MXPA06007636A - Metodos para la deteccion de cancer cervical. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos para detectar cancer cervical en un individuo. Especificamente, la invencion es relativa a las proteinas catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12 como proteinas asociadas a cancer cervical, lo cual permite una rapida deteccion de cancer cervical o un precursor del mismo. La invencion tambien es relativa a equipos de diagnostico utiles en la deteccion de cancer cervical o un precursor de mismo en un individuo.

Description

MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE CÁNCER CERVICAL ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un método para la detección de cáncer cervical.

Más específicamente, la presente invención se relaciona a proteínas asociadas a cáncer cervical las cuales actúan como marcadores útiles en la detección de cáncer cervical.

Cada año más de 450,000 casos de carcinoma invasivo del cuello de útero son diagnosticados alrededor del mundo, lo que resulta en casi un cuarto de millón de muertes (Parkin et al., 2001, Eur. J. Cáncer, 37: S4-S66). A pesar de ser una enfermedad teóricamente prevenible, el cáncer cervical es aún la segunda causa más común de cáncer en la mujer (después del cáncer de seno) (Bosch et al, 2002, J. Clin. Pathol. 55:244-265), y la quinta causa más frecuente de cáncer, con una prevalencia estimada de 1.4 millones de casos. Su velocidad de incidencia es una de las más altas en los países en desarrollo, lo cual produce el 80% de la carga de cáncer cervical. Es la causa más común de mortalidad ligada a cáncer entre las mujeres en muchos países de África, Centro y Sudamérica, y el Caribe.

En Europa Occidental, son diagnosticados cada año aproximadamente 35,000 nuevos casos de cáncer cervical y 15,000 mujeres mueren de esa enfermedad (Ferlay et al., 2002, http://www-depdb.iarc.fr/globocan/GLOBOframe.htm). En el año de 2003, en los Estados Unidos de Norteamérica, se estimaron aproximadamente 13,000 nuevos casos, y 4,000 muertes (Sanders y Taira, 2003, Emerg. Infecí. Dis. 9: 37-48) La mayoría de los canceres cervicales (al menos el 75%) son del tipo celular escamoso. Los adenocarcinomas cuentan para un 15%, y han ido aumentando en incidencia durante las últimas décadas, particularmente en las mujeres jóvenes (Zheng et al., 1996, Int. J. Epidemiol, 25: 252-258). El termino invasivo se refiere a tumores en los cuales las células malignas han penetrado la membrana basal y han infiltrado el estroma, con invasión vascular y/o linfática. Los canceres invasivos de células escamosas son agrupados como pobre o moderadamente diferenciados. Las lesiones no invasivas de células escamosas son clasificadas como precancerosas (atipia, displasia o neoplasia cervical intra-epitelial, o como carcinoma in situ, basadas en el grosor del epitelio ocupado por tipos celulares basaloides indiferenciados (células que recuerdan la capa celular basal del epitelio). Las lesiones de neoplasia cervical intraepitelial presentan algunas características morfológicas con las células del carcinoma in situ, y se piensa que representan los cambios morfológicos primarios asociados con el cáncer cervical invasivo. Es aceptado extensamente que tanto la neoplasia cervical intraepiteliar como el carcinoma in situ son etapas en el desarrollo del cáncer cervical invasivo, con lesiones de carcinoma in situ pensadas para representar el cáncer cervical invasivo.

El perfil clínico y epidemiológico del cáncer cervical ha sido ampliamente reconocido como sugerente de un proceso transmitido sexualmente, y numerosos estudios han confirmado la asociación enfre la exposición sexual y el desarrollo de carcinoma in situ y cáncer cervical invasivo, estimulando una búsqueda para agentes específicos transmitidos sexualmente que pudieran actuar como carcinógenos en canceres de genitales. Existe una evidencia consistente y convincente de que el cáncer cervical es una consecuencia extraña de la infección del fracto genital con algunos tipos mucosafrópicos del virus del papiloma humano (Bosch et al, 2002, J. Clin. Pathol. 55: 244-265).

