MXPA06008964A - Inhibidores de la senalizacion de tgf-r para el tratamiento de enfermedades del snc. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al uso de oligonucleotidos para la preparacion de una composicion farmaceutica para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad, en donde la neurogenesis y/o la neuroregeneracion tienen un efecto beneficioso, en particular una enfermedad como la enfermedad de Alzheimer, la enfermad de Parkinson, demencia de cuerpos de Lewy, esclerosis amiotropica lateral, atrofias espinocerebelosas, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, demencia frontemporal, la enfermedad Pick, el SIDA, la demencia compleja, la demencia vascular, paralisis supranuclear progresiva, degeneracion corticobasal, atrofia de multisistema, la enfermedad e Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, infarto, heridas traumaticas del cerebro y de la medula espinal, retinitis pigmentosa, degeneracion macular, glaucoma, degeneracion de coclea, depresion, esquizofrenia, esclerosis multiple, y degeneracion del neurodesarrollo.

Description

INHIBIDORES DE LA SE ALIZACIÓN DE TGF-R PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DEL SNC Especificación La presente invención se refiere al uso de oligonucleótidos para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención o el tratamiento de una enfermedad, en donde la neurogénesis y/o la neuroregeneración tiene un efecto beneficioso, en particular una enfermedad neurodegenerativa como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson incluyendo atrofia multisistema, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, demencia de cuerpos de Lewy, esclerosis amiotrópica lateral y otros enfermedades de las neuronas motoras, enfermedad de Huntington, atrofias espinocerebelosas, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob y otras enfermedades graves de priones, demencia frontemporal incluyendo la enfermedad Pick, la demencia compleja del SIDA, la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, una enfermedad cerebrovascular tal como la demencia vascular, infarto, heridas traumáticas del cerebro y de la médula espinal, retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, depresión y esquizofrenia, y enfermedades de desarrollo tales como el síndrome de Down.

Hay muchos enfermedades neurodegenerativas graves que tienen un impacto grave socio-económico en las sociedades modernas, por ejemplo, enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer, trastornos del desarrollo con demencia (tal como el síndrome de Down) , la enfermedad de Parkinson, la demencia de cuerpos de Lewy, demencia frontemporal, la enfermedad Pick, esclerosis amiotrófica lateral, atrofias espinocerebelosas, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la demencia compleja del SIDA, demencia vascular, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, atrofia multisistema, la enfermedad de Huntington, infarto, herida traumática del cerebro, retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, depresión, esquizofrenia y esclerosis múltiple. Normalmente, las causas patofisiológicas son defectos genéticos, epigenéticos o adquiridos, que frecuentemente resultan en una formación de agregados o acumulación de células muertas o rotas que últimamente llevan a un disfuncionamiento continuo y finalmente a la muerte de neuronas o de células gliales y la desintegración estructural. Células microglias y macrófagos perivasculares de reposo se atraen y se activan, intentando quitar las células y el tejido rotos y muertos. Eso puede ocurrir durante un periodo de tiempo muy corto, como en el caso de la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, o durante décadas, como por ejemplo en la enfermedad de Parkinson o la esclerosis múltiple. La población de células de microgliales/macrófagos libera un número de citoquinas inflamatorias hacia adentro la matriz extracelular y ésas se van o hacia adentro pequeñas vénulas, o al espacio LCE . Desgraciadamente, la neurogénesis y la neuroregeneración que podrían influir ventajosamente en el curso clínico de estas enfermedades arriba descritas (a pesar de sus mecanismos individuales patofisiológicos específicos) se suprimen por mecanismos no conocidos hasta el presente dia. Asi, el problema técnica en que se basa la presente invención es de proporcionar medios apropiados para tratar o impedir enfermedades neurodegenerativos o al menos sintomas asociados con dichas enfermedades en que se trata de influir en la supresión de la neurogénesis y de la neuroregeneración.

La solución de dicho problema téchnico se alcanza en que se proporcionan las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Es conocido que la familia de las proteinas TGF-beta, es decir, el TGF-betal, el TGF-beta2 y el TGF-beta3 con sus receptores específicos de la superficie de la célula, el TGF Rl, TGF RII, TGF RUI influye en múltiples aspectos decisivos del desarrollo de órganos embrionales y principalmente en el desarrollo mesenquimal / neuroectodérmico de órganos. Dichas proteínas hacen posible la diferenciación de células madres embrionarias en células precursoras neuronales y tienen un efecto neuroprotectivo para neuronas maduras heridas . Además es conocido que tienen impacto muy grave en la diferenciación de células hematopoéticas madres, que controlan la proliferación y también la diferenciación. Durante los experimentos que llevaron a la presente invención, se encontró que TGF-R, es decir, TGF Rl y TGF RII, es un factor decisivo que influye en la supresión de la neurogénesis y la neuroregeneración y, por consiguiente, un compuesto que es capaz de influir en la actividad biológica de TGF R o TGF RII es útil para el tratamiento / la prevención de enfermedades neurodegenerativas y/o enfermedades neuroinflamatorias .

Para resumir, se puede constatar lo siguiente como resultado de los experimentos que llevaron a la presente invención: 1. Se descubrió un circuito fisiológico regulatorio que influye en el nivel de regeneración efectiva del sistema nervioso central mediante células precursoras/madres, aunque por supuesto ya se - hablan conocido los compuestos individuales (TGF-ß, TGF-RII, compartimiento de liquido cerebroespinal, liquido endolinfático, vitreo, células precursoras neuronales, etc.) Este circuito - con la molécula de destino decisiva de TGF-RII que está expresado en la pared ventricular - es responsable para la neuroregeneración perjudicada en la mayoría de las patologías del SNC. 2. Es interesante que la regulación no se efectúa por la sangre, los linfáticos, o la matriz extracelular, pero al contrario por compartimientos de líquidos (líquido cerebroespinal, etc.) que tienen contacto directo con células neuronales y sus células precursores o madres. 3. Se descubrió que un circuito fisiológicamente inhibitorio para neofor ación neuronal/oligodendroglial o astrocítico es un punto de partida ideal para estrategias para reparar daños en el SNC, aplicable de manera abrumadora para casi toda patología destructiva en el sistema nervioso. A partir de conocimientos previos en cuanto a TGF-ß, se intentó más aumentar que bajar (ver 5) el funcionamiento de TGF-ß para aumentar sus actividades conocidas neuroprotectivas o inmunosupresivas en el SNC. aquí postulamos bajar su efecto inhibidor sobre neoformación de células madres mediante bloquear la señaliazción de TGF-RII en la pared ventricular. 4. Aunque durante largo tiempo se había supuesto que que procesos inflamatarios desempeñaban un papel significativo en la neurodegeneración y aunque parece que una cantidad relativamente larga de datos apoya esta idea, el circuito patrón ahora se divulgará que orquestra todos los subcircuitos regulatorios individuales, es decir, citoquinas (IL-1, IL-6,IL-12) y otros. 5. Adicionalmente, se podría mencionar que Nature ha introducido en prioridad la neuroprotección y un S?C inmunoprivilegiado antes de la neuroregeneración: hasta ahora, se ha podido demostrar que el S?C inmunoprivilegiado y altamente protegido (protegido en especial contra ataques inmunes y apoptosis neuronal) , que es en parte significativa debido al sistema de TGF-ß, tiene deficiencias en la neuroregeneración debido a exactamente este privilegio y debido a la misma molécula TGF-ß. El concepto evolucionista parece hablar en favor de la neuroprotección aguda de un S?C altamente complejo y su más complejo funcionamiento; en este contexto, neuroregeneración individual parece ser menos importante para la evolución que la neuroprotección del individuo .

El circuito regulatorio Desde el punto de vista fisiológico, la neurogénesis del cerebro permite una reparación/sustitución de células neuronales, oligodendrogliales o astrociticos que no funcionan bien o que están envejecidas mediante células precursoras respectivas. La neurogénesis para reparación en el cerebro se regula por el sistema de TGF-ß-TGF-R (en especial TGF RII, pero también TGF Rl) , mediante el fluido cerebroespinal; los orquestradores principales son células micogliales/macrófagos de linaje que producen el TGF-ß y que lo secretan por espacio extracelular hacia adentro el compartimiento del LCE (así como dentro de vitreo, endolimfáticos) , y células precursoras /células madres neuronales, que reciben esta señal por el LCE (asi como hacia adentro vitreo, endolimfáticos) mediante TGF-RII o TGF-RI altamente expresado sobre sus estructuras supferficiales, o un revestimiento ependimal con receptores idénticos. En la mayoría de la patología del SNC, la neurogénesis está gravemente afectada o no funciona bien. La regulación de la neurogénesis se ajusta, normalmente suprimida ( ! ) por la activación de células microgliales/macrófagos desde el SNC, que occurre en el contexto de toda patología específica de enfermedad. Células microgliales activadas/macrófagos suprimen por esta via - LCE a zona subventricular/otras zonas neurogénicas - la regeneración de la parénquima del cerebro neurodegenerativo, agudamente y crónicamente inflamatorio, hipóxico, aterosclerótico o envejecido. Se afecta no sólo la diferenciación neuronal, pero también linajes de células oligodendrogliales y astrocíticas . Todas las moléculas que influyen en este circuito para mejorar la regeneración neuronal/oligodenroglial/astrocítica se reclaman como tratamiento. Métodos para diagnóstica, profilaxis, prevención o prognosis de una patología del SNC que aplican este circuito son también muy importantes, posiblemente para cntrolar los efectos de una intervención terapéutica.

Descripción corta de las ilustraciones Fig. 1: TGF-betal inhibe la proliferación de células madres y precursoras neurales de roedores adultos A) Cultivos de células madres y precursoras neurales (CMN) de roedores adultos se trataron con diferentes concentraciones (0, 5, 10, 50 ng/ml) de TGF-betal recombinante humano durante 7 dias. En el dia 7, células viables se contaron por medio de un ensayo de Trypan Blue en un hemocitómetro. Los datos se indican como números medios de células ± SD (standard desviation, desviación estándar) a partir de tres experimentos que se hicieron por triplicado. B) muestra el efecto de TGF-betal sobre células precursoras neurales humanas fetales.

Fig. 2: El efecto de TGF-betal sobre CMNes es reversible Cultivos de células madres y precursoras neurales de roedores adultos se trataron con 10 ng/ml de TGF-beta recombinante humano durante 7 dias. En el día 7, las células se disociaron, se las contó por medio de un ensayo de exclusión de Trypan Blus y células previamente tratadas se sembraron otra vez en con o sin 10 ng/ml de TGF-betal. Este procedimiento se hizo todas las 7 días. Los datos se indican como números medios de células ± SD a partir de tres experimentos que se hicieron por triplicado.

Fig. 3: Anticuerpos contra TGF-betaRII pueden reducir efectos de TGF-betal sobre células madres neurales de rodeores adultos Cultivos de CMNes de roedores adultos se trataron con 10 ng/ml de TGF-betal recombinante humano durante 7 días en la presencia o la ausencia de anticuerpo de anti-TGF-betaRII (10 Dg/ml) . En el día 7, células viables se contaron por medio de un ensayo de exclusión de Trypan Blus en un hemocitómetro. Los datos se indican como números medios de células ± SD a partir de tres experimentos que se hicieron por triplicado.

Fig. 4: TGF-RII soluble inhibe la supresión inducida por TGF-ßl de la proliferación de CMNes Cultivos de CMNes de roedores adultos se trataron con 10 ng/ml de TGF-betal recombinante humano durante 7 días en la presencia o la ausencia de anti-TGF-betaRII soluble (500 ng/ml) . En el dia 7, células viables se contaron por medio de un ensayo de exclusión de Trypan Blus en un hemocitómetro. Los datos se indican como números medios de células ± SD a partir de tres experimentos que se hicieron por triplicado.

Figura 5 : Células que expresan TGF-ßRn pueden aislarse mediante utilización de técnicas de selección de células CMNes de rodeores adultos se prepararon como ya se ha descrito en el ejemplo 1. Células que expresaron TGF-bRII se purificaban mediante la utilización de anticuerpos contra TGF-bRII. A eso de un 20% de CMNes expresan el receptor y esta población de células puede enriquecerse mediante este enfoque .

Fig. 6: Oligonucleótidos antisentido contra TGF-DRII inhiben la regulación hacia abajo inducida por TGF-Dl de proliferación in vitro de células adultas madres y precursoras neurales. Se mostró que la inhibición inducida por TGF-Dl de la proliferación de células madres y precursoras neurales se bloquea completamente y específicamente debido al tratamiento antisentido.

Fig. 7: Tratamiento in vivo con oligonucleótidos antisentido específicos de TGF-RII salva el bloqueo inducido por TGF-Dl de proliferación de células en el cerebro adulto. La figura 7 demuestra la regulación hacia abajo inducida por el TGF-Dl de la proliferación de células en la convolución del hipocampo dentado (figura 7A) y en la zona subventricular (figura 7B) . Tratamiento con oligonucléótidos sin sentido no bloqueó este efecto, mientras que tratamiento con oligonucleótidos antisentido bloqueó el efecto de TGF-Dl (figura 7°A y B) Fig. 8: Tratamiento in vivo de oligonucleótidos antisentido específicos de TGF-RII impide el bloqueo inducido por TGF-Dl de proliferación de células en el cerebro adulto. La figura 8 demuestra que la regulación hacia abajo inducida por el TGF-Dl de proliferación de células en la circonvolución dentada del hipocampo (figura 8A°) y en la zona subventricular (figura 8B) puede impedirse por tratamiento previo con oligonucleótidos antisentido de TGF-DRII.

En las enfermedades arriba descritas, células microgliales, y posiblemente macrófagos perivasculares en reposo son atraídas desde agregaciones de proteinas, células muertas y rotas, inflamación, respuesta inflamatoria en aterosclerosis o muerte de células asociada con un traumatismo agudo/hipoxia. Este puede ser un proceso agudo, subagudo o crónico. Durante el proceso de activación, la población activada de células microgliales (incluyendo macrófagos de la pared del vaso o de otras fuentes) libera una cantidad de citoquinas inflamatorias hacia adentro la matriz extracelular y ésos se van hacia adentro pequeñas vénulas, o directamente al espacio LCE. Estas citoquinas alcanzarán el compartimiento LCE y serán disponibles inmediatamente en todos los lugares que son rodeados con LCE en cierta medida. Entre estas citoquinas se cuenta TGF-beta. Se demostró (Monje, M. L., H. Toda, et al. (2003). "Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis." Science 302 (5651) : 1760-1765) que la neuroinflamación inhibe la neurogénesis y que un bloqueo inflamatorio con indometacina, una fármaco corriente no esteroídeo anti-inflamatorio, restablece la neurogénesis después de inflamación inducida por endotoxinas y aumenta la neurogénesis después de irradiación cranial.

No obstante, el arte anterior no divulga TGF-beta como el principal regulador que regula hacia abajo la neurogénesis o neuroreparación después de herida o bajo condiciones patológicas. Al contrario, el arte anterior consideraba TGF-beta como un agente neuroprotectivo que impide la muerte celular de neuronas heridas o lesionadas, y intenaba regular hacia arriba TGF-beta en condiciones de enfermedad del SNC.

