MXPA06003031A - Alteracion de la patologia de una celula b usando antigenos derivados automaticamente en conjunto con un agente citorreductor de union especifica - Google Patents

Abstract

Un método para tratar enfermedades malignas relacionadas con las células B, un método para preparar composiciones para tratar enfermedades malignas relacionadas con las células B, donde la administración de una agente citorreductor de unión específica es seguida por inmunización con una proteína Id antóloga. Los dos tratamientos pueden ser secuénciales, donde la administración del agente citorreductor de unión específica es efectuada antes de la administración de la proteína Id antóloga y la administración del agente citorreductor de unión específica y la inmunización con una proteína Id antóloga puede ocurrir en un curso de tiempo superpuesto.

Description

ALTERACIÓN DE LA PATOLOGÍA DE UNA CÉLULA B USANDO ANTIGENOS DERIVADOS AUTOMÁTICAMENTE EN CONJUNTO CON UN AGENTE CITORREDUCTOR DE UNION ESPECIFICA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona, de manera general con el campo de la inmunología y la inmunoterapia. De manera más específica, esta invención se relaciona con métodos y composiciones para alterar patologías mediadas por células B, como enfermedades malignas y/o enfermedades autoinmunes relacionadas con las células B, usando una combinación de terapias . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Cánceres del Sistema Circulatorio Varios tipos de cánceres tienen su origen en el sistema circulatorio. Entre los tipos principales se encuentran las leucemias, neoplasmas de médula ósea y sangre; mielomas, cánceres de células B; y linfomas, cánceres que se originan en el sistema linfático. Los linfomas pueden ser subdivididos además en varios grupos; entre los linfomas clínicamente más importantes se encuentran los linfomas no Hodgkin (NHL) . Los linfomas no-Hodgkin a su vez forman un grupo diverso de cánceres. Tres categorías amplias de esos linfomas son definidas de acuerdo a la Formulación de Trabajo Ref. 170899 .Internacional para la clasificación de tumores: de grado bajo, grado intermedio y grado alto. Esas difieren en su agresividad y respuesta a la terapia (Cheson, et al . , "Report of an International Workshop to Standardize Response Criteria for Non-Hodgkin' s Lymphomas," J. Clin Oncol . 17(4): 1244, 1999) . El linfoma de grado bajo usualmente se presenta como una enfermedad nodal y con frecuencia es indolente o de crecimiento lento. La enfermedad de grado alto o intermedio usualmente se presenta como cánceres más agresivos con tumores extranodales grandes. En total, esos linfomas colectivamente ocupan el quinto lugar en los Estados Unidos ' en términos de incidencia y mortalidad por cáncer, y aproximadamente son diagnosticados 50,000 nuevos casos cada año. Los pacientes con NHL también pueden ser clasificados usando el sistema de clasificación de Ann Arbor: Etapa I—implicación de una sola región de nodos linfáticos o implicación localizada de un solo órgano o sitio extralinfático. Etapa II—implicación de dos o más regiones de nodos linfáticos sobre el mismo lado del diafragma o implicación localizada de un solo órgano o sitio extralinfático asociado y sus nodos linfáticos regionales con o sin otras regiones de nodos linfáticos sobre el mismo lado del diafragma. Etapa III--ímplicación de regiones de nodos linfáticos sobre ambos sitios del diafragma, posiblemente acompañada de la implicación localizada de un órgano o sitio extralinfático, implicación del bazo, o ambos. Etapa IV— implicación diseminada (multifocal) de 1 o más sitios extralinfáticos con o sin implicación de nodos linfáticos asociados o implicación de órganos extralinfáticos aislados con implicación nodal distante (no regional) . En el sistema de Ann Arbor, las etapas I, II, III, y IV, del NHL de adulto se subdividen en categorías A y B dependiendo de que si los pacientes tienen síntomas generalizados bien definidos (B) o no (A) . La designación B está asociada con pacientes que presentan los siguientes síntomas: pérdida inexplicable de más del 10% del peso corporal en 6 meses antes del diagnóstico, fiebre inexplicable con temperaturas superiores a 38°C y sudoración nocturna abundante. Para más detalles, véase The International Non-Hodgkin' s Lymphoma Prognostic Factors Project: A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma. New Eng. J. Med. 329 (14) : 987-994 (1993) . Tratamientos para los Linfomas y Leucemias Esas enfermedades linfoproliferativas neoplásicas, incluyendo las leucemias y los linfomas han sido el foco de un gran número de regímenes de tratamiento farmacéutico, quirúrgico e inmunológico con varios grados de éxito. A pesar del progreso significativo en varios tipos de tratamiento, como el linfoma non-Hodgkin' s relacionadas con células B de grado bajo en particular, la vasta mayoría de los pacientes recaen después de responder al mejor tratamiento actualmente disponible. Los pacientes típicamente comienzan con quimioterapia citorreductora usando una combinación de agentes conocidos por sus acrónimos (por ejemplo, MOPP para la mecloretamina, vincristina (Oncovin®) , prednisona, y procarbacina; CHOP para ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona; CVP para ciclofosfamida, vincristina y prednisona, y EPOCH para etopósido, prednisona vincristina, ciclofosfamida y doxorrubicina) . Para pacientes que recayeron fue aprobada recientemente una nueva terapia; ahora esos pacientes son tratados comúnmente con inmunoterapia pasiva en forma de anticuerpo monoclonal anti CD-20 Rituxan® o anticuepos similares. Esta terapia frecuentemente da como resultado una remisión temporal. Quimioterapia Frecuentemente, la primera ronda de tratamiento en los linfomas y leucemias es la quimioterapia. Una amplia variedad de métodos quimioterapéuticos están disponibles en la técnica para tratar enfermedades malignas relacionadas con las células B y las células T. En general, son usadas ' combinaciones de agentes quimioterapéuticos como se discutió supra, como CHOP, CVP y EPOCH. Para una discusión detallada de los agentes quimioterapéuticos y sus métodos de administración, véase Dorr, et al . , cáncer Chemotherapy Handbook, segunda edición, Appleton & Lange (Connecticut , 1994) incorporada aquí como referencia. Las descripciones y protocolos adicionales para los regímenes de quimioterapia son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Anticuerpos Monoclonales Recientemente han sido desarrollados tratamientos para tratar linfomas de células B con anticuerpos dirigidos contra el antígeno CD20 encontrado sobre la superficie de las células B. El CD20 es un blanco atractivo sobre linfomas de células B debido a sus altos niveles de expresión sobre la superficie de las células B malignas. Además el antígeno CD20 es un blanco lógico para terapias como (1) no es ocultado por las células B tumorales, (2)', no es internalizado por las células B tumorales (3) su expresión no es modulada. El CD20 en tejido no enfermo es un antígeno expresado por linfocitos B durante el desarrollo precélulas B iniciado y permanece sin expresión sobre la superficie hasta que las células B se diferencian a una célula plasmática. Se cree que la molécula CD20 regula un paso en el proceso de activación de las células B que se requiere para el inicio del ciclo y diferenciación celulares. Los anticuerpos Anti-CD20 han sido reportados como terapias solos o en combinación con un segundo anticuerpo u otros agentes quimioterapéuticos (véase por ejemplo en la Patente Estadounidense No. 6,455,043 Bl, expedido en Septiembre 24, 2002.) Rituxan®, un anticuerpo anti-CD20, ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos para usarse en linfoma no Hodgkin (NHL) de grado bajo con recaída y tratado previamente . También ha sido aprobado el tratamiento con un anticuerpo monoclonal relacionado, Zevalin®, (por ejemplo, Witzig TE, et al . , "Randomized controlled trial of yttrium-90-labeled ibritumomab tiuxetan radioimmunotherapy versus rituximab immunotherapy for patients with relapsed or refractory low-grade, follicular. or transformed B-cell non-Hodgkin' s lymphoma," J Clin Oncol . (2002) Mayo 15;20 (10) .-2453-63) . Un anticuerpo anti-CD20 adicional Bexxar® (tositumomab) , ha sido reciente aprobado por la FDA para el tratamiento de linfomas de células B. Otras terapias con anticuerpos monoclonales en ensayos clínicos para el tratamiento de linfomas de células B incluyen al Oncolym® (dirigido contra la proteína HLA-DrlO) , epratuzumab (dirigido contra CD22) y un anticuerpo anti-CD52 (Campath®/MabCampath®) (alemtuzumab) . Aunque su mecanismo de acción esta aún en disputa, - los anticuerpos monoclonales anti-CD20 están implicados en la producción de un efecto terapéutico vía la inducción de apoptosis. La apoptosis permite al cuerpo regular el número de células en una variedad de procesos, incluyendo el desarrollo, diferenciación y recambio celular. Un cambio característico de células que experimentan apoptosis es una actividad de endonucleosa asociada con la degradación del ADN en una apariencia similar a la de una escalera cuando es resuelta por electroforesis sobre gel. Otros cambios característicos incluyen abultamiento de la membrana y otras perturbaciones del citoesqueleto, contracción celular y pérdida del contacto en las células vecinas y, alteraciones en la membrana plasmática. Han sido identificados varios inductores de apoptosis incluyendo: TGF-ß, TNF, ligando de Fas, ciertos neurotransmisores, calcio, glucocorticoides, toxinas bacterianas, supresores tumorales y agentes quimioterapéuticos, como el cisplatino, doxorrubicina, bleomicina, prednisona, etc. Adicionalmente, la apoptosis puede ser inducida por daño físico como el choque térmico, infección viral, radicales libres y radiación gamma; y toxinas como el péptido de ß-amiloide. Inmunoterapia Además de los métodos del tratamiento anteriores, han sido desarrollados varios tratamientos experimentales para cánceres de células B sobre la base de la estimulación del sistema inmune del paciente . Los intentos iniciales en el desarrollo de tratamientos basados en inmunología dirigidos a antígenos producidos únicamente por células B malignas implicó el aislamiento y purificación laboriosas de proteínas idiotípicas (Id) directamente de células B patológicas. Esta técnica fue usada por primera vez en un sistema de modelos de ratón el cual usó inmunización activa contra determinantes idiotípicos sobre esas proteínas aisladas para proporcionar resistencia al crecimiento del tumor (Daley et al . , J Immunol . 120 (5) : 1620-24, 1978; Sakato et el., Microbiol . Immunol, 23 (9) : 927-31, 1979). Esos resultados fueron confirmados en un número de modelos de tumor experimental adicionales (Stevenson et al . , J Immunol . 130 (2) : 970-03 , 1983; George et al . , J. Immunol 141(6): 2168-74, 1988 y Kwak, et al . , Blood 76 (11) :2411-17 , 1990). Los primeros intentos por llevar esta idea y tecnología a la clínica fueron de trabajo muy intensivo. Esos primeros intentos utilizaron anticuerpos monoclonales de ratones generados contra proteínas aisladas de linfomas individuales de pacientes después de la biopsia. En un estudio, Meeker y sus colaboradores generaron anticuerpos anti-idiotipo monoclonales de ratón para el tratamiento de un pequeño grupo de pacientes después de que la mayoría habían ya sido sometidos a tratamiento quimioterapéutico para linfoma convencional (Meeker et al . , Blood 65: 1349-63, 1985) . Sin embargo, solo se obtuvieron resultados positivos en aproximadamente la mitad de los pacientes. Se notó también que las células de linfoma pueden desarrollar resistencia a ese tratamiento por una variedad de medios como (a) cambio de la clase de anticuerpos expresados en la superficie celular (Meeker et al . , N Engl J Med. 312: 1658-65, 1985), o (b) vía mutación somática en la región CDR2 (Cleary et al . , Cell 44: 97-106, 1986) . De este modo, aunque este método de tratamiento por inmunidad pasiva tiene la ventaja de que únicamente requiere aislamiento y purificación de la cantidad relativamente menor de una proteína idiotípica de un paciente, necesaria para elevar una respuesta de anticuerpo en un ratón, es útil para tratar linfomas en forma no obstante muy limitada. Kwak et al . tomaron un método diferente e inmunizaron activamente pacientes usando proteínas purificadas de sus propios linfomas únicos. Este método padece del requerimiento logístico de que deben ser aisladas grandes cantidades de proteínas idiotípicas (Kwak et al . , N. Engl . J. Med. 327: 1209-15, 1992). Los pacientes que tuvieron una enfermedad mínima o ausente después de la quimioterapia fueron tratados por vacunación con proteínas idiotípicas autólogas. Para obtener cantidades suficientes de proteínas idiotípicas para la vacunación, las células de linfoma obtenidas por biopsia fueron fusionadas con una línea celular de cultivo tisular establecido para facilitar su crecimiento en el cultivo tisular, y las proteínas idiotípicas secretadas fueron purificadas vía cromatografía. Sin embargo, la aplicación a gran escala de este método para el tratamiento es difícil a los requerimientos de trabajo extremos, barreras técnicas, requerimientos de un número relativamente grande de células tumorales viables y costos prohibitivos.

Adicionalmente, recientemente han surgido problemas relacionados con las cargas virales asociadas con la producción de proteína en células de mamífero, lo cual reclama un incremento en la precaución en el uso de esas fuentes . En un siguiente artículo, Hsu et al. reportaron el resultado de la fase I/II del ensayo clínico anterior utilizando la vacunación del idiotipo conjugado con hemocianina de cangrejo bayoneta (KLH) en el tratamiento de linfoma de célula B (Hsu et al., Blood 89: 3129-35, 1997) .

Los resultados obtenidos mostraron que la generación de una respuesta anti-idiotipo se correlacionó con una mejora en el resultado clínico. La duración de ausencia en progreso de la enfermedad y sobrevivencia total de todos los pacientes montada por una respuesta inmune celular anti-idiotipo se prolongaron significativamente en comparación con aquellos pacientes que no montaron una respuesta inmune. Nuevamente, para tratar a cada paciente individual, las células de linfoma obtenidas por biopsia fueron fusionadas con líneas celulares establecidas para permitir la producción de suficiente proteína para inmunizar a un paciente típico. Los resultados son prometedores, no obstante este proceso es muy difícil y poco práctico de usar a una escala amplia o comercial.

Más recientemente, Bendandi et al . demostraron remisiones inducidas por inmunización específica del paciente, idiotípicas, en pacientes con linfoma folicular (Bendandi et al . , Nat . Med. 5: 1171-77, 1999). Después de la quimioterapia estándar, veinte pacientes en remisión clínica completa fueron inmunizados usando proteínas idiotípicas específicas del paciente acompañadas por el factor estimulante de la colonia de los granulocitos - monocitos (GM-CSF; véase infra . ) . El análisis molecular de las translocaciones características de este linfoma fueron conducidas antes de la quimioterapia, en la remisión clínica y después de la terapia de vacunación. Se encontró que ocho de once pacientes con translocaciones detectables después de la remisión inducida por quimioterapia experimentaron una remisión molecular completa después de esta vacunación. Se encontraron células T CD8+ y CD4+ citotóxicas específicas del tumor en 19 de 20 pacientes. También se detectaron anticuerpos específicos del tumor pero se encontró que no se requerían para la remisión. Nuevamente, este estudio usó proteínas idiotípicas constituidas de la región variable y constante intactas de la inmunoglobulina que se encuentra asociada con el linfoma del paciente y producidas por función del heterohibridoma. Una vía para desarrollar regímenes de tratamiento más efectivos contra enfermedades malignas mediadas por células B es la integración de la terapia anti-CD20 con otros métodos de tratamiento. Esas terapias combinadas podrían ser otros anticuerpos, otros agentes quimioterapéuticos o tratamientos dirigidos para estimular generalmente el sistema inmune del paciente . Una de esas terapias combinadas es el uso de anticuerpos anti-CD20 en combinación con 20 (S) -camptotecina como se expone en la Patente Estadounidense No. 6,420,378 Bl (expedida en Julio 16, 2002) . Otras terapias combinadas se exponen en la Solicitud de Patente No . 2001/0018041 Al otorgada a IDEC Pharmaceuticals Corp., publicada en Agosto 30, 2001 (que usa ambos anticuerpos anti- CD20 y anti-CD40L) . Esas terapias combinadas pueden ser útiles como terapias para otros tipos de linfornas además del linfoma no Hodgkins (NHL) folicular, de grado bajo. Desafortunadamente, sin embargo, los pacientes con cáncer son con frecuencia objeto de una recaída de la enfermedad después de cualquier régimen de tratamiento. Un tratamiento más efectivo o adicional sería benéfico, considerando que en 1999 únicamente, se predijeron cerca de 57000 nuevos casos de NHL en los Estados Unidos. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención presenta el efecto sinérgico sorprendente del tratamiento rápido de la enfermedad mediada por células B con un agente citorreductor de unión específica, como un anticuerpo anti-CD20, con una inmunización con una proteína idiotípica. De este modo, en un primer aspecto, la invención presenta un método para tratar enfermedades malignas relacionadas con las células B en un paciente con una terapia combinada que comprende coadministrar contemporáneamente (1) un agente citorreductor de unión específica y (2) una composición inmunoterapéut ica que comprende una proteína Id autóloga. Para los propósitos de esta invención, la coadministración contemporánea se refiere a la administración de la composición inmunoterapéutica al inicio, durante o al final del tratamiento previo o dentro de tres meses de la finalización del tratamiento previo. En otro aspecto, la invención presenta un método para tratar enfermedades malignas relacionadas con las células B en un paciente con una terapia combinada que comprende coadministrar contemporáneamente (1) un agente citorreductor de unión específica y (2) una composición inmunoterapéutica donde la composición inmunoterapéutica ha sido cargada en células dendríticas las cuales de este modo contienen al menos parte de la proteína Id autóloga. En una modalidad preferida de este aspecto, las células dendríticas son células dendríticas autólogas . Pueden ser usadas células de Langerhans en este aspecto en una forma similar a las células dendríticas.

En un aspecto diferente, la invención presenta además un método para mejorar un tratamiento para enfermedades malignas relacionadas con las células B, donde el tratamiento para la enfermedad maligna relacionada con la célula B comprende administrar un agente citorreductor de unión específica y donde el tratamiento mejorado comprende coadministrar contemporáneamente una proteína Id autóloga. En modalidades preferidas, la enfermedad maligna relacionada con las células B no ha sido tratada previamente, o al menos no ha sido tratada previamente con agentes quimioterapéuticos . En otras modalidades preferidas, la enfermedad a ser tratada es seleccionada de la lista que consiste de enfermedad maligna relacionada con la célula B, con recaída, linfomas de células B, leucemia de células B, enfermedad de Hodgkin, Linfoma no Hodgkin (donde el linfoma No Hodgkin es de grado bajo, grado intermedio o grado alto) , linfoma de célula B linfocítica pequeña, linfoma de células B de células folicular y celular escindidas pequeñas predominantemente, linfoma de células B folicular y del tipo de células escindidas pequeñas y grandes mezclado, linfoma de células B folicular y del tipo de células grandes predominantemente, linfoma de células B escindidas pequeñas difuso, linfoma de células B de células pequeñas y grandes mezcladas difuso, linfoma de células B de células grandes difuso, linfomas de células B inmunoblástico de células grandes, linfoma de células B linfoblástico, linfoma de células B del tipo de Burkitt y no Burkitt no escindidas pequeñas, linfomas relacionados con el SIDA, linfadenopatía angioinmunoblástica, linfoma de células B monocitoides, linfoma de células del manto, leucemia de células B crónica, leucemia linfoblástica aguda de un linaje de célula B, leucemia linfocítica crónica de un linaje de células B. En modalidades adicionales, el tratamiento coadministrado contemporáneamente con proteína Id autóloga comienza dentro de los tres meses de la última administración del agente citorreductor de unión específica, dentro de los dos meses de la última administración del agente citorreductor de unión específica, dentro de un mes de la administración del agente citorreductor de unión específica, o dentro de una semana de la última administración del agente citorreductor de unión específica. El tratamiento coadministrado contemporáneamente con la proteína Id autóloga también puede ser simultáneamente, o dentro de una semana, del tratamiento con agente citorreductor. En otras modalidades, el agente citorreductor de unión específica es un agente citorreductor de unión de antígeno. En algunas de esas modalidades, el agente citorreductor de unión de antígeno es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD52, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-B7, un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD32, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD64, un anticuerpo anti-CD16, un anticuerpo anti-CD86, y un anticuerpo anti-CD156. Otros agentes citorreductores de unión específica también son útiles en la presente invención. La superficie celular de una célula inmune maligna, como una célula B, contiene numerosas proteínas que pueden servir como ligando para un agente citorreductor de unión específica. Esos agentes citorreductores de unión específica capaces de unirse a células B malignas y producir citorreducción también pueden ser usados en esta invención. En modalidades adicionales, la proteína Id autóloga es producida de manera recombinante en una célula anfitriona, donde las células anfitrionas potenciales incluyen células de mamífero, bacteria, levadura, insecto u otros anfitriones. En otras modalidades preferidas, la proteína Id autóloga es producida de manera recombinante en líneas de células de insecto. En modalidades preferidas adicionales la proteína Id autóloga es producida de manera recombinante en líneas celulares de mamífero, incluyendo células CHO y células BHK. En modalidades preferidas adicionales, la proteína Id autóloga es producida de manera recombinante en células bacterianas o células de levadura, incluyendo S. cerevisiae . En otras modalidades preferidas, la proteína Id es proporcionada al paciente en forma de una molécula de ADN que codifica para la proteína Id, por ejemplo una vacuna de ADN. En algunas modalidades preferidas, la proteína Id autóloga es acoplada al KLH antes de la administración. En un aspecto relacionado, la proteína Id autóloga es codificada como marco de lectura abierta, donde una porción de la secuencia de ADN de este marco de lectura abierta se obtiene de una secuencia de ácido nucleico aislada de la enfermedad maligna relacionada con las células B del paciente a ser tratado. En una modalidad, la proteína Id autóloga no comprende una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa o una cadena ligera de anticuerpo de longitud completa. En otras modalidades, la proteína Id no comprende una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa. En modalidades adicionales, la proteína Id autóloga no comprende la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa. En otro aspecto de la presente invención, el tratamiento coadministrado contemporáneamente con proteína Id autóloga comienza antes del fin de la administración del agente citorreductor de unión específica y donde el tratamiento usando la proteína Id autóloga y el agente citorreductor continúa en paralelo. De este modo, el tratamiento con el agente citorreductor de unión específica continua después de la primera administración de la proteína Id autóloga, y la administración del agente citorreductor de unión específica y la administración de la proteína Id autóloga continua a intervalos durante el curso del tratamiento. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Tratamiento con Favld después de la Citorreducción con Rituxan en Pacientes con NHL Folicular que Recayeron/Refractario después de la Quimioterapia. La Figura 1 muestra los resultados de los ensayos de esta presentación en el Ejemplo 1 en comparación con Witzig T. E. , et al. , "Randomized controlled trial of yttrium- 90 -labeled ibritumomab tiuxetan radioimmunotherapy versus rituximab immunotherapy for patients with relapsed or refractory low-grade, follicular, or transformed B-cell non-Hodgkin ' s lymphoma", J Clin Oncol . (2002) Mayo 15; 20 (10) : 2453-63. La gráfica compara los resultados del tratamiento con rituximab seguido por Favld™1 con los resultados de rituximab solo como se publicó en Witzig, et al. Esos resultados demuestran que el tratamiento de pacientes con NHL de células B que recayeron/refractario con quimioterapia con Favld™1 comenzando dos meses después de un solo curso de rituximab da como resultado una prolongación significativa del tiempo para el progreso de la enfermedad en comparación con el tratamiento con rituximab solo.