El virus del papiloma humano, un virus pequeño de doble cadena, fue aislado y ligado a la patogénesis del cáncer cervical a principios de los años 80. La evidencia clínica, epidemiológica, y de biología molecular indica que tipos específicos de virus de papiloma humano transmitidos sexualmente son el factor causal central en al menos el 95% de los casos de cáncer cervical invasivo (Bosch et al, 2002, J. Clin. Pathol. 55: 244-265). La evidencia también implica a la infección por el virus del papiloma humano en una considerable proporción de ofros tipos de cáncer del fracto ano-genital, incluyendo cáncer de vulva, vagina, canal anal, penis, y piel perianal, así como en algunas carcinomas orofaríngeos y esofágicos (Gillison y Shah, 2003, J. Natl. Cáncer Inst. Monorg. 31: 57-65). Existen más de 100 tipos de virus del papiloma humano, definidos esos sobre una base de la homología del ADN, de los cuales más de 40 cepas pueden infectar la capa epitelial del fracto ano-genital. La infección clínica y subclínica del virus del papiloma humano es hoy en día la causa más comunes de infecciones transmitidas sexualmente, con aproximadamente una infección cervical asintomática detectable en 5-40% de las mujeres en edad reproductiva (Woodman et al., 2001, Lancet, 357: 1831-1836), y un riesgo de infección con cualquier cepa del virus de papiloma humano de 50-80%. La prevalencia del ADN del virus de papiloma humano (una medida de la exposición al virus a un punto determinado de tiempo) y su seroprevalencia (una medida de la exposición acumulada al virus) están fuertemente asociadas con el número parejas sexuales recientes (Kjaer et al., 2002, MBJ, 325: 572). Las mujeres vienen a ser positivas al virus del papiloma humano poco después del inicio de su actividad sexual (Ho et al, 1998, N. England J. Med. 338: 423-428). Alrededor del 20-30% de las mujeres infectadas con el virus del papiloma humano albergan múltiples tipos del virus (Rousseau et al, 2003, Sex. Transm. Dis. 30: 581-587). La infección con este virus generalmente persiste por 6-12 meses en el fracto genital (el tipo 16 del virus del papiloma humano tiende a persistir más que ofros tipos) y entonces viene a ser indetectable (Elfgren et al., 2000, Am. J. Obstet. Gynecol. 183: 561- 567), aunque no esta claro la fracción de las infecciones que son completamente eliminadas con respecto a aquellas mantenidas en un estado de latencia (Galloway, 2003, Lancet Infect. Dis. 3: 469-475). La infección con tipos oncogénicos de alto riesgo del virus del papiloma humano (predominantemente los tipos 16 y 18) pueden llevar a desarrollar cáncer cervical. El tipo 16 del virus del papiloma humano es el tipo onco génico más común, y esta presente en un 50% de los cánceres cervicales y en neoplasias cervicales infraepiteliales de alto grado, y en un 25% de neoplasias cervicales intraepiteliales de bajo grado. Se estima que el 20% de los adultos vienen a ser infectados con el tipo 16 en alguna etapa de su vida. Juntos, los tipo 16 y 18, suman para un 70% de los casos de cáncer cervical invasivo en todo el mundo (Bosch et al., 1995, J. Natl. Cáncer Inst. 87: 796-802). El 30% restante de los cánceres contienen un cóctel local de otros tipos oncogénicos del virus del papiloma humano, la mayoría de los tipos 31, 33, y 45, y menos frecuentemente, los tipos 35, 51, 52, 58, y 59 (Muñoz et al., 2003, N. Engl. J. Med. 348: 518-527).

La prueba estándar para el cáncer cervical es la técnica de Papanicolao. Papanicolao G., el padre de la citología exfoliativa, mientras examinaba frotis vaginales para observar cambios citológicos relacionados al ciclo menstrual, descubrió la presencia de células altamente anormales las cuáles resultaron ser células de tumor maligno. Él y Traut H. publicaron sus primeros estudios en 1943 con respecto al potencial de diagnóstico para cáncer que tenía la examinación de frotis de fluido vaginal. Ya que las células se acumulan en los fluidos corporales por desprendimiento espontáneo de órganos adyacentes, el procedimiento se refiere generalmente como citología exfoliativa. Esta técnica es un paso extremadamente importante en la medicina preventiva; el procedimiento esta aún en uso como una prueba de tamizaje en mujeres para la detección de cáncer uterino primario (DeMay, 1997, Arch. Pathol. Lab. Med. 121: 229-238).

Sin embargo, existen diversas limitaciones a la técnica de Papanicolao. La técnica de Papanicolao involucra el examen histológico manual de frotis celulares teñidos, la tecnología es laboriosa y llena de variación en la interpretación conduciendo al potencial de diagnósticos falso negativos (Davey, 1997, Arch. Pathol. Lab. Med. 121:267-269; Mitchell et al., 1997, Cytopath. 6:368-375). Otros problemas con dicha prueba incluyen diversas carencias citotecnológicas, carencia de controles internos de calida, y problemas con la clasificación de los resultados (Slagel et al, 1995, Diag. Cytopath. 13:26-30). Además, la interpretación de hallazgos citológicos es complicado por el hecho de que se utilizan muchos criterios diferentes de clasificación para una única condición patológica. Por ofro lado, los cambios hormonales o la evaluación hormonal no se encuentran incluidos en el sistema y la clasificación no es compatible con la evaluación de lesiones endometriales o enfermedades crónicas (Kashimura et al., 1993, Sangyo D a Daigaku Zasshi, 15: 37-43). La técmca de Papanicolao puede ser también poco confiable para detectar neoplasia cervical infraepitelial (Slawson et al., 1993, J. Fam. Pract. 36: 289-293). Debido a cuestiones sobre la confiabilidad de la técnica, se recomienda una colposcopía, o un lavado del cervix con ácido acético después de un resultado positivo (Slawson et al., 1992, J. Fam. Pract. 35: 271- 277). Los falsos negativos no son sujetos a un tamizaje subsiguiente y puede llevar a un avance innecesario en la enfermedad.