Zhang et al. (Zhang, J. M., R. Hoffmann, et al. (1997). "Mitogenic and antiproliferative signáis for neural crest cells and the neurogenic action of TGF-betal. " Dev. Dyn . 208(3) 375-386.) demuestran que TGF-beta tiene un efecto sobre células en desarrollo de la cresta neural de codornices Aquí, la proliferación inducida por TGF-beta de células neurales pluripotentes de cresta (y/o sus derivados inmediatos) y de células melanogénicas correspondientes, causando una disminución del tamaño de la colonia. Adicionalmente y en contrario a la presente invención, la neurogénesis aumentó considerablemente en la presencia de TGF-beta. El número por colonia de células adrenérgicas y precursoras de neuronas sensoriales aumentaron en colonias positivas de neuroblastos tratadas con TGF-beta.

TGF-betas tienen papeles importantes en el crecimiento y la diferenciación de células, el desarrollo de órganos, la formación de la matriz, las funciones de la reparación de heridas y funciones inmunes. Mientras que TGF-beta es una sustancia poderosa para la inhibición de crecimiento de muchos tipos de células, estimula la proliferación de fibroblastos y de osteoblastos. También, es un estimulador poderoso de producción extracelular de matriz por fibroblastos y osteoblastos, inhibe la degradación de matriz y regula hacia arriba receptores para la interacción de la matriz. TGF-betal ha sido implicado como un factor clave causativo en la patogénesis de la fibrosis del hígado y por lo menos un mediador decisivo de los efectos beneficiosos y perjudiciales de la ciclosporina A sobre el sistema inmune y el riñon. Adicionalmente, se ha mostrado que diferentes enfermedades progresivas crónicas del riñon en seres humanos y modelos experimentales están asociadas con la estimulación del sistema de TGF-beta.

TGF-betal regula hacia abajo quinasas Gl y G2 dependientes del ciclina y ciclinas en cuanto a la actividad de quinasa así como a la cantidad de proteina. TGF-betal también inhibe la fosforilación del producto del gen pRb supresor del tumor retinoblastoma en residuos múltiples de serina y de treonina en células mieloides humanas de leucemia. El pRB subfosforilado se asocia con el factor de transcripción E2F-4 en fase Gl, mientras que el pRb fosforilado principalmente se enlaza a E2F-1 y E2F-3. Como TGF-betal regula hacia arriba el pl30 (miembro de la familia pRb) /formación del complejo E2F-4 y regula hacia abajo pl07 (miembro de la familia pRb) / formación del complejo E2F-4, con niveles de E2F-4 que permanecen constantes, estos resultados proponen que E2F-4 es cambiado de pl07 a pRb y pl30 cuando células salen del ciclo de células y se frenan en Gl por la acción del TGF-betal. El "inhibidor cdk" p27 es un regulador positivo así como negativo del control del ciclo celular mediado por TGF-betal .

Aunque se dice que el TGF-betal es un inhibidor eligido de células primitivas hematopoyéticas madres normales, el TGF-beta inhibe linajes de células de leucemia mieloide primitivas así como más diferenciadas. La actividad neuroprotectivo, su papel en el desarrollo neural y su papel en la modulación de respuestas inmunes del TGF-betal se consideró más importante. Se ha mostrado en un número de estudios que TGF-betal es neuroprotectivo in vitro e in vivo.

Estudios de agonistas han demostrado que TGF-betal reduce la muerte de células neuronales y la extensión de infarto que sigue la occlusión media de arterias cerebrales (middle cerebral artery occlusion; MCAO) , mientras que al revés, estudios de antagonistas han mostrado que la muerte de células neuronales y la extensión del infarto después de MCAO son más aumentadas y asi han indicado que TGF-betal desempeña un papel neuroprotectivo en la isquemia cerebral. Trabajos recientes con la sobrexpresión de TGF-betal por adenovirus in vivo en ratones además ha implicado un papel neuroprotectivo para TGF-betal en la isquemia cerebral, como lo ha demostrado una reducción de la muerte de células neuronales, la extensión de infarto y las consecuencias neurológicas . Adicionalmente estudios numerosos in vitro han documentado la capacidad neuroprotectivo de TGF-betal en neuronas de una variedad de especies, incluyendo ratas, ratones, pollos y seres humanos. De interés significativo, TGF-betal se ha mostrado ser protectivo contra una gran variedad de agentes/insultos que inducen la muerte, incluyendo hipoxía/isquemia, excitotoxicidad de glutamato, daño amiloide, oxidativo y virus de la inmunodeficiencia humana. El efecto neuroprotectivo de TGF-betal se ha relacionado con su capacidad de mantener el potencial de la membrana mitocondrial, de estabilizar la homeostasia de Ca2+, de aumenatar la expresión de las proteínas anti-apoptóticos de Bcl-2 y de Bcl-xl, de inhibir la activación de la caspasa-3 y de inducir el inhibidor-1 del activador plasminógeno. Estudios con células madres embrionarias han demostrado una célula madre neural primitiva como un compuesto de especificación de linaje neural que es negativamente regulada por señalización relacionada con TGF-beta. Expresión endógena de TGF-alpha, otro miembro de la familia de TGF, ha mostrado que regula positivamente la neurogénesis de adultos. TGF-alpha es necesario para la proliferación completa de células progenitores presentes en la subependima y la producción completa de precursores neuronales que migran hacia el bulbo olfatorio. En ratones KO de TGF-alpha, la proliferación de estas células progenitoras también es disminuido con la edad, debido a la prolongación del ciclo celular. Envejecimiento o la ausencia de TGF-alpha endógeno no afecta los números de células madres neurales aisladas in vitro en la presencia de factor de crecimiento epidermal.

El uso de TGF-beta para la inmunomodulación en seres humanos está gravemente limitado por razón de su toxicidad, incluyendo estimulación excesiva de producción de matriz, nefrotoxicidad y otros efectos detrimentales . TGF-beta tiene potencial oncogénico y ha sido implicado en glomerulopatias, fibrosis pulmonar, esclerodermia y en el síndrome crónico del injerto contra el huésped. Adicionalmente, mientras TGFbeta es una citoquina inmunosupresiva muy poderosa, múltiples líneas de evidencia indican que una estimulación crónica de la expresión de TGF-beta - relacionado con enfermedades o en modelos de animales transgénicos - puede paradójicamente llevar a o aumentar la inflamación autoinmune .

Es creciente la evidencia que las propiedades poderosas de TGF-beta como un regulador negativo de respuestas inmunes de células T desempeñan un papel clave en la patofisiológica de una variedad de patologías del SNC. Por esa razón, esta citoquina se considera como un péptido relacionado con heridas y como un objetivo posible de intervención terapéutica. La neuroinflamación y la patología microglial son asociadas con muchas enfermedades neurológicas. Aquí, las más clásicas enfermedades son claramente enfermedades neuro-inmunológicas tales como la esclerosis múltiple. Pero también incluye enfermedades de cognición en las que principalmente pérdidas de memoria ocurren, tales como la enfermedad de Alzheimer, la demencia de cuerpos de Lewy, demencia compleja del SIDA, demencia vascular, o menos principalmente, tales como enfermedad de Pick, parálisis progresiva supranuclear, degeneración corticobasal, y la enfermedad de Creutzfeld-Jakob. Adicionalmente, programas inflamatorios son activados después de lesiones agudas tales como infarto, heridas traumáticas del cerebro y espinales. En diferentes modelos animales para la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, una activación de microglia y una regulación hacia arriba de TGF-betal han sido reportados (Baker, C. A., Z. Y. Lu, et al. (1999). "Activación microglial varia en diferentes modelos de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob ." J Virol 73(6): 5089-5097). Entre los cientas de enfermedades neurodegenerativas diferentes, más atención se ha prestado solamente a un puñado de éstas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis amiotrópica lateral. Vale mencionar que los mismos procesos neurodegenerativos pueden afectar diferentes regiones del cerebro, lo que resulta en el hecho de que una enfermedad definida parece muy diferente desde un punto de vista sintomático. Enfermedades neurodegenerativos del sistema nervioso central (SNC) pueden clasificar según enfermedades de la corteza cerebral (enfermedad de Alzheimer) , de los ganglios básales (enfermedad de Parkinson) , del tronco cerebral y del cerebelo o de la médula espinal (esclerosis amiotrópica lateral) .

Ejemplos de neurodegeneración y de enfermedades neurodegenerativas son : la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) , variante nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD) , la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofia multisistema, demencia, demencia frontemporal, enfermedades de neuronas motoras, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs) , esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial, meningoencefalitis viral, trastornos autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (MS) , lesiones isquémicas /hipóxicas agudas, infarto, traumatismo del SNC, traumatismo de la cabeza, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia microangiopática, la enfermedad de Binswanger, (Leucoaraiosis) , degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear, demencia relacionada con el SIDA, retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil tremor/ataxia (FXTAS) , Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP) , degeneración estriadonigral (SND) , degeneración olivopontocerebeloso (OPCD) , síndrome de Shy Drager (SDS) .

Influir en los niveles de TGF-betal Regulación hacia arriba de TGF-betal y sus efectos Muchos estudios intentaron aumentar los niveles de TGF-beta para fines neuroprotectivos o inmunoreguladores . Estudios de agonistas han demostrado que TGF-betal reduce la muerte de células neuronales y la extensión de infarto siguiendo la occlusión media de arterias cerebrales (middle cerebral artery occlusion; MCAO) , mientras que al revés, estudios de antagonistas han mostrado que la muerte de células neuronales y la extensión del infarto después de MCAO están más aumentadas y así se ha supuesto que TGF-betal desempeña un papel importante en la isquemia cerebral. Trabajos recientes con la sobrexpresión de TGF-betal mediada por adenovirus in vivo en ratones además ha implicado un papel neuroprotectivo para TGF-betal en la isquemia cerebral, como lo ha demostrado una reducción de la muerte de células neuronales, de la extensión de infarto y de las consecuencias neurológicas. Adicionalmente numerosos estudios in vitro han documentado la capacidad neuroprotectiva de TGF-betal en neuronas de una variedad de especies, incluyendo ratas, ratones, pollos y seres humanos. De interés significativo, se ha mostrado que TGF-betal es protectivo contra una gran variedad de agentes/insultos que inducen la muerte, incluyendo hipoxía/isquemia, excitotoxicidad de glutamato, daño beta-amiloide, oxidativo y virus de la inmunodeficiencia humana. El efecto neuroprotectivo de TGF-betal se ha relacionado con su capacidad de mantener el potencial de la membrana mitocondrial, de estabilizar la homeostasia de Ca2+, de aumentar la expresión de las proteínas anti-apoptóticos Bcl-2 y Bcl-xl, de inhibir la activación de la caspasa-3 y de inducir el inhibidor-1 del activador plasminógeno.

El uso de TGF-beta para la inmunomodulacíón en seres humanos está gravemente limitada por razón de su toxicidad, incluyendo estimulación excesiva de producción de matriz, nefrotoxicidad y otros efectos detrimentales . TGF-beta tiene potencial oncogénico y ha sido implicado en inglomerulopatías, fibrosis pulmonar, esclerodermia y en el síndrome crónico del injerto contra el huésped. Adicionalmente, mientras que TGFbeta es una citoquina inmunosupresiva muy poderosa, múltiples líneas de evidencia indican que una estimulación crónica de la expresión de TGFbeta - relacionado con enfermedades o en modelos de animales transgénicos - pueden paradójicamente llevar a o aumentar la inflamación autoinmune.

Nuestras conclusions principales son que el mismo TGF-ß cuyos efectos neuroprotectivos sobre el SNC arriba mencionado se han descrito, es la molécula principal reguladora negativa de la reparación de células madres del SNC en fisiología y en casi toda patología del SNC : TGF-ß - producido por células microgliales (sea a niveles fisiológicos bajos o a niveles más altos como respuesta a una enfermedad) , penetra a través de la matriz intercelular hacia adentro el líquido cerebroespinal. Aquí, puede interagir libremente y directamente con TGF-RII y TGF-RI altamente regulados y expresados sobre la población de células precursoras/madres del SNC en la zona subependimal de la capa de células que contiene progenitores o posiblemente otras zonas de neoformación de células madres del SNC. Las consecuencias consisten en una regulación negativa, resultando en una neoformación baja de células madres en el caso de niveles altas de TGF-ß del LCE y viceversa. Fuera de lo común y más sorprendemente, el nivel extremamente alto de la expresión y de la actividad de TGF-RII está localizado en el sitio de la proliferación de células precursoras/madres, en nuestros experimentos, la ZSV (zona subventricular, SVZ, subventricular zone) o el hipocampo. Fuera de lo común es también la transmisión de la señal a través de una solución de tampón, así como por ejemplo el líquido cerebroespinal (LCE) . Por esa razón, es un circulo regulatorio completo, donde regulación fisiológica y patológica son muy similares, pero solamente varian en cuanto a la intensidad (en otras palabras: el nivel de TGF-ß en el LCE, y el nivel de la expresión de TGF-R en las células de destino) . El fenotipo individual de la patología de una enfermedad se caracteriza por cambios muy diversos, así como deficiencias genéticas (por ejemplo sinucleínopatias, dismutasa superóxida, mutaciones, trastornos de repetición de trinucleótidos) o traumatismo, hipoxia, enfermedades vasculares o inflamación o envejecimiento del SNC. El ejecutor de la patología de las enfermedas, sin embargo, siempre es el TGF-ß producido por una población de células microgliales/macrófagos : Por un lado, es neuroprotectivo y inmunosupresivo, ayuda a frenar el daño inflamatorio agudo de la parencima y la pérdida neuronal posiblemente causada por la patología de la enfermedad. Indirectamente - como una cabeza de Jano - la misma molécula impide la reparación del daño en el SNC por sus propias células madres/precursoras en que influye en el bucle de TGF- ß - TGF-R en el nivel de células precursoras o madres, por lo que considerablemente suprime la proliferación de células madres. En este caso, como células madres no se deberían considerar solamente las células derivadas de células precursoras desde adentro del SNC, sino también se deberían considerar las células precursoras/madres que intentan invadir la parencima del SNC desde los vasos, respectivamente la médula ósea. Esto también quiere decir que mediante disminución de los niveles de TGF-ß en la parencima, los efectos neuroprotectivos/inmunosupresivos sobre el SNC se destrozarían, lo que llevaría a un daño grave y agudo por causa de inflamación y/ apoptosis directa neuronal.

Una intervención local en el nivel de TGF-R por esa razón parece ser la única vía para alcanzar una intervención estable en favor de la reparación que no pone en peligro los efectos beneficíales de TGF-ß para el cerebro. Así, la presente invención se refiere a oligonucleótidos influyendo en la actividad biológica de TGF-betal sobre el acervo de células precursoras/madres que expresa el TGF-R. Dichos oligonucleótidos o formulaciones farmacéuticas que incluyen por lo menos un de dichos oligonucleótidos son útiles para la diagnosis/profilaxis/prevención o el tratamiento de una enfermedad, en donde la neurogénesis o neuroregeneración tiene un efecto beneficioso. También son útiles en la prevención terapéutica (por ejemplo después de un infarto o una herida de la cabeza) - como mostrado en experimentos -antes de que los mecanismos abajo descritos sean efectivos.

