MXPA05009140A

MXPA05009140A - Metodo para la deteccion de trastornos geneticos.

Info

Publication number: MXPA05009140A
Application number: MXPA05009140A
Authority: MX
Inventors: Ravinder Dhallan
Original assignee: Ravgen Inc
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2006-04-28
Also published as: EP1601785A4; WO2004078994A2; CA2517017A1; SG173221A1; WO2004078994A3; EP1601793A2; WO2004079011A1; EP1601785A1; EP1601793A4; JP2006521086A; AU2003268333A1

Abstract

La invencion proporciona un metodo util para la deteccion de trastornos geneticos. El metodo comprende determinar la secuencia de alelos de un lugar cromosomal de interes, y cuantificar la relacion para los alelos en el lugar cromosomal de interes, en donde la relacion indica la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal. La presente invencion tambien proporciona un metodo no invasor para la deteccion de anormalidades en un feto. La invencion es especialmente util como un metodo no invasor para determinar la secuencia de ADN fetal. La invencion proporciona ademas metodos para aislar el ADN libre de una muestra.

Description

METODOS PARA LA DETECCION DE TRASTORNOS GENETICOS Campo de la Invención La presente invención se dirige a un método para la detección de trastornos genéticos que incluyen anormalidades y mutaciones cromosomales . La presente invención proporciona un método rápido no invasor para determinar la secuencia de ADN de un feto. El método es especialmente útil para la detección de anormalidades cromosomales en un feto que incluye transubicaciones, transversiones, monosomías, trisomías, y otras anueplodias, eliminaciones, adiciones, amplificaciones, transubicaciones y reconfiguraciones.

Antecedentes de la Invención Las anormalidades cromosomales son responsables de una porción importante de los defectos genéticos en los humanos recién nacidos. El núcleo de una célula humana contiene cuarenta y seis (46) cromosomas que contienen instrucciones genéticas y determinan las operaciones de la célula. La mitad de los cuarenta y seis cromosomas se originan de cada padre. Excepto por los cromosomas del sexo que son bastante diferentes uno del otro en los masculinos normales, los cromosomas de la madre y los cromosomas del padre hacen un conjunto coincidente. Los pares se combinaron cuando se fertiliza el huevo por el esperma. Ocasionalmente sucede un ef: 166410 error en la formación o combinación de los cromosomas y el huevo fertilizado se forma con demasiados o muy pocos cromosomas, o con cromosomas que se mezclan de alguna manera. Debido a que cada cromosoma contiene muchos genes, es probable que las anormalidades cromosomales provoquen serios defectos al nacer, afectando muchos sistemas corporales y a menudo incluyendo una discapacidad en el desarrollo (por ejemplo, retraso mental) . Las células equivocadamente pueden volver a unirse en los extremos rotos de cromosomas, tanto espontáneamente como después de la exposición a compuestos químicos, cancerígenos, radiación. Cuando sucede la nueva unión cromosomal dentro de un cromosoma, se invierte un segmento de cromosoma entre los dos puntos de quiebre y se clasifica como un inversión. Con las inversiones no hay pérdida de material genético. Sin embargo, las inversiones puede provocar una disrupción de un gen critico o crear un gen de fusión que induce una condición relacionada con la enfermedad. En una transubicación recíproca, dos cromosomas no homólogos se rompen e intercambian fragmentos . En este escenario resultan dos. cromosomas anormales: cada uno consiste de una parte derivada del otro cromosoma y carece de una parte del mismo. Si la transubicación es de un tipo balanceado, el individuo no desplegará fenotipos anormales. Sin embargo, durante la formación de la célula germinal en individuos que soportan una transubicación, la distribución adecuada de cromosomas en el huevo, o el esperma falla ocasionalmente, resultando en una mala conducción, malformación o retraso mental de la progenie. En una transubicación Robertsoniana, los centrómeros de dos cromosomas acrocéntricos (un cromosoma con un centrómero que no se localiza centralmente) se fusionan para generar un gran cromosoma metacéntrico . El cariotipo de un individuo con una función céntrica tiene un número menor que el normal de diploides de cromosomas. Los errores que generan demasiados o muy pocos cromosomas también pueden conducir a fenotipos de enfermedad. Por ejemplo, una copia faltante del cromosoma X (monosomía X) resulta en el síndrome de Turner, mientras que una copia adicional del cromosoma 21 resulta en síndrome de Down. Otras enfermedades tales como el síndrome de Edward y el síndrome de Patau se provocan por una copia adicional del cromosoma 18 y el cromosoma 13, respectivamente. Una de las anormalidades de cromosomas más comunes se conoce como síndrome de Down. La incidencia estimada del síndrome de Down está entre 1 en 1,000 hasta 1 en 1,100 nacimientos vivos. Cada año aproximadamente de 3,000 a 5,000 niños nacen en los Estados Unidos con este trastorno cromosomal . La amplia mayoría de los niños con el síndrome de Down (aproximadamente 95 por ciento) tiene un cromosoma extra 21. Más a menudo, el cromosoma extra se origina de la madre. Sin embargo, en alrededor del 3 al 4 por ciento de las personas con síndrome de Down, una transubicación entre el cromosoma 21 y ya sea el 14 ó 22 es responsable de la anormalidad genética. Finalmente, otro problema del cromosoma, denominado mosaicismo, se nota en alrededor del 1 por ciento de los individuos con síndrome de Down. En este caso, algunas células tienen 47 cromosomas y otras tiene 46 cromosomas. El mosaicismo se piensa que es el resultado de un error en la división celular poco después de la concepción. Las anormalidades cromosomales son congénitas, y por lo tanto, se puede usar el diagnóstico prenatal para determinar la salud y condición de un feto nonato. Sin el conocimiento obtenido por el diagnóstico prenatal, habría un resultado desfavorable para el feto o la madre o para ambos. Las anormalidades congénitas representan del 20 al 25% de las muertes perinatales. Específicamente, el diagnóstico prenatal ayuda para administrar el periodo restante del embarazo, planeando complicaciones posibles con el proceso de nacimiento, preparando para problemas que puedan suceder en el infante recién nacido, y encontrado condiciones que puedan afectar embarazos futuros . Existe una diversidad de técnicas invasoras y no invasoras disponibles para el diagnóstico prenatal, que incluyen ultrasonografía, amniocentesis , muestreo de vellosidad coriónica (CVS) , células sanguíneas fetales en sangre materna, alfa fetoproteína de suero materno, beta-HCG de suero materno, y estriol de suero materno. Sin embargo, las técnicas que no son invasoras son menos específicas, y las técnicas con alta especificidad y alta sensibilidad son altamente invasoras. Además, se pueden aplicar la mayoría de la técnicas solamente durante periodos específicos de tiempo durante la preñez para una mayor utilidad.

Ultrasonografía Este es un proceso no invasor, inofensivo. Ondas de sonido de alta frecuencia se usan para generar imágenes visibles del patrón de los ecos hechos por diferentes órganos y tejidos, incluyendo el feto en la cavidad amniótica. El embrión en desarrollo se puede visualizar a alrededor de 6 semanas de gestación. Los órganos y extremidades internas principales se pueden evaluar para determinar si es que hay alguna anormalidad a alrededor de 16 a 20 semanas de gestación . Un examen por ultrasonido puede ser útil para determinar el tamaño y posición del feto, la cantidad del fluido amniótico y la apariencia de la anatomía fetal; sin embargo existen limitaciones para este procedimiento. Las anormalidades sutiles, tales como el síndrome de Down, donde a menudo no se notan las anormalidades morfológicas, sino solamente muy sutiles, no se pueden detectar en lo absoluto.

Amniocentesis Este es un procedimiento altamente invasivo en el cual una agu a pasa a través del abdomen inferior de la madre en la cavidad amniótica dentro del útero. Este procedimiento se puede efectuar a alrededor de 14 semanas de gestación. Para el diagnóstico prenatal, la mayoría de las amniocentesis se efectúan entre 14 y 20 semanas de gestación. Sin embargo, se efectúa un examen por ultrasonido, previo a la amniocentesis, para determinar la edad gestacional, la posición del feto y la placenta, y determinar si está presente suficiente fluido amniótico. Dentro del fluido amniótico están las células fetales (la mayoría derivadas de piel fetal) que pueden crecer en el cultivo para análisis cromosomales , bioquímicos y biológicos moleculares. Las anormalidades cromosomales, grandes tales como cromosomas extras o faltantes o fragmentos de cromosomas, se pueden detectar por la formación de cariotipos, lo cual involucra la identificación y análisis de todos los 46 cromosomas de una célula y los configura con sus pares coincidentes, con base en las diferencias sutiles en tamaño y estructura. En este despliegue sistemático, son evidentes las anormalidades en el número y estructura de cromosomas . Este procedimiento toma típicamente de 7 a 10 días para su terminación. Aunque la amniocentesis se puede usar para suministrar información genética directa, se asocian riesgos con el procedimiento que incluye la pérdida fetal y la sensibilización materna al Rh. El riesgo creciente de mortalidad fetal que sigue a la amniocentesis es de alrededor de 0.5% arriba de lo que se esperaría normalmente. Las madres con Rh negativo se pueden tratar con RhoGam. uestreo de Vellosidad Coriónica (CVS) En este procedimiento, se pasa un catéter por medio de la vagina a través de la cuello del útero y dentro del útero a la placenta en desarrollo con una guía de ultrasonido. La introducción del catéter permite que la célula de las vellosidades coriónicas de la placenta se obtengan y sean analizadas por un diversidad de técnicas, incluyendo el análisis de cromosomas para determinar el cariotipo del feto. También se pueden cultivar las células para análisis biológicos, moleculares o bioquímicos. Típicamente, se efectúa el CVS entre la 9.5 y 12.5 semanas de gestación. El CVS tiene la desventaja de ser un procedimiento invasor, y tiene una tasa baja pero importante de morbilidad para el feto; esta relación de pérdida es de alrededor de 0.5 a 1% superior que para las mujeres que se someten a amniocentesis. Muy raramente, se puede asociar el CVS con defectos en las extremidades en el feto. También, está presente la posibilidad de sensibilización materna al Rh. Además, existe también la posibilidad que sean muestreadas células de sangre materna en la placenta en desarrollo, en lugar de las células fetales y confundir el análisis de los cromosomas .

Fetoproteína alfa de suero materno (MSAFP) El feto en desarrollo tiene dos principales proteínas de sangre, albúmina y fetoproteína alfa (AFP) . La madre tiene típicamente sólo la albúmina en su sangre, y así, la prueba MSAFP se puede usar para determinar los niveles de AFP del feto. Ordinariamente, sólo una cantidad pequeña de AFP tiene acceso al fluido amniótico y atraviesa la placenta hasta la sangre de la madre. Sin embargo, si el feto tiene un defecto en el tubo neural , entonces más AFP escapa dentro del fluido amniótico. Los defectos del tubo neural incluyen anencefalia (falla de cierre en la terminación craneal del tubo neural) y espina bífida (falla del cierre en la terminación caudal del tubo neural) . La incidencia del tales defectos es de alrededor de 1 a 2 nacimientos por cada mil en los Estados Unidos. También, si hay defectos en la pared abdominal fetal, el AFP del feto se irá a la sangre materna en mayores cantidades. La cantidad de MSAFP se incrementa con la edad gestacional, y así para que la prueba MSAFP proporcione resultados precisos, la edad gestacional se debe reconocer con certidumbre. También, la raza de la madre y la presencia de diabetes gestacional pueden tener influencia en el nivel de MSAFP que se va a considerar normal . La MSAFP se reporta típicamente como múltiplos de la media (MoM) . Entre mayor el MoM, más probable que esté presente un defecto. La prueba de MSAFP tiene la mayor sensibilidad entre 16 y 18 semanas de gestación, pero se puede usar entre 15 y 22 semanas de gestación. La MSAFP tiende a ser inferior cuando está presente el síndrome de Down u otras anormalidades cromosomales . Aunque la prueba MSAFP no es invasora, la MSAFP no es 100% específica. La MSAFP se puede elevar por una diversidad de razones que no se relacionan con el tubo neural fetal o los defectos de la pared abdominal . La causa más común para una MSAFP elevada es una estimación equivocada de la edad gestacional del feto. Por lo tanto, los resultados de una prueba MSAFP nunca se consideran como definitivos y conclusivos.

Beta-HCG de suero materno . Al comenzar alrededor de una semana después de la concepción e implante del embrión en desarrollo en el útero, el trofoblasto producirá beta-HCG detectable (la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana) , que se puede usar para diagnosticar el embarazo. La beta-HCG también se puede cuantificar en el suero materno, y esto puede ser útil al principio en el embarazo, cuando se sospecha de una amenaza de aborto o un embarazo ectópico, debido a que la cantidad de beta-HCG será menor que lo normal. A la mitad hasta el final del segundo trimestre, la beta-HCG se puede usar en conjunto con la SAFP para seleccionar la anormalidades cromosomales , en particular para el síndrome de Down. Una beta-HCG elevada acoplada con una MSAFP disminuida sugiere síndrome de Down. Los altos niveles de HCG sugieren enfermedad trofoblástica (embarazo molar) . La ausencia de un feto en la ultrasonografía junto con una HCG elevada sugiere una mole hidatidiforme .

Estriol de suero materno La cantidad de estriol en el suero materno depende de un feto viable, una placenta que funcione adecuadamente y un bienestar maternal . La deshidroepiandrosterona (DHEA) se hace por glándulas adrenales fetales, y se metabolizan en la placenta hacia el estriol. El estriol entra a la circulación materna y se excreta por el riñón materno en la orina o por el hígado materno en la bilis. Los niveles normales de estriol, medidos al tercer bimestre, darán una indicación de un bienestar general del feto. Si cae el nivel del estriol, entonces el feto se amenaza y pueden ser necesario el alumbramiento inmediato. El estriol tiende a disminuirse cuando está presente el síndrome de Down y cuando hay hipoplasia adrenal con anencefalia.

La prueba de selección triple La prueba de selección triple comprende el análisis de la alfa fetoproteína de suero materno (MSAFP) , gonadotropina coriónica humana (hCG) y estriol no conjugado (uE3) . La prueba de sangre se efectúa usualmente de 16 a 18 semanas después del último periodo menstrual. Aunque la prueba de selección triple no es invasora, los resultados de prueba anormales no son indicadores de un defecto de nacimiento. Más bien, la prueba solamente indica un riesgo creciente y sugiere que se necesita una prueba adicional. Por ejemplo, 100 de cada 1,000 mujeres tendrán un resultado anormal de la prueba de selección triple. Sin embargo, solamente de 2 a 3 de las 100 mujeres tendrán un feto con defecto de nacimiento. Esta alta incidencia de falsos positivos provoca una tremenda tensión y ansiedad innecesaria a la madre en espera.

Células Fetales Aisladas de la Sangre Materna. La presencia de células nucleadas fetales en la sangre materna hace posible el uso de estas células para un diagnóstico prenatal no invasor (Walknowska, et al., Lancet 1: 1119-1122, 1969; Lo et al., Lancet 2: 1363-65, 1989; Lo et al., Blood 88: 4390-95, 1996). Se pueden seleccionar y analizar la células fetales por una diversidad de técnicas para buscar secuencias particulares de ADN (Bianchi et al . , Am. J. Hum. Genet . 61:822-29, (1997); Bianchi et al., PNAS 93: 705-08, (1996)). La hibridación por fluorescencia in situ (FISH) es una técnica que se puede aplicar para identificar cromosomas particulares de las células fetales recuperadas de la sangre materna, y diagnosticar condiciones aneuploides tales como trisomías y monosomía X. También, se ha reportado que diversas células fetales en la sangre materna se incrementan en los embarazos aneuploides . El método de FISH utiliza sondas de ADN etiquetadas con etiquetas fluorescentes coloreadas que permiten la detección de cromosomas o genes específicos bajo un microscopio. Al usar FISH, las anormalidades genéticas sutiles que no se pueden detectar por formación de cariotipos estándar se identifican fácilmente. Este procedimiento toma típicamente de 24 a 48 horas para terminar. Adicionalmente, al usar un panel de sondas FISH de ADN multicoloreadas , se pueden observar los números de copias de cromosomas anormales . Aunque se han hecho mejoras para el aislamiento y enriquecimiento de las células fetales, todavía es difícil obtener muchas células sanguíneas fetales . Puede no ser suficiente para determinar las anomalías de manera confiable del cariotipo fetal o el ensayo para otras anormalidades. Además, la mayoría de las técnicas que consumen tiempo requieren altas cantidades de mano de obra, y son difíciles de implementar en un forma de alta producción.

ADN fetal de sangre materna . Se ha detectado y cuantificado el ADN fetal en el plasma y un suero materno (Lo, et al., Lancet 350:485-487 (1997); Lo et al., Am. J. hum. Genet . 62: 768-775 (1998)). Los tipos múltiples de células fetales se presentan en la circulación materna, incluyendo los granulocitos fetales, linfocitos, células nucleadas de glóbulos rojos, y células de trofoblastos (Pertl and Bianchi, Obstetrics and Gynecology 98: 483-490 (2001)). Se puede detectar el ADN fetal en el suero a la séptima semana de gestación, y se incrementa con el final del embarazo. El ADN fetal presente en el suero fetal materno y el plasma, se comparan con la concentración de ADN obtenido de protocolos de aislamiento de células fetales . El ADN fetal en circulación se ha usado para determinar el sexo del feto (Lo, et al., Lancet 350:485-487 (1997); Lo et al., Am. J. hum. Genet. 62: 768-775 .(1998)). También, se ha detectado el genotipo D del resus fetal usando ADN fetal. Sin embargo, el diagnóstico y las aplicaciones clínicas del ADN fetal en circulación se limitan a los genes que están presentes en el feto pero no en la madre (Pertl and Bianchi, Obstetrics and Gynecology 98: 483-490 (2001)). Así, todavía existe la necesidad de un método no invasor que pueda determinar la secuencia de ADM fetal y proporcione un diagnóstico definitivo de las anormalidades cromosomales en un feto .

Breve Descripción de la Invención La invención se dirige a un método para la detección de trastornos genéticos que incluye mutaciones y anormalidades cromosomales.- En una modalidad preferida, la presente invención se usa para detectar mutaciones y anormalidades cromosomales que incluyen pero no se limitan a la transubicación, transversión, monosomía, trisomías y otras aneuplodias, eliminación, adición, amplificaciones, fragmentos, transubicación y reconfiguración. Se pueden detectar _ simultáneamente diversamente anormalidades. La presente invención también proporciona un método no invasor para determinar la secuencia del ADN fetal de una muestra de un sujeto femenino con preñez. La presente invención se puede usar para detectar cualquier alteración en la secuencia de genes en comparación con la secuencia de tipo silvestre, que incluye pero no se limita a, mutaciones de punto, -cambios en la estructura de lectura, transición, transversión, adición, inserción, eliminación, adición-eliminación, cambios de estructura, sentido equivocado, mutación inversa y alteración de microsatélite . La presente invención también proporciona un método para aislar el ácido nucleico libre de una muestra que contiene ácido nucleico. En una modalidad, la presente invención se dirige a un método para la detección de anormalidades cromosomales , el método comprende: (a) determinar la secuencia de los alelos de un lugar cromosomal de interés en el ADN de plantilla, y (b) cuantificar una relación para los alelos en un lugar cromosomal de interés heterocigótico que se identificó del lugar cromosomal de interés de (a) , en donde la relación indica la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal.