Figura 2 : Tratamiento con Favld Después de la Citorreducción con Rituxan en el Tratamiento de Pacientes con NHL Folicular Cándidos. La Figura 2 muestra los resultados de los ensayos de esta presentación en el Ejemplo 2 en comparación con Colombat P, et al . "Rituximab (anti-CD20 monoclonal antibody) as single first-line therapy for patients with follicular lymphoma with a low tumor burden: clinical and molecular evaluation, "Blood (2001) 97 (1) : 101-106. Esos resultados demuestran que el tratamiento de pacientes con NHL de células B candidos que recibieron Favld™ dos meses después de un solo curso de Rituximab tienen una prolongación significativa del tiempo para el progreso de la enfermedad cuando se comparan con el tratamiento con Rituximab . Figura 3 : Tratamiento con Favld Junto con Citorreducción con Rituxan en el Tratamiento de Pacientes con NHL Folicular Cándidos . La Figura 3 presenta una comparación de los beneficios del tratamiento con un solo curso de rituximab seguido por el tratamiento con Favld^ con los resultados presentados en Hainsworth JD, et al . "Rituximab as First-Line and Maintenance Therapy for Patients With Indolent Non-Hodgkin' s Lymphoma" J Clin Oncol . (2002) Octubre 15; 20: 4261-4267. Los datos en Hainsworth et al . demuestran el valor del régimen de rituximab administrado cada 6 meses de acuerdo a lo indicado en la Figura 3. Esta es conocida por aquellos expertos en la técnica como terapia "de mantenimiento con Rituxan®" , y comúnmente se acepta que da como resultado un tiempo más prolongado para el progreso en comparación con un solo curso de terapia con Rituxan para pacientes con NHL de células B indolente . El mantenimiento con Rituxan® representa una mejora sobre los resultados de Colombat P, et al. De este modo, una comparación de los resultados de un solo tratamiento de rituximab más Favld™ en el tratamiento de pacientes con NHL de células B candidos del Ejemplo 2 con los datos de Hainsworth et al . sugiere el potencial de los beneficios adicionales a los pacientes si el Favldm es combinado con la terapia de mantenimiento de Hainsworth et al . , si la supresión total del sistema inmune no contrarresta los beneficios del FavIdMR. El protocolo para este ensayo se expone en el Ejemplo 8. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención presenta la combinación sorprendente de un agente citorreductor de unión específica, como un anticuerpo anti-CD20, seguida inmediatamente por la inmunización con una proteína idiotípica. En la terapia anteriormente usada, un régimen de tratamiento, como la quimioterapia, es seguida por un periodo de recuperación y remisión antes de que una recaída obligue a la siguiente ronda de terapia. Adicionalmente, si se contempló la inmunización usando una proteína idiotípica, el médico tratante debe inclinarse a esperar que el sistema inmune se recupere del tratamiento previo antes de tratar de inducir una respuesta inmune. Esto sería especialmente cierto si el tratamiento con un anticuerpo anti-CD20 ha agotado específicamente la población total de células B en este paciente. La coadministración inmediata o contemporánea de un inmunógeno en forma de una proteína idiotípica induciría una respuesta de anticuerpo sustancial dirigida a la proteína idiotípica. Los inventores de la presente, sin embargo, ' descubrieron un efecto sinérgico sorprendente siguiendo rápidamente el tratamiento con un agente citorreductor de unión específica, como un anticuerpo anti-CD20, por ejemplo, rituximab, con inmunización con una proteína idiotípica, a pesar de la supresión anticipada del brazo de respuesta de células B/anticuerpo de la respuesta inmune. Sin ser limitados por esta o cualquier otra teoría, una ventaja de la presente invención es que la citorreducción con un agente de unión específica seguida rápidamente con un agente inmunoterapéutico activo en el cual el blanco pretendido del agente inmunoterapéutico se encuentra dentro de la población citorreducida da como resultado una respuesta inmune antitumoral potente que depende principalmente de las células T para su efecto terapéutico. La invención también presenta la administración de un agente citorreductor de unión específica y una proteína Id autóloga en un curso de tiempo superpuesto, donde la administración de la proteína Id autóloga ocurre primero antes del fin del tratamiento con el agente citorreductor de unión específica, y el tratamiento con ambos agentes continua de manera coordinada. Una modalidad de un curso de tiempo superpuesto es cuando el agente citorreductor de unión específica es administrado cada seis meses mientras que la proteína Id autóloga es administrada cada mes, pero no durante el mismo mes cuando es administrado el agente citorreductor de unión específica. El agente citorreductor de unión específica también puede ser administrado aproximadamente cada 2 semanas, aproximadamente cada 3 semanas, aproximadamente cada mes, aproximadamente cada dos meses, aproximadamente cada tres meses, aproximadamente cada cuatro meses, o aproximadamente cada seis meses. La proteína Id autóloga puede ser administrada aproximadamente cada dos semanas, aproximadamente cada tres semanas, aproximadamente cada mes, aproximadamente cada dos meses, aproximadamente cada tres meses, aproximadamente cada cuatro meses, o aproximadamente cada seis meses. En algunas modalidades, el calendario de administración para el agente citorreductor de unión específica o la proteína Id autóloga puede ser interrumpido por la administración del otro . Los tratamientos combinados usando un agente citorreductor de unión específica tienen más ventajas. Es bien aceptado por aquellos expertos en la técnica que la terapia inmune de cánceres probablemente sea más efectiva en el escenario de la enfermedad residual después de una reducción en el volumen o masa del cáncer. Una ventaja de seguir la terapia con agente citorreductor de unión específica con direccionamiento de la proteína Id es que la proteína Id expresada de manera única por la enfermedad maligna relacionada con la célula B del paciente no se encuentra en cualquier lugar en el cuerpo. Por lo tanto, la generación de una respuesta inmune contra una proteína Id de linfoma no dará como resultado una toxicidad significativa al tejido normal. Además, esa respuesta inmune activa provocada usando la proteína Id como inmunógeno tendría una vida prolongada y por lo tanto retrasaría o prevendría la recurrencia de la enfermedad. Finalmente, las respuestas inmune activas proporcionan una respuesta inmune más amplia que la observada con la terapia pasiva con anticuerpo como usando rituximab o agentes similares. Esta respuesta inmune activa dirigida por la inmunización con la proteína Id puede ser capaz de neutralizar mejor la heterogeneidad del tumor y la desviación mutacional en una secuencia de proteína Id de enfermedad maligna relacionada con las células B con el tiempo.

Definiciones El término "tratar" se refiere a administrar una composición a un organismo afectado con una condición anormal, como una enfermedad maligna relacionada con las células B, donde la administración de la composición tiene un efecto terapéutico y alivia al menos parcialmente o abroga la condición anormal . Nótese que el tratamiento no necesita proporcionar una cura completa y el tratamiento será considerado efectivo si al menos un síntoma mejora o es erradicado. Además, el tratamiento no necesita proporcionar una mejora permanente de la condición médica u otra condición anormal, como una enfermedad maligna relacionada con las células B, aunque esto es preferible. El tratamiento puede funcionar matando las células cancerosas, facilitando la eliminación de las células cancerosas, inhibiendo el crecimiento de las células cancerosas y/o inhibiendo el proceso de metástasis del cáncer. El término "paciente" se refiere a un organismo que sea presentado en un escenario clínico con un síntoma o síntomas particulares que sugieran la necesidad de tratamiento con un agente terapéutico. El tratamiento puede ser aceptado de manera general por la comunidad médica o puede ser experimental. En modalidades preferidas, el paciente es un mamífero, incluyendo animales como perros, gatos, cerdos, vacas, ovejas, cabras, caballos, ratas y ratones. En modalidades preferidas adicionales, el paciente es un humano. Nótese que el diagnóstico del paciente puede alterarse durante el curso del proceso de la enfermedad ya sea espontáneamente o durante el curso de un régimen o tratamiento terapéutico, no obstante, puede considerar que ese paciente necesite un tratamiento. El término "efecto terapéutico" se refiere a la inhibición o activación de factores que causan o contribuyen a una condición anormal (incluyendo una enfermedad o trastorno) . Un efecto terapéutico alivia o previene en algún grado uno o más de los síntomas de la condición anormal . Con referencia al tratamiento de condiciones anormales asociadas con la presente invención, un efecto terapéutico puede referirse a uno o más de los siguientes : (a) un incremento o disminución en el número de células presentes en un lugar específico dentro de un organismo, como una definición total de las células de linfoma; (b) un incremento o disminución de la capacidad de las células para migrar; (c) un incremento o disminución en la proliferación, crecimiento y/o diferenciación de las células; (d) una inhibición (es decir, disminución o interrupción) o aceleración de la muerte celular, como un incremento de la velocidad de apoptosis de las células de linfoma; (e) alivio, en algún grado, de uno o más de los síntomas asociados con la condición anormal; (f) mejora o inhibición de la función de una población afectada de células, como activación de células T. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa aquí significa aquella cantidad de compuesto activo que produce una respuesta biológica o medicinal en un tejido, sistema, animal o humano que sea buscada por un investigador, veterinario, médico u otro clínico para proporcionar un efecto terapéutico . El término "condición anormal" se refiere a una función en las células o tejidos de un organismo que se desvía de sus funciones normales en ese organismo e incluye, pero no se limita a, enfermedades malignas relacionadas con las células B. Una condición anormal puede relacionarse con la proliferación celular, diferenciación celular, sobrevivencia celular, función celular, o las actividades de enzimas dentro de una célula . Las condiciones anormales relacionadas con trastornos poliferativos celulares incluyen cánceres como enfermedades malignas relacionadas con las células B, linfomas de células B, leucemias de células B, enfermedades malignas relacionadas con las células T, linfomas de célula T y leucemias de células T. Las condiciones anormales relacionadas con la sobrevivencia celular se refieren a condiciones en las cuales las vías de muerte celular programada (apoptosis) son activadas o abrogadas.

Los términos "administración" o "administrar" se refieren a un método de incorporar un compuesto en las células o tejidos de un animal, preferiblemente un mamífero, para tratar o prevenir una condición anormal o enfermedad maligna relacionada con las células B. Cuando las composiciones de la invención son proporcionadas como combinaciones de agentes activos, los términos "administración" y "administrar" incluyen la introducción secuencial o concurrente de las composiciones con los otros agentes. Para células albergadas dentro de un organismo, existen muchos métodos en la técnica para administrar los compuestos. La composición terapéutica puede ser administrada por cualquier ruta convencional, incluyendo la inyección o por infusión gradual con el tiempo. La administración puede, dependiendo de la composición que esté siendo administrada, por ejemplo, ser oral, pulmonar, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, subcutánea o transdérmica . Un compuesto también puede ser administrado a un organismo aislando o retirando células del organismo, administrando un compuesto a las células aisladas o retiradas, y retornando las células al organismo. Para células fuera del organismo, y en unos cuantos casos dentro del organismo, existen métodos múltiples en la técnica para administrar las composiciones incluyen (pero sin limitarse a) técnicas de microinyección de células, técnicas de transformación, incubación y técnicas con portadores. El término "coadministrar contemporáneamente" se refiere a administrar dos o más regímenes de tratamiento a tiempos ligados, donde el segundo régimen de tratamiento puede comenzar al final del primer régimen de tratamiento o dentro de hasta tres meses después del fin del primer régimen de tratamiento. De este modo, si un Régimen hipotético A finaliza el 1 de Marzo, el Régimen B coadministrado contemporáneamente podría comenzar en algún lugar durante el período del 1 de Marzo al 31 de Mayo en el mismo año. En otras modalidades de la presente invención, "coadministrar contemporáneamente se refiere" a comenzar el régimen de tratamiento con la proteína Id autóloga simultáneamente, durante, o dentro de tres meses del fin de tratamiento del agente citorreductor de unión específica. En los métodos de la invención, la proteína Id autóloga puede ser administrada simultáneamente con el agente citorreductor , dentro de un mes, dos meses, tres meses, o a cualquier subintervalo semanal, o de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce semanas desde la última administración del último agente citorreductor de unión específica. En modalidades adicionales, la proteína Id autóloga y el agente citorreductor pueden ser administrados en forma superpuesta, donde la administración de la proteína Id autóloga comienza antes de la administración del agente citorreductor, y la administración de los dos continúa en paralelo. De este modo, la administración de proteína Id autóloga puede ser seguida por la administración de un agente citorreductor de unión específica, la cual es a su vez seguida por la administración de una proteíña Id autóloga; y este patrón de administración superpuesta puede continuar. En algunas modalidades, el agente citorreductor de unión específica puede ser administrado aproximadamente cada dos semanas, aproximadamente cada tres semanas, aproximadamente cada mes, aproximadamente cada dos meses, aproximadamente cada tres meses, aproximadamente cada cuatro meses o aproximadamente cada seis meses. La proteína Id autóloga puede ser administrada aproximadamente cada dos semanas, aproximadamente cada tres semanas, aproximadamente cada mes, aproximadamente cada dos meses, aproximadamente cada tres meses, aproximadamente cada cuatro meses, o aproximadamente cada seis meses. El programa o calidad o calendario de administración de cualquiera del agente citorreductor de unión específica o la proteína Id autóloga puede ser interrumpida por la administración del otro. La administración del agente citorreductor de unión específica o la proteína Id autóloga no necesita seguir un programa o calendario regular y puede ser administrado a intervalos variables.

