MXPA06001618A - Un metodo para la identificacion de inhibidores o agonistas de la proteina quinasa de irs. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para la identificacion de un inhibidor de la proteina quinasa de IRS, que comprende las etapas de a) poner en contacto PKC-? con al menos un peptido de IRS que comprende al menos un sitio de fosforilacion Ser de PKC-? en presencia de al menos un supuesto inhibidor, y b) medir fosforilacion del sitio de fosforilacion Ser de PKC-?.

Description

UN MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE INHIBIDORES O AGONISTAS DE LA PROTEÍNA QU1NASA DE 1RS DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere a un método para la identificación de inhibidores o agonistas de la proteína quinasa de IRS así como a péptidos seleccionados de IRS que comprenden sitios de fosforilación para PKC-? y otras serina quinasas de IRS, y al uso de estos péptidos para la identificación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes de tipo 2.

La diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM) se produce principalmente en adultos y se caracteriza por una sensibilidad reducida de los tejidos que son capaces de obtener glucosa de la sangre. A diferencia de la diabetes dependiente de insulina (IDDM, diabetes de tipo l), la diabetes de tipo II no se caracteriza por un deterioro de la secreción de insulina por las células beta pancreáticas.

Aún no se conoce el mecanismo molecular que conduce a la reducción de la sensibilidad a la insulina o incluso la resistencia a la insulina, a pesar de los intensos esfuerzos realizados por los investigadores tanto en universidades como en la industria farmacéutica. Ciertos estudios recientes han esclarecido que en la diabetes de tipo II, están alteradas las rutas de segundo mensajero que conectan el receptor de insulina activado con la translocación de GLUT4 y el transporte de glucosa. Específicamente, las proteínas del sustrato de receptor de insulina (1RS) se fosforilan en múltiples restos de tirosina por el receptor de insulina activado, el receptor del factor de crecimiento semejante a insulina y JAK1/2 y juegan un papel fundamental en el proceso de señalización de insulina posterior (1 , 2, 3). Los motivos de fosforilación, específicamente dentro de IRS-1 e IRS-2, sirven como sitios de acoplamiento para una serie de proteínas adaptadoras que poseen dominios de homología Src 2 (SH2) incluyendo Grb2, la PTPasa intracelular SHP-2, Nck, Crk y fosfatidilinositol-3 quinasa (PI-3 quinasa) (4-6). La PI-3 quinasa se compone de una subunidad catalítica de 110 kDa (p110) y una subunidad reguladora de 85 kDa (p85) que contiene dos dominios SH2 que se unen a motivos pY XM y pYXXM fosforilados en tirosina en proteínas IRS e inducen la activación de la PI-3 quinasa (7). Esto conduce a la estimulación de otras quinasas posteriores incluyendo la quinasa de serina/treonina PKB/Akt (8,9) y las isoformas ? y ? (P C-?/?) de la proteína atípica quinasa C (10, 11) por medio de una quinasa 1 dependiente de fosfoinosítido. Se ha demostrado que la activación de PKB y PKC-?/? y sus señales corriente abajo juegan un papel crítico en la mediación de acciones metabólicas de la insulina tales como translocación de GLUT4 y transporte de glucosa (10, 11), la fosforilación de serina de GSK3 y la síntesis de glucógeno (12), la fosforilación de serína de PDE y acciones anti-lipolisis (13, 14), y la activación de mTOR y la síntesis de proteínas (15, 16).

La desregulación del sistema de señalización de insulina es un proceso multifuncional que ocasiona resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2 pudiendo representar las proteínas IRS una diana principal (17). De esta manera, se ha propuesto que la fosforilación en serina/treonina de proteínas IRS juega un papel clave tanto en la inhibición por retroalimentación de la señal de insulina como en el desarrollo de resistencia celular a la insulina (como revisión, véase 17-19). Se demostró que la modificación covalente de IRS-1 en serina/treonina empeoraba su fosforilación de tirosina inducida por insulina, la activación de la Pl 3-quinasa y la estimulación del transporte de glucosa (20). En el estado no estimulado, en la célula se produce constitutivamente una fosforilación en serina/treonina de IRS- (21) que se promueve adicionalmente por citoquinas y metabolitos que inhiben la transducción de señales tales como el factor de necrosis tumoral (TNF)a (22), ácidos grasos libres, glucosa o ceramida (23). Además, la hiperfosforilación de IRS-1 en restos de serina/treonina es un descubrimiento común durante la resistencia a la insulina y la diabetes de tipo 2 (24).

A pesar de jugar un papel clave en el desarrollo de resistencia a la insulina, la fosforilación en serina de IRS-1 no se comprende completamente, principalmente porque IRS-1 contiene más de 100 sitios de fosforilación de serina potenciales y porque se demostró que representa un sustrato para muchas proteínas quinasas incluyendo la quinasa N-terminal de c-Jun (JNK) (25), qinasa-ß IkappaB (26), MAP quinasa (27), Caseína quinasa (28), glucógeno sintasa quinasa (29), fosfoinositol-3-quinasa (30), proteína quinasa A (31), proteína quinasa C (32), proteína quinasa B (PKB) (33) y proteína quinasa activada por AMP (AMPK) (34). Curiosamente, se descubrió que tanto PKB como AMPK actuaban como un regulador positivo de la función de I S-1, confirmando la idea de que la fosforilación en serina/treonina de IRS-1 tiene un papel doble, potenciar o terminar la señalización de la insulina (35). La identificación de restos dentro de dominios diferentes de IRS-1 que experimentan fosforilación de serina en respuesta a diferentes estímulos ha mejorado la comprensión de esta etapa reguladora tan compleja en la acción de la insulina. De esta manera, la Ser307, que está localizada cerca del dominio de unión a fosfotirosina (PTB), se ha identificado como una diana para quinasas activadas por estrés incluyendo JNK (25) y también puede jugar un papel como regulador de retroalimentación negativa de la acción de la insulina (36). La AMPK se dirige a la Ser789 y modula positivamente la acción de la insulina (34), sin embargo, también se descubrió que la fosforilación de Ser789 por quinasas no identificadas atenúa la señalización de insulina (37). La Ser612, la Ser632, la Ser662 y la Ser731 están localizadas dentro o cerca del dominio de interacción de la Pl 3-quinasa, sin embargo, siguen siendo difíciles de obtener las implicaciones funcionales de estos sitios (38-40).

A diferencia de las proteína quinasas mencionadas anteriormente, la proteína quinasa C (???)-?, que es un miembro atípico de la familia PKC de quinasas de serina/treonina, parece participar tanto en la transducción de la señal de insulina corriente abajo como en el control de retroalimentación negativa de la función de IRS-1 (11, 41-44). De esta manera, se descubrió que PKC-? se colocaliza con GLUT4 y es esencial para la translocación de GLUT4 regulada por insulina y el transporte de glucosa en el músculo esquelético (41) y los adipocitos (11). Además, una activación defectuosa de PKC-? puede contribuir al desarrollo dependiente de la obesidad de resistencia a la insulina en el músculo esquelético (42). Los datos recientes de Quon y colaboradores (43) han demostrado que IRS-1 representa un nuevo sustrato para PKC-? y en un estudio paralelo Zick y colaboradores (44) descubrieron que este proceso inhibe la activación de la Pl 3-quinasa, sugiriendo que PKC-? representa un elemento clave en el control de retroalimentación negativa de la acción de la insulina.

En resumen, aunque en la técnica se sabe que IRS, especialmente IRS-1 interacciona con PKC-?, no se conoce la naturaleza de esta interacción. Por consiguiente, en la técnica no se conocen agentes que interaccionen con la interacción IRS-PKC-?. Sin embargo, estos agentes serían muy necesarios, ya que es muy probable que una inhibición de la interacción de IRS y PKC-? tuviera como resultado una regulación negativa de la inhibición de IRS y, más adelante, de la Pl 3-quinasa que, a su vez, daría como resultado una mejora de la translocación de GLUT4 y el transporte de glucosa.

Por consiguiente, el objeto de la presente invención es proporcionar un método para la identificación de inhibidores o agonistas de la proteína quinasa de IRS.

De acuerdo con la presente invención, este objeto se cumple por un método para la identificación de un inhibidor de la proteína quinasa de IRS, que comprende las etapas de a) poner en contacto PKC-? con al menos un péptido de IRS que comprende al menos un sitio de fosforilación en Ser de PKC-? en presencia de al menos un supuesto inhibidor, y b) medir la fosforilación del sitio de fosforilación en Ser de PKC-?.

La presente invención se basa en la sorprendente identificación de sitios de fosforilación de serina específicos en la secuencia de IRS, que se reconocen específicamente por PKC-?. Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, se identificó el mecanismo molecular que proporciona la interacción lRS-P C-?. Además, es probable que otras proteínas quinasas tales como la quinasa N-terminal de c-Jun (JNK), quinasa lkappaB-ß, MAP quinasa, caseína quinasa, glucógeno sintasa quinasa, fosfoinositol-3-quinasa, proteína quinasa A, proteína quinasa C, proteína quinasa B (PKB) y proteína quinasa activada por AMP (AMPK) podrían reconocer estos sitios de fosforilación. Por lo tanto, la determinación de los sitios de serina, que se fosforilan por proteína quinasas, especialmente PKC-?, permite la identificación de moléculas que interfieren con esta interacción, de una manera antagonista o agonista.

