéptido (VH - VL) . Al utilizar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de enlace de antigeno. Los diacuerpos son descritos más plenamente por ejemplo en EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) . Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Por la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulina humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas instancias, los residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, Los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones son realizadas para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , comúnmente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véanse Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr . Op. Struct. Biol 2:593-596 (1992). Anticuerpos HER2 humanizados incluyen huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 o Trastuzumab (HERCEPTIN®) como se describe en la Tabla 3 de la patente estadounidense No. 5,821,337 incorporada expresamente en la presente por referencia; anticuerpos 520C9 (W093/21319) y 2C4 humanizado como se describe en la presente. Para los propósitos en la presente, "trastuzumab" "HERCEPTIN®, " y "huMAb4D5-8" se refieren a un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y cadena pesada en SEQ ID NOs: 14 y 15, respectivamente. En la presente, "pertuzumab" y "OMNITARG™" se refieren a un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y cadena pesada en SEQ ID Nos: 16 y 17, respectivamente. Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo (como se define en la presente) que no está conjugado a una molécula heteróloga, tal como una porción citotóxica o radioetiqueta .

Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con diagnóstico o usos terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso de anticuerpo, tal como se determina por el método de Lowry y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N -terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa de centrifugación o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o preferiblemente, teñido de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes puesto que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado mediante por lo menos una etapa de purificación. Un anticuerpo de HER2 que "inhibe la dimerización de HER más efectivamente que trastuzumab" es uno que reduce o elimina los dimeros de HER más efectivamente (por ejemplo por lo menos aproximadamente 2 veces más efectivamente) que el trastuzumab. Preferiblemente, tal anticuerpo inhibe la dimerización de HER2 por lo menos aproximadamente tan efectivamente como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo monoclonal murino 2C4, un fragmento Fab de anticuerpo monoclonal murino 2C4, pertuzumab, o un fragmento de Fab o pertuzumab. Se puede evaluar la inhibición de dimerización de HER al estudiar los dimeros de HER directamente o al evaluar la activación de HER o señalización corriente abajo, que resulta de la dimerización de HER y/o al evaluar el sitio de enlace de anticuerpo-HER2, etc. Análisis para seleccionar anticuerpos con la capacidad para inhibir la dimerización de HER más efectivamente que trastuzumab son descritos en Agus et al. Cáncer Cell 2: 127-137 (2002) y ejemplos 1-2 y 4 en la misma. A manera de ejemplo solamente, se puede analizar la inhibición de dimerización de HER al determinar, por ejemplo, la inhibición de formación del dimero de HER (véase, por ejemplo, Figuras 1A-B de Agus et al. Cáncer Cell 2: 127-137 (2002); y ejemplo 2 en la presente); reducción en activación de ligando HER de célula que expresan dimeros de HER (ejemplo 1 en la presente y figuras 2A-2B de Agus et al. Cáncer Cell2: 127-137 (2002), por ejemplo); bloqueo del enlace de ligando de HER a células que expresan dimeros de HER (ejemplo 1 en la presente y figura 2E de Agus et al. Cáncer Cell 2: 127-137 (2002), por ejemplo); inhibición de crecimiento celular de células de cáncer (por ejemplo células MCF7, MDA-MD-134, ZR-75-1, MD-MB-175, T-47D) que expresan dimeros de HER en presencia (o ausencia) del ligando de HER (ejemplo 1 en la presente y figuras 3A-D de Agus et al. Cáncer Cell 2: 127-137 (2002), por ejemplo); inhibición de señalización corriente abajo (por ejemplo, inhibición de fosforilación de AKT dependiente de HRG o inhibición de HRG o fosforilación de MAPK dependiente de MAPK) (véase, ejemplo 4 en la presente y figuras 2C-D de Agus et al. Cáncer Cell 2: 127-137 (2002), por ejemplo) . También se pueden determinar si el anticuerpo inhibe la dimerización de HER al estudiar el sitio de enlace de anticuerpo-HER, por ejemplo, al evaluar una estructura o modelo, tal como una estructura cristalina, del anticuerpo enlazado a HER2 (véase, por ejemplo Franklin et al Cáncer Cell 5:317-328 (2004) ) . El anticuerpo HER2 puede "inhibir la fosforilación de AKT dependiente de HRG" y/o inhibir "fosforilación de MAPK dependiente de HRG o TGFa" más efectivamente (por ejemplo por lo menos 2 veces más efectivamente) que trastuzumab (véase Agus et al. Cáncer Cell 2: 127-137 (2002) y Example 4 en la presente, por ejemplo) . El anticuerpo HER2 puede ser uno que "no inhibe la escisión del ectodominio de HER2" (Molina et al. Cáncer Res. 61:4744-4749(2001) . Un anticuerpo de HER2 que "enlaza a un sitio de enlace heterodimérico" de HER2, se enlaza a residuos en el dominio II (y también opcionalmente se enlaza a residuos en otros de los dominios del dominio extracelular de HER2, tales como dominios I y III) y puede impedir estéricamente, por lo menos a alguna extensión, la formación de un heterodimero HER2-EGFR, HER2-HER3, o HER2-HER4. Franklin et al. Cáncer Cell 5:317-328 (2004) caracterizan la estructura cristalina del HER2-pertuzumab, depositado con el banco de datos de proteina RCSB (código de ID IS78), que ilustra un anticuerpo ejemplar que se enlaza a un sitio de enlace heterodimérico de HER2. Un anticuerpo que "se enlaza al dominio II" de HER2 se enlaza a residuos de dominio II y opcionalmente residuos en otro(s) dominio (s) de HER2, tales como dominios I y III. Preferiblemente, el anticuerpo que se enlaza al dominio II se enlaza a la unión entre los dominios I, II y III de HER2. Un "ovario" es uno de los dos órganos en forma de almendra pequeños situados ya sea en un lado u otro del útero en una mujer. Un "tubo de falopio" u "oviducto" es uno de los dos tubos finos que conducen desde los ovarios de los mamíferos hembra al útero. El "peritoneo" es el forro epitelial de una cavidad corporal tal como el abdomen. "Cáncer de ovarios" es una malignidad potencialmente que amenaza la vida, que se desarrolla en uno o ambos ovarios. Al tiempo en que los síntomas del cáncer de ovarios aparecen, el tumor de ovarios puede haber crecido suficientemente grande para esparcir células de cáncer en todo el abdomen. Las células de cáncer de ovarios que se han esparcido fuera de los ovarios son denominadas como cánceres de ovarios metastático. Los tumores de ovarios tienden a esparcirse al diafragma, intestino y/o omentum (una capa grasa que cubre y rellena órganos en el abdomen) . Las células de cáncer también se esparcen a otros órganos a través de los canales linfáticos y la corriente sanguínea. El cáncer de ovarios a ser tratado en la presente incluye las tres clases primarias de tumores de ovarios malignos, es decir, tumor epitelial, tumor de célula germinal y tumor estromal. "Carcinoma peritoneal primario" se refiere a un cáncer que surge en el peritoneo. El carcinoma peritoneal primario puede ser muy similar al cáncer de ovario peritoneal en términos de apariencia microscópica, síntomas, patrón de esparcimiento y prognosis. Una mujer que ha tenido sus ovarios retirados puede todavía tener carcinoma peritoneal primario. "Carcinoma de tubo de falopio" se refiere a cáncer del tubo de falopio y/o ligamento amplio. Un "tumor epitelial" se desarrolla en una capa de células en forma de cubo conocidas como el epitelio germinal, que rodea el exterior de los ovarios. Los tumores epiteliales suman hasta 90% de todos los cánceres de ovarios. Un "tumor de célula germinal" se encuentra en células de maduración de huevo del ovario. Los tumores de célula germinal, que suman aproximadamente 3% de todos los cánceres de ovario, ocurre más frecuentemente en adolescentes y mujeres jóvenes . Un "tumor estromal" se desarrolla de células de tejido conectivo que mantienen los ovarios conjuntamente y que producen las hormonas hembra, estrógeno y progesterona. Los tumores estromales suman el 6% de todos los cánceres de ovarios . Una "muestra de tumor" en la presente es una muestra derivada de o que comprende células de tumor del tumor de un paciente. Ejemplos de muestras de tumor en la presente incluyen, pero no están limitadas a, biopsias de tumor, células de tumor circulante, proteínas de plasma circulantes, fluido ascitico, cultivos celulares primarios o lineas celulares derivadas de tumores o que exhiben propiedades semejantes a tumor, también como muestras de tumor conservadas, tales como muestras de tumor fijas en formalina, muestras de tumor embebidas de parafina. Un "agente inhibidor de crecimiento" como se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de cáncer que expresa HER ya sea in vitro o in vivo. Asi, el agente inhibidor de crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células que expresan HER en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar diferente a fase S) , tales como agentes que inducen la detención Gl y detienen la fase M. Bloqueadores de fase M clásicos incluyen la vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos, e inhibidores topo II tal como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se derraman sobre la detención de fase S, por ejemplo, agentes de alquilación de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Información adicional se puede encontrar en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., Capitulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente página 13. Ejemplos de anticuerpos "inhibidores de crecimiento" son aquellos que se enlazan a HER2 e inhiben el crecimiento de células de cáncer que sobreexpresan HER2. Anticuerpos de HER2 inhibidores de crecimiento preferidos inhiben en crecimiento de células de tumor de pecho SK-BR-3 en cultivo celular por más del 20% y preferiblemente más del 50% (por ejemplo de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/m, en donde la inhibición de crecimiento es determinada seis dias después de la exposición de las células de SK-BR-3 al anticuerpo (véase patente estadounidense No. 5,677,171 expedida el 14 de octubre de 1997). El análisis de inhibición de crecimiento de células SK-BR-3 es descrito en más detalle en aquella patente y posteriormente en la presente. El anticuerpo inhibidor de crecimiento preferido es una variante humanizada del anticuerpo monoclonal murino 4D5, por ejemplo trastuzumab. Un anticuerpo que "induce apóptosis" es uno que induce muerte celular programada tal como se determina mediante enlace de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesiculos de membrana (llamados cuerpos apoptóticos) . La célula es usualmente una que sobreexpresa el receptor HER2. Preferiblemente, la célula es una célula de tumor, por ejemplo, una célula de pecho, ovario, estómago, endometrial, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroide, pancreática o célula de vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, célula Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o célula SKO V3. Varios métodos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con apóptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidil serina (PS) puede ser medida mediante enlace de anexina; la fragmentación de ADN puede ser evaluada por medio de escalonamiento de ADN y condensación nuclear/cromatina junto con fragmentación de ADN puede ser evaluada por cualquier incremento en células hipodiploides . Preferiblemente, el anticuerpo que induce apóptosis es uno que da como resultado aproximadamente 2 a 50 veces, preferiblemente alrededor de 5 a 50 veces y más preferiblemente alrededor de 10 a 50 veces, inducción de enlace de anexina en relación con la célula sin tratar en un análisis de enlace de anexina utilizando células BT474 (véase posteriormente en la presente) . Ejemplos de anticuerpos de HER2 que inducen apóptosis son 7C2 y 7F3. El "epitopo 2C4" es la región en el dominio extracelular de HER2 al cual el anticuerpo 2C4 se enlaza. Con el fin de seleccionar anticuerpos que se enlazan al epitopo 2C4, un análisis de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988), puede ser efectuado. Alternativamente, el mapeo de epitopo se puede efectuar para determinar si el anticuerpo se enlaza al epitopo 2C4 de HER2 (por ejemplo, cualquiera de uno o más residuos en la región de aproximadamente residuo 22 a aproximadamente residuo 584 de HER2, inclusive; véanse figuras 1A-B) . El epitopo 2C4 comprende residuos del dominio II en el dominio extracelular de HER2. 2C4 y pertuzumab se enlazan al dominio extracelular de HER2 en la unión de los dominios I, II, y III. Franklin et al. Cáncer Cell 5:317-328 (2004). El "epitopo 4D5" es la región en el dominio extracelular de HER2 en el cual el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463 y trastuzumab se enlazan. Este epitopo está cercano al dominio de transmembrana de HER2 y dentro del dominio IV de HER2. Para seleccionar anticuerpos que se enlazan al epitopo 4D5, un análisis de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988), puede ser efectuado. Alternativamente, el mapeo de epitopo puede ser efectuado para determinar si el anticuerpo se enlaza al epitopo 4D5 de HER (por ejemplo, cualquiera de uno o más residuos en la región de aproximadamente residuo 529 a aproximadamente residuo 625, inclusive, véanse figuras 1A-B) . El "epitopo 7C2/7F3" es la región en el término N, dentro del dominio I, del dominio extracelular de HER2 al cual los anticuerpos 7C2 y/o 7F3(cada uno depositado con el ATCC, véase posteriormente en la presente) se enlazan. Para seleccionar anticuerpos que se enlazan al epitopo 7C2/7F3, un análisis de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988), puede ser efectuado. Alternativamente, se puede efectuar el mapeo de epitopo para establecer si el anticuerpo se enlaza al epitopo 7C2/7F3 sobre HER2 {por ejemplo, cualquiera de uno o más de los residuos en la región de aproximadamente residuo 22 aproximadamente residuo 53 de HER2; véanse figuras 1A-B) . "Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluirán aquellos ya con el cáncer, también como aquellos en los cuales el cáncer va a ser prevenido. De aqui, el paciente a ser tratado en la presente puede haber sido diagnosticado como tener el cáncer o puede estar predispuesto o susceptible al cáncer. El término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco efectivo para tratar el cáncer en el paciente. La cantidad efectiva del fármaco puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño del tumor; inhibir (esto es, frenar a alguna extensión y preferiblemente detener) la infiltración de células de cáncer a órganos periféricos; inhibir (esto es, frenar a alguna extensión y preferiblemente detener) metástasis del tumor; inhibir, a alguna extensión, el crecimiento del tumor y/o aliviar por lo menos a alguna extensión uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. A la extensión que el fármaco puede impedir el crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. La cantidad efectiva puede extender la sobreviviencia libre de avance (por ejemplo, tal como se mide por Response Evaluation Criteria for Solid Tumors, RECIST, or CA-125 changes ++++) , da como resultado una respuesta objetivo (en las que se incluyen una respuesta parcial, PR o respuesta completa, CR) , incrementar el tiempo de sobrevivencia global y/o mejorar uno o más síntomas del cáncer (por ejemplo, tal como se determina mediante FOSI) . "Sobrevivencia global" se refiere al paciente que sigue vivo por un periodo de tiempo definido, tal como 1 año, 5 año, etc., a partir del tiempo de diagnosis o tratamiento. "Sobrevivencia libre de avance" se refiere al paciente que sigue estando vivo, sin que el cáncer empeore. Una "respuesta objetivo" se refiere a una respuesta mensurable, en las que se incluyen respuesta completa (CR) o respuesta parcial (PR) . "Respuesta completa" o "remisión completa" está diseñado por la desaparición de todos los signos de cáncer en respuesta al tratamiento. Esto no siempre significa que el cáncer ha sido curado. "Respuesta parcial" se refiere a una disminución en el tamaño de uno o más tumores o lesiones o en la extensión de cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento. Un "cáncer que expresa HER" es uno que comprende células que tienen proteina de HER presente en su superficie celular. Un "cáncer que expresa HER2" es uno que produce niveles suficientes de HER2 en la superficie de células de las mismas, de tal manera que un anticuerpo de HER2 se puede enlazar al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer . Un cáncer que "sobreexpresa" un receptor de HER es uno que tiene niveles significativamente más altos del receptor de HER, tal como HER2, en la superficie celular de la misma, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede ser provocada por amplificación genética o por transcripción o traducción incrementada. Las sobreexpresión de receptor de HER puede ser determinada en un análisis de diagnóstico o prognostico al evaluar niveles incrementados de la proteina de HER presentes sobre la superficie de una célula (por ejemplo, via un análisis de inmunohistoquimica; IHC) . Alternativa o adicionalmente, se pueden medir niveles del ácido nucleico que codifica HER en la célula, por ejemplo via hibridización in situ fluorescente (FISH; véase W098/45479 publicado en octubre de 1998), southern blotting, o técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) , tal como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) . También se puede estudiar la sobreexpresión del receptor de HER al medir el esparcimiento o dispersión de antigeno (por ejemplo, dominio extracelular de HER) en un fluido biológico tal como suero (véase, por ejemplo patente estadounidense No. 4,933,294 expedida el 12 de junio de 1990; WO91/05264 publicado el 18 de abril de 1991; patente estadounidense 5,401,638 expedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al. J. Immunol . Methods 132: 73-80 (1990)). Además de los análisis anteriores, varios análisis in vivo están disponibles para el práctico experimentado. Por ejemplo, se puede exponer a las células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que está opcionalmente marcado con una etiqueta detectable, por ejemplo un isótopo radioactivo y enlace del anticuerpo a las células en un paciente se puede evaluar por ejemplo mediante exploración externa en cuanto a radioactividad o analizar una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo. Inversamente, un cáncer que "no sobreexpresa el receptor de HER2" es uno que no expresa niveles más altos que los normales del receptor de HER2 en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Un cáncer que "sobreexpresa" un ligando de HER es uno que produce niveles significativamente más altos de aquel ligando en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede ser provocada por amplificación genética o por transcripción o transducción traducción incrementada. La sobreexpresión del ligando de HER puede ser determinada diagnósticamente al evaluar niveles del ligando (o ácido nucleico lo codifica) en el paciente, por ejemplo en una biopsia de tumor o mediante varios análisis de diagnóstico tales como IHC, FISH, southern blotting, PCR o análisis in vivo descritos anteriormente. El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de células y/o provoca destrucción de células. El término se propone incluir isótopos radioactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales, en los que se incluyen fragmentos y/o variantes de los mismos. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y CYTOTOXAN® ciclofosfamida; alquilsulfonatos tales como busulfan, improsuofan y piposulfan, aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas en las que se incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente buletacina y bulatacinona) ; delta-9-tetrahidrocanabitol (dronabinol, MARINOL®) , beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulinico; una camptotecina (en los que se incluyen el análogo sintético topotecan (HYCAMIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (en los que se incluyen sus análogos de adozelesina, carzelesina y bizelesina sintéticos); podofilotoxina; ácido podofilinico; tiniposuro; criptoficinas (particularmente criptoficinal y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (en los que se incluyen los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1- TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, 4 clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos tales como antibióticos de enedina (por ejemplo calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma II y calicheamicina omega II (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl . , 33: 183-186 (1994)); dinemicina, en los que se incluyen dinemicina A; fisfofonatos, tales como clodronato, una esperamicina; también como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de enedina cromoproteina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubucina ADRIAMYCIN® (en los que incluyen morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y desoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; anís de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexate; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, diamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tales como ácido frolinico; aceglatona; glicosuro de aldofosfamida; ácido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofomina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinana; lonidainina; maytansinoides tales como maytansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; actenuazónico; triaziquona; 2 , 2' , 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente T-2 toxina, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosuro ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos; por ejemplo TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ libre de cremofor, formulación de nanoparticulas albúmina-diseñada de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y TAXOTERE® doxetaxel (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo; gemcitabina (GEMZAR®) ; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina (VELBAN®) ; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexate; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometillornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; sales aceptables farmacéuticamente, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; también como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviatura para el régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina . También incluidos en esta definición están los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como anti-estrógenos y moduladores de receptor de estrógeno selectivos (SERM) , en los que se incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (en los que se incluyen tamoxifeno NOLVADEX®) , raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTON® toremifeno; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprouro, y goserelina; también como as troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolan nucleósido citocina); oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en la proliferación de células abherantes, como por ejemplo PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como vacunas de terapia genérica, por ejemplo vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; PROLEUKIN®rIL-2; inhibidor de topoisomerasa LURTOTECAN®; AB ARELIX® rmRH; y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores. Un "agente quimioterapéutico antimetabolito" es un agente que es estructuralmente similar a un metabolito, pero no puede ser usado por el cuerpo de manera productiva. Muchos agentes quimioterapéuticos anti-metabolitos interfieren con la producción de los ácidos nucleicos, ARN y ADN. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos anti-metabolitos incluyen gemcitabina (GEMZAR®) , 5-fluorouracilo (5-FU) , capecitabina (XELODA™) , 6-mercaptopurina, metotrexato, 6-tioguanina, arabinosilcitosina ARA-C citarabina pemetrexada, raltitrexada (CYTOSAR-U®) , dacarbazina (DTIC-DOME®) , azocitosina, desoxicitosina, piridmideno, fludarabina (FLUDARA®), cladrabina, 2-desoxi-D-glucosa, etc. El agente quimioterapéutico anti-metabolitos preferido es gemcitabina. "Gemcitabina" o "2' -desoxi-2' , 2' -difluorocitidina monoclorhidrato (isómero b" es un ángulo de nucleósido que exhibe actividad anti-tumor. La fórmula empírica para gemcitabina HCl es C9H11F2N304 • HCl. Gemcitabina HCl es vendida por Eli Lilly bajo la marca comercial GEMZAR®. Un "agente quimioterapéutico a base de platino" comprende un compuesto orgánico que contiene platino como parte integral de la molécula. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos a base de platino incluyen carboplatina, cisplatina y oxaliplatino . "Quimioterapia a base de platino" significa una terapia con uno o más agentes quimioterapéuticos a base de platino, opcionalmente en combinación con uno o más de otros agentes quimioterapéuticos. Cáncer "resistente a platino" significa que el cáncer del paciente ha avanzado en tanto que recibe quimioterapia a base de platino (esto es, el paciente es "refractario al platino"), o el paciente ha avanzado en 12 meses (por ejemplo, en el transcurso de 6 meses) después de completar un régimen quimioterapéutico a base de platino. Como se usa en la presente, el término "fármaco EGFR-apuntado" se refiere a un agente terapéutico que se enlaza a EGFR y opcionalmente, inhibe la activación de EGFR. Ejemplos de tales agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se enlazan a EGFR. Ejemplos de anticuerpos que se enlazan a EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase, patente estadounidense No. 4,943,533, Mendelsohn et al.) y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225 o Cetuximab; ERBUTIX®) y humano reformado 225 (H225) (véase, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticuerpos que se enlazan al EGFR mutante tipo II (patente estadounidense No. 5,212,290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se enlazan a EGFR como se describe en la patente estadounidense No. 5,891,996; y anticuerpos humanos que se enlazan a EGFR, tales como ABX-EGF (véase WO98/50433, Abgenix) . El anticuerpo anti-EGFR puede ser conjugado con un agente citotóxico, generando asi un inmunoconjugado (véase, por ejemplo, EP659,439A2, Merck Patent GmbH) . Ejemplos de moléculas pequeñas que se enlazan a EGFR INCLUYEN ZD1839 o Gefitinib (IRESSA™; AstraZeneca) , CP-358774 o Erlotinib HCL (TARCEVA™; Genentech/OSI) y AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen) . Un "inhibidor de tirosina cinasa" es una molécula que inhibe a alguna extensión la actividad de tirosina cinasa de una tirosina cinasa tal como un receptor HER. Ejemplos de tales inhibidores incluyen los fármacos EGFR-apuntados indicados en el párrafo precedente, también como inhibidor de tirosina cinasa de HER2 de molécula pequeña tal como TAK165 disponible de Takeda, inhibidores dobles-HER tales como EKB-569 (disponible de Wyeth) que se enlaza preferiblemente a EGFR pero inhibe tanto células que sobreexpresan HER2 y EGRF, GW572016 (disponible de Glaxo) un inhibidor de tirosina cinasa de HER2 y EGFR oral y PKI-166 (disponible de Novartis) ; pan-inhibidores de HER tales como canertinib (CI-1033; Pharmacia) ; inhibidores de Raf-1 tales como agente antisentido ISIS-5132 disponible de ISIS Pharmaceuticals que inhibe la señalización de Raf-1; inhibidores de TK no HER apuntados tales como mesilato de Imatinib (Gleevac™) disponible de Glaxo; inhibidor de cinasa I MAPK extracelular regulado CI-1040 (disponible de Pharmacia) ; quinazolinas, tales como PD 153035, 4- (3-cloroanilino) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4- (fenilamino) -7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino) ftalimida) ; porciones de nitrotiofeno que contienen tirfostinas; PD-0183805 (Warner-Lamber); moléculas antisentido (por ejemplo, aquellas que se enlazan a ácido nucleico que codifica HER) ; quinoxalinas (patente estadounidense No. 5,804,396); trifostinas (Patente estadounidense No. 5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; inhibidores pan-HER tales como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly) ; Imatinib mesilato (Gleevac; Novartis) ; PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB- 569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; INC-IC1 1 (Imclone); o como se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente: Patente estadounidense No. 5,804,396; WO99/09016 (American Cyanimid); WO98/43960 (American Cyanamid) ; W097/38983 (Warner Lambert) ; WO99/06378 (Warner Lambert); WO99/06396 (Warner Lambert); WO96/30347 (Pfizer, Inc); W096/33978 (Zeneca); W096/3397 (Zeneca); and WO96/33980 (Zeneca) . Un "agente anti-angiogénico" se refiere a un compuesto que bloquea o interfiere con a algún grado el desarrollo de vasos sanguíneos. El factor anti-angiogénico puede ser por ejemplo una molécula pequeña o anticuerpo que se enlaza a un factor de crecimiento o receptor de factor de crecimiento involucrado en promover la angiogénesis . El factor anti-angiogénico preferido en la presente en un anticuerpo que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , tales como Bevacizumab (AVASTIN®) . El término "citocina" es un término generación para proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas de polipéptidos tradicionales. Incluidas entre las citocinas están la hormona de crecimiento tales como hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionilo y hormona de crecimiento bovino; hormona para tiroides; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glucoproteina tales como hormonas que estimula el folículo (FSH) , hormona que estimula la tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno placental; factor de necrosis de tumor a y ß; sustancia que inhibe muleriano; péptido gonadotropina-asociado de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento de nervio tales como NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-a y TGF-ß; factor de crecimiento semejante a insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivs; interferones tales como interferón -a, -ß, y -?; factores estimuladores de colonia (CSF) tales como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF) ; interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-11, IL-12; un factor de necrosis de tumor tal como TNF-a o TNF-ß; u otros factores de polipéptidos en los que se incluyen LIF y ligando de equipo (KL) . Como se usa en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuente naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia natural.