El término de "influir" como utilizado aquí quiere decir modular, preferiblemente reducir o eliminar, la actividad biológica de TGF-R y/o TGF-Rn o su expresión. La modulación de la actividad biológica puede alcanzarse por interacción directa o enlace de un compuesto de TGF-R, preferiblemente, TGF-Rn o por interacción indirecta, por ejemplo, por interacción con un compuesto que está asociado con la actividad biológica de TGF-R y/o TGF-RIX. Compuestos apropiados que actúan como agentes que apuntan TGF-betaRx, Rii-Rin, -Rui/ o su transducción de señales para influir en este circuito regulatorio con el objetivo de mejorar la neuroregeneración o de aumentar el reclutamiento de células neuronales/hematopoéticos madres o precursoras hacia el SNC, incluyendo todos tipos de trasplante local o sistémico (por ejemplo propagación ex vivo, células alogénicas) se enumerarán aquí abajo : (a) Plásmidos, vectores o virus naturales/sintéticos/mutados, olignonucléotidos de diferentes tipos de modificación (por ejemplo PTO, LNA, 2'F-ANA, complejos de proteínas- nucleótidos, ARNi, ARNip o micro miRNA, metilmetoxi-, fosforoamidatados, ANP, morfolino, fosforoamidato, ciclohexen (CeNA) , gapmers, ribozimas, aptameros, CpG- óligos, ADN-zimas, riboswitches, o lípidos, o lípidos que contienen moléculas, (b) péptidos, complejos de péptidos, incluyendo todos tipos de enlazadores, (c) moléculas pequeñas, modificadores de vehículos o caveoli, (d) modificadores del aparato de golgi, (e) anticuerpos y sus derivados, en especial quimeras, fragmentos Fab, fragmentos Fc, o (f) portadores, liposomas, nanopartículas, complejos, o cualquier sistema de entrega que contiene los constructos arriba mencionados, pueden utilizarse para apuntar el circuito arriba mencionado para restaurar o mejorar la neuroregeneración .

Sin embargo, entre los agentes arriba mencionados, más se prefieren oligonucleótidos antisentido, por que influyen en la formación de TGF-R o TGF-RIS y en una fase muy temprana. Las ventajas principales de estas moléculas son su especificidad en cuanto al destino extremamente alta, combinada con su tolerancia sistémica y local extremamente buena; son muy apropiadas para una aplicación local hacia adentro del SNC, sea hacia adentro de la parecima o el espacio LCE. Adicionalmente, son muy estables y asi pueden aplicarse fácilmente con un sistema implantado de bomba. También debe mencionarse su rentabilidad. Así, realizacions preferidas de la presente invención, el compuesto útil para influir en la expresión del gene que codifica TGF-R o TGF-Rn, es un oligonucleótido antisentido.

La generación de oligonucleótidos apropriados incluye la determinación de un sitio o de sitios dentro del gen TGF-R o TGF-Rn para interacción antisentido que debe tener lugar de mode que el efecto deseado, por ejemplo, la inhibición de la expression de la proteína, pueda resultar. ün sitio preferido intragénico es (a) la región alrededor del codón de la iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierta (ORF, open regarding frame) del gen o (b) la región del ARNm que es un "bulto" o un "bucle", es decir, no forma parte de una estructura secundaria. Cuando se han identificado un o más sitios de destino, oligonucleótidos se eligen que son complementarios al destino de manera suficiente para alcanzar el efecto deseado, es decir, que hibridizan suficientemente bien y con específidad suficiente.

Así la presente invención se refiere a oligonucleótidos antisentido que tienen una subsecuencia del NIS 1 o del número de identificación de secuencia 2 o del NIS 94 o del NIS 95 o del NIS 96 que comprende 8 a 50 nucleobases y miméticos de éstos. Dichos oligonucleótidos representan una parte del NIS 1 o 2 o del NIS 94 a 96 con 8 a 50 bases nucleótidas. Además oligonucleótidos que comprenden 8 a 50 nuleobases no deben tener una subsecuencia exacta del NIS 1 o 2 o NIS 94 a 96. Es suficiente si los oligonucleótidos antisentido sean por lo menos idénticos a un 80%, preferiblemente a un 84%, más preferiblement a un 88%, y más preferiblemente a un 92% a una subsecuencia que se puede encontrar en una de NIS 1 o 2 o NIS 94 o 95 o 96. Oligonucleótidos preferidos tienen una secuencia que es por lo menos idéntica a un 80% a una subsecuencia del NIS 1 o 2 o 94 o 96 que comprende 8 a 50 nucleobases, en donde dicha secuencia es capaz de hibridizarse de manera suficiente con la región alrededor del codón de la iniciación o de la terminación de la traducción del marco de lectura abierto del gen codificando el TGF-R o TGF-RII, o una región del ARNm codificando TGF-R o TGF-RII que es un "bucle" o un "bulto" y que no es parte de una estructura secundaria. Esto quiere decir que estos oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que es por lo menos complementaria a un 80% a la región correspondiente del gen que codifica TGF-R o TGF-Ru, o preferiblemente tienen una secuencia que es por lo menos a un 80% complementaria con (a) la región alrededor del codón de la iniciación o de la terminación de la traducción del marco de lectura abierta del gene que codifica TGF-R o TGF-RIS, o (b) la región del mARN que codifica TGF-R o TGF-Rn, que es un "bulto" o un "bucle", es decir, no forma parte de una estructura secundaria.

Se prefieren oligunucleótidos antisentido de 8 a 50, preferiblemente 15 a 25 nucleobases, que son capaces de hibridizar suficientemente con la región alrededor del codón de la iniciacón o de la terminación de la traducción del marco de lectura abierto del gene que codifica TGF-R o TGF-Rn, o una región de la ARNm que codifica TGF-R o TGF-RIX que es un "bulto" o un "bucle" y que no es parte de una estructura secundaria.

Se prefieren las siguientes secuencias alargadas del NIS 3 que pueden representarse por la siguiente fórmula general: 5 ' -XCAGCCCCCGACCCATGZ-3 ' en donde X se elige del grupo que comprende los siguientes oligonucleótidos : ACAGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, CAGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, AGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, ACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, CGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, ATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, TGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, TGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, CAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, AGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GCGGCCACAGGCCCCTGAG, CGGCCACAGGCCCCTGAG, GGCCACAGGCCCCTGAG, GCCACAGGCCCCTGAG, CCACAGGCCCCTGAG, CACAGGCCCCTGAG, ACAGGCCCCTGAG, CAGGCCCCTGAG, AGGCCCCTGAG, GGCCCCTGAG, GCCCCTGAG, CCCCTGAG, CCCTGAG, CCTGAG, CTGAG, TGAG, GAG, AG, G, y en donde Z se elige del grupo que comprende los siguientes oligonucleótidos : GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCCCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAG, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGA, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCG, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGAC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGA, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAG, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATA, GCAGACCCCGCTGCTCGTCAT, GCAGACCCCGCTGCTCGTCA, GCAGACCCCGCTGCTCGTC, GCAGACCCCGCTGCTCGT, GCAGACCCCGCTGCTCG, GCAGACCCCGCTGCTC, GCAGACCCCGCTGCT, GCAGACCCCGCTGC, GCAGACCCCGCTG, GCAGACCCCGCT, GCAGACCCCGC, GCAGACCCCG, GCAGACCCC, GCAGACCC, GCAGACC, GCAGAC, GCAGA, GCAG, GCA, GC, G, y en donde X y Z juntos no comprenden más de 34 nucleobases y miméticos de las mismas.

Más se prefieren las siguientes secuencias de oligonucleótidos y variantes o miméticos de éstas: NIS 3 5 ' -CAGCCCCCGACCCATG-3 * NIS 4 5 ' -GCTGATGCCTGTCACTTGAA-3 ' NIS 5 5 ' -GCCATGGAGTAGACATCGGT-3 ' NIS 6 5 ' -GCAACAGCTATTGGGATGGT-3 ' NIS 7 5 ' -GTGCAGGGGAAAGATGAAAA-3 ' NIS 8 5 ' -GTATCAGCATGCCCTACGGT-3 ' NIS 9 5 '-GGATCCAGATTTTCCTGCAA-3 ' NIS 10 5 ' -GGAGAAGCAGCATCTTCCAG-3 ' NIS 11 5 ' -GAGCTCTTGAGGTCCCTGTG-3 ' NIS 12 5 ' -GAGACCTTCCACCATCCAAA-3 ' NIS 13 5 ' -TAGCTGGCTGTGAGACATGG-3 ' NIS 14 5 ' -TTTTGAAACGCTGTGCTGAC-3 ' NIS 15 5 ' -TCAGCCAGTATTGTTTCCCC-3 ' NIS 16 5 * -TCACACAGGCAGCAGGTTAG-3 ' NIS 17 5 ' -TCAGGAATCTTCTCCTCCGA-3 ' NIS 18 5 ' -TGGTAGTGTTTAGGGAGCCG-3 ' NIS 19 5 ' -TATCCCCACAGCTTACAGGG-3 ' NIS 20 5 '-AGCCTCTTTCCTCATGCAAA-3 ' NIS 21 5 ' -ATGTCATTTCCCAGAGCACC-3 ' NIS 22 5 ' -AGGAATCTTCTCCTCCGAGC-3 ' NIS 23 5 ' -AGCCATGGAGTAGACATCGG-3 ' NIS 24 5 ' -ATGCTACTGCAGCCACACTG-3 ' NIS 25 5 ' -CCTTCTCTGCTTGGTTCTGG-3 ' NIS 26 5 ' -CCAGGAGAAATAAGGGCACA-3 ' NIS 27 5 ' -CAGCAGCTCTGTGTTGTGGT-3 ' NIS 28 5 ' -CCCACTGTTAGCCAGGTCAT-3 ' NIS 29 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGCAGACCC-3 ' NIS 30 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGCAGACC-3 ' NIS 31 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGCAGAC-3 ' NIS 32 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGCAGA-3 ' NIS 33 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGCAG-3 ' NIS 34 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGCA-3 ' NIS 35 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGC-3 ' 10 NIS 36 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 37 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATGGCAGACC-3 ' NIS 38 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATGGCAGAC-3 ' NIS 39 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATGGCAGA-3 ' 15 NIS 40 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATGGCAG-3 ' NIS 41 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATGGCA-3 ' NIS 42 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATGGC-3 ' NIS 43 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 44 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATG-3 ' 20 NIS 45 5 ' -AGCAGCCCCCGACCCATGGCAGAC-3 ' NIS 46 5 * -AGCAGCCCCCGACCCATGGCAGA-3 ' NIS 47 5 ' -AGCAGCCCCCGACCCATGGCAG-3 ' NIS 48 5 ' -AGCAGCCCCCGACCCATGGCA-3 ' 25 NIS 49 5 ' -AGCAGCCCCCGACCCATGGC-3 ' NIS 50 5 ' -AGCAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 51 5 ' -AGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' NIS 52 5 ' -GAGCAGCCCCCGACCCATGGCAGA-3 ' 30 NIS 53 5 ' -GAGCAGCCCCCGACCCATGGCAG-3 ' NIS 54 5 ' -GAGCAGCCCCCGACCCATGGCA-3 ' NIS 55 5 ' -GAGCAGCCCCCGACCCATGGC-3 ' NIS 56 5 ' -GAGCAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 57 5 ' -GAGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' NIS 58 5 ' -TGAGCAGCCCCCGACCCATGGCAG-3 ' NIS 59 5 ' -TGAGCAGCCCCCGACCCATGGCA-3 ' NIS 60 5 ' -TGAGCAGCCCCCGACCCATGGC-3 ' NIS 61 5 ' -TGAGCAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 62 5 ' -TGAGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' NIS 63 5 ' -CTGAGCAGCCCCCGACCCATGGCA-3 ' NIS 64 5 ' -CTGAGCAGCCCCCGACCCATGGC-3 ' NIS 65 5 ' -CTGAGCAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 66 5 ' -CTGAGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' NIS 67 5 ' -CCTGAGCAGCCCCCGACCCATGGC-3 ' NIS 68 5 ' -CCTGAGCAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 69 5 ' -CCTGAGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' NIS 70: 5 ' -CCCTGAGCAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 71: 5 ' -CCCTGAGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' NIS 72: 5 ' -CCCCTGAGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' Aún más se prefieren las siguientes secuencias de oligonucleótidos así como variantes y miméticos de éstas NIS 33 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGCAG-3 ' NIS 34 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGCA-3 ' NIS 35 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGC-3 ' NIS 36 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 41 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATGGCA-3 ' NIS 42 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATGGC-3 ' NIS 43 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 44 5 ' -GCAGCCCCCGACCCATG-3 * NIS 49 5 ' -AGCAGCCCCCGACCCATGGC-3 ' NIS 50 5 ' -AGCAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 51 5 ' -AGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' NIS 56 5 ' -GAGCAGCCCCCGACCCATGG-3 ' NIS 57 5 ' -GAGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' NIS 62 5 ' -TGAGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' NIS 73 5' -ATGTGAAGATGGGCAAGACC -3' NIS 74 5' -ATCTCCATGTGAAGATGGGC-3' NIS 75 5' -AACGGCCTATCTCGAGGAAT-3' NIS 76 5' -AACATCGTCGAGCAATTTCC--3' NIS 77 5' -AATCCAACTCCTTTGCCCTT--3' NIS 78 5' -AAACCTGAGCCAGAACCTGA--3' NIS 79 5' -AGGGCGATCTAATGAAGGGT--3' NIS 80 5' -AGTGCACAGAAAGGACCCAC-•3' NIS 81 5' -ACACTGGTCCAGCAATGACA--3' NIS 82 5' -TTCCTGTTGACTGAGTTGCG-•3' NIS 83 5' -CACTCTGTGGTTTGGAGCAA-•3' NIS 84 5' -CAAGGCCAGGTGATGACTTT-3' NIS 85 5' -CACACTGGTCCAGCAATGAC-•3' NIS 86 5' -CTGACACCAACCAGAGCTGA-3' NIS 87 5' -CTCTGCCATCTGTTTGGGAT-3' NIS 88 5' -TCAAAAAGGGATCCATGCTC-3' NIS 89 5'--TGACACCAACCAGAGCTGAG-3' NIS 90 5*--TGATGCCTTCCTGTTGACTG-3' NIS 91 5'--TTCCTGTTGACTGAGTTGCG-3' NIS 92 5'--TTCTCCAAATCGACCTTTGC-3' NIS 93 5'--GGAGAGTTCAGGCAAAGCTG-3' No son incluidos en el ámbito de las reivindicaciones de la presente sustancia las dos siguientes secuencias conocidas : 5 ' -GATCTTGACTGCCACTGTCTC-3 ' (J. Clin. Endocrinology & Metabolism 2003, 88(10), 4967-4976) y 5 ' -CATGGCAGCCCCCGTC-3 ' (Developmental Biology 1996, 180, 242 - 257) .

Particularmente se prefiere la secuencia NIS 3: 5'- CAGCCCCCGACCCATG-3 ' .