En otra modalidad la presente invención proporciona un método no invasor para determinar la secuencia de un lugar cromosomal de interés en el ADN fetal, el método comprende: (a) obtener un muestra de un sujeto femenino con preñez (b) agregar un inhibidor de la lisis de células, un estabilizador de membrana celular, o un reticulante a la muestra de (a) ; (c) obtener el ADN de plantilla de la muestra de (b) , en donde el ADN de plantilla comprende el ADN fetal y ADN materno; y (d) determinar la secuencia de un lugar cromosomal de interés en el ADN de plantilla. En otra modalidad, el ADN de plantilla se obtiene a partir de una muestra que incluye pero no se limita a una célula, tejido, sangre, suero, plasma, saliva, orina, lágrimas, secreción vaginal, sudor, sangre del cordón umbilical, vellosidades coriónicas, fluido amniótico, tejido embriónico, embriones, un embrión de dos células, un embrión de cuatro células, un embrión de ocho células, un embrión de 16 células, un embrión de 32 células, un embrión de 64 células, un embrión de 128 células, un embrión de 256 células, un embrión de 512 células, un embrión de 1024 células, fluido linfático, fluido cerebro espinal, secreción mucosa, fluido peritoneal, fluido ascitico, materia fecal o exudado del cuerpo. En una modalidad, se obtiene el ADN de plantilla a partir de una muestra de un sujeto femenino con preñez. En una modalidad preferida, el ADN de plantilla se obtiene de una mujer humana embarazada. En otra modalidad, el ADN de plantilla se obtiene de un embrión. En una modalidad preferida el ADN de plantilla se obtiene de una célula sencilla de un embrión. En otra modalidad, se agrega un inhibidor de lisis celular a la muestra que incluye pero no se limita a, formaldehído , y derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehído, y derivados de glutaraldehído, reticulantes, reticulantes reactivos de amina primaria, reticulantes reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de bisulfuro, reticulantes reactivos de carbohidrato, reticulantes reactivos de carboxilo, reticulantes fotorreactivos, reticulantes desdobables AEDPM APG, BASED, BM(PE0)3, BM(PEO)4, BMB, BMDB, B H, BMOE, BS3 , BSOCOES, DFDNB, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, o sulfo-EGS o los compuestos enlistados en la Tabla XXIII . En una modalidad preferida, la formalina está presente en la muestra a un porcentaje que incluye, pero no se limita a, 0.0001-0.03%, 0.03-0.05%, 0.05-0.08%, 0.08-0.1%, 0.1-0.3%, 0.3-0.5%, 0.5-0.7%, 0.7-0.9%, 0.9-1.2%, 1.2-1.5%, 1.5-2%, 2-3%, 3-5%, y más del 5%. Un agente que estabiliza las membranas celulares que puede agregarse a la muestra de sangre maternal para reducir la lisis celular maternal incluye, pero no se limita a, aldehidos, formaldehido urea, formaldehído fenol, DMAE (dimetilaminoetanol), colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol, sacarosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, isómero ? de fenilacetato de hopano tetral , isómero B de fenilacetato de hopano tetral, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoina, perftoran, polivinilpirrolidona. fosf tidilserina, tegretol, PABA, cromglicato de disodio, nedocromil de sodio, feniltoina, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio, o polaxámero 188. En otra modalidad, un agente que evita la destrucción del ADN se agrega a la muestra que incluye pero no se limita a, inhibidores de la DNasa, cloruro de zinc, ácido etilendiamintetracético, guanidina-HCI , isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y Na-dodecilsulfato . En una modalidad preferida, se obtiene el ADN de plantilla del plasma de la sangre de un sujeto femenino con preñez. En otra modalidad, se obtiene el ADN de plantilla del suero de la sangre de un sujeto femenino con preñez. En otra modalidad, el ADN plantilla comprende ADN fetal y ADN maternal . En otra modalidad, el lugar cromosomal de interés en el ADN de plantilla se selecciona de un lugar cromosomal de interés homocigótico materno. En otra modalidad, el lugar cromosomal de interés en el ADN de plantilla se selecciona de un lugar cromosomal de interés heterocigótico materno. En otra modalidad, el lugar cromosomal de interés en el ADN de plantilla se selecciona de un lugar de interés homocigótico paterno. En otra modalidad el lugar cromosomal de interés en el ADN de plantilla se selecciona del lugar cromosomal de interés heterocigótico paterno. En una modalidad, la secuencia de alelos de los lugares cromosórnales de interés múltiples en un cromosoma sencillo se determinan. En una modalidad, preferida la secuencia de alelos en los lugares cromosomales de interés múltiples, en los cromosomas múltiples se determina. En otra modalidad, la determinación de la secuencia de alelos de un lugar cromosomal de interés comprende un método que incluye pero no se limita a PCR específica de alelo, electroforesis de gel, ELISA, espectrometría de masas, hibridación, extensión del cebador, polarización de fluorescencia, detección de fluorescencia, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) , formación de secuencias, microconfiguración de ADN, SNP-IT, microplaquetas de genes, HuSNP, configuración de perlas, ensayo TaqMan, ensayo Invader, extensión de masa, método MassCleave® (hMC) , inmunotransferencia Southern, inmunotransferencia de ranura, inmunotransferencia de punto y espectrometría de masas MALDI-TOF. En una modalidad, preferida la determinación de la secuencia de alelo de un lugar cromosomal de interés comprende (a) amplificar el lugar cromosomal de interés usando un primero y segundos cebadores, en donde el segundo cebador contiene un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción que genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés; (b) digerir el ADN amplificado co la enzima de restricción que reconoce el sitio de reconocimiento en el segundo cebador; (c) incorporar un nucleótido dentro del ADN · digerido de (b) al usar la colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés como una plantilla; y (d) determinar la secuencia del lugar cromosomal de interés al determinar al secuencia del ADN de (c) . En una modalidad, la amplificación puede comprender la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . En una modalidad adicional, la temperatura de combinación de los pares base para el ciclo 1 de PCR puede ser alrededor de la temperatura de fusión de la longitud de combinación de los pares base de un segundo cebador. En otra modalidad, la temperatura de combinación de los pares base para el ciclo 2 de PCR puede ser alrededor de la temperatura de fusión de la región 3', la cual combina los pares base al ADN de plantilla del primer cebador. En otra modalidad la temperatura de combinación de los pares base para los ciclos restantes puede ser alrededor de la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador. En otra modalidad, un sitio de reconocimiento en el segundo cebador es para una enzima de restricción que corta el ADN a una distancia desde su sitio de enlace y genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés. En una modalidad preferida, el sitio de reconocimiento en el segundo cebador es para una enzima de restricción de tipo IIS. La enzima de restricción de tipo IIS incluye pero no se limita a Alw I, Alw26 I, Bbs I, Bbv I, Bce ? I, Bmr I, Bsa I, Bst71 I, BsmA I, BsmB I, BsmF I, BspM I, Ear I, Fau I, Fok I, Hga I, Pie I, Sap I, SSfaN I, y Sthi32 I y más preferiblemente BceA I y BsmF I . En una modalidad, la terminación 3' del segundo cebador es adyacente al lugar cromosomal de interés . En otra modalidad, la longitud de combinación de los pares base del segundo cebador se selecciona del grupo que consiste de 35-30, 30-25, 25-20, 20-15, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, y menos de 4 bases. En otra modalidad, la amplificación de un lugar cromosomal de interés comprende el uso del primero y segundos cebadores que contienen una porción de un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, en donde el sitio de reconocimiento contiene al menos un nucleótido variable, y después de la amplificación se genera el sitio de reconocimiento completo de la enzima de restricción, y la región 3' de los cebadores puede contener la no coincidencia con el ADN de plantilla, y la digestión con la enzima de restricción genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés . En una modalidad preferida, el sitio de reconocimiento para las enzimas de restricción incluye pero no se limitan a BsaJ (S'C^CNNGG 3'), BssK KS'^CCNGG 3'), DdeKS'C" TMAG 3'), EcoNI (5'CCTNN½NNAGG 3') ,. Fnu4HI (5'GC4 NGC 3'), Hinfl (5'Gl ANTC 3'), PflF (5'GACN½NGTC 3'), Sau96I (S'G^NCC 3'), ScrFI (5' CC½GG 3'), Thtlll (5' GACN½NGTC 3'), y más preferiblemente Fnu4HI y EcoNI, se generan después de la amplificación. En otra modalidad, la región 5' del primero y/o segundo cebador contiene un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción. En una modalidad preferida el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción es diferente del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción que genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés . En un modalidad adicional , el método de la invención comprende además la digestión del ADN con una enzima de restricción que reconoce el sitio de reconocimiento en la región 5' del primero y/o segundo cebador. El primero y/o segundo cebador pueden contener una etiqueta en la terminación 5' . Preferiblemente, el primer cebador contiene una etiqueta en la terminación 5' . La etiqueta se puede usar para preparar el ADN amplificado del ADN de plantilla. La etiqueta se puede usar para separar el ADN amplificado que contiene el nucleotido etiquetado del ADN amplificado que no contiene el nucleotido etiquetado. La etiqueta puede ser cualquier porción química que incluye pero no se limita a radioisótopo, molécula reportera fluorescente, molécula reportera quimioluminiscente, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, hapteno, biotina, derivado de biotina, fotobiotina, iminobiotina, digoxigenina, avidina, enzima, acridinio, azúcar, enzima, apoenzima, oligonucleótido homopolimérico, hormona, porción ferromagnética, porción paramagnética, porción diamagnética, porción fosforescente, porción luminiscente, porción electroquimioluminiscente, porción cromática, porción que tiene una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica, o conductividad eléctrica, o combinaciones de los mismos. Preferiblemente, la etiqueta es biotina. La etiqueta de biotina se usa para separar el ADN amplificado del ADN de plantilla usando una matriz de estreptavidina . La matriz de estreptavidina se recubre en los pozos de una placa de microtitulación. La incorporación de un nucleótido en el método de la invención es por una polimerasa de ADN que incluye pero no se limita a la polimerasa de ADN de E.coli, fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN de E.coli, T7 ADN polimerasa, T4 ADN polimerasa, T5 ADN polimerasa, polimerasas de la clase Klenow, Taq polimerasa, Pfu ADN polimerasa, polimerasa Vent, bacteriófago 29, polimerasa de ADN genómico REDTaq™, o secuenasa. La incorporación de un nucleótido puede además comprender el uso de una mezcla de nucleotidos etiquetados y no etiquetados. Un nucleótido, dos nucleotidos, tres nucleótidos, cuatro nucleótidos, cinco nucleótidos o más de cinco nucleótidos pueden incorporarse. Una combinación de los nucleótidos etiquetados y no etiquetados se puede incorporar. El nucleótido etiquetado se selecciona del grupo que consiste de un trifosfato de didesoxinucleótido (también referido como un "dideoxi") y un trifosfato de desoxinucleótido (también referido como un eoxi"). El nucleótido no etiquetado se selecciona del grupo que consiste de un trifosfato de didesoxinucleótido y un trifosfato de desoxinucleótidos . El nucleótido etiquetado se etiqueta con una molécula que incluye pero no se limita a una molécula radioactiva, molécula fluorescente, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, hapteno, carbohidrato, biotina y derivado de biotina, porción fosforescente, porción luminiscente, porción electroquimioluminiscente , porción cromática, o porción que tiene una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica o conductividad eléctrica. Preferiblemente, el nucleótido etiquetado se etiqueta con una molécula fluorescente. La incorporación de un nucleótido etiquetado fluorescente incluye además el uso de una mezcla de nucleótidos fluorescentes y no etiquetados.

En una modalidad, la determinación de la secuencia del lugar cromosomal de interés comprende detectar al nucleótido incorporado. En una modalidad, la detección es por un método seleccionado del grupo que consiste de electroforesis de gel, electroforesis capilar, electroforesis de raicrocanal, electroforesis con gel de acrilamida, detección de fluorescencia, polarización de fluorescencia, secuenciado de ADN, secuenciado dideoxi Sanger, ELISA, espectrometría de masas, espectrometría de masas de tiempo de vuelo, espectrometría de masa de cuatro polos, espectrometría de masas de sector magnético, espectrometría de masa de sector eléctrico, fluorometría, espectrometría infrarroja, espectrometría ultravioleta, amperometría palentioestática, hibridación de ADN, microconfiguración de ADN, configuraciones de microplaqueta de genes, configuraciones HuSNP, configuraciones de perla, extensión de masa, SNP-IT, ensayo TaqMan, ensayo Invader, desdoblamiento de masa, inmunotransferencia Southern, inmunotransferencia de ranura, inmunotransferencia de punto. En una modalidad, se determina la secuencia de alelos de una hasta decenas hasta centenas hasta miles de lugares cromosomales de interés en un cromosoma sencillo en el ADN de plantilla. En una modalidad preferida, se determina la secuencia de alelo de una hasta decenas, hasta centenas, hasta miles de lugares de interés en los cromosomas múltiples . En una modalidad preferida, el lugar cromosomal de interés se sospecha que contiene un polimorfismo o mutación de nucleótido sencillo. El método se puede usar para determinar secuencias de lugares múltiples de interés concurrentemente . El ADN de plantilla puede comprender lugares múltiples de un cromosoma sencillo. El ADN de plantilla puede comprender lugares múltiples de cromosomas diferentes. Los lugares cromosomales de interés en el ADN de plantilla se pueden amplificar en una reacción. Alternativamente, cada uno de los lugares cromosomales de interés en el ADN de plantilla se pueden amplificar por una reacción por separado. El ADN amplificado se puede acumular junto previo a la digestión del ADN amplificado. Cada uno del ADN etiquetado que contiene un lugar cromosomal de interés se puede separar previo a la determinación de la secuencia del lugar cromosomal de interés. En una modalidad, al menos uno de los lugares cromosomales de interés se sospecha que contiene un polimorfismo o una mutación de nucleótidos sencilla . En otra modalidad, la relación de los alelos en un lugar cromosomal heterocigótico de interés en un cromosoma se compara con la relación de alelo en un lugar heterocigótico de interés en un cromosoma diferente. No hay limitación en cuanto a los cromosomas que se puedan comparar. La relación para los alelos en un lugar heterocigótico de interés sobre cualquier cromosoma, se puede comparar con la relación de los alelos en un lugar heterocigótico de interés sobre cualquier otro cromosoma. En una modalidad preferida, la relación de alelos en los lugares heterocigóticos múltiples de interés en un cromosoma se suman y se comparan a la relación de alelos en lugares de interés múltiples heterocigóticos en un cromosoma diferente. En otra modalidad la relación de alelos en un lugar heterocigótico de interés en un cromosoma se compara a la relación de alelos en un lugar heterocigótico de interés en dos, tres, cuatro, o más de cuatro cromosomas. En otra modalidad, la relación de alelos en lugares múltiples de interés en un cromosoma se compara con la relación de alelos en lugares múltiples de interés en dos, tres, cuatro o más de cuatro cromosomas . En otra modalidad, la relación de alelos en un lugar de interés en un cromosoma se compara con la relación de alelos en un lugar de interés en un cromosoma diferente, en donde una diferencia en la relaciones indica la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal . En otra modalidad, la relación de los alelos en lugares múltiples de interés de un cromosoma se compara con la relación de los alelos en lugares múltiples de interés en un cromosoma diferente en donde una diferencia en las relaciones indica la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal . En otra modalidad, la secuencia de uno a decenas a cientos a miles de lugares de interés en un ADN de plantilla obtenido de una muestra de un sujeto femenino con preñez se determina. En una modalidad, el lugar cromosomal de interés está en un cromosoma. En otra modalidad el lugar cromosomal de interés está sobre cromosomas múltiples. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para, aislar ácido nucleico, el método comprende (a) obtener una muestra que contiene ácido nucleico; (b) agregar un inhibidor de la lisis celular, estabilizador de la membrana celular, o un reticulante a la muestra de (a) ; y (c) aislar el ácido nucleico. En una modalidad preferida, el método se usa para aislar el ácido nucleico libre. En una modalidad más preferida, el método se usa para aislar el ácido nucleico fetal libre. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para aislar el ácido nucleico fetal libre, el método comprende (a) obtener una muestra que contiene ácido nucleico; (b) agregar un inhibidor de la lisis celular, estabilizador de la membrana celular, o un reticulante a la muestra de (a) ; y (c) aislar el plasma de la muestra sanguínea, en donde el plasma se aisla al centrifugar la muestra sanguínea; y (d) remover el sobrenadante, el cual contiene el plasma, usando procedimiento para minimizar la ruptura de la "cubierta amortiguadora" . En otra modalidad, la muestra que contiene el ácido nucleico se obtiene de cualquier fuente que contiene ácido nucleico que incluye, pero no se limita a, una célula, tejido, sangre, suero, plasma, saliva, orina, lágrimas, fluido mamario, leche materna, secreción vaginal, sudor, sangre del cordón umbilical, vellosidades coriónicas, fluido amniótico, un tejido embriónico, un embrión, un embrión de dos células , un embrión de cuatro células , un embrión de ocho células, un embrión de 16 células, un embrión de 32 células, un embrión de 64 células, un embrión de 128 células, un embrión de 256 células, un embrión de 512 células, un embrión de 1024 células, fluido linfático, fluido cerebro espinal, secreción mucosa, fluido peritoneal, fluido ascítico, materia fecal , o exudado corporal . En una modalidad, la muestra que contiene el ácido nucleico se obtiene de un sujeto femenino con preñez. En una modalidad preferida, la muestra se obtiene de una mujer embarazada. En una modalidad preferida, la muestra es sangre obtenida de una hembra preñada. En otra modalidad, un inhibidor de la lisis celular, un estabilizador de membrna celular o un reticulante se agrega a la muestra que incluye, pero no se limita a, formaldehído, y derivados de formaldehído , formalina, glutaraldehído y derivados de glutaraldehído, reticulantes , reticulantes reactivos de amina primaria, reticulantes reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo, o reducción de bisulfuro, reticulantes reactivos de' carbohidratos, reticulantes reactivos de carboxilo, reticulantes fotorreactivos , reticulantes desdoblables, AEDP, APG, BASED, BM(PEO)3, BM(PEO) , BMB, BMDB, BMH, BMOE, BS3 , BSOCOES, DFD B, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, o sulfo-EGS o compuestos enlistados en la Tabla XXII. Un agente que estabiliza las membranas celulares que puede agregarse a la muestra incluye, pero no se limita a, aldehidos, formaldehído urea, formaldeh do fenol, D AE (dimetilaminoetanol) , colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol , sacarosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, isómero A de fenilacetato de hopano tetral, isómero B de fenilacetato de hopano tetral, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoina, perftoran, polivinilpirrolidona, fosfatidilserina, tegretol, ????, cromglicato de disodio, nedocromil de sodio, feniltoina, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio, o polaxámero 188. En otra modalidad, un agente que evita la destrucción del ADN se agrega a la muestra que incluye pero no se limita a inhibidores de la DNasa, cloruro de zinc, ácido etilendiamintetracético, guanidina-HCI , isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y Na-dodecilsulfato . En una modalidad preferida, el ácido nucleico se aisla del plasma obtenido de la sangre de una hembra preñada. En otra modalidad, el ácido nucleico se aisla del plasma, que se genera usando los procedimientos designados para minimizar la cantidad de lisis celular maternal. En otra modalidad, el ácido nucleico se aisla del plasma al centrifugar la sangre de un sujeto femenino con preñez, y permitir que el centrifugado se detenga sin la aplicación de un freno . En una modalidad preferida, el ácido nucleico libre se aisla del plasma obtenido de la sangre de una hembra preñada. En otra modalidad, el ácido nucleico libre se aisla del plasma, que se genera al centrifugar la sangre obtenida de una mujer embarazada, y permitir que el centrifugado se detenga sin la aplicación de un freno (el centrifugado se detiene por desaceleración natural) . En otra modalidad, la sangre de una mujer embarazada se centrifuga a una velocidad que incluye, pero no se limita a, 0-50 rpm, 50-100 rpm, 100-200 rpm, 200-300 rpm, 300-400 rpm, 400-500 rpm, 500-600 rpm, 600-700 rpm, 700-800 rpm, 800-900 rpm, 900-1000 rpm, 1000-2000 rpm, 2000-3000 rpm, 3000-4000 rpm, 4000-5000 rpm, 5000-6000 rpm, 7000-8000 rpm, 7000-8000 rpm, y más de 8000 rpm. En una modalidad preferida, la sangre de la mujer embarazada se centrífuga a una velocidad de menos de 4000 rpm. En otra modalidad, el poder de aceleración del centrífugo no se usa.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1A. Un diagrama esquemático detalla una molécula de ADN de hebra doble. Un par de cebadores, detallado como flechas dobladas, flanquean el lugar cromosomal de interés detallado como un símbolo de triángulo en la base N14. El lugar cromosomal de interés puede ser un polimorfismo de nucleótidbs sencillo, mutación de punto, inserción, eliminación, transubicación, etc. Cada cebador contiene un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de alrededor de 10 pares base desde la terminación 5' detallada como región "a" en el primer cebador y como región "d" en el segundo cebador. El sitio de reconocimiento de restricción "a" puede ser para cualquier tipo de enzima de restricción pero el sitio de reconocimiento "d" es para una enzima de restricción, que corta "n" nucleótidos alejados de su sitio de reconocimiento y deja una colgadura 5' y una terminación rebajada 3'. Los ejemplos de tales enzimas incluyen pero no se limitan a BceA I y BsmF I. La colgadura 5' sirve como una plantilla para la incorporación de un nucleótido dentro de la terminación rebajada 3' . El primer cebador se muestra modificado con la biotina en la terminación 5' para ayudar en la purificación. La secuencia de la terminación 3' de los cebadores es tal, que los cebadores se combinan en los pares base a una distancia deseada en dirección ascendente y en dirección descendente del lugar cromosomal de interés . El segundo cebador combina los pares base cercanos al lugar cromosomal de interés, el sitio de combinación de los pares base que se detalla como región wc" se designa de manera tal que la terminación 3' del segundo cebador combina los pares base con una base alejada del lugar cromosomal de interés. El segundo cebador se puede combinar a cualquier distancia desde el lugar cromosomal de interés con la condición de que la digestión con la enzima de restricción, que reconoce la región d" en este cebador, genera una colgadura 5 ' que contiene el lugar cromosomal de interés. El sitio de combinación de los pares base del primer cebador, que se detalla como región "b" , tiene alrededor de 20 bases. Figura IB. Un diagrama esquemático que detalla las etapas de extensión y combinación de pares base del primer ciclo de amplificación por PCR. El primer ciclo de amplificación se efectúa a alrededor de la temperatura de fusión de la región 3 ' , que combina los pares base al ADN de plantilla del segundo cebador detallado como región "c" , y tiene 13 pares base en este ejemplo. A esta temperatura, el primero y segundo cebadores se combinan con sus respectivas hebras complementarias efectivas y comienzan la extensión detallada por líneas punteadas. En este primer ciclo, el segundo cebador se extiende y copia la región "b" en donde el primer cebador puede combinarse en los pares base en el siguiente ciclo. Figura 1C. Un diagrama esquemático que detalla las etapas de combinación de los pares base y extensión que sigue a la desnaturalización en el, segundo ciclo de amplificación de PCR. El segundo ciclo de amplificación se efectúa a temperaturas superiores de combinación de los pares base (TM2), que es alrededor de la temperatura de fusión de los 20 pares base de la región 3 ' del primer cebador que combina los pares base con el ADN de plantilla, detallado como región "b" . Por lo tanto en T 2, el primer cebador, que es complementaria con la región b' que es complementaria con la región b, se pueden enlazar con el ADN que se copió en el primer ciclo de la reacción. Sin embargo, a TM2 el segundo cebador no puede combinarse en sus pares base al ADN de plantilla original o al ADN que se copió en el primer ciclo de la reacción, debido a que la temperatura de combinación de los pares base es demasiado alta. El segundo cebador puede combinar los pares base hasta 13 veces en el ADN de plantilla original pero TM2 se calcula a alrededor de la temperatura de fusión de 20 bases. Figura ID. Un diagrama esquemático que detalla las reacciones de combinación de pares base y extensión después de la desnaturalización durante el tercer ciclo de amplificación. En este ciclo, la temperatura de combinación de los pares base TM3 , es alrededor de la temperatura de fusión del segundo cebador completo, incluyendo las regiones "c" y "d" . La longitud de las regiones "c" + "d" es de alrededor de 27-33 pares base de largo, y así el TM3 significativamente mayor que TM1 y TM2. En esta T superior el segundo cebador, que contiene las regiones c' y d' , se combina con el ADN copiado generado en el ciclo 2. Figura 1E.' Un diagrama esquemático que detalla las reacciones de extensión y combinación de pares base para los ciclos restantes de amplificación. La temperatura de combinación de los pares base para los ciclos restantes es TM3, que es alrededor de la temperatura de fusión del segundo cebador completo. En TM3 , el segundo cebador se enlaza a las plantillas que contienen las regiones c' y d' y el primer cebador se enlaza a las plantillas que contienen las regiones a' y b. Al elevar la temperatura de combinación de los pares base sucesivamente en cada ciclo por los primeros tres ciclos, desde TM1 a T 2 hasta TM3 , se reduce significativamente la amplificación no específica. Figura 1F. Un diagrama esquemático que detalla el lugar cromosomal amplificado de interés enlazado a una matriz sólida.