La sensibilidad de esta técnica para la detección de precursores de cáncer cervical invasivo es sub-óptima y variable, variando entre 30-90% en diversos estudios, y es altamente dependiente de la colección adecuada de la muestra, preparación e interpretación de la tinción (Martin-Hirsch et al., 2002, Eur. J. Gynaecol. Oncol. 23: 363-365). La especificidad de la prueba varía entre 85-100%, y de esta forma su valor predictivo para predecir con seguridad el riesgo de desarrollo de carcinoma in situ y cáncer cervical invasivo es imperfecto. Aproximadamente el 7% de las mujeres que se les practica la prueba de Papanicolao son diagnosticadas con una anormalidad citológica que requiere una evaluación posterior (Crum, 2002, N. Engl. J. Med. 347: 1703-1705).

En este sentido, existe la necesidad de marcadores confiables que estén expresados diferencialmente en tejido normal y canceroso cervical y que puedan ser útiles en la detección de cáncer cervical. De esta forma, el objeto de de esta invención es proporcionar moléculas asociadas a cáncer cervical las cuáles son útiles como marcadores para la detección temprana y/o rápida del cáncer cervical en un individuo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo a un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar cáncer cervical o un precursor de cáncer cervical en un paciente y que comprende los pasos de a) proporcionar una muestra de tejido o fluido corporal de un paciente, y b) determinar la presencia de la sobreexpresión de catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12.

De acuerdo a un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar la progresión de cáncer cervical en un paciente y que comprende los pasos de a) proporcionar una muesfra de tejido o fluido corporal de un paciente, y b) determinar la presencia de la sobreexpresión de catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12.

Como se utiliza aquí, el término "cáncer cervical" se refiere a cualquier cáncer o lesión de cáncer asociada con el tejido cervical o células cervicales y, además, incluye precursores al cáncer cervical, por ejemplo, displasia (también conocida como una neoplasia cervical infraepitelial o una lesión escamosa infraepitelial).

El método de la invención puede efectuarse en cualquier muestra relevante de tejido o fluido corporal. Por ejemplo, el método de la invención puede efectuarse en tejido cervical, más preferiblemente en una biopsia de tejido cervical, y más preferiblemente en un frotis. Alternativamente, el método puede efectuarse en una muesfra de fluido corporal humano seleccionado del grupo consistente de: sangre, suero, plasma, saliva, fluido ascítico, fluido peritoneal, esputo, y exudado de seno. Se contempla que el método de la invención puede ser útil en ensayos para células metastásicas de cáncer cervical en otras muestras de tejidos o fluidos corporales.

La sobreexpresión de catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12 en una muesfra de tejido o fluido corporal se puede detectar utilizando cualquiera de los métodos de prueba disponible en el estado del arte. En una modalidad, por ejemplo, dicha proteínas pueden reaccionar con una porción ligadora marcada capaz de unirse específicamente a las proteínas en cuestión para producir un complejo marcado de la porción ligadora y las proteínas en cuestión. El complejo marcado puede entonces detectarse, utilizando metodologías convencionales muy conocidas en el estado del arte. La detección de la presencia del complejo marcado proporciona así una indicación de la presencia de células de cáncer cervical o células pre-cancerosas en el individuo. Como se usa aquí, la porción ligadora es marcada con una porción detectable, por ejemplo, una marca radioactiva, fluoroscópica, espectroscópica, o enzimática, utilizando técnicas muy conocidas en el estado del arte.

La porción ligadora, la cual interactúa y se une específicamente con la proteína blanco, se puede diseñar utilizando métodos convencionales muy conocidos en el estado del arte. En la invención, la porción ligadora puede ser un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal. Se prefieren los anticuerpos monoclonales. Se contempla también que se pueden incluir otras porciones de unión, por ejemplo, sitios biosintéticos de unión del anticuerpo, referidos en el estado del arte como BABS o sfv's, y fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, Fv, Fab, Fab' y (Fab')2. Los procedimientos para preparar, probar, y marcar BABS y fragmentos de anticuerpos son muy conocidos en el estado del arte, y no se discutirán al detalle.

En otra modalidad, una o todas las proteínas catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12 en una muesfra pueden detectarse al aislar primero a las proteínas de la muesfra, y entonces separar las proteínas utilizando sistemas electroforéticos. El patrón electroforético entonces se puede comparar con un estándar. Alternativamente, las proteínas marcadoras, una vez identificadas se pueden aislar de la muesfra utilizando métodos de purificación muy conocidos para un técnico en la materia, tales como la cromatografía de afinidad, para producir proteínas aisladas. Como se utiliza aquí, el término "aislado" se entiende que significa substancialmente libre de material proteico contaminante.