En modalidades preferidas, el primer régimen utiliza un agente citorreductor de unión específica. En otras modalidades preferidas, el primer régimen utiliza un anticuerpo anti-CD20. En modalidades adicionales preferidas, el primer régimen utiliza rituximab o tositumomab. En modalidades preferidas, el segundo régimen utiliza el tratamiento con una proteína idiotípica. Un ejemplo del régimen de tratamiento con agente citorreductor de unión específica es un curso de tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD20. En una forma similar a "coadministrar contemporáneamente" , los términos "cotratar" , "tratamiento aproximadamente ligado" , "tratamiento de administración aproximada" o "tratamiento ligado temporalmente" como se usan aquí también pueden referirse a los regímenes de tratamiento que sean conducidos simultáneamente o en una forma superpuesta, de modo que el segundo régimen comience dentro de tres después de la última administración del último agente apoptótico. Nótese también ' que esos • términos también se refieren a un tratamiento que donde, los dos regímenes de tratamiento se superponen, entonces el primer régimen de tratamiento no finaliza antes de que comience el segundo. En ciertas modalidades el término "coadministrar contemporáneamente" puede referirse a una proteína Id autóloga que sea administrada simultáneamente dentro de un mes, dos meses, tres meses, o cualquier subintervalo semanal como una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce de la última administración del agente citorreductor de unión específica. En modalidades preferidas el primer régimen utiliza un agente citorreductor de unión específica. En otras modalidades preferidas, el primer régimen utiliza un anticuerpo anti-CD20. En modalidades preferidas adicionales, el primer régimen comprende el rituximab o tositumomab. En modalidades aún más preferidas, el agente citorreductor de unión específica es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo anti-CD52, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-B7, un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD32, un anticuerpo anti-CD16, un anticuerpo anti-CD86 y un anticuerpo anti-CD156. Otros agentes citorreductores de unión específica son también útiles en la presente invención. La superficie celular de una célula inmune maligna, como una célula B contiene numerosas proteínas que pueden servir como ligando para un agente citorreductor de unión específica. Esos agentes citorreductores de unión específica capaces de unirse a células B malignas y producir citorreducción también pueden ser usados en esta invención. En modalidades preferidas, el segundo régimen utiliza el tratamiento con una proteína idiotípica. En otra modalidad, la proteína Id autóloga y el agente citorreductor pueden ser administrados en forma superpuesta, donde la administración de la proteína Id autóloga comienza antes de la última administración del agente citorreductor, pero después de la primera administración del agente citorreductor, la administración de la proteína Id autóloga y el agente citorreductor continúa en paralelo. El término "agente citorreductor de unión específica" se refiere a un agente citorreductor que se une selectiva y específicamente a su blanco designado, posiblemente un antígeno de la superficie celular, y por lo tanto produce citorreducción eliminando o inhibiendo el crecimiento de la célula blanco o matando a la población de células blanco. En modalidades preferidas un "agente citorreductor de unión específica" es un agente citorreductor de unión a antígeno. En modalidades más preferidas, un agente citorreductor de unión específica es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 como el rituximab. En otras modalidades preferidas, un agente citorreductor de unión específica también puede ser un anticuerpo que se une específicamente a diferentes antígenos de superficie como CD19, CD22, B7, o CD156. Un agente citorreductor de unión específica puede ser un anticuerpo, o puede ser un derivado funcional del anticuerpo como, un ScFv, un fragmento de anticuerpo camélido u otros derivados funcionales de anticuerpos. Un agente citorreductor puede ser un agente apoptótico. Son posibles otros agentes citorreductores de unión específica. Los anticuerpos específicos Bi capaces de unirse a más un antígeno de la superficie celular también son útiles en la presente invención. Además, la superficie celular de una célula inmune maligna, como una célula B, contiene numerosas proteínas que pueden servir como ligando para un agente citorreductor de unión específica. Esos agentes citorreductores de unión específica capaces de unirse a células B malignas y producir citorreducción también pueden ser usados en esta invención. El término "agente citorreductor" se refiere a un agente que reduce el número de células o retrasa la división celular en la población de células blanco. Un agente citorreductor puede actuar a través de la inducción de apoptosis, pero son posibles otros mecanismos. Cuando los compuestos de la presente invención son administrados a un sujeto, ellos son preparados generalmente como "composiciones" . Esas composiciones son con frecuencia mezclas y pueden contener de manera rutinaria, concentraciones f rmacéuticamente aceptables de sales, agentes amortiguadores, preservativos, vehículos o excipientes compatibles, y además opcionalmente otros agentes terapéuticos . Una composición puede incluir proteínas portadoras como un KLH y adyuvantes con un KLH, BCG, sales de aluminio y MF59 (Singh and O'Hagen, Nat . Biotech 17:1075-81 (1999) ) , así como compuestos de ácido nucleico simuladores como oligonucleótidos de CpG (véase por ejemplo, Jahrsdorfer B et al., J Leukoc Biol. 69(1): 81-8 (2001); Krieg AM, et al . , Trends Microbiol. 6 (1) -.23-7 (1998)). Los componentes de la ' composición pueden ser unidos covalentemente a la proteína Id autóloga. Una composición puede incluir citocinas como GM-CSF y MCP-3. La composición terapéutica puede ser administrada por cualquier ruta convencional, incluyendo la inyección o por infusión gradual con el tiempo. La administración puede, dependiendo de la composición, ser administrada, por ejemplo, por vía oral, pulmonar, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, subcutánea o transdérmica. El término "autóloga" como se usa aquí se refiere a la secuencia de aminoácidos para la región variable de la inmunoglobulina o la secuencia de ácido nucleico para un gen que codifica para la región variable de inmunoglobulina del paciente que es derivada del paciente a ser tratado . La proteína puede ser sintetizada, posteriormente in vi tro, la secuencia de ácido nucleico puede ser sintetizada, manipulada, o montada in vi tro, no obstante las secuencias de la región variable de la proteína Id son asociadas en el paciente a ser tratado con la enfermedad maligna del paciente, las secuencias de la región variable son derivadas de biopsias tomadas del paciente . La combinación exacta de las regiones variables y su tipo de inmunoglobulina usado en la proteína idiotípica puede no ser expresada por la enfermedad maligna del paciente, pero la región constante de la proteína Id autóloga se encuentra generalmente en humanos en la región variable derivada del paciente . Con referencia a las células dendríticas, u otras células derivadas de un organismo, el término "autóloga" tiene un significado adicional . Las células "autólogas" son obtenidas y/o aisladas del paciente a ser tratado. De este modo las células dendríticas autólogas son incluidas del paciente a ser tratado. En modalidades preferidas, las células dendríticas autólogas se ponen en contacto con la proteína Id autóloga y entonces se administran nuevamente al paciente. El término "proteína Id" o "proteína Id autóloga" como se usa aquí, se refiere a la Ig superficial idiotípica derivada de un tumor, autóloga, derivada de un paciente dado, también conocida como la proteína idiotípica. En modalidades preferidas, la proteína Id es derivada del tumor de células B de un paciente, la enfermedad maligna de células B de un paciente, o células derivadas del tumor o enfermedad maligna. El término "proteína Id autóloga recombiriante" se refiere a una proteína Id que ha sido sintetizada fuera del paciente por medios recombinantes . En modalidades preferidas, la proteína Id autóloga recombinante ha sido sintetizada en células de insectos. En otras modalidades preferidas, la proteína Id autóloga recombinante ha sido sintetizada en células de levadura o bacteria. En modalidades preferidas adicionales, la proteína Id autóloga recombinante ha sido sintetizada en células de mamífero. La proteína Id administrada a un paciente es generalmente una proteína quimérica, puesto que la secuencia final es derivada del paciente y el vector de expresión. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de la proteína Id autóloga recombinante puede ser idéntica a la proteína Id encontrada en el paciente. El término "contacto" como se usa aquí se refiere a agregar juntas una solución o una composición que comprende una proteína Id con un medio líquido bañando un polipéptido o célula. Las solución que comprende la proteína Id también puede comprender otro componente usado para facilitar la absorción de la proteína Id en la células de los métodos. La solución que comprende el compuesto de prueba puede ser agregado al medio que baña las células utilizando un aparato de distribución, o un dispositivo basado en una pipeta, o un dispositivo basado en una jeringa. El término "enfermedad maligna primaria" como se usa aquí se refiere a una enfermedad maligna de células B que no ha sido previamente tratado por quimioterapia antes de comenzar la terapia con un agente citorreductor de unión específica. De manera similar el término "no tratada" se refiere a una enfermedad maligna relacionada con las células B de un paciente que no ha sido tratado de enfermedad maligna relacionada con las células B antes de ser sometido a terapia por los medios de la presente invención. Por ejemplo, ese paciente no ha sido sometido a un curso de quimioterapia. El término "agente apoptótico" como se usa aquí es un compuesto, fármaco, toxina, composición o raramente una entidad biológica que comienza o promueve el proceso de apoptosis o muerte celular programada en una célula. En modalidades preferidas, la célula en la cual la apoptosis comienza o es promovida es una célula de una enfermedad maligna relacionada con las células B. Los agentes apoptóticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, TNF- , AIMI (véase, la Publicación Internacional No. WO 97/33899), AIM II (véase, la Publicación Internacional No. WO 97/34911), y Fas Ligand (Takahashi et al . , Int Immunol . , 6:1567-1574 (1994)), VEGI (véase, la Publicación Internacional No. WO 99/23105. El término "de manera recombinante" como se usa aquí puede referirse a los medios para producir un compuesto transcribiendo primero, traduciendo entonces una secuencia de ADN que ha sido ligada a otras secuencias de ADN con las cuales esta asociada la naturaleza. Un producto recombinante puede ser un péptido, un polipéptido, una proteína, una enzima, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un polipéptido que se una a un elemento regulador, una proteína estructural, una molécula ARN y/o una ribozima, por ejemplo. En modalidades preferidas, el producto recombinante de la presente invención es una proteína idiotípica. En otras modalidades preferidas, el producto recombinante de la presente invención es un anticuerpo monoclonal . En modalidades preferidas adicionales, el producto recombinante de la presente invención es un análogo de anticuerpo . Esta lista de productos recombinantes es para propósitos ilustrativos únicamente y la invención puede relacionarse con otros tipos de productos recombinantes. La secuencia de ADN usada para la producción del producto - genético se obtiene generalmente en su totalidad o parte de otro organismo o célula que se use para la expresión, entonces se liga en un vector de expresión para producir el producto genético en una forma recombinante. Nótese que los genes humanos pueden ser expresados de manera recombinante en una línea celular humana si el gen humano es aislado primero, entonces insertados en un vector de expresión, entonces regresados a una célula humana. Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se usan aquí de manera intercambiable y se usan con su significado convencional, es decir, una cadena de aminoácidos . Ninguno de los términos implica en ninguna longitud fija o intervalos de longitud de cadenas de aminoácidos . Esos términos tampoco implican o excluyen modificaciones postraslacionales (o pos-sintéticas) del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, y similares, así como otras modificaciones conocidas por aquellos expertos en la técnica, tanto naturales como no naturales. Un polipéptido puede ser una ' proteína completa o una región de la cadena de aminoácidos . Una proteína puede comprender más de un polipéptido. El término "líneas celulares de insectos" se refiere a líneas celulares derivadas de insectos. Muchas de esas líneas celulares de insectos son susceptibles a la infección por el baculovirus . Un experto en la técnica esta familiarizado con aquellas líneas celulares y las técnicas necesarias para utilizarlas. Los ejemplos representativos de líneas celulares de insecto incluyen las líneas celulares de Spodoptera frugiperda (sf9) y Trichoplusia ni (véase las Patentes Estadounidenses Nos. 5,300,435 y 5,298,418) . Los términos "células Trichoplusia ni" y "células de Spodoptera frugiperda" se refieren a líneas celulares de insecto frecuentemente usada en combinación con vectores de expresión de baculoviris. Un experto en la técnica está familiarizado con esas líneas celulares y como obtenerlas. El término "vector" aquí puede referirse a una molécula de ADN en la cual otra molécula de ADN de interés, como una molécula que codifica para una proteína Id puede ser insertada en el ADN del vector. Los ejemplos de clases de vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos ("fagos"). Típicamente, los vectores son diseñados para aceptar una amplia variedad de moléculas de ADN insertadas y entonces usados para transferir o transmitir el ADN del interés en una célula anfitriona (por ejemplo, célula de bacteria, levadura, eucariótica superior) . Un vector puede ser elegido sobre la base del tamaño de la molécula de ADN a ser insertada, así como la base del uso pretendido. Para la transcripción en el ARN o la transcripción seguida por la coalición para producir un polipéptido codificado, puede ser elegido un vector de expresión. Para la preservación e identificación de una secuencia de ADN específica (por ejemplo, una secuencia de ADN en una biblioteca de ADNc) o para la producción de un gran número de copias de la secuencia de ADN específica, puede ser elegido un vector de clonación, aunque el vector de expresión también puede ser usado para clonación o almacenamiento. Si el vector es un virus o bacteriófago, el término vector puede incluir el recubrimiento viral o del bacteriófago. Después de entrar en una célula, todo o parte de ADN del vector incluyendo el ADN insertado, puede ser incorporado en el cromosoma de la célula anfitriona, el vector puede ser mantenido extracromosomalmente . Los vectores que son mantenidos extracromosomalmente son con frecuencia capaces de replicarse autónomamente en una célula anfitriona en la cual sean introducidos (por ejemplo, muchos plásmidos que tienen un origen de replicación bacteriano) . Otros vectores se integran al genoma de una célula anfitriona tras la introducción en una célula anfitriona y por lo tanto se replican junto con el genoma anfitrión. El término "vector de expresión" como se usa aquí se refiere a un constructo o plásmido recombinante de ADN que le permita a un experto en la técnica colocar un gen que codifique para un producto genético de interés, usualmente una proteína, en un lugar específico de un vector del cual el producto genético seleccionado puada ser expresado por la maquinaria de la célula anfitriona seleccionada, o de manera alternativa por un sistema de expresión in vi tro . Este tipo de vector es con frecuencia un plásmido, pero pueden ser empleadas otras formas de vectores de expresión, como vectores de bacteriófago y vectores virales (por ejemplo, adenovirus, retrovirus de replicación defectuosa y virus adenoasociados) . La selección de los vectores de expresión, las secuencias de control, métodos de transformación y similares, dependen del tipo de célula anfitriona usada para expresar el gen. Un vector de expresión de la invención puede usar el promotor plO, el promotor poliedrina, la secuencia señal de melitina de abeja melífera o la secuencia señal de fosfatasa alcalina humana. Ese vector de expresión puede usar esos u otros promotores o secuencias señal en cualquier combinación. De este modo, el promotor plO puede ser ligado operativamente a la secuencia señal de melitina de abeja melífera o la secuencia señal de la fosfatasa alcalina humana y el promotor de poliedrina puede ser ligado a cualquiera de las secuencias señal de melitina de la abeja melífera o la secuencia señal de la fosfatasa alcalina humana. El mismo promotor puede ser ligado operativamente a ambos genes que codifiquen para las proteínas quiméricas en un vector de expresión. Las misma secuencia señal puede ser ligada de manera operativa individualmente a ambos genes que codifiquen para las proteína quiméricas en un vector de expresión. El término "vector de expresión de baculovirus" se refiere a un plásmido recombinante o constructo de ADN que está diseñado para insertar un gen de interés cuando se use en el sistema de baculovirus donde la expresión usualmente es conducida en células de insecto. Cualquiera de los baculovirus o vectores de expresión potenciales diseñados para funcionar en el sistema de baculovirus puede ser usado en la presente invención. En una forma similar el término "vector de expresión" es un género que abarca la modalidad particular de los vectores de expresión de baculovirus, pero los "vectores de expresión" no pueden funcionar en células y líneas celulares adicionales de, líneas celulares de insecto. El término "marco de lectura abierta" o "ORF" se refiere a una región de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido. Esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora total . En modalidades preferidas con referencia a toda la secuencia entre el codón de inicio y el codón sin sentido. El término "derivado del paciente" se refiere a materiales genéticos o células que han sido aisladas o purificadas de una muestra de sangre o tejido obtenido de un paciente. El término "derivado de una enfermedad maligna relacionada con la célula B" se refiere a material genético que ha sido aislado o purificado de una muestra de una enfermedad maligna relacionada con la célula B obtenida de un paciente . El término "cadena pesada de longitud completa" se refiere a una secuencia de la molécula de ADNc intacta o la cadena polipeptídica de inmunoglobulina de cadena pesada intacta como se aisló de la enfermedad maligna relacionada con las células B de un paciente . La cadena pesada de longitud completa puede ser cualquier subtipo de cadena de inmunoglobulina . El término "cadena ligera de longitud completa" se refiere a la secuencia de la molécula de ADNc intacta o la cadena polipeptídica de inmunoglobulina de cadena ligera intacta como se aisló de la enfermedad maligna relacionada con la célula B de un paciente. Esa cadena ligera de longitud completa puede ser una cadena ?(kappa) o ? (lambda) . El término "proteína quimérica" se refiere a una proteína la cual comprende una sola cadena polipeptídica que comprende segmentos derivados de al menos dos proteínas diferentes . Los segmentos de la proteína quimérica pueden ser derivados de proteínas heterólogas, es decir, que todos los segmentos del polipéptido quimérico no surgen de la misma proteína como ocurre en la naturaleza. Las proteínas quiméricas ctímo las usadas en la presente invención incluyen proteínas que contienen porciones de la región VH o VL de una cadena de inmunoglobulina, pero donde las proteínas quiméricas no comprenden toda la región C de aquellas cadenas como se encuentra en el clon de célula B del cual se derivó la región VH o VL. Además la región VH o VL puede no necesariamente incluir toda la región variable, sin incluir lo suficiente para generar una respuesta inmune. Las proteínas quiméricas como se usan en la presente invención también pueden incluir proteínas en las cuales un segmento de la proteína natural ha sido remplazado con un segmento natural o no natural equivalente. Esto incluye reemplazar la región constante de IgGx derivada de un paciente con la región constante de IgGi de una fuente diferente, y también incluye regiones constantes de in unoglobulinas en las cuales ha sido remplazado un segmento de proteína con un enlazante, segmento o dominio que es parcial o totalmente hecho por el hombre. En algunos casos, sin embargo, el gen o la región que codifica para la proteína quimérica de la presente invención puede ser el mismo que el gen para las inmunoglobulinas que se encuentran de manera natural en el paciente. El gen o marco de lectura abierta para la proteína quimérica puede ser distinguible del marco de lectura abierta de las proteínas naturales por una o más de las siguientes razones: (1) será el gen de inmunoglobulina de longitud completa o ADNc del paciente, o alguna parte más pequeña del gen de inmunoglobulina o ADNc; (2) será un subtipo diferente que se aisló del paciente; o (3) la secuencia de ácido nucleico que codifique para la región constante de IgGi del paciente será diferente de la porción del gen de IgGi usada en el vector de expresión; y/o (4) , el gen usado para la expresión idiotípica no contendrá intrones idénticos a aquellos expresados en el preARNm mensajero en la enfermedad maligna relacionada con la células B. Las proteínas quiméricas también pueden ser referidas como "proteínas de fusión" . El término "segmento" o "porción" o "parte" se usa para indicar aquellas secciones de un polipéptido derivado de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene una longitud menor que la del polipéptido de longitud completa del cual se ha derivado. Debe comprenderse que esos segmentos pueden retener una o más porciones caracterizantes del polipéptido nativo. Los ejemplos de esas características retenidas incluyen: unión con un anticuerpo específico para el polipéptido nativo o epítope del mismo. Los términos "VH y VL" se refieren a las regiones .variables de las cadenas polipeptídicas de las moléculas de inmunoglobulina, o ácidos nucleicos que codifican para esas cadenas polipeptídicas como es comprendido por aquellos expertos en la técnica. La secuencia exacta de una región variable no puede ser predicha y puede ser determinada aislando la secuencia (proteína o gen) en cuestión. Las regiones de V y VL aisladas de pacientes particulares son usadas en la presente invención. La secuencia exacta de una cadena ligera kappa (K) O lambda (?) es determinada por los rearreglos clónales de las regiones V, regiones J y la región Constante del sitio de la cadena ligera. (Los sitios kappa y ' lambda están separados y son distintos) . La secuencia exacta de una cadena pesada es determinada por los rearreglos clónales de las regiones V, regiones D, regiones J y región Constante del sitio de la cadena pesada. La variación de secuencia adicional en la región variable surge de la imprecisión durante el proceso de recombinación y también es generada por mutaciones somáticas posteriores al final del proceso de recombinación. Los términos "VH" y "VL" también se refieren a porciones o segmentos de las regiones VH y VL. Un segmento de la región VH o V puede incluir también toda o sustancialmente toda la región V. El término "sustancialmente todo" se refiere a aproximadamente 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, o menos de toda la región variable. La porción de la región VH o VL presente debe ser suficiente para permitir que la molécula quimérica opere en la presente invención. Los términos "VH" y "VL" también pueden referirse a derivados funcionales de esas regiones polipeptídicas. El término "región constante de inmunoglobulina" se refiere a toda o parte de esa porción de las moléculas de inmunoglobulina que no son codificadas por las regiones variables de las inmunoglobulinas . El término "región constante de inmunoglobulina" también puede referirse a la secuencia de ADN que codifica para la región constante de inmunoglobulina. La región constante de inmunoglobulina incluye los segmentos CL, CH1, CH2, CH3 , y la región de Bisagra. Los tipos de inmunoglobulina incluyen cadenas pesadas de IgG?l, lgG?2, IgG?3, IgG?4, IgAx, IgA2, IgM, IgD, IgE y cadenas ligeras K o ? o segmentos de las mismas . Pueden ser usados cualesquier segmentos de la región constante de inmunoglobulina para las proteínas Id quiméricas. También pueden ser usados derivados funcionales de los segmentos de la región constante de inmunoglobulina. Los términos "IgGX/ IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA?, IgA2, IgM, IgD, IgE" se refieren a clases y subclases de inmunoglobulinas humanas. Los términos pueden referirse a las secuencias de ADN, secuencias de ARN o las secuencias de aminoácidos de las proteínas . La clase y subclase de una molécula de inmunoglobulina es determinada por su cadena pesada. La IgG e IgD son clases diferentes de inmunoglobulinas; la IgG? y la IgG2 son subclases diferentes de moléculas de inmunoglobulina. El término "IgA" puede referirse a cualquier subclase de moléculas de IgA. En modalidades preferidas, se refiere a una molécula de IgAx. En otras modalidades preferidas, se refiere a una molécula de I A2. En algunas modalidades, la cadena pesada de inmunoglobulina usada puede ser una proteína quimérica que contenga aminoácidos de una segunda proteína. El término "IgG?i" se refiere a la cadena pesada asociada con la clase de inmunoglobulinas IgG? . La IgGi representa aproximadamente el 66% de las inmunoglobulinas IgG humanas (Roitt et al . , Immunology, Mosby, St Louis, pg. 4.2, 1993). Los términos "región constante kappa" , "región constante lambda" , "región constante K" y "región constante ?" se refieren a las regiones constantes de las cadenas ligeras (K) y lambda (?) que permanecen constantes durante el desarrollo del sistema inmune. Los términos pueden referirse a las secuencias de ADN, secuencias de ARN o las secuencias de aminoácidos de las proteínas . En algunas modalidades de la presente invención, las porciones de la cadena ligera de inmunoglobulina pueden estar comprendidas en una proteína quimérica que contenga aminoácidos de una o más de otras proteínas . El termino "aislar" se refiere a remover una secuencia de ácido nucleico natural en su ambiente celular normal. De este modo, la secuencia puede ser una solución libre de células o colocar en un ambiente celular diferente. El término no implica que la secuencia sea únicamente en la cadena nucleotídica presente, sino que está esencialmente libre (aproximadamente 90 - 95% pura al menos) de material no nucleotídico asociado naturalmente con esta, y de este modo se distingue de los cromosomas aislados. También, el uso del término "aislar" con referencia al ácido nucleico significa que la secuencia de ADN o ARN específica se incrementó en una fracción significativa mayor (2 a 5 veces) del ADN o ARN total presente en la solución de interés que en las células de las cuales fue tomada la secuencia. Este enriquecimiento podría ser provocado por una persona, reduciendo preferiblemente la cantidad de otro ADN o ARN presente, o incrementado preferiblemente la cantidad de la secuencia de ADN o ARN específica o por una combinación de las dos. Sin embargo, deberá notarse que este "enriquecimiento" no implica que no existan otras secuencias de ADN o ARN presentes, solo que la cantidad relativa de la secuencia de interés se ha incrementado significativamente. El término "significativamente" se usa aquí para indicar que nivel de incremento es útil para que la persona produzca tal incremento, y generalmente significa un incremento en relación a otros ácidos nucleicos de aproximadamente al menos 2 veces, de manera más preferible al menos 5 a 10 veces o aún más. El término tampoco implica que no exista ADN o ARN de otras fuentes. El ADN de otras fuentes puede, por ejemplo, comprender el ADN de un genoma de levadura o bacteria, o un vector de clonación como el pUC19. Este término se distingue de los eventos que ocurren de manera natural, como una infección viral, o crecimientos tipo tumor, el nivel de un ARN puede estar incrementado de manera natural en relación a otras especies de ARN. Es decir, el significado del término cubre solo aquellas situaciones en las cuales una persona ha intervenido para elevar la proporción del ácido nucleico deseado. El término "aislar" también puede incluir el paso donde una secuencia de ARN es convertida en una secuencia de ADNc por métodos bien conocidos en la técnica. Las secuencias de ADN aisladas son relativamente más puras que en un ambiente natural (en comparación con el nivel natural este nivel será al menos 2 a 5 veces mayor, por ejemplo, en términos de mg/mL) . Las secuencias individuales obtenidas por PCR pueden ser purificadas hasta la -homogeneidad electroforética. Las moléculas de ADN obtenidas de esa reacción de PCR pueden ser obtenidas del ADN total o del ARN total. Esas secuencias de ADN pueden o no ser naturales, pero más bien se obtienen preferiblemente vía la manipulación de una sustancia natural parcialmente purificada (por ejemplo, un ARN mensajero (ARNm)). Por ejemplo, la construcción de una biblioteca de ADNc a partir de ARNm implica la creación de una sustancia sintética (ADNc) y los clones de ADNc individuales puros pueden ser aislados de la biblioteca sintética por la selección clonal de las células que contienen la biblioteca de ADNc. El proceso que incluye la construcción de una biblioteca de ADNc del ARNm del aislamiento de diferentes clones de ADNc producen una purificación de aproximadamente 106 veces del mensaje nativo. De este modo, la purificación de al menos un orden demagnitud, preferiblemente de dos o tres órdenes, y de manera más preferible cuatro a cinco órdenes de magnitud es contemplada de manera expresa. El término "gen codificador" se refiere a una ' secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína o polipéptido de interés. La secuencia de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN o ARN. En modalidades preferidas, la molécula es una molécula de ADN. En otras modalidades preferidas, la molécula es una molécula de ARN. Cuando esta presente, una molécula de ADN, pueden comprender las secuencias necesarias o útiles para dirigir la expresión del gen. Cuando este presente, una molécula de ARN, comprende las secuencias los cuales dirigen los ribosomas de la célula anfitriona para comenzar la traducción (por ejemplo, un codón de inicio ATG) y dirigir los ribosomas hacia la traducción final (por ejemplo, un codón sin sentido) . Entre el codón de inicio y el codón sin sentido en un marco de lectura abierta (ORF) . El término "insertar" se refiere a una manipulación de una secuencia de ADN vía el uso de enzimas de restricción y ligasas por lo que la secuencia de ADN de interés que usualmente codifica para el gen de interés puede ser incorporada en otra molécula de ácido nucleico digiriendo ambas moléculas con enzimas de restricción apropiadas para crear superposiciones compatibles y usando entonces una ligasa para unir las moléculas juntas. Un experto en la técnica estará bien familiarizado con esas manipulaciones y ejemplos pueden encontrarse en Sambrook et al . , (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición Cold Spring Habor Laboratory, 1989), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad incluyendo' cualesquier dibujos, figuras y tablas. El término "que permite la expresión de" se refiere colocar un vector de expresión en un ambiente en el cual el gen de interés será expresado. Esto comúnmente significa insertar el vector de expresión en un tipo de célula apropiado donde el promotor y otras regiones necesarias para la expresión del gen serán reconocidas por los componentes de la célula anfitriona y producirán la expresión del gen de interés. La expresión normalmente consiste de dos pasos: transcripción y traducción. La expresión también puede ser conducida in vi tro usando componentes derivados de células. Un experto en la técnica está familiarizado con esas técnicas, y esas técnicas son expuestas en Sambrook et al . , (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) . En la modalidad preferida, el producto expresado es una proteína o polipéptido. En otras modalidades preferidas, el producto expresado es VH/IgGy?, VL/CK, ~Vt/C?, o VL/IgG??. El término "secuencia señal secretora" se refiere a una secuencia peptídica o una secuencia nucleotídica que dirige la exportación de una proteína desde la célula. Cuando esta secuencia nucleotídica es traducida en el marco como un péptido unido al extremo amino terminal de un polipéptido de elección, la secuencia de la señal secretora peptídica producirá la secreción del polipéptido de elección interactuado con la maquinaria de la célula anfitriona. Como parte del proceso secretor, esta secuencia señal secretora será escindida, dejando únicamente el polipéptido de interés, después de que ha sido exportada. En modalidades preferidas, es empleada la secuencia señal secretora de la melitina de abeja melífera. En otras modalidades preferidas, es enviada la secuencia señal secretora de la fosfatasa alcalina de placenta humana. Los sistemas de expresión de baculovirus no son limitados por esa secuencia señal secretora y otras conocidas por aquellos expertos en la técnica pueden ser sustituidas en lugar de, además de esas. El término "controles de promotor" se refiere a un arreglo de ADN en un vector de expresión en el cual es colocado un promotor 5' a un gen de interés y dirige la transcripción de la secuencia de ADN en una molécula de ARNm. Esta molécula de ARNm puede entonces ser traducida por la maquinaria de la célula anfitriona. Los términos "proteína A" , "proteína G" y proteína L" se refieren a proteínas bacterianas específicas las cuales son capaces de unirse específicas a moléculas de inmunoglobulinas sin interactuar con un sitio de unión de antígeno. La proteína A es un polipéptido aislado de Staphylococcus aureus que une a la región Fe de las moléculas de inmunoglobulina. La proteína G es una proteína de la pared celular bacteriana con afinidad por la inmunoglobulina G (IgG) , la cual ha sido aislada de una cepa estreptocócica del grupo G humano (G148) . La proteína L es una proteína de unión de la cadena ligera de inmunoglobulina expresada por algunas cepas de especies de bacterias anaeróbicas Peptostreptococcus magnus . El término "ligado operativamente" se refiere a un arreglo de ADN en el cual una región de control, como un promotor o mej orador está unido a un gen de ADN conectado de interés para revocar su transcripción, y en consecuencia permitir su traducción. El término "ligado operativamente" también puede referirse a una secuencia de ADN que codifique para una señal de procesamiento, una secuencia señal secretora, conectada a un gen que codifique para un polipéptido para formar un solo marco de lectura abierta. Después de la traducción y transcripción, la secuencia señal secretora tiene el potencial de provocar la exportación del polipéptido traducido. El término "aislar" con referencia a una proteína o polipéptido, se refiere a remover un polipéptido o proteína natural de su ambiente celular normal o se refiere a remover un polipéptido o proteína sintetizada en un sistema de expresión (como un sistema de baculovirus descrio aquí) de los otros componentes del sistema de expresión. De este modo, la secuencia polipeptídica puede estar en una solución libre de células o colocada en un nivel de células diferentes. El término no implica que la secuencia polipeptídica sea la única cadena de aminoácidos presente, sino que está esencialmente libre (aproximadamente 90-95% pura al menos) de material no basado en aminoácidos asociado naturalmente con esta. El uso del término "enriquecido" con referencia a un polipéptido significa que la secuencia de aminoácidos específica constituye una fracción significativamente mayor (2 a 5 veces) de las secuencias de aminoácidos totales presentes en la células o soluciones de interés que en células normales o enfermas o en las células de las cuales se tomó la secuencia. Esto podría ser provocado por una persona . reduciendo preferiblemente la cantidad de otras secuencias de aminoácidos presentes (u otro material) , o pueden ir incrementado preferiblemente la cantidad de la secuencia de aminoácidos específica de interés o por una combinación de las dos. Sin embargo, deberá notarse que enriquecido no implica que no existen otras secuencias de aminoácidos presentes, solo que la cantidad relativa de la secuencia de interés se ha incrementado significativamente. El término significativamente aquí es usado para indicar que el nivel de incremento es útil para que la persona efectúe al incremento, y generalmente significa un incremento en relación a otras ' secuencias de aminoácidos de aproximadamente al menos 2 veces, de manera más preferible al menos 5 a 10 veces o aún más. El término tampoco implica que no existan secuencias de aminoácidos de otras fuentes . Las otras fuentes de secuencias de aminoácidos pueden, por ejemplo, comprender secuencias de aminoácidos codificadas por un genoma de levadura o bacteria, o un vector de clonación como pUC19. En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos es una proteína quimérica como se describió anteriormente . El significado del término cubre únicamente aquellas situaciones en las cuales ha intervenido una persona para incrementar la proporción de la secuencia de aminoácido deseada. También es ventajoso para algunos propósitos que una secuencia de aminoácidos esté en forma purificada. El término "purificada" con referencia a un polipéptido no requiere la pureza absoluta (como una preparación homogénea) ; en su lugar, representa una indicación de que la secuencia está relativamente más pura que en el ambiente natural. En comparación con el nivel natural este nivel deberá ser al menos de 2 a 5 veces mayor (por ejemplo, en términos de mg/mL) . La purificación de al menos un orden de magnitud, de manera preferible dos o tres órdenes, y de manera más preferible cuatro a cinco órdenes de magnitud se contempló expresamente . La sustancia está preferiblemente libre de contaminación a un nivel funcionalmente significativo, por ejemplo 90%, 95%, ó 99% pura. El término "agente quimioterapéutico" como se usa aquí es un compuesto, fármaco, toxina o composición que es utilizada para inducir un efecto terapéutico en un paciente que padece de cáncer. En modalidades preferidas, el cáncer es una enfermedad maligna relacionada con las células B. Una variedad de posibilidades para agentes quimioterapéuticos se listan aquí y esos, así como otros, son bien conocidos en la técnica. También están disponibles agentes terapéuticos biotecnológicos como el rituximab y el tositumomab. El término "agente quimioterapéutico" como se usa aquí también incluye, por ejemplo, agentes interactivos con el ADN, antimetabolitos, agentes interactivos con la tubulina, agentes hormonales y otros, como la asparaginasa o hidroxiurea. Los agentes quimioterapéuticos pueden ser agrupados como agentes interactivos con el ADN, antimetabolitos, agentes interactivos con la tubulina, agentes hormonales y otros agentes como la asparaginasa o hidroxiurea. Cada tipo de agentes quimioterapéuticos puede ser subdividido adicionalmente . Los agentes quimio terapéuticos pueden ser seleccionados de cualquiera de esos grupos, pero no se limitan a estos.

Inmunoterapia Usando un Idiotipo Propio del Paciente Producido en Células de Insecto Históricamente, los antígenos de superficies de las células circulatorias y aquellas del sistema inmune han sido caracterizados exhaustivamente. Esta ventaja puntual ha conducido a la comprensión de que muchos cánceres del sistema circulatorio tienen antígenos de superficie clonalmente únicos; los tumores de células B, especialmente, consisten de células producidas en masa que expresan un solo anticuerpo con ese anticuerpo presentado sobre la superficie de la célula con la proteína idiotípica. Esto sugiere inmediatamente que un tumor de células B podría ser atacado selectivamente usando la precisión del sistema inmune en lugar de recurrir a la destrucción masiva de la quimioterapia . La posibilidad de evocar una respuesta inmune que reconozca y elimine únicamente células neoplásicas discriminando a la vez tejido normal representa un método excitante para el tratamiento del cáncer. Como se observó anteriormente en los Antecedentes de la Invención, han sido desarrollados métodos poco prácticos para lograr esto. Inducir esa respuesta inmune requiere identificar un antígeno tumoral único y presentar este como un inmunógeno. La mayoría de las enfermedades malignas relacionadas con las células B surgen de la expansión clonal de una sola célula B, de este modo cada célula B alberga una secuencia genética única usada en la producción del idiotipo de inmunoglobulina. En consecuencia, la proteína idiotípica servirá como un blanco ideal para la terapia basada en el sistema inmune de cualquier enfermedad maligna relacionada con las células B (una enfermedad clonal de células B) , si puede producirse en cantidad suficiente. Para lograr esto, la proteína Id de cada paciente debe ser identificada y producida en masa para usarse como un antígeno en inmunización. La identificación puede ser efectuada usando las secuencias de la región estructural que son específicas de la especie y PCR. Además, este proceso toma ventaja de la abundancia clonal relativa de un tumor de células B . Las células tumorales serán la población más abundante de células productoras de anticuerpo en el cuerpo. De este modo, han sido desarrolladas técnicas para aislar la porción del gen requerido para inmunoterapia. Para un ejemplo, véase la Solicitud PCT No. PCT/US01/25204, titulada "Método y Composición para Alterar una Patología Mediada por Células B" publicada en Febrero 21, 2002 como WO 02/13862, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad, incluyendo cualesquier dibujos, figuras y tablas. Ha sido expedida una notificación de confesión en correspondencia a la Solicitud Estadounidense No. de Serie 09/927,121, y se expedirá una Patente Estadounidense. Sin embargo, puede ser usada, cualquier técnica adecuada que permita que toda o parte de la proteína Id sea producida en cantidades suficiente para ser usada para inmunoterapia activa. Para esto existen numerosas técnicas disponibles en la técnica. Esta inmunoterapia activa evita el fenómeno de escape mutacional observado con estrategias inmune pasivas y tiene el potencial de generar una respuesta inmune más amplia y por lo tanto reconocer la población de células tumorales heterogéneas que puedan surgir con el tiempo. Después del aislamiento del gen, pueden ser usadas técnicas estándar para producir la proteína idiotípica. Se encuentra disponible una amplia variedad de técnicas; en general, los anticuerpos son producidos in vi tro usando células de mamífero, células de levadura, bacteria, eucarióticas o procarióticas . Las células de mamífero producen anticuerpo funcional, incluyendo la glicosilación apropiada. Las células bacterianas son más fáciles de hacer crecer y pueden ser biomodificadas para producir anticuerpos, sin embargo, los anticuerpos así producidos no están glicosilados . Otras células eucarióticas pueden ser anfitrionas para la expresión de genes endógenos y los anticuerpos producidos son glicosilados. En la Publicación PCT, WO 02/13862, Gold and Shopes demuestran que podrían ser usadas células de insectos para producir proteínas idiotípicas glicosiladas, y además, que esas proteínas idiotípicas podrían ser usadas para elevar una respuesta inmune .