Figura 1G. Un diagrama esquemático que detalla el ADN amplificado enlazado después de la digestión con una enzima de restricción que reconoce "d" . La terminación en la dirección "descendente" se libera en el sobrenadante y se puede retirar por lavado con cualquier solución amortiguadora adecuada. La terminación en la dirección ascendente contiene el lugar cromosomal de interés que permanece enlazado a la matriz sólida. Figura 1H. Un diagrama esquemático que detalla el enlace del ADN amplificado después de "rellenar" con un ddNTP etiquetado. Se usa una polimerasa de ADN para "rellenar" la base (N'14) que es complementaria al lugar cromosomal de interés (N14) . En este ejemplo, solamente los ddNTP están presentes en esta reacción, de manera tal que solamente el lugar cromosomal de interés o SNP de interés se rellena. Figura II . Un diagrama esquemático que detalla el ADN enlazado, etiquetado, después de la digestión con la enzima de restricción "a" . El ADN etiquetado se libera en el sobrenadante, que se puede recolectar para identificar la base que se incorporó. Figura 2. Un diagrama esquemático que detalla las plantillas de ADN de hebra doble con un número "n" de lugares cromosomales de interés y un número "n" de pares cebadores, Xi, yi a xn, yn, combinados en sus pares base específicamente de manera que un cebador flanquea a cada lugar cromosomal de interés. Los primeros cebadores se biotinilan en la terminación 5' detallada por ·, y contiene un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción, "a" , que se reconoce por cualquier tipo de enzima de restricción. Los segundos cebadores contienen un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción "d" , en donde "d" es un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción que corta al "n" a una distancia desde su sitio de reconocimiento, y genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés y una terminación rebajada 3'. Los segundos cebadores se combinan en sus pares base adyacentes a los lugares cromosomales respectivos de interés . La posición exacta del sitio de la enzima de restricción "d" en los segundos cebadores se diseña de manera tal que la digestión del producto PCR de cada lugar cromosomal de interés con la enzima de restricción "d" , genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés y una terminación rebajada 3'. Los sitios de combinación de los pares base de los primeros cebadores tienen alrededor de 20 bases de longitud y se seleccionan de manera tal que cada primer cebador sucesivo se aleje además de su segundo cebador respectivo. Por ejemplo, si en el lugar cromosomal 1 de las terminaciones 3' del primero y segundo cebadores están separadas por Z pares base, entonces en el lugar 2, las terminaciones 3' del primero y segundo cebadores están separadas en los pares base Z + K en donde K= 1, 2, 3 o más que tres bases. Los cebadores para el lugar N están separados en sus pares base ZN~i + K. El propósito de hacer cada primer cebador sucesivo alejado adicionalmente de sus segundos cebadores respectivos es tal, que los fragmentos de restricción wrellenos" (generados después de la amplificación, purificación, digestión y etiquetado como se describe en las figuras 1B-1I) , difieren en tamaño y se pueden resolver, por ejemplo por electroforesis , para permitir la detección de cada lugar cromosomal individual de interés . Figuras 3A - 3C. Amplificación por PCR de los fragmentos de ADM que contienen SNP que usan temperaturas múltiples de combinación de los pares base. Un muestra que contiene plantillas de ADN genómico de treinta y seis voluntarios humanos se analizó para los siguientes cuatro SNP: SNP HC21S00340 (pista 1) , el número de identificación como se asigna en la base de datos de 21 cSNP de cromosomas humanos, localizada en el cromosoma 21; SNP TSC 0095512 (pista 2), localizada en el cromosoma 1; SNP TSC 0214366 (pista 3), localizada en el cromosoma 1 y SNP TSC 0087315 (pista 4) , localizada en el cromosoma 1. Cada SNP se amplifica por PCR usando los tres protocolos de temperatura de combinación de pares base diferentes, referido aquí como la temperatura de combinación de pares base de baja severidad; temperatura de combinación de pares base de severidad media; y temperatura de combinación de pares base de alta severidad. Independientemente del protocolo de la temperatura de combinación de los pares base, cada SNP se amplifica por 40 ciclos de PCR. La etapa de desnaturalización para cada reacción PCR se efectúa por 30 segundos a 95 °C. Figura 3A. Fotografía de un gel que demuestra la amplificación PCR de 4 diferentes SNP usando el protocolo de temperatura de combinación de los pares base de baja severidad. Figura 3B. Fotografía de un gel que demuestra la amplificación PCR de 4 SNP diferentes usando el protocolo de temperatura de combinación de pares base de severidad media.

Figura 3C. Fotografía de un gel que demuestra la amplificación PCR de 4 diferentes SNP usando el protocolo de temperatura de combinación de pares base de alta severidad. Figura 4A. Detalle de una secuencia de ADN de SNP HC21S00027, asignada por la base de datos del cromosoma humano de 21 cSNP localizados en el cromosoma 21. Se indican arriba y a continuación en primer cebador y un segundo cebador, respectivamente, la secuencia de HC21S00027. El primer cebador está biotinilado y contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para EcoRI . El segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para BsmFI y contiene 13 bases que combinan a los pares base con la secuencia de ADN. El SNP se indica por R(A/G) y r(T/C) (complementario a R) . Figura 4B. Un detalle de la secuencia de ADN SNP HC21S00027, como se asigna por el cromosoma humano 21 en la base de datos cSNP, localizada en el cromosoma 21. Un primer cebador y un segundo cebador, se indican arriba y a continuación, respectivamente, de la secuencia de HC21S00027. El primer cebador está biotinilado y contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para EcoRI . El segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para BceA I y tiene 13 bases que combinan los pares base con la secuencia de ADN. El SNP se indica por R(A/G) y r (T/C) (complementario a R) . Figura 4C. Un detalle de la secuencia de ADN SNP TSC0095512 del cromosoma 1. El primer cebador y el segundo cebador se indican arriba y a continuación, respectivamente, de la secuencia de TSC0095512. El primer cebador está biotinilado y contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para EcoRI . El segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para BsmF I y tiene 13 bases que combinan con los pares base con la secuencia de ADN. El SNP se indica por S (G/C) y s(C/G) (complementario a S) . Figura 4D.' Un detalle de la secuencia de ADN SNP TSC0095512 del cromosoma 1. El primer cebador y el segundo cebador se indican arriba y a continuación, respectivamente, de la secuencia de TSC0095512. El primer cebador está biotinilado y contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para EcoRI . El segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para BceA I y tiene 13 bases que combinan con la secuencia de ADN. El SNP se indica por S (G/C) y s (C/G) (complementario a S) . Figuras 5A-5D. Un diagrama esquemático detalla las secuencias de nucleótidos SNP HC21S00027 (FIG. 5A y figura 5B) , y SNP TSC0095512 (FIG . 5C y FIG. 5D) después de la amplificación con los cebadores descritos en las figuras 4A-4D. Se indican en negritas los sitios de restricción en la secuencia el cebador. Figuras 6?-6?. Un diagrama esquemático detalla las secuencias de nucleótidos de cada fragmento amplificado de SNP después de la digestión con la enzima de restricción tipo IIS adecuada. Las figuras 6A y 6B, detallan fragmentos de ADN que contiene SNP HC21S00027 digerido con las enzimas de restricción de tipo IIS BsmF I y BceA I, respectivamente. Las figuras 6C y 6D detallan los fragmentos de SNP TSCO095512 digerido con las enzimas de restricción de tipo IIS BsmF I y BceA I , respectivamente . Figuras 7A-7D. Un diagrama esquemático detalla la incorporación de un nucleótido etiquetado fluorescentemente usando la colgadura 5' del sitio SNP digerido como una plantilla para "rellenar" la terminación rebajada 3'. Las figuras 7A y 7B, detallan el lugar cromosomal digerido SNP HC21S00027 con un ddNTP etiquetado incorporado (*R~dd= nucleótido dideoxi fluorescente) . Las figuras 7C y 7D detallan el lugar cromosomal digerido SNP TSC0095512 con un ddNTP (*S~dd= nucleótido dideoxi fluorescente) . El uso de los ddNTP asegura que la terminación rebajada 3' se extiende por un nucleótido que es complementario con el nucleótido de interés o un sitio SNP presente en la colgadura 5' . · Figura 7E. Un diagrama esquemático que detalla la incorporación de dNTPs y un ddNTP dentro de la colgadura 5' que contiene el sitio SNP. El SNP HC21S00007 se digiere con BsmF I, lo cual genera una colgadura 5' de cuatro bases. El uso de una mezcla de dNTPs y ddNTPs permite que la terminación rebajada 3' se extienda un nucleótido (un ddNTP se incorpora primero) ; dos nucleótidos (un dNTP se incorpora seguido por un ddNTP) ; tres nucleótidos (dos dNTP se incorporan, seguido por ddNTP) ; o cuatro nucleótidos (tres dNTP se incorporan, seguido por un ddNTP) . Todos los cuatro productos se pueden separar por tamaño y detectarse el nucleótido incorporado (*R~dd= nucleótidos dideoxi fluorescentes) . La detección del primer nucleótido, que corresponde al SNP o a un sitio de lugar de cromosoma, y los siguientes tres nucleótidos proporcionan un nivel adicional de aseguramiento de calidad. El SNP se indica por R(A/G) y r(T/C) (complementario a R) . Figuras 8A-8D. Liberar el SNP "rellenado" de la matriz de soporte sólido, esto es el pozo recubierto con estreptavidina . SNP HC21S00027 se muestra en FIG. 8A y FIG.8B, mientras que SNP TSC0095512 se muestra en FIG.8C y FIG.8D. El SNP "rellenado" está libre en solución y se puede detectar. Figura 9A. Análisis de secuencia de un fragmento de SNP HC21S00027 digerido con BceAI . Se muestran cuatro reacciones de "llenado"; cada reacción contiene un nucleótido etiquetado fluorescentemente ddGTP, ddATP, ddTTP, o ddCTP, y ddNTP no etiquetables . La colgadura 5' generada por la digestión con BceA I y los nucleótidos esperados en este sitio SNP se indican. Figura 9B. Análisis de secuencias de SNP TSC0095512. SNP TSC0095512 se amplifica con un segundo cebador que contiene el sitio de reconocimiento para BceA I, y en una reacción separada con un segundo cebador que contiene el sitio de reconocimiento para BsmF I . Cuatro rellenos en las reacciones se muestran para cada producto PCR; cada reacción contiene un nucleótido etiquetado fluorescentemente, ddGTP, ddATP, ddTTP o ddCTP, y ddNTP no etiquetables. La colgadura 5' generada por la digestión con BceA I y con BsmF I y los nucleótidos esperados se indican. Figura 9C. Análisis de secuencias de SNP TSC0264580 después de la amplificación con un segundo cebador que contiene el sitio de reconocimiento para BsmF I. Cuatro "rellenos" en las reacciones se muestran; cada reacción contiene un nucleótido etiquetado fluorescentemente, que fue ddGTP, ddATP, ddTTP o ddCTP y ddNTP no etiquetables . Dos diferentes colgaduras 5' se detallan: una representa las moléculas de ADN que fueron cortadas con 11 nucleótidos en la hebra sentido y con 15 nucleótidos en la hebra antisentido y la otra representa las moléculas de ADN que se cortaron 10 nucleótidos en hebra sentido y 14 nucleótidos en la hebra antisentido. Ijos nucleótidos esperados también se indican. Figura 9D. Análisis de secuencia de SNP HC21S00027 amplificado con un segundo cebador que contiene el sitio de reconocimiento para BsmF I . Una mezcla de los ddNTP etiquetados y el dNTP sin etiquetar se usó para llenar la colgadura 5' generada por la digestión con BsmF I. Se detallan dos colgaduras diferentes 5': una representa las moléculas de ADN que se cortaron con 11 nucleótidos fuera de la hebra sentido y 15 nucleótidos fuera en la hebra antisentido y el otro representa las moléculas de ADN que se cortaron 10 nucleótidos fuera de la hebra sentido y 14 nucleótidos en la hebra antisentido. El nucleótido en dirección ascendente del SNP, el nucleótido en el sitio SNP (la muestra contenia las plantillas de ADN de 36 individuos; ambos nucleótidos se esperaría que estuvieran representados en la muestra) , y los tres nucleótidos en la dirección descendente del SNP se indican. Figura 10. Análisis de secuencia de los SNP múltiples. Los SNP HC21S00131, y HC21S00027, que se localizan en el cromosoma 21 y los SNP TSC0087315, SNP TSC0214366, SNP TSC0413944, y SNP TSC0095512, que están en el cromosoma 1, se amplificaron en reacciones PCR por separado con segundos cebadores que contenían un sitio de reconocimiento para BsmFI . Los cebadores se diseñaron de manera que cada lugar cromosomal amplificado de interés era de tamaños diferentes. Después de la amplificación, se acumularon las reacciones en una muestra sencilla y todas las etapas posteriores del método efectuado (como se describe para FIGS . 1F-1I) en esa muestra. Cada SNP y el nucleótido encontrado en cada SNP se indican. Figura 11A - 11B. Cuantificación del porcentaje de ADN fetal en sangre materna. Se obtuvo sangre de una mujer embarazada con el consentimiento informado. Se aisló el ADN y se hicieron diluciones en serie para determinar el porcentaje de ADN fetal presente en la muestra. El gen SRY, que se localiza en el cromosoma Y se usó para detectar el ADN fetal. El gen de la fibrosis cística, que se localiza en el cromosoma 7, se usó para detectar el ADN fetal y materno. Figura 11 A. Amplificación del gen SRY y el gen de la fibrosis cística usando una plantilla de ADN aislada de una muestra de sangre que se trató con EDTA. Figura 11 B. Amplificación del gen SRY y del gen de la fibrosas cística usando una plantilla de ADN que se aisló de una muestra de sangre que se trató con formalina y EDTA. Figura 12. Análisis genético de un individuo previamente preparado en su genotipo con trisomía 21 (Síndrome de Do n) . Se recolectó la sangre, con el consentimiento informado, de un individuo que se le había hecho previamente en genotipo con trisomía 21. Se aisló el ADN y se formaron genotipos de 2 SNP en el cromosoma 21 y dos SNP en el cromosoma 13. Como se muestra en la fotografía del gel, los SNP en el cromosoma 21 muestran relaciones desproporcionadas de los dos nucleótidos. La inspección visual del gel demuestra que un nucleótido de los dos nucleótidos en los sitios SNP analizados para el cromosoma 21 es de mayor intensidad, lo que sugiere que no está presente en una relación 50:50. Sin embargo, la inspección visual del gel sugiere que los nucleótidos en los sitios SNP heterocigóticos analizados en el cromosoma 13 están presentes en la relación esperada 50:50. Figura 13. Determinación de la secuencia de ambos alelos de SNP TSC0837969, TSC0034767, TSC1130902, TSC0597888, TSC0195492, TSC06Q7185 usando un nucleótido etiquetado fluorescentemente. Se usó el ddGTP etiquetado en presencia del dATP, dCTP, dTTP sin etiquetar para llenar la colgadura generada por la digestión por BsmF I. El nucleótido que antecede al sitio variable en la hebra que se rellenó no fue guanina, y el nucleótido después del sitio variable en la hebra que se llenó no fue guanina. Las dos bases de nucleótidos después del sitio variable en la hebra que se rellenó fue guanina. Los alelos que contienen guanina en el sitio variable se rellenan con ddGTP etiquetado. Los alelos que no contienen guanina se rellenan con dATP, dCTP, dTTP sin etiquetar y la polimerasa continúa incorporando nucleótidos hasta que el ddGTP se rellena en la posición 3 complementaria a la colgadura. Figura 14. Identificación de los SNP con alelos que son variables dentro de la población. Las secuencias de ambos alelos de los siete SNP localizados en el cromosoma 13 se determinaron usando un ADN de plantilla que comprende el ADN obtenido de 245 individuos. El ddGTP etiquetado se usó en presencia del dATP, dCTP, dTTP sin etiquetar para rellenar la colgadura por digestión con BsmF I. El nucleótido que antecede al sitio variable en la hebra que se rellenó no fue guanina y el nucleótido después del sitio variable en la hebra que se rellenó no fue guanina. Las dos bases de nucleótidos después del sitio variable en la hebra que se rellenó fue guanina. Los alelos que contienen guanina en el sitio variable se llenan con el ddGTP etiquetado. Los alelos que no contiene guanina se llenan con el dATP, dCTP, dTTP sin etiquetar y la polimerasa continua incorporando nucleótidos hasta que el ddGTP etiquetado se. llena en la posición 3 complementaria a la colgadura. Figura 15. Determinación de la relación para un alelo con el otro alelo en los SNP heterocigóticos . Los nucleótidos observados para SNP TSC0607185 son citosina (referido como el alelo 1) y timidina (referido como el alelo 2) en la hebra de sentido. La relación del alelo 2 al alelo 1 se calcula usando el ADN de plantilla aislado de 5 individuos. La relación del alelo 2 al alelo 1 (alelo 2/alelo 1) fue consistentemente 1:1. Los nucleótidos observados para SNP TSC1130902 son guanina (referido como el alelo 1) y adenina (referido como el alelo 2) en la hebra de sentido. La relación del alelo 2 al alelo 1 se calcula usando el ADN de plantilla aislado de cinco individuos. La relación del alelo 2 al alelo 1 (alelo 2/ alelo 1) fue consistentemente 75:25. Figura 16. El porcentaje del alelo 2 al alelo 1 en SNP TSC0108992 permanece lineal cuando se calcula en el ADN de plantilla que contiene una copia extra de cromosoma 21. Se amplificó el SNP TSC0108992 usando el ADN de plantilla de cuatro individuos y dos reacciones de relleno separadas (etiquetadas como A y B) se efectuaron para cada reacción de PC (etiquetada 1 a la 4). El porcentaje calculado del alelo 2 al alelo 1 en el ADN de plantilla de individuos normales fue 0.47. La desviación del porcentaje teóricamente predicho de 0.50 permaneció lineal en el ADN de plantilla aislado de un individuo con síndrome de Down. Figura 17A. Análisis de un SNP localizado en el cromosoma 21 del ADN de plantilla aislado de un individuo con cariotipo genético normal. SNP TSC0108992 se amplificó usando los métodos aguí descritos y después de la digestión con la enzima de restricción de tipo IIS BsmF I, la colgadura 5'se rellenó usando dTTP etiquetado y dATP, dCTP, dTTP sin etiquetar. Se efectuaron. tres reacciones PCR separadas y cada reacción PCR se dividió en dos muestras. El porcentaje del alelo 2 en el sitio SNP (alelo 2/ (alelo 2 + alelo 1)) se calculó, lo cual resultó de una media de 0.50. Figura 17B. Análisis de un SNP localizado en el cromosoma 21 del ADN de plantilla aislado de un individuo con un cariotipo genético de trisomía 21. SNP TSC0108992 se amplificó usando los métodos aquí descritos y después de la digestión con la enzima de restricción de tipo IIS BsmF I la colgadura 5' se rellenó usando dTTP etiquetado y dATP, dCTP, dTTP sin etiquetar. Se efectuaron tres reacciones PCR separadas y cada reacción PCR se dividió en dos muestras. El porcentaje del alelo 2 en el sitio SNP (alelo 2 / (alelo 2 + alelo 1)) se calculó, lo cual resulto de una media de 0.30. Figura 17C. Análisis de un SNP localizado en el cromosoma 21 a partir de una mezcla que comprende un ADN de plantilla de un individuo con trisomía 21 y el ADN de plantilla de un individuo con un cariotipo genético normal en una relación de 3:1 (trisomía 21: normal). SNP TSC0108992 se amplifica a partir de la mezcla de un ADN de plantilla usando los métodos aquí descritos y después de la digestión con la enzima de restricción de tipo IIS BsmF I la colgadura 5' se relleno usando dTTP etiquetado y dATP, dCTP, dTTP sin etiquetar. Se efectuaron 3 reacciones PCR separadas, y cada reacción PCR se dividió en dos muestras. El porcentaje del alelo 2 en el sitio SNP (alelo 2 / (alelo 2 + alelo 1) ) se calculó, lo cual resultó en una media de 0.319. Figura 17D. Análisis de un SNP localizado en el cromosoma 21 a partir de una mezcla que comprende un ADN de plantilla de un individuo con trisomía 21 y el ADN de plantilla de un individuo con un cariotipo genético normal en una relación de 1:1 (trisomía 21: normal). SNP TSC0108992 se amplifica a partir de la mezcla de un ADN de plantillas usando los métodos aquí descritos y después de la digestión con la enzima de restricción de tipo IIS BsmF I, la colgadura 5 'se rellenó usando dTTP etiquetado y dATP, dCTP, dTTP sin etiquetar. Se efectuaron tres reacciones PCR separadas y cada reacción PCR se dividió en dos muestras. El porcentaje del alelo 2 en el sitio SNP (alelo 2 / (alelo 2 + alelo 1)) en el sitio SNP se calculó, lo cual resulto en una media de 0.352.

