JP4796490B2 - Irsプロテインキナーゼ阻害剤またはアゴニストの同定方法 - Google Patents
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Description
a)PKC−ζと、PKC−ζ−Ser−リン酸化部位を少なくとも1つ含むIRSペプチドの少なくとも1種とを、少なくとも1種の推定の阻害剤の存在下で接触させる工程、および、
b)PKC−ζ−Ser−リン酸化部位のリン酸化を測定する工程、
を含むIRSプロテインキナーゼ阻害剤の同定方法によって達成される。
a)少なくとも1つのPKC−ζ−Ser−リン酸化部位を含む推定のアゴニストの少なくとも1種の存在下で、PKC−ζと、PKC−ζ−Ser−リン酸化部位を少なくとも1つ含むIRSペプチドの少なくとも1種とを接触させる工程、および
b)推定のアゴニストのPKC−ζ−Serリン酸化部位のリン酸化を測定する工程、を含む。
a)PKC−ζを、PKC−ζ−Ser−リン酸化部位を少なくとも1つ含むIRSペプチドの少なくとも1種とを、少なくとも1種の推定の阻害剤の存在下で接触させる工程、および
b)PKC−ζ−Ser−リン酸化部位のリン酸化を測定する工程、
含む。
a)少なくとも1種のIRSペプチド、
b)PKC−ζ調製物、および
c)少なくとも1種の推定のIRSプロテインキナーゼ阻害剤またはアゴニスト、
を含む。
a)上記で定義されたIRSプロテインキナーゼ阻害剤またはアゴニストを同定する工程、
b)適量の前記IRSプロテインキナーゼ阻害剤を提供する工程、および
c)IRSプロテインキナーゼ阻害剤を、場合により製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて、医薬組成物に製剤化する工程、
を含む。
オリゴヌクレオチドプライマーを、MWG−バイオテック(MWG−Biotech,エベルスベルグ(Ebersberg),ドイツ)から得た。BL21コドン・プラス(Codon Plus)およびクイックチェンジ(QuikChange)TM部位特異的変異誘発キットを、ストラタジーン(Stratagene,ラホヤ,カリフォルニア州,米国)から購入した。ワン・ショット・トップ10(One Shot TOP10)コンピテント細胞を、インビトロジェン(Invitrogen,カールスルーエ,ドイツ)から得た。プラスミド・ミニプレップ・キットを、キアゲン(Qiagen,ヒルデン,ドイツ)から得た。ポリクローナル抗IRS−1抗血清は、J.A.マッセン博士(Dr.J.A.Maassen,ライデン,オランダ)からの寄贈品であった。ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされる抗ホスホチロシン抗体(RC20)と抗p85α抗体を、トランスダクション・ラボラトリーズ社(Transduction Laboratories,Inc.,レキシントン,ケンタッキー州,米国)から得た。モノクローナル抗IRp抗体を、オンコジーン(Oncogene,ケンブリッジ,マサチューセッツ州,米国)より購入した。抗IRS−1pS616抗体を、バイオソース(Biosource,カマリロ,カリフォルニア州,米国)から得た。エンハンスト・ケミルミネセンス(ECL)検出の二次抗体としての、HRP標識抗ウサギおよび抗マウスIgG抗体を、プロメガ社(Promega Corp.,マンハイム,ドイツ)から得た。ラット脳由来のプロテインキナーゼC(PKC−rb)、組換えヒトプロテインキナーゼC−ζ、ビスインドリルマレイミドI(BIM)、および、PKC−ζ偽基質の阻害剤を、カルバイオケム(サンディエゴ,カリフォルニア州,米国)から得た。アルファトロンビンを、アップステート・バイオテクノロジー社(Upstate Biotechnology Inc.,レイクプラシッド,ニューヨーク州,米国)から購入した。分子生物学のための酵素、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル、および、改変トリプシン(配列解析グレード)を、ロシュ(Roche,マンハイム,ドイツ)から得た。オカダ酸、ホスファチジルセリン、および、小麦胚芽アグルチニン(Triticum vulgaris)を、シグマ(SIGMA,ミュンヘン,ドイツ)から購入した。IRS−1ペプチドは、ホフマン博士(Dr.Hoffmann,BMFZ,デュッセルドルフ大学(University of Duesseldorf),デュッセルドルフ,ドイツ)によって合成された。