Por consiguiente, la presente invención se refiere también a secuencias que son muy relacionadas con cualquiera de NIS 3 o NIS 93. A dichas secuencias se las denominará « variantes » aquí. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser modificados de múltiples maneras diferentes. Modificaciones dentro de la cadena principal (backbone) son posibles y se refieren a oligonucleótidos en donde los átomos fósforos son parcialmente o completamente sustituidos por otros átomos en su cadena principal internucleósida . Oligonucleótidos modificados preferidos incluyen por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriéster, aminoalquil fosfotriésteres, metil, etil y C3-C?o-alquil fosfonatos incluyendo 3' -alquilen y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamitdatos incluyendo 3' -amino-fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3' -5' normales, análogos 2' -5' -enlazados de éstos, y los que tienen polaridad invertida, en donde las parejas adyacentes de unidades de nucleósidos están enlazadas 3 '-5' a 5 '-3' o 2 '-5' a 5 '-2'. Diferentes sales, sales mezcladas y ácidos libres de los mismos también son incluidos.

También se prefieren variants de NIS 3 a NIS 93 en donde en el extremo terminal 3' y/o en el extremo terminal 5' se añaden 1, 2, 3, 4, o 5 otras nucleobases. Tales otras nucleobases son preferiblemente las cinco nucleobases en las NIS 1, 2, 94 o 96 que se añaden directamente delante de o detrás de las secuencias respectivas. Además, dichas variantes pueden tener 1, 2, 3, o 4 cambios de nucleobases, es decir, dentro de dichas variantes preferidas, un, dos, tres o cuatro nucleótidos pueden ser sustituidos por otra nucleobase. Se debería poner énfasis en el hecho de que estas variantes pueden también contener cualquier de las modificaciones de la cadena prinicpal o de la base o del grupo azúcar divulgadas aquí, tales como cadenas principales de fosforotionato .

Cadenas principales modificadas de oligonucleótidos preferidas que no incluyen un átomo fósforo tienen estructuras que se forman por enlaces internucleósidos de alquilos de cadena corta o de cicloalquil, de enlaces internucleósidos de heteroátomos y alquil o cicloalquil. Se incluyen las que tienen enlaces morfolino (formados en parte desde el grupo de azúcar del nucleósido) ; cadenas principales de siloxano, cadenas principales de sulfuro, de sulfóxido y de sulfona; cadenas principales de formacetil y tioformacetil; cadenas principales de metileno formacetil y de tioformacetil, estructuras que contienen alqueno, estructuras de sulfamato; estructuras de metilenoimino y metilenohidrazino; estructuras de sulfonato y de sulfonamido; estructuras de amidas, mezclas de los tipos arriba mencionados de estructuras y otras estructuras en las que se mezclan partes de compuestos de N, 0, S, P, y CH2.

Otras realizaciones preferidas de la presente invención comprenden oligonucleótidos con estructuras de fosforotioato o heteroátomos, y en particular con -CH2-NH-0-CH2-, -CH2-N (CH3) -0-CH2- (conocidas como un metileno (metilimino) o estructuras MMl), -CH2-0-N (CH3) -CH2-, -CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2-y -O-N (CH3) -CH2-CH2- (en donde la cadena principal natural de fosfodiéster está representada como 0-P-0-CH2-) . También oligonucleótidos que tienen grupos de morfolino en su cadena principal o que tienen una cadena principal de morfolino o que tienen una cadena principal de aminoalquilamido se prefieren (véase más abajo) . Oligonucleótidos pueden también tener miméticos de azúcar tales como grupos de ciclobutil en vez del azúcar de pentofuranosil .

P B se refiere al grupo de la base tal como el grupo de purina o de pirimidina que pueden ser derivatizados. Otra modificación de los oligonucleótidos de la presente invención implica el proceso de enlazar de manera química a los oligonucleótidos un o más grupos o conjugados que aumentan la actividad, la distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Oligonucleótidos modificados pueden también contener un o más grupos de azúcar sustituidos o modificados. Oligonucleótidos preferidos comprenden un de los siguientes grupos en la posición 2 ' : -OH, -F, -O-alquil, -S-alquil, -N-alquil, -O-alquenil, -S-alquenil, -N-alquenil, -O-alquinil, -S-alquinil, -N-alquinil, -0-alquil-O-alquil, en donde el alquil, alquenil y alquinil pueden ser Ci a Cío alquil sustituido o no sustituido o C2 a Cío alquenil y C2 a Cío alquinil. ün grupo de azúcar modificado particularmente preferido es un grupo de azúcar de 2 ' -O-metoxietil (2 '-OCH2CH2OCH3, también conocido como 2'-0- (2-metoxietoxi) o 2'-M0E) y 2 ' -dimetilaminooxietoxi tal como 0(CH2)2ON(CH3) (conocido como 2'-DMA0E). También se prefieren particularmente O [ (CH2) n0]mCH3, 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2, 0 (CH2) n0N [ (CH2) n CH3] , en donde n y m cada uno son independientemente del otro números enteros de 1 a 10. Otras modificaciones preferidas incluyen 2' -metoxi, 2 ' -aminopropoxi y 2'-fluoro. Oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los grupos siguientes en la posición 2 ' : -OCH3, -OC2H5, -OC3H7, -0-cyclo-C3H5, OCH(CH3)2, -OC(CH3)3, -OC4H9, -OPh, -OCH2-Ph, -N02, -F, -Cl, Br, -I, -N3, -CN, -OCN, -NCO, -SCN, -NCS, -COCH3, -COC2H5, -COC3H7, CO-ciclo-C3H5, -COCH(CH3)2, -CF3 -SH, -SCH3, -SC2H5, -SC3H7, -S-ciclo-C3H5, -SOCH3, -SOC2H5, -SOC3H7, -SO-cyclo-C3H5, -S02CH3, -S02C2H5, -S02C3H7, -S02-ciclo-C3H5, -NH2, -NHCH3, -NHC2H5, -NHC3H7, -NH-ciclo-C3H5, -N(CH3)2, -N(C2H5)2, -N(C3H7)2, -N (ciclo-C3H5) 2, N[CH(CH3)2]2-CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2, -C4H9, -CH2- CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5 -C(CH3)3, -C5H11, -CH (CH3) -C3H7, -CH2-CH(CH3)-C2H5, -CH(CH3)-CH(CH3)2, -C (CH3) 2-C2H5, -CH2- C(CH3)3, -CH(C2H5)2, -C2H4-CH(CH3)2, -C6H?3, -C3H6-CH (CH3) 2, -C2H4-CH(CH3)-C2H5, -CH(CH3)-C4H9, -CH2-CH (CH3) -C3H7, ~C2H4- C(CH3)3, -CH(CH3)-CH2-CH(CH3)2, -CH (CH3) -CH (CH3) -C2H5, ~CH2- CH(CH3)-CH(CH3)2, -CH2-C(CH3)2-C2H5, -C (CH3) 2-C3H7, C(CH3)2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C(CH3)3, C7-C10 alquil, C?-C?0 alquil sustituido, alquilaril, arilalquil, O-C1-C10 alquil, O-arilalquil, heterocicloalquil, heterocicloalquil, amnoalquilamino, polialquilamino, silil sustituido, un grupo que se separa del ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de los oligonucleótidos, o sustituyentes que tienen propiedades similares. También se prefieren las deoxinucleobases (deoxy nucleobases) .

Modificaciones similares también pueden hacerse en otras posiciones en el nucleótido, particularmente en la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal o en oligonucleótidos 2' -5' -enlazados en la posición 5' del nucleótido 5'-terminal .

Modificaciones preferidas pueden representarse por el siguiente fragmento de estructura: en donde R representa cualquiera de los sustituyentes arriba mencionados para posición 2' y especialmente -H, -F, -OH, -NH2, -OCH3, -OCH2CH2OCH3, X y X' son independientemente el uno del otro -O-, -NH-, - S-, -CH2-, e Y representa -0~, -S~, -N(CH3)2, -OCH3, -SCH3. Más se prefieren variantes en donde X e X' representan oxígeno e Y representa azufre.

Además, oligonucléotidos puramente diastereoméricos o miméticos o variantes de los mismos son preferidos. En especial se prefieren Sp- y Rp-diastereomeros : Diastereomero Rp Diastereomero Sp Más se prefieren las secuencias NIS 3 a NIS 93, y en especial NIS 3, en donde una o más modificaciones que son divulgadas aquí son presentes . Se prefieren los fracciones de fosforotioato en la cadena principal o cadenas principales completas de fosforotioato y dentro de dichos fosforotioatos, los diastereomeros Rp y Sp se prefieren.

Los oligonucleótidos de la presente invención puede también incluir sustituciones de nucleobases. Las nucleobases son las cuatros bases estándar, la adenina (A) , la timina (T) , la guanina (G) y la citosina (C) . Nucleobases modificados incluyen otras nucleobases sintéticos y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquil de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquil de adenina y guanina, uracilo (U) , 6-carboxiuracilo, N6-metil-adenina, 5-halouracilo, 5-halocitosina, 5-propinil uracilo, 5-propinil citosina, 6-azo uracilo, 6-azo citosina, 6-azo timina, 5-uracilo (seudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo-, 8-amino-, 8-tiol-, 8-tioalquil, 8-hidroxil y otros adeninas y guaninas 8-sustituidos ; 5-halo- en particular 5-bromo-, 5- trifluorometil- y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina ; 7-metiladenina, 8-azaguanina, 8-azaadenina, 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, 3-deazaguanina y 3- deazaadenina, 2-thiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina etc., en donde las sustituciones 5-metilcitosina se prefieren como estás modificaciones han mostrado que aumentan la estabilidad de ácido nucleico y de la hélice doble.

Se prefieren variantes que tienen la secuencia de cualquiera de las NIS 3 a NIS 93, en donde una, dos tres o cuatro nucleobases son sustituidas por otras nucleobases o nucleobases químicamente modificadas . Una variante debe referirse a una secuencia de NIS 3 a NIS 93, en donde una a cuatro nucleobases son, por ejemplo, sustituidas por uracilo (U) , 5-halouracilo, 5-metilcitosina, y/o N6-metiladenina.

Particularmente se prefieren variantes del NIS 3, en donde una, dos o tres nucleobases son sustituidas por los grupos arriba mencionados .

"Oligonucleótido" se refiere a un olígómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o de ácido desoxirribonucléico (ADN) o miméticos o variantes de éstos. Este término incluye oligonucleótidos que se componen de nucleobases que ocurren naturalmente, azúcares y enlaces internucleósidos (de la cadena principal) así como oligonucleótidos que tienen fracciones que no ocurren naturalmente que funcionan de manera similar. A estos oligonucleótidos modificados o sustituidos se las prefiere a las formas naturales a causa de propiedades deseables tales como, por ejemplo, absorbción celular aumentada, afinidad aumentada para apuntar el ácido nucleico y estabilidad aumentada en la presencia de nucleasas. Mientras oligonucleótidos antisentido son formas preferidas del compuesto antisentido, la presente invención comprende otros compuestos antisentido oligoméricos, incluyendo pero no limitado a miméticos oligonucleótidos tales como arriba descritos. Los compuestos antisentido según esta invención comprenden de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleóbases (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleósidos enlazados) , preferiblemente 9 - 42, 10 - 36, 11 - 32, 12 - 30, 13 - 28, 14 - 26, y más preferiblemente 15 - 25 nucleóbases.

En particular, compuestos antisentido preferido son oligonucleótidos antisentido, aún más preferible son los que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleóbases. Compuestos antisentido incluyen ribozimas, secuencias guía externa (EGS, external guide sequences) , oligonucleótidos (oligozimas) , y otros ARNs cortos catalíticos o oligonucleótidos catalíticos que hibridizan con el ácido nucleico de destino y inhiben su expresión.

El término de "sales" se refiere a sales fisiológicamente y/o farmacéuticamente aceptables de los compuestos, en especial los oligonucleótidos antisentido de la presente invención. Sales de adición de base farmacéuticamente aceptables se forman con bases inorgánicas son bases. Ejemplos para bases orgánicas y inorgánicas apropiadas son bases derivadas de iones de metales, por ejemplo aluminio, iones de metales alcalinos tales como sodio o potasio, iones de metales alcalinotérreo tales como calcio o magnesio, o un ion de una sal amina, hidróxidos, carbonatos o bicarbonatos de alcalinos o alcalinotérreos. Ejemplos incluyen LiOH, NaOH, KOH, NH4OH acuoso, carbonato potásico, amoníaco y bicarbonato sódico, sal de amonio, aminas primarias, secundarias y terciarias, tales como por ejemplo hidróxido de tetraalquilamonio, alquilaminas inferiores tales como metilamina, t-butilamina, procaína, atanolamina, arilalquilaminas tales como dibenzilamina y N,N-dibenziletilenodiamina, alquilpiperidinas inferiores tales como N-etilpiperidina, cicloalquilaminas tales como ciciohexilamina o diciclohexilamina, morfolina, glucamina, N-metil- y N,N-dimetilglucamina, 1-adamantylamina, benzatina, o sales derivadas de aminoáciods tales como arginina, lisina, ornitina, o amidas de aminoácidos originalmente neutras o ácidos, cloroprocaína, colina, procaína o otros.

Los compuestos de la invención que son básicos pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos orgánicos y inorgánicos. Ejemplos de ácidos apropiados para tal formación de sales mediante adición de sales son el ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico , ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido salicílico, ácido p-aminosalicílico, ácido málico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido sulfónico, ácido fosfónico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido glucónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido hidroximaléico, ácido pirúvico, ácido fenilacético, ácido benzoico, ácido p-aminobenzóico, ácido p- hidroxibenzóico, ácido metanosulfónico, etanosulfónico, ácido nitroso , ácido hidroxietanosulfónico, ácido etilenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido naftilsulfónico, ácido sulfanílico, ácido camforsulfónico, ácido china, ácido mandélico, ácido o-metilmandélico, ácido de hidrógeno benzenosulfónico, ácido pícrico, ácido adípico, ácido D-o-toliltartárico, ácido tartrónico, ácido a-toluico, ácido (o, m, p)-toluico, ácido sulfónico de naftilamina y otros ácidos minerales y carboxílicos bien conocidos a los expertos en la técnica. Las sales se preparan de la siguiente manera: se contacta la forma de base libre con una cantidad suficiente del ácido deseado para producir una sal según la manera conocida.

Las formas de base libre pueden regenerarse mediante tratamiento de la sal con una solución básica acuosa diluida apropiada tal como un hidróxido sódico diluido acuoso, carbonato potásico, bicarbonato de amoníaco y de sodio. Las formas de bases libres son diferentes sus sales correspondientes en cuanto a propiedades físicas particulares, tal como solubilidad en disolventes polares, pero las sales son por lo más equivalentes a sus formas correspondientes de bases libres para conseguir los fines de esta invención.