Además, un técnico en la materia puede producir secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen a las proteínas catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12, o fragmentos de las mismas, utilizando métodos actualmente disponibles en el estado del arte (ver por ejemplo, Maniatis et al., eds (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press). Además, un técnico en la materia, utilizando tecnologías descritas en las patentes norteamericanas 4, 885,236 y 4, 882,268 puede aislar a partir de una muesfra celular una molécula de ácido nucleico que codifica para cada una de las proteínas catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12. La detección de las moléculas de ácido nucleico arriba mencionadas puede servir de este modo como un indicador de la presencia de un precursor de cáncer cervical, cáncer cervical, y/o cáncer cervical metastásico en un individuo. Las moléculas de ácido nucleico arriba mencionadas pueden detectarse, por ejemplo, por el análisis de Northern blot al reaccionar la muesfra con una sonda de hibridación marcada, por ejemplo, una sonda de oligonucleótido marcado con 32P, capaz de hibridar específicamente con al menos una porción de las moléculas de ácidos nucleicos codificantes para las proteínas catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12. La detección de dichas moléculas de ácidos nucleicos sirve como un indicador de la presencia de cáncer cervical en un individuo.

De acuerdo a un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un equipo para determinar la presencia de cáncer cervical o para evaluar la eficacia de un fratamiento terapéutico de cáncer cervical en un paciente. Tal equipo puede comprender, en combinación, i) un receptáculo para colocar una muesfra de tejido o fluido corporal humano, ii) un ligador que se une específicamente a un epítopo de las proteínas arriba mencionadas o a una secuencia de ácido nucleico que codifica a dichas proteínas, iii) medios para detectar la unión del ligador con las proteínas o ácido nucleico que las codifica, y iv) una muesfra de referencia. En una modalidad del equipo, la muesfra de referencia puede comprender un control negativo y/o positivo. Siendo el confrol negativo un indicativo de una célula cervical normal y siendo el confrol positivo un indicativo de cáncer cervical.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DD3UJOS Figura 1. Niveles de expresión de ARNm de catepsina f (CTSF), metaloproteinasa 11 (MMP 11), y metaloproteinasa 12 (MMP 12) en tumores cervicales detectado por RT-PCR. Las muestras utilizadas fueron: carril a) confrol positivo, carril b) confrol negativo, carriles 1-4 tejido cervical normal, carriles 5-7, y 13-14 muestras de tejido tumoral positivo al virus 18 del papiloma humano 18, carriles 8-12 muestras de tejido tumoral positivos al virus 16 del papiloma humano.

Figura 2. Hibridación in situ de tejido cervical con sondas para CTSF, MMP11, y MMP12. A) Cáncer de seno (como control positivo de CTSF), B) Epitelio cervical normal, negativo para hibridación con CTSF, C) Lesión intraepitelial escamosa grado superior con tinción positiva. D) Cáncer cervical positivo para hibridación con CTSF, E) Cáncer de seno (como confrol positivo para MMP 11), F) Epitelio cervical nopnal, negativo para hibridación con MMP11, G) como en C), positivo para hibridación con MMP11, H) hibridación positiva para MMP 11 en cáncer cervical, I) Cáncer de seno (como confrol positivo para MMP 12), J) Hibridación negativa para MMP 12 en epitelio normal, K), como en C y G positivo para hibridación con MMP 12, y L Hibridación positiva para MMP 12 en cáncer cervical.

Figura 3. Detección por inmunohistoquímica de MMP 11 y MMP 12 en tejido cervical. A) Muesfra de cáncer de seno (como control positivo para la tinción de MMP 11), B) Confrol negativo; una muestra de cáncer cervical sin anticuerpo primario; C) Tinción negativa para MPPl l en tejido cervical normal; D) Lesión infraepitelial escamosa grado inferior el cual presenta una inmunotinción positiva para MMP11, E) Tinción positiva para MPPl l en lesión infraepitelial escamosa grado superior; F) Inmunoreacción positiva para MPPll en cáncer cervical; G) Confrol positivo para MMP 12, H) Como en B, control negativo para MMP 12, I) Tinción negativa para MMP 12 en tejido cervical nopnal; J) Inmunoreacción positiva para MMP 12 en lesión infraepitelial grado inferior; K) Inmunoreacción para MMP 12 en lesión infraepitelial escamosa grado superior; y L) ínmunoreacción positiva para MMP12 en cáncer cervical.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para la detección de cáncer cervical, o un precursor de cáncer cervical en un paciente. La invención esta basada, en parte, al descubrimiento de las proteínas catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12 asociadas al cáncer cervical, o a precursores de cáncer cervical, las cuales están presentes a niveles altamente detectables en células cancerosas cervicales.

Las proteínas catepsina f, metaloproteinasa 11- y metaloproteinasa 12 en una muesfra se pueden reaccionar con una porción ligadora capaz de unirse específicamente a dicha proteínas. La porción ligadora puede comprender, por ejemplo, un miembro de un ligando-receptor. La porción ligadora puede comprender, por ejemplo, un miembro de una unión específica, tal como antígeno-anticuerpo, enzima-sustrato, ácido nucleico-ácido nucleico, proteína-ácido nucleico, proteína-proteína, u otra unión específica conocida en el estado del arte. Opcionalmente, la porción ligadora puede estar ligada, a su vez, con una etiqueta detectable, tal como una etiqueta enzimática, fluorescente, radioactiva, fosforescente o partícula coloreada. El complejo marcado se puede detectar, por ejemplo, visualmente o con la ayuda de un espectrofotómefro u ofro detector.

