USO DE UCLEOSIDOS 5-SUBSTITUIDOS PARA REFORZAR EL EFECTO APOPTOTICO DE FARMACOS CITOSTÁTICOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona al uso de por lo menos un inhibidor de sobre expresión de genes reparadores de ADN y/o oncogenes para producir un fármaco para incrementar el efecto apoptótico de citostáticos después de la quimioterapia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades cancerígenas en humanos son una de las causas más frecuentes de muerte y la quimioterapia es el método de tratamiento más frecuente. Las oportunidades inadecuadas para una curación por una quimioterapia son basadas en la ocurrencia de resistencias . Estas resistencias tienen su raíz en el hecho de que los citostáticos influyen en la expresión de genes y tienen un efecto genotóxico, es decir inducen mutaciones, amplificaciones y recombinaciones de genes y por lo tanto desestabilizan el genoma. En esta forma, una quimioterapia induce o selecciona células cancerígenas resistentes. Con frecuencia los oncogenes, tales como por ejemplo Ras, Bcl2, Bcr-abl, Myc, ErbB2 y otros, son afectados por tales efectos inducidos por citostáticos. La expresión regulada equivocadamente de genes junto con la reparación y recombinación de genes también contribuye a la quimioresistencia (por ejemplo el gen p53, BRCAl/2, UBE2N, REF: 167067 APEX y Rad51) , además de las enzimas las cuales metabolizan y bioactivan los citostáticos (por ejemplo DHFR, DT-diaforasa (DT-D) , o proteínas las cuales transportan los citostáticos (por ejemplo DR1) . La mayoría de los citostáticos eliminan células tumorales ya que inducen la apoptosis. La apoptosis es una forma de muerte celular programada la cual fue primero descrita en Kerr, J. F. et al., Br J Cáncer, 26(4) (1972); 239-257. En contraste a la necrosis, la apoptosis es una forma fisiológica de muerte celular. Estas dos formas de muerte celular pueden ser diferenciadas por medio de diferencias entre la necrosis y la apoptosis. La apoptosis ha definido características morfológicas y bioquímicas las cuales ocurren sucesivamente como eventos de una cascada ordenada. El proceso continuo puede ser dividido en fases. Las características morfológicas de la apoptosis son condensación de la cromatina del núcleo (cariopiknosis) , contracción del citoplasma, formación de vesículas apoptóticas y finalmente cuerpos apoptóticos . Las células tumorales pueden prevenir esto por sobreactivación de mecanismos de sobrevivencia. Los mecanismos de quimioresistencia por lo tanto también comprenden genes de acción anti-apoptótica, tales como por ejemplo STAT3 , el transductor de señal o activador de transcripción 3" activado o JUN-D. En 1995 se descubrieron efectos de hormonas específicas y nucleósidos 5-substituidos los cuales eran hasta ese momento desconocidos . Estos suprimen la amplificación SV40 en células inducida por 2-amino-6-mercaptopurina (AMP) del hámster Chino (Fahrig, R. et al., Mutat. Res., 356 (2), 1996, 217-224) y recombinación inducida por trietilenmelamina en levaduras (Fahrig, R . , Mutat Res. 372 (1), 1996, 133-139). En la Patente Europea EP 0 806 956 Bl, se describe el tratamiento de células de leucemia del ratón con nucleósidos 5-substituidos, se ha inhibido la amplificación del gen drl inducida por doxorubicina (adriamicina) y la guimioresistencia . En pruebas in vitro implementadas a la fecha, los nucleósidos 5-substituidos (es decir análogos básicos) han sido siempre aplicadas junto con uno o más citostáticos . A partir del estado de la técnica descrita hasta ahora, es el objeto de la presente invención prevenir la reducción en el efecto apoptótico provocado por la formación de resistencia o por al menos retrasarla y por lo mismo proporcionar un método de tratamiento mejorado con relación a las formas de terapia conocidas a partir del estado de la técnica. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN Este objeto se logra por el uso descrito en la reivindicación 1. Las reivindicaciones dependientes adicionales demuestran desarrollos ventajosos. De acuerdo a la invención, se hace uso de por lo menos un inhibidor de sobre expresión de gen reparador de ADN y/u oncogen para producir un fármaco para incrementar el efecto apoptótico de citostáticos después de que se proporciona la quimioterapia. Son de especial interés todos los genes reparadores de ADN UBE2N y/o APEX, de especial interés como oncogenes DDX1, STAT3 y /o JUN-D. Preferentemente, un nucleósido 5-substituido, las formas protegidas, sales o profármacos de los mismos, se usan como inhibidores de sobre expresión. Preferentemente, por lo menos un citostático junto con por lo menos un inhibidor de sobre expresión de gen reparador de ADN -y/u oncogen o un fármaco el cual contiene el inhibidor de sobre expresión es ya usado durante la quimioterapia. Se usa como nucleósido 5-substituido, (E) -5- (2-bromovinil ) -2 ' -deoxiuridina (BVDU) , las formas protectoras, sales y/o profármacos de los mismos están dispuestos para ser usados. Un ejemplo de un profármaco de BVDU de acuerdo a la invención está representado en la fórmula general I:
Preferentemente, se usa el nucleósido 5-substituido en una dosis la cual lleva a una concentración sanguínea entre 0.02 y 50 µg/ml. Sorpresivamente, es capaz de ser mostrado que, después de la terminación de la quimioterapia, si las células crecen además únicamente con nucleósidos 5-substituidos (análogos básicos) , el crecimiento de las mismas es inhibido incluso más que si ha sido continuada la quimioterapia con las citostáticos . Completamente inesperado, se incrementa el efecto de los nucleósidos 5-substituidos (análogos básicos) en lugar de reducirse . Se establece este efecto por medio de un sistema de tamizado de acuerdo la invención. Este método de tamizado se basa en el tratamiento de células tumorales durante un ciclo de quimioterapia sobre un periodo de preferentemente ocho a treinta días con dosis incrementadas de un citostático y una dosis constante del inhibidor de sobre expresión. Después de este tratamiento de combinación, se discontinúa el citostático y se continúa el tratamiento únicamente con el inhibidor de sobre expresión. Esta fase de recuperación (así llamada fase de recuperación) dura preferentemente entre 3 y 10 días. Los ciclos de quimioterapia de este tipo pueden ser implementados sucesivamente hasta 6 veces. Como resultado, se produce una constelación de formas de tratamiento la cual es sorpresiva para la persona experta en la técnica. - si se dan nucleósidos 5-substituidos , solos, no muestran efecto. - si se dan nucleósidos 5-substituidos , junto con un citostático, muestran un efecto. si · se dan nucleósidos 5 -substituidos, solos, después de que han sido dados antes junto con un citostático (fase de recuperación), muestran un efecto incrementado. El efecto, es decir la inhibición de quimioresistencia e incremento en la quimiosensibilidad, pueden ser descritos como mantenimiento atóxico de apoptosis inducido por citostáticos por influir en la expresión de genes de genes específicos. Esto toma lugar por 1. Bloqueo de "trayectorias de sobrevivencia" en la fase de recuperación. 2. Bloqueo de la reparación de ADN de enzimas asociadas.
3. Inducción de actividad de la DT-diaforas . 4. Expresión reducida de enzimas generadas por ATP en la fase de recuperación. Con respecto a 1) , los análogos básicos tales como BVDU bloquean las "trayectorias de sobrevivencia" principalmente en la fase de recuperación del cotratamiento después de la discontinuación de los citostáticos y consecuentemente cumplen el curso de la apoptosis .