Figura 17E. Análisis de un SNP localizado en el cromosoma 21 a partir de una mezcla que comprende un ADN de plantilla de un individuo con trisomía 21, y el ADN de plantilla de un individuo con un cariotipo genético normal en una relación de 1:2.3 (trisomía 21: normal). SNP TSC0108992 se amplifica a partir de la mezcla de un ADN de plantilla usando los métodos aquí descritos y después de la digestión con la enzima de restricción de tipo IIS BsmF I, la colgadura 5' se rellenó usando dTTP etiquetado y dATP, dCTP, dTTP sin etiquetar. Se efectuaron tres reacciones PCR separadas y cada reacción PCR se dividió en dos muestras. El porcentaje del alelo 2 en el sitio SNP (alelo 2 / (alelo 2 + alelo 1) ) se calculó, lo cual resultó de una media de 0.382. Figura 17F. Análisis de un SNP localizado en el cromosoma 21 a partir de una mezcla que comprende un ADN de plantilla de un individuo con trisomía 21, y el ADN de plantilla de un individuo con un cariotipo genético normal en una relación de 1:4 (trisomía 21: normal). SNP TSC0108992 se amplifica a partir de la mezcla de un ADN de plantilla usando los métodos aquí descritos, y después de la digestión con la enzima de restricción de tipo IIS BsmF I, la colgadura 5' se rellenó usando dTTP etiquetado, y dATP, dCTP, dTTP sin etiquetar. Se efectuaron tres reacciones PCR separadas, y cada reacción PCR se dividió en dos muestras. El porcentaje del alelo 2 en el sitio SNP (alelo 2 / (alelo 2 + alelo 1) ) se calculó, lo cual resultó en una media de 0.397. Figura 18A. Análisis de gel de agarosa de nueve (9) SNP amplificados de un ADN de plantilla. Cada uno de los nueve SNP se amplificaron del ADN genómico usando los métodos aqui descritos. La pista 1 corresponde a SNP TSC0397235, la pista 2 corresponde a TSC0470003, la pista 3 corresponde a TSC1649726, la pista 4 corresponde a TSC1261039, la pista 5 corresponde a TSC0310507, la pista 6 corresponde a TSC1650432, la pista 7 corresponde a TSC1335008, la pista 8 corresponde a TSC0128307, y la pista 9 corresponde a TSC00259757. Figura 18B. El ADN de plantilla original se amplificó usando 12 cebadores base que se combinaron en sus pares base a diversas regiones en el cromosoma 13. Se usaron 100 diferentes conjuntos de cebadores para amplificar las regiones a través del cromosoma 13. Para cada uno de los nueve SNP, se usaron un cebador que combinó en sus pares base aproximadamente 130 bases desde el lugar cromosomal de interés y 130 bases en la dirección descendente del lugar cromosomal de interés. Esta reacción de. amplificación, que contenía un total de 100 diferentes conjuntos de cebadores se usó para amplificar las regiones que contienen los lugares cromosomales de interés . El producto resultante de PCR se usó en una reacción posterior de PCR, en donde cada uno de los nueve SNPs se amplificaron individualmente usando un primer cebador y un segundo cebador, en donde el segundo cebador contenía el sitio de enlace para la enzima de restricción tipo IIS BsmF I. Se cargaron los SNP en el mismo orden como FIG. 18A. Figura 19A. Cuantificación del porcentaje del alelo 2 al alelo 1 para SNP TSC047003 en el ADN de plantilla original (IA) y el ADN de plantilla multiplexado ( 1-M3) , en donde el ADN se amplificó primero usando 12 cebadores base que se combinaron con 150 bases en dirección ascendente y dirección descendente de los lugares cromosomales de interés. Luego, se efectuaron tres reacciones PCR por separado efectuadas en un ADN de plantilla multiplexado usando un primero y segundo cebador . Figura 19B. Cuantificación del porcentaje del alelo 2 al alelo 1 para SNP TSC1261039 en el ADN de plantilla original (IA) y el ADN de plantilla multiplexado (M1-M3) , en donde el ADN se amplificó primero usando 12 cebadores base que se combinaron con 150 bases en dirección ascendente y dirección descendente de los lugares cromosomales de interés . Luego, se efectuaron 3 reacciones PCR por separado efectuadas en un ADN de plantilla multiplexado, usando un primero y segundo cebador. Figura 19C. Cuantificación del porcentaje del alelo 2 al alelo 1 para SNP TSC310507 en el ADN de plantilla original (IA) y el ADN de plantilla multiplexado (M1-M3) , en donde el ADN se amplificó primero usando 12 cebadores base que se combinaron con 150 bases en dirección ascendente y dirección descendente de los lugares cromosomales de interés. Luego, se efectuaron tres reacciones PCR por separado efectuadas en un ADN de plantilla multiplexado usando un primero y segundo cebado . Figura 19D. Cuantificación del porcentaje del alelo al alelo 1 para SNP TSC1335008 en el ADN de plantilla original (IA) y el ADN de plantilla múltiple usado (M1-M3) , en donde el ADN se amplificó primero usando 12 cebadores base que se combinaron con 150 bases en dirección ascendente y dirección descendente de los lugares cromosomales de interés. Luego, se efectuaron 3 reacciones PCR por separado efectuadas en un ADN de plantilla multiplexado, usando un primero y segundo cebador. Figura 20. Detección del ADN fetal del ADN de plasma aislado de una mujer embarazada. Cuatro SNPs dentro del ADN materno fueron homocigóticos se analizaron en el ADN de plasma. El ADN materno fue homocigotico para la adenina TSC0838335 (pista 1) , mientras que el ADN de plasma desplegó un patrón heterocigótico (pista 2) . El alelo de guanina representó el ADN fetal, que se tiene diferencia claramente de la señal materna. El ADN materno y el ADN de plasma fueron homocigóticos para la adenina en TSC0418134 (pistas 3 y 4) . El ADN materno fue homocigotico para la guanina en TSC0129188 (pista 5) , mientras que el ADN de plasma desplegó un patrón heterocigótico (pista 6) . El alelo de adenina representó el ADN fetal . El ADN materno y el ADN de plasma fueron homocigóticos para la adenina en TSC0501389 (pista 7 y 8) .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un método para la detección de trastornos genéticos, incluyendo pero no limitado a mutaciones, inserciones, eliminaciones, y anormalidades cromosomales, y es especialmente útil para la detección de trastornos genéticos de un feto. El método es especialmente útil para la detección de una transubicación, adición, amplif cación, transversión, inversión, aneuploidia, poliploidia, monosomía, trisomía, trisomía 21, trisomía 13, trisomía 14, trisomía 15, trisomía 16, trisomía 18, trisomía 22, triploidia, tetraploidia y anormalidades del cromosoma del sexo incluyendo XO, XY, YY, y XXX. El método también proporciona una técnica no invasora para la determinación de la secuencia del ADN fetal e identificar mutaciones con el ADN fetal. La invención se dirige a un método para la detección de anormalidades cromosomales, el método comprende: (a) determinar la secuencia de alelo de un lugar cromosomal de interés en un ADN de plantilla; y (b) cuantificar una relación para los alelos en un lugar heterocigótico de interés que se identifica del lugar de interés de (a) , en donde la relación indica la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal . En otra modalidad, la presente invención proporciona un método no invasor para determinar la secuencia de un lugar cromosomal de interés en el ADN fetal , el método comprende : (a) obtener una muestra de una mujer embarazada; (b) agregar un inhibidor de liéis, estabilizador de membrana de células o reticulante a la muestra de (a) ; (c) obtener el ADN de plantilla de la muestra de (b) , en donde el ADN de plantilla comprende el ADN fetal y el ADN materno; y (d) determinar la secuencia de un lugar cromosomal de interés en el ADN de plantilla. En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para aislar el ADN, el método comprende: (a) obtener una muestra que contiene ácido nucleico; (b) agregar un inhibidor de lisis celular, estabilizador de membrana de células o reticulante a la muestra de (a) ; y (c) aislar el ADN. En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para aislar el ADN libre, el método comprende: (a) obtener una muestra que contiene ácido nucleico; (b) agregar un inhibidor de lisis celular, estabilizador de membrana de células o reticulante a la muestra de (a) ; y (c) aislar el ADN. En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para aislar el ADN libre de una muestra que contiene ácido nucleico al cual se le ha agregado un inhibidor de lisis celular, un estabilizador de membrana de células o un reticulante, el método comprende aislar el ADN. En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para aislar el ADN, el método comprende: (a) obtener una muestra que contiene ácido nucleico; (b) agregar un inhibidor de lisis celular, estabilizador de membrana de células o reticulante a la muestra de (a) ; y (c) aislar el ADN. En otra modalidad, el ADN se aisla usando cualquier técnica apropiada en el arte que incluye, pero no se limita a, gradiente de cloruro de cesio, gradientes, gradientes de sacarosa, gradientes de glucosa, protocolos de centrifugación, ebullición, sistemas de purificación Qiagen, kit de purificación de sangre de ADN QIA, kit de maxi plásmido HiSpeed, kit de plásmido QIAfilter, sistemas de purificación de ADN Promega, sistemas basados en partículas paramagnéticas MangeSil, tecnología Wizard SV, kit de purificación de ADN genómico Wizard, sistemas de purificación Amersham, kit de purificación de ADN sanguíneo genómico GFX, sistemas de purificación de Invitrogen Life Technologies, sistema de purificación CONCERT, sistemas de purificación de o Bio Laboratories, kits de UltraClean BloodSpin, y kit de ADN sanguíneo UltraClean. En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para aislar el ADN libre fetal de una muestra que contiene ácido nucleico a la cual se le ha agregado un inhibidor de lisis celular, estabilizador de membrana de células o reticulante, el método comprende aislar el ADN. En una modalidad preferida, el ADN fetal libre se aisla del plasma o suero obtenido de la sangre de una mujer embarazada.

En otra modalidad, el ADN se aisla usando técnicas y/o protocolos que reducen substancialmente la cantidad de ADN maternal en la muestra, que incluye, pero no se limita a, centrifugar las muestras, con el poder de rompimiento del centrífugo establecido en cero (el freno en el centrífugo no se usa) , transferir el sobrenadante a un tubo nuevo con un mínimo o sin trastorno de la ""cubierta esponjosa", y transferir sólo una porción del sobrenadante a un tubo nuevo. En una modalidad preferida, tanto el poder de aceleración como el poder de rompimiento para el centrífugo se establecen en cero . En otra modalidad, el ADN se aisla usando técnicas y/o protocolos que reducen substancialmente la cantidad de ADN maternal en la muestra, que incluye, pero no se limita a, centrifugar las muestras, con el poder de aceleración del centrífugo establecido en cero, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo con un mínimo o sin trastorno de la "cubierta esponjosa", y transferir sólo una porción del sobrenadante a un tubo nuevo . En otra' modalidad, la "cubierta esponjosa" se remueve del tubo antes de remover el sobrenadante usando cualquier método aplicable que incluye, pero no se limita a, el uso de una jeringa o aguja para retirar la "capa esponjosa". En otra modalidad, el poder de rompimiento para el centrífugo se establece a un porcentaje que incluye, pero no se limita a, 1-5%, 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-99% de poder de rompimiento máximo . En otra modalidad, el poder de aceleración para el centrífugo se establece a un porcentaje que incluye, pero no se limita a, 1-5%, 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-99% de poder de aceleración máximo. En otra modalidad, la presente invención se dirige a una composición que comprende ADN fetal libre y ADN maternal libre, en donde la composición comprende una relación de ADN fetal libre a ADN maternal libre que incluye, pero no se limita a, al menos alrededor de 15% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 20% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 30% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 40% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 50% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 60% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 70% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 80% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 90% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 91% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 92% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 93% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 94% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 95% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 96% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 97% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 98% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 99% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 99.5% de ADN fetal libre. En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para usar una composición que comprende ADN fetal libre y ADN maternal libre para diagnóstico prenatal, en donde la composición comprende una relación de ADN fetal libre a ADN maternal libre que incluye, pero no se limita a, al menos alrededor de 15% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 20% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 30% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 40% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 50% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 60% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 70% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 80% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 90% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 91% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 92% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 93% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 94% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 95% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 96% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 97% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 98% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 99% de ADN fetal libre, al menos alrededor de 99.5% de ADN fetal libre. En otra modalidad, la presente invención se dirige a una composición que comprende ADN fetal libre y ADN maternal libre, en donde la composición comprende una relación de ADN fetal libre a ADN maternal libre que incluye, pero no se limita a, alrededor de 13-15% de ADN fetal libre, alrededor de 15-16% de ADN fetal libre, alrededor de 16-17% de ADN fetal libre, alrededor de 17-18% de ADN fetal libre, alrededor de 18-19% de ADN fetal libre, alrededor de 19-20% de ADN fetal libre, alrededor de 20-21% de ADN fetal libre, alrededor de 21-22% de ADN fetal libre, alrededor de 22-23% de ADN fetal libre, alrededor de 23-24% de ADN fetal libre, alrededor de 24-25% de ADN fetal libre, alrededor de 25-35% de ADN fetal libre, alrededor de 35-45% de ADN fetal libre, alrededor de 45-55% de ADN fetal libre, alrededor de 55-65% de ADN fetal libre, alrededor de 65-75% de ADN fetal libre, alrededor de 75-85% de ADN fetal libre, alrededor de 85-90% de ADN fetal libre, alrededor de 90-91% de ADN fetal libre, alrededor de 91-92% de ADN fetal libre, alrededor de 92-93% de ADN fetal libre, alrededor de 93-94% de ADN fetal libre, alrededor de 94-95% de ADN fetal libre, alrededor de 95-96% de ADN fetal libre, alrededor de 96-97% de ADN fetal libre, alrededor de 97-98% de ADN fetal libre, alrededor de 98-99% de ADN fetal libre, alrededor de 99-99.7% de ADN fetal libre.