En el contexto de la presente invención, la expresión "inhibidor de la proteína quinasa de IRS" se refiere a una sustancia que interfiere con la interacción entre IRS y una proteína quinasa, ejemplificada por PKC-?.

En el contexto de la presente invención, la expresión "péptido de IRS" se refiere a un péptido que comprende un tramo de al menos 5, preferiblemente 7, preferiblemente al menos 10 aminoácidos de IRS. La expresión "péptido de IRS" incluye la posibilidad de que el péptido de IRS comprenda, además del tramo de aminoácidos derivado de IRS, otros aminoácidos que no proceden de IRS.

Todos los métodos de la invención preferiblemente se realizan in vitro.

PKC-? está disponible en el mercado, por ejemplo, en CalBiochem (San Diego, CA, USA). Además, en la bibliografía citada en la presente solicitud se describen métodos para el aislamiento de PKC-?.

En la técnica se conoce la secuencia de IRS, especialmente IRS-1 e IRS-2 de diferentes especies. La secuencia de IRS-1 de rata se proporciona en este documento como SEC ID N°: 16.

En la técnica se conocen métodos para la producción de proteínas y, por consiguiente, de IRS e incluyen, por ejemplo, la expresión de la proteína en células apropiadas a partir de un ADNc o la producción por la posterior adición de aminoácidos a un aminoácido de partida (véase Current Protocols, John Wiley & Sons, Inc., New York) Además, en la técnica se conocen métodos para la producción de fragmentos de proteínas (véase anteriormente) e incluyen la escisión de la proteína con proteasas apropiadas o la generación de fragmentos de ácido nucleico que codifican los fragmentos proteicos y la posterior expresión de los fragmentos en células apropiadas.

En la técnica se conocen métodos para la producción de proteínas mutadas, por ejemplo, por intercambio de uno o más aminoácidos o por deleción de tramos de aminoácidos (véase anteriormente). Estos métodos incluyen mutagénesis de localización dirigida del gen de IRS y la expresión del gen modificado en células apropiadas.

De acuerdo con una modalidad preferida, una fosforilación reducida del sitio de fosforilación Ser de PKC-? en comparación con la fosforilación en ausencia de al menos un supuesto inhibidor indica las propiedades inhibidoras del supuesto inhibidor.

Preferiblemente, la PKC-? es de mamífero, preferiblemente de roedor o de origen humano, más preferiblemente de rata o de origen humano.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el péptido de IRS procede de un IRS, preferiblemente IRS-1 , de mamífero, preferiblemente de origen humano o de roedor, más preferiblemente de rata.

Preferiblemente, el IRS-1 procede de rata y dicho al menos un sitio de fosforilación Ser de PKC-? se selecciona entre el grupo consistente en Ser 458, 469, 481 , 498, 522, 526, 530, 536, 538, 539, 542, 560, 570, 577, 599, 600, 612, 620, 632, 635, 662 y 664, donde los números de la secuencia corresponden a IRS-1 de rata como se representa en la SEC ID N°:16. Además, el IRS-1 puede ser de origen humano y dicho al menos un sitio de fosforilación Ser de PKC-? se selecciona entre restos de Ser correspondientes a los restos de Ser anteriores del IRS-1 de rata.

Preferiblemente, el sitio de fosforilación Ser de PKC-? en el contexto de la presente invención puede seleccionarse entre el grupo consistente en Ser498, Ser570 y Ser512, más preferiblemente Ser570.

De acuerdo con una modalidad más preferida de la presente invención, el péptido es rlRS449"664 (SEC ID N°: 17).

Preferiblemente, el inhibidor se selecciona entre el grupo consistente en péptidos de unión, anticuerpos y compuestos de bajo peso molecular (LMW).

La expresión "proteína de unión" o "péptido de unión" se refiere a una clase de proteínas o péptidos que se unen e inhiben al IRS, que incluyen, sin limitación, anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos de anticuerpos y proteínas andamio dirigidas contra IRS, p.ej. anticalinas, que se dirigen contra IRS.

El procedimiento para preparar un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se efectúa de acuerdo con métodos que son bien conocidos por el especialista en la técnica, p.ej. inmunizando un mamífero, por ejemplo un conejo, con PAK, donde sea apropiado en presencia de, por ejemplo, adyuvante de Freund y/o geles de hidróxido de aluminio (véase, por ejemplo, Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349). Los anticuerpos policlonales que se forman en el animal como resultado de una reacción inmunológica pueden aislarse de la sangre posteriormente usando métodos bien conocidos y, por ejemplo, purificarse por medio de cromatografía en columna. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales, por ejemplo, de acuerdo con el método conocido de Winter & Milstein (Winter, G. & ilstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299).

Según la presente invención, el término anticuerpo o fragmento de anticuerpo también se entiende que significa anticuerpos o partes de los mismos que se unen con antígenos, que han sido preparados de manera recombinante y, donde sea apropiado, modificados, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos multifuncionales, anticuerpos biespecíficos u oligoespecíficos, anticuerpos de hebra única y fragmentos F(ab) o F(ab)2 (véase, por ejemplo, la patente europea EP-B1-0 368 684, el documento US 4.816.567, el documento US 4.816.397, la solicitud de patente internacional WO 88/01649, la solicitud de patente internacional WO 93/06213 o la solicitud de patente internacional WO 98/24884).

Como alternativa a los anticuerpos clásicos también es posible, por ejemplo, usar proteínas andamio contra IRS, p.ej. anticalinas, que están basadas en lipocalina (Beste et al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903). Los sitios de unión con ligandos naturales de las lipocalinas, por ejemplo la proteína de unión con el retinol o la proteína de unión con la bilina, pueden alterarse, por ejemplo por medio de un procedimiento de "diseño combinatorio de proteínas", de tal manera que se unan a haptenos seleccionados, en este caso a IRS (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50). Se sabe que otras proteínas andamio conocidas son alternativas a los anticuerpos para el reconocimiento molecular (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167-187).

Los LMW son moléculas que no son proteínas, péptidos anticuerpos o ácidos nucleicos, y que tienen un peso molecular menor de 5000 Da, preferiblemente menor de 2000 Da, más preferiblemente menor de 2000 Da, y aún más preferiblemente menor de 500 Da. Estos LMW pueden identificarse en procedimientos de alto rendimiento a partir de bibliotecas.

El inhibidor puede estar en forma de un extracto de un producto natural, en forma bruta o en forma purificada. El extracto puede producirse de acuerdo con procedimientos normalizados, tales como extracción en agua y/o alcohol y/o un disolvente orgánico y/o cromatografía en columna y/o precipitación a partir de una fuente animal, vegetal o microbiana, como veneno de serpiente, hojas o caldos de fermentación microbiana.

En el contexto de la presente invención, IRS y PKC-? se proporcionan, por ejemplo, en un sistema de ensayo y se ponen directa o indirectamente en contacto con un compuesto de ensayo, en particular un compuesto de ensayo bioquímico o químico, por ejemplo, en forma de una biblioteca de compuestos químicos. Después, se mide o se detecta la influencia del compuesto de ensayo sobre la fosforilación de IRS. Después de eso, se pueden analizar y/o aislar inhibidores adecuados. Para el cribado de librerías de compuestos químicos, se prefiere el uso de ensayos de alto rendimiento que son conocidos por el especialista en la técnica o que están disponibles comercialmente.

Según la presente invención, el término "librería de compuestos químicos" se refiere a una pluralidad de compuestos químicos que han sido ensamblados a partir de cualquiera de múltiples fuentes, que incluyen moléculas sintetizadas químicamente y productos naturales, o que han sido generados por técnicas de química combinatoria.

En general, la influencia del compuesto de ensayo sobre la interacción se mide o se detecta determinando el grado de fosforilación del péptido de IRS. Esto puede realizarse usando anticuerpos específicos de fósforo. Estos anticuerpos se conocen en la técnica y están disponibles, por ejemplo, en Clonetech, Santa Cruz y Cellsignal.

Como alternativa, el grado de fosforilación puede medirse usando ATP radiomarcado en el ensayo. El ATP puede marcarse con 32-P o 33-P, y la cantidad de fosfato radiactivo incorporado en el IRS puede medirse por métodos conocidos en la técnica (véase el Ejemplo 2,9.). Por ejemplo, la intensidad de una señal medida por autorradiografía puede indicar el grado de fosforilación.

Ventajosamente, el método de la presente invención se lleva a cabo en un sistema de robótica, p.ej. que incluya la preparación robótica de cultivos en placas y un sistema robótico de transferencia de líquidos, p.ej. usando sistemas microfluídicos, es decir, de estructura en canales.