Las proteínas catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12 se pueden detectar también al utilizar sistemas de separación electroforética disponible en el estado de la técnica.

Dichas proteínas también se pueden detectar utilizando cualquiera de las técnicas de inmunoensayo disponibles en el estado del arte. Por ejemplo, se puede emplear el formato de inmunoensayo de sandwich para detectar cáncer cervical en una muesfra de fluido corporal. Alternativamente, se puede utilizar procedimientos inmunohistoquímicos convencionales para detectar la presencia de dichas proteínas en una muesfra de tejido, por ejemplo, en un frotis de Papanicolao, utilizando una o más proteínas ligadoras marcadas.

En un inmunoensayo tipo sandwich, son utilizados generalmente dos anticuerpos capaces de unirse a las proteínas en cuestión, uno de ellos inmovilizado en un soporte sólido, y el ofro libre en solución y marcado con un compuesto químico detectable. Los ejemplos de etiquetas químicas que pueden utilizarse para el segundo anticuerpo incluyen radioisótopos, compuestos fluorescentes, y enzima u otras moléculas las cuales generan productos coloreados o electroquímicamente activos cuando se exponen a un reactivo o sustrato enzimático.

Las proteínas catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12 pueden ser utilizadas para el desarrollo de equipos de diagnóstico y otras pruebas de evaluación de tejidos para monitorear el nivel de las proteínas en una muesfra de tejido o fluido. Por ejemplo, el equipo puede incluir anticuerpos u otras proteínas de unión específica los cuales se unen específicamente con las proteínas catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12, lo cual permite la presencia y/o concentración de dichas proteínas a ser detectadas y/o cuantificadas en una muesfra de tejido o fluido.

Una molécula de ácido nucleico que codifica para las proteínas en cuestión puede ser detectada utilizando una porción ligadora, capaz de unirse específicamente a la molécula de ácido nucleico blanco. La porción ligadora puede comprender, por ejemplo, una proteína, un ácido nucleico. Adicionalmente, un ácido nucleico blanco, tal como un ARNm codificante para las proteínas en cuestión, puede detectarse, por ejemplo, por análisis de Northern blot utilizando oligonucleótidos marcados, tales como fragmentos de ácido nucleicos complementarios a y capaz de hibridar específicamente con al menos una porción de un ácido nucleico blanco. Mientras que cualquier longitud de oligonucleótido puede utilizarse para hibridar un transcrito de ARNm, los oligonucleótidos típicamente denfro del rango de 8-100 nucleótidos, preferiblemente del rango 15-50 nucleótidos, son considerados más útiles en pruebas estándar de hibridación.

De esta forma, el cáncer cervical o un precursor del mismo, puede ser identificado por la presencia de las proteínas catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12 como se ha descrito arriba. Además, los métodos proporcionados en la presente solicitud pueden ser utilizados para monitorear la progresión y/o el fratamiento de la enfermedad. Los siguientes ejemplos, únicamente ilustrativos y no limitativos de la invención, proporcionan detalles de la metodología para la detección de cáncer cervical o un precursor de mismo.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Líneas celulares y muestras de tejidos para los ensayos de apeglos de ADNc y RT-PCR. Las células HeLa (HPV18), SiHa (HPV16) y CaSki (HPV16) crecieron en un medio de cultivo. Las líneas designadas CaLO (derivadas de carcinoma invasivo escamoso etapa IIB, HPV18) y INBL (derivada de carcinoma invasivo escamoso IV A, HPV18 se establecieron en la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza-UNAM, México. Las biopsias frescas de lesiones de displasia se tomaron durante colposcopía de 20 pacientes en el Centro Nacional de Displasias, en la Ciudad de México. Se obtenidos 22 tejidos cervicales normales, denfro de las 2 primeras post mortem, de mujeres pre-menopaúsicas quienes murieron de causas no relativas a problemas ginecológicos. Todos los procedimientos descritos fueron aprobados y evaluados por el Comité de Ética del Instituto Mexicano del Seguro Social. Todas las muestras fueron divididas en 3 secciones, la parte cenfral fue congelada y almacenada en nitrógeno líquido hasta exfracción de ADN, y los exfremos de las biopsias fueron fijados toda la noche en etanol al 70% y embebidos en parafina. Secciones seriales de los exfremos de las biopsias se tiñeron con Hematoxilina/Eosina y se inspeccionó todo el tejido microscópicamente. Las muestras de carcinoma se consideraron como representativas cuando al menos el 70% de las células en la sección del tejido consistían de células cancerosas. Las muestras de tejidos normales se consideraron como tales cuando al menos 80& de la muesfra consistía microscópicamente de tejido normal ectocérvico y la ausencia de infección por el virus de papiloma humano. Todas las muestras invasivas se diagnosticaron como lesiones escamosas.