Inducción de la Apoptosis de Células B con un Anticuerpo Anti-CD20 Como se mencionó anteriormente, el Rituxan® es un anticuerpo monoclonal específico para el anticuerpo CD20 encontrado sobre las células B maduras . Aunque su efecto es específico para las células B, aún ataca toda la población de células B de un paciente, en lugar de dirigir una respuesta - inmune anti-idiotipo específica dirigida específicamente a células B malignas . Si la eficacia de la estimulación inmune después de la inmunoterapia con una proteína idiotípica, como es mostrado por Gold and Shopes, se debe en su totalidad o en una gran parte a la producción de anticuerpo, entonces la inyección de proteína idiotípica inmediatamente después del tratamiento con Rituxan® sería un derroche de recursos; la terapia sería privada de un brazo del sistema inmune. De manera sorprendente, sin embargo, el tratamiento con rituximab seguido rápidamente por la inmunización con una proteína Id produce una respuesta sinérgica: la población de células B deprimidas conduce a una mejor respuesta a la inmunización con proteína Id. Esto sugiere a los inventores, sin ser limitados por esta o alguna otra teoría, que la terapia con proteína Id funciona principalmente induciendo, in vivo una respuesta inmune mediada por células (por ejemplo, células T) para alterar la patología mediada por células B.

Agentes Quimioterapéuticos para el Tratamiento de Enfermedades Malignas Relacionadas con las Células B Los agentes quimioterapéuticos, como es usado el término aquí, incluyen una amplia variedad de moléculas pequeñas como agentes interactivos con el ADN, antimetabolitos, agentes interactivos con la tubulina, agentes hormonales y otros, como la asparaginasa o hidroxiurea. Los agentes quimioterapéuticos . pueden ser seleccionados de cualquiera de los siguientes grupos pero no se limitan a estos. Los agentes interactivos con el ADN incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes, como el cisplatino, ciclofosf mida, altretamina; agentes degradantes de la hebra de ADN, como la bleomicina; inhibidores de la topoisomerasa II intercalantes, por ejemplo, la dactinomicina y doxorrubicina) ; inhibidores de la topoisomerasa II no intercalantes como, el etopósido y tenipósido; y el aglutinante de la ranura menor del ADN plicamidina. Los agentes alquilantes pueden formar aductos químicos covalentes con ADN celular, ARN o moléculas de proteína, o con aminoácidos más pequeños, glutation o compuestos químicos similares. Los ejemplos de agentes alquilantes típicos incluyen, pero no se limitan a, mostazas nitrogenadas (biscloroetilaminas) , como el clorambucilo, ciclofosfamida, isofamida, mecloretamina, melfalan, mostaza de uracilo; aziridina como la tiotepa; esteres de metansulfonato (o alquil alcon sulfonatos) como el busulfan; nitroso ureas, como la carmustina, lomustina, estreptozocina; complejos de platino, como el cisplatino, carboplatino; y agentes alquilantes no clásicos como la procarbazina, dacarbazina y altretamina. Los agentes antibióticos son un grupo de fármacos producidos de manera similar a los antibióticos como una modificación de productos naturales. Los ejemplos de agentes antibióticos incluyen, pero no se limitan a, un alquilador biorreductor, como la mitomicina-C y agentes degradantes de la hebra de ADN que incluyen a la bleomicina como un ejemplo. Otros agentes antibióticos incluyen compuestos que se sabe actúan como inhibidores de la ADN topoisomerasa II y pueden incluir intercaladores como los siguientes: amsacrina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina) , idarrubicina, y mitoxantrona; así como no intercaladores como el etopósido y tenipósido. Otros agentes similares incluyen a la epirrubicina y antracendiona . Los antimetabolitos generalmente interfieren con la producción de ácidos nucleicos y por lo tanto el crecimiento de las células por uno de dos mecanismos principales. Ciertos fármacos inhiben la producción de trifosfatos de desoxirribonucleósids que son los precursores de la síntesis de ADN, inhibiendo de este modo la replicación del ADN. Los ej emplos de esos compuestos son análogos de purinas o pirimidinas y se incorporan en las vías nucleotídicas anabólicas. Esos análogos son entonces sustituidos en el ADN o ARN en lugar de sus contrapartes normales . Los antimetabolitos útiles como agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antagonistas de folato como el metotrexato y trimetrexato; antagonistas de pirimidina, como el fluorouracilo, fluorodesoxiuridina, CB3717, azacitidina, citarabina, y floxuridina; antagonistas de purina como la mercaptopurina, 6-tioguanina, fludarabina, pentostatina; e inhibidores de ribonucleótido reductasa como la hidroxiurea. Otros antimetabolitos incluyen a la pentostatina, fosfato de fludarabina, cladribina (2-CDA) , y gemcitabina. Otros agentes incluyen a la hidroxiurea (la cual parece actuar principalmente a través de la inhibición de la enzima ribonucleótido reductasa) , y asparaginasa (una enzima la cual convierte la asparagina a ácido aspártico y de este modo inhibe la síntesis de proteína) . Los agentes derivados de plantas son un grupo de fármacos que son derivados de plantas o son modificaciones de agentes derivados de plantas. Los ejemplos de agentes derivados de plantas incluyen, pero no se limitan a, alcaloides de vinca (por ejemplo vincristina, vinblastina, vindesina, vinzolidina y vinorelbina) , podofilotoxinas (por ejemplo, etopósido (VP-16) y tenipósido (VM-26) ) , taxanos (por ejemplo, paclitaxel (Taxol) y docetaxel) . Algunos de esos agentes derivados de plantas, como algunos de los alcaloides de vinca y el paclitaxel, actúan como agentes - antimitóticos por una unión a la tubulina y por lo tanto perturban la mitosis. Se cree que las podofilotoxinas como el etopósido interfieren con la síntesis de ADN interactuando con la topoisomerasa II, conduciendo a la escisión de la hebra de ADN. Otro agente quimioterapéutico derivado de plantas es la 20 (S) -camptotecina. Los agentes hormonales también son útiles en el tratamiento de cánceres y tumores y están indicados en tumores hormonalmente susceptibles . Esos agentes usualmente se derivan de fuentes naturales . Los agentes hormonales incluyen, pero no se limitan a, estrógenos, estrógenos conjugados y etinil estradiol y dietilestilbesterol, clortrianisen e idenestrol; progestinas como el caproato de hidroxiprogesterona, medroxiprogesterona, y megestrol; y andrógenos como la testosterona, propionato de testosterona; fluoximesterona, y metiltestosterona. Los corticosteroides adrenales son derivados del cortisol adrenal natural o hidrocortisona y son usados para tratar enfermedades malignas relacionadas con las células B. Ellos son usados debido a sus beneficios antiinflamatorios así como la capacidad de algunos para inhibir las divisiones mitóticas y detener la síntesis de ADN. Esos compuestos incluyen, pero no se limitan a, la prednisona, dexametasona, metilprednisolona, y prednisolona. Los agentes quimioterapéuticos adicionales incluyen a la 2-CDA, 2' -desoxicofo nicina, etopósido ifosfamida, y antraciclina.

Una lista de algunos agentes quimioterapéuticos •actualmente disponibles de acuerdo a la clase, e incluyendo las enfermedades para las cuales están indicados esos agentes, se proporciona como Tabla 3 de la Patente Estadounidense No. 6,608,096, la cual se incorpora por lo tanto aquí como referencia en su totalidad, incluyendo cualesquier dibujos, figuras y tablas. Las siguientes combinaciones de agentes quimioterapéuticos, entre otras, son usadas para tratar enfermedades malignas relacionadas con células B y células T: MOPP, ABVD, ChlVPP, CABS, MOPP más ABVD, MOPP más ABV, BCVPP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, CEM, MTX-CHOP, EVAP y EPOCH. Otras combinaciones ejemplares de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a CVP, CHOP, C-MOPP, CAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE- CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEPP (B) , CAMP, CMP; COP, CAP, (vincristina, prednisona, antraciclina y ciclofosfamida o asparaginasa) ; y (vincristina, prednisona, antraciclina, ciclofosfamida y asparaginasa) . Para una discusión detallada de los agentes quimioterapéuticos y su método de administración, véase Dorr, et al . , Cáncer Chemotherapy Handbook, 2d edición, Appleton & Lange (Connecticut , 1994) incorporada aquí como referencia. Las descripciones y protocolos adicionales para los regímenes de quimioterapia son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Otros agentes usados en la terapia del cáncer incluyen agentes biotecnológicos que producen regresión del cáncer/tumor cuando se usan solos o en combinación con quimioterapia y/o radioterapia. Los ejemplos de agentes biotecnológicos incluyen, pero no se limitan a, proteínas inmunomoduladoras como las citocinas, anticuerpos monoclonales contra antígenos tumorales y compuestos que estimularán al sistema inmune para atacar a las células cancerosas. Todas las citocinas poseen actividad inmunomoduladora. Algunas citocinas en particular, como la interleucina-2 (IL-2, aldesleucina) e interferón-a (IFN- ) han sido aprobadas para el tratamiento de pacientes con ciertas formas de cáncer habiendo demostrado actividad antitumoral . La IL-2 es un factor del crecimiento de las células T que es central para las respuestas inmunes mediadas por células T. Los efectos antitumorales selectivos de la IL-2 sobre algunos pacientes puede ser el resultado de una respuesta inmune mediada por células que discrimina entre lo propio y lo ajeno. El IFN-a ha demostrado actividad contra enfermedades malignas sólidas y hematológicas, y las últimas parecen ser particularmente sensibles. Otras citocinas que son útiles en la presente invención incluyen a aquellas citocinas que ejercen control sobre la hematopoyesis y funciones inmunes. Los ejemplos de esas citocinas incluyen pero no se limitan a la eritropoyetina (epoyetina- ) , CSF granulocítico (filgrastim) , y CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, sargramostim) . Pueden ser usados otros agentes biotecnológicos en la presente invención que proporcionen un efecto terapéutico contra una enfermedad maligna relacionada con las células B. Los ejemplos de esos agentes inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan al bacilo de Calmette-Guerin, levamisol, y octreotida. Sin limitarse a una teoría particular, el GM-CSF puede ser particularmente útil en la presente invención sobre la base de su capacidad para reclutar células dendríticas en el sitio de inyección de la proteína Id autóloga. Por lo tanto, otros agentes que recluten células dendríticas en el sitio de inyección también pueden probar ser útiles para la presente invención.

Tratamiento con Anticuerpo Monoclonal Los anticuerpos monoclonales contra antígenos presentes en células tumorales han mostrado ser eficaces como agentes terapéuticos. En particular, los anticuerpos monoclonales dirigidos al antígeno CD20 ("un anticuerpo anti-CD20") presente sobre las células B malignas ha probado ser eficaz en el tratamiento de enfermedades malignas relacionadas con las células B. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal RITUXAN® (rituximab) fue creado contra el antígeno CD20 (también conocido como el antígeno Bp35) sobre células de linfoma y aborda selectivamente células B normales y malignas CD20+ pre-B y maduras. El RITUXAN® es con frecuencia usado solo como un agente terapéutico para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin de células B con recaída, o de grado bajo refractario o folicular, CD20+. Otro ejemplo de un anticuerpo monoclonal usado como agente quimioterapéutico en el cáncer es el HERCEPTIN101 (Trastruzumab) . El HERCEPTIN™ fue creado contra el receptor 2 del factor del crecimiento epidérmico humano (HER2) que se encontró está sobreexpresado en algunos tumores de mama metastásicos . La sobreexpresión de la proteína HER2 está asociada con una enfermedad más agresiva y un pronóstico más pobre en la clínica. El HERCEPTIN™ es usado como tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína HER2. El Rituxan® está aprobado para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin de células B, con recaída o refractario, de grado bajo o folicular, CD20-positivas . Los resultados del ensayo de la Fase III en 166 pacientes indican un porcentaje de respuesta total del 48% (respuesta completa (CR) del 6%) , un tiempo mediano para el progreso de la enfermedad en todos los pacientes tratados de 9.0 meses y una duración media de la respuesta de 11.2 meses [1.9 a 42.1+ meses] (McLaughlin P, et al . , "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma: half of patients respond to a four-dose treatment program, "J. Clin. Oncol. 1998; 16 (8): 2825-33)). LA FDA ha recientemente ampliado la etiqueta para incluir el retratamiento de pacientes que han logrado una respuesta objetiva a un curso previo de Rituxan®. En un multicentro, en un estudio de un solo brazo, 60 pacientes recibieron 375 mg/m2 de Rituxan® semanalmente durante 4 dosis. (Davis T, et al . "Rituximab anti-CD20 monoclonal antibody therapy in non-Hodgkin1 s lymphoma: safety and efficacy of re-treatment, "J. Clin. Oncol. 2000; 18 (17): 3135-43)). Todos los pacientes tenían NHL de células B con recaída o refractario, de grado bajo o folicular y habían alcanzado una respuesta clínica objetiva a un curso anterior de Rituxan®. De esos 60 pacientes, 55 recibieron el segundo curso de Rituxan®, 3 pacientes recibieron su tercer curso y 2 pacientes recibieron su segundo y tercer cursos de Rituxan® en este estudio. El porcentaje de respuesta total (ORR) fue de 38% (CR del 10% y respuesta parcial (PR) del 28%) con una duración media proyectada de la respuesta de 15 meses (intervalo, 3.0 a 25.1+ meses). Para vacunas que producen principalmente una respuesta al anticuerpo, hubo el temor de que combinar la inmunoterapia con Rituxan®, el cual produce un agotamiento rápido y sostenido (hasta de 6 a 9 meses después del tratamiento en 83% de los pacientes) de las células B circulantes y basadas en tejido, cortaría cualquier respuesta al anticuerpo. Otro anticuerpo anti-CD20, Bexxar® (tositumomab), también ha sido recientemente aprobado por la FDA para el tratamiento de linfomas de células B (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 6,565,827; 6,287,537; 6,090,365; 6,015,542; 5,843,398; y 5,595,721). Otras terapias con anticuerpos monoclonales en ensayos clínicos o recientemente aprobadas incluyen al Oncolym® (dirigido contra la proteína HLA-DrlO) , Zevalint®, epratuzumab, y un anticuerpo anti-CD52 Campath®/MabCampath® (alemtuzumab) .

Inmunoterapia con Proteína Id Autóloga La presente invención contempla el uso del antígeno único, el idiotipo de inmunoglobulina (Id) , sobre la enfermedad maligna relacionada con las células B como una inmunoterapia. Este Id contiene secuencias de proteína de ambas regiones pesada y ligera de inmunoglobulina (VH y VL) fijas dentro de los dominios de anticuerpo constantes. Usando la proteína idiotípica como un inmunógeno, puede demostrarse que los determinantes únicos que definen el idiotipo instruyen y activan al sistema inmune a su existencia que conduce al reconocimiento y destrucción posterior de la enfermedad maligna relacionada con las células B de la cual los genes idiotípicos fueron clonados inicialmente . La secuencia de ADN que codifica para la región variable de las inmunoglobulinas idiotípicas se clonó usando cebadores derivados del extremo 5' de cada subfamilia única de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina junto con un cebador de la región constante. Típicamente, este proceso usa una de varias técnicas de clonación adecuadas como la PCR. Esos cebadores de la región constante, en combinación con una de la región de VH y de la región VL, pueden ser usados para clonar las regiones variables como un primer paso en la producción de una proteína quimérica que comprende una región variable y una región constante. De manera alternativa, pueden ser usadas técnicas como la 5 'RACE. Para los estudios descritos aquí, se usó 5'RACE para clonar las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de -inmunoglobulina para producir una proteína quimérica. Los ejemplos de proteínas quiméricas incluyen: VL/C?, VL/C?, VL/lgG??, VH/IgG??, VH/C?, y VH/C?. La proteína quimérica comprende de este modo una porción de una región variable de una molécula de inmunoglobulina de un paciente y también comprende una porción de una región constante de una fuente diferente a la del paciente. En modalidades preferidas, las secuencias de la región constante de las cadenas ligera y pesada se derivaron de células 9F12. Sin embargo, pueden ser usadas otras fuentes para los genes de la región constante de inmunoglobulina. Se predijo que esas proteínas quiméricas serán producidas más eficientemente que .usando los sistemas existentes para producir proteínas idiotípicas y serán inmunógenos excelentes para usarse en protocolos de inmunización . Esto significa que inducir una inmunoterapia activa puede evitar el fenómeno de escape mutacional observado con estrategias inmunes pasivas. Esa terapia tiene el potencial de generar una respuesta inmune más amplia y por lo tanto reconocer la población de células tumorales heterogéneas que puedan surgir con el tiempo. La dificultad con la inmunoterapia activa reside en convencer al sistema inmune del paciente de reaccionar contra un "antígeno propio" percibido expresado por el tumor. A diferencia de la proteína idiotípica encontrada enfermedades malignas relacionadas con las células B, muchos antígenos expresados por los tumores son inmunógenos débiles . Para diseñar la proteína idiotípica producida in vi tro para un paciente particular se requiere primero la identificación y aislamiento del gen que codifica para los antígenos únicos, entonces los medios para producir aquellos antígenos. Esto puede ser logrado en un número de formas diferentes disponibles a un experto en la técnica. Por ejemplo, un método recientemente desarrollado que se adaptó a las necesidades de la presente invención usa un sistema de expresión de baculovirus/células de insecto novedoso y fue recientemente desarrollado para la producción eficiente de anticuerpos funcionales para inmunoterapia (véase, por ejemplo, la Solicitud PCT No. PCT/US01/25203, titulada "Método y Composición para Alterar una Patología Mediada por Células T" publicada como WO 02/13861 en Febrero 21, 2002, la cual se incorpora por lo tanto aquí como referencia en su totalidad incluyendo cualesquier dibujos, figuras y tablas) . En la invención descrita en la WO 02/13861 y la WO 02/13862, esas proteínas quiméricas son producidas en células de insecto usando un vector de baculovirus . El sistema de expresión de baculovirus/célula de insecto empleado ha probado ser efectivo como lo muestra la producción eficiente de anticuerpos funcionales y proteínas Id para inmunoterapia en numerosos pacientes . La expresión de proteínas recombinantes usando el sistema de baculovirus permite la producción de grandes cantidades de proteínas biológicamente activas sin muchas de las desventajas asociadas con proteínas producidas en bacterias, y también evita las complicaciones de usar células de mamífero. Por ejemplo, los genes de inmunoglobulina de la línea celular humana estable 9F12 (ATCC#HB8177) , la cual produce un anticuerpo IgG??/? humano específico para el toxoide tetánico, fueron clonados en un vector de transferencia de expresión de promotor doble de baculovirus . La inmunoglobulina IgG??/? intacta fue producida en células de insecto que se comportan de manera similar al anticuerpo de mamífero en el análisis con SDS-PAGE y electroinmunotransferencias Western. El anticuerpo producido por células de insecto estuvo glicosilado. Se determinó que las afinidades de unión del Acm9F12 purificado y el anticuerpo expresado en baculovirus purificado eran idénticas y se determinó que los niveles de producción eran aproximadamente de 5-10 µg/ml. De este modo, el sistema de expresión de baculovirus es una alternativa excelente a la producción de anticuerpos en células de E. coli y de mamífero. La producción de alto rendimiento (1-100 mg/L) de proteínas biológicamente activas en células eucarióticas es posible usando el sistema de baculovirus (Haseman et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. 87: 3942-46, 1990). El sistema de baculovirus/células de insecto evita los problemas de solubilidad con' frecuencia encontrados cuando son sobreexpresadas proteínas recombinantes en - procariotes . Además, las células de insecto contienen la maquinaria de modificación postraslacional responsable del pliegue correcto, formación de disulfuro, glicosilación, ß-hidroxilación, acilación de ácidos grasos, fenilación, fosforilación y amidación de células eucarióticas, pero no presente en procariotes . La producción de un anticuerpo monoclonal glicosilado, funcional, que reconoce células de carcinoma colorrectal humano de un sistema de expresión de baculovirus ha sido demostrado (Nesbit, J. et al . , I munol . Methods, 151: 201-208, 1992) . Este anticuerpo producido en baculovirus mostró mediar la ADCC; en contraste, los anticuerpos producidos en bacterias no están glicosilados y en consecuencia no tienen actividad de ADCC detectable. Sin embargo, la glicosilación producida por la producción de proteína recombinante de células de insecto no es idéntica a la ligada cuando son producidas proteínas recombinantes en células de mamífero. (Véase, por ejemplo, Altmann et al . , Glycoconjugate J 16: 109-123 (1999)).