II. Producción de anticuerpos HER2 Una descripción sigue en cuanto a técnicas ejemplares para reproducción de los anticuerpos usados de acuerdo con la presente invención. El antigeno de HER a ser usado para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de HER2 o una porción del mismo, que contiene el epitopo deseado. Alternativamente, células que expresan HER2 en su superficie celular (por ejemplo células NIH-3T3 transformadas para sobreexpresar HER2 o una linea cloruro de carcinoma tal como células SK-BR-3 cells, véase Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)) pueden ser usados para generar anticuerpos. Otras formas de HER2 útiles para generar anticuerpos serán evidentes para aquellos experimentados en el arte. (i) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales son preferiblemente cultivados en animales mediante inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) múltiples del antigeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antigeno relevante con una proteina que inmunogénica en las especies a ser inmunizadas, por ejemplo, hemocianina de lapa de bocallave, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o agente de derivación, por ejemplo maleimidobenzoil sulfosuccimida éster (conjugación por medio de residuos de cisteina) , N-hidroxisuccinimida (por medio de residuos de glicina) , glutaraldehido, anhídrido succinico, S0C12, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Los animales son inmunizados contra el antigeno, conjugados inmunogénicos o derivados al combinar, por ejemplo, 100 µg o 5 µg de la proteina o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde los animales son reforzados con 1/5 a 1/10 la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. 7 a 14 dias más tarde, los animales son sangrado y el suero es analizado en cuanto a titulo de anticuerpo. Los animales son reforzados hasta la meseta del titulo. Preferiblemente, el animal es reforzado con el conjugado del mismo antigeno, pero conjugado a una diferente proteina y/o por medio de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también pueden ser fabricados en cultivo celular recombinante como fusiones de proteina. También, agentes de agregación tales como alumbre son utilizados apropiadamente para mejorar la respuesta inmune. (ii) Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales son obtenidos a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, estos, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que se presentan de manera estable en la naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores. Asi, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por no ser una mezcla de anticuerpos discretos . Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser fabricados utilizando el método de hibridoma descrito por primer vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden ser fabricaos mediante métodos de ADN recombinantes (Patente estadounidense No. 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado tal como un hámster, es inmunizado como se describe anteriormente para producir linfocitos que producen o son aptos de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente a la proteina usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Luego los linfocitos son fusionados con células de mieloma utilizando un agente de fusión apropiado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma ( (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células de hibridoma asi preparadas son sembradas y cultivadas en un medio de cultivo apropiado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células de mieloma originales sin funcionar. Por ejemplo, si las células de mieloma parenterales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá comúnmente hipoxantina aminopterina y timidina (medio HAT) , tales sustancias impiden el crecimiento de células deficientes de HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que fusionan eficientemente, soportan la producción de alto nivel estable del anticuerpo mediante las células que producen anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. De entre estas, las lineas celulares de mieloma preferidas son lineas de mieloma murinas, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y células SP-2 o X63- Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las lineas celulares de mieloma humano y lineas celulares de heteromieloma de ratón-humano también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma son cultivadas es analizado en cuanto a la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. Preferiblemente, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma es determinada mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de enlace in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RÍA) o análisis de inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede ser determinada por ejemplo mediante el análisis de Scatchard y Munson, et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Después que las células de hibridoma son identificadas que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden ser sub-clonados mediante procedimientos de dilución limitantes y cultivados mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) . Medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden ser cultivadas in vivo como tumores de ascites en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los sub-clones son separados apropiadamente por medio de cultivo, fluido de ascites o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales, tales como por ejemplo proteina A-Sefarosa, hidroxilapatita, cromatografía, electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es aislado fácilmente y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótidos que son aptas de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, que son luego transfectados a células huésped tales como células E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células de mieloma que de otra manera no producen proteina de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Artículos de revisión en cuanto a la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol, 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Revs . , 130:151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos pueden ser aislados a partir de bibliotecas de fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990) . Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante redistribución de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), también como infección combinatoria y combinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fago muy grandes (Waterhouse et al., Nuc . Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)) . Asi, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales . El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación para dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (patente estadounidense No. 4,816,567; y Morrison, et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o al unir covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido que no es de inmunoglobulina. Comúnmente, tales polipéptidos sin inmunoglobulina son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo o son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación de antigeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad por un antigeno y otro sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad por un antigeno diferente. (iii) Anticuerpos humanizados Métodos para humanizar anticuerpos no humanos han sido descritos en el arte. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos al mismo de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son denominados frecuentemente como residuos de "importación", que son tomados comúnmente de un dominio variable de "importación". La humanización puede ser efectuada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), al sustituir secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Asi, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son comúnmente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a ser usados en la fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es seleccionada contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a aquellos del roedor es luego aceptada como la región de estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un sub-grupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede ser usada para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151:2623 (1993)). Es importante además que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para obtener este objetivo, de acuerdo con un método preferido, anticuerpos humanizados son preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son familiares para aquellos experimentados en el arte. Programas de computadora están disponibles que ilustran y exhiben estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, esto es, el análisis de residuos que influencia la capacidad de la inmunoglobulina candidato para enlazarse a su antigeno. De esta manera, residuos de FR pueden ser seleccionados y combinados del receptor y secuencias de importación, de tal manera que la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada por el (los) antigeno(s) objetivo se obtiene. En general, los residuos de región hipervariable están directa y más sustancialmente involucrados en influenciar el enlace de antigeno. El ejemplo 3 a continuación describe la producción de anticuerpos de HER2 humanizados ejemplares que enlazan HER2 y bloquean la activación del ligando de un receptor HER. El anticuerpo humanizado de particular interés en la presente bloquea la activación moderada por EGF, TGF-a y/o HRG de MAPK, esencialmente de manera tan efectiva como el anticuerpo monoclonal murino 2C4 (o un fragmento de Fab del mismo) y/o se enlaza a HER2 esencialmente de manera tan efectiva como el anticuerpo monoclonal murino 2C4 (o un fragmento Fab del mismo) . El anticuerpo humanizado en la presente puede comprender por ejemplo residuos de región hipervariable no humanos incorporadas a un dominio pesado variable humano y puede comprender además una sustitución de región de estructura (FR) en una posición seleccionada del grupo que consiste de 69H, 71H y 73H utilizando el sistema de numeración de dominio variable resumido en Kabat et al., Sequences of Proteins of I munological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones FR en dos o todas las posiciones de 69H, 71H y 73H. Un anticuerpo humanizado ejemplar de interés en la presente comprende residuos que determinan la complementareidad de dominio pesado variable GFTFTDYTMX, en donde X es preferible D o S (SEQ ID NO :7) ; DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 8); y/o NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 9), que comprende opcionalmente modificaciones de aminoácidos de aquellos residuos de CDR, por ejemplo, en donde las modificaciones mantienen esencialmente o mejoran la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo de interés puede tener de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 o aproximadamente 5 sustituciones de aminoácido en las secuencias de CDR pesadas variables anteriores. Tales variantes de anticuerpo pueden ser preparadas mediante maduración de afinidad, por ejemplo como se describe posteriormente en la presente. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácido de dominio pesado variable en SEQ ID NO: 4. El anticuerpo humanizado puede comprender residuos que determinan la complementareidad de dominio ligero variable KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10); SASYX1X2X3, en donde X1 es preferiblemente R o L, X2 es preferiblemente Y o E y X3 es preferiblemente T o S (SEQ ID NO: 11); y/o QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), por ejemplo además de aquellos residuos de CDR de dominio pesado variable en el párrafo precedente. Tales anticuerpos humanizados comprenden opcionalmente modificaciones de aminoácido de los residuos de CDR anteriores, por ejemplo, en donde las modificaciones mantienen esencialmente o mejoran la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo de interés puede tener de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 o aproximadamente 5 sustituciones de aminoácido en las secuencias de CDR ligeras variables anteriores. Tales variables de anticuerpo pueden ser preparadas mediante maduración de afinidad, por ejemplo como se describe posteriormente en la presente. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácidos de dominio ligero variable en SEQ ID NO: 3. La presente solicitud también contempla anticuerpos madurados por afinidad que se enlazan a HER2 y bloquean la activación del ligando de un receptor de HER. El anticuerpo original puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, por ejemplo uno que comprende las secuencias ligeras y/o pesadas variables de SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente (esto es, variante 574). El anticuerpo madurado de afinidad se enlaza al receptor de HER2 con una afinidad superior a aquella de 2C4 murino o la variante 574 (por ejemplo, de aproximadamente 2 o aproximadamente 4 veces a aproximadamente 100 veces o aproximadamente 100 veces afinidad mejorada, por ejemplo como se determina utilizando una ELISA de dominio extracelular de HER (ECD) ) . Residuos de CDR pesados variables para sustitución incluyen H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99, o combinaciones de dos o más (por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de estos residuos). Ejemplos de residuos de CDR ligeros variables para alteración incluyen L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 o combinaciones de dos o más (por ejemplo, dos a tres, cuatro, cinco o hasta aproximadamente diez de estos residuos) . Varias formas del anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado por afinidad son contempladas. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado por afinidad puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que está opcionalmente conjugado con uno o más agentes citotóxicos con el fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado por afinidad puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto. (iv) Anticuerpos humanos Como una alternativa a la humanización, se puede generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son aptos, después de la inmunización, de producir un pleno repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la cancelación de homozigo del gen de región que une la cadena pesada de anticuerpo (JH) y ratones mutantes de linea de germinación da como resultado inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la disposición genética de inmunoglobulina de linea de germinación humana en tales ratones mutantes de linea de generación dará como resultado la producción de anticuerpos humanos después del tratamiento de antigeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al. Year in Immuno., 7:33 (1993); y patentes estadounidenses No. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. Alternativamente, se puede usar tecnología de exhibición de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de gen de dominio variable de inmunoglobulina (V) a partir de donadores sin inmunizar. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo son clonados en cuadro ya sea a un gen de proteina de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y exhibidos como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma de fago, las selecciones a base de las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. Asi, el fago imita algunas de las propiedades de célula B. La exhibición de fago puede ser efectuada en una variedad de formatos; para su revisión, véase, por ejemplo Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de gen V pueden ser usados para la exhibición de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una diversa disposición de anticuerpos de anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatorial aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V a partir de donadores humanos no humanizados puede ser construido y los anticuerpos a una diversa disposición de antigeno (en los que se incluyen auto-antigenos) pueden ser aislados esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véase también, patentes estadounidenses Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Como se discute anteriormente, anticuerpos humanos pueden también ser generados mediante células B activadas in vitro (véase patentes estadounidenses Nos. 5,567,610 y 5,229,275). Los anticuerpos HER2 humanos son descritos en la patente estadounidense No. 5,772,997 expedida el 30 de junio de 1998 y WO 97/00271 publicado el 3 de enero de 1997. (v) Fragmentos de anticuerpo Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos eran derivados via digestión proteolitica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora ser producidos directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislados a partir de las bibliotecas de fago de anticuerpo discutidas anteriormente.

