MXPA06005251A - Acidos nucleicos que se unen especificamente a ghrelin bioactivo - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a unácido nucleico que específicamente se une a ghrelin bioactivo, mas preferiblemente a n-octanoil ghrelin, y su uso para el diagnóstico de enfermedades y trastornos mediados por ghrelin.

Description

de péptido y no alcanza la máxima intensidad de señal en el intervalo de concentración observado. Las formas de desoctanoílo de ambos péptidos no estimulan el receptor ghrelin humano a ninguna concentración analizada en el ensayo. Este experimento confirma que los cinco aminoácidos N-terminales de ghrelin son suficientes para la estimulación del receptor de ghrelin humano, y que el grupo octanoílo es esencial para la actividad biológica del ghrelin.

EJEMPLO 3 INHIBICIÓN DE LIBERACIÓN DE CALCIO INDUCIDA POR GHRELIN MEDIANTE SPIEGELMERS DE UNIÓN A GHRE IN La inhibición de la liberación de calcio inducida por ghrelin se midió usando el ensayo celular descrito en el ejemplo 2. Como una modificación del método, las soluciones de estimulación en el ensayo de inhibición se complementaron con cantidades variables del Spiegelmer L-NOX-B11. Como control, se analizaron muestras con péptido solamente (máxima liberación de calcio) y muestras sin péptido (liberación mínima de calcio). Después de incubación durante 15 - 60 minutos a temperatura ambiente, se añadió 10 µl de las soluciones de estimulación a las células, dando como resultado una concentración final de péptldo de 5 nM. Usualmente se eligieron las concentraciones finales de Spiegelmer de 0,1 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, y 100 nM.

Para cada pocilio se determina la diferencia entre la fluorescencia máxima y el valor de línea base (Fmáx - Fmin). Los valores para el 100% de actividad (sin inhibición) y 0% de actividad (inhibición completa) se pueden obtener a partir de las muestras de control (muestras "con péptido solamente" y "sin péptido"). Para todas las otras muestras la actividad correspondiente se calcula en "tanto por ciento", y se representa gráficamente contra a la concentración de Spiegelmer (curva de inhibición), permitiendo la determinación de la constante de inhibición media máxima (Cl50). La figura 3 muestra las curvas de inhibición que se producen a partir de un experimento, que analiza la actividad inhibidora de L-NOX-B11 con formas de longitud completa y truncada, de octanoil - ghrelin. Resulta que el spiegelmer inhibe la actividad de todas las formas de octanoil-ghrelin sometidas a prueba: el péptido de longitud completa, ghrelin 1-10, y ghrelin 1-5. Los valores de Cl50 no muestran una desviación significativa para los tres péptidos (ghrelin de longitud completa: 7 nM, ghrelin 1-10: 9 nM, ghrelin 1-5: 5 nM). Se puede concluir que la región de unión del Spiegelmer está localizada en el extremo N de ghrelin, que comprende los aminoácidos 1 - 5. La unión de L-NOX-B11 a este motivo mínimo da como resultado la inhibición eficaz de la actividad biológica de ghrelin en el ensayo celular.

EJEMPLO 4: DIFERENCIACIÓN DE OCTANOIL- GHRELIN Y DESOCTANOIL- GHRELIN MEDIANTE SPIEGELMERS DE UNIÓN A GHRELIN Las características de la unión de Spiegelmer L-NOX-B11 con el ghrelin se analizaron posteriormente en un ensayo de competitividad, basándose en el procedimiento descrito en el ejemplo 3. En estos ensayos, el Spiegelmer se incubó con diferentes combinaciones de péptidos ghrelin en las soluciones de estimulación antes de la estimulación de células. El esquema de combinaciones de péptidos y los resultados del experimento con ghrelin de longitud completa se resumen en la figura 4 (barras numeradas de izquierda a derecha): sin ningún ghrelin, o con desoctanoil-ghrelin en una concentración final de 300 nM, no se puede detectar estimulación de células (barras 1 y 2), mientras que el octanoil-ghrelín en una concentración de 10 nM es suficiente para mediar la liberación de calcio (barra 3); la adición adicional de desoctanoil-ghrelin 300 nM (barra 4) no interfiere con la estimulación de células, indicando que el desoctanoil-ghrelin biológicamente inactivo no es un antagonista del receptor. La liberación de calcio mediada por octanoil-ghrelin 10 nM se puede inhibir por un exceso de 3 veces de L-NOX-B11 (barra 5), e incluso la presencia de desoctanoil-ghrelin en un exceso de 30 veces (300 nM) sobre octanoil-ghrelin no compite por la inhibición (barra 6). Por el contrario, una concentración de ensayo de octanoil-ghrelin 300 nM y Spiegelmer 30 nM muestra un incremento en la liberación de calcio (barra 7), proporcionando evidencia de que bajo estas condiciones de ensayo se puede lograr una potenciación de la estimulación con octanoil-ghrelin .Este experimento demuestra, que L-NOX-B11 diferencia específicamente entre ghrelin en la forma octanoílo y en la forma desoctanoílo. El experimento se repitió con ghrelin 1 - 5 en lugar del péptido de longitud completa, mostrando resultados idénticos (Figura 5). Sin embargo, dependiendo de la actividad estimuladora más débil de ghrelin 1 - 5, las señales son comparativamente más bajas.