Por medio de coloración doble de HOPI de células tumorales de AHl3r de la rata, es capaz de ser detectado que los citostáticos tales como doxorubicina (DOX) , mitoxantrona (MXA) o mitomicina C (MMC) inician la apoptosis. El cotratamiento con el análogo básico (E) -5- (2-bromovinil) -2'-deoxiuridina (BVDU) promueve la apoptosis por bloqueamiento de "trayectorias de sobrevivencia" anti-apoptóticas las cuales incluyen STAT3 y JUN-D. Este efecto ocurre primeramente en la fase de recuperación de las células, como puede ser visto en el Ej emplo 2. STAT3 activado constitutivamente tiene un efecto oncogénico y contribuye al desarrollo de diferentes enfermedades cancerígenas humanas . Esto ocurre por inhibición de apoptosis. En esta forma, STAT3 facilita la sobrevivencia de células tumorales y hace células resistentes a una quimioterapia . Correspondientemente, la inhibición de
"señalización STAT3" induce la apoptosis e incrementa la sensibilidad a los citostáticos. JUN-D, un miembro de la familia del gen JUN, es un componente esencial del complejo del factor de transcripción "proteína activante" (AP-1) con expresividad omnipresente. Los fibroblastos primarios JUN-D1"''"' muestran envejecimiento prematuro e incrementan la apoptosis después de la radiación UV o tratamiento de TNFa. Este resultado lleva a la suposición de que JUN-D activa la "trayectoria de sobrevivencia NfkappaB" . Adicionalmente, p202, el cual está regulado directamente por JUN-D, hace a los fibroblastos capaces de resistir la apoptosis. El cotratamiento por BVDU reduce la expresión de ambas isoformas JUN-D por aproximadamente un cuarto. En contraste, se regula STAT3 en la fase de recuperación por aproximadamente dos tercios. (Ejemplo 2) . El efecto en la fase de recuperación después del cotratamiento con mitomicina C es particularmente impresivo. Aquí, el análogo básico reduce la sobreexpresion del oncogen JUN-D al nivel de ' control (Ejemplo 2) . Con respecto a 2) , los análogos básicos tales como BVDU bloquean DDX1. DDX1 es coamplificado con MYCN y sobre expresado en neuroblastoma (NB) y líneas celulares de retinoblastoma y tumores . Los pacientes NB con amplificación de ambos DDX1 y MYCN tienen una prognosis más deficiente que los pacientes con solamente la amplificación de gen MYCN. DDX1 tiene por lo tanto potencial oncogénico. El cotratamiento de MMC con BVDU reduce la sobre expresión de UBE2N y APEX por aproximadamente un tercio. Las modificaciones de UBE2N influyen la resistencia al daño de ADN. La APEX nucleasa es una enzima reparadora de ADN. El bloqueamiento de la expresión de APEX duplica la lisis celular e incrementa los rompimientos de ADN. Con respecto a 3), BVDU induce la DT-diaforasa (Ejemplo 3) . Esta última tiene dos propiedades las cuales son importante para la quimioterapia. Activa, por una parte, los citostáticos a partir de una clase de quinonas y, por otra parte, reduce los efectos tóxicos no específicos los cuales se basan en la producción de especies reactivas a oxígeno. La ausencia del gen DT-D lleva por expresión reducida de p53 y p73 a hiperplasia mieloide y correspondientemente a proporciones de apoptosis reducidas. Esto es de acuerdo con la observación que un fenotipo de "resistencia a múltiples fármacos" multifactorial de células tumorales implica una reducción y no incremento en la expresión de DT-diaforasa. En forma interesante, la actividad de la enzima DT-D también estabiliza las poblaciones de linfocitos . Este efecto puede tener un efecto ventajoso en la estabilización del sistema inmune de pacientes durante la quimioterapia . Muchos citostáticos, tales como por ejemplo DOX y