SDS−PAGEのための化学物質、GST遺伝子融合ベクターpGEX−5X−3、グルタチオンセファロース(R)4B、および、[γ−32P]ATPを、アマシャム・バイオサイエンス(Amersham Biosciences,フライブルグ,ドイツ)から購入した。ゲルコード・ブルー(GelCode Blue)染色試薬、リストアー(Restore)TMウェスタンブロットストリッピング緩衝液、および、スーパーシグナル(SuperSignal)基質を、ピアース(Pierce,ロックフォード,米国)から得た。ビアコア(Biacore)XおよびセンサーチップCM5は、ビアコア(Biacore,フライブルグ,ドイツ)の商品である。その他全ての化学物質は、市販の最高グレードのものである。
方法1)融合タンパク質の構築および発現
発現ベクターpGEX−2TにクローニングしたウシPI3−キナーゼの調節p85αサブユニットは、P.シェパード博士(Dr.P.Shepherd,ロンドン,英国)からの親切な寄贈品であった。ラットIRS−1(rIRS−1449-664、分子量51.2kDa)のアミノ酸449-664を含むグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質を、SmithおよびJohnson(40)によって説明された方法に基づき、pGEX−5X−3ベクターを用いて製造した。対応するラットCDNAを、鳥類の骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を用いた逆転写によってラット心臓から単離されたRNAから生成し、続いて、PwoDNAポリメラーゼと、以下のオリゴヌクレオチドプライマー:5’−プライマー、ATATTGTCGACCAC−ACCCCACCAGCCAGG、3’−プライマー、ATGTACTACTACAGAGGGTC−ACGCCGGCGTAAGAATA(配列番号1および2)を用いてポリメラーゼ連鎖反応で増幅した。PCR産物を単離し、適切な制限酵素で消化し、pGEX−5X−3にサブクローニングした。ラットIRS−1クローンの同一性を、制限エンドヌクレアーゼ解析とヌクレオチド配列解析によって確認した。このベクターとp85α−pGEX−2Tコンストラクトを用いて、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)BL21を形質転換した。形質転換細胞を、0.1mg/mlアンピシリンが添加された2×YTA媒体(16g/lのトリプトン、10g/lの酵母、5g/lのNaCl)中でA600mnが0.6〜0.8になるまで成長させ、0.1mMイソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)で2時間誘導した。融合タンパク質を、グルタチオン−セファロースカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、50mMトリスHCl(pH8.0)中の10mMグルタチオンで溶出させた。p85αGST−融合タンパク質のGST部分を、PBS中で、ウシトロンビンを用いてタンパク質分解によって除去した。プロテアーゼを、グルタチオンセファロースカラムに結合した融合タンパク質に添加し、室温で2時間インキュベートし、次に、溶出液を回収した。バイオ・ラッド(Bio−Rad)タンパク質分析の改変法を用いて、タンパク質を測定した。全てのGST融合タンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって解析した際の予想分子量を有していた。
ラット肝臓を迅速に取り出し、液体窒素中で即座に凍結し、(41)で説明されているようにして加工した。簡単に言えば、50mMのHepes(pH7.4)、1%トリトン(Triton)X−100、および、2×完全プロテアーゼ阻害剤からなる、氷冷した緩衝液(3.5vol/wt)を添加し、肝臓を、UltraturraxおよびPotter−Elvehjemホモジナイザーを用いてホモジナイズし、続いて、4℃で、10,000×gで10分間遠心分離した。得られた上清を、室温で60分間ゆっくり撹拌し、次に、再度、4℃で、100,000×gで90分間遠心分離した。次に、上清を、アガロースに結合させた小麦胚芽アグルチニン(WGA)カラムにアプライした。カラムを50mMのHepes(pH7.4)と0.1%トリトンX−100で洗浄し、WGAカラムから、0.3MのN−アセチルグルコサミンを含む上記緩衝液で結合した糖タンパク質を溶出させた。