Como alternativa, la composición farmacéutica de la invención contiene un vector que permite transcribir un oligonucleótido antisentido de la invención, por ejemplo dentro de un huésped mamífero. Preferiblemente, tal vector es un vector que es útil para terapia génica. Vectores preferidos útiles para terapia génica son vectores virales, por ejemplo adenovirus, baculovirus, virus herpes, virus vaccinia, o más preferiblemente un virus ARN tal como un retrovirus . Aún más preferiblemente, el vectro retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Ejemplos de tales vectores retrovirales que pueden utilizarse en la presente invención son: Virus de leucemia murina de Moloney (MoMuLV) , virus de sarcoma murina de Harvey (HaMuSV) , virus de tumor mamario murino (MuMTV) y virus de sarcoma de Rous (RSV) . Más preferiblemente, un vector retroviral no humano de primates se utiliza, tal como virus de leucemia de mono de gibón (GaLV) , que puede utilizarse en un campo más extenso de huéspedes en comparación con vectores murinos. Como retroviruses recombinantes son defectivos, es necesario que haya algo para producir partículas infecciosas. Eso puede consistir en la utilización de líneas de células coadyuvantes que contienen plásmidos que codifican todas los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias regulatorias dentro del LTR. Líneas de células adyuvantes apropiadas son bien conocidos a los expertos en la técnica. Dichos vectores pueden adicionalmente contener un gen que codifica un marcador de manera que se pueden identificar las células transducidas. Además, los vectores retrovirales pueden ser modificados de tal modo que son específicos de sus destinos. Esto puede lograrse por ejemplo mediante introducción de un polinucleótido que codifica un azúcar, de un glicolípido o una proteína, preferiblemente un anticuerpo. Los expertos en la técnica conocen otros métodos para generar vectores específicos de sus destinos. Otros vectores apropiados y métodos para la terapia génica in vitro o in vivo están descritos en la literatura y están conocidos por los expertos en la técnica, véase por ejemplo WO 94/29469 o WO 97/00957. Para que la expresión solamente se realice en el órgano de destino, por ejemplo del tejido del cerebro, las secuencias ADN para la transcripción de los oligonucleótidos antisentido pueden ser enlazadas con un promotor específico del tejido respectivo y utilizadas para la terapia génica.

En el seno de una estructura de oligonucleótidos, a los grupos de fosfotato se los refiere normalmente como formando la cadena principal internucleósida del oligonucleótido. El enlace normal o cadena principal de ARN y ADN es un enlace 3' a 5' fosfodiéster. Ejemplos específicos de compuestos o variantes antisentido preferidos útiles en la presente invención incluyen oligonucleótidos que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleósidos no naturales . Oligonucleótidos que tienen cadenas principales modificadas incluyen oligonucleótidos que tienen un átomo fósforo en la cadena principal y los que no tienen un átomo fósforo en la cadena principal. Cadenas principales de oligonucleótidos modificados que pueden resultar en una estabilidad aumentada son conocidos al experto en la técnica, tal modificación preferiblemente es un enlace fosforotionato o la sustitución de un o más grupos de fosfato (grupos de ácido fosfórico) por un grupo de fosfonato (ácido fosfónico) o por un grupo de sulfato (ácido sulfúrico) o por un grupo de sulfonato (ácido sulfónico) o por un sulfóxido. Un mimético de oligonucleótido preferido es un mimético de oligonucléotido que ha demostrado sus propiedades excelentes de hibridización y al que se refiere como ácido nucleico peptídico (ANP) En compuestos ANP, la cadena principal de azúcar de un oligonucleótido está sustituida por una cadena principal que contiene amidas, en particular por una cadena principal de aminoetilglicina. A las nucleobases se las retiene y se las enlaza directamente o indirectamente a átomos de aza nitrógeno de la porción de amida de la cadena principal (véase por ejemplo Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497-1500.) En el contexto de esta invención, el término de "hibridización" significa enlaces por puentes de hidrógeno, que pueden ser enlaces por puentes de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o enlaces revertidos de hidrógeno de Hoogsteen, entre bases complementarias de nucleósidos y nucleótidos. El término "complementario" como se lo utiliza aquí se refiere a la capacidad para formar parejas exactas entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una posición particular de un oligonucleótido es capaz de formar enlaces por puentes de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, el oligonucleótido y la ADN o ARN se consideran complementarios el uno al otro en esta posición. Los oligonucleótidos y el ADN o ARN son complementarios los unos a los otros cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula está ocupado por nucleótidos que pueden formar enlaces por puentes de hidrógeno los unos con los otros. De esa manera, "específicamente hibridizable" y "complementario" son términos que se utilizan para indicar un nivel suficiente de complementaridad o una formación exacta de parejas, de manera que hay formación específica de enlaces entre los oligonucleótidos y el destino ADN o ARN. Está conocido en la técnica que la secuencia de un compuesto antisentido no debe ser complementario a un 100% con la secuencia de su ácido nucleico de destino para ser específicamente hibridizable Un compuesto antisentido es específicamente hibridizable cuando la formación de enlace del compuesto con la molécula de ADN o ARN de destino influye en la función normal del ADN o ARN de destino de tal manera que causa una pérdida de utilidad, y hay un nivel suficiente de complementaridad para impedir formación de enlaces no específica de compuestos antisentido con secuencias que no son las secuencias de destino bajo condiciones en las que formación específica de enlaces se desea, es decir, en el caso de tratamiento terapéutico.

En otros miméticos preferidos de olignucleótidos, el azúcar así como las enlaces internucleósidos, es decir, la cadena principal de las unidades de nucleótidos están sustituidos por grupos nuevos. Las unidades de base se mantienen para hibridización con un compuesto de ácido nucleico de destino apropiado. Se denomina un ejemplo de tal mimético de oligonucleótido del que han demostrado las propiedades excelentes de hibridización con el término de ácido nucleico peptídico (ANP) En compuestos ANP, la cadena principal de azúcar de un oligonucleótido está sustituida por una cadena principal que contiene amidas, en particular por una cadena principal de aminoetilglicina. A las nucleobases se las retiene y se las enlaza directamente o indirectamente con aza nitrógeno de la porción de amida de la cadena principal.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica el proceso de enlazar de manera química con los oligonucleótidos un o más grupos o conjugados que aumentan la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Tales grupos incluyen grupos lípidos tales como un grupo de colesterol, ácido cólico, un tioéter, hexil- S-tritiltiol, a tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo dodecanodiol o residuos undecil, un fosfolípido tal como dihexadecil-rac-glicero o trietilamonio-1, 2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3H-fosfonato, una cadena de poliamino o de polietilenglicol, o ácido acético de adamantina, un grupo de palmitil o un grupo de octadecilamino o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras" en el contexto de esta invención son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos que contienen dos o más regiones quimicamente distintas, en donde toda región se compone de una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Estos oligonucleótidos típicamente contienen por lo menos una región en donde el oligonucleótido está modificado de manera que transmite al oligonucleótido una resistencia a la degradación por nucleasa, captación celular aumentada, y/o afinidad aumentada para formar enlaces del ácido nucleico de destino. Una región adicional del oligonucleótido puede servir de sustrato para enzimas capaces para desdoblar ARN, ADN o híbridos de ARN, ADN. A título de ejemplo, RNasa H es una endonucleasa celular que desdobla la cadena de ARN de una doble hélice de ARN:ADN. Activación de la RNasa H, por esa razón, resulta en el desdoblamiento del destino de ARN, aumentando mucho la eficacia de la inhibición de la expresión de genes que presenta el olignucleótido. Por consiguiente, resultados comparables pueden obtenerse frecuentemente con oligonucleótidos más cortos cuando se utilizan oligonucleótidos quiméricos, comparado con fosforotioato deoxioligonucleótidos que hibridizan con la misma región de destino. Compuestos quiméricos antisentido de la invención pueden formarse como estructuras de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados y/o oligonucleótidos miméticos como arriba descritos. A tales compuestos se les denomina en la técnica con el término de híbridos o gapmers .

En especial, la presente invención se refiere al uso de los oligonucleótidos divulgados aquí o variantes o miméticos de ellos para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, neurotrau atismo, enfermedades neurovasculares y neuroinflamatorios incluyendo enfermedades postinfecciosos . El término "enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias" se refiere a la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) , variación nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD) , la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofia multisistema, demencia, demencia frontemporal, enfermdedas de neuronas motoras, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs), esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial, meningoencefalitis viral, trastornos autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (EM) , lesiones agudas isquémicas/hipóxicas, infarto, traumatismo del SNC, traumatismo de la cabeza, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia microangiopática, la enfermedad de Binswanger, leucoaraiosis, degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear, demencia relacionada con el SIDA, retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil frágil-tremor/ataxia, Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP) , degeneración estriadonigral (SND) , degeneración olivopontocerebeloso (OPCD) , síndrome de Shy Drager (SDS) . De manera más general, la presente invención se refiere al uso de los oligonucleótidos aquí divulgados o variantes o miméticos de ellos para tratar enfermedades asociadas con la señalización regulada hacia arriba o aumentada de TGF-R and/or TGF-RII, por ejemplo mediante niveles aumentados de TGF-beta. Los oligonucleótidos antisentido así inhiben la expresión de TGF-R y/o TGF-Ru. En lugar de los oligonucleótidos, o en combinación con los oligonucleótidos, compuestos antisentido pueden ser utilizados. Compuestos antisentido se refieren a vectores aquí divulgados que permiten transcribir un olignucleótido antisentido o a ribozimas, ribozimas, guía externa (EGS, external guide sequences), oligonucleótidos (oligozimas) , y otros ARNs cortos catalíticos o oligonucleótidos catalíticos que hibridizan con el ácido nucleico de destino que codifica TGF-R o TGF-RXI. Dichos compuestos antisentido inhiben la expresión de TGF-R o TGF-Rn. De esa manera, la cantidad de TGF-R y/o TGF-Rn presente durante un estado de enfermedad se reduce en estos casos .

Los oligonucleótidos antisentido y los compuestos antisentido aquí divulgados son útiles para la regeneración y un reconexión funcional de vías neurales dañadas y para el tratamiento de diferentes enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias .

En otra realización preferida de la presente invención, el compuesto útil para influir en la actividad biológica de TGF-R y/o TGF-Rn es un compuesto que reduce o inhibe el enlazamiento de TGF-ßl con su receptor. Ejemplos preferidos de tales compuestos son anticuerpos (neutralizantes) dirigidos contra un receptor TGF-ß; véase Lin et al., 1992, preferiblemente el receptor TGF-ß II. El término "anticuerpo" preferiblemente se refiere a anticuerpos que se componen esencialmente de anticuerpos monoclonales combinados con diferentes especificaciones epitópicas, así como preparaciones diferentes de anticuerpos monoclonales . Anticuerpos monoclonales se producen a partir de un antígeno que contiene por ejemplo un fragmento de TGF-R o TGF-Rn o un receptor correspondiente mediante métodos bien conocidos a los expertos en la técnica. El término "anticuerpo" (Ab) como utilizado aquí o "anticuerpo monoclonal" (Mab) debe incluir moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que son capaces para enlazarse de manera específica con una proteína. Fragmentos Fab y F(ab')2 no tienen el fragmento Fc de un anticuerpo intacto, salen de la circulación más rápidamente y pueden tener menos enlaces no específicos que un anticuerpo intacto. (Wahl et al., J. Nucí. Med. 24: 316-325 (1983)). De ese modo, estos fragmentos se prefieren, así como los productos de un banco FAB u otro banco de expresión de inmunoglobulina. Además, anticuerpos que son útiles para los fines de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena singular o anticuerpos humanizados.

Otros compuestos preferidos para la utilización de la presente invención son receptores solubles de TGF-ß. Tales receptores solubles de TGFD.son proteínas de fusión entre regiones Fc de anticuerpos y el dominio extracelular de receptores TGFD. Tales moléculas tienen una gran afinidad al TGF-bl soluble. Por esa razón, la concentración de TGF-bl libre se reduce drásticamente. Según el protocolo del fabricante (R&D Systems, Germany) , una secuencia ADN que codifica el residuo de 159 aminoácidos del dominio extracelular de TGF-ßRn humano (Lin et al., Cell 1992, 68(4), 775-785) se fusionó con la región Fc de IgGl humano y la proteína quimérica fue expresada en una línea de células mieloma de ratón NSO.

El término "soluble" como utilizado aquí en el contexto de receptores preferiblemente se refiere a fragmentos de los receptores que solamente comprenden los dominio (s) extracelulares del receptor o una parte de él que puede aún formar un enlace con su ligando natural, por ejemplo TGF-ßl. El experto en la técnica puede determinar tales fragmentos basados en las secuencias conocidas de aminoácidos de los receptores y la determinación del dominio extracelular puede ser efectuada mediante la utilización de métodos conocidos, por ejemplo por medio de programas de ordenadores (punto de hidrofilicidad) . En una realización particularmente preferida del uso de la presente invención, dicho receptor soluble TGF-ß es el receptor II de TGF-ß.

La presente invención también se refiere a un método para identificar un compuesto que influye en (a) la actividad biológica de TGF-R y/o TGF-Ru o de la expresión de TGF-R y/o de TGF-RII o (b) de la señalización de TGF-ßl/TGF-R, que comprende los siguientes pasos: (a) incubar un compuesto candidato con un sistema de prueba que comprende TGF-ßl y células precursoras neuronales, y (b) ensayar la expresión de receptores activos de TGF o la proliferación de las células precursoras neuronales; en donde (c) una abolición de (i) la supresión de expresión de receptores TGF activos o (iii) supresión de la proliferación de las células precursoras neuronales en comparación con el sistema de prueba en ausencia de dicho compuesto de prueba indica la presencia de un compuesto candidato que tiene las propiedades deseadas.

Ejemplos de tales moléculas candidatos incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas, (por ejemplo, receptores) o pequeñas moléculas. Tales moléculas pueden ser diseñadas de manera racional mediante utilización de técnicas conocidas . Preferiblemente, dichos sistemas de pruebas que se utilizan para la selección comprenden sustancias de propiedades similares químicas y/o físicas, más preferiblemente, dichas sustancias son idénticas. Los compuestos que pueden preparse y identificarse según una utilización de la presente invención pueden ser bancos de expresión, por ejemplo bancos de expresión de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, ligandos, hormonas, peptidomiméticos, ANPs u otros. Más recientemente, WO 98/25146 describió otros métodos para la selección de bancos de complejos para compuestos que tienen una propiedad deseada, en especial, la capacidad de servir de agonista de, para ligarse a, o para servir de antagonista de un polipéptido o su receptor celular. Los complejos en tales banocs comprenden un compuesto bajo prueba, una marcación que registra al menos un paso en la síntesis del compuesto, y un teter (tether) susceptible de ser modificado por una molécula informadora. Modificación del teter se usa para marcar que un complejo contiene un compuesto que tiene una propiedad deseada. La marcación puede decodificarse para revelar por lo menos un paso en la síntesis de tal compuesto. Otros métodos para identificar compuestos que reaccionan con TGF-R y/o TGF-Rn según la invención o moléculas de ácidos nucleicos que codifican tales moléculas son, por ejemplo la selección in vitro con el sistema de selección por fagos, así como ensayos de filtro mediante enlaces o la medida en tiempo real de la interacción, por ejemplo el aparato BIAcore (Pharmacia) . Todos estos métodos pueden utilizarse según la presente invención para identificar un compuesto que influye en la actividad biológica de TGF-R y/o TGF-Rn o de la expresión de dichos receptores, o de la señalización de TGFßl/TGF-R.