Métodos Producción de Proteínas Variables de Id Autólogas Se administró una composición que contiene al menos una proteína quimérica que tiene al menos una porción de una región VH o VL de una región variable de inmunoglobulina derivada de un paciente y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina. La región VH o VL usada en esta composición está asociada con una inmunoglobulina particular producida por una célula B de un paciente que tiene una patología mediada por células B. La composición puede contener dos proteínas quiméricas diferentes. Cada proteína quimérica tiene al menos una porción de una región VH y/ VL de una cadena de inmunoglobulina derivada de un paciente ligada a al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina. Las regiones VH y/o VL que son parte de la proteína quimérica están asociadas con cadenas de inmunoglobulina particulares de una célula B del paciente que tiene una patología mediada por células B. De este modo, - pueden ser desarrolladas cadenas de inmunoglobulina específicas que contengan cadenas de VH y/o VL únicas derivadas del paciente como composiciones terapéuticas. La proteína Id administrada al paciente también puede ser toda la VHCH mas VLCL como la derivada del paciente, o cualquier porción de la misma. La región constante de inmunoglobulina usada en las composiciones anteriores y la proteína quimérica pueden ser de cadenas ligeras K o ? y de cadenas pesadas de IgGx, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, IgA2, IgM, IgD, IgE o porciones de las mismas. En algunas de las modalidades, la proteína quimérica únicamente contiene la región VH y/o VL de una región de inmunoglobulina con una región constante de inmunoglobulina. Los ejemplos de proteínas quiméricas incluyen VH-IgG??, VL-? y VL-?. En otra modalidad, la composición contiene dos proteínas quiméricas que contienen cada una respectivamente una región VH y VL con una región constante de inmunoglobulina. Los ejemplos incluyen VH-IgG?l y VL-?, y VH-IgG?l y VL-?. Una proteína quimérica puede ser producida usando la tecnología del ADN recombinante y un sistema de expresión. Este método incluye los siguientes pasos: (a) aislar los genes que codifican para la región VH o VL de una cadena de inmunoglobulina de células B de un paciente que tiene una patología mediada por células B, (b) insertar el gen aislado que codifica para la región VH o VL de una cadena de inmunoglobulina y el gen que codifica para una región constante de inmunoglobulina en un vector de expresión para permitir la expresión de una proteína quimérica, (c) producir la proteína quimérica introduciendo el vector de expresión en células y permitir su expresión, y (d) aislar la proteína quimérica. El método para producir proteínas quiméricas incluye además un paso de insertar un gen que codifique para la región VH y/o VL de una cadena de inmunoglobulina y un gen que codifique para una segunda región constante de inmunoglobulina en el vector de expresión para permitir la expresión de la segunda proteína quimérica. La primera de las proteínas quiméricas puede comprender toda la región VH y una región constante humana de una inmunoglobulina IgG?l (VH-IgG?l) , y la segunda proteína quimérica puede comprender toda la VL y una región constante K o ? humana (VL-CK VL-C?) . Cualquiera o ambas de las proteínas quiméricas pueden comprender al menos una porción de una región VH y/o VL de una cadena de inmunoglobulina, más una región enlazante y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina. La composición puede comprender una sola proteína quimérica que contenga una región VH y/o VL de una cadena de inmunoglobulina particular de una célula B de un paciente y una región constante de inmunoglobulina. Los ejemplos incluyen proteínas quiméricas VH-IgG??, VL-?, VL-?, VL-IgG??, VH- , y VH-?. El vector de expresión usado para expresar las proteínas quiméricas puede ser un vector de expresión de baculovirus . Las proteínas quiméricas pueden ser expresadas en células de insecto. El vector de expresión usado para expresar la proteína quimérica puede ser un vector de expresión de levadura. Las proteínas quiméricas pueden ser expresadas en células de levadura. El vector de expresión usado para expresar las proteínas quiméricas puede ser un vector de expresión de célula de mamífero . Las proteínas quiméricas pueden ser expresadas en células de mamífero. El vector de expresión usado para expresar las proteínas quiméricas también puede ser un vector de expresión bacteriano. Las proteínas quiméricas pueden ser expresadas en células bacterianas. Un vector para usarse en los métodos de la invención preferiblemente contiene dos casetes de expresión cada uno de los cuales tiene un promotor, una secuencia señal secretora y una proteína quimérica. En una modalidad, el cásete de expresión puede contener el promotor plO del baculovirus AcNPV ligado a la secuencia señal secretora de melitina de abeja melífera. El otro cásete de expresión puede tener el promotor de poliedrina ligado a una secuencia señal secretora de fosfatasa alcalina de placenta humana. También pueden ser usados otros promotores y secuencia señal . En algunas modalidades, la secuencia señal son secuencias señal endógenas asociadas con los genes de VH y VL aislados de pacientes, y otras secuencias señal implicadas en la producción de anticuerpos. La modalidad de expresión de baculovirus, los genes que codifican para las porciones VH o VL de las cadenas de inmunoglobulina, y los genes que codifican para la región constante de inmunoglobulina son insertados, separados y/o juntos en el cásete de expresión anterior del vector de baculovirus permitiendo la expresión de una o dos proteínas quiméricas. En una modalidad preferida, la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, como la IgG?i, con cualquiera de las regiones VH o VL, es controlada por el promotor de poliedrina. El promotor de poliedrina puede ser ligado operativamente a cualquiera del promotor de melitina de abeja melífera o al promotor de fosfatasa alcalina humana, como lo puede ser el promotor plO.

Las proteínas quiméricas producidas son purificadas usando columnas de afinidad con anticuerpos anti-inmunoglobulina o proteínas de unión de Ig, como la proteína A para la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina, y proteína L para las cadenas ligeras K y/o cualesquier otras proteínas que se unan a un dominio de unión de inmunoglobulina. Las proteínas quiméricas pueden ser acopladas covalentemente a una proteína portadora como la hemocianina de cangrejo bayoneta (KLH) . La composición también puede ser administrada a un paciente junto con una citocina como la CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , o una quimocina como una proteína quimotáctica monocítica 3 (MCP 3) . Debido a que las proteínas quiméricas de la presente están relacionadas específicamente con una inmunoglobulina particular de células B de un paciente que tiene una patología mediada por células B, la administración de esta composición induce una respuesta inmune contra el idiotipo específico de la enfermedad en la cual están implicados segmentos de VH o VL particulares. Las rutas de administración para la composición inventada incluyen, pero no se limitan a la liberación oral, liberación por inhalación, liberación por .inyección, liberación transdérmica y similares . Esta técnica toma ventaja de los antígenos de la superficie celular únicos presentes sobre la superficie de las células B implicadas en patologías relacionadas con las células B, y son preparados en una forma específica del paciente . Esas proteínas Id autólogas proporcionan una selectividad exquisita para dirigir el sistema inmune de un paciente a marcadores únicos asociados con células B patógenas encontradas en un paciente dado.

Expresión de Baculovirus de Proteínas Recombinantes Como se discutió supra, la expresión de proteínas recombinantes usando el sistema de baculovirus ha emergido como una elección excelente para la producción de alto rendimiento (1-100 mg/L) de proteínas biológicamente activas en células eucarióticas. Nesbit y sus colaboradores demostraron la producción de un anticuerpo monoclonal glicosilado, funcional, a partir de un sistema de expresión de baculovirus (Nesbit, J. , et al . , Immunol . Methods 151: 201-208,1992). Adicionalmente, también ha sido demostrada la expresión de IgA recombinante en células de baculovirus, y esta IgA fue correctamente montada en heterodímeros de cadena pesada/cadena ligera, N-glicosilada y secretada (Carayannopoulos et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. 91: 8348-52, 1994, Publicación PCT No. WO 98/30577, Patente Estadounidense No. 6,063,905) . El sistema de expresión de baculovirus/células de insecto ha probado ser efectivo para la producción eficiente de anticuerpos funcionales y proteínas Id para la inmunoterapia de cualquier paciente dado. Un vector de expresión de baculovirus como se describe en la WO 02/13862 fue diseñado de modo que únicamente sean necesarios dos cebadores específicos del gen de costumbre para amplificar cualquier par de regiones variables de anticuerpo para la subclonación y expresión fácil como proteínas quiméricas sobre la base de la cadena ligera K humana y la cadena pesada de IgG?i . La incorporación de secuencias señal secretoras heterólogas, las cuales dirigen las cadenas pesada y ligera a la vía secretora de células de insecto, se incorporaron para la expresión de grandes cantidades de inmunoglobulina activa. Este vector es útil para la expresión de cualquier región variable de cadena ligera K (VL) en el marco con la región constante K humana secretada vía la secuencia señal secretora de fosfatasa alcalina de placenta humana; y cualquier región variable de cadena pesada (VH) en cuadro con el dominio constante de IgG?l humana conducida por la secuencia señal secretora de melitina de abeja melífera. La región constante de la cadena ligera ? puede reemplazar a la región constante K. La proteína quimérica es entonces expresada con la región VL en el marco con la región constante ? humana y secretada vía la secuencia señal secretora de fosfatasa alcalina de placenta humana, junto con cualquier región variable de cadena pesada (VH) en marco con el dominio constante de IgG?? humana, conducida por la secuencia señal secretora de melitina de abeja melífera. Cualquier anticuerpo monoclonal, de ratón o humano, ya sea de una línea celular o monoclonal o identificado por clonación de presentación de fagos, podría ser fácilmente expresado como IgG??/? o IgG??/? humana completa en este vector después de dos pasos simples de subclonación. Adicionalmente, podrían ser usados diferentes tipos de inmunoglobulina, incluyendo cadenas pesadas de IgG?2/ IgG?3, IgG? , IgA, IgA, IgAx, IgA2, IgM, IgD, igE o fragmentos de las mismas, en lugar de la región constante de IgG?? . Además, aquella secuencia señal descrita supra , la presente invención puede usar otras secuencias señal secretoras como las secuencias secretoras endógenas asociadas con los genes de la inmunoglobulina derivados de un paciente dado. Adicionalmente, el experto en la técnica podría seleccionar varios cebadores que podrían ser usados equivalentemente en este sistema para producir resultados equivalentes para amplificar cualquier par de las regiones variables del anticuerpo para facilitar la subclonación. En algunos casos, la utilización del sistema de baculovirus para la expresión de proteínas biológicamente activas ha sido impedida por la incapacidad de solubilizar de manera eficiente proteínas recombinantes sin degradación proteolítica excesiva. Para evitar los problemas de solubilidad y proteólisis encontrados con la expresión de proteínas recombinantes en células de insecto, han sido desarrollados vectores de transferencia de baculovirus para la secreción eficiente de proteínas biológicamente activas. Esos vectores que facilitan la secreción de proteínas recombinantes de células de insecto anfitrionas son construidos insertando secuencias líder secretoras funcionales corriente abajo del promotor de poliedrina, el promotor plO, u otros promotores. La inserción en cuadro de secuencias de ADNc dio como resultado la síntesis de proteínas que contienen una secuencia señal heteróloga la cual dirigió la proteína recombinante a la vía secretora. Pueden ser probadas otras secuencias líder de humano e insecto para maximizar la secreción de proteínas heterólogas de células de insecto. Para ejemplos de secuencias líder, véase la publicación de la WO 02/13862 de Gold and Shopes. Adicionalmente, pueden ser diseñados vectores de baculovirus para expresar grandes cantidades de la proteína de interés en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf9) (Jasny, Science 238: 1653, 1987; Miller et al . , en: Genetic Engineering, Vol. 8, Plenum, Setlow et al . , eds., pp. 277-297,1986). Los vectores que pueden ser usados incluyen las series del pAc (Smith et al . (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie del pVL (Lucklo and Summers (1989) Virology 170: 31-39).

Otros Sistemas de Expresión para Proteínas Recombinantes Las proteínas, fragmentos de proteína y análogos también pueden ser sintetizados, en su totalidad o en parte, por métodos recombinantes usando vectores de expresión que codifiquen para toda o parte de una proteína.

Anfitriones procarióticos Los anfitriones procarióticos son, en general muy eficientes y convenientes para la producción de polipéptido recombinantes y son, por lo tanto, un tipo de sistema de expresión preferido. Los procariotes muy frecuentemente son representados por varias cepas de E. coli , pero pueden ser usadas otras cepas microbianas, incluyendo otras cepas bacterianas . Las anfitrionas procarióticas reconocidas incluyen bacterias como E. coli , Bacillus, Streptomyces , Pseudomonas, Salmonella, Serratia, y similares. La modificación genética de anfitrionas procarióticas es posible dado que esas anfitrionas glicosilarán proteínas (Véase, por ejemplo Wacker et al . , N-linked . glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli" Science (2002) 298 (5599) : 1790-93) . En sistemas procarióticos, pueden ser usados vectores que contengan sitios de replicación y secuencias de control derivadas de una especie compatible con la anfitriona. Los vectores procarióticos preferidos incluyen plásmidos como aquellos capaces de replicarse en. E. coli (como, por ejemplo, pBR322, ColEl, pSClOl, pACYC 184, VX, pUC118, pUC119 y similares) . Los vectores de fago o bacteriófago adecuados pueden incluir al ?gtlO, ?gtll, vectores derivados de bacteriófago filamentoso como el ml3 , y similares . Los plásmidos de Streptomyces adecuados incluyen al pIJIOl, y bacteriófagos de Streptomyces como el phi . C31. Los plásmidos de Bacillus incluyen pC194, pC221, pT127, y similares. Los plásmidos de Pseudomonas adecuados han sido revisados por Izaki (Jpn. J. Bacteriol . 33: 729-742, 1978) y John, et al . , (Rev. Infect . Dis. 8: 693-704, 1986). Para expresar una proteína (o un derivado funcional de la misma) en una célula procariótica, es necesario ligar operativamente la secuencia que codifique para la proteasa de la invención a un promotor procariótico funcional. Esos promotores son promotores constitutivos o inducibles, pero generalmente son usados promotores inducibles. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen al promotor int del bacteriófago ?, el promotor bla de la secuencia del gen de ß-lactamasa del pBR322, y el promotor cat de la secuencia del gen de la cloranfenicol acetil transferasa del pPR325, y similares. Los ejemplos de promotores procarióticos inducibles incluyen los promotores derecho e izquierdo mayores del bacteriófago ?, el trp, recA, lacZ, lacl, y promotores gal de E. coli , la a-amilasa y promotores específicos de sigma-28 de B . subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, y promotores de Streptomyces . Los promotores procarióticos son revisados por Glick (Ind. Microbiot. 1: 277-282,1987), Cenatiempo (Biochimie 68: 505- 516, 1986), y Gottesman (Ann. Rev. Genet . 18: 415-442,1984). Adicionalmente, la expresión apropiada en una célula procariótica también requiere la presencia de un sitio de unión ribosomal corriente arriba de la secuencia que codifica para la secuencia del gen. Estos sitios de unión ribosomal son descritos, por ejemplo, por Gold, et al , (Ann. Rev. Microbiol. 35: 365-404, 1981).

Proteínas de Fusión Las proteínas pueden ser expresadas como proteínas de fusión. Los genes para las proteínas expresadas como proteínas de fusión ligadas a vectores de expresión que agregan un número de aminoácidos a una proteína codificada y expresada, usualmente al amino terminal de la proteína recombinante . Esa estrategia de producir proteínas de fusión usualmente es adoptada para tres propósitos: (1) ayudar a la purificación actuando como un ligando en la purificación por afinidad, (2) incrementar la solubilidad del producto, e (3) incrementar la expresión del producto. Con frecuencia, los vectores de expresión para usarse en la producción de 'proteína de fusión, se incluye un sitio de escisión proteolítica en la unión de la región de fusión y la proteína de interés para permitir la purificación de la proteína recombinante de la región de fusión después de la purificación por afinidad de la proteína de fusión. Esas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas incluyen al Factor Xa, trombina y enterocinasa, y también pueden incluir tripsina o quimotripsina. Los vectores de expresión por fusión típicos incluyen al pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S., Gene 67: 31-40, 1988), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.) los cuales se funden a la glutation S-transferasa (GST) , proteína de unión de maltosa E, o proteína, respectivamente, a la proteína recombinante blanco.

Rendimiento Mejorado La maximización de la expresión de la proteína recombinante en E. coli puede ser ayudada expresando la proteína o proteínas de fusión en una bacteria anfitriona con un sistema proteolítico mejorado para reducir la degradación posterior a la síntesis de la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. 119-128, 1990) . Otra estrategia es alterar la mezcla de codones usados en la secuencia codificadora para reflejar el uso de los codones individuales de cada aminoácido en el anfitrión, (por ejemplo, E. coli (Wada, et al . , Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118, 1992) . Esa alteración de las secuencias de ácido nucleico de la invención puede ser llevada a cabo por técnicas de síntesis de ADN estándar y puede probar ser útil para una variedad de sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos.

Anfitriones Eucarióticos Los anfitriones adecuados pueden incluir células eucarióticas, los anfitriones eucarióticos preferidos incluyen, por ejemplo, células de levadura, hongo e insecto, y células de mamífero tanto in vivo como en cultivo tisular. Las células de mamífero útiles anfitrionas incluyen células HeLa, células de origen fibroblástico como VERO o CHO-Kl, y células de origen linfoide y sus derivados, así como la línea celular de mieloma NSO. Las células anfitrionas de mamífero preferidas incluyen SP2/0 y J558L, así como líneas de células de neuroblastoma como la IMR 332, las cuales pueden proporcionar mejores capacidades para el procesamiento postralacional correcto. Otras líneas celulares preferidas pueden ser usadas para la expresión de genes recombinantes incluyen otras variantes de células CHO, células L de ratón, células BW5147, y variantes de las mismas. En general, los organismos eucarióticos como las levaduras proporcionan ventajas sustanciales dado que también pueden llevar a cabo modificaciones postraslacionales . Un gran número de los sistemas de expresión de levadura que. pueden ser utilizados potencialmente incorporan elementos promotores y de terminación de las secuencias expresadas activamente que codifican para enzimas glicolíticas . Esos sistemas de expresión producen grande cantidades de proteínas cuando las levaduras se hacen crecer en medios ricos en glucosa. Las secuencias genéticas glicolíticas conocidas también pueden proporcionar señales de control transcripcional muy eficientes. Existe un número de estrategias de ADN recombinante que utiliza secuencias promotoras fuertes y plásmidos con un alto número de copias que pueden ser utilizados para la producción de las proteínas deseadas en levadura. Los ejemplos de vectores adecuados para la expresión en S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari, et al . , (1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al . , (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.). Los vectores de expresión que incorporan los péptidos señal líder de MFa (factor a) han sido usados con frecuencia para la expresión de proteínas heterólogas en levadura; por ejemplo, véanse las Patentes Estadounidenses Nos. 5,162,498 y 4,546,082. En la patente 082, un gen de interés fue fusionado a la secuencia señal/líder de MFa de S. cerevisiae para proporcionar la secreción y procesamiento de la proteína de interés. Otro sistema de expresión de levadura es descrito en la Patente Estadounidense No. 6,183,989. Adicionalmente, puede ser usada Pichia pastoris para expresar proteínas heterólogas (Cregg, et al . , "Recombinant protein expression in Pichia pastoris" , Mol . Biotechnol. 16: 23 (2000)). Además, han sido desarrolladas técnicas novedosas para expresar proteínas en levadura con un patrón de glicosilación más similar al del humano (Hamilton, R., et al . , Science 301: 1244-46 (2003) ) . En otra modalidad, la proteína de interés puede ser expresada en células de insecto, por ejemplo larvas de Drosophila, pero también incluyendo los métodos discutidos supra . Usando células de insecto como anfitrionas, puede ser usado el promotor de alcohol deshidrogenasa de Drosophila (Rubín, Science 240: 1453-1459, 1988). También pueden ser usadas células Sf9 junto con vectores como los de la serie del pAc (Smith et al . , Mol. Cell Biol. 3: 2156-65 (1983)), o la serie del pVL (Lucklow et al . , Virology 170: 31-39 (1989) ) . También pueden ser utilizadas células de planta como anfitrionas, las secuencias de control compatibles con células de planta están disponibles, como los promotores 35S y 19S del virus del mosaico de la coliflor, y el promotor de nopalina sintasa y las secuencias señal de poliadenilación.

Además, la proteína de interés puede ser expresada en plantas que han incorporado el vector de expresión en su línea germinal .

Vectores de Expresión de Mamífero En otra modalidad más, un ácido nucleico de la invención puede ser expresado en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Las técnicas para la expresión en células de mamífero han sido recientemente resumidas (Colosimo, et al . , "Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells, "Biotechniques 29(2): 314-8, 320-2, 324 passim, 2000; la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad incluyendo cualesquier dibujos, tablas y figuras) . Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman et al . (1987) EMBO J.6: 187-193) . Para usarse en células de mamífero, las secuencias reguladoras del vector de expresión son con frecuencia derivadas de elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados son derivados por Virus de Simio 40 (SV40) , polioma, Adenovirus 2, y virus citomegalovirus (CMV). Los promotores eucarióticos preferidos incluyen, por ejemplo, el promotor de la secuencia del gen de la metalotioneina I de ratón (Hamer et al . , J. Mol. Appl . Gen. 1: 273-288, 1982); el promotor TK del virus del Herpes (McKnight, Cell 31: 355-365, 1982); el promotor inicial de SV40 (Benoist et al . , Nature (Londres) 290: 304-31,1981); y el promotor de la secuencia del gen gal4 de levadura (Johnston et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975, 1982; Silver et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5955, 1984). De manera alternativa, pueden ser empleados promotores de productos de expresión de mamífero, como la actina, colágeno, miosina, y similares. Los elementos reguladores también pueden ser derivados de adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus, virus de simio, o similares. Pueden ser seleccionadas señales reguladoras del inicio transcripcional que permiten la represión o activación, de modo que la expresión de las secuencias genéticas pueda ser modulada. De interés son las señales reguladoras que son sensibles a la temperatura, de modo que haciendo variar la temperatura, la expresión puede ser reprimida o iniciada, o son objeto de regulación química (como metabolitos) . La expresión de proteínas de interés en anfitriones eucarióticos requiere el uso de regiones reguladoras eucarióticas. Esas regiones en general, incluirán una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis de ARN. También puede diseñarse un vector de expresión de mamífero recombinante que sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferiblemente en un tipo de célula particular (es decir, que son usados elementos reguladores específicos del tejido para controlar la expresión) . Esos promotores específicos del tejido incluyen al promotor de alúmina específico del hígado (Pinkert et al . (1987) Genes Dev. 1: 268-277); promotores específicos linfoides (por ejemplo, Caíame and Eaton (1988) Adv. Immunol . 43: 235-275), y en particular promotores de inmunoglobulinas y receptores de células T ( (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733, Banerji et al . (1983) Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741-748); promotores específicos de la glándula mamaria (por ejemplo, promotor del suero de leche; Patente Estadounidense No. 4,873,316 y Publicación de Solicitud Europea No. 264,166); y promotores específicos del páncreas (Edlund et al . (1985) Science 230: 912-916) . También pueden ser utilizados promotores regulados de manera desarrollística, por ejemplo, el promotor de a-fetoproteína (Camper and Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546), y los promotores hox murinos (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) . Los plásmidos eucarióticos preferidos incluyen, por ejemplo, SV40, BPV, pMAM-neo, pKRC, vaccinia, círculo de 2-micrones, y similares, o sus derivados. Esos plásmidos son bien conocidos en la técnica (Botstein et al . , Miami Wntr. Symp. 19: 265-274, 1982; Broach, In: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces : Life Cycle and Inheritance, " Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p. 445-470, 1981; Broach, Cell 28: 203-204, 1982; Bollón et al . , J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39-48, 1980; Maniatis, In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, p . 563-608, 1980) . Una vez que el vector o la molécula de ácido nucleico que contiene los plásmidos recombinantes o constructos ha sido preparado para la expresión, los plásmidos recombinantes o constructos de ADN pueden ser introducidos en una célula anfitriona apropiada por cualquiera de una variedad de medios adecuados, és decir, transformación, transfección, conjugación, fusión protoplástica, electroporación, tecnología de cañón de partículas, transfección mediada con dextrano y DEAE, lipofección, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, y similares. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células anfitrionas pueden ser encontrados en Sambrook, et al . ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001) . Después de la introducción del vector, las células receptoras se hacen crecer en un medio selectivo, el cual selecciona el crecimiento de las células que contienen vector. La expresión de los genes clonados da como resultado la producción de una proteína de interés, o fragmentos de la misma.

Otros sistemas de expresión adecuados para células procarióticas y eucarióticas son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen mejor en manuales de laboratorio como Sambrook et al . , 2001 o Ausubel et al . ("Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, 1998) ambos de los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad, incluyendo cualesquier dibujos, figuras o tablas. Para la transformación de células eucarióticas, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usada, solo una pequeña fracción de células puede integrarse en el ADN ajeno en su genoma. Para identificar y seleccionar esos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células anfitrionas junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, como el G418, higromicina, neomicina, metotrexato, glifosato, y bialofos. El ácido nucleico que codifica para un marcador seleccionable puede ser introducido en una célula anfitriona en el mismo vector que codifica para la proteína de interés o puede ser introducido en un vector separado. Las células transformadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas por selección de fármacos (por ejemplo, células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán) . En otras modalidades, la secuencia genética de ADN usada para la expresión del producto recombinante puede ser ajustada por la preferencia del organismo anfitrión. Además, la preferencia de codón también puede ser ajustada por el tejido de origen de la célula anfitriona (véase, por ejemplo, Plotkin JB, et la., "Tissue-specific codon usage and the expression of human genes," Proc Nati Acad Sci U S . 2004 Ago 24; 101 (34) : 12588-91) . Puede ser usada una célula anfitriona de la invención, como una célula anfitriona procariótica o eucariótica en cultivo, para producir (o expresar) la proteína de interés. En consecuencia, la invención proporciona además métodos para producir la proteína de interés usando las células anfitrionas de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar la célula anfitriona en la cual ha sido introducido un vector de expresión recombinante que codifica para la proteína de interés en un medio adecuado, de modo que la proteína de interés sea producida, y pueda ser purificada por un experto en la técnica. Los vectores, o preferiblemente los vectores de expresión pueden contener un gen que codifique para un polipéptido de interés como una proteína idiotípica. Esos vectores pueden ser empleados para expresar el polipéptido codificado en cualquier célula procariótica o eucariótica.

Transcripción y Traducción in vitro También pueden ser sintetizadas proteínas, fragmentos de proteína y análogos usando el montaje recombinante de un vector de expresión seguido por la transcripción y la traducción in vi tro.

Vacuna de ADN Las células propias del paciente pueden producir proteínas y fragmentos de proteína cuando se les proporcione una vacuna de ADN. Puede ser construido un plásmido recombinante que codifique para el gen de interés y entonces usado como vacuna de ADN.