インスリン受容体によるrIRS−1449-664のリン酸化のために、WGAで精製した糖タンパク質分画(5μg)を、20mMのHepes(pH7.4)、1mMのDTT、10mMのMgCl2、100μg/mlのウシ血清アルブミン、0.2mMのNa3VO4、1.7mMのCaCl2、0.6mg/mlのホスファチジルセリン、および、0.5μg/mlのオカダ酸を含むリン酸緩衝液中の100nMのインスリンと、30℃で30分間プレインキュベートした。自己リン酸化を、濃度50μMのATPの添加により開始させ、30℃で10分間継続した。基質のリン酸化を、同じ緩衝液中で、50μMのATPの存在下でPKCアイソフォームによる前処理(30分間)を行って、または、行わないで、等量のrIRS−1449-669(1μg)を添加することによって開始させ、30℃で10分間進行させた(最終容量50μl)。6×サンプル緩衝液(0.35MのトリスHCl(pH6.8)、10.28%(w/v)SDS、36%(v/v)グリセロール;0.6MのDTT、0.012%(w/v)ブロモフェノールブルー)を添加し、5分間沸騰させたることによって反応を止めた。SDS−PAGEでタンパク質を分離し、ニトロセルロースにトランスファーした後に、抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫検出で解析した。様々なPKCアイソフォームによるrIRS−1449-664のセリン/スレオニンのリン酸化を、50μMのATPと2μCi[γ−32P]ATPの存在下で、rIRS−1449-664(1μg)と、PKC−rbまたはPKC−ζ(0.5μg)とをリン酸緩衝液中で30℃で30分間インキュベートすることによって(容積20μl)評価した。SDS−PAGEでタンパク質を解析し、染色して乾燥させたゲルをオートラジオグラフィで処理した。リン酸取り込みの程度を、切り出したフラグメントのチェレンコフカウンターによって測定した。
インビトロでリン酸化されたrIRS−1449-664を、グルタチオンセファロースビーズと、ローター上で、4℃で1時間インキュベートした。ペレットを、結合緩衝液(50mMトリス(pH7.4)、150mMのNaCl、1%(v/v)ノニデット(Nonidet)P−40、1mMのEDTA、1mMのNaF、1mMのNa3VO4)で3回洗浄した。次に、組換えp85α(0.5μg)を添加し、4℃で2時間インキュベートし続けた。3回洗浄した後に、結合したタンパク質を2×サンプル緩衝液20μlで溶出させ、SDS−PAGEで分離した。
8〜18%勾配のゲルを用いたSDS−PAGEでタンパク質を分離し、続いて、半乾性のブロッティング装置中でニトロセルロースにトランスファーさせた。次に、このメンブレンを、0.05%トゥイーン20と、1%BSAまたは5%脱脂粉乳とを含むトリス緩衝食塩水中で60分間ブロックし、適切な抗体(抗IRS−1、抗pTyr、抗p85α)で探査した。大規模に洗浄した後、このメンブレンを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体とインキュベートし、再度洗浄し、次に、タンパク質のバンドを、エンハンスト・ケミルミネセンス(ECL)法によって、ルミイメージャー・ワークステーション(Lumilmager workstation)(ベーリンガー,マンハイム,ドイツ)上で可視化した。ルミイメージャー・ソフトウェアを用いて、全てのブロットを定量した。報告された 差の有意性を、帰無仮説と、対になっていないデータに関してはt統計量を用いることによって評価した。0.05未満のp値を、統計学的に有意とみなした。
PKC−ζ50U(40μg)を用いて、上述の条件化で、5nmolのrIRS−1449-664タンパク質を、50μMのATPと0.25mCi/ml[γ−32P]ATPで、60分間リン酸化した。タンパク質を、SDS−PAGEで分離し、リン酸化したrIRS−1449-664を、切り出したゲル片中で、トリプシン100μgで30℃で一晩消化した。ペプチドを、50mMのNH4HCO3、50%アセトニトリルで溶出させ、陰イオン交換カラム(ヌクレオゲル(Nucleogel)SAX1000−8/46,50×4.6mm,Macherey&Nagel,デューレン,ドイツ)で、ベックマン(Beckman)の金溶媒デリバリーシステムを用いて分離した。