También está bien conocido al experto en la técnica el hecho de que es posible diseñar, sintetizar y evaluar miméticos de compuestos orgánicos pequeños que, por ejemplo pueden cumplir la función de sustrato o ligando a un receptor TGF-ß. Por ejemplo ha sido descrito que miméticos D-glucosa de hapalosina exponen eficiencia similar como la halpalosina en que en una proteína asociada con la asistencia en antagnonizar la formación de resistencia de drogas múltiples en citotoxicidad véase Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998) , 981-987. El gene que codificado TGF-ßl or TGF-R pueden también servir de destino para seleccionar inhibidores. Inhibidores pueden comprender, por ejemplo, proteínas que se enlazan con la ARNm del gene que codifica TGF-R, preferiblemente TGF-RIl? así destabilizando conformación nativa del mARN y dificultando la transcripción y/o la traducción. Además, métodos se describen en la literatura para identificar moléculas tales como un fragmento de ARN que imitan la estructura de una molécula definida o indefinida de ARN con la que un compuesto se enlaza dentro de una célula, lo que resulta en el retraso del crecimiento de las células o la muerte de células, véase por ejemplo WO 98/18947 y referencias allí citadas . Estas moléculas de ácido nucleico pueden utilizarse para identificar compuestos no conocidos de interés farmacéutico y para identificar destinos de ARN no conocidos para uso en el tratamiento de la enfermedad. Estos métodos y composiciones pueden ser utilizados para identificar compuestos que son útiles en reducir niveles de expresión de TGF-ßl y/o del receptor correspondiente/de los receptores correspondientes. Los compuestos que pueden analizarse y identificarse según el método de la invención pueden ser bancos de expresión, por ejemplo bancos de expresión de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, ligandos, hormonas, peptidomiméticos, ANPs u otros (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 7 (1994) , 193-198 y referencias arriba citadas) . Además, genes que codifican un regulador putativo de TGF-ßl y/o que ejecutan sus efectos aguas arriba o abajo de TGF-P1 pueden ser identificados mediante utilización de por ejemplo, inserción mutagénesis, utilizando por ejemplo vectores que apuntan genes particulares conocidos en el arte. Dichos compuestos pueden también ser derivados funcionales o análogos de inhibidores conocidos. Tales compuestos útiles pueden por ejemplo ser factores de transacción (transaction factors) que se enlazan con TGF-R o TGF-Rn o secuencias regulatorios del gen que lo codifica. Identificación de factores de transacción puede efectuarse mediante utilización de métodos estándar en el arte. Para determinar si una proteína se enlaza con la proteína misma o secuencias regulatorias, análises estándar Gelshift pueden efectuarse. Para identificar un factor de transacción que se enlaza con la proteína o secuencia regulatoria, la proteína o secuencia regulatoria pueden utilizarse como un reactivo de afinidad en métodos de proteína estándar de purificación, o como una prueba para seleccionar una banco de expresión. La identificación de moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos que reaccionan con TGF-R or TGF-Rn pueden alcanzarse, por ejemplo, como descrito para GF-ßl en Scofield (Science 274 (1996), 2063- 2065) mediante el uso de los llamados "sistemas de dos híbridos" de levadura. En este sistema, TGF-ßl está enlazado con el dominio que enlaza el ADN del factor GAL4 de transcripción. Una cepa de levadura que expresa este polipéptido de fusión y que comprende un gen informador lacZ que está controlado por un promotor apropiado, que está reconocida por el factor GAL4 de transcripción, es transformada por un banco de ADNcs que van a expresar proteínas de plantas o peptídos de ellos que son fusionados con un dominio de activación. De ese modo, si un péptido codificado por un de los ADNcs es capaz de reaccionar con el péptido de fusión que comprende un péptido de, por ejemplo TGF-R o TGF-Rn, el complejo será capaz de dirigir la expresión del gen informador. De ese modo, por ejemplo TGF-R or TGF-Rn y el gen que codifica cada receptor puede ser utilizado para identificar péptidos y proteínas que reaccionan con TGF-R or TGF-Rn. Es obvio al experto en la técnica que este sistema y sistemas similares entonces pueden utilizarse para la identificación de inhibidores. Finalmente, la presente invención se refiere al uso de un compuesto que se identifica mediante el método arriba descrito para la preparado de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, en donde la neurogénesis o la neuroregeneración tienen un efecto beneficioso. El ejemplo abajo descrito describe la invención en más detalles.

La presente invención también se refiere a métodos para identificar los efectos del tratamiento o de la prevención/profilaxis en la población de células madres/precursoras inducidos por la modulación del sistema TGF-R- o TGF-RII. Esto puede ser especialmente útil para establecer un tratamiento exitoso en el paciente individual que permite por ejemplo una dosis individualizada. Los métodos diagnósticos comprenden (a) aplicación sistémica de anticuerpos específicos dirigidos contra TGF-R or TGF-RII y marcados con núclidos específicos para diagnóstica nuclear medical (lodina, tecnecio, flúor 18) o con sales de gadolinio, perfluorocarburos u otros productos tierras raras / compuestos paramagnéticos / partículas de hierro para uso en la formación de imágenes por resonancia magnética. En este contexto, puede ser necesario abrir duranto corto tiempo la barrera hematoencefálica en la capa subependimal, en caso de que no haya relación señal a ruido suficiente, aunque esta región es altamente vascularizada, y que el contraste puede ser suficiente para visualización con una máquina 3Tesla, abrir la barrera hetamoencefálica puede apoyar adicionalmente este proceso . Esto puede ser realizado o con soluciones híperosmolares (por ejemplo glicerol) o con VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) . (b) aplicación sistémica de oligonucleótidos (las mismas moléculas que arriba mencionadas) que son específicos para TGF-R o TGF-RII: Ellos se marcarían como sigue: Gd o 11:LIn - DTPH (5 "XXXXXXXXXXXXXXXXX3^-Biotin) - (SA- o OX 26, 8D3 o Ak-HIR) (en donde Gd se utiliza para MRI, 11:lIn se usa para radiodiagnóstica, OX 26 se usa para experimentos de ratones y apunta los receptores de transferrina, 8D3 es un anticuerpo de receptor de ratón antitransferrina de rata, AK-HIR es un anticuerpo que está dirigido al receptor de insulina humana) . Estos compuestos solamente hibridizarían y señalarían en las células que tienen el ARNm activo para TGF-R o TGF-RII. DTPH se utiliza como un agente que forma quelato, el Ak- HIR utiliza el receptor de insulina para trasladar el oligonucleótido a través de las diferentes barreras, en el caso de los anticuerpos de los receptores de transferrina, el último se utiliza para la traslación transmembranal. Hay una estabilidad de hibridación diferencial en las células en las que un gran número de mARN es disponible y por esa razón, una señal mucho más fuerte puede detectarse (Susuki T, Schlachetzki F, et al. J. Nucí. Med. 45: 1766-1775, 2004, Susuki T, Zhang Y, Zhang Y-f, Schlachetzki F, Pardridge et al., Mol. Imaging 2005, 3, 356-363) . (c) aplicación sistémica de oligonucleótidos (las mismas moléculas que arriba mencionadas) que son específicos para Doublecortin (DCX) con marcación idéntica a la marcación en (b) (véase WO 2004067751) Preferiblemente, en una composición farmacéutica, tal compuesto como está arriba descrito se combina con un portador faramacéuticamente aceptable. "Farmacéuticamente aceptable" debe comprender todo portador que no influye en la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico para el huésped al que se lo adminstra. Ejemplos de portadores farmacéuticos apropiados son bien conocidos en el arte y incluyen soluciones salinas de tampón fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones aceite/agua, diferentes tipos de productos humectantes, soluciones estériles etc... Tales portadores pueden formularse mediante métodos comunes y el compuesto activo puede administrarse al sujeto en una dosis efectiva. Una "dosis efectiva" significa una cantidad del ingrediente activo que es suficiente para influir el curso y la gravedad de la enfermedad, lo que lleva a la reducción o la remisión de tal patología. Una "dosis efectiva" para tratar y/o impedir estas enfermedades o trastornos puede determinarse mediante utilización de métodos conocidos al experto en la técnica. Administración de composiciones apropiados pueden efectuarse por vías diferentes, por ejemplo mediante administración intravenoso, intraperetoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradermal. La vía de administración, por supuesto, depende del tipo de terapia y del tipo de compuesto contenido en la composición farmacéutica. Además, los compuestos de la presente invención pueden ser mezclados y adminstrados juntos con lipósomas, agentes que forman complejos, moléculas que apuntan receptores, solventes, agentes conservadores y/o diluyentes .

Se prefieren preparaciones farmacéuticas en forma de soluciones de infusiones o matrices sólidas para liberación continuo del agente activo, en especial para liberación de por lo menos un oligonucleótido antisentido o variantes o miméticos de los mismos . Más se prefieren preparaciones farmacéuticas en forma de soluciones o matrices sólidas apropiadas para adminstración local hacia adentro el cerebro.

El régimen de dosis será determinado por el médico tratante y otros factores clínicos. Como se sabe bien en los artes medicales, dosificaciones para un paciente dependen de muchos factors, incluyendo la talla del paciente, la superficie del cuerpo, la edad, el sexo, el compuesto particular que tiene que ser administrado, el tiempo y la vía de la administración, el tipo de terapia, salud general y otras drogas que se administran al mismo tiempo.

La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas que comprenden por lo menos un oligonucleótido, variantes o miméticos de ellos, como arriba revelado. En vez de o adicionalmente al por lo menos un oligonucleótido antisentido, por lo menos un compuesto antisentido podría estar presente. Compuestos antisentido se refieren a vectores que permiten transcribir un olignucleótido antisentido, en especial un de los oligonucleótidos antisentido aquí divulgados o a ribozimas, secuencias guía externa (EGS, external guide sequences), oligonucleótidos (oligozimas) , y ARNs cortos catalíticos u oligonucleótidos catalíticos que hibridizan con el ácidos nucleico de destino que codifica TGF-R o TGF-RII . Dicho compuesto antisentido inhibe la expresión de TGF-R o TGF-RII y preferiblemente es capaz de reducir respectivamente la cantidad de TGF-R o TGF-Rn que se forma.

En una realización preferida de la presente invención, la enfermedad que puede impedirse y/o tratarse es una enfermedad neuroinflamatoria del SNC, una isquemia aguda o lesión traumática/hipoxica del cerebro. Ejemplos preferidos de enfermedades neuroregenerativos o neuroinflamatorios son la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) , variación nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD) , la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofia multisistema, demencia, demencia frontemporal, enfermedades de neuronas motoras, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs) , esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial y meningoencefalitis viral (prevención de depresión postinflamatoria de proliferación de células madres) trastornos autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (EM) , lesiones isquémicas/hípoxicas agudas , traumatismo del SNC, traumatismo de la cabeza, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia icroangiopática, la enfermedad de Binswanger, Leuoaraiosis, demencia relacionada con el SIDA, , retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil frágil-tremor/ataxia, Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP) , degeneración estriadonigral (SND) , degeneración olivopontocerebeloso (OPCD) , síndrome de Shy Drager (SDS) , degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear. También reducción de neoformación de células madres debido a la edad puede contar entre dichas enfermedades.

Ejemplos Ejemplo 1 TGF-betaTGF-ßl inhibe la proliferación de células madres y precursoras neurales de roedores Se matan ratones femeninas adultas (diferentes cepas) o ratas Fischer-344 (3-4 meses; Charles River, Alemania) , se extraen los cerebros y las médulas espinales y se los pone en 4°C DPBS (PAN, Alemania) con 4.5 gm/1 de glucosa (Merck, Alemania) (DPBS/glu) . Meninges y vasos sanguíneos sobreyacentes se extraen. Zonas de hipocampo y ependimales inlcuyendo zonas subependimales y subventriculares de la pared lateral del ventrículo lateral (SVZ, subventricular zone) se extraen de manera aséptica. El tejido disecado se traslada a DPBS/glu fresco, se lava por una vez, se lo pone en platillos de Petri, y se lo disocia de manera mecánica. La suspensión de células se lava en DPBS/glu para enjuagar sangre excedente y se la resuspende en solución PPD que contiene 0.01% de papaína ((Worthington Biochemicals, Inglaterra), 0.1% dispasa II (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), 0,01% Dnasa I (Worthington Biochemicals), y 12.4 mM MgS04 en HBSS (PAN) sin Mg2/Ca2 (PAA, Alemania) y se la lava durante 30 a 40 minutos a temperatura ambiental. La suspensión de células es triturada cada 10 minutos. Células disociadas se recogen y se resuspenden en medio DMEM/F12 sin suero que contiene 2 mM de L-glutamina y 0.1 gm/1 de penicilina/streptomicina y lavado tres veces con trituración exacta. Entonces, la suspensión de células singulares se resuspende en medio NB (Gibco BRL, Alemania) enriquecida con B27 (Gibco BRL) (NB/B27), 2 mM de L-glutamina (PAN), 0.1 gm/1 penicillin/streptomycin (PAN) , 2 g/ml de heparina (Sigma, Taufkirchen, Alemania), 20 ng/ml de bFGF-2 (R&D Systems, Alemania), y 20 ng/ml de EGF (R&D Systems, Alemania). Células viables se cuentan por medio de un ensayo de exclusión de Trypan Blus en un hemocitómetro. Células se siembran en cajas T-25 para el cultivo de microbios y a los cultivos se los mantiene a 37 °C dentro de un incubador con un 5% de C02. Células singulares empiezan a formar esferas durante 5 a 7 días de cultivo de suspensión y continúan creciendo en masa y número durante los próximas semanas. La mitad del medio se cambia cada 7 días. Células de los números (passage numbers) 3 a 20 se usan para los experimentos (Wachs, F. P., S. Couillard-Despres, et al., Lab Invest 2003, 83(7), 949-962). Los cultivos de células madres y precursoras neurales se denominan CMNes. Para el proceso de disociación, el medio de cultivo que contiene neuroésferas adentro se recoge en un tubo de centrífuga de 15 ml y se lo centifuga a 120 fre (ref, relative centrifugal forcé, fuerza relativa de centrifugación) durante 5 minutos. El granulado es resuspendido en 200 µl de Accutase (Innovative Cell Technologies Inc., distribuido por PAA) y triturado aproximadamte 10 veces mediante utilización de una pipeta. Entonces, la suspensión de células es incubada a 37 °C durante 10 minutos. Esferas disociadas son trituradas otra vez y resuspendidas en 800 µl de medio de NB/B27. Células disociadas se centrifugan a 120 fre durante 5 minutos y son resuspendidas en medio de NB/B27. Una parte aliquota se cuenta por medio de un ensayo de exclusión de Trypan Blue en un hemocitómetro para determinar la cantidad de células viables. Células (105) se ponen en placa en cajas T75 para el cultivo de microbios para el paso de largo plazo en medio de NB/B27 (10 ml de medio de cultivo por caja) . Las células obtenidas después de tratamiento de Accutase de neuroesferas primarias proliferan y producen neuroesferas secundarias . Neuroesferas secundarias son pasadas 7 a 9 días después de poner en placa células de neuroesferas primarias . Similar a cultivos primarios y neuroesferas primarias, células singulares obtenidas después de disociación de neuroesfereas secundarias proliferan y producen neuroesferas terciarias (Wachs, F. P., S. Couillard-Despres, et al., Lab Invest 2003, 83(7) , 949-962) . 104 CMNs se siembran en placa de 12 pocilios en medio de NB/B27 en un volumen de 1 ml y crecen durante 7 días. 2 horas, 3 días y 6 días después de sembrar, las células son estimuladas mediante adición de diferentes concentraciones (0, 2,5, 5, 10, y 100 ng/ml) de factor de crecimiento transformador ßl (TGF-ßl) (R&D Systems, Alemania). En el día 7, los cultivos se disocian por el uso de Accutase™ y células viables se cuentan mediante un ensayo de exclusión de Trypan Blus en un hemocitómetro. TGF-ßl in vitro inhibe la proliferación de células madres y precursoras adultas neurales de una manera que depende de la dosis (figura 1A) . Un efecto similar se observó en células neurales humanas fetales. El tratamiento con 50 ng/ml de TGF-bl redució la proliferación de células a aproximadamente un 50% de los controles durante 7 días (figura IB) .