Tratamiento del Paciente Las composiciones usadas en la presente invención son preferiblemente estériles y contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una sustancia activa para producir la respuesta deseada en un peso o volumen adecuado para la administración a un paciente. Los factores dentro del conocimiento y experiencia de los practicantes en la salud para administrar la composición incluye: la condición particular que esté siendo tratada, la severidad de la condición, la edad del paciente, la condición física del -paciente, el peso del paciente, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay) , la ruta de administración y factores similares. Esos factores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden ser tratados con nada más que los ajustes de rutina. Generalmente, se prefiere que sea usada una dosis máxima de los componentes individuales o combinaciones de los mismos, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo al juicio médico. Deberá ser comprendido por aquellos expertos en la técnica, sin embargo, que un paciente puede insistir en una dosis más baja o dosis tolerable por razones médicas, razones fisiológicas o por otras razones. La respuesta del paciente puede ser medida por ensayos bien conocidos por un experto en la técnica. Esos ensayos pueden ser empleados para medir el nivel de respuesta. Otros protocolos para la administración de composiciones terapéuticas serán conocidos por el experto en la técnica, en las cuales la cantidad de la dosis, programa de inyección, sitios de inyección, modo de administración y similares variarán de los anteriores. La administración de las composiciones terapéuticas a mamíferos diferentes a los humanos, por ejemplo, para propósitos de prueba o propósitos terapéuticos veterinarios, se lleva a cabo bajo las mismas condiciones sustanciales descritas anteriormente .

EJEMPLOS Ejemplo 1; Tratamiento de un Paciente con NHL de células B con Recaída/Refractario de Terapias de Linfoma Anteriores Usando un Agente Citorreductor de Unión Específica y Proteína Id Autóloga Estudio Racional El Rituxan® está aprobado para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin de células B, CD20 positivo de bajo grado o folicular con recaída o refractario (véase, por ejemplo, McLaughlin P, et al . , " Rituximab chimeric anti- CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma: half of patients respond to a four-dose treatment progra ," J Clin Oncol. (1998) 16 (8): 2825-33). Su uso en - conjunto con inmunizaciones de Id-KLH más GM-CSF fue estudiado como se expone más adelante. En sistemas de modelo de ratón, existen evidencias de que para inmunizaciones que inducen fuertes respuestas de células T, como Id-KLH más GM- CSF, que agotan las células B podrían realmente incrementar la respuesta de las células T al inmunógeno. (Qin Z, et al . , "B cells inhibit induction of T cell-dependent tumor immunity," Nature Med. 4(5): 627-30 (1998); Monach PA, et al . , "CD4+ and B lymphocytes in transplant immunity. II.

Augmented rejection of tumor allografts by mice lacking B cells," Transplantation 55(6): 1356-61 (1993); Epstein MM, et al . , "Successful T-cell priming in B-cell deficient mice," J. Exp. Med. 182 (4): 915-22 (1995)). El NCI está actualmente conduciendo un ensayo en fase 2 de inmunoterapia con Id-KLH más GM-CSF después de la quimioterapia y Rituxan® en pacientes con linfoma de células extendidas. Ellos están evaluando el efecto del Rituxan® sobre la capacidad de los pacientes para montar una respuesta de células T a su inmunógeno idiotípico. Además, recientemente se condujeron estudios preclínicos en un modelo murino de linfoma de células T en Favrille, Inc., utilizando ratones genéticamente deficientes en células B. En esos estudios, los animales que fueron tratados demuestran una respuesta protectora mejorada a Id-KLH en combinación con GM-CSF. En esos estudios, los ratones inmunizados desarrollaron significativamente menos tumores en comparación con los controles tratados con KLH/GM-CSF. A la luz de esas observaciones, el siguiente estudio evaluó la combinación de la inmunización activa de Favld con Rituxan®. Los pacientes en este ensayo que tenían linfoma folicular grado 1 ó 2 con recaída o refractarios después de la quimioterapia o que habían recaído después del Rituxan®, fueron elegibles para recibir Rituxan® más FavIdMR y GM-CSF. Este protocolo fue para evaluar la capacidad de los pacientes tratados con Rituxan® más Favid™1 y GM-CSF para montar una respuesta inmune (humoral y/o celular) al KLH y su idiotipo. Adicionalmente se evaluó el porcentaje de respuesta objetivo, duración media de la respuesta y punto medio para el progreso producido por Favid y GM-CSF en combinación con Rituxan® . Diseño de Estudio (1) General Este fue un estudio de Fase II de una sola rama, de marca o etiqueta abierta diseñado para evaluar si los pacientes tratados con Rituxan® pueden montar una respuesta inmunológica a Favid"11 más GM-CSF después del tratamiento con rituximab . Todos los pacientes tuvieron una biopsia de nodo linfático para obtener tejido para la clasificación morfológica, caracterización inmunofenotípica y para proporcionar material para la generación de Favid"11. Únicamente los pacientes con linfoma folicular grado 1 o 2 cuyas biopsias se encontró que se expresaban inmunoglobulinas de superficie monoclonal (indicativas de que había sido aislado un tumor) fueron aceptados como candidatos de estudio . Las suspensiones celulares de biopsia remanentes fueron almacenadas en nitrógeno líquido para propósitos de archivo . Algo de material , sin embargo fue usado para estudios de respuesta inmunológica in vi tro para detectar la presencia de anticuerpos específicos del tumor en sueros de pacientes tratados o de linfocitos T reactivos al tumor de sangre periférica de pacientes tratados. Además, puede ser preparado ADN de muestras de tej idos restantes para establecer la presencia de una traslocación t(14;18) en la preparación del tumor. Si es identificada esa traslocación, pueden efectuarse evaluaciones posteriores en la ocurrencia de esta traslocación en linfocitos de sangre periférica. Si transcurren más de 18 meses entre la biopsia y la administración de la terapia, o si un paciente esta progresando después de una respuesta inicial, puede ser obtenida una segunda biopsia, biopsia central, o aspirado con aguja fina para confirmar las características moleculares del producto terapéutico o para determinar la similitud genética con el tumor inicial en el paciente con progreso del tumor. Para entrar, los pacientes deben tener al menos una lesión bidimensionalmente medible remanente que mida al menos 2 cm en cada dimensión. Se obtuvieron exploraciones CT de todos los nodos linfáticos en la línea basal (tan cerca de la administración de Rituxan® como es posible pero dentro de un mes en cada caso) . Se obtuvieron exploraciones repetidas CT cada 3 meses posteriormente. Se obtuvo un segundo original y se sometió a Favrille para una revisión central . Los pacientes elegibles recibieron 4 infusiones semanales del Rituxan® a una dosis de 375 mg/m2 seguidas aproximadamente 8 semanas después por 6 tratamientos subcutáneos mensuales de Favid"11 /GM-CSF. Los pacientes con una respuesta objetiva (CR o PR) o carente de enfermedad progresiva pudieron continuar recibiendo tratamientos con Favldm /GM-CSF cada mes durante 6 tratamientos y entonces cada 3 meses siempre que no hubiera evidencia del progreso de la enfermedad. Todos los pacientes fueron verificados estrechamente por toxicidad a través del estudio. Los pacientes tuvieron verificaciones en serie de la respuesta inmune (respuestas humoral y de células T) . Se evalúo el anticuerpo anti-idiotípico anti-KLH en suero de muestras obtenidas en la línea basal (antes del Rituxan®) y antes de cada tratamiento con Favid"11 y a las 4 semanas después del último tratamiento con Favid"11. También se midió la proliferación de PBMC específica del idiotipo y especifica del KLH de muestras obtenidas de una línea basal (antes del Rituxan®) y antes de cada tratamiento con Favid"11 y 4 semanas después de completar la terapia con Favid"11.

Administración del Fármaco (1) Rituxan® El Rituxan® fue proporcionado por cada sitio de estudio y fue administrado como una infusión intravenosa de acuerdo al inserto del paquete una vez a la semana durante 4 semanas. Se usaron los detalles de prescripción proporcionados por el fabricante , (2) Favid™ y GM-CSF El FavIdMR y GM-CSF fueron suministrados por Favrille, Inc. y comenzaron aproximadamente 8 semanas después de completar el Rituxan® (tan pronto como lo permitió la conclusión de la producción de FavId"R) . El FavIdMR fue producido en parte a los métodos expuestos en la Solicitud PCT No. PCT/US01/25204, titulada "Método y Composición para Alterar una Patología Mediada por Células B" publicada en Febrero 21, 2002 como WO 02/13862. El Favid"11, 1 mg (0.5 mg de proteína Id de tumor conjugada con 0.5 mg de proteína de soporte de KLH) y 250 mcg de GM-CSF soluble se seleccionaron sobre la base de la experiencia clínica anterior con programas y dosis de tratamiento similares. (Véase por ejemplo, Hsu FJ, et al., "Tumor-specific idiotype vaccines in the treatment of patients with B-cell lymphoma—long-term results of a clinical trial," Blood 89 (9) ¡3129-35 (1997); Bendandi M, et al., "Complete molecular remissions induced by patient-specific vaccination plus granulocyte-monocyte colony-stimulating factor against lymphoma, "Nat . Med 5(10):1171-7 (1999); M. et al., "idiotype vaccination in human myeloma: generation of tumor-specific immune responses after high-dose chemotherapy, "Blood 94(2): 673-83 (1999)). Los pacientes recibieron una inyección subcutánea de Favid"11 con GM-CSF (dividida en dos sitios de inyección) una vez al mes durante 6 meses. Se administró una dosis plana de 250 mcg de GM-CSF únicamente por inyección subcutánea durante 3 días después de cada inyección de Favid"11. Todas las inyecciones de GM-CSF fueron también divididas (125 mcg por sitio de inyección) y se dieron muy cerca de los sitios de inyección de Favid"11. , tan cerca de los sitios exactos de la inyección de FavId"R del día 1 como fue posible. Los sitios de inyección se rotaron entre las extremidades superior e inferior cada mes. La administración de GM-CSF sola no necesariamente se efectúo en el sitio de investigación principal sino que en algunos casos pudo haber sido administrada por el propio paciente o su designado después de una instrucción apropiada. Se verificó la posible toxicidad de GM-CSF, y el GM-CSF puede ser ajustado cuando fue apropiado. Los pacientes fueron observados por eventos adversos durante 1 hora después de la administración de Favid"11 y de GM-CSF del día 1 de cada curso de terapia. (3) Exposición de los Procedimientos de Estudio/ Programa de Evaluaciones Los pacientes fueron tratados de acuerdo al programa expuesto a continuación. Después de completar 4 tratamientos semanales con Rituxan®, los pacientes recibieron inyecciones subcutáneas de Favid"11 más GM-CSF durante el curso de 6 meses a menos que se documentara una toxicidad no manejable o un progreso clínicamente significativo de la enfermedad que requiere de intervención con otra terapia anti cáncer. Los pacientes que recibieron una respuesta objetiva (CR o PR) o carentes de enfermedad progresiva (PD) pudieron continuar recibiendo tratamientos con Favid"11/GM-CSF cada mes durante 6 tratamientos y entonces cada 3 meses siempre que no hubiera evidencia de progreso de la enfermedad. La evaluación de la respuesta del tumor se obtuvo por exploración CT a intervalos de tres meses posteriormente. Se hicieron evaluaciones de seguridad de todos los pacientes al menos mensualmente durante el tratamiento de estudio en intervalos de 3 meses posteriormente mientras están en tratamiento .

Población de Estudio (1) Criterios de Inclusión Los pacientes fueron de al menos 18 años de edad. Loa pacientes habían recaído o fueron refractarios después de la quimioterapia o recayeron después del tratamiento con Rituxan®. (Nota: el Rituxan® pudo haberse dado como una terapia de segunda línea después de la respuesta inicial a la quimioterapia o en combinación con quimioterapia para la terapia inicial de su enfermedad) . Los pacientes en el estudio tuvieron un tumor accesible para biopsia o material de una biopsia reciente previa; los pacientes también tuvieron al menos una lesión bidimensional adicional que medía al menos 2 cm en cada dimensión. Ellos padecían de linfoma de células B folicular grado 1 ó 2 confirmado histológicamente (clasificación de la WHO) , con un estado de desempeño (ECOG) de 0 , 1 ó 2 ; conteo absoluto de granulocitos mayor que o igual a 1,000/mm3 (pacientes con más de 5,000 linfocitos fueron excluidos); plaquetas más de 100,000/mm3,-bilirrubina total menor de o igual a 22 mg/dL; AST y ALT menor o igual a 2X por encima de un límite normal, y creatinina menor de o igual a 1.5 mg/dL. Los pacientes fueron excluidos del estudio si (1) fueron refractarios al Rituxan® o quimioterapia o quimioterapia más Rituxan®; (2) no tenían más de dos regímenes de tratamiento previo (por ejemplo, CHOP más Rituxan® en un régimen de tratamiento; CHOP seguido por Rituxan® a recaídas iniciales igual a dos regímenes de tratamiento; (3) antes de fludarabina menos de un año antes del inicio del tratamiento con FavIdMR; (4) pacientes con más de 5,000 linfocitos; (5) habían tenido inmunoterapia idiotípica específica para el tumor anterior; (6) estaban siendo sometidos a terapia inmunosupresora concurrente (esteroides en altas dosis, etc.); (7) tenían una esplenoctomía previa; (8) tenían una historia conocida de linfoma del SNC o linfomatosis meníngea; (9) eran VIH positivos; (10) tenían una enfermedad no maligna seria (por ejemplo, trastornos psiquiátricos, función pulmonar comprometida (por ejemplo asma activa, COPD, neumonitis, bronquiolitis obliterans) insuficiencia cardiaca congestiva, o infecciones bacterianas, virales o micóticas incontrolables u otras condiciones que, en la opinión del investigador pudieran comprometer los objetivos del protocolo; (11) enfermedad maligna previa (excluyendo no melanomas, carcinomas de la piel y carcinomas cervicales in si tu) a menos a revisión de más o igual a 2 años; (12) tratamiento con un fármaco de investigación dentro de 30 días antes de entrar al estudio; o (13) mujeres embarazadas o lactantes (se avisó a las mujeres con potencial de embarazarse que evitaran embarazarse mientras recibían el tratamiento de estudio) .

Enrolamiento de los Pacientes Los pacientes que estaban listos para enrolarse en el estudio fueron evaluados por su eligibilidad por el investigador. Los pacientes que reunieron los criterios de elegibilidad fueron enrolados antes de una biopsia y se les asignó un número de estudio. Consideraciones Eticas y Reguladoras El estudio fue conducido de acuerdo a las Buenas Prácticas Clínicas, la Declaración de Helsinki y US 21 CFR parte 50 - Protección se Sujetos Humanos, y parte 56 -Agencia Revisora Institucional. Se obtuvo en consentimiento por escrito, informado y fechado, de todos los pacientes antes de llevar a cabo los procedimientos especificados en el protocolo. Después de firmar, a cada paciente se le dio una copia de su consentimiento informado. La aprobación de este estudio fue obtenida de una Agencia Revisora Institucional antes de enrolar a los pacientes en el estudio. Las formas de consentimiento estuvieron en un lenguaje completamente comprensible por el paciente prospecto. El consentimiento fue documentado por la firma fechada del paciente por la firma de un testigo independiente que registró el consentimiento del paciente . Cada forma de consentimiento informado o firmado por el paciente se conservó en un archivo en la Oficina de Investigación Clínica donde los pacientes individuales fueron observados .

Evaluación de la Respuesta (1) Evaluación de la Respuesta del Tumor Para que los pacientes fueran enrolados, se documentó la evidencia de recaída o enfermedad refractaria (exploración CT, descripción del investigador del estado clínico de la enfermedad, etc) . Los pacientes fueron evaluados por exploración CT y examen físico en la línea basal cada tres meses posteriormente. Se solicitó una segunda exploración original para presentarla a Favrille para una revisión central . Todos los nodos linfáticos fueron evaluados en la línea basal y después cada 3 meses. La respuesta fue reportada usando mediciones de resultados estándar para ensayos clínicos (respuesta completa (CR) o respuesta completa/no confirmada (CRu) , respuesta parcial (PR) , enfermedad estable (SD) y enfermedad progresiva (PD) ) de acuerdo a lo definido por Cheson et al., (Cheson BD, et al., "Report of an International Workshop to Standardize Response Criteria for Non-Hodgkin' s Lymphomas," J. Clin Oncol 17(4): 1244 (1999)). Cualquier respuesta objetiva (CR, CRu, PR) requirió confirmación a un mínimo de 4 semanas posteriormente . (2) Evaluación de la Respuesta Inmune Se definió un paciente con una respuesta inmune como uno, en cuya respuesta inmune humoral y/o celular a Id-KLH fue demostrada en dos o más ocasiones . (3) Evaluación de la respuesta inmune humoral El suero para los niveles de anticuerpo específicos para el idiotipo y KLH se obtuvieron en la línea basal (antes del Rituxan®) y entonces nuevamente antes de cada dosis de Favid"11 y a las 4 semanas después del último tratamiento con FavId"R. Las muestras de suero fueron marcadas o etiquetadas y almacenadas congeladas hasta que fueron solicitadas por Favrille y entonces fueron probadas por su reactividad contra KLH o el idiotipo de vacunación específico por ELISA. (4) Evaluación de la respuesta inmune celular El recubrimiento amarillento de muestras de sangre heparinizadas se obtuvo en la línea basal (antes del Rituxan®) y entonces nuevamente después de cada dosis de Favid"11 y a las 4 semanas después del último tratamiento con Favid"11. Las muestras fueron marcadas y almacenadas en medios de congelamiento suministrados por Favrille. Las células fueron probadas por su capacidad para sintetizar citocinas o inferieron gamma después de estimulación con KLH o el idiotipo de vacunación específica.

Información del Fármaco El Rituxan® fue proporcionado por cada sitio de estudio y administrado por infusión intravenosa una vez a la semana durante 4 semanas a una dosis de 375 mg/m2 de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las toxicidades descritas en el Inserto del Paquete para el Rituxan incluyen: reacciones relacionadas con la infusión (fiebre, escalofríos/rigor, hipotensión, dispnea, broncoespasmo, angioedema, náuseas, vómito, urticaria, fatiga, cefalea, prurito, rinitis, dolor en los sitios enfermos) ; Síndrome de lisis del Tumor, anormalidades hematológicas (trombocitopenia, neutropenia, anemia) ; arritmia cardiaca; y reacciones de piel bulosas (incluyendo necrólisis epidérmica tóxica) . El FavIdMR (Id-KLH) fue producido a partir del gen idiotípico capturado de los linfomas de cada paciente. Este gen específico del paciente fue usado para generar la proteína idiotípica usando la tecnología recombinante. La proteína purificada resultante fue acoplada covalentemente a hemocianina (KLH) antes de la administración al paciente. El Favid"11 formulado (Id-KLH) para la administración subcutánea contiene 0.5 mg de Id y 0.5 mg de KLH por mi de solución salina normal; este se proporcionó en frascos de plástico de tapa roscada, y se almacenó antes de la administración a -20°C. El Favid"11 fue administrado junto con GM-CSF. El día de la inyección del FavIdMR se extrajo 250 mcg de GM-CSF en una jeringa tuberculina de plástico y se agregaron a un frasco descongelado de FavId"R. El frasco fue agitado suavemente, y el contenido del frasco extraído usando una aguja calibre 18. Después de que todo el contenido había sido retirado, la aguja de calibre 18 fue reemplazada por una aguja de calibre 25 para la inyección SQ. Este procedimiento es importante para asegurar que sean obtenidas todas las partículas del frasco. La dosis fue dividida igualmente entre dos extremidades superior e inferior (por ejemplo, brazo derecho y brazo izquierdo) . Los sitios de inyección deberán ser rotados entre las extremidades superior e inferior. (1) Efectos Laterales Esperados - Fayld1"1 Previamente ha sido administrado Id-KLH e Id-KLH con GM-CSF soluble a pacientes con linfoma no Hodgkin y mieloma múltiple (Hsu et al, 1997; Bendandi M, et al., 1999; Massaia, et al., 1999; Harris NL, et al., "World Health Organization Classification of Neoplastic Diseases of the Hematopoietic and Lymphoid Tissues : Report of the Clinical Advisory Committee Meeting-Airlie House, Virginia, November 1997," 17 (12): 3835-49 (1999)). Los efectos laterales fueron mínimos, el más frecuente de los cuales incluyó reacciones locales en el sitio de inyección. Los efectos adversos potenciales se listan a continuación: (1) reacciones de la piel locales en el sitio de inyección: eritema, sensibilización, endurecimiento, urticaria/salpullido, prurito; (2) Fiebre, mialgias/artralgias, escalofrío/rigor, nausea, fatiga, cefalea, trombocitopenia y otras citopenias, hiperglicemia, vómito, hipotensión; y (3) además puede existir el riesgo del desarrollo de enfermedades autoinmunes, aunque no existe evidencia de esto, ha sido observado en el estudio de Inmunoterapia Id. (2) GM-CSF (Sargra ostim; LEUKINE®) El GM-CSF usado en este estudio fue glicosilado, factor estimulante de la colonia de los granulocitos de macrófagos humanos (rhu GM-CSF) producidos por la tecnología del ADN recombinante en un sistema de expresión de levadura (S . cerevisiae) y fabricado por Inmunes Corporation. Como es proporcionado el LEUKINE® Líquido contiene 500 mcg/mL (2.8 x 106 IU/mL) de sargramostim y fue proporcionado por Favrille, Inc. El LEUKINE® líquido fue mantenido en refrigeración a 2- 8°C (36-46°F) , y ni congelado ni agitado. Los frascos fueron desechados después de 20 días. Se administró una dosis plana de 250 mcg de GM-CSF junto con FavIdMR dividida en dos sitios de inyección el día 1 de cada tratamiento. La dosis de GM-CSF sola (250 mcg) también fue dividida (125 mcg por sitio de inyección) e inyectada SQ los días 2-4, tan pronto como fue posible en los sitios bilaterales de inyección de Favld™1 al día 1. La - administración del GM-CSF solo no fue efectuada necesariamente en el sitio principal del investigador pero pudo hacer sido administrada por el propio paciente o su designado después de dar las instrucciones apropiadas . Las toxicidades descritas en los pacientes que reciben GM-CSF pueden incluir: fiebre, escalofrío, diaforesis, mialgias, fatiga, malestar, cefalea, mareos, dispnea, broncespasmo, efusión pleural, anorexia, - indigestión, nausea, vómito, diarrea, sensibilidad del sitio de inyección, urticaria, salpullido, prurito, reacción de hipersensitibilidad, dolor óseo, eventos tromboembólicos, plebitis, hipotensión, edema periférico, leucocitosis, trombocitosis, anormalidades de enzimas hepáticas y elevación de bilirrubina.

Seguridad Ocupacional No se esperaba que el FavId"R posea riesgo de seguridad ocupacional significativos para el personal de investigación bajo condiciones normales de uso y administración. Sin embargo, deberán tomarse precauciones para evitar el contacto directo con el medicamento de estudio. El Rituxan® y el Leukine® deberán ser manejados de acuerdo al inserto del paquete . Eventos Adversos (1) Evento Adverso Un evento adverso (AE) es cualquier ocurrencia médica indeseable en un paciente o paciente en investigación clínica al que se le administró un producto farmacéutico, sin importar la evaluación de causalidad. Un evento adverso puede por lo tanto ser cualquier signo desfavorable o no preferible (incluyendo un hallazgo de laboratorio anormal) , síntoma o enfermedad temporalmente asociada con el uso de un producto medicinal (de investigación) , que se considere o no esté relacionado con un producto medicinal (de investigación) . No se requiere un reporte adicional de eventos adversos nuevos después del inicio de cualquier quimioterapia posterior. (2) Eventos Adversos Serios Un evento adverso serio (SAE) es cualquier ocurrencia médica indeseable de que a cualquier dosis (incluyendo sobredosis) es fatal, amenazada la vida, requiere o prolonga la hospitalización, da como resultado una discapacidad permanente, es una anormalidad congénita, requiere intervención médica/quirúrgica, es un evento médicamente significativo. Todos los SAE deben ser reportados a Favrille, Inc. dentro de las 24 horas de su ocurrencia. Será proporciona un Formulario de Evento adverso Serio por Favrille y completado en el sitio de estudio. Entonces se generará un formulario de observación médica y, quedará pendiente para revisar el investigar principal, presentado con la FDA.

Conclusión y Retiro del Paciente (1) Indicación para Retirar Pacientes del estudio Los pacientes con evidencia clara de progreso de la enfermedad (nuevas lesiones; incremento de > 50% en SPD) al completar las 6 dosis de inmunoterapia fueron removidos del estudio. Nota: los pacientes con progreso durante la enfermedad completaron las 6 dosis de inmunoterapia debido al potencial de una respuesta inmune tardía siempre que el investigador sintiera que hubo el mejor interés del paciente. Todos los pacientes que experimentaron toxicidad de grado 3 ó 4 (excepto reacciones relacionadas con la velocidad de infusión o toxicidad dermatológica) secundaria al Rituxan® o una segunda toxicidad en el sitio de inyección local grado 3 del FavIdMR y GM-CSF después de una reducción en la dosis de GM-CSF fueron removidos del estudio. Los pacientes también fueron removidos del estudio si el tratamiento continuo no encontró el mejor interés en el paciente a juzgar por el investigador, o si el paciente solicitó ser retirado del estudio. Los pacientes fueron removidos del estudio si el paciente había completado todo el estudio de tratamiento y evaluación final . Nótese que los pacientes con la respuesta objetivo (CR, PR) o carentes de enfermedad progresiva (PD) después de un curso total de tratamiento (es decir, 4 dosis de Rituxan® y 6 dosis de Favid"11) continuaron recibiendo opcionalmente inmunoterapia con Favid"11 cada 2 meses durante 6 dosis y entonces cada 6 dosis y entonces cada 3 meses hasta que se documentó progreso de la enfermedad. (2) Conclusión del estudio El estudio se consideró concluido cuando se cumplió -el objetivo del entrenamiento y todos los pacientes completaron un curso completo de tratamiento de estudio (4 dosis de Rituxan® y 6 dosis de Favid"11) , más un periodo de seguimiento mínimo de 1 mes .