Ejemplo 2. Aislamiento de ácidos nucleicos para la preparación de la sonda y RTPCR. Tanto el ADN como el ARN fueron aislados de todas la muestras de tejido las cuales cumplían los criterios requeridos (carcinoma de células escamosas, tipo 16 y 18 de virus del papiloma humano, al menos el 70% de células cancerosas en la biopsia, y de las líneas de células de cáncer cervical) utilizando el reactivo Trizol (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island NY USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y fueron sujetas a la tipificación del viras utilizando la reacción de PCR utilizando los iniciadores consenso MY09/MY11 y secuenciación directa. El ADN potencialmente contaminante fue removido utilizando el tratamiento de ADNasa I libre de ARNasa. La concentración resultante de ARN se midió especfrofotométricamente y la calidad de los ácidos nucleicos se confirmo en geles de agarosa.

Ejemplo 3. Preparación de la sonda de ADN. Los ADNc se sintetizaron de acuerdo al manual del usuario del Sistema Ambion. Esas muestras fueron: las líneas celulares HeLa, SiHa, CaSki, CALO e INBL, fres muestras de tumor HPV16+ (T07, T31, T64) y fres muestras HPV- normal (N03, NI 1, N22). Las sondas de ADNc se obtuvieron por RT-PCR a partir de 500 ng RNA en presencia de (a-33P) dATP (3000 Ci/mmol, NEN). Brevemente, los ARNs fueron desnaturalizados a 70°C durante 10 min y los ADNc fueron sintetizados a 42°C por priming con oligo-dT en un volumen final de 30 µl. Los ADC marcados se purificaron por cromatografía de columna. La incorporación final de la radiomarca fue aproximadamente 1 x 108 cpm por reacción.

Ejemplo 4. Hibridación y análisis de arreglos. Los "blots" del arreglo del sistema de ULTRArray Advantage System (Ambion Inc. Austin Texas USA) conteniendo 8400 genes fueron prehibridados a 68°C por al menos 90 minutos antes de la adición de la sonda en el amortiguador de hibridación. Entonces, 1.5 x 107 cpm de cada ADNc marcado se añadieron al amortiguador. La hibridación se efectuó a 60°C toda la noche en una botella rotatoria. Los apeglos fueron lavados dos veces con SSC 2X y SDS al 0.5 % a 60°C por 30 minutos, seguido por dos lavados astringentes con SSC 0.5X, y SDS al 0.5% a la misma temperatura y por la misma longitud de tiempo. Finalmente, los apeglos fueron sellados en plástico y expuestos a placas de imagen (BASMP 2040S; Fuji, Nakamura, Japan) por 24 horas, las cuales fueron escaneados con un fosfoimagen/fluoroimagen STORM 860 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire UK) para obtener imágenes de 16-bit. Se utilizó el software ArrayVision (Image Research Inc) para dicho análisis. Los artefactos fueron eliminados y la intensidad de cada mancha fue analizada después de restar el fondo. Entonces, los datos se normalizaron y analizaron utilizando bioconductores "limma" y empaque "marray" para todos los genes presentados en el arreglo y fueron los medios del apeglo normal (fres muestras normales). La frecuencia de los casos positivos se obtuvo al comparar el apeglo nopnal medio con cada arreglo de línea celular o tumor individual. La frecuencia del umbral fue colocada al 40% y los valores de umbral de la proporción de intensidad (tumor; normal) de 4 sobreregulaciones y -l para subregulaciones presentes en todas las muestras fueron usadas en un intento para detectar los cambios significativos de expresión.

Ejemplo 5. Análisis de RT-PCR análisis. 200 ng de ARN total de todas las muestras fueron transcritos de forma reversa utilizando el Sistema Access de RT-PCR (Promega, Madison, Wl). Los Iniciadores de los genes de interés fueron diseñados utilizando el Software Integrated DAN Technologies (http://biotools.idtdna.com/gateway): Catepsina F (CTSF) 396 bp, TM=67°C, (5*-GTGCTGATCAGAGTGGCTGCTGC-3' y 5'-AGTTTCCYGGACATGGAGAGGGAC-3'); metaloproteinasa 12 (MMP12), 370 bp TM=55°C (5'-TCACGAGATTGGCCATTCCTT-3' y 5'-TCTGGCTTCAATTTCATAAGC- 3'); y metaloproteinasa 11 (MMP11/ STMY3), 399 bp, TM=66°C, (5'-CCATGGCAGTTGGTGCAGGAGCAG-3' y 5*- TGCAGTCATCTGGGCTGAGACTCA-3'); y actina: (5'- TGAAGTCTGACGTGGACATC-3' y GTTCGTTCCTCATACTGCTCA-3') 243 bp, TM = 55°C. Las condiciones del RT-PCR fueron: para la síntesis de a primera cadena de ADNc 48°C por 45 minutos y 94°C por 2 minutos para desnaturalizar el templado, y para la síntesis de la segunda cadena y amplificación de ADN 94°C por 30 segundos, (TM°C específica para cada grupo de iniciadores) por 1 minuto, y 68°C por 2 minutos por un total de 24 ciclos, seguido por un paso a 68°C por 7 minutos. Los productos fueron visualizados en geles de agar al 1.5% teñidos con bromuro de etidio, y las señales fueron cuantificadas por densitometría utilizando el sistema de análisis Meta View (versión 4.5 Universal Imaging Corp., USA). La expresión de MMP11, MMP12 y CTS se estandarizó a la expresión de actina probada para el mismo ADNc en reacciones separadas de PCR y corridas en paralelo sobre geles separados. La media estandarizada de cada triplicado de PCR fue expresada en relación a los niveles de ADC de actina. En general, los análisis presentaron resultados significante consistentes con aquellos obtenidos por los apeglos de ADNc. Todas la ocho muestras investigadas por medio de los apeglos de ADNc presentaron una expresión elevada de CTSF, y en línea con esto, las intensidades de las bandas de tumor en geles de agarosa, cuando se comparan con la intensidad de la banda del control, se mostraron aumentadas de un promedio de 1.2 a 7 veces en todos los tumores para CTSF en los análisis de RT-PCT. Todas las muestras estudiadas por análisis de microarreglo de ADNc tuvieron una expresión aumentada de MMP 11, y tuvieron una media de 6 veces de aumento por RT-PCR. La gran diferencia enfre los dos métodos se encontró en la expresión de MMP 12.