Alternativamente, fragmentos de Fab'-SH pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados química para formar fragmentos de F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro procedimiento, fragmentos de F(ab')2 pueden ser aislados directamente de cultivo de célula huésped recombinante. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el práctico experimentado. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento de Fv de una sola cadena (scFv) . Véase WO 93/16185; Patente estadounidense No. 5,571,894; y Patente estadounidense No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo puede también ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo como se describe en la patente estadounidense No. 5,641,870 por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecificos o biespecificos . (vi) Anticuerpos biespecificos Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para por lo menos dos epitopos diferentes. Anticuerpos biespecificos ejemplares se pueden enlazar a dos epitopos diferentes de la proteina HER2. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace de HER2 con sitio (s) de enlace para EGFR, HER3 y/o HER4. Alternativamente, un brazo de HER2 se puede combinar con un brazo que se enlaza a una molécula de activación sobre un leucocito, tal como una molécula de receptor de célula T (por ejemplo CD2 o CD3) , o receptores de Fe para IgG (Fc?R), tales como Fc?RI (CD64), Fc?RII (CD32) y Fc?RIII (CD16) para enfocar mecanismos de defensa celulares a la célula que expresa HER2. Anticuerpos biespecificos pueden también ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expresan HER2. estos anticuerpos poseen un brazo de enlace de HER2 y un brazo que se enlaza al agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti-interferón-a, vinca alcaloide, cadena de ricino A, metotrexato o hapteno isótopo radioactivo) . Anticuerpos biespecificos pueden ser preparados como anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab')2. WO 96/16673 describe un anticuerpo de HER2/Fc?RIII biespecifico y la patente estadounidense No. 5,837,234 revela un anticuerpo de HER2/Fc?RI biespecifico IDM1 (Osidem) . Un anticuerpo HER2/Fca es mostrado en WO 98/02463. La patente estadounidense No. 5,821,337 enseña un anticuerpo de HER2/CD3 biespecifico. MDX-210 es un Ab de HER2-Fc?RIII biespecifico. Métodos para fabricar anticuerpos biespecificos son conocidos en el arte. La producción tradicional de anticuerpos biespecificos de plena longitud está basada en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la clasificación aleatoria de cadenas pesada y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de los cuales solamente una tiene la estructura bisespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se hace usualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es más bien molesta y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares son descritos en WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655- 3659 (1991). De acuerdo con un procedimiento diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitio de combinación de anticuerpo-antigeno) son fusionados a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la articulación o engozne, CH2 y regiones CH3. Es preferido tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados a vectores de expresión separados y son co-transfectados a un organismo huésped apropiado. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades cuando proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de significado particular. En una modalidad preferida de este procedimiento, los anticuerpos biespecificos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimetría facilita la separación del compuesto biespecifico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina indeseable, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente la mitad de la molécula bisespecifica proporciona una manera de separación fácil. Este procedimiento es revelado en WO 94/04690. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecificos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acuerdo con otro procedimiento descrito en la patente estadounidense No. 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser diseñada para maximizar el porcentaje de heterodimeros que son recuperados del cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende por lo menos parte del dominio de CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptófano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral (es) grande son creadas sobre la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas laterales de aminoácidos grande con pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodimero con respecto a los productos finales indeseables tales como homodimeros. Anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo para apuntar células del sistema inmune a células indeseables (patente estadounidense No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección de HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser fabricados utilizando cualesquier métodos de reticulación convenientes. Agentes de reticulación apropiados son bien conocidos en el arte y son revelados en la patente estadounidense No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación. Técnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos pueden ser preparados utilizando enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde anticuerpos intactos son escindidos proteoliticamente para generar fragmentos de F(ab')2. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente acomplejante de ditiol arsinato de sodio para estabilizar ditioles vecinales e impedir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos de Fab' generados son luego convertidos a derivado de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab ' -TNB es luego recuperado al Fab '-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab ' -TNB para formar el anticuerpo biespecifico. Los anticuerpos biespecificos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El avance reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos de Fab'-SH de E. coli, el cual puede ser acoplado químicamente para formar anticuerpos biespecificos . Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula de F(ab')2 de anticuerpo biespecifico plenamente humanizada. Cada fragmento de Fab' fue secretado separadamente de E. coli y sometido a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecifico. El anticuerpo biespecifico asi formado fue apto de enlazar a células que sobreexpresan el receptor de HER2 y células T humanas normales, también como disparar la actividad litica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de pecho humano. Varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecificos directamente de cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos han sido producidos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol, 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun fueron enlazados a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión genética. Los homodimeros de anticuerpo fueron reducidos en la región de engozne para formar monómeros y/o oxidados para formar los heterodimeros de anticuerpo. Este método puede también ser utilizado para la producción de homodimeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita en Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpo biespecificos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Asi, los dominios de VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios de VH y VL complementarios de otro fragmento, formando mediante esto dos sitios de enlace de antigeno. Otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpo biespecificos mediante el uso de dimeros de Fv (sFv) de una sola cadena también se ha reportado. Véase Gruber et al., J. Immunol . , 152:5368 (1994). Anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, anticuerpos triespecificos pueden ser preparados. Tutt et al. J. Immunol . 147: 60 (1991). (vii) Otras modificaciones de secuencia de aminoácido Modificaciones de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos HER2 descritos en la presente son contempladas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo HER2 son preparadas al introducir cambios de nucleótidos apropiados al ácido nucleico del anticuerpo HER2 o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo cancelaciones de y/o inserciones a y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo HER2. Se puede efectuar cualquier combinación de cancelación, inserción y sustitución para llegar al constructo o construcción final, a condición de que el constructo o construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos post-traducción del anticuerpo HER2, tal como cambiar el número o posición de sitios de glucosilación. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo HER2 que son sitios preferidos para mutagénesis es llamado "mutagénesis de exploración o barrido de alanina" como se describe por Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, un residuo o un grupo de residuos objetivos son identificados (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antigeno de HER2. Aquellos sitios de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son luego refinados al introducir variantes adicionales u otras variantes en o para los sitios de sustitución. Asi, en tanto que el sitio para introducción de una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminada, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se efectúa exploración o barrido ala o mutagénesis aleatoria en el codón objetivo o región y las variantes de anticuerpo de HER2 expresadas son seleccionadas en cuanto a la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que fluctúan en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen 100 o más residuos, también como inserciones de intrasecuencia de residuos individuales o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo HER2 con un residuo N-terminal metionilo o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo de HER2 incluyen la fusión al término N o C del anticuerpo HER2 a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la vida media en el suero del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo de HER2 reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero alteraciones FR son también contempladas. Sustituciones conservadoras son mostradas en la figura 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en actividad biológica, entonces más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1 o como se describe posteriormente en la presente en referencia a clases de aminoácidos pueden ser introducidos y los productos seleccionados.

Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se efectúan al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto al mantener (a) la estructura de la cadena fundamental de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoácidos pueden ser agrupados de acuerdo con similaridades en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, in Biochemistry, segunda edición, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L) , He (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W) , Met (M) (2) polar sin carga: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C), Tyr (Y), Asn (N) , Gln (Q) (3) ácidos: Asp (D) , Glu (E) (4) básico: Lys (K) , Arg (R) , His(H) Alternativamente, los residuos que se presentan de manera estable en la naturaleza pueden ser divididos en grupo en base a propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofilico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservadoras abarcarán intercambiar un elemento de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteina no involucrado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo HER2 también puede ser sustituido. En general con serina, para mejorar la estabilidad oxidante de la molécula e impedir la reticulación aberrante. Inversamente, enlace (s) de cisteina puede (n) se agregado (s) al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) .

Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante (s ) seleccionada (s) para desarrollo adicional tendrá (n) propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo original del cual son generados. Una manera conveniente para generar tales variantes sustitucionales involucra maduración de afinidad utilizando exhibición de fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones amino-posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo asi generadas son mostradas de forma monovalente de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto de gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Luego las variantes exhibidas por fago son seleccionadas en cuanto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace) como se revela en la presente. Con el fin de identificar sitos de región hipervariable candidatas para modificación se puede efectuar mutagénesis de barrido de alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace de antigeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo antigeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y HER2 humano. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que tales variantes son generadas, el panel de variantes es sometido a selección como se describe en la presente y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes pueden ser seleccionados para desarrollo adicional. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Alterar significa cancelar una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo y/o agregar uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de anticuerpos es comúnmente N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la anexión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para anexión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Asi, la presencia de ya sea una u otra de estas secuencias de tripéptidos con un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación O-enlazada se refiere a la anexión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina .

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se efectúa convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos, de tal manera que contiene una o más secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación N-enlazado) . La alteración puede también ser usada mediante la adición de o sustitución por uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación O-enlazados) . Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo HER2 son preparadas mediante una variedad de métodos conocidos en el arte. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza) o preparación mediante mutagénesis oligonucleótido-moderada (o dirigida al sitio) , mutagénesis de PCR y mutagénesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo de HER2. Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo para mejorar la citotoxicidad moderada por la célula dependiente de antigeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Eso se puede obtener al introducir una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fe del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, residuo (s) de cisteina pueden ser introducidos en la región de Fe, permitiendo mediante esto la formación de enlace de disulfuro de intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico asi generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o exterminio celular moderado por complemento incrementada y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo incrementada (ADCC). Véase Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada pueden también ser preparados utilizando agentes de reticulación heterobifuncionales como se describe en Wolff et al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser diseñado que tenga regiones Fe dobles y puede mediante esto tener lisis de complemento y capacidades de ADCC mejoradas. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para incrementar la vida media en el suero del anticuerpo, se puede incorporar un epitopo de enlace de receptor silvestre al anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente estadounidense No. 5,739,277, por ejemplo. Como se usa en la presente, el término "epitopo de enlace de receptor silvestre" se refiere a un epitopo de la región Fe de una molécula de IgG (por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de incrementar la vida media en el suero in vivo de la molécula de IgG. (viii) Selección de anticuerpos con las propiedades deseadas Técnicas para generar anticuerpos se han descrito anteriormente. Se pueden seleccionar además anticuerpos con ciertas características biológicas, como se desee. Para identificar un anticuerpo que bloquea la activación de ligando de un receptor HER, la capacidad del anticuerpo para bloquear el enlace de ligando de HER a células que expresan el receptor HER (por ejemplo, en conjugación con otro receptor de HER en el cual el receptor de HER de interés forma un hetero-oligómero de HER) puede ser determinada. Por ejemplo, células que expresan naturalmente o transfectadas para expresar, receptores de HER del hetero-oligómero de HER puede ser incubadas con el anticuerpo y luego expuestas a un ligando de HER marcado. La capacidad del anticuerpo HER2 para bloquear el enlace de ligando al receptor de HER al hetero-oligómero de HER puede luego ser evaluada. Por ejemplo, la inhibición del enlace de HRG a lineas celulares de tumor de pecho de MCF7 mediante anticuerpos de HER2 se puede efectuar utilizando cultivos de MCF7 en monocapa sobre hielo en un formato de placa de 24 cavidades esencialmente como se describe en el ejemplo 1 posteriormente en la presente. Anticuerpos monoclonales HER2 pueden ser agregados a cada cavidad e incubados durante 30 minutos. Luego se puede agregar rHRGßl?77-i44 125I-marcado (25 pm) y la incubación puede ser proseguida por 4 a 16 horas. Curvas de respuesta de dosis pueden ser preparadas y un valor de IC50 puede ser calculado para el anticuerpo de interés. En una modalidad, el anticuerpo que bloquea la activación de ligando de un receptor HER tendrá una IC50 para inhibir el enlace de HRG a células de MCF7 en este análisis de aproximadamente 50 nM o menor, más preferiblemente 10 nM o menor. En donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento de Fab, la IC50 para inhibir el enlace de HRG a células de MCF7 en este análisis puede ser por ejemplo, aproximadamente 100 nM o menor, más preferiblemente 50 nM o menor. Alternativa o adicionalmente, la capacidad del anticuerpo de HER para bloquear la fosforilación de tirosina estimulada por ligando de HER de un receptor de HER presente en un hetero-oligómero de HER puede ser determinada. Por ejemplo, células que expresan endógenamente los receptores de HER o transfectados para expresarlos pueden ser incubadas con el anticuerpo y luego analizadas en cuanto a actividad de fosforilación de tirosina dependiente de ligando de HER utilizando un anticuerpo monoclonal de anti-fosforil tirosina (que está opcionalmente conjugado con una etiqueta detectable) . El análisis de activación de receptor de cinasa descrito en la patente estadounidense No. 5,766,863 también está disponible para determinar la actividad de receptor de HER y bloqueo de aquella actividad por un anticuerpo.