Evaluación de los Datos (3) Estadísticas y Tamaño de la Muestra Para este estudio de la fase II, como es normal, el tamaño de la muestra de pacientes no fue conducido estadísticamente. Un total de 20 evaluables entraron durante doce a dieciocho meses . (4) Definición de los Pacientes Evaluables Los pacientes fueron solo evaluados completamente por la respuesta objetivo después de recibir las cuatro dosis de Rituxan® y las seis dosis de Favid"11 para ser considerados. Todos los pacientes que recibieron al menos 2 dosis de Favid fueron evaluados por cualquier evidencia de respuesta inmune. Los pacientes fueron evaluados por respuestas objetivas a dos puntos en el tiempo: (1) a los tres meses después del inicio de la dosificación con Rituxan®, y (2) al final de los seis cursos de tratamiento con FavIdMR. Cualquier respuesta objetiva fue confirmada al menos cuatro semanas después. Pudo haberse considerado que un paciente teniendo una enfermedad progresiva en cualquier momento durante al terapia con Rituxan® o FavIdMR. Todos los pacientes que recibieron algún tratamiento de estudio fueron evaluados por su severidad y toxicidad. (5) Reporte de Resultados Se proporcionaron estadísticas descriptivas para la respuesta inmune, severidad y eficacia al concluir el estudio. Fueron y serán reportados los porcentajes de respuesta objetivos de CR, PR, SD, y PD para aquellos pacientes que se determinó eran evaluables . La seguridad fue y será reportada como el por ciento de pacientes que experimenten un evento adverso dado .

Ejemplo 2: Tratamiento de un Paciente con NHL de Células B sin Terapia Previa de Linfoma Usando un Agente Citorreductor de Unión Específica y Proteína Id Autóloga El FavIdMR es una proteína idiotípica (Id) de inmunogolublina recombinante de células B específica de un tumor que se compleja con KLH y se usa para inyección de una respuesta inmune en pacientes con NHL indolente.

Objetivo: Este estudio fue conducido para evaluar la capacidad del FavIdMR para incrementar o prolongar el porcentaje de respuesta objetiva después del rituximab en comparación con los datos histológicos para rituximab solo de Witzig et al. y para evaluar la capacidad de los pacientes tratados con FavIdMR después del rituximab para montar una respuesta inmune a KLH e idiotipo.

Elegibilidad: Los pacientes con NHL folicular grado 1 ó 2 que fueron candidos para el tratamiento.

Tratamiento; Como se describió supra en el Ejemplo 1, se dio Rituximab 375mg/m2 semanalmente durante 4 semanas. Dos meses después de la última dosis de rituximab, comenzó el tratamiento con FavId"R (1 mg) con el FavId"R administrado s. q. una vez al menos durante 6 meses. Se dieron 250 mcg de GM- CSF en el sitio de inyección de Favid"11 los días 1-4. Los pacientes con al menos SD después de 6 dosis de Favid"11 fueron elegibles para continuar recibiendo la vacuna durante otro mes durante 6 dosis y entonces cada 3 meses hasta el progreso de la enfermedad. Se enrolaron un total de 40 pacientes y recibieron tratamiento con rituximab y FavIdMR. El FavIdMR se produjo en parte de acuerdo a los métodos expuestos en la Solicitud PCT No. PCT/USOl/25204, ' titulada "Método y composición para Alterar una Patología Mediada por Células B" publicada en Febrero 21, 2002 como WO 02/13862.

Conclusión: El FavIdMR administrado en esta dosis y programa después del rituximab es extremadamente bien tolerado e incrementa el porcentaje de respuesta y prolonga el tiempo hasta el progreso después del rituximab como se observa en la Figura 2. Se inició un ensayo doblemente ciego, aleatorizado, de rituximab + Favid"11.

Ej e plo 3 ; Uso de Células Dendríticas como Parte de la Terapia de Combinación Las células dendríticas han mostrado jugar un papel crítico en el inicio de respuestas inmunes. Para tomar ventaja de esto, se retiraron varios grupos de células dendríticas buscando inmunizar a un paciente con antígenos de cáncer, de un paciente, impulsándose con un inmunógeno, y reinoculándose en el paciente. En realidad, un grupo ha sido referido como "adyuvantes naturales" ( (Thurner B, et al., "Vaccination with mage-3Al peptide-pulsed mature, monocyte-derived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma," J Exp Med. 190: 1669-1678 (1999)) (citado en Schuler G & RM Steinman, "Dendritic cells as adjuvants for immune- mediated resistance to tumors," J Exp Med., 186 (8): 1183-87 (1997) ) . Entre los cánceres estudiados se encuentran: linfomas de células B (Hsu, FJ, et al., Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. Nat Med. 2: 52-58 (1996), (Timmerman JM, et al . , "Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients, "Blood 99 (5): 1517-26 (2002)); melanoma (Nestle FO, et al., "Vaccination of melanoma patients with peptide-or tumor lysate-pulsed dendritic cells," Nat Med. 4: 328-332 (1998)), (Thurner B, et al., "Vaccination with mage-3Al peptide-pulsed mature, monocyte-derived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma," J Exp Med. 190: 1669-1678 (1999)); carcinoma de próstata (Murphy, et al., "Phase II prostate cáncer vaccine trial: report of a study involving 37 patients with disease recurrence following primary treatment," Prostate 39: 54-59 (1999)), (Murphy GP, et al., "Infusión of dendritic cells pulsed with HLA-A2 -specific prostate-specific membrane antigen peptides: a phase II prostate cáncer vaccine trial involving patients with hormone-refractory metastatic disease, "Prostate. 38: 73-78 (1999)); y carcinoma de células renales (Kugler A, et al., - "Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids," Nat Med. 6: 332-336 (2000)) y cánceres que expresan antígeno carcinoembriónico (Fong L, et al., "Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy, "Proc Nati Acad Sci U S A. 98: 8809-8814 (2001) ) . Como puede observarse, las células dendríticas - cargadas han sido usadas para estudios para tratar varios cánceres, pero ninguna ha tomado ventaja de la rápida clonación de una proteína idiotípica seguido por su expresión para seguir rápidamente la terapia como un agente citorreductor de unión específica. Las células dendríticas pueden ser aisladas y cargadas con proteínas Id por los métodos de Timmerman et al. Timmerman et al. aislaron células dendríticas de productos de la leucaféresis en una serie de pasos de centrifugación y un gradiente de densidad. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) son obtenidas por leucaféresis usando un aparato separador de células de COBE o técnicas similares .

Esta es seguida por sedimentación con Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suiza) . Los monocitos son entonces removidos por un gradiente de Percoll discontinuo (50%) (Pharmacia) . Esta fracción de alta densidad es cultivada durante la noche en RPMI 1640 más 10% de suero autólogo humano o 10% de suero AB en recipientes de teflón (Savillex, Minneapolis, MN) junto con antígeno a 2 µg/mL. Los linfocitos de alta densidad son removidos usando un gradiente de metrizamida al 15% (Sigma, St Louis, MO) . La fracción rica en células dendríticas, de baja densidad es recultivada durante la noche en proteína Id a una concentración incrementada de proteína Id (50 µg/mL) . Después de esta última incubación, las células dendríticas son cosechadas, lavadas, y resuspendidas en solución salina estéril para su reinfusión (Timmerman JM, et al., "Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients," Blood 99 (5): 1517-26 (2002)). Nótese que Timmerman basó sus concentraciones de inmunógeno en incubaciones nocturnas secuenciales basado en parte en la disponibilidad limitada de proteínas Id usando sus métodos. Con los métodos mejorados para generar proteína Id en la presente invención, esta limitación puede ser removida . Thurner et al . usaron un protocolo ligeramente diferente para la producción de células dendríticas cargadas. De este modo, las células dendríticas también pueden ser obtenidas usando una sola leucaféresis como se describe en Thurner et al., 1999 (Thurner, B., et al., "Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinical application, " J. Immunol . Methods 223: 1-15 (1999)). Después de retirar las células de un paciente, las PBMC son aisladas por medios como sobre LymphoprepMR (Nycomed Pharma) y son divididas en tres fracciones. La primera fracción de 109 PBMC es cultivada en cajas de petri bacteriológicas recubiertas con Ig humano (100 µg/ml) en medio RPMI 1640 completo (BioWhittaker) suplementado con 20 µg/ml de gentamicina, glutamina 2 mM, y 1% de plasma humano inactivad con calor durante 24 horas. Esto genera un medio acondicionado con monocitos (MCM) para su uso posterior para estimular la maduración de DC. La segunda fracción del PBMC es usada como fuente de célula dendríticas a ser cargadas con proteína Id, o porciones de la proteína Id, y regresar al paciente, así como para cualesquier pruebas requeridas . Esas pruebas podrían incluir la prueba de hipersensibilidad del tipo retrasada (DTH) 1. Los monocitos adherentes son cultivados en 1,000 U/ml de GM- CSF (10 x 107 U/mg) y 800 U/ml de IL-4 (pureza >98%; 4.1 x 107 ' U/mg en un bioensayo usando la proliferación de IL-4R humana + CTLL durante seis días; esto es seguido por la adición de MCM para conducir la maduración de las célula dendríticas. El MCM puede ser suplementado en algunos pacientes con 10 ng/ml de GMP-rhu TNF-a (pureza de > 99%; 5 x 107) para asegurar la maduración total de DC. Las DC maduras son cosechadas el día 7. La tercera fracción de PBMC es conjugada en alícuotas y almacenada en nitrógeno líquido para su uso futuro (Thurner B, et al., "Vaccination with mage-3Al peptide-pulsed mature, monocyte-derived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma," J Exp Med. 190: 1669-1678 (1999). Las células dendríticas son impulsadas con inmunógenos, en este caso, Favid™1, a concentraciones de 10 µg/ml a 10 µM. Después de siete días, las células dendríticas son cosechadas, resuspendidas en medio completo, lavadas, impulsadas nuevamente con el péptido a 30 µM durante 60 minutos a 37°C. Las células dendríticas son lavadas y resuspendidas en PBS para ser regresadas al paciente (Thurner, et al., 1999). En modalidades preferidas, la carga de células dendríticas es dentro de doce semanas después del tratamiento con un agente citorreductor con un agente de unión específica, como un anticuerpo anti-CD22.

Ej e plo 4 ; Uso de Células de Langerhans como Parte de la Terapia de Combinación Kumamoto et al . , también han desarrollado recientemente una técnica para cargar células de Langerhans atrapadas en nodos linfáticos con varillas de polímero de etileno-acetato de vinilo. Usando esta tecnología, las células presentadoras de antígeno son cargadas con un inmunógeno (antígeno asociado con un tumor) in vivo (Kumamoto et al., Nat. Biotech. 20: 64-69 (2002)). El inmunógeno usado en la presente invención es. la proteína Id expresada en un sistema in vi tro como células bacterianas, levaduras, células de mamífero o células de insecto. En modalidades preferidas, la carga de las células de Langerhans es dentro de dos escenarios después del tratamiento con un agente citorreductor de unión específica como un anticuerpo anti-CD22.

Ejemplo 5; Tratamiento de un Paciente usando un Agente Citorreductor de Unión Específica y Proteína Id Autóloga Producida en Células de Mamífero Los anticuerpos Anti-CD20 están aprobados para tratamientos de pacientes con ciertos tipos de linfoma Hodgkin de células B. Ellos son usados en conjunto con la inmunización de proteína Id conjugada a KLH más una citocina o una quimocina como GM-CSF. Todos los pacientes tienen una biopsia de nodo linfático para obtener tejido de clasificación morfológica, caracterización inmunofenotípica y para proporcionar material para la generación in vitro de proteína Id. Después de la caracterización del linfoma, las suspensiones de células de biopsias restantes son almacenadas en nitrógeno líquido para propósitos de archivo. Este material puede ser usado para estudios de respuesta inmunológica in vi tro para detectar la presencia de anticuerpos específicos del tumor en los sueros de los pacientes tratados o linfocitos T reactivos al tumor detectado de la sangre periférica de pacientes tratados. Los pacientes elegidos reciben cuatro infusiones semanalmente de Rituxan® a dosis estándar seguidas dentro de 12 semanas por la primera de 6 inyecciones subcutáneas mensuales de proteína Id conjugada con KLH junto con GM-CSF. Los pacientes con una respuesta objetiva (CR o PR) o que carecen de enfermedad progresiva continúan recibiendo los tratamientos con proteína Id/GM-CSF cada mes durante seis tratamientos y entonces cada tres meses siempre que no existen evidencias de progreso de la enfermedad. El anticuerpo anti-idiotípico y anti-KLH del suero son evaluados de las muestras obtenidas en las líneas básales (antes del anticuerpo anti-CD20) y antes de cada tratamiento con proteína Id y a las 4 semanas después del último tratamiento con proteína Id. La proliferación de PBMC específica del idiotipo y específica de KLH son también medidas en muestras obtenidas en la línea basal (antes del anticuerpo anti-CD20) y antes de cada tratamiento con proteína Id y cuatro semanas después de concluir la terapia con proteína Id.

Administració : (1) El anticuerpo anti-cd20 es administrado con infusión intravenosa de acuerdo al inserto de paquete una vez a la semana durante 4 semanas o según lo considere apropiado el médico tratante. Se usaron los detalles de prescripción proporcionados por el fabricante. (2) proteína Id/KLH y GM-CSF Los tratamientos con proteína Id/KLH y GM-CSF comenzaron aproximadamente 8 semanas después de concluir el tratamiento con anticuerpo anti-CD20, o tan pronto, como lo permitió la conclusión de la producción de proteína Id. La proteína Id, 1 mg (0.5 mg de proteína Id de tumor conjugada con 0.5 mg de proteína portadora de KLH) y 250 mcg de GM-CSF son generalmente usados antes de la experiencia clínica con programas y dosis de tratamientos similares. Los pacientes reciben una inyección subcutánea de proteína Id con GM-CSF (dividida en dos sitios de inyección) una vez al mes durante seis meses. Se administra una dosis plana de 250 mcg de GM-CSF solo con inyección subcutánea durante 3 después de cada inyección de proteína Id. Todas las inyecciones de GM-CSF son también divididas (125 mcg por sitio de inyección) y se dan muy cerca de los sitios de inyección de Favid"11, tan cerca como sea posible de los sitios exactos de inyección de Favid"11 Día 1. Los sitios de inyección se rotan entre las extremidades superior e inferior cada mes .

Información del Fármaco El anticuerpo anti-CD20 es obtenido del fabricante y usado de acuerdo a los procedimientos recomendados . La proteína Id es producida del gen idiotípico capturado de cada linfoma de paciente. Este gen específico del paciente es usado para generar un gen que expresa la región idiotípica insertada en un vector que codifica para las cadenas ligeras y cadenas pesadas de inmunoglobulina por la tecnología recombinante . El gen recombinante es expresado en células de mamífero usando técnicas estándar conocidas en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión que codifica para la proteína Id puede ser transformada en células CHO junto con el gen DHFR, seguido por amplificación, como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,399,216, 4,634,665, y 5,179,017 (patentes de Axel) . La proteína purificada resultante es acoplada covalentemente a la hemocianina de cangrejo bayoneta (KLH) antes de la administración al paciente. El FavId"R (Id-KLH) -formulado para la administración subcutánea contiene 0.5 mg de Id y 0.5 mg de KLH por mi de solución salina normal; es proporcionado en frascos de plástico de tapa roscada, y almacenada antes de la administración a -20°C. El Favid"11 es administrado junto con el GM-CSF como se describió en otra parte en la especificación.

Ejemplo 6; Tratamiento de un Paciente Usando un Agente Citorreductor de Unión Específica y Proteína d Autóloga Producida por Células de Levadura Los anticuerpos Anti-CD20 están aprobados para tratamientos de pacientes con ciertos tipos de linfoma Hodgkin de células B. Ellos son usados en conjunto con la inmunización de proteína Id conjugada a KLH más una citocina o una quimocina como GM-CSF. Todos los pacientes tienen una biopsia de nodo linfático para obtener tejido de clasificación morfológica, caracterización inmunofenotípica y para proporcionar material para la generación in vi tro de proteína Id. Después de la caracterización del linfoma, las suspensiones de células de biopsias restantes son almacenadas en nitrógeno líquido para propósitos de archivo. Este material puede ser usado para estudios de respuesta inmunológica in vitro para detectar la presencia de anticuerpos específicos del tumor en los sueros de los pacientes tratados o linfocitos T reactivos al tumor detectados de la sangre periférica de pacientes tratados. Los pacientes elegidos reciben cuatro infusiones semanalmente de Rituxan® a dosis estándar seguidas dentro de 12 semanas por la primera de 6 inyecciones subcutáneas mensuales de proteína Id conjugada con KLH junto con GM-CSF. Los pacientes con una respuesta objetiva (CR o PR) o que carecen de enfermedad progresiva pueden continuar recibiendo los tratamientos con proteína Id/GM-CSF cada mes durante seis tratamientos y entonces cada tres meses siempre que no existen evidencias de progreso de la enfermedad. El anticuerpo anti-idiotípico y anti-KLH del suero son evaluados • de las muestras obtenidas en las líneas básales (antes del anticuerpo anti-CD20) y antes de cada tratamiento con proteína Id y a las 4 semanas después del último tratamiento con proteína Id. La proliferación de PBMC específica del idiotipo y específica de KLH son también medidas en muestras obtenidas en la línea basal (antes del anticuerpo anti-CD20) y antes de cada tratamiento con proteína Id y cuatro semanas después de concluir la terapia con proteína Id.

Administración: (1) El anticuerpo anti-cd20 es administrado con infusión intravenosa de acuerdo al inserto de paquete una vez a la semana durante 4 semanas o según lo considere apropiado el médico tratante. Se usaron los detalles de prescripción proporcionados por el fabricante. (2) proteína Id/KLH y GM-CSF Los tratamientos con proteína Id/KLH y GM-CSF comenzaron aproximadamente 8 semanas después de concluir el tratamiento con anticuerpo anti-CD20, o tan pronto como lo permitió la conclusión de la producción de proteína Id. La proteína Id, 1 mg (0.5 mg de proteína Id de tumor conjugada con 0.5 mg de proteína portadora de KLH) y 250 mcg de GM-CSF son generalmente usados antes de la experiencia clínica con programas y dosis de tratamientos similares. Los pacientes reciben una inyección subcutánea de proteína Id con GM-CSF (dividida en dos sitios de inyección) una vez al mes durante seis meses. Se administra una dosis plana de 250 mcg de GM-CSF solo con inyección subcutánea durante 3 después de cada inyección de proteína Id. Todas las inyecciones de GM-CSF son también divididas (125 mcg por sitio de inyección) y se dan muy cerca de los sitios de inyección de Favid"11, tan cerca como sea posible de los sitios exactos de inyección de FavIdMR Día 1. Los sitios de inyección se rotan entre las extremidades superior e inferior cada mes.

Información del Fármaco El anticuerpo anti-CD20 es obtenido del fabricante y usado de acuerdo a los procedimientos recomendados . La proteína Id es producida del gen idiotípico capturado de cada linfoma de paciente. Este gen específico del paciente es usado para generar un gen que expresa la región idiotípica insertada en un vector que codifica para las cadenas ligeras y cadenas pesadas de inmunoglobulina por la tecnología recombinante . El gen recombinante es expresado en células de mamífero usando técnicas estándar conocidas en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión que codifica para la proteína Id puede ser transformada en células de levadura y expresadas como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,546,082 5,162,498 o 6,183,989.

La proteína purificada resultante es acoplada covalentemente a la hemocianina de cangrejo bayoneta (KLH) antes de la administración al paciente. El Favid"11 (Id-KLH) formulado para la administración subcutánea contiene 0.5 mg de Id y 0.5 mg de KLH por mi de solución salina normal; es proporcionado en frascos de plástico de tapa roscada, y almacenada antes de la administración a -20°C. El Favid"11 es administrado junto con el GM-CSF como se describió en otra parte en la especificación.

Ej emplo 7 : Tratamiento de un Paciente Usando un Agente Citorrßductor de Unión Específica y una Proteína d Autóloga Producida en Bacterias Los anticuerpos Anti-CD20 están aprobados para tratamientos de pacientes con ciertos tipos de linfoma Hodgkin de células B. Ellos son usados en conjunto con la inmunización de proteína Id conjugada a KLH más una citocina o una quimocina como GM-CSF. Todos los pacientes tienen una biopsia de nodo linfático para obtener tejido de clasificación morfológica, caracterización inmunofenotípica y para proporcionar material para la generación in vi tro de proteína Id. Después de la caracterización del linfoma, las suspensiones de células de biopsias restantes son almacenadas en nitrógeno líquido para propósitos de archivo. Este material puede ser usado para estudios de respuesta inmunológica in vi tro para detectar la presencia de anticuerpos específicos del tumor en los sueros de los pacientes tratados o linfocitos T reactivos al tumor detectados de la sangre periférica de pacientes tratados . Los pacientes elegidos reciben cuatro infusiones semanalmente de Rituxan® a dosis estándar seguidas dentro de 12 semanas por la primera de 6 inyecciones subcutáneas mensuales de proteína Id conjugada con KLH junto con GM-CSF. Los pacientes con una respuesta objetiva (CR o PR) o que carecen de enfermedad progresiva pueden continuar recibiendo los tratamientos con proteína Id/GM-CSF cada mes durante seis tratamientos y entonces cada tres meses siempre que no existen evidencias de progreso de la enfermedad. El anticuerpo anti-idiotípico y anti-KLH del suero son evaluados de las muestras obtenidas en las líneas básales (antes del anticuerpo anti-CD20) y antes de cada tratamiento con proteína Id y a las 4 semanas después del último tratamiento con proteína Id. La proliferación de PBMC específica del idiotipo y específica de KLH son también medidas en muestras obtenidas en la línea basal (antes del anticuerpo anti-CD20) y antes de cada tratamiento con proteína Id y cuatro semanas después de concluir la terapia con proteína Id.

Administración; (1) El anticuerpo anti-cd20 es administrado con infusión intravenosa de acuerdo al inserto de paquete una vez a la semana durante 4 semanas o según lo considere apropiado el médico tratante. Se usaron los detalles de prescripción proporcionados por el fabricante . (2) proteína Id/KLH y GM-CSF Los tratamientos con proteína Id/KLH y GM-CSF comenzaron aproximadamente 8 semanas después de concluir el tratamiento con anticuerpo anti-CD20, o tan pronto como lo permitió la conclusión de la producción de proteína Id. La proteína Id, 1 mg (0.5 mg de proteína Id de tumor conjugada con 0.5 mg de proteína portadora de KLH) y 250 mcg de GM-CSF son generalmente usados antes de la experiencia clínica con programas y dosis de tratamientos similares. Los pacientes reciben una inyección subcutánea de proteína Id con GM-CSF (dividida en dos sitios de inyección) una vez al mes durante seis meses. Se administra una dosis plana de 250 mcg de GM-CSF solo con inyección subcutánea durante 3 después de cada inyección de proteína Id. Todas las inyecciones de GM-CSF son también divididas (125 mcg por sitio de inyección) y se dan muy cerca de los sitios de inyección de Favid"11, tan cerca como sea posible de los sitios exactos de inyección de Favid"11 Día 1. Los sitios de inyección se rotan entre las extremidades superior e inferior cada mes .

Información del Fármaco El anticuerpo anti-CD20 es obtenido del fabricante y usado de acuerdo a los procedimientos recomendados . La proteína Id es producida del gen idiotípico capturado de cada linfoma de paciente. Este gen específico del paciente es usado para generar un gen que expresa la región idiotípica insertada en un vector que codifica para las cadenas ligeras y cadenas pesadas de inmunoglobulina por la tecnología recombinante . El gen recombinante es expresado en células de •mamífero usando técnicas estándar conocidas en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión que codifica para la proteína Id puede ser transformada en células CHO junto con el gen DHFR, seguido por amplificación, como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,816,567, y 6,331,415 (patentes de Cabilly) . La proteína purificada resultante es acoplada covalentemente a la hemocianina de cangrejo bayoneta (KLH) antes de la administración al paciente. El FavIdMR (Id-KLH) formulado para la administración subcutánea contiene 0.5 mg de Id y 0.5 mg de KLH por mi de solución salina normal; es proporcionado en frascos de plástico de tapa roscada, y almacenada antes de la administración a -20°C. El Favid"11 es administrado junto con el GM-CSF como se describió en otra parte en la especificación.