En otra modalidad de la presente invención, el método se lleva a cabo en forma de un sistema de cribado de alto rendimiento. En tal sistema, ventajosamente el método de cribado está automatizado y miniaturizado, en particular usa pocilios miniaturizados y microfluídicos controlados por un robotizador.

La invención también se refiere a un método para la identificación de un agonista de IRS, que comprende las etapas de a) poner en contacto PKC-? con al menos un péptido de IRS que comprende al menos un sitio de fosforilación Ser de PKC-? en presencia de al menos un supuesto agonista que comprende al menos un sitio de fosforilación Ser de PKC-?, y b) medir la fosforilación del sitio de fosforilación Ser de PKC-? del supuesto agonista.

Para este método de la invención, con respecto a PKC-? e 1RS, se aplican las mismas modalidades que para el método descrito anteriormente.

En una modalidad preferida, el agonista en un péptido. En la técnica se conocen bibliotecas de péptidos que podrían usarse en el contexto de la presente invención.

De acuerdo con una modalidad preferida de este método de la invención, una mayor fosforilación del sitio de fosforilación Ser de PKC-? de agonista en comparación con la fosforilación del sitio de fosforilación Ser de PKC-? del péptido de IRS indica las propiedades agonistas del supuesto agonista.

La invención además se refiere a un método para la determinación de la actividad de PKC-?, que comprende las etapas de a) poner en contacto PKC-? con al menos un péptido de IRS que comprende al menos un sitio de fosforilación en Ser de PKC-? en presencia de al menos. un supuesto inhibidor, y b) medir la fosforilación del sitio de fosforilación en Ser de P C-C.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para medir la actividad de PKC-?. Este método es especialmente útil cuando tiene que medirse la actividad de PKC-? de diferentes pacientes para conseguir más información acerca del sistema de transducción de señales en pacientes, especialmente en pacientes diabéticos.

Dentro de este método de la invención, PKC-? es preferiblemente de mamífero, más preferiblemente de origen humano.

Con respecto a este método de la invención y al IRS usando en dicho método, se aplica lo mismo que para el otro método de la invención descrito anteriormente.

La invención se refiere además a un péptido de IRS-1 que comprende la Ser570, preferiblemente IRS-1449"664 como se muestra en la SEC ID N°: 17 o su homólogo humano.

Dentro de la presente invención, se ha descubierto que este péptido de la invención es especialmente útil para la identificación de análogos o inhibidores de IRS.

La invención además proporciona un kit que comprende a) al menos un péptido de IRS, b) una preparación de PKC-?, y c) al menos un supuesto inhibidor o agonista de la proteína quinasa de IRS.

Como se ha descrito anteriormente, este kit es extremadamente útil para la identificación de inhibidores de la proteína quinasa de IRS. Sus componentes individuales ya se han descrito anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un péptido de IRS-1, donde la Ser570 y/o la Ser612 están mutadas, preferiblemente a alanina. Este péptido es útil para bloquear la actividad de PKC-? in vitro o in vivo.

La invención también se refiere al uso de un péptido de IRS como se ha definido anteriormente, para la producción de anticuerpos, preferiblemente contra un sitio de fosforilación Ser de PKC-?, preferiblemente contra la Ser498, la Ser570 y la Ser612, más preferiblemente contra la Ser570. Por consiguiente, con la ayuda de los péptidos de IRS como se definen en la presente invención, es posible producir anticuerpos específicos de IRS, especialmente anticuerpos que se dirigen contra sitios de fosforilación de PKC-?. Estos anticuerpos pueden servir tanto en diagnósticos in vitro como en composiciones farmacéuticas.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un péptido de IRS como se ha definido anteriormente o de un péptido de IRS-1 con sitios Ser mutados como se ha definido anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes de tipo 2. Estos péptidos pueden inhibir la interacción entre IRS y PKC-? y, por lo tanto, pueden servir como antagonistas de la fosforilación de IRS.

Para la producción de la composición farmacéutica, los inhibidores o agonistas de la proteína quinasa de IRS como se han identificado en la presente invención o los péptidos de la presente invención normalmente se formulan con uno o más aditivos o sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como solución tampón fisiológico, por ejemplo, solución de cloruro sódico, agua desmineralizada, estabilizantes tales como inhibidores de proteasas o nucleasas, preferiblemente aprotinina, ácido e-aminocaproico o pepstatina A o agentes complejantes tales como EDTA, formulaciones de gel tales como vaselina blanca, parafina de baja viscosidad y/o cera amarilla, etc., dependiendo del tipo de administración.

Son aditivos adicionales adecuados, por ejemplo, detergentes, tales como, por ejemplo, Tritón X-100 o desoxicolato sódico, pero también polioles, tales como, por ejemplo, polietilenglicol o glicerol, azúcares, tales como, por ejemplo, sacarosa o glucosa, compuestos zwitteriónicos, tales como, por ejemplo, aminoácidos tales como glicina o en particular taurina o betaína y/o una proteína, tal como, por ejemplo, albúmina de suero bovino o humano. Se prefieren los detergentes, polioles y/o compuestos zwitteriónicos.

La solución de tampón fisiológico tiene preferiblemente un pH de aprox. 6,0-8,0, especialmente un pH de aprox. 6,8-7,8, en particular un pH de aprox. 7,4, y/o una osmolaridad de aprox. 200-400 miliosmol/litro, preferiblemente de aprox. 290-310 miliosmol/litro. El pH de la composición farmacéutica se ajusta, en general, usando un tampón orgánico o inorgánico adecuado, tal como, por ejemplo, usando preferiblemente un tampón fosfato, un tampón tris (tris(hidroximetil)aminometano), un tampón HEPES (ácido[4-(2-hidroxietil)piperazino]etanosulfónico) o un tampón MOPS (ácido 3-morfolino-1-propanosulfónico). La elección del tampón respectivo depende, en general, de la molaridad deseada del tampón. El tampón fosfato es adecuado, por ejemplo, para disoluciones para inyección o infusión.

La composición farmacéutica puede administrarse de una manera convencional, p.ej. por medio de formas de dosificación oral, tales como, por ejemplo, comprimidos o cápsulas, por medio de las membranas mucosas, por ejemplo la nariz o la cavidad oral, en la forma de depósitos implantados bajo la piel, por medio de inyecciones, infusiones o geles que contienen las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención. Además, es posible administrar la composición farmacéutica tópica y localmente, si es apropiado, en forma de complejos de liposomas. Además, el tratamiento puede llevarse a cabo por medio de un sistema terapéutico transdérmico (TTS), que hace posible una liberación temporalmente controlada de las composiciones farmacéuticas. Se conocen TTS, por ejemplo, de las solicitudes de patente europea EP O 944 398 A1 , EP 0 916 336 A1 , EP 0 889 723 A1 ó EP 0 852 493 A1.

Las soluciones para inyección se usan, en general, si sólo van a administrarse al cuerpo cantidades relativamente pequeñas de una disolución o suspensión, por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mi. Las soluciones para infusión se usan, en general, si va.a ser administrada una cantidad más grande de una disolución o suspensión, por ejemplo uno o más litros. Dado que, en contraste con la solución para infusión, sólo se administran unos pocos mililitros en el caso de soluciones para inyección, las diferencias pequeñas del pH y de la presión osmótica de la sangre o el fluido tisular en la inyección no se hacen perceptibles o sólo se hacen perceptibles en un grado insignificante con respecto a la sensación de dolor. Lá dilución de la formulación de acuerdo con la invención antes del uso no es, por tanto, necesaria en general. En el caso de la administración de cantidades relativamente grandes, sin embargo, la formulación de acuerdo con la invención debe diluirse un poco antes de la administración hasta tal punto que se obtenga una solución al menos aproximadamente isotónica. Un ejemplo de solución isotónica es una disolución de cloruro sódico de 0,9% de concentración. En el caso de la infusión, la dilución puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando agua estéril, mientras que la administración puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un llamado bypass.