EJEMPLO 5: REQUERIMIENTOS PARA LA UNION DE L- NOX-B11 A OCTANOIL- GHRELIN El sitio de unión para L-NOX-B11 en octanoil-ghrelin se localiza en el extremo N del péptido (comparar el ejemplo 3), e implica el grupo octanoílo (comparar el ejemplo 4). La importancia e implicación de ambos componentes para el caso de unión, péptido y grupo de ácido graso, se muestra en el siguiente experimento. El fundamento de este experimento es que, los Spiegelmers se unen a sus péptidos diana de una manera enantio específica, y el propio grupo octanoílo es un grupo aquíral. Si la parte de ácido graso de ghrelin sola fuera suficieníe para unir el Spiegelmer, el acto de unión no sería enantio selectivo con respecto a la parte péptido; entonces D-NOX-B11 y L-NOX-B11 se deberían unir a D-octanoil-ghrelin de una manera similar. El NOX-B11 se sintetizó químicamente como ARN L y D, y se marcó radiacíivamente usando T4-Polinucleótidoquinasa (Invitrogen, Karlsruhe) con ?-32[P]-ATP (Hartmann Analytlc, Braunschweig). El ARN se purificó sobre un gel de pollacrilamida desnaturalizaníe al 10% y se incubaron 0.5 - 5 p moles de ARN con D-ghrelin biotinilado 5 µM en regulador de unión [Tris/HCl 20 mM, pH 7,4; NaCI 150 mM; KCl 5 mM; MgCI21 mM; CaCI2 1 mM; Tween-20 al 0,1%] durante 2 horas a 37°C. La conceníración de péptido comparablemente alta se eligió para permitir controlar incluso las interacciones débiles de Spiegelmers. Posteriormente, se añadió una cantidad constante de maíriz UltraLink conjugada con Estreptavidina. Los complejos de ARN - ghrelin unidos a la matriz, se lavaron con regulador de unión, se contaron en un contador de centelleo (Beckman LS6500), y se representaron gráficamente como porcentaje de la unión total a D-ghrelin. Cada grupo experimental se analizó por triplicado. Los resultados del experimento se muestran en la figura 6. Resultó que el D-NOX-B11 se une específicamente a D-ocíanoil-ghrelin (barras 1 y 2), mientras que el correspondiente enantíómero L no lo hace (barras 3 y 4). Este resultado indica que el residuo octanoílo principalmente sirve como un grupo hidrófobo, que presenta el motivo GSSFL N-terminal del L-octanoil-ghrelin en una conformación en la que el Spiegelmer L-NOX-B11 se une de manera eficiente. Tanto el péptido como la parte octanoílo de L-octanoil-ghrelin son necesarias para la unión a L-NOX-B11. Las características de la presente invención descritas en la memoria descriptiva, las reivindicaciones y/o los dibujos pueden servir como material tanto separadamente como en cualquier combinación de los mismos, para realizar la invención en diversas formas de la misma.

Claims (78)

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico que se une a ghrelin bioactivo.

2. El ácido nucleico que se une específicamente a ghrelin bioactívo.

3. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado además porque el ácido nucleico no se une específicamente a ghrelin bioactivo.

4. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o con la reivindicación 3, caracterizado además porque la unión específica se expresa como el valor de Kd, caracterizado además porque el valor de Kd del ácido nucleico está entre 10 pM a 1 µM, más preferiblemente eníre 100 pM y 500 nM, y mucho más preferiblemente entre 1 nM y 100 nM.

5. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el ghrelin bioactivo es n-octanoil ghrelin.

6. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado además porque el residuo n-octanoílo del n-octanoil ghrelin está unido mediante un enlace éster a Ser en la posición 3 del ghrelin.

7. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque el ácido nucleico es un L-ácido nucleico, preferiblemente un Spiegelmer.

8. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque el ácido nucleico se selecciona entre el grupo comprendido por ácido desoxirribonuclelco, ácido ribonucleico y las mezclas de los mismos.

9. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque el ácido nucleico tiene una estructura secundaria mostrada en la Figura 1B.

10. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque el ácido nucleico es variable en la estructura del bucle interno de la eslrucíura secundaria mostrada en la Figura 1B.

11. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, una secuencia de acuerdo con la SEQ ID N° 1.

12. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado además porque el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia de acuerdo con SEQ ID N° 2 a SEQ ID N° 15.

13. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la unión de ghrelin bioactivo.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado además porque la unión es selectiva para ghrelin bioactivo con un Kd de ácido nucleico entre 10 pM y 1 µM, más preferiblemente entre 100 pM y 500 nM, y mucho más preferiblemente en el intervalo de 1 nM y 100 nM.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque la unión excluye la unión de ghrelin diferente del ghrelin bioactivo en presencia de un exceso de 1000 veces de ghrelin bioinactivo sobre ghrelin bioactivo, más preferiblemente en presencia de un exceso de 100 veces de ghrelin bioinactívo sobre ghrelin bioactívo, y mucho más preferiblemente en presencia de un exceso de 10 veces de ghrelin bioinactivo sobre ghrelin bioactivo. ?.

16. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado además porque el ghrelin bioactivo es n-octanoil ghrelin.

17. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado además porque la unión es una unión in vivo o in vitro.

18. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la detección de ghrelin bioactivo.

19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado además porque el ghrelin bioactivo se detecta específicamente.

20. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19, caracterizado además porque el ghrelin no bioactivo no es detectado por el ácido nucleico, preferiblemente no es detectado específicamente por el ácido nucleico.

21. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado además porque el ghrelin bioactivo y/o el ghrelin no bioactivo se detecta in vivo y/o in vitro.

22. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la inhibición de ghrelin bioactivo.

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado además porque el ghrelin bioactivo está inhibido específicamente.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado además porque el ghrelin no bioactivo no está inhibido por el ácido nucleico, preferiblemente no está inhibido específicamente por el ácido nucleico.

25. Uso de acuerdo con cualquiera las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado además porque el ghrelin bioactivo es n-octanoil ghrelin.

26. Uso de acuerdo con cualquiera las reivindicaciones 22 a 25, caracterizado además porque la inhibición es inhibición in vitro y/o inhibición in vivo.

27. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la fabricación de un medicamento.

28. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado además porque el medicamento es para el tratamienío y/o prevención de una enfermedad y/o un trastorno.

29. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado además porque la enfermedad y/o trastorno se selecciona entre el grupo comprendido por obesidad, regulación de equilibrio de energía, apetito, peso corporal, trastornos de alimentación, diabetes, metabolismo de glucosa, lumor, presión sanguínea y enfermedad cardiovascular.

30. Uso de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29, caracterizado además porque la enfermedad y/o trastorno está mediado por un ghrelin bioactivo.

31. Un método para la detección de ghrelin bioactivo, que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una muesíra que se va a someler a prueba para evaluar la presencia de ghrelin bioactivo, (b) proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, (c) hacer reaccionar la muestra con el ácido nucleico, caracterizado además porque el paso (a) se puede realizar antes del paso (b), o el paso (b) se puede realizar antes del paso (a).

32. El método de acuerdo con la reivindicación 31, caracterizado además porque se proporciona un paso (d) adicional: (d) detectar la reacción de la muesíra con el ácido nucleico.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado además porque el ácido nucleico del paso (b) está inmovilizado con respecío a una superficie.