Ejemplo 8; Tratamiento de un Paciente Usando un Agente Citorreductor de Unión Específica y Proteína Id Autóloga Durante el Tratamiento con un Agente Citorreductor Inmunoterapia de Mantenimiento con Rituximab más Fa ld™ y GM-CSF en pacientes con Linfoma de Células B Indolente El propósito de este ejemplo es el tratamiento del linfoma Hodgkin indolente (células escindidas pequeñas foliculares, foliculares mezcladas, linfocíticas pequeñas [SLL] ) . El ejemplo se planeó para evaluar la seguridad de la combinación de mantenimiento del rituximab y Favid en pacientes candidos al tratamiento (estado ECOG de 0 , 1 ó 2) sobre la base de porcentaje de sobrevivencia y respuesta libre de eventos. El ejemplo pretendió además evaluar el desarrollo de una respuesta inmune anti-Id (tanto celular como humoral después del Favid) . Los pacientes inicialmente comenzarán el tratamiento con rituximab a una dosis y programa estándar (por ejemplo 375 mg/m2/semana x 4) . Tan pronto como el Favld™-se vuelve disponible (aproximadamente doce semanas después de haber comenzado el tratamiento) , los pacientes comenzarán a recibir inyecciones subcutáneas mensuales de Favid"11. De este modo, la administración del agente citorreductor de unión específica y la proteína Id autóloga continua en una forma superpuesta, o paralela. El GM-CSF será administrado junto con FavId"R y solo en el segundo, tercer y cuarto días después de la administración del FavId"R. El tratamiento con rituximab será repetido cada 6 meses durante un total de 4 ciclos con Favld^/GM-CSF no siendo dado los meses cuando sea administrado rituximab. Comenzando en el mes 12, la frecuencia de administración para el FavIdMR/GM-CSF disminuirá a cada dos meses. Si los pacientes no muestran progreso de la enfermedad después de 25 meses, pueden continuar recibiendo Favid"11/GM-CSF cada tres meses hasta el progreso de la enfermedad . Los pacientes son evaluados de acuerdo a datos químicos de laboratorio, exámenes físicos, observaciones de eventos adversos . Los resultados son medidos por EFS (Sobrevivencia Libre de Eventos) , porcentaje de respuesta a los seis meses, porcentaje de respuesta total (porcentaje de respuesta) TTP, DR, y respuesta inmune al Favid"11 (tanto celular como humoral) . Los datos de eficacia son analizados en un intento por tratar (ITT) y por una eficacia evaluable en poblaciones de pacientes (EE) . El FavIdMR generalmente es administrado a una concentración de 1 mg/ml en solución. El GM-CSF es administrado a 500 mcg/ml . El rituximab es generalmente administrado a 10 mg/ml. La toxicidad mínima del Favid"11 y el rituximab deberán permitir la combinación de ambos agentes a una dosis y programa totales. Sin ser limitados por ninguna teoría, el agotamiento de células B inducido por el rituximab puede conducir a un incremento de la respuesta inmune mediada por células a la inmunización subsecuente con Favid"11. Se usó el programa de mantenimiento de rituximab de Hainsworth et al. ' (Hainsworth JD, et al., J Clin Oncol 20 (20) : 4261 4267 (2002)) junto con el programa de Favid"11 usado en estudios con FavIdMR anteriores (disminuyendo las inyecciones mensuales iniciales a inyecciones cada dos meses después de las primeras 6 inyecciones, y entonces inyecciones cada 3 meses después del primero de dos años) . Administrando rituximab y Favld1^ en días diferentes, es más fácil asignar los efectos laterales a un fármaco específico en lugar de todo el régimen de tratamiento. POBLACIÓN DE ESTUDIO Para ser incluidos en el estudio, los pacientes deben satisfacer los siguientes criterios: (1) _> 18 años de edad; (2) estado de desempeño de ECOG de 0, 1 ó 2; (3) Sin terapia anticáncer anterior excepto por terapia con irradiación local; (4) Tumor accesible por biopsia, o material de biopsia disponible juzgado por Favrille como adecuado para la preparación de Favld"11; (5) Enfermedad medible o evaluable después de la biopsia de nodo; (6) Linfoma de células B folicular grado 1 ó 2 o linfoma linfocítico pequeño (SLL) confirmado histológicamente por el sistema de clasificación de la OMS; (7) Considerado adecuado para tratamiento con rituximab por el médico tratante; (8) conteo de WBC _> 3,000/mm3; (9) Plaquetas > 100,000/mm3; (10) Bilirrubina total < 2 mg/dL; (11) AST y ALT < 2x Límite Superior del Normal; (12) Creatinina £ 1.5 mg/dL; (13) Los pacientes con potencial para embarazarse y pacientes que tienen pareja con potencial para embarazarse deben acordar el uso de anticoncepción para firmar el consentimiento informado hasta 30 días después de descontinuar el estudio; y (14) Capacidad de comprender la naturaleza del estudio y dar su consentimiento informado voluntariamente.

PLANTA DE TRATAMIENTO Los pacientes serán sometidos a FNA de su linfoma para obtener una biopsia para la producción de Favid. Los pacientes inicialmente reciben rituximab a 375mg/m2 IV, una vez por semana durante 4 semanas consecutivas. Los pacientes son reevaluados por la respuesta al rituximab a la semana 9 (mes 3) . Los pacientes con respuesta objetiva (CR, CRu, PR) o enfermedad estable proceden con una terapia de mantenimiento. Los pacientes con progreso de linfoma son removidos del estudio. Todos los pacientes que estén en terapia de mantenimiento pueden recibir cursos repetidos de rituximab intervalos de 6 meses e inyecciones intermitentes de Favld/GM-CSF durante un total de 24 meses. Durante el primer año de terapia de mantenimiento, se administra Favld/GM-CSF mensual-mente, comenzando el mes 4 (semana 13) . Se administra concurrentemente una combinación de Favld/GM-CSF con rituximab, durante los primeros 12 meses. Las inyecciones de Favid son generalmente administradas a los meses 4, 5, 6, 8, 9, 10, y 11. Durante el segundo año, se administra Favld/GM-CSF cada mes (excepto durante los meses cuando es administrado rituximab) . Por lo tanto, las inyecciones durante el segundo año son los meses 14, 16, 18, 20, 22, y 24. Para pacientes con respuesta continua después de completar dos años de terapia, se continúa el Favld/GM-CSF a intervalos de 3 meses hasta el progreso del linfoma. Los días que es administrado Favld/GM-CSF, la proteína Favid (0.5 mg) y la proteína KLH (0.5 mg) es mezclada con 250 µg de GM-CSF e inyectada subcutáneamente. Los días 2-4, se administrarán SQ 250 µg de GM-CSF y serán inyectados cerca de la inyección de Favid. Las dosis los días 2-4 pueden ser administradas por el mismo paciente en su casa.

Mantenimiento con Rituximab; Los cursos de mantenimiento de rituximab se dieron cada 6 meses durante 3 cursos de mantenimiento (es decir, comenzando los meses 7, 13, y 19) . Cada curso de mantenimiento de rituximab generalmente consiste de 4 dosis semanales (infusión IV de 375mg/m2) .

Evaluación del Pretratamiento : Los estudios que son necesarios para la evaluación de pretratamiento, durante los primeros 12 meses de tratamiento, se resumen en la Tabla 1. Todos los pacientes tienen una biopsia para la producción de anticuerpo Favid. Las evaluaciones radiológicas se efectuaron dentro de un mes a la entrada del estudio. Las pruebas de laboratorio se efectuaron dentro de una semana a la entrada del estudio. Los pacientes tendrán aspiración de médula ósea y biopsia, si esos estudios no han sido efectuados dentro de los 6 meses a la entrada del estudio.

Tabla 1 - Estudios de Pretratamiento y Evaluaciones Durante los Primeros 12 Meses gretra- Mes tamiento 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Historial Médico X X X X X X X X X X X X Peso, PS X Mediciones del X X Tumor CBC, plaquetas, X X X X X X X X X X X X dif. CPM+ DH+ácido X X X X X X X X X X X X úrico Serologia de VIH X Prueba de embarazo Xa CT pecho/cabeza X X CT cabeza Xb Aspiración de Xc Xf Médula ósea bx Biopsia de linfoma Xd Inmunidad Xe celular/humoral aUnicamente en mujeres con potencial de embarazo. bSolo si se indicó clínicamente. cCitometría de flujo para la detección de arreglos del gen bcl-2 deberá ser se excluida. No se requiere en pacientes que tuvieron aspiración de médula ósea dentro de 6 meses . dRequerido para especímenes para producir anticuerpo para Fvald (véase el Apéndice 1) . eLínea basal antes de cada dosis de Fvald. Los especímenes serán almacenados y enviados a Favrille (Apéndice III) . fUnicamente si es anormal inicialmente, y si es necesario conformar CR (incluye citometría de flujo) . Los pacientes son reevaluados por la respuesta al tratamiento a intervalos de 3 meses. Los pacientes son examinados mensualmente durante el primer año, y CBC, plaquetas, diferencia y química se efectúan mensualmente. La reclasificación y mediciones del tumor continúan a intervalos de 6 meses. Las CBC, plaquetas, CPM y pruebas de inmunidad humoral/celular se efectúan antes de cada dosis programada de Favld/GM-CSF, y antes de cada curso de rituximab.

Tabla 2 - Evaluación del Paciente Durante los Meses 12-25 Mes 13 14 15 1 166 1 177 1 188 1 199 2 200 21 22 23 24 24 [istorial/ Médico X X X X Peso, PS X X X X X Mediciones del X X X X X Tumor CBC, plaquetas, X X X X X X X X X dif. CMP, LDH, X X X X X X X X X ácido úrico CT pecho/cabeza X X X Inmunidad X humoral/celular Al cumplir 2 años de mantenimiento (mes 25) , los pacientes son reclasificados con reevaluaciones del estado del tumor. Si están en una remisión clínica completa, los pacientes tienen aspiración de médula ósea/biopsia repetida en este momento, si estuvo implicada previamente la médula ósea, y se confirmará una remisión completa. Después de completar 2 años de terapia de mantenimiento, los pacientes son observados cada 3 meses con historia y examen médico, CBC, diferencial, perfil químico y mediciones tumorales de cualesquier lesiones evaluables por examen médico. A intervalos de 6 meses, se repiten las exploraciones CT del pecho y el abdomen, para evaluar el estado del tumor. Esas evaluaciones deberán continuar hasta que se documente el progreso del tumor. EVALUACIÓN DE LA EFICACIA Lo siguiente describe los parámetros usados para determinar la eficacia. Evaluación de la Respuesta del Tumor. Las respuestas se definieron usando los Criterios de Respuesta del Seminario Internacional: Para completar la lista de criterios, véase el Apéndice II resumido en la Tabla a continuación.

Adaptada de Cheson et al, 1999. Evaluación de la Respuesta Inmune El análisis de la respuesta humoral y celular se efectuó en muestras de sangre obtenidas de • cada paciente usando técnicas estándar. La siguiente sección lista la información específica sobre los fármacos usados para el tratamiento. INFORMACIÓN DEL FÁRMACO 1. Favid"11 Descripción: El Favid"11 es fabricado por cada paciente usando información genética tomada de la biopsia de nodo linfático. El Favid"11 consiste de una proteína Id única derivada de un paciente acoplada covalentemente a hemocianina de cangrejo bayoneta (KLH) . Formulación: El FvaIdMR para administración subcutánea (SQ) contiene 0.5 mg de proteína Id y 0.5 mg de proteína KLH por mi de solución salina normal . Preparación: El día de la inyección de Favid"11, se retiraron 250 mcg de GM-CSF comercialmente disponible en una jeringa de tuberculina de plástico y se hizo a un lado. Todo el contenido de un frasco de FavIdMR descongelado se extrajo con una jeringa con una aguja de calibre 18. Cualesquier partículas deberán ser destruidas con la aguja y deberá tenerse cuidado para asegurar que todas las partículas en el frasco que se pretende sean administradas al paciente sean llevadas a la jeringa. El émbolo deberá ser jalado hacia atrás para extraer cualquier material de estudio de la conexión de la aguja y para dejar espacio para la adición de GM-CSF. Después de que ha sido extraído todo el contenido del frasco, la aguja de calibre 18 deberá ser removida de la jeringa de 3 mi. La dosis de GM-CSF preextraída es agregada a la jeringa de 3 mi dejando espacio para aire en el barril de la aguja. La aguja de calibre 18 es conectada nuevamente y la jeringa es agitada suavemente para mezclar las soluciones. Es expulsado el aire y la solución de estudio es dividida en dos jeringas de tuberculina para la administración. Deberá ser usada una jeringa de calibre 25 para la administración. Almacenamiento y Estabilidad: El Favid"11 es almacenado a -20°C. Administración: El día de la administración, la dosis total de FvaIdMR es dividida igualmente entre las dos extremidades superior e inferior (por ejemplo, el brazo derecho y el brazo izquierdo) . Los sitios de inyección se rotan entre las extremidades superior e inferior con las administraciones posteriores . Efectos Laterales Esperados : El Id-KLH (similar al Fvald"11) con o sin GM-CSF ha sido administrado previamente a pacientes. Los efectos laterales fueron mínimos, el más frecuente de los cuales incluyó reacciones locales en el sitio de inyección. Los eventos adversos incluyen: Reacciones locales de la piel en el sitio de inyección como eritema, sensibilización, endurecimiento, urticaria/salpullido, prurito. Reacciones sistémicas como fiebre, mialgia/artralgia, escalofrío/rigor, nauseas, fatiga, cefalea, trombocitopenia y otras citopenias, hiperglicemia, vómito, hipotensión. Además existe riesgo teórico de desarrollo de enfermedad autoinmune, aunque la enfermedad autoinmune clínica no ha sido descrita aún en pacientes que reciban vacunación con Id-KLH. 2. GM-CSF (Sargramostim; Leukine®) Descripción: GM-CSF (LEUKINE®) es un factor estimulante de la colonia de los granulocitos-macrófagos humano, glicosilado (rhu GM-CSF) producido por la tecnología del ADN recombinante en un sistema de expresión de levadura (S. cerevisiae) fabricado por Immunex Corporation. El GM-CSF es usado de acuerdo a la descripción y protocolo del fabricante . 3. Rituximab u Otro Agente Citorreductor Descripción: Rituximab o cualquier otro agente citorreductor es usado de acuerdo a la descripción y protocolo del fabricante.

Puntos finales (Primario y Secundario) ; La siguiente es una descripción de los puntos finales usados para el ensayo . Primario ; La sobrevivencia libre de eventos (EFS) se define como el tiempo desde la primera dosis de rituximab hasta el tiempo de cualquiera de los siguientes eventos: muerte, progreso de la enfermedad, o tratamiento por la institución o adicional (sin protocolo especificado) . Puntos Finales de Eficacia Secundaria; El porcentaje de respuesta objetiva al mes 6 (justo antes del segundo curso de rituximab) el porcentaje de respuesta objetivo a los 6 meses definido como porcentaje de pacientes que han alcanzado o mantenido una respuesta completa (CR) o una respuesta parcial (PR) a la evaluación al mes 6. El porcentaje de respuesta objetiva total: El porcentaje de respuesta objetiva total se define como un porcentaje de pacientes que alcanzaron una respuesta completa (CR) o una respuesta parcial (PR) en cualquier momento durante la participación del estudio. Tiempo para el Progreso: Tiempo para el progreso (TTP) se define como tiempo desde la primera dosis de rituximab hasta el tiempo que es documentado por primera vez y el progreso de la enfermedad. Los pacientes que no han progresado, no son seguidos, o mueren antes de que el progreso sea efectuado al momento de su última evaluación. Duración de la Respuesta: La duración de la respuesta (DR) se define como un punto desde la fecha de la primera documentación de respuesta (CR o PR) hasta el tiempo de la primera documentación de enfermedad progresiva. Los pacientes que no han progresado, no son seguidos o mueren antes de que sea detectado el proceso al momento de su última evaluación. Respuesta Inmune: Se considerará que los pacientes tuvieron una respuesta inmune positiva y desarrollaron una respuesta celular y/o humoral positiva a su proteína Id en cualquier momento después del inicio de la vacunación con Id.

Los pacientes también serán evaluados por una respuesta inmune celular u humoral positiva a KLH.

Poblaciones de Estudio El intento por tratar una población: El intento por tratar una población (ITT) incluye todos los pacientes que han recibido al menos una dosis de rituximab. Población Evaluable por Eficacia: La población evaluable por la eficacia (EE) incluye todos los pacientes que recibieron terapia con rituximab, recibieron al menos una dosis de FavIdMR/GM-CSF, y recibieron al menos un seguimiento de evaluación del tumor.

Evaluable por Seguridad: todos loa pacientes recibieron algún tratamiento de estudio (ya sea rituximab o FavIdMR/GM-CSF) serán evaluables por su seguridad y toxicicidad. La invención descrita ilustrativamente puede ser practicada, de manera adecuada, en ausencia de cualquier elemento o elementos, indicación o limitaciones que no sean descritas específicamente aquí. De este modo, por ejemplo, los términos "que comprende" "que incluye", "que contiene" , etc deberán ser leídos ampliamente sin limitación. De manera adicional, los términos y expresiones empleadas aquí han sido usados en términos de descripción y no limitación, y no existe la intención en el uso de esos términos y expresiones de excluir cualquier equivalente de la invención mostrada o porción de la misma, pero debe reconocerse que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invención reclamada. De este modo, deberá comprenderse que aunque la presente invención ha sido descrita específicamente por modalidades preferidas y características opcionales, pueden ser hechas fácilmente modificaciones y variaciones en las modalidades de las invenciones descritas aquí por aquellos expertos en la técnica, ya que esas modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de la invención descrita aquí. La invención ha sido descrita de manera amplia y genérica aquí. Cada una de las especies más estrechas y agrupamientos subgenéricos que caigan dentro de la descripción genérica también forman parte de esa invención. Esto se incluye dentro de la descripción genérica de cada una de las invenciones como una condición o limitación negativa que permitirá remover cualquier materia objeto de género, sin importar si o no el material a ser removido fue expuesto específicamente. Además, donde las características o aspectos de una invención sean descritos en términos del grupo de Markush, aquellos versados en la técnica reconocerán que la invención también es descrita por lo tanto en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush. Además, cuando se hace referencia a un aspecto de la invención que lista un intervalo de miembros individuales, como por ejemplo, "SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 100, inclusive" se pretende que sea equivalente a listar cada miembro de la lista individualmente, y adicionalmente deberá comprenderse que cada miembro individual puede ser excluido o incluido en la reivindicación individualmente . Los pasos descritos y/o usados en los métodos de la presente pueden ser efectuados en diferente orden al descritos y/o establecido. Los pasos son meramente ejemplares del orden en que pueden ocurrir esos pasos . Los pasos pueden ocurrir en cualquier orden que se desea de modo que aún se alcancen las metas de la invención reclamada. De la descripción de la invención aquí, se vuelve manifiesto que pueden ser usados varios equivalentes para implementar los conceptos de la presente invención sin apartarse de su alcance. Además, aunque la invención haya sido descrita con referencia específica a ciertas modalidades, un experto en la técnica reconocer que pueden hacerse cambios en la forma y detalles sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Las modalidades descritas son consideradas en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas. También deberá comprenderse que la invención no se limita a las modalidades particulares descritas aquí, sino que es capaz de muchos equivalentes, arreglos, modificaciones y sustituciones sin apartarse del alcance de la invención. De este modo, las modalidades adicionales están dentro del alcance de la invención y dentro de las siguientes reivindicaciones . Todas las patentes y solicitudes estadounidenses; patentes y solicitudes extranjeras; artículos científicos; libros; y publicaciones mencionadas aquí se incorporan por lo tanto como referencia en su totalidad como si cada patente o publicación individual fuera indicada específica o individualmente incorporada como referencia, incluyendo cualesquier dibujos, Figuras y tablas, como se expuso de manera completa. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para tratar una enfermedad maligna relacionada con las células B en un paciente que necesite de ese tratamiento con una terapia de combinación, caracterizado porque comprende coadministrar de manera contemporánea (1) un agente citorreductor de unión específica y (2) una composición inmunoterapéutica que comprende una proteína Id autóloga.
2. 2. Un método para tratar una enfermedad maligna relacionada con las células B en un paciente que necesite de ese tratamiento con una terapia de combinación, caracterizado porque comprende coadministrar de manera contemporánea (1) un agente citorreductor de unión específica y (2) una composición inmunoterapéutica que comprende al menos una parte de una proteína Id autóloga.
3. 3. Un método para mejorar un tratamiento para una enfermedad maligna relacionada con las células B, caracterizado porque el tratamiento para una enfermedad maligna relacionada con las células B comprende administrar un agente citorreductor de unión específica y donde el tratamiento mejorado comprende coadministrar de manera contemporánea una proteína Id autóloga.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la enfermedad maligna relacionada con las células B no ha sido tratada previamente.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la enfermedad maligna relacionada con las células B no ha sido tratada previamente con agentes quimioterapéuticos .
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la enfermedad maligna relacionada con las células B es una enfermedad maligna relacionada con las células B con recaída.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque el tratamiento coadministrado de manera contemporánea con la proteína Id autóloga comienza dentro de los tres meses de la última administración del agente citorreductor de unión específica.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque el tratamiento coadministrado de manera contemporánea con la proteína Id autóloga comienza dentro de los dos meses de la última administración del agente citorreductor de unión específica.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque el tratamiento coadministrado de manera contemporánea con la proteína Id autóloga comienza dentro de un mes de la última administración del agente citorreductor de unión específica.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2 ó 3, caracterizado porque el tratamiento coadministrado de manera contemporánea con la proteína Id autóloga comienza dentro de una semana de la última administración del agente citorreductor de unión específica.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación I, 2 ó 3, caracterizado porque la enfermedad maligna relacionada con las células B es seleccionada del grupo que consiste de linfomas de células B y leucemias de células B.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque el linfoma relacionado con las células B es seleccionado del grupo que consiste de Linfoma ' de Enfermedad de Hodgkin y Linfoma no Hodgkin.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el Linfoma no Hodgkin es de grado bajo, grado intermedio o grado alto.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el Linfoma no Hodgkin es seleccionado del grupo de subtipos que consiste de células linfocíticas pequeñas, foliculares y predominantemente escindidas pequeñas, del tipo de células foliculares, y escindidas pequeñas y grandes mezcladas, del tipo de células foliculares y predominantemente grandes, células escindidas pequeñas difusas, células pequeñas y grandes mezcladas difusas, células grandes difusas, inmunoblástico de células grandes, linfoblástico, del tipo de Burkitt no escindido pequeño y no Burkitt, linfomas relacionados con el SIDA, linfadenopatía angioinmunoblástica y linfoma de células B monocitoides .
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el Linfoma no Hodgkin es un linfoma de células extendidas.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la leucemia de células B es una leucemia de células B crónica, leucemia linfoblástica aguda de un linaje de células B, o leucemia linfocítica crónica de un linaje de células B.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque el agente citorreductor de unión específica es un agente citorreductor de unión a antígeno .
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque el agente citorreductor de unión específica es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-B7 y un anticuerpo anti-CD156.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga es producida de manera recombinante.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga es producida de manera recombinante en líneas celulares de insecto .
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga es acoplada a KLH.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga es codificada por un marco de lectura abierta donde una porción de la secuencia de ADN del marco de lectura abierta se obtiene de la secuencia de ácido nucleico derivada de la enfermedad maligna relacionada con las células B del paciente a ser tratado con la proteína Id autóloga.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga no comprende una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa o una cadena ligera de anticuerpo de longitud completa .
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga no comprende una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga no comprende una cadena ligera de anticuerpo de longitud completa.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las células dendríticas son células dendríticas autólogas.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga es producida de manera recombinante en células de levadura.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga es producida de manera recombinante en células bacterianas .
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga es producida de manera recombinante en células de mamífero.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la proteína Id autóloga es producida de manera recombinante en células T linfoides de mamífero.
31. 31. El método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el tratamiento coadministrado de manera contemporánea con la -proteína Id autóloga comienza antes de finalizar la administración del agente citorreductor de unión específica y donde el tratamiento usando la proteína Id autóloga y el agente citorreductor continúa en paralelo.