HPLCの流速は、0.5ml/分であった。サンプル注入後、ペプチドを、100%緩衝液A(20mMのNH4CH3COOH、pH7.0)と0%緩衝液B(1MのKH2PO4、pH4.0)で開始させて溶出させた。緩衝液Bの量は、40分間までに10%増加させ、その後の75分間の間に10%から50%に増加させた。0.5mLの分画を回収し、放射活性を、チェレンコフカウンターで測定した。放射性の分画を、逆相HPLCで処理した。ペプチドを、C18−逆相カラム(ヌクレオシル(Nucleosil)300−5C18、250mm×2mm、粒度5μm、孔径300A、Macherey&Nagel,デューレン,ドイツ)で分離した。HPLC流速を、0.33ml/分に調節した。サンプルをアプライした後に、溶出を、100%の溶液A(0.1%TFA)と0%の溶液B(アセトニトリル/TFA(84/0.1;v/v))で開始させた。溶液Bの含量を、120分間までに100%に高めた。再度、回収された分画の放射活性を測定した。放射標識したペプチドを含む分画を、ESI−TOFマススペクトロメトリーで処理した。エレクトロスプレー四重極飛行時間型マススペクトロメトリー(QSTAR Pulsar I,アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems),フォスターシティー,カリフォルニア州,米国)上に、ナノスプレー源(プロタナ(Protana),オーデンセ,デンマーク)を用いてマススペクトルを記録した。選択されたペプチドを、タンデムマススペクトロメトリー様式で解析し、配列と翻訳後修飾をマニュアルの説明によって検索した。
rIRS−1449-664の、セリン570からアラニンへの突然変異体と、セリン612からアラニンへの突然変異体を、部位特異的変異誘発によって、クイックチェンジTM部位特異的変異誘発キットを製造元の説明書に従って用いて、テンプレートとしてpGEX−5X−3/rIRS−1449-664を用いて生成した。以下のプライマーを用いた:S570A、5’−CCCGGCTACCGGCATGCCGCCTTCGTGCCCACC(配列番号3)、および、3’−GGGCCGATGGCCGTACGGCGGAAGCACGGGTGG(配列番号4);S612A、5’−GGCTACATGCCCATGGCTCCCGGAGTGGCTCC(配列番号5)、および、3’−CCGATGTACGGGTACCGAGGGCCTCACCGAGG(配列番号6)。
これまでに、ビアコア(BIAcore)TMバイオセンサー(ビアコア,フライブルグ,ドイツ)の操作原理が説明されている(42)。融合タンパク質のGST部分の干渉性の二量体化を回避するために、精製の際にそれらをトロンビンで切断した。SH2−ドメインのホスホペプチドへの極めて迅速な会合速度がわかっているため、関連する親和性を競合分析によって評価した(43)。それゆえに、一定濃度のp85α(100nM)を、ランニング緩衝液(0.01MのHepes(pH7.4)、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、0.005%界面活性剤P20(HBS−EP))中で、CM5センサーチップ表面に結合したものと同一な競合するペプチドの濃度を様々に変えて(50nM〜10μM)インキュベートした。室温で1時間プレインキュベートした後に、様々な混合物を、HBS−EP緩衝液中で、流速5μl/分、25℃で連続的に注入した。用いられたペプチドDDGYMPMSPGV(配列番号7)、DDGpYMPMSPGV、DDGYMPMpSPGV、および、DDGpYMPMpSPGVは、ラットIRS−1のアミノ酸605〜615を示しており、これを、アプライド・バイオシステムズのモデル433ペプチドシンセサイザーで合成した。全てのペプチドを、製造元が説明しているような標準的なアミンカップリング法によって、濃度5mg/ml、100mMのH3BO4(NaOH,pH8.5)中で、1μl/分で固定した。各結合実験の後に、6M塩酸グアニジンを2分間注入することによって再生が行われた。pY608とpY606〜pS612の相互作用を用いたp85αの反応速度論解析を、BIAエバリュエーション(BIA evaluation)3.1ソフトウェア(ビアコア,フライブルグ,ドイツ)と、グラフパッド・プリズム(GraphPad Prism)3.0(サンディエゴ,カリフォルニア州,米国)を用いて行った。