34. El méíodo de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado además porque el ácido nucleico está inmovilizado con respecto a una superficie mediante un enlace químico covalente entre la superficie y el ácido nucleico.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 34, caracterizado además porque el ácido nucleico está inmovilizado con respecto a una superficie mediante una pareja de interacción del ácido nucleico.

36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizado además porque la pareja de interacción se selecciona entre el grupo comprendido por ácidos nucleicos, polipépíidos, proteínas y anticuerpos.

37. El método; de acuerdo con la reivindicación 36, caracterizado además porque la pareja de interacción es un anticuerpo, preferiblemeníe un anticuerpo monoclonal, caracterizado además porque el anticuerpo se une al ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

38. El método de acuerdo con la reivindicación 36, caracterizado además porque la pareja de interacción es un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico funcional.

39. El método de acuerdo con la reivindicación 38, caracterizado además porque el ácido nucleico funcional se selecciona entre el grupo comprendido por aptámeros, Spiegelmers, y ácidos nucleicos que son al menos parcialmeníe complemeníarios para el ácido nucleico.

40. El método de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado además porque el ácido nucleico comprende un primer miembro de un par de parejas de interacción y la superficie comprende un segundo miembro del par de parejas de interacción.

41. El método de acuerdo con la reivindicación 40, caracterizado además porque el par de parejas de interacción se selecciona entre el grupo de parejas de interacción comprendido por biotina y avidina, biotina y estreptavidina, y biotina y neutravidina.

42. El método de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizado además porque el primer miembro del par de parejas de interacción es biotina.

43. El méíodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 42, caracterizado además porque se forma un complejo inmovilizado de ghrelin bioactivo y el ácido nucleico.

44. El método de acuerdo con la reivindicación 43, caracterizado además porque se detecta el complejo.

45. El método de acuerdo con la reivindicación 44, caracterizado además porque se detecta el ghrelin bíoactivo.

46. El método de acuerdo con la reivindicación 45, caracterizado además porque se detecta el ghrelin bioactivo mediante un medio de detección que es específico de ghrelin bioactivo.

47. El método de acuerdo con la reivindicación 46, caracterizado además porque se detecta el ghrelin bioactivo mediante un medio de detección que detecta tanto ghrelin bioactivo como ghrelin no bioactivo.

48. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 44 a 47, caracterizado además porque el medio de detección se selecciona entre el grupo comprendido por ácidos nucleicos, polipépíidos, proleínas y anticuerpos.

49. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 44 a 48, caracterizado además porque después de la formación del complejo la muesíra se retira del recipiente de reacción.

50. El método de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado además porque una pareja de inleracción de ghrelin bioactivo y/o no bioactivo está inmovilizada sobre una superficie.

51. El método de acuerdo con la reivindicación 50, caracterizado además porque la pareja de inferacción se selecciona entre el grupo comprendido por ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos.

52. El método de acuerdo con la reivindicación 51, caracterizado además porque la pareja de interacción es capaz de unirse a ghrelin bioactivo y/o a ghrelin no bioactivo.

53. El método de acuerdo con la reivindicación 51 ó 52, caracterizado además porque la pareja de interacción es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

54. El método de acuerdo con la reivindicación 51 ó 52, caracterizado además porque la pareja de interacción es un ácido nucleico funcional.

55. El método de acuerdo con la reivindicación 54, caracterizado además porque el ácido nucleico funcional se selecciona del grupo constituido por aptámeros y Spiegelmers.

56. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 50 a 55, caracterizado además porque la pareja de interacción forma un complejo con el ghrelin bioactivo y/o el no bioactivo. -

57. El méíodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 50 a 56, caracterizado además porque el ghrelin bioactivo se detecta por un medio de detección.

58. El método de acuerdo con la reivindicación 57, caracterizado además porque el medio de detección es un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

59. El método de acuerdo con la reivindicación 58, caracterizado además porque el ácido nucleico se detecta usando un segundo medio de detección.

60. El método de acuerdo con la reivindicación 59, caracterizado además porque el segundo medio de detección se selecciona entre el grupo comprendido por ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos.

61. El método de acuerdo con la reivindicación 60, caracterizado además porque el segundo medio de detección es un anticuerpo, caracterizado además porque preferiblemente el anticuerpo es específico para el ácido nucleico.