La invención se refiere además a un método para la preparación de una composición farmacéutica, que comprende las etapas de: a) identificar un inhibidor o agonista de la proteína quinasa de como se ha definido anteriormente, proporcionar cantidades adecuadas del inhibidor de la proteína quinasa de IRS, y c) formular el inhibidor de la proteína quinasa de IRS en una composición farmacéutica, opcionalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención se describe adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos y figuras, que no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Materiales Los cebadores oligonucleotídicos se obtuvieron en MWG-Biotech (Ebersberg, Germany). BL21 Codon Plus y el kit de mutagénesis de localización dirigida QuikChange™ se adquirieron en Stratagene (La Jolla, CA, USA). Las células competentes One Shot TOP 10 procedían de Invitrogen (Karlsruhe, Germany). Se obtuvo un kit de minipreparación de plásmidos en Qiagen (Hilden, Germany). El antisuero policlonal anti-IRS-1 fue una donación de Dr. J. A. Maassen (Leiden, The Netherlands). El anticuerpo anti-fosfotirosina (RC20) acoplado a peroxidasa de rábano picante y el anticuerpo anti-p85a se obtuvieron en Transduction Laboratories, Inc. (Lexington, KY, USA). El anticuerpo monocional anti-^ se suministró a partir de Oncogene (Cambridge, MA, USA). El anticuerpo pS616 anti-IRS-1 procedía de Biosource (Camarillo, CA, USA). El anticuerpo IgG anti-conejo y anti-ratón conjugado con HRP como anticuerpo secundario para la detección por quimioluminiscencía aumentada (ECL) procedía de Promega Corp. (Mannheim, Germany). La proteína quinasa C de cerebro de rata (PKC-rb), la proteína quinasa C-? humana recombinante, la bisindolilmaleimida I (BIM) y el inhibidor del pseudosustrato de PKC-? se obtuvieron en Calbiochem (San Diego, CA, USA). La trombina alfa se adquirió en Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY, USA). Las enzimas para biología molecular, el cóctel inhibidor de proteasa completo y la tripsina modificada de calidad de secuenciación se obtuvieron en Roche ( annheim, Germany). El ácido okadaico, la fosfatidilserina y la aglutinina de germen de trigo (Triticum vulgaris) se adquirieron en SIGMA (München, Germany). Los péptidos de IRS-1 se sintetizaron por el Dr. Hoffmann (BMFZ, University of Dusseldorf, Dusseldorf, Germany). Los agentes químicos para SDS-PAGE, el vector de fusión génica de GST pGEX-5X-3, Glutathione Sepharose® 4B y [?-32?]??? se suministraron por Amersham Biosciences (Freiburg, Germany). El reactivo de tinción GelCode Blue, el tampón Restore™ Western Blot Stripping Buffer y el SuperSignal Substrate se obtuvieron en Pierce (Rockford, USA). Biacore X y el chip sensor CM5 son productos de Biacore (Freiburg, Germany). Todos los demás agentes químicos fueron de la mayor calidad disponible en el mercado.