Ejemplo 2 El efecto de TGF-ßl sobre células madres y precursoras neurales es reversible Para determinar si la inhibición de crecimiento inducida por TGF-ßl es un efecto reversible, CMNs se estimulan con 10 ng/ml de TGF-ßl durante 7 días siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 1. Después de disociación, células viables se cuentan por medio de un ensayo de de exclusión deTrypan Blue en un hemocitometro y 104 CMNs estimuladas por el factor de crecimiento se resiembran y se cultivan con o sin 10 ng/ml de TGF-ßl según el protocolo descrito en el ejemplo 1. Este proceso de disociar/contar/resembrar se efectúa cada 7 días. Como mostrado en las figuras 2, después de 3 semanas de cultivo, la tasa de proliferación de células inicialmente tratadas con TGF-ßl ahora crecidas sin TGF-ßl se normaliza en comparación con células antes no tratadas. Esto indica que el efecto de TGF-ßl sobre células neurales madres y precursoras es reversible. Incubación a largo plazo con TGF-ßl no reduce más la proliferación de células .

Ejemplo 3 Anticuerpos contra TGF-betaRn pueden reducir efectos de TGF- ßl sobre células madres neurales de rodeores adultos Neuroesferas no estimuladas que tienen siete días de edad de números bajos se disocian mediante el uso de Accutase™ como descrito en el ejemplo 1. La suspensión obtenida que contiene un solo tipo de células se utilizó para análisis de bloqueo. CMNs de rodeores adultos se sembraron en una densidad de 104 células en placa de 12 pocilios en medio de NB/B27 en un volumen de 1 ml . 2 horas después de sembrar y 1 hora antes de la estimulación con 10 ng/ml de TGF-ßl, diferentes concentraciones de anticuerpos neutralizantes anti-TGF-ßRn (R&D Systems, Alemania) se añadieron al medio de cultivo. 3 días y 6 días después de sembrar, a las células se las estimula otra vez mediante adición de anticuerpos de anti- TGF-ßRn y TGF-ßl, similar al proceso que se efectúa en el día 1. En el día 7, los cultivos se disocian por uso de Accutase™ y células viables se cuentan mediante un ensayo de exclusión de Trypan Blue en un hemocitómetro. Es interesante que la adición de los anticuerpos anti-TGF-ßRn ellos mismos reduce la proliferación de CMNs. Anticuerpos contra TGF-ßRn solamente parcialmente son capaces de inhibir efectos inducidos por TGF-ßl incluso en las concentraciones utilizadas más altas (10 µg/ml) (figura 3).

Ejemplo 4 TGF-Ru soluble inhibe completamente la supresión de proliferación de CMNs inducida por TGF-ßl Según el protocolo del fabricante (R&D Systems, Alemania) , una secuencia ADN que codifica el residuo de 159 aminoácidos del dominio extracelular de TGF-ßRn humano (Lin et al., Cell 1992, 68(4), 775-785) fue fusionada con la región Fc de IgGl humano y la proteína quimérica fue expresada en una línea de células mieloma de ratón NSO. Neuroesferas no estimuladas que tienen siete días de edad de números bajos se disocian mediante el uso de Accutase™ como descrito en el ejemplo 1. La suspensión obtenida que contenía un solo tipo de células se utilizó para análisis de bloqueo. CMNs de rodeores adultos se sembraron en una densidad de 104 células en placa de 12 pocilios en medio de NB/B27 en un volumen de 1 ml . 2 horas después de sembrar y 1 hora antes de la estimulación con 10 ng/ml de TGF-ßl, diferentes concentraciones de TGF-ßsRn bioactivo soluble humano recombinante/Quimera Fc (R&D Systems, Alemania) anticuerpos neutralizantes anti-TGF-ßRII (R&D Systems, Alemania) se añadieron en el medio de cultivo. 3 días y 6 días después de sembrar, a las células se las estimula otra vez mediante adición de anticuerpos de TGF-ßsRn/ Quimera Fc y TGF-ßl similar al proceso que se efectúa en el día 1. En el día 7, los cultivos se disocian por uso de Accutase™ y células viables se cuentan mediante un ensayo de exclusión de Trypan Blue en un hemocitómetro. Es interesante que la adición del TGF-ßsRu/Quimera Fc es capaz de bloquear completamente efectos inducidos por TGF-ßl en una manera que depende de la dosis (datos no mostrados) . Está claro que la abolición de TGF-ßl activo en el sobrenadante mediante administración previa de un Fc soluble recombinante humano (TGF-ßRu soluble) completamente bloquea la supresión de crecimiento inducida por TGF-ßl de células adultas madres y precursoras neurales (figura 4).

Ejemplo 5 Células que expresan TGF-ßRII pueden aislarse mediante utilización de técnicas de selección de células Métodos comunes no permiten aislación rápida y fiable y purificación de células neurales madres y precursoras . Para investigar la posibilidad de aislar poblaciones de células neurales madres y precursoras puras basado en la expresión de marcadores de superficie definidos, aislamos células neurales madres y precursoras debido a la expresión de TGF-ßRn por medio de técnicas diferentes. Es posible aislar células neurales madres y precursoras que expresan TGF-ßRn por medio de dos técnicas, i) selección por medio de SCAF (Separación de células activada por fluorescencia FACS-sorting) (datos no mostrados) , y ii) selección por medio de separación magnética de células (MACS-sorting) . Células disociadas madres y precursoras neurales adultas se incuban con 10 µg/ml de anticuerpos primarios contra TGF-Ru (R&D Systems, Alemania) durante 20 minutos a temperatura ambiental. Después de un paso de lavado con PBS, las células se incuban con el anticuerpo secundario conejo anti-cabra PE (1:500) (Dianova) . Después de un paso de lavado con PBS, anticuerpos terciarios se añaden a las células contra PE conectado a granulos paramagnéticos según los protocolos de fabricante (Miltenyi Biotech, Alemania) . La suspensión de células se separa magnéticamente usando el sistema MACS según el protocolo de fabricante (Miltenyi Biotech, Alemania) y células negativas y positivas después de la separación se cuentan y se cultivan (figura 5) . Aproximadamente un 20% de todos los tipos de células presentaron un resultado positivo para TGF-ßRu.

Ejemplo 6 Oligonucleótidos antisentido contra TGF-DRII inhiben la regulación hacia abajo inducida por la proliferación in vitro de células adultas madres y precursoras neurales. Las células se prepararon, se disociaron y se pusieron en placa como descrito en el ejemplo 1. Después, a las células se las incubó durante 1 semana con o sin lOng/ml de TGF-bl, 10 DM de TGF-DRII oligonucleótido antisentido 5' cagcccccgacccatg - 3' (NIS 3) , oligonucleótido antisentido 5' - catgggtcgggggctg - 3', o sin sentido 5' - catccccggacccgtg - 3' . A los oligonucleótidos se los modificó con fosfotioatos y se cambió diariamente el medio con oligonucleótidos. Es importante que que la inhibición inducida por TGF-Dl de proliferación de células madres y precursoras neurales se bloqueo completamente y específicamente por el tratamiento antisentido (NIS 3) (figura 6) .

Ejemplo 7 Tratamiento in vivo de oligonucleótidos antisentido específicos de TGF-RII salva el bloqueo inducido por la proliferación de células en el cerebro adulto. Este ejemplo demuestra i) el efecto de la infusión de TGF-Dl en la proliferación de células madres y progenitores neurales in vivo y ii) el hecho de que este efecto se salva mediante tratamiento con oligonucleótidos antisentido TGFDRII . Por esa razón, el siguiente experimento se realizó: TGF-Dl se infundió por vía intraventricular durante dos semanas seguido por una co-infusión de TGF-Dl con oligonucleótidos. Experimentos animales se efectuaron según el European Communities Council Directive del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) . Cánulas de acero inoxidable conectados con minibombas osmóticas (Model 2001, Alza, Stadt, Land) se implantaron dentro de dos ratas Fischer-344 de 2 meses de edad (n=24) para infusión intracerebroventricular como se ha descrito. Los animales recibieron o TGF-Dl recombinante (500 ng/ml presente en la bomba) o fluido cerebroespinal artificial (LCEa) como control (n=8 cada uno) en una dosificación de 0.5 µl/hr durante dos semanas. Después de la segunda semana, las bombas se cambiaron y LCEa, TGF-Dl (500 ng/ml presente en la bomba) , oTGF-Dl (500 ng/ml presente en la bomba) se infusieron hacia adentro de los ventrículos durante los dos siguientes semanas. Los oligonucleótidos fueron como descritos en el ejemplo 6. En el día 27, los animales recibieron una inyección intraperitóneal singular de 200 mg/kg de bromodeoxiuridina (BrdU) . Un día más tarde, a los animales se les perfundió por inyección intracardial con paraformaldehído 4%. El tejido se trató para inmunodetección cromógena o epifluorescente en 40 µm de secciones sagitales como se ha descrito. Análises de epifluorescencia se efectuó mediante el uso de un microscopio Leica (Leica Mikroskopie und Syste e GmbH, Wetzlar, Alemania) equipado con una cámara digital Spot™ (Diagnostic Instrument Inc, Sterling Heights, EEUU) o un microscopio confocal por barrido laser (Leica TCS-NT, Bensheim, Alemania) . Anticuerpos primarios fueron: rata -BrdU 1:250 (Oxford Biotechnology, Oxford, RU) . Anticuerpos secundarios fueron: burro a-cabra, ratón, conejo o rata conjugado con fluoresceína (FITC) , rodamina X (RHOX) , CY5 o biotina 1:500 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, EEUU) . Para contar, un procedimiento sistemático y aleatorio se utilizó. Células positivas BrdU se contaron en el seno de tres marcos de 50µm x 50µm por sección situados en la parte más baja, media, más alta de la zona subventricular (ZSV) . Perfiles positivos que pasaron el plano focal más alto (plano de exclusión) o los límites laterales de exclusión del marco para contar no se contaron. Las cuentas totales de perfiles positivos se multiplicaron por la relación del volumen de referencia al volumen de selección para obtener el número estimado de células positivas para BrdU de cada estructura. Todas las extrapolaciones se calcularon en cuanto a un hemisferio cerebral y deberían doblarse para representar los valores totales del cerebro. Los datos se presentan como valores medios ± desviaciones estándares (DE) . Análises estadísticas se efectuaron mediante el uso de la comparación del test t para muestras apareadas bilaterales de estudiantes (unpaired, two-sided t-test comparison -Student' s t-test) entre los grupos tratados con TGF-Dl y los grupos de control (StatView Software, Cary, NC, EEUU). El nivel de significado se determinó a p < 0.05. La figura 7 demuestra la regulación hacia abajo inducida por el TGF-Dl de proliferación de células en la convolución dentada del hipocampo (figura 7o) y en la zona subventricular (figura 7B) . Tratamiento con oligonucleótidos sin sentido no bloqueó este efecto. Al contrario, tratamiento con oligonucleótidos sin sentido (NIS 3) bloqueó el efecto de TGF-Dl (figura 7A y B) Ejemplo 8 Tratamiento in vivo de oligonucleótidos antisentido específicos de TGF-RII previene el bloqueo inducido por TGF- Dl de la proliferación de células en el cerebro adulto. Este ejemplo demuestra que un tratamiento con oligonucleótidos antisentido contra TGF-DRII puede impedir la regulación hacia abajo de la proliferación de células inducida por TGF-Dl en el cerebro adulto. Oligonucleótidos se infundieron por vía intraventricular durante una semana seguido por una co-infusión de TGF-Dl con oligonucleótidos. Experimentos animales se efectuaron según el European Communities Council Directive del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) . Cánulas de acero inoxidable conectados con minibombas osmóticas (Model 2001, Alza, Stadt, Land) se implantaron dentro de dos ratas Fischer-344 de 2 meses de edad (n=24) para infusión intracerbroventricular como se ha descrito. Los animales recibieron o oligonucleótidos de fosfotioatos (concentration de 1, 64 mM presente en la bomba) o un aLCE durante la primera semana, y un TGF-Dl (500 ng/ml presente en la bomba) , o una co-infusión de TGF-Dl (500 ng/ml presente en la bomba) y oligonucleótidos fosfotioatos (concentration de 1, 64 mM presente en la bomba) durante la segunda y tercera semana. Oligonucleótidos se describieron en el ejemplo 6. En el día 20, los animales recibieron una inyección intraperitóneal singular de 20 mg/kg de bromodeoxiuridina (BrdU) . Un día más tarde, a los animales se les perfundió por inyección intracardial con paraformaldehído 4%. El tejido se trató y se analizó como descrito en la figura 7. La figura 8 demuestra que la regulación hacia abajo inducida por el TGF-Dl de proliferación de células en la convolución del hipocampo dentado (figura 8A° ) y en la zona subventricular (figura 8B) puede prevenirse por tratamiento previo con un tratamiento con oligonucleótidos antisentido de TGF-DRII (NIS 3) .