Ejemplo 6. Hibridación in situ. Secciones de tejido de 5 micrómetros se obtuvieron a partir de bloques de parafina TMA, desparafinados y rehidratados en una serie de etanol graduado (100, 90, 70, y 30%), y transferidos a solución PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO , 1.4 mM KH2PO4) por 10 min. Los tejidos fueron tratados con solución de ADNasa (1 µg/ml) por 10 minutos a 37°C y lavados tres veces con solución PBS. La inactivación de la peroxidasa endógena se llevo a cabo al incubar las muestras en peróxido de hidrógeno al 3% en metanol por 40 minutos. Sonda sentido y antisentido de los genes CTSF, MMP 11 y MMP 12 se generaron por PCR de cadena sencilla utilizando ADNc específico obtenido de ARN de células de SiHa como templado y marcado con biotina- 16-dUTP (Roche). Cada tejido fue cubierto con 50 µl de cóctel de hibridación y cubiertas con un portaobjetos. El cóctel de hibridación consistió de formamida al 50%, sulfato de dextrán al 10%, SSC 2X, (SSC 20X: NaCl 3 M, Na3C6H5O7 300mM), PBS, SDS al 2%, 100 µg/ml esperma de salmón sonicado y 50 ng de sonda marcada con dUTPbiotina (sentido o antisentido). Tanto la sonda como el ARN de tejido fueron desnaturalizados a 65°C por 10 minutos. Después de la hibridación, el portaobjetos fue embebido en solución salina amortiguada con Tris con amortiguador Tween IX (TBST 10X: 500 nmol/L TrisHCL, pH 7.6, 3 mol/L NaCl, 1% Tween 20), y los tejidos fueron incubados a 55°C por 20 minutos en solución de lavado astringente. Se aplicó inmediatamente a los tejidos el anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano (GenPoint System from DAKO) y se incubaron por 15 minutos en una cámara humidificadota. Las secciones se lavaron en TBST IX. Se aplicó a secciones de tejido Biotinil tiramide durante 15 minutos a temperatura ambiente para amplificar la señal, y se lavaron en TBST. Un segundo paso de anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano se llevo a cabo y la reacción de color se desarrollo con 0.06% diaminobenzidina al 0.06% (DAB) en 3% H2O2. Finalmente, frieron lavados, confrateñidos con hematoxilina, deshidratados en etanol grado y montadas. Los controles negativos para la hibridación in situ se llevo a cabo con las sondas sentido o con tratamiento con solución ARNasa (100 µg/ml por 30 minutos a 37°C) antes de la hibridación in situ. Las células se regisfraron como positivas para MMP11, MMP 12 y CTSF cuando presentaron una expresión citoplásmica bajo la luz del microscopio. Únicamente la región neoplásica de cada tejido se evaluó. Para probar la tinción del citoplasma, la placa de vidrio se observó a 40x de magnificación. Lo positivo de las células en cada sección de tejido se estimó como la intensidad media de la señal, en donde: (0) es tinción positiva presente en al menos la mitad del tejido estudiado, (1) es tinción positiva de la mitad del área del tumor, y (2) cuando todo el tejido tuvo tinción positiva. Una fuerte señal (+++) se observó en todos los casos de cáncer cervical para los tres genes con 90 y 100% de positivos. El número de células positivas presentes en cáncer cervical (+++) fue más alto que en lesiones infraepiteliales escamosas de gr5ado superior (++). La CTSF se expresó en un 90%, la MMP 11 en un 90%, y la MMP 12 en un 90%» de las muesfras de lesiones intraepiteliales escamosas superiores. Todas las lesiones infraepiteliales presentaron numerosas células positivas para los fres transcritos estudiados (ver Figura 2C, G y 2K). En la mayoría de las lesiones infraepiteliales escamosas superiores la tinción para MMP11, MMP 12 y CTSF fue observada exclusivamente en el epitelio. El número de células positivas en las lesiones intraepiteliales escamosas superiores fue superior que en las de grado inferior (++, +). Los fres genes se tiñeron en un 90% de las muesfras de lesiones infraepiteliales escamosas de grado inferior (+), mientras que la señal fue más débil o indetectable en los tejidos cervicales normales (ver Figura 2). La tinción con Hematoxilina/eosina a una magnificación superior revelo que la expresión de CTSF, MMP 11 y MMP 12 se confinó usualmente al citoplasma de un subgrapo de células tumorales de epitelio con características de diferenciación escamosa. La mayoría de las muesfras presentaron una tinción homogénea a lo largo del tumor, presentando pocos casos una fuerte reacción en las células de la capa basal.