MXA alteran el estado redox y la respiración mitocondrial de la célula cancerígena. Esto lleva a la producción de especies reactivas al oxígeno (ROS por sus siglas en inglés) . No solamente la célula cancerígena sino también otros células son afectadas por la acumulación pronta de ROS, como un resultado del cual efectos laterales indeseados ocurren durante la quimioterapia . DT-D inactiva ROS y de esta forma protege a las células de ROS no especifica y ataques electrofilicos . Como un Índice para este efecto de BVDU en la reducción de efectos laterales indeseados durante la quimioterapia, el incremento en peso de ratas tratadas con doxorubicina + BVDU pueden ser citados en el Ejemplo 4. El tratamiento con DOX solo lleva a pérdidas de peso debido a los efectos laterales tóxicos. Es cierto que solamente los efectos laterales (posiblemente la característica de cardiotoxicidad de DOX) son reducidos por BVDU pero no los efectos tóxicos en el tumor. Con respecto a 4) , por expresión alterada de diferente enzimas en la fase de recuperación, se mantiene el efecto citostático también en la ausencia de un citostático. Como puede ser visto en el Ejemplo 5, la expresión de ocho •genes es incrementada, aquella de seis genes disminuida. Los productos de genes influyen la formación de microfilamentos, diferenciación, transducción de señal y generación de ATP . El objeto de acuerdo a la invención es explicado con más detalle con referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos sin limitar el objeto de las modalidades mencionadas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el efecto de un citostático solo y en combinación con BVDU en el número de células AHR13r. La Figura 2 muestra, en comparación con la Figura 1, los resultados con la doxorubicina (DOX) , mitoxantrona ( XA) y metotrexato (MTX) . La Figura 3 muestra un análisis Western Blot para probar las "trayectorias de sobrevivencia" con doxorubicina (DOX) . La Figura 4 muestra pruebas con mitomicina (MMC) que corresponde a la Figura 3. La Figura 5 muestra los resultados de la medición de DT-diaforasa (DT-D) , doxorubicina (DOX) que ha sido usada sola o junto con BVDU. La Figura 6 muestra pruebas con metotrexato (MTX) que corresponde a la Figura 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Ejemplo 1: El tratamiento con BVDU incrementa la sensibilidad .de células de sarcoma AH13r a apoptosis inducida por quimioterapia. Este efecto es mantenido incluso después de la discontinuación del citostático en la asi llamada fase de recuperación. Se someten las células AH13r a dosis incrementadas del citostático mitomicina C (MMC) . BVDU, dado solo, muestra un efecto no tóxico. El tratamiento con MMC+ BVDU lleva, después de tres ciclos de tratamiento, a reducción en el número celular en comparación con el tratamiento con MMC solo. Este efecto inhibitorio es mantenido incluso después de la discontinuación del citostático en el siguiente ciclo, en la asi llamada fase de recuperación. Las células sin MMC y BVDU continúan creciendo sin inhibición. Sin embargo, aquellos que continúan recibiendo BVDU crecen sin inhibición. Sin embargo, aquellos los cuales continúan recibiendo BVDU son inhibidos bastante en su crecimiento (ver la Figura 1) . Se logran resultados correspondientes con metotrexato (MTX) , doxorubicina (DOX) y mitoxantrona (???) (ver Figura 2) . La indicación de que la reducción en el número celular se basa en la apoptosis, es detectada por medio de doble coloración con HoechsT 33258/yoduro de propidio (Hopi por sus siglas en inglés) . · Ejemplo 2: Se han probado diferentes "trayectorias de sobrevivencia" por medio del análisis Western Blot . Se implementan los análisis de acuerdo a los métodos estándar, como se describe en Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning (3a edición) . Las diluciones de anticuerpos: P-STAT3 (señalización celular) 1: 500, JUN-D (Santa Cruz, California) 