Ejemplo 9 Formulación farmacéutica que comprende por lo menos un olignucleótido antisentido Tres formulaciones representativas acuosas de los oligonucleótidos antisentido: 1. en LCEa 148,0 mM de NaCl, 3,0 mM de KCl, 1,4 mM de CaCl2, 0,8 mM de MgCl2, 1,5 mM de Na2HP04, 0,2 mM de NaH2P04, pH 7.4, 100 µg/ml de albúmina de suero de rata, 50 µg/ml de gentamícina 2. en 0,9% de NaCl 3. en H20

Claims (1)

1. Reivindicaciones Oligonucleótidos que se eligen del grupo que comprende el NIS 3 y secuencias prolongadas del NIS 3 que pueden ser representados por la siguiente fórmula general: 5 ' -XCAGCCCCCGACCCATGZ-3 ' en donde X se elige del grupo que comprende los siguientes oligonucleótidos: ACAGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, CAGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, AGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, ACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, CGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, ATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, TGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, TGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, CAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, AGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GCGGCCACAGGCCCCTGAG, CGGCCACAGGCCCCTGAG, GGCCACAGGCCCCTGAG, GCCACAGGCCCCTGAG, CCACAGGCCCCTGAG, CACAGGCCCCTGAG, ACAGGCCCCTGAG, CAGGCCCCTGAG, AGGCCCCTGAG, GGCCCCTGAG, GCCCCTGAG, CCCCTGAG, CCCTGAG, CCTGAG, CTGAG, TGAG, GAG, AG, G, y en donde Z se elige del grupo que comprende los siguientes oligonucleótidos: GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCCCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAG, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGA, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCG, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGAC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGA, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAG, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATA, GCAGACCCCGCTGCTCGTCAT, GCAGACCCCGCTGCTCGTCA, GCAGACCCCGCTGCTCGTC, GCAGACCCCGCTGCTCGT, GCAGACCCCGCTGCTCG, GCAGACCCCGCTGCTC, GCAGACCCCGCTGCT, GCAGACCCCGCTGC, GCAGACCCCGCTG, GCAGACCCCGCT, GCAGACCCCGC, GCAGACCCCG, GCAGACCCC, GCAGACCC, GCAGACC, GCAGAC, GCAGA, GCAG, GCA, GC, G, y en donde X y Z juntos no comprenden más de 34 nucleobases y miméticos de las mismas en donde dichos oligonucleótidos son capaces de hibridizar suficientemente con la región que rodea el codón de la iniciación de la traducción del marco de lectura abierto del gen que codifica TGF-Rn y miméticos, variantes, sales y isómeros ópticos de dicha secuencia. y con la condición de que dicho oligonucleótido no sea 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGCAG-3 ' . Oligonucleótidos eligidos del grupo que comprende NIS 3 a NIS 32 y NIS 34 a NIS 72 en donde dichos oligonucleótidos son capaces de hibridizar suficientemente con la región que rodea el codón de la iniciacón o la terminación de la traducción del marco de lectura abierto del gen que codifica TGF-Ru, o una región del la ARNm que codifica TGF-Rn que es un "bulto" o un "bucle" y que no es parte de una estructura secundaria y miméticos, variantes, sales y isómeros ópticos de dicha secuencia. Oligonucleótidos según la reivindicación 2, que se eligen del grupo que comprende lo siguiente: NIS 3: 5' -CAGCCCCCGACCCATG-3' NIS 34 5 ' -CAGCCCCCGACCCATGGCA-3 ' NIS 35 5' -CAGCCCCCGACCCATGGC-3' NIS 36 5' -CAGCCCCCGACCCATGG-3' NIS 41 5' -GCAGCCCCCGACCCATGGCA-3' NIS 42 5' -GCAGCCCCCGACCCATGGC-3' NIS 43 5' -GCAGCCCCCGACCCATGG-3' NIS 44 5' -GCAGCCCCCGACCCATG-3' NIS 49 5' -AGCAGCCCCCGACCCATGGC-3' NIS 50 5' -AGCAGCCCCCGACCCATGG-3' NIS 51 5' -AGCAGCCCCCGACCCATG-3' NIS 56 5' -GAGCAGCCCCCGACCCATGG-3' NIS 57 5' -GAGCAGCCCCCGACCCATG-3' NIS 62 5 ' -TGAGCAGCCCCCGACCCATG-3 ' Preparación farmacéutica que comprende por lo menos un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 así como miméticos, variantes, sales y sus isómeros ópticos y/o al menos un compuesto antisentido eligido que comprende un vector que permite transcribir un oligonucleótido antisentido junto con al menos un vehículo, excipiente o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Preparación farmacéutica según la reivindicación 4, en donde la preparación farmacéutica es una solución de infusión o una matriz sólida para la liberación continua del ingrediente activo. Preparación farmacéutica según las reivindicaciones 4 o 5, en donde la preparación farmacéutica es apropiada para una administración local en el cerebro. Uso de por lo menos un oligonucleótido que tiene una secuencia que es idéntica por lo menos a un 80% a una subsecuencia del NIS 1 o del NIS 2 o que comprende 8 a 50 nucleobases, en donde dicha secuencia es capaz de hibridizarse de manera suficiente con la región que rodea el codón de iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierto del gen que codifica TGF-Ru, o una región del ARNm que codifica TGF-Rn que es un "bucle" o un "bulto" y que no es parte de una estructura secundaria y miméticos, variantes, sales y isómeros ópticos de dicha secuencia para promover regeneración exitosa y reconexión funcional de vías neurales perjudicadas . Uso de por lo menos un oligonucleótido según la reivindicación 7 así como miméticos y variantes del mismo y/o al menos un compuesto antisentido que comprende un vector que permite transcribir por lo menos un dicho oligonucleótido o una formulación farmacéutica que comprende al menos un olignoucleótido según la reivindicación 7 para promover regeneración exitosa y reconexión funcional de vías neurales perjudicadas. Uso de por lo menos un oligonucleótido según la reivindicación 8 así como miméticos y variantes del mismo y/o al menos un compuesto antisentido que comprende un vector que permite transcribir por lo menos un dicho oligonucleótido o una formulación farmacéutica según la reivindicación 7 para la profilaxis/la prevención terapéutica y el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, traumáticas, postraumáticas, vasculares/hipóxicas, neuroinflamatorias y postinfecciosas del Sistema Nervioso Central, así como reducciones inducidas por la edad de la neoformación de células madres neuronales . Uso según la reivindicación 9 para inhibir la expresión de TGF-Rn en enfermedades asociadas con niveles de TGF-Ru regulados hacia arriba y aumentados. Uso según la reivindicación 9 o 10 en donde las enfermedades asociadas con niveles del TGF-Rn arriba regulados o elevados o las enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamotorias se eligen del grupo que comprende lo siguiente: La enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) , variante nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD) , la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofia multisistema, demencia, demencia frontemporal, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs) u otras enfermedades de neuronas motoras, esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial, meningoencefalitis viral, enfermedades autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (MS) , lesiones agudas isquémicas/hipóxicas, infarto, traumatismo de la médula espinal y del SNC, traumatismo de la cabeza y espinal, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia microangiopática, la enfermedad de Binswanger (Leuoaraiosis) , degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear, demencia relacionada con el SIDA, retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil tremor/ataxia (FXTAS) , Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP) , degeneración estriadonigral (SND) , degeneración olivopontocerebelosa (OPCD) , síndrome de Shy Drager (SDS), deficiencias de la memoria debidas a la edadd, trastornos del neurodesarollo asociados con demencia, síndrome de Down, sinucleinopatías, mutaciones de dismutasa de superóxido, enfermedades de repetición de trinucleótido, traumatismo, hipoxía, enfermedades vasculares, inflamaciones vasculares, envejecimiento del SNC. 12. Uso según la reivinidicación 9 para inhibir la actividad de TGF-D en enfermedades asociadas con niveles regulados hacia arriba o aumentados de TGF-Rn 13. Uso según la reivindicación 9 o 12 en donde las enfermedades asociadas con niveles del TGF-Rn arriba regulados o aumentados o las enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamotorias se eligen del grupo que comprende lo siguiente: La enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) , variante nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD) , la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofia multisistema, demencia, demencia frontemporal, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs) u otras enfermedades de neuronas motoras, esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial, meningoencefalitis viral, enfermedades autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (MS) , lesiones agudas isquémicas/hipóxicas, infarto, traumatismo de la médula espinal y del SNC, traumatismo de la cabeza y espinal, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia microangiopática, la enfermedad de Binswanger (Leuoaraiosis) , degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear, demencia relacionada con el SIDA, retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil tremor/ataxia (FXTAS) , Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP), degeneración estriadonigral (SND), degeneración olivopontocerebelosa (OPCD) , síndrome de Shy Drager (SDS) , deficiencias de la memoria debidas a la edadd, trastornos del neurodesarollo asociados con demencia, síndrome de Down, sinucleinopatías, mutaciones de dismutasa de superóxido, enfermedades de repetición de trinucleótido, traumatismo, hipoxía, enfermedades vasculares, inflamaciones vasculares, envejecimiento del SNC 14. Método para identificar un compuesto que influye en (a) la actividad biológica de TGF-Rn o la expresión de TGF- RII o (b) la señalización de TGF-ßl/TGF-R, que comprende los siguientes pasos: (a) incubar un compuesto candidato con un sistema de prueba que comprende TGF-ßl y células precursoras neuronales, y (b) ensayar la expresión de receptores activos de TGF o la proliferación de las células precursoras neuronales ; en donde (c) una abolición de (i) la supresión de la expresión de receptores TGF activos o (ii) supresión de la proliferación de las células precursoras neuronales en comparación con el sistema de prueba en ausencia de dicho compuesto de prueba indica la presencia de un compuesto candidato que tiene las propiedades deseadas . Oligonucleótidos que tienen una secuencia que es por lo menos idéntica a un 80% a una subsecuencia del NIS 94 o del NIS 95 o del NIS 96 que comprende 8 a 50 nucleobases, en donde dicha secuencia es capaz de hibridizarse de manera suficiente con la región que rodea el codón de iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierto del gen que codifica TGF-Ri, o una región del ARNm que codifica TGF-RS que es un "bucle" o un "bulto" y que no es parte de una estructura secundaria, y miméticos, variaciones, sales y isómeros ópticos de dicha secuencia . Oligonucleótidos que tienen una subsecuencia del NIS 94 o del NIS 95 o del NIS 96 o del NIS 8 o del NIS 50 que comprende 8 a 50 nucleobases y miméticos, variantes, sales y isómeros ópticos. Oligonucleótidos según la reivindicación 16, que se eligen del grupo que comprende lo siguiente: NIS 73 5 ' -ATGTGAAGATGGGCAAGACC-3 ' NIS 74 5 ' -ATCTCCATGTGAAGATGGGC-3 ' NIS 75 5 ' -AACGGCCTATCTCGAGGAAT-3 ' NIS 76 5 ' -AACATCGTCGAGCAATTTCC-3 ' NIS 77 5 ' -AATCCAACTCCTTTGCCCTT-3 ' NIS 78 5 ' -AAACCTGAGCCAGAACCTGA-3 ' NIS 79 5 ' -AGGGCGATCTAATGAAGGGT-3 ' NIS 80 5 ' -AGTGCACAGAAAGGACCCAC-3 ' NIS 81 5 '-ACACTGGTCCAGCAATGACA-3 ' NIS 82 5 ' -TTCCTGTTGACTGAGTTGCG-3 ' NIS 83 5 ' -CACTCTGTGGTTTGGAGCAA-3 ' NIS 84 5 ' -CAAGGCCAGGTGATGACTTT-3 ' NIS 85 5 ' -CACACTGGTCCAGCAATGAC-3 ' NIS 86 5 * -CTGACACCAACCAGAGCTGA-3 ' NIS 87 5 ' -CTCTGCCATCTGTTTGGGAT-3 ' NIS 88 5 ' -TCAAAAAGGGATCCATGCTC-3 * NIS 89 5 ' -TGACACCAACCAGAGCTGAG-3 ' NIS 90 5 ' -TGATGCCTTCCTGTTGACTG-3 ' NIS 91 5 ' -TTCCTGTTGACTGAGTTGCG-3 ' NIS 92 5 ' -TTCTCCAAATCGACCTTTGC-3 ' NIS 93 5 ' -GGAGAGTTCAGGCAAAGCTG-3 ' Preparación farmacéutica que comprende por lo menos un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 15 - 17 así como miméticos, variantes, sales y sus isómeros ópticos y/o al menos un compuesto antisentido que comprende un vector que permite transcribir por lo menos un dicho oligonucleótido junto con al menos un vehículo, excipiente o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Preparación farmacéutica según la reivindicación 18, en donde la preparación farmacéutica es una solución de infusión o una matriz sólida para la liberación continua del ingrediente activo. Preparación farmacéutica según las reivindicaciones 18 o 19, en donde la preparación farmacéutica es apropiada para una administración local en el cerebro. Uso de por lo menos un oligonucleótido según las reivindicaciones 15 a 17 así como miméticos y variantes del mismo y/o al menos un compuesto antisentido que comprende un vector que permite transcribir por lo menos un dicho oligonucleótido o una formulación farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 para promover regeneración exitosa y reconexión funcional de vías neurales perjudicadas. 22. Uso de por lo menos un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 así como miméticos y variantes del mismo y/o al menos un compuesto antisentido que comprende un vector que permite transcribir por lo menos un dicho oligonucleótido o una formulación farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 para profilaxis, prevención terapéutica y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, traumáticas, postraumáticaß, vasculares/hípóxicas, neuroinflamatorias y postinfecciosas del Sistema Nervioso Central, así como reducciones inducidas por la edad en la neoformación de células madres neuronales. 23. Uso según la reivindicación 22 para inhibir la expresión de TGF-Ri en enfermedades asociadas con niveles de TGF-Rj regulados hacia arriba y aumentados. 24. Uso según la reivindicación 22 o 23 en donde las enfermedades asociadas con una señalización de TGF-Ri regulada hacia arriba o aumentada o las enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamotorias se eligen del grupo que comprende lo siguiente: La enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) , variante nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD) , la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofia multisistema, demencia, demencia frontemporal, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs) u otras enfermedades de neuronas motoras, esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial, meningoencefalitis viral, enfermedades autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (MS) , lesiones agudas isquémicas/hipóxicas, infarto, traumatismo de la médula espinal y del SNC, traumatismo de la cabeza y espinal, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia microangiopática, la enfermedad de Binswanger (Leuoaraiosis) , degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear, demencia relacionada con el SIDA, retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil tremor/ataxia (FXTAS) , Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP) , degeneración estriadonigral (SND) , degeneración olivopontocerebelosa (OPCD) , síndrome de Shy Drager (SDS) , deficiencias de la memoria debidas a la edadd, trastornos del neurodesarollo asociados con demencia, síndrome de Down, sinucleinopatías, mutaciones de dismutasa de superóxido, enfermedades de repetición de trinucleótido, traumatismo, hipoxía, enfermedades vasculares, inflamaciones vasculares, envejecimiento del SNC Uso según la reivinidicación 22 para inhibir la actividad de TGF-D en enfermedades asociadas con niveles regulados hacia arriba o aumentados de TGF-D? Uso según la reivindicación 22 o 25 en donde las enfermedades asociadas con niveles del TGF-D regulados hacia arriba o aumentados o los enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamotorias se eligen del grupo que comprende lo siguiente: La enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) , variante nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD) , la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofia multisistema, demencia, demencia frontemporal, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs) u otras enfermedades de neuronas motoras, esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial, meningoencefalitis viral, enfermedades autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (MS) , lesiones agudas isquémicas/hipóxicas, infarto, traumatismo de la médula espinal y del SNC, traumatismo de la cabeza y espinal, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia microangiopática, la enfermedad de Binswanger (Leuoaraiosis), degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear, demencia relacionada con el SIDA, retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil tremor/ataxia (FXTAS) , Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP) , degeneración estríadonigral (SND) , degeneración olivopontocerebelosa (OPCD) , síndrome de Shy Drager (SDS) , deficiencias de la memoria debidas a la edadd, trastornos del neurodesarollo asociados con demencia, síndrome de Down, sinucleinopatías, mutaciones de dismutasa de superóxido, enfermedades de repetición de trinucleótido, traumatismo, hipoxía, enfermedades vasculares, inflamaciones vasculares, envejecimiento del SNC. Método para identificar un compuesto que influye en (a) la actividad biológica de TGF-RI o la expresión de TGF-R! o (b) la señalización de TGF-ßl/TGF-R, que comprende los siguientes pasos : (a) incubar un compuesto candidato con un sistema de prueba que comprende TGF-ßl y células precursoras neuronales, y (b) ensayar la expresión de receptores activos de TGF o la proliferación de las células precursoras neuronales; en donde ¡c) una abolición de (i) la supresión de la expresión de receptores TGF activos o (ii) supresión de la proliferación de las células precursoras neuronales en comparación con el sistema de prueba en ausencia de dicho compuesto de prueba indica la presencia de un compuesto candidato que tiene las propiedades deseadas .