En una modalidad, se puede seleccionar un anticuerpo que inhibe la estimulación de HRG de fosforilación de tirosina pl80 en células MCF7 esencialmente como se describe en el ejemplo 1 a continuación. Por ejemplo, las células MCF7 pueden ser depositadas en placas de 24 cavidades y anticuerpos monoclonales a HER2 pueden ser agregados a cada cavidad e incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente; luego se puede agregar rHRGßli77-244 a cada cavidad a una concentración final de 0.2 nM, y la incubación puede ser proseguida durante 8 minutos. Los medios pueden ser aspirados de cada cavidad y las reacciones pueden ser detenidas mediante la adición de 100 µl de solución reguladora del pH de muestra de SDS (5% SDS, 25 mM DTT, y 25 mM Tris-HCl, pH 6.8). Cada muestra (25 µl) puede ser sometida a electroforesis sobre un gel de gradiente de 4-12% (Novex) y luego transferida electroforéticamente a membrana de difluoruro de polivinilideno. Se pueden desarrollar inmunoabsorciones de aminofosfotirosina (a lµg/ml) y la densidad de la banda de reacción predominante a Mr ~180, 000 puede ser cuantificada mediante densitometria de reflectancia. El anticuerpo seleccionado preferiblemente inhibirá significativamente la estimulación de HRG fosforilación de tirosina pl80 a aproximadamente 0-35% del control en este análisis. Una curva de dosis-respuesta para la inhibición de estimulación de HRG de fosforilación de tirosina pl80 tal como se determina mediante densitometria de reflectancia puede ser preparada y una IC5o para el anticuerpo de interés puede ser calculado. En una modalidad, el anticuerpo que bloquea la activación de ligando de receptor de HER tendrá una IC50 para inhibir la estimulación de HRG de fosforilación de tirosina pl80 en este análisis de aproximadamente 50 nM o menos, más preferiblemente 10 nM o menor. En donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab, la IC50 para inhibir la estimulación de HRG de fosforilación de tirosina pl80 en este análisis puede ser de por ejemplo aproximadamente 100 nM o menor, más preferiblemente 50 nM o menor. También se pueden determinar los efectos inhibidores del crecimiento del anticuerpo en células MDA-MB-175, por ejemplo esencialmente como se describe en Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997). De acuerdo con este análisis, células MDA-MB-175 pueden ser tratadas con un anticuerpo monoclonal de HER2 (10 µg/mL) durante 4 dias y teñidas con violeta cristal. La incubación con un anticuerpo de HER2 puede mostrar un efecto inhibidor de crecimiento en esta linea cloruro similar a aquel exhibido por el anticuerpo monoclonal 2C4. En una modalidad adicional, el HRG exógeno no invertirá significativamente esta inhibición. Preferiblemente, el anticuerpo será apto de inhibir la proliferación celular de células MDA-MB-175 a una extensión mayor del anticuerpo monoclonal 4D5 (y opcionalmente a una extensión mayor que el anticuerpo monoclonal 7F3) , tanto en presencia como en ausencia de HRG exógeno. En una modalidad, el anticuerpo de HER2 de interés puede bloquear la asociación dependiente de heregulina de HER2 con HER3 tanto en células MCF7 como células SK-BR-3 tal como se determina en un experimento de co-inmunoprecipitación al como aquel descrito en el ejemplo 2 sustancialmente más efectivamente que el anticuerpo monoclonal 4D5 y de preferencia sustancialmente más efectivamente que el anticuerpo monoclonal 7F3. Para identificar anticuerpos de HER2 inhibidores de crecimiento, se pueden seleccionar anticuerpos que inhiben el crecimiento de células de cáncer que sobreexpresan HER2. En una modalidad, el anticuerpo inhibidor de crecimiento de elección es apto de inhibir el crecimiento de células SK-BR-3 en cultivo celular por aproximadamente 20-100% y preferiblemente por alrededor de 50-100% a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml. Para identificar tales anticuerpos, el análisis de SK-BR-3 descrito en la patente estadounidense No. 5,677,171 puede ser efectuado. De acuerdo con este análisis, células SI-BR-3 son cultivadas en una mezcla 1:1 de F12 y medio de DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal, glutamina y penicilina estreptomicina. Las células SK-BR-3 son depositadas a 20,000 células en una placa de cultivo celular de 35 mm (2 ml/35 mm de placa) . 0.5 a 30 µg/ml del anticuerpo HER2 son agregados por placa o caja. Después de seis dias, el número de células, en comparación con las células sin tratar son contadas utilizando un contador de células electrónico COULTER™. Aquellos anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células SK-BR-3 por aproximadamente 20-100% o aproximadamente 50-100% pueden ser seleccionadas como anticuerpos inhibidores de crecimiento. Véase patente estadounidense No. 5,677,171 para análisis de selección de anticuerpos inhibidores de crecimiento, tales como 4D5 y 3E8. Con el fin de seleccionar anticuerpos que inducen apóptosis, un análisis de enlace de anexina utilizando células BT474 está disponible. Las células BT474 son cultivadas y sembradas en cajas como se discute en el párrafo precedente. Luego el medio es separado y reemplazado con medio nuevo solo o medio que contiene 10 µg/ml del anticuerpo monoclonal. Enseguida de un periodo de incubación de tres dias, las monocapas son lavada con PBS y separadas mediante tripsinización . Luego las células son centrifugadas, resuspendidas en solución reguladora del pH de enlace de Ca2+ y toma sen alícuotas en tubos como se discute anteriormente para el análisis de muerte celular. Luego los tubos reciben anexina marcada (por ejemplo, anexina V-FTIC) (1 µg/ml). Las muestras pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo FACSCAN™ y elementos de programación FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de enlace de anexina en relación con el control son seleccionados como anticuerpos que inducen apóptosis. Además del análisis de anexina, un análisis de teñido de ADN utilizando células BT474 está disponible. Con el fin de efectuar este análisis, células BT474 que han sido tratadas con el anticuerpo de interés como se describe en los dos párrafos precedentes son incubadas con 9 µg/ml de HOECHST 33342™ durante 2 horas a 37°C, luego analizadas en un citómetro de flujo EPICS ÉLITE™ (Coulter Corporation) utilizando elementos de programación MODFIT LT™ (Verity Software House) . Los anticuerpos que inducen un cambio en el porcentaje de células apoptóticas que es dos veces o mayor (y preferiblemente 3 veces o mayor) que las células sin tratar (hasta 100% de células apoptóticas) pueden ser seleccionados como anticuerpos pro-apoptóticos utilizando este análisis. Véase W098/17797 en cuanto análisis para seleccionar anticuerpos que inducen apóptosis, tales como 7C2 y 7F3. Para seleccionar anticuerpos que se enlazan a un epitopo sobre el HER2 enlazado por un anticuerpo de interés, un análisis de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988), puede ser efectuado para determinar si el anticuerpo bloquea de manera cruzada el enlace de un anticuerpo, tal como 2C4 o pertuzumab a HER2. Alternativa o adicionalmente, se puede efectuar el mapeo de epitopo mediante métodos conocidos en el arte (véase, por ejemplo figuras 1A y IB en la presente) y/o se puede estudiar la estructura de anticuerpo-HER2 (Franklin et al. Cáncer Cell 5:317-328 (2004)) para ver cual (es) dominio(s) de HER2 está/están enlazados por el anticuerpo. (ix) Inmunoconjugados La invención también pertenece a inmunoconjugados que comprende un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (una toxina de molécula pequeña o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, en los que se incluyen fragmentos y/o variantes de las mismas) o un isótopo radioactivo (esto es, un radioconjugado) . Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados han sido descritos anteriormente. Conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como calicheamicina, una maytansina (patente estadounidense No. 5,208,020), un tricoteno y CC1065 también son contemplados en la presente. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo es conjugado a una o más moléculas de maytansina (por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 10 molécula de maytansina por molécula de anticuerpo) . La maytansina puede por ejemplo ser convertida a May-SS-Me, el cual puede ser reducido a May-SH3 y hacerse reacciona con el anticuerpo modificado (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) para generar un inmunoconjugado de maytansinoide-anticuerpo. Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo de HER2 conjugado a una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos de calicheamicina son aptos de producir rupturas de ADN de doble hebra a concentraciones sub-picomolares . Análogos estructurales de calicheamicina que pueden ser usados incluyen, pero no están limitados a ?i1, a2?, a3x, N-acetil-?i1, PSAG y 0J? (Hinman et al., Cáncer Research 53: 3336-3342 (1993) y Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998)). Véase, también patentes estadounidenses Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; y 5,773,001 incorporadas expresamente por referencia en la presente. Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas pueden ser usados incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa ) , cadena de ricino A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii , proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de carantia momordica, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Véase por ejemplo, WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolitica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa, tal como una desoxiribonucleasa; DNAasa) . Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos HER2 radioconjugados. Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu . Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden ser fabricados utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteina bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-?iridilditiol) (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados funcionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehido) , componentes bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2, 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede ser preparada como se describe en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminpentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Véase WO 94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un enlazador ácido-lábil, enlazador peptidasa-sensible, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) puede se usado. Alternativamente, una proteina de fusión que comprende el anticuerpo de HER2 y agente citotóxico puede ser fabricado por ejemplo mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptido. En todavía otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en pre-apuntamiento de tumor, en donde el conjugado de anticuerpo-receptor es administrado al paciente, seguido por la remoción del conjugado sin enlazar de la circulación utilizando un agente de despeje y luego administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo radionucleótido) . (x) Terapia de profármaco moderada por enzima dependiente de anticuerpo (ADEP) Los anticuerpos de la presente invención pueden también ser usados en ADEPT al conjugar el anticuerpo a una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, agente quimioterapéutico de peptidilo, véase WO81/01145) a un fármaco anti-cáncer activo. Véase, por ejemplo, WO 88/07378 y patente estadounidense No. 4,975,278. El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un fármaco de tal manera para convertirlo a su forma citotóxica más activa . Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato a los fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato a fármacos libres; citocina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitocina no tóxica al fármaco anticáncer, 5-fluorouracilo; proteasas tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsina B y L) , que son útiles para convertir fármacos que contienen péptido al los fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de aminoácido D; enzimas que escinden carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados a fármacos libres; ß-lactamas útil para convertir fármacos derivados de ß-lactama a fármacos libres y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente en fármacos libres. Alternativamente, anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en el arte como "abzimas" pueden ser usados para convertir los profármacos de la invención a fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden ser preparados como se describe en la presente para la administración de la abzima a una población de células de tumor. Las enzimas de esta invención pueden ser enlazadas covalentemente a los anticuerpos HER2 mediante técnicas bien conocidas en el arte, tal como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales descritos anteriormente. Alternativamente, proteínas de fusión que comprenden por lo menos una región de enlace de antigeno del anticuerpo de la invención enlazado a por lo menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención puede ser construido utilizando técnicas de ADN recombinantes bien conocidas en el arte (véase, por ejemplo Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984) . (xi) Otras modificaciones de anticuerpo Otras modificaciones del anticuerpo son contempladas en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser enlazado a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolimeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo también puede ser atrapado en microcápsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilacrilato) , respectivamente) , en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edición, Oslo, A., Ed., (1980). Los anticuerpos de HER2 revelados en la presente pueden también ser formulados como inmunoliposomas. Liposomas que contienen el anticuerpo son preparados mediante métodos conocidos en el arte, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); Patentes estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Liposomas con tiempo de circulación mejorados son revelados en la patente estadounidense No. 5,013,556.

Liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lipido que comprende fosfatidil colina, colesterol y fosfatidiletanolamina PEG-derivada (PEG-PE). Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos de Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) via una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Véase, Gabizon et al. J. National Cáncer Inst. 81 (19) 1484 (1989) .

III . Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos usados de acuerdo con la invención son preparados para almacenamiento al mezclar un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales, (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizadores apropiados son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones usadas e incluyen soluciones reguladoras del pH tal como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes en los que se incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butilico o bencílico; alquil parabenes tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexenol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofilicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos en los que se incluyen glucosa, mañosa o dextrina; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio, complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteina) , y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) . Formulaciones de anticuerpos HER2 liofilizadas preferidas son descritas en WO 97/04801, incorporado expresamente en la presente por referencia. La formulación en la presente puede también contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre si. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar anticuerpos que se enlazan a EGFR, HER2 (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza a un epitopo diferente sobre HER2), HER3, HER4 o factor endotelial vascular (VEGF) en la formulación. Alternativa o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor de crecimiento, agente anti-hormonal, fármaco EGFR-apuntado, agente anti-angiogénico y/o cardioprotector . Tales moléculas están presentes apropiadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado. Los ingredientes activos pueden también estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistema de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) . Preparaciones de liberación sostenida pueden ser preparadas. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (alcohol vinilico) ) , polilacturos (patente estadounidense No. 3,773,919), copolimeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolimeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolimero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuproluro) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutirico. Las formulaciones a ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