Ejemplo 2 Métodos 1.) Construcción y Expresión de Proteínas de Fusión La subunidad reguladora p85a de la Pl 3-quinasa bovina clonada en el vector de expresión pGEX-2T fue una amable donación del Dr. P. Shepherd (London, UK). Se preparó una proteína de fusión de glutatión S-transferasa (GST) que contenía los aminoácidos 449-664 de IRS-1 de rata (rlRS-1449"664, Mw de 51 ,2 kDa) basándose en el método descrito por Smith y Johnson (40) usando el vector pGEX-5X-3. El ADNc de rata correspondiente se generó a partir de ARN aislado de corazón de rata por transcripción inversa usando la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar y por la posterior amplificación por reacción en cadena de la polimerasa usando la ADN polimerasa Pwo y los siguientes cebadores oligonucleotídicos: cebador 5', ATATTGTCGACCAC-ACCCCACCAGCCAGG, cebador 3', ATGTACTACTACAGAGGGTC-ACGCCGGCGTAAGAATA (SEC ID N°: 1 y 2). Los productos de PCR se aislaron, se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas y se subclonaron en pGEX-5X-3. La identidad del clon de IRS-1 de rata se verificó por análisis con endonucleasas de restricción y secuenciación de nucleótidos. Este vector y la construcción p85 -pGEX-2T se usaron para transformar Escherichia coli BL21. Las células transformadas se cultivaron hasta una ?ß?? nm de 0,6 - 0,8 en 2x medio YTA (16 g/l de triptona, 10 g/l de levadura, NaCI 5 g/l) suplementado con 0,1 mg/ml de ampicilina e inducido durante 2 h con ¡sopropil- -D-tiogalactósido (IPTG) 0,1 mM. Las proteínas de fusión se purificaron por cromatografía de afinidad en columnas de glutatión-sepharose y se eluyeron por glutatión 10 mM en Tris-HCI 50 mM (pH 8,0). La parte GST de la proteína de fusión de GST p85a se retiró proteolíticamente usando trombina bovina en PBS. La proteasa se añadió a la proteína de fusión unida a la columna de glutatión sepharose, se incubó durante 2 h a temperatura ambiente y después se recogió el eluato. La proteína se determinó usando una modificación del ensayo de proteínas Bio-Rad. Todas las proteínas de fusión de GST tenían el peso molecular esperado cuando se analizaron por eiectroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS) (PAGE). 2. ) Preparación de la Quinasa del receptor de Insulina Se retiró rápidamente hígado de rata, se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se procesó como se ha descrito (41). En resumen, se añadió 3,5 vol/peso de un tampón enfriado con hielo que consistía en Hepes 50 mM (pH 7,4), Tritón X-100 al 1% y 2x Inhibidores de Proteasa Completos y el hígado se homogeneizó usando un Ultraturrax y un homogeneizador Potter-Elvehjem, seguido de centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante resultante se agitó lentamente a temperatura ambiente durante 60 min y después se centrifugó de nuevo a 100.000 x g durante 90 minutos a 4DC. El sobrenadante después se aplicó a una columna de aglutinina de germen de trigo unida a agarosa (WGA). La columna se lavó con Hepes 50 mM (pH 7,4), Tritón X-100 al 0,1%, y las glicoproteínas unidas se eluyeron de la columna WGA con este tampón que contenía N-acetilglucosamina 0,3 M. 3. ) Ensayo de Fosforilación In vitro Para la fosforilación de rlRS-14 9"664 por el receptor de insulina, se preincubaron 5 yg de la fracción de glicoproteína purificada por WGA durante 30 minutos a 30°C con una concentración 100 nM de insulina en un tampón de fosforilación que contenía Hepes 20 mM (pH 7,4), DTT 1 mM, MgCfe 10 mM, 100 pg/ml de albúmina de suero bovino, Na3V04 0,2 mM, CaCI2 1,7 mM, 0,6 mg/ml de fosfatidilserina y 0,5 pg/ml de ácido okadaico. La autofosforílación se inició por la adición de ATP a una concentración de 50 pM y se continuó durante 10 minutos a 30 °C. Las fosforilaciones del sustrato se iniciaron por la adición de volúmenes iguales de rlRS-1449-669 (1 pg) con o sin pretratamiento (30 minutos) por las isoformas de PKC en el mismo tampón en presencia de ATP 50 pM y se dejó que continuaran durante 10 minutos a 30°C en un volumen final de 50 µ?. La reacción se terminó por la adición de 6x tampón de muestra (Tris-HCI 0,35 mM (pH 6,8), 10,28 % (p/v) de SDS, 36% (v/v) de glicerol; DTT 0,6 M, 0,012% (p/v) de azul de bromofenol) y ebullición durante 5 min. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y se analizaron por inmunodetección con un anticuerpo anti-fosfotirosina después de la transferencia a nitrocelulosa. La fosforilación en serina/treonina de Rirs-1449"664 por diferentes isoformas de PKC se evaluó incubando 1 pg de rIRS-1449"664 con 0,5 pg de PKC-rb o PKC-? en tampón de fosforilación durante 30 min a 30°C en presencia de ATP 50 µ? más 2 pCi de [?-32?]??? en un volumen de 20 pl. Las proteínas se resolvieron por SDS-PAGE y los geles teñidos y secados se sometieron a autorradiografía. Ei grado de incorporación de fosfato se determinó por recuento de Cerenkov de fragmentos escindidos. 4.) Ensayo de Retirada de GST Se incubó rlRS-1449"664 fosforilada in vitro con perlas de glutatión sepharose en un rotador durante 1 h a 4°C. Los gránulos se lavaron tres veces con tampón de unión (Tris 50 mM (pH 7,4), NaCI 150 mM, 1% (v/v) de Nonidet P-40, EDTA 1 mM, NaF 1 mM, Na3V04 1 mM). Después se añadieron 0,5 ig de p85ct recombinante y la incubación se continuó durante 2 h a 4°C. Después de lavar tres veces, las proteínas unidas se eluyeron con 20 µ? de 2x tampón de muestra y se separaron por SDS-PAGE. 5.) Inmunotransferencia Las proteínas se separaron por SDS-PAGE usando geles en gradiente de 8-18% seguido de transferencia a nitroceluiosa en un aparato de transferencia semi-seca. La membrana después se bloqueó 60 minutos en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 al 0,05% y BSA al 1 % o leche desnatada en polvo a 5% y se sometió a una sonda con los anticuerpos apropiados (anti-IRS-1 , anti-pTyr, anti-p85a). Después de un lavado extensivo, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante, se lavaron de nuevo y después las bandas proteicas se visualizaron por el método de quimioluminiscencia aumentada (ECL) en una estación de trabajo Lumilmager (Boehringer, Mannheim, Germany). Todas las manchas de transferencia se cuantificaron usando el software Lumilmager. El significado de las diferencias indicadas se evaluó usando la hipótesis nula y la estadística t para datos no emparejados. Un valor de p menor de 0,05 se consideró estadísticamente significativo. 6.) Localización de Fosfopéptido por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) y Espectrometría de Masas de Ionización por Electronebulización (ESI-MS) Usando 50 U (40 pg) de PKC-?, se fosforilaron 5 nmol de proteína rlRS-l449-664 con ATP 50 µ? más 0,25 mCi/ml de [?-32?]??? durante 60 min en las condiciones descritas anteriormente. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y la rlRS-1449"664 fosforilada se digirió con 100 pg de tripsina en las piezas de gel escindidas durante una noche a 30°C. Los péptidos se eluyeron con NH4HCO3 50 mM y acetonitrilo al 50% y se separaron en una columna de intercambio aniónico (Nucleogel SAX 1000-8/46, 50 x 4,6 mm, Macherey & Nagel, Düren, Germany) usando un sistema de liberación de disolvente de oro de Beckman. El caudal de la HPLC fue de 0,5 ml/min. Después de la inyección de la muestra, los péptidos se eluyeron empezando con 100% de tampón A (NH4CH3COOH 20 mM, pH 7,0) y 0% de tampón B (KH2P04 1 M, pH 4,0). La cantidad de tampón B se aumentó a 10% en 40 minutos y de 10 a 50% durante los siguientes 75 min. Se recogieron fracciones de 0,5 mi y se midió la radiactividad por recuento de Cerenkov. Las fracciones radiactivas se sometieron a HPLC de fase inversa. Los péptidos se separaron en una columna C18 de fase inversa (Nucleosil 300-5 C 8, 250 mm x 2 mm, tamaño de partículas 5 pm, tamaño de poros 300 A, Macherey & Nagel, Düren, Germany). El caudal de HPLC se ajustó a 0,33 ml/min. Después de la aplicación de la muestra, la elución comenzó con 100% de solución A (0,1% de TFA) y 0% de solución B (acetonitrilo/TFA (84/0,1 ; v/v)). El contenido de solución B se elevó a 100% en 120 min. Se volvió a medir la radiactividad de las fracciones recogidas. Las fracciones que contenían los péptidos radiomarcados se sometieron a espectrometría de masas ESI-TOF. Los espectros de masas se registraron en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolo de electronebulización (QSTAR Pulsar I, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) usando una fuente de nanonebulización (Protana, Odense, Denmark). Los péptidos seleccionados se analizaron en modo de espectrometría de masas en tándem y la secuencia y las modificaciones postraduccionales se recuperaron por interpretación manual. 7.) Mutagénesis de Localización Dirigida Los mutantes de la serina 570 a alanina y de la serina 612 a alanina de rlRS-1449"664 se generaron por mutagénesis de localización dirigida usando el Kit de Mutagénesis de Localización Dirigida QuikChange™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando pGEX-SX-S/rIRS-l449"664 como plantilla. Se usaron los siguientes cebadores: S570A, 5'-CCCGGCTACCGGCATGCCGCCTTCGTGCCCACC (SEC ID N°:3) y 3'-GGGCCGATGGCCGTACGGCGGAAGCACGGGTGG (SEC ID N°:4); S612A, 5'-GGCTACATGCCCATGGCTCCCGGAGTGGCTCC (SEC ID N°:5) y 3'-CCGATGTACGGGTACCGAGGGCCTCACCGAGG (SEC ID N°:6). La presencia de las mutaciones deseadas se confirmó por secuenciación de las moléculas recombinantes por Qiagen Sequencing Services (Hilden, Germany). 8.) Estudios de interacción por tecnología de resonancia de plasmón superficial El principio de operación del biosensor BIAcore™ (Biacore, Freiburg, Germany) se ha descrito previamente (42). Para evitar la interferencia de la dimerización de la parte GST de la proteína de fusión, se escindió con trombina durante la purificación. Debido a las conocidas velocidades de asociación extremadamente rápidas de los dominios SH2 a fosfopéptidos, las afinidades relativas se evaluaron por ensayo competitivo (43). Por lo tanto, se incubó una concentración constante de p85a (100 nM) en tampón de ensayo (Hepes 0,01 M pH 7,4, NaCI 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,005% de Surfactant P20 (HBS-EP)) con una concentración variable del péptido competidor (50 nM - 10 µ?), que fue idéntico al unido en la superficie del chip sensor CM5. Después de 1 h de preincubación a temperatura ambiente, las diversas mezclas después se inyectaron secuencialmente a un caudal de 5 µ?/min a 25°C en tampón HBS-EP. Los péptidos usados DDGYMPMSPGV (SEC ID N°: 7), DDGpYMPMSPGV, DDGYMPMpSPGV y DDGpYMPMpSPGV, que representan los aminoácidos 605 a 615 de IRS-1 de rata, se sintetizaron en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems modelo 433. Todos los péptidos se inmovilizaron con una concentración de 5 mg/ml en H3BO4 100 mM (NaOH pH 8,5) a 1 µ?/min por el procedimiento de acoplamiento de amina como describe el fabricante. La regeneración después de cada experimento de unión se realizó por inyección de clorhidrato de guanidina 6 M durante 2 min. El análisis cinético de la interacción de p85a con pY608 y pY606-pS612 se ha realizado usando el software BIAevaluation 3.1 (Biacore, Freiburg, Germany) y GraphPad Prism 3.0 (San Diego, CA, USA). 9.) Medición de la fosforilación en serina/treonina de rlRS-1449"664 por PKC La fosforilación en serina/treonina de rlRS-1449-66 por diferentes isoformas de PKC se evaluó pipeteando volúmenes apropiados de 1 µg de rlRS- 449"664 y 0,1 - 1 ,0 gg de PKC-? o PKC-cerebro de rata en µ? de 2x tampón de fosforilación (Hepes 20 mM (pH 7,4), DTT 1 mM, MgCI2 10 mM, 100 pg/ml de albúmina de suero bovino, Na3NO 0,2 mM, CaCI2 1 ,7 mM, 0,6 mg/ml de fosfatidilserina y 0,5 pg/ml de ácido okadaico, ATP 50 µ? + 2 µ?? [y-32P]ATP). La mezcla se ajustó con agua hasta un volumen final de 20 µ? menos el volumen de ATP necesario. Después, la reacción de fosforilación se inició por la adición de ATP desde una solución madre a una concentración final de ATP 50 µ? más 2 pCi [y-32P]ATP y se incubó durante 30 minutos a 30°C. La reacción se detuvo por la adición de 4 µ? de 6x tampón de muestra (Tris-HCI 0,35 mM (pH 6,8), 10,28 % (p/v) de SDS, 36% (v/v) de glicero!; DTT 0,6 M, 0.012% (p/v) de azul de bromofenol) y ebullición durante 5 min. Las proteínas después se resolvieron por SDS-Page y los geles teñidos y secos se sometieron a análisis por autorradiografía. Ejemplo 3 Un dominio de IRS-1 se fosforita por el receptor de insulina e iníeracciona con la Pl 3-quinasa Para determinar los efectos de la fosforilación en serina/treonina sobre la interacción de IRS-1 con el receptor de insulina y PI3-quinasa, se desarrolló un ensayo de fosforilación in vitro y de interacción con la Pl 3-quinasa usando p85 recombinante y una estrategia de retirada de GST. Se clonó una parte seleccionada de la proteína IRS-1 de rata, se expresó como una proteína de fusión de GST y se purificó a partir de E. coli. Esta proteína de fusión de GST (rlRS-1449"664) cubre un dominio de 216 aminoácidos (449-664) de la proteína IRS-1 de rata que contiene sitios de fosforilación de tirosina potenciales dentro de motivos consenso YMXM o YXXM, incluyendo los sitios de unión principales de PI3-quinasa Tyr608 y Tyr628 (39) (véase la Fig. 1). Basándose en la estructura de la proteína de fusión codificada, se calculó una masa molecular de 51 ,2 kDa y se determinó un peso aparente de 55 kDa por SDS-PAGE. El procedimiento experimental de la fosforilación in vitro y el ensayo de interacción de p85a se presenta en la Fig. 2 A. La exposición de la proteína de fusión al receptor de insulina purificado por WGA indujo una fosforilación de tirosina estimulada por insulina prominente de rlRS-1449"664 (Fig. 2 B, panel superior). La cuantificación mostró una estimulación de 8,8 ± 1 ,1 veces con respecto al nivel basal (n = 10, Fig. 2 C). El ensayo de retirada de GST reveló un aumento significativo en la interacción de la subunidad reguladora de p85a de la PI3-quinasa con la rlRS-.| 449-664 fosfor¡|acia en tirosina (Fig. 2B, panel intermedio).

Ejemplo 4 Diferentes isoformas de PKC inhiben la fosforilación de tirosina estimulada por insulina de rlRS-1449"664 y la posterior asociación con p85 .