様々なPKCアイソフォームによるrIRS−1449-664のセリン/スレオニンリン酸化を、適量のrIRS−1449-664(1μg)と、PKC−ζまたはPKC−ラット脳(0.1〜1.0μg)を、μlの2×リン酸緩衝液(20mMのHepes(pH7.4)、1mMのDTT、10mMのMgCl2、100μg/mlのウシ血清アルブミン、0.2mMのNa3NO4、1.7mMのCaCl2、0.6mg/mlのホスファチジルセリン、および、0.5μg/mlのオカダ酸、50μMのATP+2μCi[γ−32P]ATP)にピペッティングすることによって評価した。この混合物を、最終容積が20μlから必要なATP容積を引いた値になるように、水で調節した。次に、ストック溶液からのATPを、最終濃度50μMのATP+2μCi[γ−32P]ATPになるように添加することによってリン酸化反応を開始させ、30℃で30分間インキュベートした。6×サンプル緩衝液4μl(0.35MのトリスHCl(pH6.8)、10.28%(w/v)SDS、36%(v/v)グリセロール;0.6MのDTT、0.012%(w/v)ブロモフェノールブルー)を添加し、5分間沸騰させることによって反応を止めた。次に、このタンパク質をSDS−PAGEで解析し、染色して乾燥させたゲルを、解析のためにオートラジオグラフィで処理した。
IRS−1ドメインは、インスリン受容体によってリン酸化され、PI3−キナーゼと相互作用する
IRS−1とインスリン受容体およびPI3−キナーゼとの相互作用におけるセリン/スレオニンリン酸化の作用を決定するために、我々は、組換えp85αとGST−プルダウンアプローチを用いたインビトロでのリン酸化、および、PI3−キナーゼ相互作用分析を開発した。ラットIRS−1タンパク質の選択された部分をクローニングし、GST−融合タンパク質として発現させ、E.coliから精製した。このGST−融合タンパク質(rIRS−1449-664)は、主要なPI3−キナーゼ結合部位Tyr608およびTyr628を含むYMXMまたはYXXMコンセンサスモチーフ内に可能性のあるチロシンリン酸化部位を含むラットIRS−1タンパク質の216個のアミノ酸(449〜664)からなるドメインをカバーする(39)(図1を参照)。コードされた融合タンパク質の構造に基づき、分子量は51.2kDaと計算され、SDS−PAGEにより見かけの重量は55kDaと決定された。インビトロでのリン酸化とp85α相互作用分析の実験手順を、図2Aに示す。
様々なPKCアイソフォームが、rIRS−1 449-664 のインスリンで刺激されたチロシンのリン酸化、および、それに続くp85αへの会合を阻害する
プロテインキナーゼCが、インビトロでrIRS−1449-664をリン酸化することができる場合を評価するために、我々は、まず、融合タンパク質と、PKCラット脳およびPKC−ζとを、[32P]ATPの存在下でインキュベートした。次に、rIRS−1449-664を、SDS−PAGEとオートラジオグラフィによって解析し(図3A)、PKCによるrIRS−1449-664の顕著なリン酸化が検出可能になった。PKC阻害剤の存在下で、同量のPKCとインキュベートしたrIRS−1449-664は、顕著なリン酸取り込みを示さなかった(図3A)。次に、PKC量を高めた場合の用量応答曲線を決定し、最大リン酸化条件を確立し、最大リン酸化条件は、0.5μgのPKCラット脳またはPKC−ζで観察された(データ示さず)。この条件を用いて、次に、我々は、rIRS−1449-664のセリンリン酸化の、それに続く自己リン酸化されたIRによる活性化への影響を調査した。それゆえに、rIRS−1449-664を、PKCを用いて、または用いないで処理し、次に、WGAで精製したIRとインキュベートした。その後、p85αの会合を、rIRS−1449-664を、そのGST部分を介してグルタチオンセファロースビーズにカップリングし、p85α(0.5μg)とインキュベートすることによって測定した(概要を図2Aに示す)。サンプルを、SDS−PAGEと、ホスホチロシン(pTyr)、p85αおよびIRS−1に対する抗体と免疫ブロッティングすることによって解析した。図3Bで示されるように、PKCラット脳でのrIRS−1449-664の前処理により、インスリンで刺激されたチロシンリン酸化の減少と、p85αとの相互作用が引き起こされる。rIRS−1449-664のTyr−リン酸化の減少は、27±4%(n=9)であり、p85αの会合はより顕著な阻害を示した(49±8%)(図3C)。ビスインドリルマレイミド(BIM)の添加によるrIRS−1449-664のリン酸化後のPKC−rbの阻害は、この結果に影響を与えなかった(図3C)。