IV. Selección de Pacientes para Terapia De acuerdo con una modalidad preferida de la invención de la presente, el paciente seleccionado para terapia tiene un tumor que muestra activación de HER (y preferiblemente HER2) . En una modalidad, la extensión de activación de HER (o HER2) en células de cáncer excede significativamente el nivel de activación de aquel receptor en células no cancerosas del mismo tipo de tejido. Tal activación excesiva puede resultar de la sobreexpresión del receptor de HER y/o mayor que nivel normales de un ligando de HER disponible para activar el receptor de HER en las células de cáncer. Tal activación excesiva puede provocar y/o ser provocada por el estado maligno de una célula de cáncer. En algunas modalidades, el cáncer será sometido a un análisis de diagnóstico o prognostico para determinar si la amplificación y/o sobreexpresión de un receptor de HER está ocurriendo que da como resultado tal activación excesiva del receptor de HER. Alternativa o adiciónalmente, el cáncer puede ser sometido a un análisis de diagnóstico o prognostico para determinar si se está presentando amplificación y/o sobreexpresión de un ligando de HER en el cáncer que se atribuye a la activación excesiva del receptor. En un sub-conjunto de tales cánceres, la activación excesiva del receptor puede resultar de una ruta estimulatoria autócrina. Varios análisis para determinar la activación de HER será descrito en más detalle posteriormente en la presente. (i) Dimeros de HER Muestras de tumor pueden ser determinadas en cuanto a la presencia de dimeros de HER, tal como se indica por la activo de HER o HER2. Cualquier método conocido en el arte puede ser usado para detectar dimeros de HER2, tales como EGFR-HER2, HER2-HER3, en tumores. Varios métodos preferidos son descritos a continuación. Estos métodos detectan interacciones de proteina-proteina no covalentes o de otra manera indican proximidad entre proteínas de interés . Métodos a base de inmunoafinidad, tal como inmunoprecipitación o ELISA, pueden ser usados para detectar dimeros de HER. En una modalidad, se usan anticuerpos HER2 para inmunoprecipitar complejos que comprenden HER2 de células de tumor y luego el inmunoprecipitante resultante es probado en cuanto a la presencia de EGFR o HER3 mediante inmunoabsorción . En otra modalidad, anticuerpos de EGFR o HER3 pueden ser usados para la etapa de inmunoprecipitación y luego el inmunoprecipitante probado con anticuerpos HER2. En una modalidad adicional, ligandos de HER específicos a complejos de EGFR, HER3, EGFR/HER2 o complejos de HER2/HER3 pueden ser usados para precipitar complejos que luego son probados en cuanto a la presencia de HER2. Por ejemplo, los ligandos pueden ser conjugados a avidina y complejos purificados en una columna de biotina. En otras modalidades, tal como ELISA o análisis tipo "emparedado" de anticuerpo, anticuerpos a HER2 son inmovilizados sobre un soporte sólido, puestos en contacto con células de tumor o lisado de célula de tumor, lavados y luego expuestos a anticuerpo contra EGFR o HER3. El enlace del último anticuerpo, que puede ser detectado directamente o mediante un anticuerpo secundario conjugado a una etiqueta detectable, indica la presencia de heterodimeros . En ciertas modalidades, el anticuerpo de EGFR o HER3 es inmovilizado y el anticuerpo de HER es usado para la etapa de detección. En otras modalidades, ligandos de HER pueden ser usados en lugar de o en combinación con anticuerpos HER. La reticulación química o reticulación UV puede también ser usada para unir covalentemente dimeros sobre la separa de células vivientes. Hunter et al., Biochem. J., 320:847-53. Ejemplos de agentes de reticulación químicos incluyen propionato de ditiobis (succinimidilo) (DSP) y propionato de 3, 3' -ditiobis (sulfosuccinimidilo) (DTSSP). En una modalidad, extractos celulares de células de tumor reticuladas químicamente son analizadas mediante SDS-PAGE e inmunoabsorbidas con anticuerpos a EGFR y/o HER3. Una banda super-desplazada del peso molecular apropiado representa más probablemente dimeros de EGFR-HER2 o HER2-HER3, ya que HER2 es el socio de dimerización preferido para EGFR y HER3. Este resultado puede ser confirmado mediante inmunoabsorción subsecuente con anticuerpos de HER2. También se puede usar transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) para detectar dimeros de EGFR-HER2 o HER2-HER3. FRET detecta cambios conformacionales de proteina e interacciones de proteina-proteina in vivo e in vitro en base a transferencia de energía de un fluoróforo donador a un fluoróforo donador a un fluoróforo aceptor. Selvin, Nat. Struct. Biol, 7:730-34 (2000). La transferencia de energía toma lugar solamente si el fluoróforo donador está en proximidad suficiente al fluoróforo aceptor. En un experimento de FRET típico, dos proteínas o dos sitios en una sola proteina son marcados con sondas fluorescentes diferentes. Una de las sondas, la sonda donadora, es excitada a un estado de energía más alto mediante luz incidente de una longitud de onda especificada. Luego la sonda donadora transmite su energía a la segunda sonda, la sonda aceptora, dando como resultado una reducción en la intensidad de fluorescencia del donador y un incremento en la emisión de fluorescencia del aceptor. Para medir la extensión de transferencia de energía, la intensidad del donador en una muestra marcada con sondas de donador y aceptor es comparada con su intensidad con una muestra marcada con sonda donadora solamente. Opcionalmente, la intensidad del aceptor es comparada en muestras de donador/aceptor y aceptor solamente. Sondas apropiadas son conocidas en el arte e incluyen, por ejemplo, tintes permeantes de membrana, tales como fluoresceina y rodamina, tintes orgánicos, tales como los tintes de cianina y átomos de lantánido. Selvin, supra. Métodos e instrumentación para detectar y medir transferencia de energía son también conocidos en el arte. Selvin, supra. Técnicas a base de FRET apropiadas para detectar y medir interacciones de proteina-proteina en células individuales son también conocidas en el arte. Por ejemplo, microscopía de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de fotoblanqueado de donador (pbFRET) y microscopía de formación de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) pueden ser usadas para detectar la dimerización de receptores de superficie celular. Selvin, supra; Gadella & Jovin, J. Cell Biol., 129:1543-58 (1995). En una modalidad, se usa pbFRET sobre células ya sea "en suspensión" o "in situ" para detectar y medir la formación de dimeros de EGFR-HER2 o HER2-HER3, como se describe en Nagy et al., Cytometry, 32:120-131 (1998). Estas técnicas miden la reducción en el tiempo de vida de fluorescencia del donador debido a la transferencia de energía. En una modalidad particular, se puede usar una técnica de FRET tipo Foerster citométrico de flujo (FCET) para investigar la dimerización de EGFR-HER2 y HER2-HER3 como se describe en Nagy et al., supra, and Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001). FRET es usado preferiblemente en conjunción con técnicas de marcación inmunohistoquimica estándar. Kenworthy, Methods, 24:289-96 (2001). Por ejemplo, anticuerpos conjugados a tintes fluorescentes apropiados pueden ser usados como sondas para marcar dos proteínas diferentes. Si las proteínas están en proximidad entre si, los tintes fluorescentes actúan como donadores y aceptores para FRET. La transferencia de energía es detectada mediante medos estándar. La transferencia de energía puede ser detectada mediante medios citométricos de flujo o mediante sistemas de microscopía digital, tales como microscopía confocal o microscopía de fluorescencia de campo amplio acoplado a una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) . En una modalidad de la presente invención, anticuerpos de HER2 y ya sea anticuerpos EGFR o HER3 son marcados directamente con dos fluoróforos diferentes, por ejemplo como se describe en Nagy et al., supra. Células de tumor o Usados de células de tumor se ponen en contacto con los anticuerpos marcados diferentemente, que actúan como donadores y aceptores para FRT en presencia de dimeros EGFR-HER2 o HER2-HER3. Alternativamente, anticuerpos sin marcar contra HER2 y ya sea EGFR o HER3 son usados junto con anticuerpos secundarios marcados diferentemente que sirven como donadores y aceptores. Véase, por ejemplo, Brockhoff et al., supra. La transferencia de energía es detectada y la presencia de dimeros es determinada si se encuentra que las etiquetas están en proximidad estrecha. En otras modalidades, ligandos receptores de HER que son específicos para HER2 y ya sea HERÍ o HER3 son marcados fluorescentemente y usados para estudios de FRET. En todavía otras modalidades de la presente invención, la presencia de dimeros sobre la superficie de células de tumor es demostrada mediante la co-localización de HER2 ya sea con EGFR o HER3 utilizando técnicas de inmunofluorescencia directa o indirecta estándares y microscopía de barrido de láser confocal. Alternativamente, se usa formación de imagen de barrido de láser (LSI) para detectar el enlace de anticuerpo y co-localización de HER2 ya sea con EGFR o HER3 en formato de alto rendimiento, también como una placa de microcavidades, como se describe en Zuck et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96: 11122-27 (1999). En modalidades adicionales, la presencia de dimeros de EGFR-HER2 y/o HER2-HER3 es determinada al identificar la actividad enzimática que es dependiente de la proximidad de los componentes de componente de dimero. Un anticuerpo de HER2 es conjugado con una enzima y un anticuerpo EGFR o HER3 es conjugado con una segunda enzima. Un primer sustrato para la primera enzima es agregado y la reacción produce un segundo sustrato para la segunda enzima. Esto conduce a una reacción con otra molécula para producir un compuesto detectable, tal como un tinte. La presencia de otro enlace químico rompe el segundo sustrato, de tal manera que la reacción con la segunda enzima es impedida a no ser que las primeras y segundas enzima y asi los dos anticuerpos estén en proximidad estrecha. En una modalidad particular, células de tumor o Usados de célula son puestos en contacto con un anticuerpo de HER2 que es conjugado con glucosa oxidasa y un anticuerpo HER3 o HERÍ que es conjugado con peroxidasa de rábano. Glucosa es agregada a la reacción, junto con un precursor de tinte, tal como DAB y catalasa. La presencia de dimeros es determinada por el desarrollo de color después del teñido para DAB. Los dimeros pueden también ser detectados utilizando métodos a base del sistema de análisis eTag™ (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA) , como se describe por ejemplo, en la solicitud de patente estadounidense 2001/0049105, publicada el 6 de diciembre de 2001, ambas de las cuales son incorporadas expresamente por referencia en la su totalidad. Una eTag™, o "etiqueta electroforética" comprende una porción reportero detectable, tal como un grupo fluorescente. Puede también comprender un "modificador de movilidad" que consiste esencialmente de una porción que tiene una movilidad electroforética única. Estas porciones permiten la separación y detección de la eTag™ de una mezcla compleja bajo condiciones electroforéticas definidas, tales como electroforesis capilar (CE) . La porción de la eTag™ que contiene la porción reportero y opcionalmente el modificador de movilidad es enlazado a una primera porción de enlace objetivo mediante un grupo enlazante escindible para producir un primer compuesto de enlace. La primera porción de enlace objetivo reconoce específicamente un primer objetivo particular, tal como un ácido nucleico o proteina. La primera porción de enlace objetivo no está limitada de ninguna manera y puede ser por ejemplo un polinucleótido o un polipéptido. Preferiblemente, la primera porción de enlace objetivo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Alternativamente, la primera porción de enlace objetivo puede ser un ligando receptor de HER o fragmento competente de enlace del mismo. El grupo enlazante comprende preferiblemente una porción escindible, tal como un sustrato de enzima o cualquier enlace químico que puede ser escindido bajo condiciones definidas. Cuando la primera porción de enlace objetivo se enlaza a su objetivo, el agente de escisión es introducido y/o activo y el grupo enlazante es escindido, liberando asi la porción de la eTag™ que contiene la porción reportero y el modificador de movilidad. Asi, la presencia de una eTag™ "libre" indica el enlace de la porción de enlace objetivo a su objetivo. Preferiblemente, un segundo compuesto de enlace comprende el agente de escisión y una segunda porción de enlace objetivo que reconoce específicamente un segundo objetivo. La segunda porción de enlace objetivo tampoco está limitada de ninguna manera y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o un ligando receptor de HER o fragmento de ligando competente de enlace. El agente de escisión es de tal manera que solamente escindirá el grupo enlazante en el primer compuesto de enlace si el primer compuesto de enlace y el segundo compuesto de enlace están en proximidad estrecha.

En una modalidad de la presente invención, un primer compuesto de enlace comprende una eTag™ en la cual un anticuerpo a HER2 sirve como la primera porción de enlace objetivo. Un segundo compuesto de enlace comprende un anticuerpo a EGFR o HER3 unido a un agente de escisión capaz de escindir el grupo enlazante de la eTag™. Preferiblemente, el agente de escisión puede ser activado con el fin de ser apto de escindir el grupo enlazante. Células de tumor o Usados de células de tumor son puestos en contacto con la eTag™, que se enlaza a HER2 y con el anticuerpo EGF o HER3 modificado, que se enlaza a EGFR o HER3 sobre la superficie de la célula. El compuesto de enlace sin enlazar es preferiblemente separado y el agente de escisión es activado, si es necesario. Si están presentes dimeros EGFR-HER2 o HER2-HER3, el agente de escisión escindirá el grupo enlazante y liberará la eTag™ debido a la proximidad del agente de escisión al grupo enlazante. Luego la eTag™ libre puede ser detectada mediante cualquier método conocido en el arte, tal como electroforesis capilar. En una modalidad, el agente de escisión es una especie química activable que actúa sobre el grupo enlazante. Por ejemplo, el agente de escisión puede ser activado al exponer la muestra a la luz. En otra modalidad, la eTag™ es construida utilizando un anticuerpo a EGFR o HER3 como la primera porción de enlace objetivo y el segundo compuesto de enlace es construido a partir de un anticuerpo a HER2. En todavía otra modalidad, el dimero de HER es detectado utilizando un anticuerpo u otro reactivo que se enlaza especifica o preferiblemente al dimero en comparación al enlace del mismo ya sea alrededor de HER en el dimero. (ii) Fosforilación de HER2 La inmunoprecipitación con anticuerpo EGFR, HER2, o HER3 como se discute en la sección previa puede opcionalmente ser seguida por un análisis funcional en cuanto a dimeros, como una alternativa o complemento a la inmunoabsorción. En una modalidad, la inmunoprecipitación con anticuerpo HER3 es seguida por un análisis en cuanto a actividad del receptor tirosina cinasa en el inmunoprecipitante. Debido a que el HER3 no tiene actividad de tirosina cinasa intrínseca, la presencia de actividad de tirosina cinasa en el inmunoprecipitante indica que el HER3 está más probablemente asociado con HER2. Graus-Porta et al.,EMBO J., 16:1647-55 (1997); Klapper et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96:4995-5000 (1999). Este resultado puede ser confirmado mediante inmunoabsorción con anticuerpos HER2. En otra modalidad, la inmunoprecipitación con anticuerpo HER2 es seguida por un análisis en cuanto a actividad tirosina cinasa del receptor EGFR. En este análisis, el inmunoprecipitante es puesto en contacto con ATP radioactivo y un sustrato de péptido que imita el sitio de transfosforilación in vivo de HER2 por EGFR. La fosforilación del péptido indica co-inmunoprecipitación y asi dimerización de EGFR con HER2. Análisis de actividad de tirosina cinasa del receptor son bien conocidos en el arte e incluyen análisis que detectan fosforilación de sustratos objetivo, por ejemplo mediante anticuerpo de fosfotirosina y activación de rutas de transducción de señal cognatas, tales como la ruta MAPK. La fosforilación del receptor HER puede ser determinada mediante inmunoprecipitación de uno o más receptores de HER, tales como receptor HER2 (HER2) y análisis de Western blot. Por ejemplo, la positividad es determinada por la presencia de una banda de fosfo-HER2 sobre el gel, utilizando un anticuerpo de anti-fosfotirosina para detectar residuo (s) de tirosina fosforilados en el (los) receptor (es) de HER inmunoprecipitados . Anticuerpos anti-fosfotirosina están d disponibles comercialmente de Pan Vera (Madison, WI), una subsidiaria de Invitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula, CA) , o Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) . La negatividad es determinada por la ausencia de la banda. En otra modalidad, la fosforilación del receptor HER2 (HER2) es determinada mediante inmunohistoquimica utilizando un anticuerpo HER2 fosfo-especifico (clon PN2A; Thor et al., J. Clin. Oncol, 18 ( 18 ) : 3230-3239 (2000)) . Otros métodos para detectar fosforilación de receptor (es) HER incluyen, pero no están limitados a, KIRA ELISA (Patentes estadounidenses Nos. ,766,863; 5,891,650; 5,914,237; 6,025,145; y 6,287,784), espectrometría de masas (que compara el tamaño de HER2 fosforilado y no fosforilado) y análisis de proximidad de e-etiqueta tanto con anticuerpo de HER (por ejemplo HER2 ) y anticuerpo especifico fosfo-especifico o fosfo-tirosina especifico (por ejemplo, utilizando el equipo de análisis eTag™ disponible de Aclara BioSciences (Mountain View, CA) . Detalles del análisis de eTag son descritos anteriormente en la presente . Se pueden también usar anticuerpos fosfo-especificos en disposición celular para detectar estatus de fosforilación en una muestra celular de proteina de transducción de señal (US 2003/0190689) . (iii) Ligandos HER2 Niveles de un ligando de HER, tal como TGF-a en o asociado con el tumor pueden ser determinados de acuerdo con procedimientos conocidos. Tales análisis pueden detectar proteina y/o ácido nucleico que la califica en la muestra a ser probada. En una modalidad, los niveles de ligando de HER en el tumor pueden ser determinados utilizando inmunohistoquimica (IHC); véase, por ejemplo, Scher et al. Clin. Cáncer Research 1:545-550 (1995). Alternativa o adicionalmente, se pueden evaluar niveles de ácido nucleico que codifica el ligando de HER en la muestra a ser probada; por ejemplo, via FISH, southern blotting, o técnicas PCR. (iv) Cáncer que no sobreexpresa HER2 En tanto que el cáncer puede ser caracterizado por la sobreexpresión del receptor de HER2, la presente solicitud proporciona además un método para el tratamiento de cáncer que no es considerado ser sobreexpresante de HER2. Para determinar la expresión de HER2 en el cáncer, varios análisis de diagnóstico/prognóstico están disponibles. En una modalidad, la sobreexpresión de HER2 puede ser analizada mediante IHC, por ejemplo utilizando el HERCEPTEST® (Dako) . Secciones de tejido embebidas de parafina de una biopsia de tumor pueden ser sometidas a análisis de IHC y de acuerdo con los criterios de intensidad de teñido de proteina de HER2 como sigue : Puntuación 0 no observa ningún teñido o el teñido de membrana es observado en menos de 10% de células de tumor. Puntuación 1+ un teñido de membrana tenue/escasamente perceptible es detectado en más de 10% de las células de tumor. Las células son solamente teñidas en parte de su membrana. Puntuación 2+ un teñido de membrana débil a completo moderado es observado en más de 10% de las células de tumor.

Puntuación 3+ se observa un teñido de membrana moderado a fuerte completo en más de 10% de las células de tumor . Aquellos tumores con puntuaciones de 0 a 1+ para la determinación de sobreexposición de HER2 pueden ser caracterizados que no sobreexpresan HER2, mientras que aquellos tumores con puntuaciones de 2+ o 3+ pueden ser caracterizados que sobreexpresan HER2. Los tumores que sobreexpresan HER2 pueden ser clasificados mediante puntuaciones inmunohistoquimicas correspondientes al número de copias de moléculas de HER2 expresadas por célula y pueden ser determinados bioquímicamente : 0 = 0-100,000 copias/célula, 1+ = por lo menos aproximadamente 200,000 copias/célula 2+ = por lo menos aproximadamente 500,000 copias/célula 3+ = por lo menos aproximadamente 2,000,000 de copias/célula La sobreexpresión de HER2 al nivel 3+, que conduce a la activación independientemente de ligando de la tirosina cinasa (Hudziak et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84:7159- 7163 (1987)), ocurre en aproximadamente 30% de cánceres de pecho y en estos pacientes, la sobreviviencia libre de recurrencia y la sobrevivencia global son disminuidas. (Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987) ) . Alternativa o adicionalmente, análisis de FISH tales como el INFORM™ (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION™ (Vysis, Illinois) pueden ser efectuados sobre tejido de tumor embebido en parafina, fijo en formalina para determinar la extensión (si la hay) de sobreexpresión de HER en el tumor. En una modalidad, el cáncer será uno que expresa (y puede sobreexpresar) EGFR, tal expresión puede ser evaluada como para los métodos para evaluar expresas de HER2 como se indica anteriormente. La sobreexpresión o amplificación de receptor HER o ligando de HER pueden también ser evaluados utilizando un análisis de diagnóstico in vivo, por ejemplo administrar una molécula (tal como un anticuerpo) que enlaza la molécula a ser detectada y es marcada con una etiqueta detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo) y barrido externamente del paciente para la localización de la etiqueta.