Para evaluar si la proteína qulnasa C puede fosforilar rlRS-1 664 ¡n vitro, se incubó primero la proteína de fusión con PKC de cerebro de rata y PKC-? en presencia de [32P]ATP. Después se analizó rIRS-1449"664 por SDS-PAGE y autorradiografía (Fig. 3 A) y se hizo detectable una prominente fosforilación de rlRS-l449-664 por PKC. La proteína rlRS-1449 654 incubada con la misma cantidad de PKC en presencia de inhibidores de PKC no presentó ninguna incorporación significativa de fosfato (Fig. 3 A). Después se determinó una curva de dosis-respuesta con cantidades crecientes de PKC para establecer las condiciones de la fosforilación máxima, que se observó con 0,5 pg de PKC de cerebro de rata o PKC-? (datos no mostrados). Usando esta condición, después se investigó la influencia de la fosforilación en serina de rlRS-1449"664 sobre la posterior activación por el IR autofosforilado. Por lo tanto, rlRS-1449 664 se trató con o sin PKC y después se incubó con IR purificado por WGA. La asociación de p85a posteriormente se determinó por acoplamiento de rlRS-1449"664 a perlas de glutatión sepharose a través de su parte GST e incubación con 0,5 pg de p85oc, como se indica en la Figura 2 A. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos dirigidos contra fosfotirosina (pTyr), p85a e IRS-1. Como se muestra en la Figura 3 B, el pretratamiento de rlRS-1449"664 con PKC de cerebro de rata produjo una reducción en la fosforilación de tirosina estimulada por insulina y la interacción con p85a. La fosforilación en Tyr de rlRS-1449-664 se redujo en 27 + 4% (n = 9) con una inhibición más prominente de la asociación de p85a (49 ± 8%) (Fig. 3 C). La inhibición de PKC-rb después de la fosforilación de rlRS-1449"664 por la adición de bisindolilmaleimida (BIM) no modificó este resultado (Fig. 3 C).

Para excluir adicionalmente los efectos de PKC a nivel del IR, se examinó la autofosforilación de la subunidad ß. No fue detectable ninguna alteración significativa de la autofosforilación de IR cuando el receptor autoactivado se incubó durante 10 min a 30°C en presencia de PKC-rb o PKC-? en comparación con los controles (Fig. 4).

La estrategia experimental descrita en la Fig. 3 B después se repitió para PKC-?. Cuando se comparó con PKC-rb, se observó una reducción más prominente en la fosforilación de tirosina de rIRS-l449"664 y la interacción con p85a (Fig. 5A). La cuantificación de los datos mostró una inhibición de la fosforilación de tirosina en 46 + 5% (n = 3) y una inhibición concomitante de la unión de p85 a IRS-1 de 81 + 1% (Fig. 5 B).

Ejemplo 5 Identificación y análisis funcional de sitios de fosforilación en serina de IRS-1 dirigidos por PKC Ciertos estudios previos han indicado que la regulación negativa de la señalización de insulina por la proteína quinasa C implica la proteína quinasa activada por mitógeno y la fosforilación de la serina 612 en IRS-(26). La serina 612 se localiza en las cercanías de un motivo principal YMXM en Y608 que, según se describe, es uno de los sitios principales de interacción para la Pl 3-quinasa (39).

Se evaluó la modificación de este sitio por PKC usando un anticuerpo de fosfoserina 612 específico de IRS-1 (apS612). Después de la incubación con PKC de cerebro de rata y PKC-? durante 30 min a 30°C, la proteína rlRS-1 49-664 se sometió a una inmunotransferencia fuerte con apS612 (Figura 6A); la inhibición de PKC con BIM claramente impidió la fosforilación de esta serina.

Para caracterizar la influencia de la fosfoserina 612 de IRS-1 sobre la interacción con la Pl 3-quinasa, se usó la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR). Para este fin, se sintetizaron péptidos con la secuencia DDGYMPMSPGV (SEC ID N°:7) que representaba los aminoácidos 605 a 615 de IRS-1 de rata y se inmovilizaron en la superficie de un chip por acoplamiento de amino convencional. Se ha notificado que la fusión de dominios SH2 a GST puede afectar a su unión a fosfopéptidos conduciendo a una sobreestimación de la afinidad de unión (44). Por lo tanto, se escindió la parte de GST de la proteína de fusión de p85ot recombinante. La unión de ?85 a los péptidos se estudió aplicando diversas concentraciones de la p85<x purificada a un chip biosensor al que se acoplaron los péptidos en diferentes formas de fosforilación. Estos experimentos demostraron que p85a sólo se une a la forma fosforilada de tirosina del péptido (Fig. 6B y C), coherente con la bibliografía (45).

Después se determinó la afinidad de unión relativa de esta reacción controlando la unión de p85a 100 nM a los péptidos pY608 (DDGpYMPMSPGV) y pY608-pS612 (DDGpY P pSPGV) en presencia de péptidos solubles competitivos (Fig. 6 D, E, F). Se obtuvieron concentraciones inhibidoras semimáximas (CI50) representando la respuesta a SPR 440 s después de la inyección en equilibrio frente al logaritmo de la concentración de péptido. Los dos péptidos presentaron una actividad de unión medible (Fig. 6 D frente a 6 E). Los péptidos solubilizados inhibieron la unión de p85a a los péptidos inmovilizados a concentraciones micromolares. Se consiguió la inhibición completa a una concentración de péptido de -10 µ . El ajuste de las lecturas determinadas con una ecuación para competición de dos sitios dio como resultado una CI50 para pY608 de 0,26 µ?t???/? y 16,56 pmol/l (^=0,9983), y para pY608-pS612 de 0,15 µpt???/?, 2,88 µpt???/? (^=0,9989). Por estos datos está claro que el péptido pY608-pS612 inhibía la unión de p85a con una mejor eficacia, indicando que la presencia de un resto de fosfoserina en la posición +4 de la fosfotirosina incluso aumenta la afinidad del dominio SH2 de p85oc por el fosfopéptido de IRS-1.

Para identificar otros sitios de fosforilación por PKC-? en rlRS-1449"664 que puedan promover la inhibición de la fosforilación de tirosina estimulada por insulina en el sistema in vitro, se incubó rlRS-1449"664 con PKC-? y se separó por SDS-PAGE. La proteína rlRS-1449"664 fosforilada se digirió con tripsina y se extrajo del gel. Los péptidos generados por digestión se resolvieron por HPLC bidimensional y el contenido de radiactividad en las fracciones se controló por recuento de Cerenkov.

El perfil de HPLC de la primera separación usando una columna de intercambio aniónico mostró 6 picos principales reproducibles (Fig. 7 A). Para separar los péptidos comigratorios, se reunieron fracciones radiactivas de cada pico de acuerdo con el perfil de elución y se sometieron a HPLC de fase inversa (RP) (Fig. 7 B). Esto dio como resultado 10 fracciones de RP-HPLC radiomarcadas distintas que posteriormente se sometieron a espectrometría de masas de ionización por electronebulización (ESl-MS). Los resultados obtenidos por análisis MS se resumen en la Tabla 1. Pudieron identificarse ocho péptidos, que cubrían 37% de la secuencia de rIRS-1449"664. Se encontraron dos fosfoserinas, la serina 358 (serina 570 en IRS-1 de longitud completa) (LPGYRHpSAFVPTHSYPEEGLEMHHLER (SEC ID N°:8)) en el pico 4 de la HPLC de intercambio aniónico, y la serina 286 (serina 498) (YIPGATMGTpSPALTGDEAAGAADLDNR (SEC ID N°:9)) en los picos 5 y 6. El fosfopéptido con la serina 358/570 correspondía a aproximadamente 19% de la radiactividad incorporada. El péptido con la fosfoserina 286/498 representaba 11 % de la radiactividad medida global.

La fosfoserina 358 se identificó por ESI-MS/MS. El ion de fragmento con una diferencia de masa de 97,9 Da con el ion parental indica un fosfopéptido (Fig. 8 A). Una diferencia de masa de 97,9 Da se correlaciona con la pérdida de ácido fosfórico. El sitio de fosforilación se identificó por la pérdida del grupo fosfato (HP03) y ácido fosfórico (H3P04) de los iones de fragmento bg y b-??. Esta desfosforilación de los iones de fragmento indica que la fosforilación sólo podría tener lugar por Y355 o S358. S358 es el fosfoaminoácido, porque no se detectó desfosforilación por el ion b4, indicando una fosforilación en Y355 (datos no mostrados).

La fosfoserina 612 no pudo detectarse por espectrometría de masas a pesar de detectarse por un anticuerpo específico de fosfosito (Fig. 6 A), pero se encontró un péptido que incluía este sitio en el pico 2 junto con tres péptidos adicionales. El pico 1 y el pico 3 sólo contenían un péptido que cubría el 13% y el 21% de la radiactividad, respectivamente (THSAGTSPTISHQK y TPSQSSWSIEEY-TEMMPAAYPPGGGSGGR). (SEC ID °:10 y 11) Para confirmar adicionalmente que los sitios de fosforilación encontrados eran la serina 570 y 612, se generaron dos proteínas de fusión de GST adicionales con mutación de serina a aianina. Estas proteínas de fusión de GST se expusieron a PKC-? y se fosforilaron por la enzima a un nivel comparable al tipo silvestre (datos no mostrados). Por otra parte, la conversión de la serina 358/570 en aianina redujo en gran medida el pico 4 en HPLC de intercambio aniónico (Fig. 9 B) demostrando que la serina 570 de IRS-1 es un nuevo sitio de fosforilación dirigido por PKC-?. La mutación de serina 400/612 a aianina conduce a una reducción del pico 2 (Fig. 9 C), confirmando los datos obtenidos con el antisuero fosfoespecífico.