PKCによって標的化されたIRS−1のセリンリン酸化部位の同定および機能的な解析
以前の研究で、プロテインキナーゼCによるインスリンシグナル伝達の負の調節は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、および、IRS−1のセリン612のリン酸化に関与することが示されている(26)。セリン612は、Y608における主要なYMXMモチーフのすぐ隣に局在しており、これは、PI3−キナーゼの主要な相互作用部位の一つであると説明されている(39)。
rIRS−1 449-664 におけるセリン残基570および612の機能的な関連
同定されたリン酸部位の機能的な関連を決定するために、rIRS−1449-664のセリン358/570からアラニンおよびセリン400/612への突然変異体を、インビトロでのリン酸化とp85α相互作用分析で試験した(図10A)。PKC−ζで前処理した後のIRによるチロシンリン酸化の結果を比較したところ、野生型rIRS−1449-664に匹敵する減少(30〜40%)と、2種の突然変異体が示された(図10B,左のパネル)。しかしながら、2種の突然変異体とp85αとの相互作用を比較した場合、有意差が明らかになった。従って、p85αのS570Aへの結合は、PKC−ζ処理によってコントロールの43±4%(n=3)に減少し、rIRS−1449-664のS612A突然変異体に関しては28±3%に減少した(図10B,右のパネル)。
上部のパネル:関連するプレクストリン相同(PH)、および、ホスホチロシン結合(PTB)ドメインの位置は、多数のチロシンリン酸化部位を含むC末端のテールの次に示される。PI3−キナーゼ、Grb2およびSHP−2を含む可能性のある結合パートナーもまた示される。中央のパネル:既知の(S307、612、632、789)、および、可能性のあるセリンリン酸化部位は、強調表示される。下部のパネル:ラットIRS−1の、主要なPI3−キナーゼの結合部位を含むaa449-664を含むGST−融合タンパク質の構築。
(A)実験手順の概略図。IR(5μg)を、100nMインスリンで30分間プレインキュベートした後に、リン酸緩衝液中で、30℃で10分間自己リン酸化させた。その後、基質のリン酸化を、自己リン酸化されたIRをrIRS−1449-664のアリコート(1μg)に添加することによって開始させた。反応を10分間進行させ、次に、グルタチオンセファロースビーズを添加し、サンプルを、4℃で、ローター上で1時間インキュベートした。ペレットを結合緩衝液で3回洗浄し、組換えp85α(0.5μg)を添加し、インキュベートを2時間継続した。洗浄の後に、2×サンプル緩衝液を添加し、続いて5分間沸騰させることによって結合したタンパク質を溶出させた。(B)方法の章で詳述したように、溶出したタンパク質をSDS−PAGEによって解析し、ホスホチロシン、p85αおよびIRS−1に対する抗体を用いて免疫ブロッティングによって解析した。6回の独立した実験のうち代表的なブロットを示す。(C)rIRS−1449-664のチロシンリン酸化の定量化を、ルミイメージャー・ソフトウェアを用いて得た。データは平均値±SEMである(n=10)。
(A)方法において詳述したように、rIRS−1449-664(1μg)を、ラット脳由来のPKC(PKC−rb)(0.5μg)、または、PKC−ζ(0.5μg)と、2μCi(32P)−ATPの存在下(最終濃度50μM)でインキュベートした。PKC−rbまたはPKC−ζにとってそれぞれビスインドリルマレイミドI(BIM)または偽基質ペプチドによって反応を阻害させた。タンパク質をSDS−PAGEによって解析し、オートラジオグラフィで処理した。(B)IRによるrIRS−1449-664のチロシンリン酸化、および、p85αとの相互作用を、図2で説明されているようにして測定した。rIRS−1449-664を、PKC−rb(0.5μg)と30分間プレインキュベートした。代表的なブロットを示す。(C)インスリンによって刺激されたチロシンリン酸化に対するPKC−rbの阻害作用、および、インスリンで刺激された値とのp85αの相互作用の定量化を、100%と設定した。存在する場合、IRによる基質のリン酸化を開始する前に、BIMを10分間添加した(図2を参照)。データは平均値±SEMである(n=6〜9)。