En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para usar la composición que comprende ADN fetal libre y ADN maternal libre para diagnóstico prenatal, en donde la composición comprende una relación de ADN fetal libre a ADN maternal libre que incluye, pero no se limita a, alrededor de 13-15% de ADN fetal libre, alrededor de 15-16% de ADN fetal libre, alrededor de 16-17% de ADN fetal libre, alrededor de 17-18% de ADN fetal libre, alrededor de 18-19% de ADN fetal libre, alrededor de 19-20% de ADN fetal libre, alrededor de 20-21% de ADN fetal libre, alrededor de 21-22% de ADN fetal libre, alrededor de 22-23% de ADN fetal libre, alrededor de 23-24% de ADN fetal libre, alrededor de 24-25% de ADN fetal libre, alrededor de 25-35% de ADN fetal libre, alrededor de 35-45% de ADN fetal libre, alrededor de 45-55% de ADN fetal libre, alrededor de 55-65% de ADN fetal libre, alrededor de 65-75% de ADN fetal libre, alrededor de 75-85% de ADN fetal libre, alrededor de 85-90% de ADN fetal libre, alrededor de 90-91% de ADN fetal libre, alrededor de 91-92% de ADN fetal libre, alrededor de 92-93% de ADN fetal libre, alrededor de 93-94% de ADN fetal libre, alrededor de 94-95% de ADN fetal libre, alrededor de 95-96% de ADN fetal libre, alrededor de 96-97% de ADN fetal libre, alrededor de 97-98% de ADN fetal libre, alrededor de 98-99% de ADN fetal libre, alrededor de 99-99.7% de ADN fetal libre. En otra modalidad, la presente invención se dirige a una composición que comprende ADN fetal libre y ADN maternal libre, en donde la composición comprende una relación de ADN fetal libre a ADN maternal libre que incluye, pero no se limita a un máximo de 13%-15% de ADN fetal libre, un máximo de 15-18% de ADN fetal libre, un máximo de 18-20% de ADN fetal libre, un máximo de 20-40% de ADN fetal libre, un máximo de 40-50% de ADN fetal libre, un máximo de 50-60% de ADN fetal libre, un máximo de 60-70% de ADN fetal libre, un máximo de 70-80% de ADN fetal libre, un máximo de 80-90% de ADN fetal libre, un máximo de 90-92% de ADN fetal libre, un máximo de 92-94% de ADN fetal libre, un máximo de 94-95% de ADN fetal libre, un máximo de 95-96% de ADN fetal libre, un máximo de 96-97% de ADN fetal libre, un máximo de 97-98% de ADN fetal libre, un máximo de 98-99% de ADN fetal libre, un máximo de 99-99.5% de ADN fetal libre, un máximo de 99.5-99.9% de ADN fetal libre. En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para usar la composición que comprende ADN fetal libre y ADN maternal libre para diagnóstico prenatal, en donde la composición comprende una relación de ADN fetal libre a ADN maternal libre que incluye, pero no se limita a un máximo de 13%-15% de ADN fetal libre, un máximo de 15-18% de ADN fetal libre, un máximo de 18-20% de ADN fetal libre, un máximo de 20-40% de ADN fetal libre, un máximo de 40-50% de ADN fetal libre, un máximo de 50-60% de ADN fetal libre, un máximo de 60-70% de ADN fetal libre, un máximo de 70-80% de ADN fetal libre, un máximo de 80-90% de ADN fetal libre, un máximo de 90-92% de ADN fetal libre, un máximo de 92-94% de ADN fetal libre, un máximo de 94-95% de ADN fetal libre, un máximo de 95-96% de ADN fetal libre, un máximo de 96-97% de ADN fetal libre, un máximo de 97-98% de ADN fetal libre, un máximo de 98-99% de ADN fetal libre, un máximo de 99-99.5% de ADN fetal libre, un máximo de 99.5-99.9% de ADN fetal libre.

Plantilla de ADN Por un "lugar cromosomal de interés" se pretende una región seleccionada de ácido nucleico que está dentro de una región mayor de ácido nucleico. Un lugar cromosomal de interés pueden incluir pero no se limita a 1-100, 1-50, 1-20, ó 1-10 nucleótidos, preferiblemente 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, ó 1 nucleótidos . Como se usa en la presente, un "alelo" es una de varias formas alternas de un gen o regiones no codificadoras de ADN que ocupan la misma posición en un cromosoma. El término alelo se pueden usar para describir el ADN de cualquier organismo que incluye pero no se limita a bacterias, virus, hongos, protozoarios , mohos, levaduras, plantas, humanos, no humanos, animales y arqueobacterias . Por ejemplo, las bacterias tienen típicamente una hebra larga de ADN. El término alelo con respecto al ADN bacteriano se refiere a una forma de un gen encontrado en un célula en comparación con la misma forma del gen en un célula bacteriana diferente de la misma especie. Los alelos pueden tener la secuencia idéntica o pueden variar por un nucleótido sencillo o más de un nucleótido. Con respecto a los organismos que tiene dos copias de cada cromosoma, si ambos cromosomas tiene el mismo alelo, la condición se refiere como homocigótico. Si los alelos en los dos cromosomas son diferentes, las condición se refiere como heterocigóticos . Por ejemplo, si el lugar cromosoma! de interés es SNP X en el cromosoma 1, y el cromosoma materno contiene una adenina en SNP X (alelo A) y el cromosoma paterno contiene una guanina en SNP X (alelo G) , el individuo es heterocigótico en SNP X. Como se usa en la presente, secuencia significa la identidad de un nucleótido o más de un nucleótido contiguo en un polinucleótido . En el caso de un nucleótido sencillo por ejemplo, una "secuencia", SNP, e "identidad" se usan de forma intercambiable en la presente. El término "anormalidad cromosomal" se refiere a una desviación entre la estructura de un cromosoma sujeto y un cromosoma homólogo normal . El término "normal" se refiere a un cariotipo predominante o patrón de banda que se encuentra en individuo saludable de una especie en particular. Una anormalidad cromosomal puede ser numérica o estructural incluye pero no se limita a aneuploidia, poliploidia, inversión, una trisomía, una monosomía, duplicación, eliminación, eliminación de una parte de un cromosoma, adición, adición de una parte de un cromosoma, inserción, un fragmento de un cromosoma, una región de un cromosoma, reconfiguración croraosomal , y transubicación. Se puede correlacionar una anormalidad cromosomal con la presencia de una condición patológica o con una predisposición a desarrollar una condición patológica. Como se define en la presente, un polimorfismo de nucleótidos sencillo ("SNP") no es una anormalidad cromosomal. Como se usa en la presente, la incorporación de un nucleótido por una polimerasa se refiere a como una reacción de alargado o una reacción de relleno intercambiablemente. Como se usa en la presente con respecto a los individuos, los "alelos imitantes" se refiere a alelos variantes que se asocian con un estado de enfermedad. El término "plantilla" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que se puede usar para amplificación en la invención. El ARN o ADN que no está naturalmente de hebra doble se puede hacer de ADN de hebra doble de manera que se usa como ADN de plantilla. Cualquier ADN de hebra doble o preparación que contiene moléculas de ADN diferentes múltiples se pueden usar como un ADN de plantilla para amplificar un lugar o lugares cromosomales de interés contenidos en el ADN de plantilla. - El ADN de plantilla se puede obtener de cualquier fuente incluyendo pero no limitado a humanos, no humanos, mamíferos, reptiles, ganado, gatos, perros, cabras, cerdos, puercos, monos, simios, gorilas, toros, vacas, osos, caballos, ovejas, aves de corral, ratones, ratas, peces, delfines, ballenas, y tiburones . El ADN de plantilla puede ser de cualquier muestra adecuada que incluye pero no se limita a, muestras que contienen ácido nucleico de tejido, fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero, plasma, saliva, orina, lágrimas, fluido peritoneal, fluido ascítico, secreción vaginal, fluido linfático, fluido cerebro espinal, o secreción de mucosa) , sangre del cordón umbilical, vellosidades coriónicas, fluido amniótico, un embrión, un embrión de dos células, un embrión de cuatro células, un embrión de ocho células, un embrión de 16 células, un embrión de 32 células, un embrión de 64 células, un embrión de 128 células, un embrión de 256 células, un embrión de 512 células, un embrión de 1024 células, tejidos embriónicos, fluido linfático, fluido cerebro espinal, secreción mucosa u otro exudado del cuerpo, materia fecal, una célula o extracto individual de tales fuentes que contengan el ácido nucleico de las mismas y estructuras subcelulares tales como la mitocondria, usando protocolos bien establecidos dentro del arte.

En una modalidad, se puede obtener el ADN de plantilla de una muestra de una mujer embarazada. En otra modalidad, el ADN de plantilla se puede obtener de un embrión. En una modalidad preferida, el ADN de plantilla se puede obtener de una célula sencilla de un embrión. En una modalidad, el ADN de plantilla es ADN fetal. El ADN fetal se puede obtener de fuentes que incluyen pero no se limitan a sangre materna, suero materno, plasma materno, células fetales, sangre del cordón umbilical, vellosidades coriónicas, fluido amniótico, células o tejidos. En otra modalidad se agrega un inhibidor de la lisis celular a la muestra que incluye pero no se limita a formaldehído, derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehído y derivados de glutaraldehído, reticulantes, reticulantes reactivos de amina primaria, reticulantes reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de bisulfuro, reticulante reactivo de carbohidrato, reticulantes reactivos de carboxilo, reticulantes fotorreactivos, reticulantes desdoblables AEDP, APG, BASED, BM(PE0)3, BM(PE0)4, B B, BMDB, B H, B OE, BS3 , BSOCOES, DFDNB, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, o Sulfo-EGS o compuestos enlistados en la Tabla XXIII. En otra modalidad dos, tres, cuatro, cinco, o mas cinco inhibidores de la lisis celular se pueden agregar a la muestra. En una modalidad preferida, la formalina está presente en la muestra a un porcentaje que incluye, pero no se limita a, 0.0001-0.03%, 0.03-0.05%, 0.05-0.08%, 0.08-0.1%, 0.1-0.3%, 0.3-0.5%, 0.5-0.7%, 0.7-0.9%, 0.9-1.2%, 1.2-1.5%, 1.5-2%, 2-3%, 3-5%, y más del 5%. En otra modalidad, cualquier combinación de reticulante, estabilizador de membrana celular, o inhibidor de lisis celular puede agregarse a la muestra e incluye pero no se limita a un' reticulante y un estabilizador de membrana celular, un reticulante y un inhibidor de lisis celular, y un estabilizador de membrana celular y un inhibidor de lisis celular. Más de un reticulante puede usarse con más de un estabilizador de membrana celular. Más de un reticulante puede usarse con más de un inhibidor de lisis celular. Más de un estabilizador de membrana celular puede usarse con más de un inhibidor de lisis celular. En otra modalidad, el inhibidor de la lisis celular se agrega a la muestra de tal manera que la lisis es de menos de alrededor de 10% de las células. En una modalidad preferida, el inhibidor de lisis celular se agrega a la muestra de tal manera que la lisis es de menos de alrededor de 5% de las células. En una modalidad preferida, el inhibidor de lisis celular se agrega a la muestra de tal manera que la lisis es de menos de alrededor de 1% de las células. En una modalidad preferida, el estabilizador de membrana celular se agrega a la muestra de tal manera que la lisis es de menos de alrededor de 10% de las células. En una modalidad preferida, el estabilizador de membrana celular se agrega a la muestra de tal manera que la lisis es de menos de alrededor de 5% de las células. En una modalidad preferida, el estábilizador de membrana celular se agrega a la muestra de tal manera que la lisis es de menos de alrededor de 1% de las células. En una modalidad preferida, el reticulante se agrega a la muestra de tal manera que la lisis es de menos de alrededor de 10% de las células. En una modalidad preferida, el reticulante se agrega a la muestra de tal manera que la lisis es de menos de alrededor de 5% de las células. En una modalidad preferida, el reticulante se agrega a la muestra de tal manera que la lisis es de menos de alrededor de 1% de las células . En una modalidad preferida, el inhibidor de lisis celular, el reticulante o el estabilizador de membrana celular se agrega a la muestra en un periodo de tiempo aplicable que incluye, pero no se limita a 1-10 segundos, , 10-30 segundos, 30-60 segundos, 1-5 minutos, 5-10 minutos, 10-20 minutos, 20-30 minutos, 30-40 minutos, 40-50 minutos, 60-90 minutos, 90-180 minutos o más de 180 minutos después de colectar la muestra. En otra modalidad, el inhibidor de lisis celular, reticulante, o estabilizador de membrana celular se presenta en el aparato en el cual se colecta la muestra incluye pero no se limita a tubo de vidrio, tubo de plástico, recipiente circular, un tubo de Eppendorf, una bolsa IV, o cualquier otro dispositivo de colectado apropiado. En otra modalidad, después de la adición del inhibidor de lisis celular, estabilizador de membrana celular, o reticulante, la muestra se deja a alrededor de temperatura ambiente por un periodo de tiempo para permitir que el reactivo funcione, que incluye pero no se limita a 1-5, 5-10, 10-20, 20-40, 40-60, 60-90, 90-120, 120-150, 150-180, 180-240, 240-300 o más de 300 minutos. En otra modalidad, el ADN de plantilla contiene ADN materno y ADN fetal. En una modalidad, preferida se obtiene el ADN de plantilla de una sangre de una mujer embarazada. La sangre se recolecta usando cualquier técnica estándar para retirar sangre incluida pero no limitado a la punción de la vena. Por ejemplo, se puede sacar la sangre de un vena del interior del codo o de la parte posterior de la mano. Se pueden recolectar muestras de sangre de una mujer embarazada en cualquier momento durante la gestación fetal. Por ejemplo, se pueden recolectar muestras de sangre de sujetos femeninos humanos a 1-4, 4-8, 8-12, 12-16, 16-20, 20-24, 24-28, 28-32, 32-36, 36-40, o 40-44 semanas de gestación fetal, y preferiblemente entre 8-28 semanas de gestación fetal. La muestra de sangre se centrifuga para separar el plasma de las células maternas. Las fracciones de células maternas y de plasma se transfieren a tubos separados y se vuelven a centrifugar. La fracción de plasma contiene el ADN fetal libre de células y el ADN materno. Se puede usar cualquier técnica estándar de aislamiento de ADN para aislar el ADN fetal y el ADN materno incluido pero no limitado el kit Midi de sangre de ADN QIAamp suministrado por QIAGEN (número de catálogo 51183) . En una modalidad preferida, se puede recolectar la sangre en un aparato que contiene un quelador de magnesio que incluye pero no se limita a EDTA y se almacena a 4°C. opcionalmente, se puede agregar un quelador de calcio que incluye pero no se limita a EGTA. En otra modalidad, se agrega un inhibidor de lisis celular a la sangre materna que incluye, pero no se limita a, formaldehído, derivados de formaldehído y formalina, glutaraldehído y derivados de glutaraldehído, reticulantes , reticulantes reactivos de amina primaria, reticulantes reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo, o reducción de bisulfuro, reticulante reactivo de carbohidrato, reticulantes reactivos de carboxilo, reticulantes fotorreactivos, reticulantes desdoblables AEDP, APG, BASED, B (PE0)3, BM(PEO)4, BMB, B DB, B H, BMOE, BS3 , BSOCOES, DFDNB, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS , HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, o sulfo-EGS, o compuestos enlistados en la Tabla XXIII . En otra modalidad, un agente que estabiliza las membranas celulares puede agregarse a las muestras de sangre maternal para reducir la lisis celular maternal incluyen pero no se limita a, aldehidos, formaldehído urea, formaldehído fenol, DMAE (dimetilaminoetanol) , colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol, sacarosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, isómero A de fenilacetato de hopano tetral, isómero B de fenilacetato de hopano tetral, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoina, perftoran, polivinilpirrolidona, fosfatidilserina, tegretol , PABA, cromglicato de disodio, nedocromil de sodio, feniltoina, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio, o polaxámero 188. En otra modalidad, el ADN de plantilla se obtiene del plasma o suero de la sangre de una mujer embarazada. El porcentaje de ADN fetal en el plasma materno está entre 0.39-11.9% (Pertl, and Biachi, Obstetrics and Gynecology 98:483-490 (2001)). La mayoría del ADN en la muestra de plasma es materno, lo cual hace difícil el uso del ADN para forma genotipos del feto. Sin embargo, los métodos que incrementan el porcentaje de ADN fetal en el plasma materno permiten que se determine la secuencia del ADN fetal, y permiten la detección de trastornos genéticos que incluyen mutaciones, inserciones, eliminaciones y anormalidades cromosomales. La adición de inhibidores de lisis celular a la muestra de sangre materna puede incrementar el porcentaje relativo del ADN fetal. Aunque se inhibe la lisis de la células materna y fetales, la vasta mayoría de células son maternas y asi al reducir la lisis de las células maternas hay incremento relativo en el porcentaje del ADN fetal libre. Ver el Ejemplo 4. En otra modalidad, cualquier técnica de extracción de sangre, método, protocolo o equipo que reduzca la cantidad de lisis celular se puede usar, incluido pero no limitado a una aguja boar grande, una aguja de longitud más corta, un recubrimiento de aguja que incremente el flujo laminado por ejemplo, teflón, una modificación del bisel de la aguja para incrementar el flujo de laminado o técnicas que reduzcan la relación de flujos sanguíneos. Las células fetales probablemente se destruyen en el sistema inmune de la madre. Sin embargo es probable que una gran porción de la lisis de células maternas suceda como resultado de la extracción de sangre. Así, los métodos que eviten o reduzcan la lisis celular reducirán la cantidad de ADN materno en la muestra, e incrementarán el porcentaje relativo de ADN fetal libre. En otra modalidad un agente que conserva la integridad estructural de las células se puede usar para reducir la cantidad de lisis celular. En otra modalidad, cualquier protocolo que reduce la cantidad de ADN maternal libre en la sangre maternal puede usarse antes de obtener la muestra. En otra modalidad, antes de obtener la muestra, la mujer embarazada se mantiene sin actividad física por un periodo de tiempo que incluye pero no se limita a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-55, 55-60, 60-120, 120-180, 180-240, 240-300, 300-360, 360-420, 420-480, 480-540, 540-600, 600-660, 660-720, 720-780, 780-840, 840-900; 900-1200, 1200-1500, 1500-1800, 1800-2100, 2100-2400, 2400-2700, 2700-3000, 3000-3300, 3300-3600, 3600-3900, 3900-4200, 4200-4500, y más de 4500 minutos. En otra modalidad, la muestra se obtiene de una mujer embarazada después de que su cuerpo ha alcanzado un estado de relajación. El periodo de reposo antes de obtener la muestra puede reducir la cantidad de ácido nucleico maternal en la muestra. En otra modalidad, la muestra se obtiene de la mujer embarazada en la mañana, incluyendo pero no se limita a 4-5 ara, 5-6 am, 6-7 am, 7-8 am, 8-9 am, 9-10 am, 10-11 am, y 11-12 am. En otra modalidad, la muestra se obtiene de la mujer embarazada después de que a dormido por un periodo de tiempo que incluye pero no se limita a 0-1, 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11, 11-12, o más de 12 horas. En otra modalidad, antes de obtener la muestra, la mujer embarazada se ejercita durante un periodo de tiempo después de un periodo de reposo. En otra modalidad, el periodo de ejercicio incluye pero no se limita a 0-15, 15-30, 30-45, 45-60, 60-120, 120-240, o más de 240 minutos. En otra modalidad, los agentes que evitan la destrucción del ADN que incluyen pero no se limitan a un inhibidor de DNasa, cloruro de zinc, ácido etilendiamintetraacético, guanidina-HCl , isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarco'sina y Na-dodecilsulfato, se pueden agregar a la muestra de sangre . En otra modalidad, el ADN fetal se obtiene de una célula fetal, en donde la célula fetal se puede aislar de fuentes que incluyen pero no se limitan a sangre materna, sangre del cordón umbilical, vellosidades coriónicas, fluido amniótico, tejido embriónico y mucosa obtenida del cuello del útero o vagina de la madre . En una modalidad preferida se pueden aislar las células fetales de la sangre periférica materna. Se puede usar un anticuerpo especifico para las células fetales para purificar las células fetales del suero materno (Mueller et al., Lancet 336: 197-200 (1990); Ganshirt-Ahlert et al., Am. J. Obstet . Gynecol. 166: 1350-1355 (1992)). También se pueden usar técnicas de citometría de flujo para enriquecer las células fetales (Herzenberg et al., PNAS 76: 1453-1455 (1979); Bianchi et al., PNAS 87:3279-3283 (1990); Bruch et al., Prenatal Diagnosis 11:787-798 (1991)). La patente de E.U.A No. 5,432,054 también describe una técnica para la separación de células de glóbulos rojos nucleados fetales, usando un tubo que tiene una parte superior ancha y un fondo estrecho capilar hecho de polietileno. La centrifugación usando un programa de velocidad variable resulta en un apilamiento de las células de glóbulos rojos en el capilar con base en la densidad de las moléculas . La fracción de densidad que contiene glóbulos rojos de baja densidad, incluyendo células de glóbulos rojos fetales, se recupera y luego se hemoliza diferencialmente para destruir preferentemente las células maternales de glóbulos rojos. Se usa un gradiente de densidad en un medio hipertónico para separar las células de glóbulos rojos, enriquecidos ahora en las célula fetales de glóbulos rojos de linfocitos y células maternales fragmentadas. El uso de una solución hipertónica reduce el tamaño de las células de glóbulos rojos, lo cual incrementa su densidad y facilita la purificación de linfocitos más densos; Después de que se han aislado las células fetales, se puede purificar el ADN fetal usando técnicas estándar en el arte. El ácido nucleico que se va a analizar puede ser cualquier ácido nucleico por ejemplo, cromosomas artificiales genómicos, de plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales de levadura, de ADN artificial o hecho por el hombre incluyendo secuencias únicas de ADN, y también el ADN que ha sido transcrito de forma inversa de una muestra de ARN tal, como ADNc. La secuencia de ARN se puede determinar de acuerdo con la invención si es capaz de hacerse en una forma de ADN de hebra doble al usarse como un ADN de plantilla. Los términos ^cebador" y "cebador de oligonucleótido" son intercambiables cuando se usan para discutir uno oligonucleótido que se combina a una plantilla y se puede usar para cebar la síntesis de una copia de esa plantilla. El ADN "amplificado" es un ADN que se ha "copiado" una vez o múltiples, veces por ejemplo por una reacción en cadena de polimerasa. Cuando está disponible para ensayo una gran cantidad de ADN, de manera tal de que ya está presente un número suficiente de copias del lugar cromosomal de interés en la muestra a ser ensayada, puede no ser necesario "amplificar" el ADN del lugar cromosomal de interés en un número aun mayor de copias replicadas. Más bien, simplemente al "copiar" el ADN de plantilla una vez usando un conjunto de cebadores adecuados, que pueden contener estructuras de horquilla que permiten que los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción sean de hebra doble, pueden ser suficiente . "Copia" , como un "ADN copiado" se refiere a un ADN que ha sido copiado una vez, o un ADN que ha sido amplificado en más de una copia. En una modalidad, el ácido nucleico se amplifica directamente en la muestra original que contiene la fuente de ácido nucleico. No es esencial que el ácido nucleico se extraiga, purifique o aisle; solamente necesita suministrarse en una forma que pueda amplificarse. La hibridación de la plantilla de ácido nucleico con cebador, previo a la amplificación, no se requiere. Por ejemplo, se puede efectuar la amplificación en una célula o lisado de muestra usando protocolos estándar bien conocidos en el arte. El ADN que está sobre un soporte sólido, en una preparación biológica fija, o de otra manera en una composición que contiene sustancias que no son de ADN y que se pueden amplificar sin extraer primero el soporte sólido o la preparación fija o sustancias que no son de ADN en la composición, se pueden usar directamente sin purificación adicional, con tal de que el ADN pueda combinarse en sus pares base con los cebadores adecuados, y copiarse, especialmente amplificarse, y los productos copiados o amplificados se puedan recuperar y/o utilizar como se describe en la presente. En una modalidad preferida, el ácido nucleico se extrae, purifica o aisla de materiales que no son de ácido nucleico que están en la muestra original usando métodos conocidos en el arte previo a la amplificación.