Ejemplo 6 Relevancia funcional de los restos de serina 570 y 612 en rIRS-14 9"664 Para determinar la relevancia funcional de los fosfositos identificados, se ensayaron los mutantes de serina 358/570 a aianina y serina 400/612 de rlRS- 4 9"664 en el ensayo de fosforilación y el ensayo de interacción de p85oc (Fig. 10 A). La comparación de los resultados de la fosforilación de tirosina por IR después del pretratamiento de PKC-? mostró una reducción comparable (30-40%) para la proteína rlRS-14 9-66 de tipo silvestre y los dos mutantes (Fig. 10 B, panel izquierdo). Sin embargo, se hizo evidente una diferencia significativa cuando se comparó la interacción de los dos mutantes con p85a. De esta manera, la unión de p85a a S570A se redujo a 43 + 4% (n = 3) del control por tratamiento con PKC-?, con una reducción a 28 ± 3% para el muíante S612A de rlRS-1449"faS4 (Fig. 10 B, panel derecho).

Las abreviaturas usadas son: GST, glutaíión S-transferasa; HPLC, cromatografía líquida de alta resolución; IR, receptor de insulina; IRS, sustrato del receptor de insulina; ESI- S, espectrometría de masas de ionización por electronebulización; p85, subunidad reguladora de fosfatidilinositol (PI)-3 quinasa; PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida; Pl 3-quinasa, fosfatid¡Iinositol-3-quinasa; RP, fase inversa; PKC, proteína quinasa C; PKB, proteína quinasa B; RTK, tirosina quinasas de receptor; SH2, dominio de homología src 2; WGA, aglutinina de germen de trigo; SDS, dodecil sulfato sódico; ECL, quimioluminiscencia aumentada.

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Figura 2: Fosforilación en tirosina de rlRS-1 e interacción con la subunidad p85a de la Pl 3-quinasa. (A) Diagrama esquemático del procedimiento experimental. Se autofosforilaron 5 pg de IR durante 10 minutos a 30°C en tampón de fosforilación después de una preincubación de 30 minutos con insulina 100 n . Posteriormente se inició la fosforilación del sustrato por la adición de IR autofosforilado a alícuotas de 1 µg de rlRS-1 49"664. La reacción continuó durante 10 minutos y después se añadieron perlas de glutatión sepharose y se incubaron muestras a 4°C en un rotador durante 1 h. Los sedimentos se lavaron tres veces con tampón de unión, se añadieron 0,5 g de p85a recombinante y la incubación se continuó durante 2 h. Después de lavar, las proteínas unidas se eluyeron por la adición de 2x tampón de muestra seguido de ebullición durante 5 minutos. (B) Las proteínas eluidas se resolvieron por SDS-PAGE y se analizaron por inmunotransferencia usando anticuerpos contra fosfotirosina, p85 e IRS-1 , como se detalla en la sección de Métodos. Se muestran manchas de transferencia de seis experimentos distintos. (C) La cuantificación de la fosforilación en tirosina de rlRS-1449-66 se obtuvo usando un software Lumi Imager. Los datos son valores medios ± SEM (n = 10).

Figura 3: Efecto de PKC de cerebro de rata sobre la fosforilación en tirosina de rIRS-1449"564 y la interacción con p85oc. (A) Se incubó 1 pg de rlRS-l449-664 con 0,5 pg de PKC de cerebro de rata (PKC-rb) o 0,5 pg de PKC-? en presencia de 2 pCi de (32P)-ATP (conc. final 50 µ?), como se detalla en la sección de Métodos. La reacción se inhibió por bisindolilmaleimida I (BIM) o péptido de pseudosustrato para PKC-rb o PKC-?, respectivamente. Las proteínas se resolvieron por SDS-PAGE y se sometieron a autorradiografía. (B) La fosforilación en tirosina de rlRS-1449 664 por IR y la interacción con p85a se determinó como se describe en la Fig. 2. rlRS-1449"664 se preincubó con 0,5 pg de PKC-rb durante 30 min. Se muestran manchas de transferencia representativas. (C) Cuantificación del efecto inhibidor de PKC-rb sobre la fosforilación de tirosina estimulada por insulina y la interacción de p85a, fijándose el valor estimulado por insulina como 100%. Cuando estuvo presente, se añadió BIM durante 10 minutos antes de empezar la fosforilación del sustrato por IR (véase la Fig. 2). Los datos son valores medios ± SEM (n = 6-9).

Figura 4: Efecto de las isoformas de PKC sobre la autofosforilación de IR. (A) Se realizó una autofosforilación de IR como se indica en la Fig. 2. Se añadió PKC-rb o PKC-? después de 10 minutos de autofosforilación y se continuó la incubación durante otros 10 minutos. Después se analizó la fosforilación en tirosina de la subunidad IR ß por inmunotransferencia. (B) La cuantificación de las manchas de transferencia se obtuvo usando el software Lumi Imager. Los datos son valores medios ± SEM (n = 4-6).

Figura 5: Efecto de PKC-? sobre la fosforilación en tirosina de rlRS-1449 664 y la interacción con p85a. (A) Se preincubó rlRS-1449"654 con PKC-? (0,5 pg) durante 30 minutos. La fosforilación de tirosina por IR y la interacción con p85oc se determinó por inmunotransferencia, como se detalla en la Fig. 2.(B). La cuantificación del efecto inhibidor de PKC-? se realizó como se describe en la Fig. 3. Los datos son valores medios + SEM (n = 3).

Figura 6: Identificación de la serina 612 de IRS-1 como diana de PKC y análisis de interacción con p85a usando resonancia de plasmón superficial. (A) Se incubaron 0,5 pg de rlRS-14 9-664 con 0,5 pg de las diferentes PKC durante 30 min a 30°C y se sometieron a inmunotransferencia con un anticuerpo contra la fosfoserina 612. Se muestra un experimento representativo. (B) Unión de p85a a péptidos inmovilizados que corresponden a los aminoácidos 605 a 615 de IRS-1 con fosfotirosina 608 o (C) sin fosfotirosina usando resonancia de plasmón superficial (pY608 -DDGpYMPMSPGV y Y608 - DDGYMPMSPGV). Las concentraciones proteicas de p85a usadas fueron (desde la inferior a la superior): 1 , 5, 10, 25, 50, 100, 250 y 500 nM. (D) Inhibición de la unión de p85 por competición con los péptidos solubles pY608 - DDGpYMPMSPGV o (E) pY608-pS612 -DDGpYMPMpSPGV. Los péptidos solubles también se inmovilizaron en el chip. (F) Se obtuvieron concentraciones inhibidoras semimáximas (C150) representando la respuesta a SPR en el equilibrio (440 s después de la inyección) frente al logaritmo de la concentración de péptido. CI50 para pY608: 0,26 pmol/l, 16,56 pmol/l y para pY608-pS612: 0,15 pmol/l, 2,88 µ mol/I.

Figura 7: Análisis por HPLC de fosfopéptidos trípticos derivados de rlRS-1449"664 fosforilado por PKC-?. Se fosforilaron cinco nanomoles de rlRS-1 49 664 durante 60 minutos usando 0,5 nmol de PKC-?. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y la rlRS-1449"664 escindida se digirió con tripsina. La mezcla de péptido radiomarcado con P recuperado se separó por intercambio iónico (A) y HPLC de fase inversa C18 (B). La radiactividad de las fracciones recogidas se determinó por recuento de Cerenkov. Después de la HPLC de fase inversa, se analizaron las fracciones radiactivas por espectrometría de masas.

Fig. 8: Espectros de ESI-MS/MS del fosfopéptido 352-378. (A) Pérdida de ácido fosfórico del ion parental [M+4H]4+ = 818,11, indicando la fosforilación. (B) Desfosforilación del ion del fragmento b9 y b-io, indicando el sitio de fosforilación.

Fig. 9: Análisis de HPLC de fosfopéptidos trípticos de rlRS-1449"664 y mutantes S570A y S6 2A. Se muestra el análisis de HPLC de péptidos trípticos generados a partir de rlRS-l449-664 de tipo silvestre (A), rlRS-1449"664 S570A (B), e rlRS-1449-664 S612A (C) fosforilado con PKC-? recombinante. Se presentan perfiles de HPLC representativos.