(A)図2で概説されているようにして、IRの自己リン酸化を行った。10分間自己リン酸化した後に、PKC−rbまたはPKC−ζのいずれかを添加し、インキュベートをさらに10分間継続した。次に、IRのβ−サブユニットのチロシンリン酸化を免疫ブロッティングで解析した。(B)ブロットの定量化をルミイメージャー・ソフトウェアを用いて得た。データは平均値±SEMである(n=4〜6)。
(A)rIRS−1449-664を、PKC−ζ(0.5μg)と30分間プレインキュベートした。図2で概説したように、IRによるチロシンリン酸化、および、p85αとの相互作用を免疫ブロッティングで測定した。(B)図3で説明されているように、PKC−ζの阻害作用の定量化を行った。データは平均値±SEMである(n=3)。
(A)rIRS−1449-664(0.5μg)を、様々なPKC(0.5μg)と30℃で30分間インキュベートし、ホスホセリン612に対する抗体を用いて免疫ブロットした。代表的な実験を示す。(B)表面プラズモン共鳴を用いた、p85αの固定されたペプチド(ホスホチロシン608を含む、IRS−1のアミノ酸605〜615に相当する)への結合、または、(C)p85αの上記ペプチド(ホスホチロシンを含まない)への結合(pY608−DDGpYMPMSPGV、および、Y608−DDGYMPMSPGV)。用いられたp85αのタンパク質濃度は、(上から下へ):1、5、10、25、50、100、250、500nMであった。(D)可溶性ペプチドpY608−DDGpYMPMSPGVと競合させることによるp85α結合の阻害、または、(E)pY608−pS612−DDGpYMPMpSPGVと競合させることによるp85α結合の阻害。また、可溶性ペプチドも、チップに固定した。(F)半最大阻害濃度(IC50)を、SPR応答を、平衡(注入後の440s)に対する対数ペプチド濃度でプロットすることにより得た。pY608に関するIC50は、0.26μモル/l、16.56μモル/lであり、pY608−pS612に関するIC50は、0.15μモル/l、2.88μモル/lであった。
5ナノモルのrIRS−1449-664を、0.5nmolのPKC−ζを用いて60分間リン酸化した。タンパク質をSDS−PAGEで分離し、切り出したrIRS−1449-664をトリプシンで消化した。回収した32P−放射標識ペプチド混合物を、イオン交換(A)、および、C18逆相HPLG(B)で分離した。回収された分画の放射活性を、チェレンコフカウンターで測定した。逆相HPLCの後、放射性の分画をマススペクトロメトリーによって解析した。
(A)親イオンからのリン酸の損失が[M+4H]4+=818.11であることは、リン酸化を示す。(B)フラグメントイオンb9およびb10の脱リン酸化は、リン酸化部位を示す。
組換えPKC−ζでリン酸化された、野生型rIRS−1449-664(A)、rIRS−1449-664S570A(B)、および、rIRS−1449-664S612A(C)から得られたトリプシンペプチドのHPLC解析を示す。代表的なHPLCプロファイルを示す。
(A)図5で概説されているように、rIRS−1449-664、および、指定された突然変異体を、PKC−ζでプレインキュベートし、IRでのチロシンリン酸化で処理し、p85αと相互作用させた。代表的なウェスタン、ブロットを示す。(B)ルミイメージャー・ソフトウェアを用いてブロットを定量し、データを、インスリンで刺激されたコントロール値(100%と設定された)と相関させて示した。結果は平均値±SEMである(n=3)。
Claims (21)
- a)PKC−ζと、配列番号16のSer570およびSer612からなる群、または、他の種由来のIRS−1ペプチドのこれらに相当するSer残基からなる群より選択されるPKC−ζ−Ser−リン酸化部位を少なくとも1つ含むIRS−1ペプチドの少なくとも1種とを、少なくとも1種の想定される阻害剤の存在下で接触させる工程、ここで、該IRS−1ペプチドはIRS−1の断片である、および、
b)配列番号16のSer570およびSer612からなる群、または、他の種由来のIRS−1ペプチドのこれらに相当するSer残基からなる群より選択される残基において、PKC−ζ−Ser−リン酸化部位のリン酸化を測定する工程、
を含む、IRS−1プロテインキナーゼ阻害剤の同定方法。 - 少なくとも1種の想定される阻害剤の非存在下におけるリン酸化と比較して減少しているPKC−ζ−Ser−リン酸化部位のリン酸化は、想定される阻害剤の阻害特性に関する指標である、請求項1に記載の方法。