V. Tratamiento con los anticuerpos HER2 Se contempla que, de acuerdo con la presente invención, los anticuerpos de HER2 pueden ser usados para tratar cáncer resistente a quimioterapia o cáncer resistente a platino, tal como cáncer resistente a platino. El cáncer comprenderá en general células que expresan HER2 , de tal manera que el anticuerpo de HER2 en la presente es apto de enlazarse a la célula de cáncer. El paciente es tratado con una combinación del anticuerpo de HER2, preferiblemente pertuzumab y un agente quimioterapéutico anti-metabolito, preferiblemente gemcitabina.

La administración combinada incluye co-administración o administración concurrente, utilizando formulaciones separadas 0 una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en tanto que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Asi, el agente quimioterapéutico antimetabolito puede ser administrado antes o enseguida de la administración del anticuerpo de HER2. En esta modalidad, la sincronización entre por lo menos una administración del agente quimioterapéutico anti-metabolito y por lo menos una administración del anticuerpo de HER2 es preferiblemente de manera aproximadamente 1 mes o menor y más preferiblemente alrededor de 2 semanas o menor. Alternativamente, el agente quimioterapéutico anti-metabolito y el anticuerpo HER2 son administrados concurrentemente al paciente, en una sola formulación o formulaciones separadas. El tratamiento con la combinación dará como resultado una mejora en los signos o síntomas del cáncer. Por ejemplo, tal terapia puede dar como resultado una mejora en la sobrevivencia (sobrevivencia global y/o sobrevivencia libre de avance) en relación con un paciente tratado con el agente quimioterapéutico anti-metabolito solamente y/o puede dar como resultado una respuesta clínica objetiva (parcial o completa) . Además, el tratamiento con la combinación del agente quimioterapéutico anti-metabolito (por ejemplo gemcitabina) y el anticuerpo de HER2 (por ejemplo, pertuzumab) pueden dar como resultado un beneficio terapéutico sinergistico o mayor que el aditivo, al paciente. Preferiblemente, el anticuerpo HER2 administrado es un anticuerpo desnudo. Sin embargo, el anticuerpo de HER2 administrado puede ser conjugado con un agente citotóxico. Preferiblemente, el inmunoconjugado y/o proteina de HER2 al cual es enlazado es/son internalizados por la célula, dando como resultado una eficacia terapéutica incrementada del inmunoconjugado en el exterminio de la célula de cáncer a la cual se enlaza. En una modalidad preferida, el agente citotóxico se apunta o interfiere con el ácido nucleico en la célula de cáncer. Ejemplos de tales agentes citotóxicos incluyen maytansinoides, calicheamicinas, ribonucleasas y en nucleasas de ADN. El anticuerpo de HER2 (o inmunoconjugado de anticuerpo de HER2 ) y agente quimioterapéutico anti-metabolito son administrados a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo como un bolo o mediante infusión continua en un periodo de tiempo, mediante ruta intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación. El anticuerpo de HER2 y agente quimioterapéutico anti-metabolito pueden ser, pero no necesitan ser, administrados por la misma ruta de administración. La administración intravenosa tanto del anticuerpo como el agente quimioterapéutico anti-metabolito es preferida. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo de HER2 dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se define anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo HER2 es administrado por propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo HER2 y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo HER2 es administrado apropiadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 50 mg/kg {por ejemplo 0.1-20 mg/kg) de anticuerpo HER2 es una dosificación candidata inicial para administración al paciente, ya sea por ejemplo mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. En una modalidad, el tiempo de infusión inicial para el anticuerpo de HER2 puede ser más largo que los tiempos de infusión subsecuentes, por ejemplo aproximadamente 90 minutos para la infusión inicial y aproximadamente 30 minutos para infusiones subsecuentes (si la infusión inicial es bien tolerada) . La dosificación preferida del anticuerpo de HER2 estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Asi, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de los mismos) puede ser administrada al paciente. Tales dosis pueden ser administradas intermitentemente, por ejemplo una vez a la semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente recibe de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, por ejemplo aproximadamente 6 dosis del anticuerpo HER2) . Una dosis de carga más alta inicial, seguida por una o más dosis más bajas pueden ser administradas. En una modalidad, el anticuerpo HER2 es administrado como una dosificación de carga de aproximadamente 840 mg seguida por aproximadamente 420 mg a aproximadamente cada tres semanas. En otra modalidad, el anticuerpo de HER2 es administrado a una dosis de aproximadamente 1050 mg administrados aproximadamente cada 3 semanas . El agente quimioterapéutico anti-metabolitos es administrado usualmente a dosis conocidas del mismo u opcionalmente disminuidas debido a la acción combinada de los fármacos o efectos secundarios negativos atribuibles a la administración del agente quimioterapéutico anti-metabolitos. Programas de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden ser usados de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el práctico experimentado. Programas de preparación de dosificación para tal quimioterapia son también descritos en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). En donde el agente quimioterapéutico antimetabolitos es gemcitabina, preferiblemente es administrada a una dosis entre aproximadamente 600 mg/m2 a 1250 mg/m2 (por ejemplo aproximadamente 1000 mg/m2) , por ejemplo en los dias 1 y 8 de un ciclo de 3 semanas. Además del anticuerpo de HER2 y agente quimioterapéuticos antimetabolitos, otros regímenes terapéuticos pueden ser combinados con los mismos. Por ejemplo, un segundo (tercero, cuarto, etc.) agente (s) quimioterapéutico (s) puede (n) ser administrado (s) , en donde el segundo agente quimioterapéutico es ya sea otro agente quimioterapéutico antimetabolitos diferente o un agente quimioterapéutico que no es antimetabolitos. Por ejemplo, el segundo agente quimioterapéutico puede ser un taxano (tal como paclitaxel o docetaxel) , capecitabina o agente quimioterapéutico a base de platino (tal como carboplatina, cisplatina u oxaliplatina), antraciclina (tales como doxorubicina, en las que se incluyen doxorubicina liposomal) , topotecana, pemetrexed, vinca alcaloide (tal como vinorelbina) , y TLK 286. "Cócteles" de diferentes agentes quimioterapéuticos pueden ser administrados. Otros agentes quimioterapéuticos que pueden ser combinados con el anticuerpo HER2 y agentes quimioterapéutico antimetabolitos incluyen uno o más de: un segundo anticuerpo HER2 diferente (por ejemplo, un anticuerpo HER2 inhibidor de crecimiento tal como trastuzumab o un anticuerpo HER2 que induce apóptosis de una célula que sobreexpresa HER2, tal como 7C2, 7F3 o variantes humanizadas de los mismos; un segundo anticuerpo dirigido contra otro antigeno asociado al tumor, tales como EGFR, HER3, HER4; compuesto anti-hormonal, por ejemplo, compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen o un inhibidor de aromatasa; un cardioprotector (para prevenir o reducir cualquier disfunción miocardiaca asociada con la terapia) ; una citocina; un fármaco apuntado a EGFR (tal como TARCE VA®, IRESS A® o Cetuximab) ; un agente anti-angiogénico (especialmente Bevacizumab vendido por Genentech bajo la marca comercial AV ASTIN™) ; un inhibidor de tirosina cinasa; un inhibidor de COX (por ejemplo, un inhibidor de COX-I o COX-2) ; fármaco antiinflamatorio no esferoidal, Celecoxib (CELEBREX®) ; inhibidor de farnesil transferasa (por ejemplo, Tipifarnib/ZARNESTRA® R115777 disponible de Johnson and Johnson o Lonafarnib SCH66336 disponible de Schering-Plough) ; anticuerpo que enlaza proteina oncofetal CA 125 tal como Oregovomab (MoAb B43.13); vacuna HER2 (tal como vacuna HER2 AutoVac de Pharmexia o vacuna de proteina APC8024 de Dendreon, o vacuna de péptido de GSK/Corixa) ; otra terapia de apuntamiento de HER {por ejemplo, trastuzumab, cetuximab, gefitinib, erlotinib, CI1033, GW2016 etc); Raf y/o inhibidor de Ras (Véase, por ejemplo WO 2003/86467); Doxil; Topetecan; taxano; GW572016; TLK286; EMD-7200; un medicamento que trata náusea tal como antagonista de serotonina, esferoide o benzodiazepina; un medicamento que previene o trata erupciones en la piel o terapias de acné estándar, en las que se incluyen antibiótico tópico u oral; un medicamento que reduce la temperatura del cuerpo tal como acetaminofen, difenilhidramina o meperidina; factor de crecimiento hematopoyético, etc. Dosificaciones apropiadas para cualquiera de los agentes co-administrados anteriores son aquellas usadas actualmente y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente y anticuerpo HER2. Además de las regiones terapéuticas anteriores, el paciente puede ser sometido a remoción quirúrgica de células de cáncer y/o terapia de radiación. Además de la administración de la proteina de anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla administración del anticuerpo mediante terapia genética. Tal administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo es acompañada por la expresión "administrar un anticuerpo". Véase, por ejemplo WO96/07321 publicado en 14 de marzo de 1996, concerniente con el uso de terapia de gen para generar anticuerpos intracelulares . Hay dos procedimientos principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) a las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo, el ácido nucleico es inyectado directamente al paciente, usualmente en el sitio en donde el anticuerpo es requerido. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente son separadas, el ácido nucleico es introducidos a estas células aisladas y las células modificadas son administradas al paciente ya sea directamente o por ejemplo encapsuladas dentro de membranas porosas que son implantadas al paciente (véanse por ejemplo patentes estadounidenses Nos. 4,892,538 y 5;283,187). Hay una variedad de técnicos disponibles para introducir ácidos nucleicos a células viables. Las técnicas varían dependiendo si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped propuesto. Técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico a células mamiferas in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE dextrana, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector usado comúnmente para la administración ex vivo del gen es un retrovirus.

Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de Herpes simplex I o adeno-virus asociados) y sistemas a base de lipidos (lipidos útiles para la transferencia moderadas por lipido del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que apunta a las células objetivo, tal como un anticuerpo especifico para una proteina de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor sobre la célula objetivo, etc. En donde se usan liposomas, las proteínas las cuales se enlazan a una proteina de membrana de superficie celular asociada con endocitosis puede ser usada para apuntamiento y/o para facilitar la absorción, por ejemplo proteínas de capsido o fragmentos de los mismos trópicos para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en la ciclización y proteínas que apuntan a la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitosis moderada por receptor es descrita por ejemplo por Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990). Para una revisión de la marcación genética actualmente conocida y protocolos de terapia genética, véase Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Véase también WO 93/25673 y las referencias citadas en el mismo.

VI . Depósito de Materiales Las siguientes lineas celulares de hibridoma han sido depositadas con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) : Designación de Anticuerpo No. ATCC Fecha de depósito 7C2 ATCC HB-12215 17 octubre 1996 7F3 ATCC HB-12216 17 octubre 1996 4D5 ATCC CRL-10463 24 mayo 1990 2C4 ATCC HB-12697 8 abril 1999 Detalles adiciones de la invención son ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes. Las revelaciones de todas las citas en la especificación son incorporadas expresamente en la presente por referencia.

Ejemplo 1 Producción y Caracterización de Anticuerpo Monoclonal 2C4 Los anticuerpos monoclonales murinos 2C4, 7F3 y 4D5 que enlazan específicamente el dominio extracelular de HER2 fueron producidos como se describe en Fendly et al., Cáncer Research 50:1550-1558 (1990). Brevemente, células NIH 3T3/HER2-34oo (que expresan aproximadamente 1 x 105 moléculas de HER2/célula) producidas como se describe en Hudziak et al. Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 84:7159-7163 (1987) fueron cosechadas con solución salina reguladora del pH de fosfato (PBS) que contiene EDTA 25 mM y usadas para inmunizar ratones BALB/c. Se proporcionó a los ratones inyecciones i.p. de 107 células en 0.5 ml de PBS en las semanas 0, 2, 5 y 7. Se proporcionó a los ratones con antisuero que inmunoprecipitó HER2 32P-marcado inyecciones i.p. de un extracto de membrana de HER2 purificada por aglutinina-Sefarosa (WGA) de germen de trigo en las semanas 9 y 13. Esto fue seguido por una inyección i.v. de 0.1 ml de la preparación de HER2 y los esplenocitos fueron fusionados con linea de mieloma de ratón X63-Ag8.653. Los sobrenadantes de hibridoma fueron seleccionados para enlace de HER2 mediante ELISA y radioinmunoprecipitación. Los epitopos de HER2 enlazados mediante anticuerpos monoclonales 4D5, 7F3 y 2C4 fueron determinados mediante análisis de enlace competitivo (Fendly et al. Cáncer Research 50:1550-1558 (1990)). Estudios de bloqueo cruzado se efectuaron sobre anticuerpos mediante fluorescencia directa sobre células intactas utilizando la máquina de selección PANDEX™ para cuantificar la fluorescencia. Cada anticuerpo monoclonal fue conjugado con isotiocianato de fluoresceina (FITC), utilizando procedimientos establecidos. (Wofsy et al. Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel and Schiigi (eds.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)). Monocapas confluentes de células NIH 3T3/HER2-340o fueron tripsinizadas, lavadas una vez y resuspendidas a 1.75 x 106 células/ml en PBS frió que contiene 0.5% de albúmina de suero bovino (BSA) y 0.1% de NaN3, Una concentración final de 1% de partículas de látex (IDC, Portland, OR) fue agregada para reducir la obturación de las membranas de placa PANDEX™. Las células en suspensión, 20 µl y 20 µl de anticuerpos monoclonales purificados (100 µg/ml a 0.1 µg/ml) fueron agregados a las cavidades de placa PANDEX™ e incubadas en hielo durante 30 minutos. Una dilución predeterminada de anticuerpos monoclonales FITC-marcados en 20 µl fueron agregados a cada cavidad, incubadas durante 30 minutos, lavada y la fluorescencia fue cuantificada mediante el sistema PANDEX™. Se consideró que los anticuerpos monoclonales comparten un epitopo si cada uno bloquea en enlace del otro por 50% o mayor en comparación con un control de anticuerpo monoclonal irrelevante. En este experimento, los anticuerpos monoclonales 4D5, 7F3 y 2C4 son asignados los epitopos I, G/F y F, respectivamente. Las características inhibidoras de crecimiento de los anticuerpos monoclonales 2C4, 7F3 y 4D5 fueron evaluadas utilizando la linea de célula de tumor de pecho, SK-BR-3 (véase, Hudziak et al. Molec. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989)). Brevemente, células SK-BR-3 fueron separadas al utilizar 0.25% (volumen/volumen) de tripsina y suspendida en medio completo a una densidad de 4 x 105 células/ml. Alícuotas de 100 µl (4 x 104 células) fueron depositadas en placas de microdilución de 96 cavidades, se permite que las células se adhieran y 100 µl de medio solo o medio que contiene anticuerpo monoclonal (concentración final 5 µg/ml) fueron luego agregados. Después de 72 horas, las placas fueron lavadas dos veces con PBS (pH 7.5), teñidas con violeta cristal (0.5% en metanol) y analizadas en cuanto a proliferación celular relativa como se describe en Sugarman et al. Science 230:943-945 (1985). Los anticuerpos monoclonales 2C4 y 7F3 inhibieron la proliferación celular relativa SK-BR-3 por aproximadamente 20% y aproximadamente 38%, respectivamente, en comparación con aproximadamente 56% de inhibición obtenida con el anticuerpo monoclonal 4D5. Los anticuerpos monoclonales 2C4, 4D5 y 7F3 fueron evaluados en cuanto a su capacidad para inhibir la fosforilación de tirosina estimulada por HRG de proteínas en el intervalo de Mr 180,000 a partir de Usados de célula entera de células MCF7 Lewis et al. Cáncer Research 56:1457-1465 (1996)). Se reporta que las células MCF7 expresan todos los receptores de HER conocidos, pero a niveles relativamente bajos. Puesto que HER2, HER3, y HER4 tienen tamaños moleculares casi idénticos, no es posible discernir cual proteina se está volviendo fosforilada por tirosina cuando Usados de célula entera son evaluados mediante análisis de Western blot. Sin embargo, estas células son ideales para análisis de fosforilación de HRG tirosina debido a que bajo las condiciones de análisis usadas, en ausencia de HRG agregado exógenamente, exhiben niveles bajos a detectables de proteínas de fosforilación de tirosina en el intervalo de Mr 180,000. Células de MCF7 fueron depositadas en placas de 24 cavidades y anticuerpos monoclonales a HER2 fueron agregados a cada cavidad e incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente; luego se agrega rHRGßl?77-244 a cada cavidad a una concentración final de 0.2 nM y la incubación fue proseguida por 8 minutos. Los medios fueron aspirados cuidadosamente de cada cavidad y las reacciones fueron detenidas mediante la adición de 100 µl de solución reguladora del pH de muestra SDS (5% SDS, 25 mM DTT, y 25 mM Tris-HCl, pH 6.8). Cada muestra (25 µl) fue sometida a electroforesis sobre un gel de gradiente 4-12% (Novex) y luego transferida electroforéticamente a membrana de difluoruro de polivinilideno. Se desarrollaron inmunoabsorciones de anti-fosfotirosina (4G10, de UBI, usada a 1 µg/ml) y la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr 180,000 fue cuantificada mediante densitometria de reflectancia, como se describe previamente (Holmes et al.