Figura 0: Análisis funcional de serina 570 y serina 612. (A) rlRS-1449"664 y los mutantes indicados se preincubaron con PKC-? y se sometieron a fosforilación en tirosina por IR e interacción con p85a, como se indica en la Fig. 5. Se muestran transferencias de Western representativas. (B) Las manchas de transferencia se cuantificaron usando un software Lumi Imager y los datos se expresan con respecto al valor de control estimulado por insulina fijado como 100%. Los resultados son valores medios + SEM (n = 3). LISTA DE SECUENCIAS Tabla 1 : Resultados del Análisis de la Secuencia de Fosfopéptidos de r,RS 1449-664 N°:12) GASTLTAPNGHYILSR (SEC ID 255-270 2 20,7 N°:13) 277-303 S286 5 y 6 10,6 YIPGATMGTSPALTGDEAAGAADLD R (SEC ID N°: 9). 308-321 1 12,9 THSAGTSPTISHQK (SEC ID No:10) 322-351 3 21,2 TPSQSSWSIEEYTEMMPAAYPPGGGSG GR 352-378 S358 4 18,8 (SEC ID N°: 11). LPGYRHSAFVPTHSYPEEGLEMHHLER 380-410 2 20,7 (SEC ID N°: 8) GGHHRPD S SNLHTDDGYMPMSPGVAP V 441-456 2 20,7 PS R (SEC HD 0: 14). VDPNGYMMMSPSAAAS (SEC ID N°:15) a Se analizaron los péptidos trípticos de rIRS-1 después de HPLC de intercambio aniónico y HPLC de fase inversa por espectrometría de masas. Los restos de serina fosforilados están marcados en negrita. Numeración de acuerdo con una secuencia compuesta de glutatión S-transferasa más los aminoácidos 449-664 de IRS-1. 0 Picos de HPLC de cromatografía de intercambio aniónico (números) (véase la figura 7 A). d La cantidad total de radiactividad incorporada dentro de los fosfopéptidos identificados se fijó a 100% y el porcentaje dado representa el área del pico integrada.

Claims (32)

REIVINDICACIONES

1. - Un método para la identificación de un inhibidor de la proteína quinasa de IRS, que comprende las etapas de a) poner en contacto PKC-? con al menos un péptido de IRS que comprende al menos un sitio de fosforilación en Ser de PKC-? en presencia de al menos un supuesto inhibidor, y b) medir la fosforilación del sitio de fosforilación en Ser de PKC-?.

2. - El método de la reivindicación 1 , en el que una fosforilación reducida del sitio de fosforilación Ser de PKC-? en comparación con la fosforilación en ausencia de al menos un supuesto inhibidor indica las propiedades inhibidoras del supuesto inhibidor.

3. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que PKC-? procede de un mamífero, preferiblemente de un ser humano o roedor, más preferiblemente de rata o de ser humano.

4. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido de IRS procede de un IRS, preferiblemente IRS-1 , procedente de mamífero, preferiblemente de humano o de roedor, más preferiblemente de rata.

5. - El método de la reivindicación 4, en el que el IRS-1 procede de rata y en el que dicho al menos un sitio de fosforilación Ser de PKC-? se selecciona entre el grupo consistente en Ser 458, 469, 481 , 498, 522, 526, 530, 536, 538, 539, 542, 560, 570, 577, 599, 600, 612, 620, 632, 635, 662 y 664, donde los números de la secuencia corresponden a IRS-1 de rata como se representa en la SEC ID N°:16.

6. - El método de la reivindicación 5, en el que el sitio de fosforilación de Ser de PKC-? se selecciona entre el grupo consistente en Ser498, Ser570 y Ser612, preferiblemente Ser570.

7. - El método de la reivindicación 6, en el que el péptido es Rirs-1449-664 (SEC ID N°: 17).

8. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el inhibidor se selecciona entre el grupo consistente en anticuerpos, péptidos de unión y compuestos de bajo peso molecular (LMW).

9.- Un método para la identificación de un agonista de IRS, que comprende las etapas de a) poner en contacto PKC-? con al menos un péptido de IRS que comprende al menos un sitio de fosforilación Ser de PKC-? en presencia de al menos un supuesto agonista que comprende al menos un sitio de fosforilación Ser de PKC-?, y b) medir la fosforilación del sitio de fosforilación Ser de PKC-? del supuesto agonista.

10. - El método de la reivindicación 9, en el que una mayor fosforilación del sitio de fosforilación de Ser de PKC-? del agonista en comparación con la fosforilación del sitio de fosforilación de Ser de PKC-? del péptido de IRS indica las propiedades agonistas del supuesto agonista.

11. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que la PKC-? procede de mamífero, preferiblemente de ser humano o roedor, más preferiblemente de rata.

12. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el péptido de IRS procede de un IRS, preferiblemente IRS-1, procedente de mamífero, preferiblemente de humano o de roedor, más preferiblemente de rata.

13. - El método de la reivindicación 12, en el que el IRS procede de rata y en el que dicho al menos un sitio de fosforilación Ser de PKC-? se selecciona entre el grupo consistente en Ser 458, 469, 481 , 498, 522, 526, 530, 536, 538, 539, 542, 560, 570, 577, 599, 600, 612, 620, 632, 635, 662 y 664, donde los números de la secuencia corresponden a IRS de rata como se representa en la SEC ID N°:16.

14.- El método de la reivindicación 13, en el que el sitio de fosforilación de Ser de PKC-? se selecciona entre el grupo consistente en Ser498, Ser570 y Ser612, preferiblemente Ser570.

15. - El método de la reivindicación 14, en el que el péptido es rIRS-14 9-66 (SEC ID N°: 17).

16. - Un método para la determinación de la actividad de PKC-?, que comprende las etapas de a) poner en contacto PKC-? con al menos un péptido de IRS que comprende al menos un sitio de fosforilación en Ser de PKC-? en presencia de al menos un supuesto inhibidor, y b) medir la fosforilación del sitio de fosforilación en Ser de PKC-?.

17. - El método de la reivindicación 16, en el que la PKC-? procede de mamífero, preferiblemente de ser humano o roedor, más preferiblemente de rata.

18. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, en el que el péptido de IRS procede de un IRS, preferiblemente IRS-1 , procedente de mamífero, preferiblemente de humano o de roedor, más preferiblemente de rata.

19. - El método de la reivindicación 18, en el que el IRS procede de rata y en el que dicho al menos un sitio de fosforilación Ser de PKC-? se selecciona entre el grupo consistente en Ser 458, 469, 481 , 498, 522, 526, 530, 536, 538, 539, 542, 560, 570, 577, 599, 600, 612, 620, 632, 635, 662 y 664, donde los números de la secuencia corresponden a IRS de rata como se representa en la SEC ID N°:16.

20. - El método de la reivindicación 19, en el que el sitio de fosforilación de Ser de PKC-? se selecciona entre el grupo consistente en Ser498, Ser570 y Ser612, preferiblemente Ser570.

21. - El método de la reivindicación 20, en el que el péptido es rIRS-14 MM(SEC ID N°: 17).

22. - Un péptido de IRS-1 que comprende Ser570, preferiblemente ? 49-664

23.- Un kit que comprende a) al menos un péptido de IRS, b) una preparación de PKC-?, y c) opcionalmente al menos un supuesto inhibidor o agonista de la proteína quinasa de IRS.

24. - El kit de la reivindicación 23, en el que la PKC-? procede de mamífero, preferiblemente de ser humano o roedor, más preferiblemente de rata.

25. - El kit de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 24, en el que el péptido de IRS procede de un IRS, preferiblemente IRS- , procedente de mamífero, preferiblemente de humano o de roedor, más preferiblemente de rata.

26. - El kit de la reivindicación 25, en el que el IRS procede de rata y en el que dicho al menos un sitio de fosforilación Ser de PKC-? se selecciona entre el grupo consistente en Ser 458, 469, 481 , 498, 522, 526, 530, 536, 538, 539, 542, 560, 570, 577, 599, 600, 612, 620, 632, 635, 662 y 664, donde los números de la secuencia corresponden a IRS de rata como se representa en la SEC ID N°:16.

27.- El kit de la reivindicación 26, en el que el sitio de fosforilación de Ser de PKC-? se selecciona entre el grupo consistente en Ser498, Ser570 y Ser612, preferiblemente Ser570.

28.- El método de la reivindicación 27, en el que el péptido es rlRS-1 49-66 (SEC ID N°: 17).

29. - Un péptido de IRS-1 , en el que la Ser570 y/o la Ser612 están mutadas, preferiblemente a alanina.

30. - Uso de un péptido de IRS como se define en las reivindicaciones 3 a 7 para la producción de anticuerpos, preferiblemente contra un sitio de fosforilación Ser de PKC-?, preferiblemente contra la Ser498, la Ser570 y la Ser612, más preferiblemente contra la Ser570.

31. - Uso de un péptido de IRS como se define en las reivindicaciones 3 a 7 o de un péptido de IRS-1 de la reivindicación 29 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes de tipo II.

32. - Un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende las etapas de: identificar un inhibidor o agonista de la proteína quinasa de IRS de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 15, proporcionar cantidades adecuadas del inhibidor de la proteína quinasa de IRS, y formular el inhibidor de la proteína quinasa de IRS en una composición farmacéutica, opcionalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.