En otra modalidad, se extrae, purifica o aisla el ácido nucleico de la muestra original que contiene la fuente del ácido nucleico y previo a la amplificación, se fragmenta el ácido nucleico usando cualquier número de métodos bien conocidos en el arte incluido, pero no limitado a, la digestión enzimática, f agmentación manual, o sonicación. Por ejemplo, se puede digerir el ADN con una o más enzimas de restricción que tienen un sitio de reconocimiento, y especialmente un sitio de reconocimiento de ocho pares base o seis pares base, que no está presente en el lugar cromosomal de interés. Típicamente, el ADN se puede fragmentar hasta cualquier longitud deseada incluyendo 50, 100, 250, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000 y 100,000 pares base de longitud. En otra modalidad, el ADN se fragmenta hasta una longitud promedio de alrededor de 1000 hasta 2000 pares base. Sin embargo, no es necesario que se fragmente el ADN. Los fragmentos de ADN que contienen los lugares cromosomales de interés se pueden purificar a partir de ADN fragmentado antes de la amplificación. Tales fragmentos se pueden purificar al usar los cebadores que se usarán en la amplificación (ver la sección a continuación del "Diseño del cebador" ) , como ganchos para recuperar los lugares cromosomales de interés, con base en la capacidad de tales cebadores para combinar los pares base a los lugares cromosomales de interés. En una modalidad preferida, se usan los cebadores modificados en la etiqueta, tales como por ejemplo, cebadores biotinilados . Al purificar los fragmentos de ADN que contienen los lugares cromosomales de interés, se puede mejorar la especificidad de la reacción de amplificación. Esto minimizará la amplificación de regiones no específicas del ADN de plantilla. La purificación de los fragmentos de ADN también puede permitir una PC múltiple (Reacción en Cadena de Polimerasa) o la amplificación de lugares múltiples de interés con especificidad mejorada. Los lugares cromosomales de interés que van a formar secuencias se pueden seleccionar con base en la secuencia sola. En los humanos, se han descrito más de 1.42 millones de polimorfismos de nucleótidos sencillos (los SNP) (Nature 409: 928-933 (2001) ; The SNP Consortium LTD) . En promedio, hay un SNP cada 1.9 kb del genoma humano. Sin embargo, la distancia entre los lugares cromosomales de interés no necesita considerarse cuando se seleccionan los lugares cromosomales de interés a formar secuencias de conformidad con la invención. Si se va a analizar más de un lugar cromosomal de interés en el ADN genómico, los lugares cromosomales seleccionados de interés pueden estar en el mismo cromosoma o en cromosomas diferentes. En una modalidad preferida, los lugares cromosomales de interés seleccionados se puede agrupar a una región en particular en un cromosoma. Se pueden localizar lugares cromosomales de interés múltiples dentro de una región de ADN de manera tal que aun con cualquier rompimiento o fragmentación del ADN, permanezcan en los lados en los lugares de interés múltiples. Por ejemplo, si el ADN se obtiene y se rompe por fuerzas naturales en fragmentos de 5 Kb, se puede seleccionar lugares múltiples de interés dentro de las regiones 5 kb. Esto permite que cada fragmento, cuando se mide por los lugares de interés dentro de ese fragmento, sirva como una unidad de experimental, y reducirá cualquier ruido experimental libre al comparar los lugares cromosomales de interés sobre cromosomas múltiples. Los lugares cromosomales de interés en un cromosoma puede estar a cualquier distancia uno del otro incluido pero no limitado a 10-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-10,000 y más de 10,000 pares base. En una modalidad preferida, la longitud de la secuencia que se amplifica es preferiblemente diferente para cada lugar cromosomal de interés, de manera que los lugares cromosomales de interés se pueden separar por tamaño. De hecho, es una ventaja de la invención que los cebadores que copian una secuencia completa de genes no se necesitan utilizar. Más bien los lugares cromosomales de interés copiados son preferiblemente sólo una parte pequeña del gen total o una parte pequeña de la región no codificadora de ADN. No hay ventaja para formar secuencias del gen completo ya que esto puede incrementar el costo y retrasar los resultados . Al formar las secuencias solamente de las bases deseadas o lugares cromosomales de interés dentro del gen, se maximiza la eficiencia global del método debido a que permite el número máximo de lugares cromosomales de interés a determinarse en la cantidad de tiempo más rápida y con el costo mínimo. Debido a que se pueden analizar juntas un gran número de secuencias, el método de la invención es especialmente afín a la separación por exclusión de gran escala de un número individual de muestras . Cualquier número de lugares cromosomales de interés se puede analizar y procesar, especialmente en paralelo usando el método de la invención. Las muestras se pueden analizar para determinar la secuencia en un lugar cromosomal de interés o en lugares cromosomales múltiples de interés al mismo tiempo. Los lugares de interés pueden estar presentes sobre un cromosoma sencillo o sobre cromosomas múltiples . Alternativamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-100, 100-250, 250-500, 500-1,000, 1,000-2,000, 2,000-3,000, 3,000-5,000, 5,000-10,000, 10,000-50,000 o más de 50,000 lugares cromosomales de interés se pueden analizar al mismo tiempo cuando se desea una separación por exclusión genética global . Tal separación por exclusión genética global se pudiera desear cuando se usa el método de la invención para proporcionar una huella genética para identificar a un cierto microorganismo o individuo, o para formación de un genotipo SNP . Los lugares cromosomales de interés que se van a copiar, pueden estar dentro de una secuencia de codificación o fuera de una secuencia de codificación. Preferiblemente, uno o más lugares cromosomales que se van a copiar están dentro de un gen. En una modalidad preferida, el ADN de plantilla que se copia es un lugar o lugares de interés que está dentro de una secuencia codificadora genómica ya sea un intrón o exón. En una modalidad altamente preferida, se copian secuencias del ADN del exón. Los lugares cromosomales de interés pueden ser sitios en donde se conozcan mutaciones para provocar enfermedad o predisponer para un estado de enfermedad. Los lugares cromosomales de interés pueden ser sitios de polimorfismos de nucleótidos sencillos. Alternativamente, los lugares cromosomales de interés que se van a copiar pueden estar fuera de las secuencias de codificación, por ejemplo, en una región reguladora transcripcional , y especialmente una secuencia promotora, enriquecedora o represora.

Método para determinación de las secuencias de un lugar de interés Cualquier método que proporcione información sobre la secuencia de un ácido nucleico se puede usar, incluido pero no limitado a, la PCR específica del alelo, PCR espectrometría de masas, hibridación de espectrometría de masas MALDI-TOF, extensión de cebador, detección por fluorescencia, transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET) , polarización por fluorescencia, formación de secuencia de ADN, formación de secuencias dideoxi Sanger, geles formadores de secuencia de ADN, electroforesis capilar sobre una máquina formadora de secuencias de ADN automatizadas, electroforesis de microcanal, microconfiguración, inmunotransferencia Southern, inmunotransferencia de ranura, inmunotransferencia de punto y amplificación de ácidos nucleicos lineales de cebador sencillo como se describe en la patente de E.U.A No. 6,251,639. NSP-IT, GeneChips, HuSNP, Configuración de Perlas, ensayo TaqMan, ensayo invasor, Extensión de masa, o método MassCleave® (hMC) . El método preferido para la detección de la secuencia se ha descrito previamente en la solicitud de E.U.A No. 10/093,618 presentada el 11 de Marzo de 2002 que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

I. Diseño del cebador La secuencias publicadas, incluyendo las secuencias de consenso se pueden usar para seleccionar o diseñar cebadores para su uso en la amplificación del ADN de plantilla. La selección de secuencias a usarse para la construcción de cebadores que flanqueen un lugar cromosomal de interés, se puede hacer por el examen de la secuencia de los lugares de interés o inmediatamente a ello. La secuencia recientemente publicada del genoma humano, proporciona una fuente de información útil de secuencia de consenso a partir de la cual se diseñan cebadores para flanquear un lugar de interés del gen humano deseado . Al "flanquear" un lugar cromosomal de interés significa que las secuencias de los cebadores son tales que al menos una porción de la región 3' de un cebador es complementaria con la hebra antisentido del ADN de plantilla y en la dirección ascendente del lugar cromosomal de interés (cebador delantero), y al menos una porción de la región 3' del otro cebador es complementaria con la hebra de sentido del ADN de plantilla y la dirección descendente del lugar cromosomal de 'interés (cebador reverso) . Se pretender que un "par cebador" especifique un par de cebadores delantero y reverso. Ambos cebadores de un par cebador se combinan en los pares base en una forma que permite la extensión de los cebadores, de manera tal que la extensión resulta en la amplificación del ADN de plantilla en la región del lugar cromosomal de interés . Los cebadores se pueden preparar por una diversidad de métodos que incluyen pero no se limitan a la clonación de secuencias adecuadas y la síntesis química directa usando métodos bien conocidos en el arte (Narang et al . , Methods Enzymol. 68:90(1979); Brown ét al., Methods Enzymol . 68: 109 (1979) ) . También se pueden obtener cebadores de fuentes comerciales tales como Operon Technologies, Amersham Pharmacia Biotech, Sigma, and Life Technologies. Los cebadores pueden tener una temperatura de fusión idéntica. Las longitudes de los cebadores se pueden extender o acortar en la terminación 5' o en la terminación 3' para producir cebadores con temperaturas de fusión deseadas . En una modalidad preferida, uno de los cebadores del par cebador es más extenso que el otro cebador. En una modalidad preferida, las longitudes de combinación de pares base 3' de los cebadores, dentro de un par cebador, difieren. También, la posición de combinación de los pares base de cada par cebador se puede diseñar de manera tal que la secuencia y longitud de los pares cebadores produzcan la temperatura de fusión deseada. La ecuación más sencilla para determinar la temperaturas de fusión de los cebadores más pequeños de 25 pares es la regla de Wallace (Td = 2 (A+T) +4) G+C) ) . También se pueden usar los programas de computadora para diseñar cebadores incluyendo pero no limitado a Array Designer Software (Arrayit Inc.), Oligonucleotide Probé Sequence Design Software for Genetic Analysis (Olympus Optical Co.), NetPrimer, y DNAsis de Hitachi Software Engineering. La TM (temperatura de fusión o de combinación de los pares base) de cada cebador se calcula usando programas de software tales como Net Primer (programa gratuito basado en la web a http: / /premierbiosoft . com/netprimer/netprlaunch/netprlaunen . h tml (Dirección de Internet del 17 de abril de 2002) . En otra modalidad, la temperatura de combinación de los pares base de los cebadores se puede recalcular e incrementar después de cualquier ciclo de amplificación incluido pero no limitado al ciclo 1, 2, 3, 4, 5, ciclos 6-10, ciclos 10-15, ciclos 15-20, ciclos 20-25, ciclos 25-30, ciclos 30-35, o ciclos 35-40. Después de los ciclos iniciales de amplificación, la mitad 5' de los cebadores se incorpora en los productos de cada lugar cromosomal de interés, así la TM se puede recalcular con base en la secuencia de la mitad 5' y la mitad 3f de cada cebador. Por ejemplo, en la figura IB, el primer ciclo de amplificación se efectúa a alrededor de la temperatura de fusión de la región 3' del segundo cebador (región "c") que combina los pares base al ADN de plantilla, que tiene 13 bases. Después del primer ciclo, la temperatura de combinación de los pares base se puede elevar hasta TM2, que es alrededor de la temperatura de fusión de la región 3' que combina los pares base al ADN de plantilla del primer cebador que se detalla como región wb" . El segundo cebador no puede enlazarse al ADN de plantilla original debido a que solamente combina los pares hasta 13 bases en la plantilla original de ADN y TM2 es alrededor de la temperatura de fusión de aproximadamente 20 bases, que es la región de combinación de pares base 3' del primer cebador (FIG. 1C) . Sin embargo, el primer cebador se puede unir al ADN que se copió en el primer ciclo de la reacción. En el tercer ciclo, la temperatura de combinación de los pares base se eleva hasta TM3, que es alrededor de la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador, que se describe como las regiones "c" y " . El ADN de plantilla producido del segundo sito de PCR contiene ambas regiones c' y d' , y por lo tanto, el segundo cebador puede combinar los pares base y extenderse en TM3 (FIG. ID) . Los ciclos restantes se efectúan en T 3. La secuencia completa del primer cebador (a + b' ) puede combinar los pares base a la plantilla del tercer ciclo de PCR, y extenderse (FIG. 1E) . Al incrementar la temperatura de combinación de los pares disminuirá el enlace no específico e incrementa la especificidad de la reacción que es especialmente útil si se amplifica un lugar cromosomal de interés del ADN genómico humano que contiene 3xl09 pares base de longitud.