62. El método de acuerdo con la reivindicación 60, caracterizado además porque el segundo medio de detección es un ácido nucleico, preferiblemente una guía molecular.

63. El método de acuerdo con la reivindicación 60, caracterizado además porque el ácido nucleico comprende una marca de detección.

64. El método de acuerdo con la reivindicación 63, caracterizado además porque la marca de detección se selecciona entre el grupo-'; constituido por biotina, una marca de bromo-desoxiuridina, una marca de digoxigenína, una marca de fluorescencia, una marca UV, una marca radiactiva, y una molécula quelante.

65. El método de acuerdo con la reivindicación 63, caracterizado además porque el segundo medio de defección interactúa con la marca de detección.

66. El método de acuerdo con la reivindicación 65, caracíerizado además porque la marca de deíección es biotina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra biotina, o caracíerizado además porque la marca de deíección es bioíina y el segundo medio de detección es una avidina o una molécula portadora de avidina, o caracterizado además porque la marca de detección es biotina y el segundo medio de detección es una esíreptavldlna o una molécula portadora de estreptavidina, o caracterizado además porque la marca de deíección es biolina y el segundo medio de delección es una neutravidina o una molécula portadora de neuíravidina, o caracíerizado además porque la marca de deíección es una bromo-desoxiuridina y el segundo medio de deíección es un aníicuerpo dirigido coníra bromo-desoxiuridina, o caracterizado además porque la marca de detección es una digoxigenina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra digoxigenina, o caracterizado además porque la marca de detección es un quelante y el segundo medio de detección es un radionúclido.

67. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 50 a 66, caracterizado además porque el segundo medio de detección se detecta usando un tercer medio de detección, preferiblemente el tercer medio de detección es una enzima, más preferiblemente que mueslra una reacción enzimática tras la detección del segundo medio de detección, o el íercer medio de detección es un medio para detectar radiación, más preferiblemente radiación emitida por un radionúclido.

68. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 56 a 67, caracterizado además porque después de la formación del complejo, la muestra se retira de la reacción, más preferiblemente del recipiente de reacción donde se realiza el paso (c) y/o el paso (d).

69. El méíodo de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado además porque el ácido nucleico de acuerdo con 5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 comprende una porción de fluorescencia, y caracterizado además porque la fluorescencia de la porción de fluorescencia es diferente tras la formación del complejo entre el ácido nucleico y el ghrelin bioactivo y el ghrelin bioactivo libre. 0

70. El métodoJde acuerdo con las reivindicaciones 32 y 69, caracterizado además porque el ácido nucleico es un derivado del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el derivado del ácido nucleico comprende al menos un derivado fluorescente de adenosina que reemplaza adenosina. -5

71. El método de acuerdo con la reivindicación 70, caracterizado además porque el derivado fluorescente de adenosina es etenoadenosina.

72. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 69 a 71, caracterizado además porque el complejo 0 constiluido por el derivado del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y el ghrelin bioactivo se detecta usando fluorescencia.

73. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 72, caracterizado además porque el ghrelin bioactivo es n-octanoil ghrelin.

74. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 73, caracterizado además porque el ghrelin no bioactivo es ghrelin diferente del n-octanoil ghrelin.

75. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 74, caracterizado además porque se crea una señal en el paso (c) o en el paso (d), y preferiblemente la señal se correlaciona con la concentración de ghrelin blorreactivo en la muestra.

76. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 75, caracterizado además porque la muestra se selecciona entre el grupo comprendido por sangre, plasma, suero, licor y tejidos.

77. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 76, caracterizado además porque el método es un método de diagnósíico o méíodo de pronósíico.

78. El méíodo de acuerdo con la reivindicación 77, caracterizado además porque el método es para diagnosis, determinación del alcance, y/o pronóstico de una enfermedad y/o trastorno, caracterizado además porque preferiblemente dicha enfermedad y/o traslorno se selecciona entre el grupo comprendido por obesidad, regulación de equilibrio de energía, apetiío, peso corporal, írastornos de alimentación, diabetes, metabolismo de glucosa, tumor, presión sanguínea y enfermedad cardiovascular. RES UMEN La presente invención se refiere a un ácido nucleico que específicamente se une a ghrelin bioactivo, más preferiblemente a n-octanoíl ghrelin, y su uso para el diagnóstico de enfermedades y trastornos mediados por ghrelin .