- PKC−ζは、哺乳動物由来である、請求項1または2に記載の方法。
- IRS−1ペプチドは、哺乳動物由来のIRS−1から誘導される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- IRS−1ペプチドは、rIRS−1449-664(配列番号17)である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 阻害剤は、抗体、結合ペプチド、低分子量の化合物(LMW)からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- a)PKC−ζと、配列番号16のSer570およびSer612からなる群、または、他の種由来のIRS−1ペプチドのこれらに相当するSer残基からなる群より選択されるPKC−ζ−Ser−リン酸化部位を少なくとも1つ含むIRS−1ペプチドの少なくとも1種とを、少なくとも1つのPKC−ζ−Ser−リン酸化部位を含む想定されるアゴニストの少なくとも1種の存在下で接触させる工程、ここで、該IRS−1ペプチドはIRS−1の断片である、および、
b)配列番号16のSer570およびSer612からなる群、または、他の種由来のIRS−1ペプチドのこれらに相当するSer残基からなる群より選択される残基において、想定されるアゴニストのPKC−ζ−Ser−リン酸化部位のリン酸化を測定する工程、を含む、IRS−1アゴニストの同定方法。 - IRS−1ペプチドのPKC−ζ−Ser−リン酸化部位のリン酸化と比較して増加しているアゴニストのPKC−ζ−Ser−リン酸化部位のリン酸化は、想定されるアゴニストの特性に関する指標である、請求項7に記載の方法。
- PKC−ζは、哺乳動物由来である、請求項7または8に記載の方法。
- IRS−1ペプチドは、哺乳動物由来のIRS−1から誘導される、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- IRS−1ペプチドは、rIRS−1449-664(配列番号17)である、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- a)PKC−ζと、配列番号16のSer570およびSer612からなる群、または、他の種由来のIRS−1ペプチドのこれらに相当するSer残基からなる群より選択されるPKC−ζ−Ser−リン酸化部位を少なくとも1つ含むIRS−1ペプチドの少なくとも1種とを、少なくとも1種の想定される阻害剤の存在下で接触させる工程、ここで、該IRS−1ペプチドはIRS−1の断片である、および、
b)配列番号16のSer570およびSer612からなる群、または、他の種由来のIRS−1ペプチドのこれらに相当するSer残基からなる群より選択される残基において、PKC−ζ−Ser−リン酸化部位のリン酸化を測定する工程、
を含む、PKC−ζ活性の決定方法。 - PKC−ζは、哺乳動物由来である、請求項12に記載の方法。
- IRS−1ペプチドは、哺乳動物由来のIRS−1から誘導される、請求項12または13に記載の方法。
- IRS−1ペプチドは、rIRS−1449-664(配列番号17)である、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- rIRS−1449-664(配列番号17)である、IRS−1ペプチド。
- a)rIRS−1449-664(配列番号17)であるIRS−1ペプチド、および
b)PKC−ζ調製物、を含む、IRS−1プロテインキナーゼ阻害剤またはIRS−1アゴニストを同定するためのキット。 - 少なくとも1種の想定されるIRS−1プロテインキナーゼ阻害剤またはIRS−1アゴニストをさらに含む、請求項17に記載のキット。
- PKC−ζは、哺乳動物由来である、請求項17に記載のキット。
- IRS−1ペプチドは、哺乳動物由来のIRS−1から誘導される、請求項18または19に記載のキット。
- Ser570、または、Ser570およびSer 612 がアラニンに突然変異しているIRS−1ペプチドであって、ここで、該IRS−1ペプチドは、Ser 570 およびSer 612 の少なくとも1つを含むIRS−1の断片である、IRS−1ペプチド。
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