1: 1,000. La parte superior de las dos bandas JUN-D muestra la "isoforma de longitud completa" y la banda menor la "isoforma truncada" la cual es 48 aminoácidos más corta. Ambas isoformas pueden activar la transcripción, pero la variante de "longitud completa" es más efectiva que la isoforma "truncada" (con referencia a la Figura 3) . El contenido densitométricatnente determinado de proteínas de oncogen JU -D y STAT 3 es reducido por un cuarto a dos tercios después del tratamiento con DOX en la fase de recuperación (rifase de recuperación) . En la "recuperación" solamente BVDU es dado, no citostático. Se logra un resultado correspondiente en las pruebas con mitomicina C (MMC) (ver la Figura 4) En la prueba con mitomicina C (MMC) , BVDU, dado en la "recuperación" , efectúa una inhibición completa de sobre expresión de JUN-D inducida por MMC al nivel de control. Ejemplo 3 La medición de la DT-diaforasa (DT-D) es efectuada como un dicoumarol que impide NAD (P) H: diclorofenol indofenol reductasa, como se describe en Hodnick et al., Anal. Biochem 252(1), 1997, 165-168. Se prueban extractos de un número similar de células las cuales han sido tratadas con DOX +/- BVDU para actividad de DT-D. Las células tratadas con BVDU muestran una actividad DT-D aproximadamente triplicada con relación a las células a partir del grupo de control o del grupo de células tratadas únicamente con DOX (ver la Figura 5) . Se logran resultados correspondientes con mitoxantrona (???) y metotrexato (MTX) . BVDU solo incrementa la actividad de DT-D constantemente, pero en parte solo semanalmente . Los resultados con metotrexato (MTX) y células tumorales K562 humanas son citadas en la Figura 6. MB significa MTX y BVDU. El pasaje significa dilución y conversión de las células para crecimiento adicional. La actividad DT-D relativa es ilustrada en el eje Y. Ejemplo 4 : La reducción en efectos laterales tóxicos de doxorubicina (DOX) es capaz de ser mostrada en la prueba con ratas (ver la Tabla 1) . Se tratan las ratas SD con dimetilbenzantraceno (DMBA) . Los tumores inducidos consecuentemente son inhibidos en su crecimiento por tratamiento con DOX (1 mg/kg) Durante el tratamiento y un dia después de cada tratamiento, es decir en la fase de recuperación, los animales obtienen -respectivamente 15 mg/kg BVDU. Tabla 1
E emplo 5 : Listado de proteínas influidas por el tratamiento con análogos básicos y mitomicina C. Los resultados de la implementación de una electroforesis de gel dimensional son compilados en la siguiente Tabla 2.
Tabla 2 Proteína Control DMSO BVDU solo MUERTE/H BOX 1 : DDX1 0.88 0.332 MMC solo MMC + BVDU MALATO DESHIDROGENASA, 0.418 1.359 SOLUBLE; MDH1 MIOSINA, CADENA 1 PESADA, 0.182 0.588 SIMILARIDAD NORMAL, ADULTO, MYH1 ENZIMA E2N QUE CONJUGA LA 0.669 0.178 UBIQUITNA; UBE2N ENDONUCLEASA APURlNICA: 0.363 0.14 APE; APE1 ; APEX "recuperación" MMC "recuperación" MMC + BVDU, además cultivo sin MMC y tratamiento adicional por BVDU BVDU solo FACTOR ACETILHIDROLASA 0.219 0.619 QUE SE ACTIVA POR
PLAQUETAS, ISOFORMA 1 B, ALFA-SUBUNIDAD; PAFAH1 B1 PROTEINA ESPECIFICA U5 0.2 0.523 snRNP, 116-KD HEMOGLOBINA-ALFA LOCUS; 0.088 0.502 HBB
HEMOGLOBINA-ALFA LOCUS 1 ; 0.054 0.316 HBA1 ACTINA, BETA; ACTB 0.163 0.451 Similar a BETA-ACTINA 0.096 0.357 Similar a ACTINA 0.1 12 0.398 TROPOMODULIN 2; TMD02 0.095 0.28 COMPLEJO DE SUCCINATO- 0.255 ausente DESHIDROGENASA, SUBUNIDAD A, FLAVOPROTEÍNA; SDHA COMPLEJO DE PIRUVATO 1.751 0.533 DESHIDROGENASA, E1-ALFA POLIPÉPTIDO 1 ; PDHA1 TUBULIN, BETA-5 4.705 1.553 POLI(Rc)-PROTEINA DE ENLACE 0.912 0.234 2; PCBP2 MALATO-ENZIMA 2; ME2 0.972 0.322 Inadecuada preservación del 0.374 0.119 minicromosoma 7; MITOTINA, SIMILAR AL CICLO DE CLASE
CELULAR 1 ; CDCL1 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.