Ejemplo 7. Ensayos de inmunohistoquímica. Secciones de tejido fueron desparafinadas y rehidratadas en una serie de etanol graduado. La inactivación de la peroxidasa endógena se llevó a cabo como se describió en el ejemplo anterior, y las placas de vidrio fueron preincubadas con medio Protein Block Serum (DAKO, Carpinteria, CA) por 30 minutos a 37°C para prevenir la inmunoreacción inespecífica. El exceso de medio fue decantado y el tejido incubado con el primer anticuerpo como sigue: MMP 11 (Biomeda, Cat VI 0221, Lot 10441, 1:100), MMP12 (R&D Systems, Cat MAB917, Lot AGEO22051. 1:100) a 37°C por 30 minutos, después de lo cual se aplico el sistema Peroxidasa (DAKO Envision System) y las placas de vidrio se contratiñeron con hematoxilina. Como para la hibridación in situ, solamente las células en la región neoplásica de cada tumor fueron evaluadas y solamente cuando estuvo presente la tinción de las dos proteínas en el citoplasma. Los niveles de expresión de MMP11 y MMP 12 en las secciones de tejido bajo la luz del microcopio. Los registros se obtuvieron al estimar la media de la intensidad de la señal (escala del O al 2). El registro fue similar como para la hibridación in situ. Por inmunotinción, las proteínas MMP 11 y MMP 12 estuvieron presentes solamente en el citoplasma. Existió una fuerte correlación entre las reacciones positivas en la hibridación in situ y la inmunohistoquímica. Todas las muestras de cáncer cervical tuvieron un gran número de células positivas (+++, ++) para ambas proteínas, el número de células positivas fue inferior en las lesiones infraepiteliales escamosas grado superior (+++, ++). Como se observo en la hibridación in situ, la tinción de las lesiones intraepiteliales escamosas de grado inferior fue menor a la mosfrada en las de grado superior (+) y no se observó tinción alguna en los tejidos normales para ninguna de las proteínas (Figure 3). La inmunotinción fue heterogénea en cáncer cervical y en lesiones infraepiteliales escamosas grado superior, mientras que en las lesiones intraepiteliales escamosas grado inferior la tinción se observó preferentemente en las células del epitelio basa. No se observó tinción alguna en el estroma adyacente.

Claims (1)

1. CAPITULO REIVINDICATORÍO Un método para diagnosticar cáncer cervical o un precursor de cáncer cervical en un paciente y que comprende los pasos de: a) proporcionar una muesfra de tejido o fluido corporal de un paciente, y b) determinar la presencia de la sobreexpresión de catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinasa 12. Un método para determinar la progresión de cáncer cervical en un paciente y que comprende los pasos de: a) proporcionar una muestra de tejido o fluido corporal de un paciente, y b) determinar la presencia de la sobreexpresión de catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloprotemasa 12. Un equipo para determinar la presencia de cáncer cervical o para evaluar la eficacia de un fratamiento terapéutico de cáncer cervical en un paciente, en donde el equipo comprende, en combinación: i) un receptáculo para colocar una muesfra de tejido o fluido corporal humano, ii) un ligador que se une específicamente a un epítopo de las proteínas arriba mencionadas o a una secuencia de ácido nucleico que codifica a dichas proteínas, iii) medios para detectar la unión del ligador con las proteínas o ácido nucleico que las codifica, y iv) una muesfra de referencia. El método de conformidad con las reivindicaciones 1-2, en donde la muesfra de fluido corporal es sangre, suero, plasma, saliva, fluido ascítico, fluido peritoneal, esputo, y exudado de seno. El método de conformidad con las reivindicaciones 1-2. en donde el paso de determinar la presencia de la sobreexpresión de catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloprotemasa 12, se lleva a cabo utilizando tecnologías de biología molecular. El método de conformidad con la reivindicación 5. en donde las tecnologías de biología molecular se seleccionan de Southern-blot, Northern-blot, e hibridación in situ. El método de conformidad con las reivindicaciones 1-2, en donde el paso de determinar la presencia de la sobreexpresión de catepsina f, metaloproteinasa 11 y metaloproteinas 12, se lleva a cabo utilizando tecnologías de inmunoensayo. El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde las tecnologías de inmunoensayo se seleccionan de ELISA, RÍA, e inmunohistoquímica.