Science 256: 1205-1210 (1992); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269:14661-14665 (1994)). Los anticuerpos monoclonales 2C4, 7F3 y 4D5 inhibieron significativamente la generación de una señal de fosforilación de tirosina inducida por HRG a Mr 180,000. En ausencia de HRG, ninguno de estos anticuerpos fue apto de estimular la fosforilación de tirosina de proteínas en el intervalo de Mr 180,000. También, estos anticuerpos no reaccionan de manera cruzada con EGFR Fendly et al. Cáncer Research 50:1550-1558 (1990)), HER3, o HER4. Los anticuerpos 2C4 y 7F3 inhibieron significativamente la estimulación de HRG de fosforilación de tirosina pl80 a <25% del control. El anticuerpo monoclonal 4D5 fue apto de bloquearla estimulación de HRG de fosforilación de tirosina por ~50%. La figura 2A muestra las curvas de dosis-respuesta para la inhibición de 2C4 o 7F3 de estimulación de HRG de fosforilación de tirosina pl80 tal como se determina por densitometria de reflectancia. La evaluación de estas curvas de inhibición utilizando un ajuste de 4 parámetros produjo una IC50 de 2.8 ± 0.7 nM y 29.0 ± 4.1 nM para 2C4 y 7F3, respectivamente. La inhibición del enlace de HRG a lineas de células de tumor de pecho de MCF7 mediante anticuerpos HER2 se llevó a cabo con cultivos de monocapa sobre hielo en un formato de placa de 24 cavidades Lewis et al. Cáncer Research 56:1457-1465 (1996)). Anticuerpos monoclonales HER2 fueron agregados a cada cavidad e incubados durante 30 minutos. Se agrega rHRGßli77-224 125I-marcado (25 pm) y la incubación fue proseguida por 4 a 16 horas. La figura 2B proporciona curvas de dosis-respuesta para la inhibición de 2C4 o 7F3 del enlace de HRG a células de MCF7. Concentraciones variables de 2C4 o 7F3 fueron incubadas con células de MCF7 en presencia de rHRGßl 125I-marcado y las curvas de inhibición son mostradas en la figura 2B. El análisis de estos datos produjo una IC50 de 2.4 ± 0.3 nM y 19.0 ± 7.3 nM para 2C4 y 7F3, respectivamente. Una inhibición máxima de ~74% para 2C4 y 7F3 estuvieron en acuerdo con los datos de fosforilación de tirosina. Para determinar si el efecto de los anticuerpos de HER2 observados sobre células de MCF7 era un fenómeno general, lineas de células de tumor humanas fueron incubadas con 2C4 o 7F3 y el grado de enlace especifico de rHRGßl 125I-marcado fue determinado (Lewis et al. Cáncer Research 56:1457-1465 (1996)). Los resultados de este estudio son mostrados en la figura 3. El enlace de rHRGßl 121I-marcado podría ser inhibido significativamente ya sea por 2C4 o 7F3 en todas las lineas celulares, con la excepción de la linea celular de cáncer de pecho MDA-MB-468, que se ha reportado que expresa poco o nada de HER2. Se reporta que las lineas celulares restantes expresan HER2, el nivel de expresión de HER2 varia ampliamente entre estas lineas celulares. En efecto, el intervalo de expresión de HER2 en las lineas celulares probadas varia por más de dos órdenes de magnitud. Por ejemplo, BT-20, MCF7 y Caov3 expresa -104 HER2 receptores/célula, mientras que BT-474 y SK-BR-3 expresa ~10 HER2 receptores/célula. Dado el amplio intervalo de expresión de HER2 en esta células y los datos anteriores, se concluyó que la interacción entre HER2 y HER3 o HER4, fue en si mismo una interacción de alta afinidad que toma lugar sobre la superficie de la membrana de plasma.

Los efectos inhibidores de crecimiento de los anticuerpos monoclonales 2C4 y 4D5 sobre células MDA-MB-175 y SK-BR-3 en presencia o ausencia de rHRGßl exógeno fueron determinados (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Niveles de HER2 en células MDA-MB-175 son 4-6 veces más altos que el nivel encontrado en células epiteliales de pecho normales y el receptor de HER2-HER4 es constitutivamente tirosina fosforilado en células MDA-MB-175. Células MDA-MB-175 fueron tratadas con anticuerpos monoclonales HER2 2C4 y 4D5 (10 µg/ml) durante 4 dias. En un análisis de teñido con violeta cristal, la incubación con 2C4 mostró un fuerte efecto inhibidor de crecimiento sobre esta linea celular (figura 4A) . El HRG exógeno no invierte significativamente esta inhibición. Por otra parte, 2C4 no reveló ningún efecto inhibitorio sobre la linea celular que sobreexpresa HER2 SK-BR-3 (Figura 4B) . El anticuerpo monoclonal 2C4 fue apto de inhibir la proliferación celular de células MDA-MB-175 a una extensión mayor que el anticuerpo monoclonal 4D5, tanto en presencia como en ausencia de HRG exógeno. La inhibición de la proliferación celular por 4D5 es dependiente del nivel de expresión de HER2 (Lewis et al. Cáncer Immunol . Immunother. 37:255-263 (1993)). Una inhibición máxima de 66% en células SK-BR-3 podría ser detectado (figura 4B) . Sin embargo, este efecto podria ser separado por HRG exógeno.

EJEMPLO 2 Asociación dependiente de HRG de HER2 con HER3 es bloqueada mediante anticuerpo monoclonal 2C4 La capacidad de HER3 para asociarse con HER2 fue probada en un experimento de co-inmunoprecipitación. 1.0 x 106 células MCF7 o SK-BR-3 fueron sembradas en placas de cultivo de tejido de 6 cavidades en un medio de DMEM/Ham F12 50:50 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y HEPES 10 mM, pH 7.2 (medios de cultivo) y se le permite anexarse durante toda la noche. Las células fueron dejadas sin alimentar durante 2 horas en medio de cultivo sin suero antes de comenzar el experimento. Las células fueron lavadas brevemente con solución salina de pH regulado de fosfato (PBS) y luego incubadas ya sea con 100 mM del anticuerpo indicado diluido en 0.2% peso/volumen de albúmina de suero bovino (BSA), medio de RPMI, con HEPES 10 mM, pH 7.2 (solución reguladora del pH de enlace) o con solución reguladora del pH de enlace solo (control) . Después de una hora a temperatura ambiente, se agrega HRG a una concentración final de 5 nM a la mitad de las cavidades (+) . Un volumen similar de solución reguladora del pH de enlace fue agregado a las otras cavidades (-) . La incubación fue proseguida por aproximadamente 10 minutos. Los sobrenadantes fueron separados mediante aspiración y las células fueron sometidas a lisis en RPMI, pH 7.2, 1.0% volumen/volumen de de TRITÓN X-100™, 1.0% peso/volumen de CHAPS (solución reguladora de pH de lisis), que contiene PMSF 0.2 mM, 10 µg/ml de leupeptina, y 10 TU/ml de aprotinina. Los Usados fueron despejados de material insoluble mediante centrifugación. HER2 fue inmunoprecipitado utilizando un anticuerpo monoclonal acoplado covalentemente a un gel de afinidad (Affi-Prep 10, Bio-Rad) . Este anticuerpo (Ab-3, Oncogene Sciences) reconoce un epitopo de dominio citoplásmico. La inmunoprecipitación fue efectuada al agregar 10 µl de pasta aguada de gel que contiene aproximadamente 8.5 µg de anticuerpo inmovilizado a cada lisado y se permite que las muestras se mezclen a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego los geles fueron recolectados mediante centrifugación. Los geles fueron lavados por lotes tres veces son solución reguladora del pH de lisis para separar el material sin enlazar. Luego la solución reguladora del pH de muestra SDS fue agregada y las muestras fueron calentadas brevemente en un baño de agua hirviente. Los sobrenadantes se hicieron correr sobre geles de poliacrilamida 4-12% y electroabsorbido sobre membranas de nitrocelulosa. La presencia de HER3 fue determinada al probar los productos absorbidos con un anticuerpo policlonal contra un epitopo de dominio citoplásmico del mismo (c-17, Santa Cruz Biotech) . Los productos absorbidos fueron visualizados utilizando un sustrato quimioluminiscente (ECL, Amersham) .

Como se muestra en los carriles de control de las figuras 5A y 5B, para células MCF7 y SK-BR-3, respectivamente, HER3 estaba presente en un inmunoprecipitado de HER2 solamente cuando las células fueron estimuladas con HRG. Si las células fueron primero incubadas con anticuerpo monoclonal 2C4, la señal de HER3 fue abolida en células MCF7 (figura 5A, carril 2C4 +) o reducida sustancialmente en células SK-BR-3 (figura 5B, carril 2C4 + ) . Como se muestra en las figuras 5A-B, el anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea la asociación dependiente de heregulina de HER3 con HER2 tanto en células MCF7 como células SK-BR-3 sustancialmente más efectivamente que trastuzumab. La pre-incubación con trastuzumab disminuyó la señal de HER3 en los Usados de MCF7 pero tuvo poco o ningún efecto sobre la cantidad de HER3 co-precipitado de Usados de SK-BR-3. La pre-incubación con un anticuerpo contra el receptor EGF (Ab-1, Oncogene Sciences) no tuvo ningún efecto sobre la capacidad de HER3 para co-inmunoprecipitar con HER2 ya sea en una linea celular u otra. EJEMPLO 3 Anticuerpos 2C4 Humanizados Los dominios variables del anticuerpo monoclonal murino 2C4 fueron primero clonados a un vector que permite la producción de un fragmento de Fab quimérico de ratón/humano. ARN total fue aislado de las células de hibridoma utilizando un equipo de extracción de ARN Stratagene siguiendo los protocolos de fabricante. Los dominios variables fueron amplificados mediante RT-PCR, purificados en gel e insertados a un derivado de un plásmido a base de pUC119 que contiene un dominio constante kappa humano y dominio CH1 como se describe previamente (Cárter et al. PNAS (USA) 89:4285 (1992); y Patente estadounidense No. 5,821,337). El plásmido resultante fue transformado a cepa de E. coli 16C9 para expresión del fragmento Fab. El crecimiento de cultivos, inducción de expresión de proteina y purificación de fragmento de Fab fue como se describe previamente (Werther et al. J. Immunol . 157:4986-4995 (1996); Presta et al. Cáncer Research 57: 4593-4599 (1997) ) . El fragmento Fab quimérico purificado 2C4 fue comparado con el anticuerpo original murino 2C4 con respecto a su capacidad para inhibir el enlace de 125I a células MCF7 e inhibir la activación de rHRG de fosforilación de tirosina pl80 en células MCF7. Como se muestra en la figura 6A, el fragmento Fab quimérico 2C4 es muy efectivo para alterar la formación del sitio de enlace de HER2-HER3 de alta afinidad sobre la linea celular de cáncer de pecho humano, MCF7. El valor relativo IC50 calculado para murino intacto 2C4 es 4.0 ± 0.4 nM, mientras que el valor para el fragmento Fab es 7.7 ± 1.1 nM. Como se ilustra en la figura 6B, el fragmento Fab quimérico monovalente 2C4 es muy efectivo para alterar la activación de HER2-HER-3 dependiente de HRG. El valor de IC50 calculado para el anticuerpo monoclonal murino intacto 2C4 es 6.0 ± 2 nM, mientras que el valor para el fragmento Fab es 15.0 ± 2 nM. La secuenciación de ADN del clon quimérico permitió la identificación de los residuos de CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) (Figuras 7 A y B) . Utilizando mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótido, todas las seis de estas regiones de CDR fueron introducidas a una estructura humana compleja (subgrupo kappa VL I y subgrupo VH III) contenida sobre el plásmido VX4 como se describe previamente (Presta et al., Cáncer Research 57: 4593-4599 (1997)). La proteina del "barrido de CDR" resultante fue expresada y purificada como antes. Estudios de enlace fueron efectuados para comparar las dos versiones. Brevemente, una placa NUNC MAXISORP™ fue recubierta con 1 microgramo/ml de dominio extracelular de HER2 (ED; producido como se describe en WO 90/14357) en solución reguladora del pH de carbonato 50 mM, pH 9.6, durante todo la noche a 4°C y luego bloqueado con diluyente de ELISA (0.5% de BSA, 0.05% de polisorbato 20, PBS) a temperatura ambiente durante 1 hora. Diluciones en serie de muestras en diluyente de ELISA fueron incubadas sobre las placas durante 2 horas. Después del lavado, el fragmento de Fab enlazado fue detectado con anticuerpo anti-humano kappa murino biotinilado (ICN 634771) seguido por peroxidasa de rábano estreptavidina-conjugada (Sigma) y utilizando 3, 3 ', 5, 5 ' -tetrametil bencidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como sustrato. La absorbancia fue leida a 450 nm. Como se muestra en la figura 8A, todo el enlace fue perdido en la construcción del fragmento de Fab CDR-barrido humano. Para restaurar el enlace del Fab humanizado, se construyeron mutantes utilizando ADN del CDR-barrido como plantilla. Utilizando un modelo generado por computadora (figura 9), estas mutaciones difieren designadas para cambiar los residuos de región de estructura humano a sus contrapartes murinas en posiciones en donde el cambio podría afectar las confirmaciones CDR o la interfase de anticuerpo-antigeno. Los mutantes son mostrados en la Tabla 2.

Tabla 2 Designación de mutaciones de FR 2C4 humanizadas Las curvas de enlace para los varios mutantes son mostradas en las figuras 8A-C. La versión de Fab humanizada 574, con los cambios ArgH7lVal, AspH73Arg y IleH69Leu, parece tener en enlace restaurado a aquel del fragmento de Fab de 2C4 quimérico original. Residuos de FR y/o CDR adicionales, tales como L2, L54, L55, L56, H35 y/o H48, pueden ser modificados (por ejemplo, sustituidos como sigue IleL2Thr; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser; y ValH48lle) con el fin de refinar adicionalmente o mejorar el enlace de anticuerpo humanizado. Alternativa o adicionalmente, el anticuerpo humanizado puede ser madurado por afinidad (véase anteriormente) con el fin de mejorar adicionalmente o refinar su afinidad y/u otras actividades biológicas. La versión 574 de 2C4 humanizado fue madurada por afinidad utilizando un método de fago-exhibición. Brevemente, Fab 2C4.574 humanizado fue clonado a un vector de exhibición de fago como una fusión de gen III. Cuando partículas de fago son inducidas mediante infección con fago auxiliar M13K07, esta fusión permite que Fab sea mostrado sobre el término N de la proteina de cola-fibra del fago, gen III (Baca et al. J Biol Chem. 272:10678 (1997) ) . Bibliotecas individuales fueron construidas para cada uno de los 6 CDR identificados anteriormente. En estas bibliotecas, los aminoácidos en los CDR los cuales fueron identificados utilizando un modelo generado por computadora (figura 9) como siendo potencialmente significativos en el enlace a HER2 fueron aleatorizados utilizando oligos que contienen "NNS" como sus codones. Luego las bibliotecas fueron sometidas a cromatografía de afinidad contra HER2 ECD recubiertos sobre placas NUNC MAXISORP™ con 3% de leche anhidra en PBS con 0.2% de TWEEN 20® (MPBST) usado en lugar de todas las soluciones de bloqueo. Con el fin de seleccionar el fago con afinidades más altas que aquella de 2C4.574, en las rondas de cromatografía de afinidad 3, 4 y 5, HER2 ECD soluble o Fab 2C4.574 soluble fue agregado durante las etapas de lavado como competidor. Los tiempos de lavado fueron extendidos a 1 hora a temperatura ambiente. Después de 5 rondas de cromatografía de afinidad, los clones individuales fueron otra vez analizados mediante fago-ELISA. Clones individuales fueron cultivados en placas de cultivo de tejido con fondo en forma de U de 96 cavidades Costar y fago fueron inducidos mediante adición del fago auxiliar. Después de cultivo durante toda la noche, células E. coli fueron aglomeradas y los sobrenadantes que contienen fago fueron transferidos a placas de 96 cavidades en donde el fago fue bloqueado con MPBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Placas NUNC MAXISORP™ recubierta con HER2 ECD fueron también bloqueadas con MPBST como antes. El fago bloqueado fue incubado sobre las placas durante 2 horas. Después del lavado, el fago enlazado fue detectado utilizando conjugado de peroxidasa de rábano anticuerpo monoclonal anti-M13 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 27-9421-01) diluido 1:5000 en MPBST, seguido por 3, 3 ', 5, 5 ' -tetrametil bencidina como sustrato. La absorbancia fue leída a 450 nm. Los 48 clones de cada biblioteca que dieron las señales más altas fueron sometidos a secuenciación de ADN. Aquellos clones cuyas secuencias ocurrían más frecuentemente fueron subclonadas al vector descrito anteriormente que permite la expresión de Fab solubles. Estos Fab fueron inducidos, las proteínas purificadas y los Fab purificados fueron analizados en cuanto a enlace mediante ELISA como se describe anteriormente y el enlace fue comparado con aquel de la versión 2C4.574 humanizada de partida. Después que mutaciones interesantes en CDR individuales fueron identificadas, mutantes adicionales que eran varias combinaciones de estos fueron construidos y probados como antes. Los mutantes que dieron enlace mejorado en relación con 574 son descritos en la Tabla 3.