Como se usa en la presente, el término "alrededor" con respecto a las temperaturas de combinación de los pares base se usa para abarcar temperaturas dentro de 10 grados Celsius de las temperaturas establecidas . En una modalidad, un par cebador se usa para cada lugar cromosomal de interés. Sin embargo, se pueden usar pares cebadores múltiples para cada lugar cromosomal de interés . En una modalidad, los cebadores se diseñan de manera tal que uno o ambos cebadores del par cebador contienen la secuencia en la región 5' para una o más endonucleasas de restricción (enzima de restricción) . Como se usa en la presente, con respecto a la posición en la cual las enzimas de restricción digieren el ADN, la hebra de "sentido" es la hebra de lectura 5' a 3' en la dirección en la cual se corta la enzima de restricción. Por ejemplo, BsmFI reconoce la siguiente secuencia: 5'GGGAC(N)103' 3'CCCTG(N) 145' 5 ' (N) 14GTCCC 3 ' 3' (N)ioCAGGG 5' La hebra de sentido es la hebra que contiene la secuencia "GGGAC" como se lee 5' a 3' en la dirección que corta la enzima de restricción. Como se usa en la presente, con respecto a la posición a la cual las enzimas de restricción difieren el ADN, la hebra "antisentido" es la lectura de hebra 3' a 5' en la dirección en la cual se corta la enzima de restricción. En otra modalidad, uno de los cebadores en un par cebador se diseña de manera tal que contiene un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción para una enzima de restricción que corta a nn" nucleótidos alejados del sitio de reconocimiento, y produce un extremo rebajado 3' y una colgadura 5' que contiene el lugar de interés (referido en la presente como segundo cebador) . "N" es una distancia desde el sitio de reconocimiento al sitio de corte por la enzima de restricción. En otras palabras el segundo cebador de un par cebador contiene un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción que no corta el ADN en el sitio de reconocimiento sino que corta a wn" nucleótidos del sitio de reconocimiento. Por ejemplo, si la secuencia de reconocimiento es para la enzima de restricción BceA I, la enzima cortará diez (10) nucleótidos desde el sitio de reconocimiento en la hebra de sentido, y doce (12) nucleótidos alejados desde el sitio de reconocimiento en la hebra antisentido. La región 3' y preferentemente la mitad 3' de los cebadores se diseña para combinar los pares base hasta una secuencia que flanquea los lugares cromosomales de interés (FIG. 1A) . El segundo cebador puede combinar los pares base y cualquier distancia desde el lugar cromosomal de interés, con tal de que la digestión con la enzima de restricción que reconoce el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción en este cebador genere una colgadura 5' que contiene el lugar de interés. Las colgaduras 5' pueden ser de cualquier tamaño incluido pero no limitado a l, 2, 3, 4, 5, 6 , 7 , 8 , y más de 8 bases . En una modalidad preferida, la terminación 3' del segundo cebador puede combinar los pares base 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más de 14 bases desde el lugar cromosomal de interés o en el lugar cromosomal de interés. En una modalidad preferida, se diseña el segundo cebador para combinar los pares base más cercanos al lugar de interés que el otro cebador de un par cebador (el otro cebador se refiere en la presente como "cebador primero"). El segundo cebador puede ser un cebador delantero o inverso y el primer cebador puede ser un cebador inverso o delantero, respectivamente. Ya sea que el primero o segundo cebador deba ser el cebador delantero o inverso, se puede determinar por cual diseño proporcionara los mejores resultados de formación de secuencias. Por ejemplo, el cebador que combina los pares base más cercanos al lugar de interés puede contener un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BsmF I, que corta (10) nucleótidos desde el sitio de reconocimiento en la hebra sentido y (14) nucleótidos desde el sitio de reconocimiento en la hebra antisentido. En este caso, el cebador se puede diseñar de manera que el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción es de 13 bases, 12 bases, 10 bases u 11 bases desde el lugar cromosomal de interés. Si el sitio de reconocimiento es de 13 bases desde el lugar cromosomal de interés, la digestión con BsmF I generará una colgadura 5' (RXXX) , en donde el lugar de interés (R) es el primer nucleotido en la colgadura (lectura de 3' hasta 5') y X es cualquier nucleótido. Si el sitio de reconocimiento tiene 12 bases desde el lugar de interés, la digestión con BsmF I generará una colgadura 5' (XRXX) , en donde el lugar de interés (R) es el segundo nucleótido en la colgadura (lectura 3' hasta 5'). Si el sitio de reconocimiento tiene 11 bases desde el lugar cromosomal de interés, la digestión con BsmF I generará una colgadura 5 ' (XXRX) , en donde en el lugar cromosomal de interés (R) es el tercer nucleótido en la colgadura (lectura 3' hasta 5') . La distancia entre el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción y el lugar cromosomal de interés se debe diseñar de manera que la digestión con la enzima de restricción genere una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés. La distancia efectiva entre el sitio de reconocimiento y el lugar cromosomal de interés variará dependiendo de la elección de la enzima de restricción.

En otra modalidad, el cebador que combina los pares base más cercanos al lugar de interés con relación al otro cebador, se puede diseñar de manera que la enzima de restricción que genera el colgadura 5', que contiene el lugar de interés, ver a la misma secuencia en el sitio de corte, independiente del nucleó ido en el lugar cromosomal. Por ejemplo, si el cebador que combina los pares base más cercanos al lugar cromosomal de interés se diseña de manera que el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BsmF I (5'GGGAC3') tiene trece bases desde el lugar cromosomal de interés, la enzima de restricción cortará la hebra antisentido, una base en la dirección ascendente del lugar cromosomal de interés. El nucleótido en el lugar cromosomal de interés es adyacente al sitio de corte y puede variar de molécula de ADN a molécula de ADN. Si se desea que los nucleótidos adyacentes al sitio de corte sean idénticos, el cebador se puede diseñar de manera que el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para BsmF I está alejado doce bases desde el sitio del lugar cromosomal de interés. La digestión con BsmF I generará un colgadura 5', en donde el lugar cromosomal de interés está en la segunda posición de la colgadura (lectura 3' hasta 5') ya no está adyacente al sitio de corte. El diseño del cebador de manera que el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción tenga doce (12) bases desde el sitio del lugar cromosomal de interés, permite que los nucleótidos adyacentes al sitio de corte sean iguales, independiente del nucleótido en el lugar cromosomal de interés . También, los cebadores que se han diseñado de manera que el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, BsmF I, tenga once (11) o diez (10) bases desde el lugar cromosomal de interés, permitirán a los nucleótidos adyacentes al sitio de corte que sean iguales, independientemente del nucleótido en el lugar cromosomal de interés. Se pueden emplear estrategias similares del diseño del cebador con otras enzimas de restricción de manera que los nucleótidos adyacentes al sitio de corte serán iguales, independientemente del nucleótido en los lugares cromosomales de interés. La terminación 3 ' del primer cebador (ya sea el delantero o el inverso) se pueden diseñar para combinar los pares base a una distancia elegida desde el lugar cromosomal de interés. Preferiblemente, por ejemplo, esta distancia está entre 1-10, 10-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000 y mayor que 1000 veces alejada del lugar cromosomal de interés. Los sitios de combinación de los pares bases de los primeros cebadores se escogen de manera tal que cada cebador en la dirección ascendente sucesiva se aleja más y más del cebador en la dirección descendente respectiva . Por ejemplo, si en el lugar de interés 1 las erminaciones 3 ' del primero y segundo cebadores están separadas por Z bases, entonces en el lugar cromosomal de interés 2, las terminaciones 3' de los cebadores en dirección ascendente y dirección descendente están Z + K bases separados, en donde K = 1, 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-56, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900-1000, o mayor que 1000 bases (FIG. 2) . El propósito de hacer a los cebadores en la dirección ascendente más y más separados de sus cebadores en la dirección descendente respectiva, es que de esa manera los productos PCR de todos los lugares cromosomales de interés que difieren en tamaño se pueden separar, por ejemplo, sobre un gel formador de secuencias. Esto permite multiplexar por acumulación los productos PCR en las últimas etapas . En una modalidad, la región 5' del primero o segundo cebador puede tener un sitio de reconocimiento para cualquier tipo de enzima de restricción. En una modalidad preferida la región 5' del primero y/o segundo cebador tiene al menos un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción que es diferente del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción que se usa para generar la colgadura 5', que contiene el lugar cromosomal de interés . En una modalidad, la región 5' del primer cebador puede tener un sitio de reconocimiento para cualquier tipo de enzima de restricción. En una modalidad preferida, el primer cebador tiene al menos un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción que es diferente del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción en el segundo cebador. En otra modalidad preferida, el primer cebador se combina en sus pares base alejado del lugar cromosomal de interés que el segundo cebador. En una modalidad preferida, el segundo cebador contiene una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción para la enzima de restricción del tipo IIS que incluye pero no se limita a, BceA I y BsmF I que produce una colgadura de dos bases 5' y una colgadura de cuatro bases .5', respectivamente. Las enzimas de restricción que son del tipo IIS se prefieren debido a que reconocen las secuencias bases asimétricas (no palindrómicas tipo las enzimas ortodoxas de tipo II) . Las enzimas de restricción de tipo IIS desdoblan el ADN en una posición especifica que está fuera del sitio de reconocimiento, típicamente hasta 20 pares base fuera del sitio de reconocimiento. Estas propiedades hacen a las enzimas de restricción tipo IIS, y a los sitios de reconocimiento mismos, especialmente útiles en el método de la invención. Preferiblemente, las enzimas de restricción de tipo IIS usadas en este método dejan una colgadura 5' y una terminación rebajada 3'. Se conoce una amplia variedad de enzimas de restricción de tipo IIS y tales enzimas se han aislado de bacterias, fagos, arqueobacterias y virus de algas eucarióticas y están comercialmente disponibles (Promega, Madison WI ; New England Biolabs, Beverly, MA; Szybalski W. et al., Gene 100: 13-16, 1991). Los ejemplos de las enzimas de restricción de tipo IIS que serían útiles en el método de la invención incluyen pero no se limitan a, enzimas tales como aquellas enlistadas en la Tabla I.

Fuente de la enzima Sitio de Proveedor desdoblamiento/ reconocimiento Alw I-Acinetobacter lwoffii GGATC(4/5) NE Biolabs Alw26 I-Acinetobacter lwoffii GTCTC (1/5) Promega Bbs I-Bacillus laterosporus GAAGAC (2/6) NE Biolabs Bbv I-Bacillus brevís GCAGC(8/12) NE Biolabs BceA I-Bacillus cereus 1315 ACGGC (12/14) NE Biolabs Bmr I-Bacillus megateriu ACTGGG(5/4) NE Biolabs Bsa I-Bacillus stearothermophilus GGTCTC(l/5) NE Biolabs 6-55 Bst71 I-Bacillus GCAGC (8/12) Promega stearothermophilus BsmA I-Bacillus GTCTC (1/5) NE Biolabs stearothermophilus ?664 BsmB I-Bacillus CGTCTC (1/5) NE Biolabs stearothermophilus B61 BsmF I-Bacillus GGGAC (10/14) NE Biolabs stearothermophilus F BspM I-Bacillus species M ACCTGC(4/8) NE Biolabs Ear I-Enterobacter aerogenes CTCTTC (1/4) NE Biolabs Fau I -Flavojbactejrium aquatile CCCGC (4/6) NE Biolabs Fok I-FlavOjacterium oJceonoJoi tes GGATG(9/13) NE Biolabs Hga I-Haemophilus gallinarum GACGC (5/10) NE Biolabs Pie I-Pseudomonas lemoignei GAGTC (4/5) NE Biolabs Sap I-Saccharopolyspora species GCTCTTC(l/4) NE Biolabs SfaN -Streptococcus faecalis GCATC (5/9) NE Biolabs ND547 Sthl32 I-Streptococcus CCCG(4/S) Ningún thermophilus ST132 proveedor comercial (Gen 195:201- 206 (1997) ) En una modalidad, un par cebador, tiene una secuencia en la región 5' de cada uno de los cebadores que proporcionan un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción que es único para una enzima de restricción. En otra modalidad, un par cebador, tiene secuencia en la región 5' de cada uno de los cebadores que proporciona un sitio de restricción que se reconoce por más de una enzima de restricción y especialmente por más de una enzima de restricción de tipo IIS. Por ejemplo, ciertas secuencias de consenso se pueden reconocer por más de una enzima. Por ejemplo, Bsgl, Eco57I y Bpml reconoce todos en consenso (G/C)TgnAG y desdoblan 16 pares base alejados en la hebra antisentido y 14 pares alejados en la hebra de sentido. Un cebador que proporciona tal secuencia de consenso resultaría en un producto que tiene un sitio que se puede reconocer por cualquiera de las enzimas de restricción Bsgl, Eco57I y Bpml .