Tabla 3 Designación de mutantes derivados de maduración de afinidad de 2C4.574 * Proporción de la cantidad mutante necesario para dar el OD medio de la curva estándar a la cantidad de 574 necesaria para dar el OD medio de la curva estándar en un ELISA Erb2-ECD. Un número menor de 1.0 indica que el mutante se enlaza a Erb2 mejor que el 574 se enlaza.

Los siguientes mutantes también han sido construidos y están actualmente bajo evaluación: Los siguientes mutantes sugeridos por un barrido de homología, están actualmente siendo construidos: 678 thrH30ala 679 thrH30ser 680 lysH64arg 681 leuH96val 682 thrL97ala 683 thrL97ser 684 tyrL96phe 685 tyrL96ala 686 tyrL91phe 687 thrL56ala 688 glnL28ala 689 glnL28glu El aminoácido preferido en H34 seria metionina. Un cambio a leucina podría ser efectuado si se encontrara que hay oxidación en esta posición. Se encontró que asnH52 y asnH53 son fuertemente preferidos para el enlace. El cambio de estos residuos a alanina o ácido aspártico disminuye espectacularmente el enlace. Un anticuerpo intacto que comprende los dominios ligeros y pesados variables de la versión humanizada 574 con una región constante de cadena pesada IgGl humano ha sido preparado (véase patente estadounidense No. 5,821,337). El anticuerpo intacto es producido mediante células de ovario de hámster chino (CHO) . Aquella molécula es designada como pertuzumab en la presente.

EJEMPLO 4 El anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea la activación moderada por EGF, TGF-a o HRG de MAPK y Akt cinasa Muchos receptores de factor de crecimiento señalan por medio de la ruta de proteina cinasa mitógeno-activada (MAPK) . Estas cinasas de especificidad doble son uno de los puntos finales claves en las rutas de transducción de señal que disparan finalmente las células de cáncer a dividirse. La capacidad del anticuerpo monoclonal 2C4 o trastuzumab para inhibir la activación de EGF, TGF-a o HRG de MPAK fue determinada de la siguiente manera. Células MCF7 (105 células/cavidad) fueron depositadas en medio que contiene suero en placas de cultivo celulares de 12 cavidades. El siguiente dia, los medios celulares fueron separados y medio nuevo que contiene 0.1% de suero fue agregado a cada cavidad. Luego este procedimiento fue repetido el siguiente dia y antes del análisis los medios fueron reemplazados con solución reguladora del pH de enlace libre de suero Jones et al. J. Biol. Chem. 273:11667-74 (1998); y Schaefer et al. J. Biol. Chem. 274:859-66 (1999)). Se permite que las células se equilibren a temperatura ambiente y luego son incubadas durante 30 minutos con 0.5 mL de trastuzumab 200 nM o anticuerpo monoclonal 2C4. Las células fueron luego tratadas con EGF 1 nM, TGF-a 1 nM, o HRG 0.2 nM durante 15 minutos. La reacción fue detenida al aspirar el medio de célula y luego agregar 0.2 mL de solución reguladora del pH de muestra SDS-PAGE que contiene 1% de DTT. La activación de MAPK fue determinada mediante Western blotting utilizando un anticuerpo MAPK anti-activo (Promega) como se describe previamente (Jones et al. J. Biol. Chem. 273:11667-74 (1998)). Como se muestra en la figura 01, el anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea significativamente la activación moderada por EGF, TGF-a y HRE de MAPK a una extensión mayor que Trastuzumab. Estos datos sugieren que el anticuerpo monoclonal 2C4 se enlaza a una superficie de HER2 que es usada para su asociación ya sea con EGFR o HER2 y asi impide la formación del complejo del receptor de señalización. También se demostró que el anticuerpo monoclonal 2C4 inhibe la activación de Akt dependendiente de heregulina (HRG) . La activación de la ruta de transducción de señal de PI3 cinasa es importante para la sobrevivencia de la célula (Carraway et al. J. Biol. Chem. 270: 7111-6 (1995)). En células de tumor, la activación de PI3 cinasa puede jugar un papel en el fenotipo invasivo (Tan et al. Cáncer Research. 59: 1620-1625, (1999)). La ruta de sobrevivencia es principalmente moderada por el AKT de serina/treonina cinasa (Bos et al. Trends Biochem Sci. 20: 441-442 (1995) . Los complejos formados entre HER2 y ya sea HER3 o EGFR pueden iniciar estas trayectorias en respuesta a heregulina o EGF, respectivamente (Olayioye et al. Mol. & Cell. Biol. 18:5042-51(1998); Karunagaran et al., EMBO Journal. 15:254-264(1996) y Krymskaya et al. Am. J. Physiol. 276: L246-55 (1999)) . La incubación de células de cáncer de pecho MCF7 con 2C4 inhibe la activación de Akt moderada por heregulina. Agus et al. Cáncer Cell 2: 127-137 (2002). Además, el nivel basal de activación de Akt presente en ausencia de adición de heregulina es reducido adicionalmente por la adición de 2C .

Ejemplo 5 Terapia de cáncer resistente al tumor Este ejemplo demuestra la seguridad, tolerabilidad y eficacia de pertuzumab en combinación con gemcitabina en pacientes con cáncer de ovario resistente al platino, carcinoma peritoneal primario o carcinoma de tubo de Falopio. El efecto de pertuzumab y gemcibatina en la sobrevivencia libre de avance es evaluado en todos los pacientes y el subconjunto de pacientes cuyos tumores contienen marcadores que indican activación de HER2. Los pacientes que han avanzado mientras reciben o en el transcurso de 6 meses de recibir, un régimen de quimioterapia a base de platino serán eligibles para este estudio. Los pacientes serán aleatorizados para recibir ya sea gemcitabina en combinación con pertuzumab o gemcibatina en combinación con placebo. Los pacientes tratados en la presente incluyen aquellos que no han recibido un tratamiento de régimen de salvamento previo para enfermedad resistente a platino antes de entrar al estudio y aquellos que han tenido un régimen previo para enfermedad resistente al platino. La gemcitabina será administrada a 1000 mg/m2 en los dias 1 y 8 de cada ciclo de 21 dias. La gemcitabina será infusionada primero durante 30 minutos. Se permitirán reducciones de dosis por toxicidad. Se administrará placebo o pertuzumab en el dia 1 del ciclo de 21 dias. Los sujetos aleatorizados para recibir pertuzumab serán administrados con una dosis de carga inicial de 840 mg (ciclo 1) seguido por 420 mg en el ciclo 2 y más alia. Los sujetos aleatorizados para recibir placebo serán administrados con placebo en el mismo volumen como el administrado con el brazo de pertuzumabpara el ciclo 1, ciclos 2 y más allá. Los sujetos con enfermedad progresiva pueden recibir tratamiento por hasta 17 ciclos o 1 año . Los pacientes tendrán reducción de dosis de gemcitabina estándar y dosis retenidas como resultado de citopenias. El pertuzumab también será retenido por cualquier dia de retención 1 de dosis de gemcitabina. Las dosis subsecuentes estarán a las dosis reducidas y no serán incrementadas. Si se requiere reducción o retención de dosis en más de 4 ocasiones o si las dosis son retenidas por más de 3 semanas, entonces se descontinuará la gemcitabina y con la aprobación del médico de tratamiento y monitor médico, se puede proseguir con el fármaco ciego hasta el avance de la enfermedad. Si las dosis de gemcitabina del dia 8 son retenidas, entonces la dosis del dia 8 será omitida y el tratamiento subsecuente comenzará con el siguiente ciclo (dia 22 del ciclo previo) . La gemcitabina será mantenida y la dosis reducida como se recomienda por la siguiente tabla: Las dosis subsecuentes para cualquier paciente que requiera reducción de dosis será a la dosis reducida. Si las dosis son mantenidas por más de 3 semanas como resultado de citopenias, se supondrá que los pacientes tienen toxicidad inaceptable y descontinuarán la gemcitabina. Si no hay otras toxicidades grado III o IV adicionales, la continuación del fármaco ciego será a discreción del médico y el monitor médico. La toxicidad hematológica de gemcitabina ha estado relacionada con la velocidad de administración de dosis. La gemcitabina será administrada durante 30 minutos sin consideración de la dosis total. El uso de agentes estimuladores de colonia para citopenias NCI-CTC grado 2 se puede efectuar a discreción del médico de tratamiento. La opción para el cruce a un solo agente de pertuzumab será ofrecida. Una dosis de carga de 840 mg será administrada en el siguiente ciclo debido a continuación de 420 mg con ciclos subsecuentes cada 21 dias. Una muestra de tumor embebida en parafina o portaobjetos de parafina sin teñir de tumor representativo que contiene el cáncer será obtenida y determinada en cuanto a status de fosforilación HER2. aproximadamente 20-40% de pacientes con cáncer de ovario pueden tener fosforilación de HER2 detectable. La respuesta será determinada al final de los ciclos 2, 4, 6, 8, 12 y 17. La enfermedad mensurable será determinada usando los Criterios de Evaluación de Respuesta para Tumores Sólidos (RECIST) , mediante evaluación clínica y exploración o barrido de CT o equivalente. La respuesta para sujetos con enfermedad evaluable serán determinados de acuerdo con cambios a CA-125 y evidencia clínica y radiológica de enfermedad. Las respuestas deben ser confirmadas 4-8 semanas después de la documentación inicial de respuesta. Los sujetos evaluables consistirán de sujetos que han tenido por lo menos una determinación de respuesta y tienen una determinación de status de fosforilación de HER2 en su muestra de tumor. Las siguientes medidas de resultados serán determinadas .

Punto final de eficacia primaria La sobrevivencia libre de avance, como se determina por la determinación del investigador usando RECIST o cambios de CA-125, enseguida del inicio del tratamiento de estudio asignado a todos los sujetos en cada brazo. La sobrevivencia libre de avance, como se determina por la determinación del investigador usando RECIST o cambios de CA_125 enseguida del inicio del tratamiento de estudio asignado en cada brazo en los siguientes subgrupos: Sujetos con marcadores detectables de activación de HER2. Sujetos sin marcadores detectables de activación de HER2.

Puntos de eficacia secundarios Respuesta objetiva (PR o CR) Duración de respuesta Tiempo de sobrevivencia Libertad de avance a 4 meses Estos puntos finales serán determinados en todos los sujetos en cada brazo y en los siguientes subgrupos: Sujetos con marcadores detectables de activación HER2. Sujetos sin marcadores detectables de activación HER2. Para impedir o tratar posibles náusea y vómito, el paciente puede ser premeditado con antagonistas de serotonina, esteroides y/o benzodiazepinas . Para impedir o tratar posible erupción, se pueden usar terapias de acné estándar, en las que se incluyen anticuerpos tópicos y/u orales. Otras medicaciones concomitantes posibles son cualesquier medicaciones de prescripción u preparaciones de mostrador usadas por el sujeto en el intervalo que comienza 7 dias antes del dia 1 y que continua hasta el último dia del periodo de seguimiento. Los sujetos que experimentan elevaciones de temperatura asociadas con la infusión a > 38.5°C u otros síntomas asociados con la infusión pueden ser tratados sintomáticamente con acetaminofen, difenhidramina o meperidina. Factores de crecimiento hematopoyético no experimental pueden ser administrados para citopenias NCI-CTC grado 2. El paciente tratado como se describe anteriormente mostrará mejora en los signos o síntomas de cáncer de ovario, carcinoma peritoneal primario o carcinoma de tubo de Falopio, tal como se evalúa por uno o más de los puntos finales de eficacia primarios o secundarios. Además, el paciente resistente a platino tratado como se describe anteriormente con la combinación de Pertuzumab o Gemcitabina mostrará mayor mejora en cualquiera de los signos o síntomas de cáncer, en comparación con el paciente resistente a platino tratado con gemcitabina solamente.

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para el tratamiento de cáncer resistente al platino seleccionado del grupo que consiste de cáncer de ovarios, carcinoma peritoneal primario y carcinoma de tubo de Falopio, caracterizado porque comprende administrar a un paciente un anticuerpo de HER2 que inhibe la dimerización de HER más efectivamente que el trastuzumab y un agente quimioterapéutico antimetabolito, cada uno en cantidades efectivas para tratar el cáncer.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo de HER2 se enlaza al dominio II de HER2.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo de HER2 es pertuzumab.
4. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el agente quimioterapéutico antimetabolito es gemcitabina.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una muestra de tumor del paciente exhibe activación de HER.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque una muestra de tumor del paciente exhibe activación de HER2.
7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque da como resultado una mejora en sobrevivencia, en relación con un paciente tratado con el agente quimioterapéutico antimetabolito solamente .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque da como resultado una mejora en la sobrevivencia libre de avance, en relación con un paciente tratado con el agente quimioterapéutico antimetabolito solamente .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque da como resultado una mejora en la sobrevivencia global en relación con un paciente tratado con el agente quimioterapéutico antimetabolito solamente.
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque da como resultado una respuesta objetiva.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque da como resultado una respuesta completa .
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque da como resultado una respuesta parcial .
13. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo HER2 es administrado como una dosis de carga de aproximadamente 840 mg, seguida por aproximadamente 420 mg cada 3 semanas .
14. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el anticuerpo de HER2 es administrado como una dosis de entre aproximadamente 1050 mg administrados aproximadamente cada 3 semanas.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la gemcitabina es administrada a una dosis de entre aproximadamente 600 mg/m2 a 1250 mg/m2 en los dias 1 y 8 de un ciclo de 3 semanas.
16. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el agente quimioterapéutico antimetabolito es administrado antes de o enseguida de la administración del anticuerpo HER2.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la sincronización entre por lo menos una administración del agente quimioterapéutico antimetabolito y por lo menos una administración del anticuerpo HER2 es de aproximadamente 1 mes o menor.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la sincronización entre por lo menos una administración del agente quimioterapéutico antimetabolito y por lo menos una administración del anticuerpo HER2 es de aproximadamente 2 semanas o menor.
19. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el agente quimioterapéutico antimetabolito y el anticuerpo HER2 son administrados concurrentemente a un paciente, en una sola formulación o formulaciones separadas.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer no sobreexpresa HER2.
21. 21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende además administrar un segundo agente quimioterapéutico al paciente .
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el segundo agente quimioterapéutico es seleccionado del grupo que consiste de un taxano, capecitabina, agente quimoterapéutico a base de platino, antraciclina, doxorubicina liposomal, topotecano, vinca alcaloide y TLK 286.
23. 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tratamiento con la combinación del agente quimioterapéutico antimetabolito y el anticuerpo HER2 da como resultado un beneficio terapéutico sinergistico o mayor que aditivo al paciente .
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el tratamiento con la combinación de gemcitabina y el anticuerpo HER2 da como resultado un beneficio terapéutico sinergistico o mayor que aditivo al paciente.
25. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo HER2 es un anticuerpo desnudo.
26. 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo HER2 es un anticuerpo intacto.
27. 27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque el anticuerpo HER2 es un fragmento de anticuerpo que comprende una región de enlace de antigeno.
28. 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cáncer es cáncer de ovario.
29. 29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque el cáncer es carcinoma peritoneal primario.
30. 30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque el cáncer es carcinoma de tubo de Falopio.
31. 31. Un método para el tratamiento de cáncer resistente a platino seleccionado del grupo que consiste de cáncer de ovario, carcinoma peritoneal primario y carcinoma de tubo de Falopio, caracterizado porque comprende administrar a un paciente un anticuerpo de HER2 que se enlaza a un sitio de enlace heterodimérico sobre HER2 y gemcitabina, cada uno en cantidades efectivas para tratar el cáncer.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el anticuerpo bloquea la heterodimerización de HER2 con EGFR o HER3.
33. 33. Un método para el tratamiento de cáncer resistente a platino seleccionado del grupo que consiste de cáncer de ovario, carcinoma peritoneal primario y carcinoma de tubo de Falopio, caracterizado porque comprende administrar a un paciente un anticuerpo de HER2 que se enlaza al dominio II de HER2 y gemcitabina, cada uno en cantidades efectivas para tratar el cáncer.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque se enlaza a la unión entre los dominios I, II y III de HER2.