Otras enzimas de restricción que cortan el ADN a una distancia desde el sitio de reconocimiento y producen una terminación rebajada 3' y una colgadura 5' incluyen las enzimas de restricción tipo III. Por ejemplo, la enzima de restricción EcoP151I reconoce la secuencia 5'CAGCAG3' y desdobla 25 bases en la dirección descendente en la hebra de sentido y 27 bases en la hebra antisentido. Se apreciará además por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, que las nuevas enzimas de restricción se descubren continuamente y pueden adaptarse fácilmente para su uso en la invención objetivo. En otra modalidad, el segundo cebador puede contener una porción de la secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción, en donde el sitio de reconocimiento completo para la enzima de restricción se genera con la amplificación del ADN de plantilla de manera tal que la digestión con la enzima de restricción genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés. Por ejemplo, el sitio de reconocimiento para BsmF I es 5 ' GGGAC KJ^ ' . La región 3' que combina los pares base con al ADN de plantilla del segundo cebador puede terminar con los nucleótidos "GGG" , que no tienen que ser complementarios con el ADN de plantilla. Si la región de combinación de pares base 3' tiene alrededor de 10-20 bases, aun si las últimas 3 bases no se combinan, el cebador se extenderá y generará un sitio BsmF I . Segundo cebador: 5' GGAAATTCCATGATGCGTGGG-» ADN de plantilla: 3 ' CCTTTAAGGTACTACGCAN1N2N3TG5 ' 5 ' GGAAATTCCATGATGCGTNi<N2<N3'AC3 ' El segundo cebador se puede diseñar para combinar los pares base al ADN de plantilla, en donde las siguientes dos bases del ADN de plantilla son timidina y guanina, de manera tal que se incorporan una adenosina y citosina en la cebador formando un sitio de reconocimiento para BsmF I, 5 ' GGGACNioJ'S ' . El segundo cebador se puede diseñar para combinar los pares base en una forma tal que la digestión con BsmF I genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés . En otra modalidad, el segundo^ cebador puede contener un sitio de reconocimiento completo o entero para una enzima de restricción o una porción del sitio de reconocimiento, que genera un sitio de reconocimiento completo con la amplificación del ADN de plantilla de manera tal que la digestión con una enzima de restricción que corta en el sitio de reconocimiento genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés. Por ejemplo, la enzima de restricción BsaJ I se enlaza al siguiente sitio de reconocimiento : 5 ' c'CN1N2GG3 ' . El segundo cebador se puede diseñar de manera tal que la región 3' del cebador termina con WCC" . El SNP de interés se representa por "Ni" ' , y la secuencia de plantilla en la dirección descendente del SNP es WN2' GG" . Segundo cebador 5 ' GGAAATTCCATGATGCGTACC—» ADN de plantilla 3 ' CCTTTAAGGTACTACGCATGGN1N2CC5 ' 5' GGAAATTCCATGATGCCTACCNi-N2-GG3 ' Después de la digestión con BsaJ I, una colgadura 5' de la siguiente secuencia se generaría. 5'C 3' 3 ' GG 1 2CC5 ' Si no se reporta un nucleótido de guanina en el lugar cromosomal de interés, la terminación 3' rebajada se puede ocupar con una citosina no etiquetada que es complementaria al primer nucleótido en la colgadura. Después de retirar la citosina en exceso, se puede usar los ddNTP etiquetados para llenar el siguiente nucleótido, Nlf que representa el lugar cromosomal de interés . Se pueden usar otras enzimas de restricción incluido pero no limitado a BssK I (5' ^CCNGG3 ' ) , Dde I (S'C^TNAG 3'), EcoN I (5 ' CCTNNHINNNAGG3 ' ) , Fnu4H I (5 ' GC½GC3 ' ) , Hinf I (5 ' GÍANTC3 ' ) , Pf1F I (5 ' GACN½NGTC3 ' ) , Sau96 I (5' G^GNCC3 ' ) , ScrF I (5'CCÍNGG3') y Tthlll I (5 ' GACN -NNGTC3 ' ) . No es necesario que la región 3 ' , que se combina en sus pares base al ADN de plantilla, del segundo cebador sea 100% complementaria al ADN de plantilla. Por ejemplo, los últimos 1, 2 ó 3 nucleótidos de la terminación 3' del segundo cebador pueden no hacer coincidencias con el ADN de plantilla. La región del cebador que combina los pares base al ADN de plantilla dirigirá al cebador y permitirá que se extienda el cebador. Aún si, por ejemplo, los últimos 2 nucleótidos no son complementarios al ADN de plantilla el cebador se extenderá y generará un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción. Por ejemplo, los últimos dos nucleótidos en un segundo cebador son "CC" . El segundo cebador combina los pares base al ADN de plantilla y permite la extensión aun si "CC" no es complementario a los nucleótidos Na, y Nb, en el ADN de plantilla. Segundo cebador 5 ' GGAAATTCCATGATGCGTACC ? ADN de plantilla 3 ' CCTTTAAGGTACTACGCATNa'Nb'Ni'N2'CC5 ' 5 ' GGAAATTCCATGATGCCTANaNi,N1N2CC3 ' Después de la digestión con BsaJ I, una colgadura 5' de las siguientes secuencias se generaría 5' C 3' 3' GGNXN2CC 5' Si no se reporta el nucleótido de guanina en el lugar de interés, se puede rellenar la colgadura 5' con una citosina no etiquetada. Se puede enjuagar la citosina en exceso y rellenarse con ddNTP etiquetados. El primer nucleótido incorporado ( i') corresponde al lugar de interés. Si la guanina se reporta en el lugar de interés, los lugares de interés se pueden rellenar con las citocinas sin etiquetar y un nucleótido en la dirección descendente del ' lugar de interés se puede detectar. Por ejemplo, suponiendo que N2 es adenina. Si el lugar cromosomal de interés es guanina, se puede usar la citosina sin etiquetar la reacción de relleno. Después de retirar la citosina, se puede usar una reacción de relleno con la timidina etiquetada. La timidina etiquetada se incorporará solamente si el lugar de interés fue una guanina. Así, la secuencia de un lugar cromosomal de interés se puede determinar al detectar un nucleótido en la dirección descendente del lugar cromosomal de interés. En otra modalidad, el primero y segundo cebadores contienen una porción de una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción, en donde el sitio de reconocimiento completo para la enzima de restricción se genera con la amplificación de ADN de plantilla, de manera tal de que la digestión con la enzima de restricción genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés. El sitio de reconocimiento para cualquier enzima de restricción que contenga uno o más de un nucleótido variable se puede generar incluyendo pero no se limita a, BssK I (5' cCNGG3') , Dde I (5'C4TNAG 3'), EcoN I (5 ' CCT N½NNAGG3 ' ) , Fnu4H I (5'GC NGC3' ) , Hinf I (5 ' GANTC3 ' ) , PflF I (5'GACNlNNGTC3' ) , Sau96 I (5' G!G CC3 ' ) , ScrF I (5 ' CC>INGG3 ' ) y Tthl 11 I (5 ' GACNÍNNGTC3 ' ) En una modalidad preferida las regiones 3' del primero y segundo cebador contienen la secuencia parcial para una enzima de restricción, en donde la secuencia parcial contiene 1, 2, 3, 4 ó más de 4 no coincidencias con el ADN de plantilla; estas no coincidencias crean el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción. El número de no coincidencias que se puede tolerar en la terminación 3 ' depende de la longitud del cebador. Por ejemplo, si el lugar cromosomal de interés está representado por Nlf se puede diseñar un primer cebador para ser complementario con el ADN de plantilla detallado a continuación como región "a". La región 3' del primer cebador termina con "CC" , que no es complementaria al ADN de plantilla. El segundo cebador se diseña para ser complementario al ADN de plantilla que se detalla a continuación como región "b"'. La región 3' del segundo cebador termina con "CC" , que no es complementaria con el ADN de plantilla. Primer cebador 5' a CC—» ADN de plantilla 3' a¿ A i-N2'TT bj 5' 5 ' a TTNaN2AA b 3 ' <-CC b' 5 ' segundo cebador Después de una ronda de amplificación, se generarían los siguientes productos : 5' a CCNiN2AA b 3' y En el segundo ciclo, se pueden combinar los pares base de los cebadores a las plantillas que se generaron desde el primer ciclo de PCR : 5 ' a CCN^AA b 3 ' <-CC b 5 ' <-CC a 5 ' 5 ' b' CCN2N3AA a' 3 ' Después del ciclo dos de PCR , los siguientes productos pueden ser generados : 5 ' a CCN1N2GG b 3 ' 5 ' a' GGNiM2CC b' 3 ' Es generado el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para BsaJ I, y después de digestión con BasJ I, es generada una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés . El lugar cromosomal de interés puede ser detectado como se describe en detalle a continuación. En otra modalidad, un par cebador tiene secuencia en la región 5' de cada uno de los cebadores que provee dos o más sitios de restricción que son reconocidos por dos o más enzimas de restricción. En una modalidad más preferida, un par de cebador tiene diferentes sitios de reconocimiento de enzima de restricción en las regiones 5', especialmente las terminaciones 5', de manera que una enzima de restricción diferente es requerida para dividir cualquiera de las secuencias no deseadas. Por ejemplo, el primer cebador para el lugar cromosomal de interés "A" puede contener secuencia reconocida por una enzima de restricción, "X", la cual puede ser de cualquier tipo de enzima de restricción, y el segundo cebador para el lugar cromosomal de interés "A" , el cual combina pares base cercanos al lugar cromosomal de interés, puede contener secuencia para una enzima de restricción, "Y" , la cual es una enzima de restricción de Tipo IIS que corta los nucleótidos un" y deja una colgadura 5' y una terminación 3' rebajada. La colgadura 5' contiene el lugar cromosomal de interés. Después de unir el ADN amplificado a los pozos recubiertos de estreptavidina, se puede digerir con enzima "Y", enjuagarse, luego rellenar con nucleótidos etiquetados y enjuagar, y luego digerirse con enzima de restricción "X" , la cual liberará el fragmento de ADN que contiene el lugar cromosomal de interés de la matriz sólida. El lugar cromosomal de interés puede ser analizado por detección del nucleótido etiquetado que fue "rellenado" en el lugar cromosomal de interés, por ejemplo en el sitio SNP. En otra modalidad, los segundos cebadores de los diferentes lugares cromosomales de interés que están siendo amplificados de acuerdo con la invención contienen secuencia de reconocimiento en las regiones 5' para la misma enzima de restricción y de la misma manera todos los primeros cebadores también contienen el mismo sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, la cual es una enzima diferente de la enzima que reconoce los segundos cebadores. En otra modalidad, los segundos cebadores para los lugares cromosomales múltiples de interés que están siendo amplificados de acuerdo con la invención contienen secuencias de reconocimiento de enzima de restricción en las regiones 5' para enzimas de restricción diferentes . En otra modalidad, los primeros cebadores para los lugares cromosomales múltiples de interés que están siendo amplificados de acuerdo con la invención contienen secuencias de reconocimiento de enzima de restricción en las regiones 5' para enzimas de restricción diferentes. Las secuencias de enzima de restricción múltiple proveen una oportunidad para influenciar el orden en el cual los lugares cromosomales de interés acumulados son liberados del soporte sólido. Por ejemplo, si 50 lugares cromosomales de interés son amplificados, los primeros cebadores pueden tener una etiqueta en la terminación 5' extrema para ayudar en la purificación y un sitio de reconocimiento de enzima de restricción, y los segundos cebadores pueden contener un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción de tipo IIS. Por ejemplo, varios de los primeros cebadores pueden tener un sitio de reconocimiento de enzima de restricción para EcoR I, otros primeros cebadores pueden tener un sitio de reconocimiento para Pst I, y todavía otros primeros cebadores pueden tener un sitio de reconocimiento para BamH I. Después de la amplificación, los lugares cromosomales de interés pueden ser unidos a un soporte sólido con la ayuda de la etiqueta en los primeros cebadores. Al efectuar los productos de digestión de restricción una enzima de restricción en un tiempo, puede liberar en forma seriada los lugares cromosomales de interés amplificados. Si la primera digestión es realizada con EcoRI, los lugares cromosomales de interés amplificados con los primeros cebadores que contienen el sitio de reconocimiento para EcoR I serán liberados, y recolectados mientras los otros lugares cromosomales de interés permanecen enlazados al soporte sólido. Los lugares cromosomales de interés amplificados pueden ser liberados selectivamente del soporte sólido por digestión con una enzima de restricción en un tiempo. El uso de sitios de reconocimiento de enzima de restricción diferentes en los primeros cebadores permite un número grande de lugares cromosomales de interés a ser amplificados en un tubo de reacción único. En una modalidad preferida, cualquier región 5' del sitio de digestión de enzima de restricción de cada cebador puede ser modificada con un grupo funcional que se provea para manipulación, procesamiento, identificación, y/o purificación del fragmento. Los ejemplos de los grupos funcionales, o etiquetas, incluyen pero no están limitados a biotina, derivados de biotina, carbohidratos, haptenos, pigmentos, moléculas radioactivas, anticuerpos, y fragmentos de anticuerpos, péptidos, y moléculas inmunogénicas . En otra modalidad, el ADN de plantilla puede ser replicado una vez, sin ser amplificado más allá de una sucesión única de replicación. Esto es usado cuando hay una gran cantidad del ADN disponible para análisis de manera que una gran cantidad de copias de los lugares cromosomales de interés ya están presentes en la muestra, y además las copias no son necesarias. En esta modalidad, los cebadores son diseñados preferiblemente para contener una estructura de "horquilla" en la región 5', de manera que la secuencia duplica hacia atrás y combina pares base para una secuencia interna para ella misma en una manera complementaria. Cuando el ADN de plantilla es replicado una vez, la secuencia de ADN que comprende el sitio de reconocimiento sería de hebra sencilla sino es por la estructura de "horquilla" . Sin embargo, en la presencia de la estructura de horquilla, esa región es de hebra doble efectivamente, suministrando así un sustrato de hebra doble para actividad por enzimas de restricción. Al grado de que las condiciones de reacción sean compatibles, todos los pares de cebadores a analizar de un lugar o lugares cromosomales de interés de ADN pueden ser mezclados juntos para usarse en el método de la invención. En una modalidad preferida, todos los pares de cebadores son mezclados con el ADN de plantilla en un recipiente de reacción único. Tal recipiente de reacción puede ser, por ejemplo, un tubo de reacción, o un pozo de una placa de microti ulación. Alternativamente, para evitar la competencia de los nucleótidos y para minimizar los dímeros de cebadores y dificultades con las temperaturas de combinación de pares base para cebadores, cada lugar cromosomal de interés o grupos pequeños de lugar cromosomal de interés puede ser amplificado en tubos o pozos de reacción separados, y los productos se acumulan posteriormente si se desea. Por ejemplo, las reacciones separadas pueden ser acumuladas en un recipiente de reacción único antes de la digestión con la enzima de restricción que genera una colgadura 5', la cual contiene el lugar cromosomal de interés o el sitio SNP, y una terminación rebajada 3'. Preferiblemente, los cebadores de cada par de cebadores son provistos en cantidades equimolares. También, de forma especialmente preferible, cada uno de los diferentes pares de cebadores se proporciona en cantidades equimolares relativas a los otros pares que están siendo usados. En otra modalidad, las combinaciones de pares de cebadores que permiten amplificación eficiente de sus respectivos lugares cromosomales de interés pueden ser usados (ver por ejemplo FIG. 2) . Tales combinaciones pueden ser determinadas antes de usar en el método de la invención. Las placas de múltiples pozos y las máquinas PCR pueden ser usadas para seleccionar pares de cebadores que trabajan eficientemente uno con el otra. Por ejemplo, las máquinas PCR de gradiente, tales como la máquina PCR de gradiente Eppendorf Mastercycler®, puede ser usada para seleccionar la temperatura de combinación de pares base óptima para cada par de cebadores. Los pares de cebadores que tienen propiedades similares pueden ser usados juntos en un tubo de reacción único . En otra modalidad, un recipiente de muestra múltiple que incluye pero no está limitado a una placa de 96 pozos o más puede ser usado para amplificar un lugar cromosomal de interés único con los mismos pares de cebadores para muestras de ADN de plantilla múltiple con condiciones de PCR óptimas para tal lugar cromosomal de interés. Alternativamente, un recipiente de muestra múltiple separado puede ser usado para la amplificación de cada lugar cromosomal de interés y los productos para cada muestra de ADN de plantilla son acumulados posteriormente. Por ejemplo, el gen A de 96 muestras de ADN diferentes puede ser amplificado en la placa de microtitulación 1, el gen B de 96 muestras de ADN diferentes puede ser amplificado en la placa de microtitulación 2, etc., y luego los productos de amplificación pueden ser acumulados . El resultado de los lugares cromosomales de interés múltiples de amplificación es una preparación que contiene productos PCR representativos que tienen la secuencia de cada lugar cromosomal de interés. Por ejemplo, si el ADN de un individuo solamente es usado como el ADN de plantilla y si cientos de lugares cromosomales de interés relacionados con enfermedad fueron amplificados del ADN de plantilla, el ADN amplificado podría ser una mezcla pequeña de los productos de PCR de cada uno de los lugares cromosomales de interés. Tal preparación puede además ser analizada en ese tiempo para determinar la secuencia en cada lugar cromosomal de interés o solamente en alguno de los lugares cromosomales de interés. Adicionalmente, la preparación podría ser almacenada en una manera que conserve el ADN y pueda ser analizada en un tiempo posterior. La información contenida en el ADN amplificado puede ser revelada por cualquier método apropiado incluyendo pero no limitada a detección de fluorescencia, secuenciamiento, electroforesis de gel, y espectrometría de masa (ver sección posterior de "Detección de Nucleótido Incorporado") .

II. Amplificación de los Lugares Cromosomales de Interes El ADN de plantilla puede ser amplificado usando cualquier método apropiado conocido en la técnica que incluye pero no está limitado a PCR (reacción de cadena de polimerasa) , 3SR (reacción de secuencia auto sostenida) , LCR (reacción de cadena de ligasa) , RACE-PCR (amplificación rápida de terminaciones de cADN) , PLCR (una combinación de reacción de cadena de polimerasa y reacción de cadena de ligasa) , amplificación del fago Q-beta (Shah y colaboradores, J Medical Micro. 33:1435-41 (1995)), SDA (amplificación de desplazamiento estándar) , SOE-PCR (PCR de extensión traslapada unida), y similares. Estos métodos pueden ser usados para diseñar variaciones del cebador liberable mediante reacción de amplificación cíclica descrita explícitamente en esta aplicación. En la mayoría de las modalidades preferidas, el ADN de plantilla es amplificado usando PCR (PCR: A Practical Approach, M. J. McPherson, y colaboradores, IRL Press (1991) ; Protocolos PCR: A Guide to Methods and Applications, Innis, y colaboradores, Academic Press (1990) ; y tecnología PCR: Principáis and Applications of DNA Amplification, H. A. Erlich, Stockton Press (1989)). La PCR también está descrita en numerosas patentes de EUA, incluyendo Patentes de EUA Nos. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; 4,889,818; 5,075,216; 5,079,352; 5,104,792; 5,023,171; 5,091,310; y 5,066,584.

Los componentes de una reacción PCR tradicional incluyen pero no están limitados a un ADN de plantilla, cebadores, una solución amortiguadora de reacción (dependiendo la selección de la polimerasa) , los dNTP (dATP, dTTP, dGTP, y dCTP) y una polimerasa de ADN. Los cebadores de PCR apropiados pueden ser diseñados y preparados como se discutió arriba (ver la sección de arriba de "Diseño de cebadores") . Por poco tiempo, la reacción es calentada a 95°C por 2 minutos para separar las hebras del ADN de plantilla, la reacción es enfriada a una temperatura apropiada (determinada por el cálculo de la temperatura de combinación de pares base de los cebadores diseñados) para permitir a los cebadores combinar pares base al ADN de plantilla, y calentado a 72 °C por dos minutos para permitir la extensión. En una modalidad preferida, la temperatura de combinación de pares base es incrementada en cada uno de los tres primeros ciclos de amplificación para reducir la amplificación no específica. Ver también el Ejemplo 1, abajo. El T 1 del primer ciclo de PCR está alrededor de la temperatura de fusión de la región 3' del segundo cebador que combina pares base para el ADN de plantilla. La temperatura de combinación de pares base puede ser elevada en los ciclos 2-10, preferiblemente en el ciclo 2, para TM2 , la cual está alrededor de la temperatura de fusión de la .región 3', la cual combina pares base para el ADN de plantilla, del primer cebador. Si la temperatura de combinación de pares base es elevada en el ciclo 2 , la temperatura de combinación de pares base permanece alrededor de la misma hasta que la siguiente se incremente en una temperatura de combinación de pares base. Finalmente, en cualquier ciclo posterior al ciclo en el cual la temperatura de combinación de pares base fue incrementada a TM2 , preferiblemente el ciclo 3, la temperatura de combinación de pares base es elevada a TM3, la cual está alrededor de la temperatura de fusión del segundo cebador completo. Después del tercer ciclo, la temperatura de combinación de pares base para los ciclos que permanecen puede ser alrededor de TM3 o puede ser además incrementada. En este ejemplo, la temperatura de combinación de pares base es incrementada en los ciclos 2 y 3. Sin embargo, la temperatura de combinación de pares base puede ser incrementada de una temperatura de combinación de pares base baja en el ciclo 1 a una temperatura de combinación de pares base alta en el ciclo 2 sin ningún incremento más en la temperatura o la temperatura de combinación de pares base puede cambiar progresivamente de una temperatura de combinación de pares base baja a una temperatura de combinación de pares base alta en cualquier número de pasos de incremento. Por ejemplo, la temperatura de combinación de pares base puede ser cambiada en los ciclos 2, 3, 4, 5, 6, etc.

Después de la combinación de pares base, la temperatura en cada ciclo es incrementada a una temperatura de "extensión" para permitir a los cebadores "extenderse" y luego después de la extensión, la temperatura en cada ciclo es incrementada a la temperatura de desnaturalización. Para los productos de la PCR menores de 500 pares base de tamaño, pueden eliminarse el paso de extensión en cada ciclo y solo tener los pasos de desnaturalización y combinación de pares base. Una reacción PCR tradicional consiste de 25-45 ciclos de desnaturalización, combinación de pares base y extensión como se describió arriba. Sin embargo, como se notó previamente, aún puede ser suficiente solamente un ciclo de amplificación (una copia) para practicar la invención. En otra modalidad, los conjuntos múltiples de cebadores en donde un conjunto cebador comprende un cebador delantero y un cebador reverso, se pueden usar para amplificar el ADN de plantilla para 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 o más de 20 ciclos, y luego el producto amplificado se amplifica además en una reacción con un conjunto cebador sencillo o un subconjunto de los conjuntos cebadores múltiples. En una modalidad preferida, se usa una concentración baja de cada conjunto cebador para minimizar la formación del dímero del cebador. Se puede amplificar una concentración baja del ADN de partida usando conjuntos de cebador múltiples. Se puede usar cualquier número de conjunto de cebador en la primera reacción de amplificación que incluye pero no se limitan a, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-1000, y más de 1000. En otra modalidad, el producto amplificado se amplifica en una segunda reacción con un conjunto cebador sencillo. En otra modalidad, el producto amplificado se amplificado más con un subcon unto de pares cebadores múltiples que incluyen pero no se limitan a, 2-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90,-90-100, 100-150, 150-200, 200-250 y más de 250. Los conjuntos múltiples de cebadores amplificarán los lugares cromosomales de interés, de manera tal que una cantidad de ADN de plantilla no es limitante para el número de lugares que se pueden detectar. Por ejemplo, si se aisla el ADN de plantilla, de una célula sencilla o se obtiene el ADN de plantilla de una mujer embarazada, que comprende el ADN de plantilla maternal y el ADN de plantilla fetal, se pueden usar en bajas concentraciones de cada conjunto cebador en una primera reacción de amplificación para amplificar los lugares cromosomales de interés. La baja concentración de cebadores reduce la formación del cebador-dímero e incrementa la probabilidad de que los cebadores se combinaran en los pares base al ADN de plantilla y permite que se extienda la polimerasa. El número óptimo de ciclos efectuados con los conjuntos de cebador múltiples se determinan por la concentración de los cebadores. Siguiendo la primera reacción de amplificación se pueden agregar cebadores adicionales para amplificar además los lugares cromosomales de interés. Se pueden agregar cantidades adicionales de cada conjunto cebador y amplificarse además en una reacción sencilla. Alternativamente, el producto amplificado se puede amplificar además usando un conjunto cebador sencillo en cada reacción o subconjunto de los conjuntos cebadores múltiples. Por ejemplo, si se usaron 150 conjuntos de cebador en la primera reacción de amplificación, se pueden usar los subconjuntos de 10 conjuntos de cebador para amplificar además el producto de la primera reacción. Cualquier polimerasa de ADN que cataliza la extensión del cebador puede ser usada incluyendo pero no limitada a polimerasa de ADN de E. coli, fragmento Klenow de polimerasa de ADN de E. coli I, polimerasa de ADN T , polimerasa de ADN T4, polimerasa Taq, polimerasa de ADN Pfu, polimerasa de ADN Vent, bacteriófago 29, y polimerasa de ADN genómica de REDTaq™, o secuenasa. Preferiblemente, es usada una polimerasa de ADN termoestable . Una PCR de "inicio caliente" también puede ser realizada en donde la reacción es calentada a 95 CC por dos minutos antes de la adición de la polimerasa o la polimerasa puede ser mantenida inactiva hasta el paso de primer calentamiento en el ciclo 1. La PCR de "inicio caliente" puede ser usada para minimizar la amplificación no específica. Cualquier número de ciclos de PCR puede ser usado para amplificar el ADN, incluyendo pero no limitado a 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, ó 45 ciclos. En una modalidad más preferida, el número de ciclos de PCR realizados es tal que las cantidades equimolares de cada uno de los lugares cromosomales de interés son producidos .

III. Purificación de ADN Amplificado La purificación del ADN amplificado no es necesaria para practicar la invención. Sin embargo, en una modalidad, si la purificación es preferida, la terminación 5' del cebador (primero o segundo cebador) puede ser modificada con una etiqueta que facilita la purificación de los productos de PCR. En una modalidad preferida, el primer cebador es modificado con una etiqueta que facilita la purificación de los productos de PCR. Es preferible la misma modificación para todos los cebadores , aunque pueden ser usadas modificaciones diferentes si se desea para separar los productos de PCR en grupos diferentes. La etiqueta puede ser cualquier porción química incluyendo, pero sin limitarse a un radioisótopo, molécula reportera fluorescente, molécula reportera quimioluminiscente, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, apteno, biotina, derivado de biotina, fotobiotina, iminobiotina, digoxigenina, avidina, enzima, acridinio, azúcar, enzima, apoenzima, oligonucleótido homopolimérico, hormona, porción ferromagnética, porción paramagnética, porción diamagnética, porción fosforescente, porción luminiscente, porción eletroquimioluminiscente, porción cromática, porción que tiene una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica o conductividad eléctrica, o combinaciones de estas. 1 Como un ejemplo, las terminaciones 5' de los cebadores pueden ser biotinilados (Kandpal y colaboradores, Nucleic Acids Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka y colaboradores, Biotechniques 10:30-34 (1991); Green y colaboradores, Nucleic Acids Res. 18:6163-6164 (1990)). La biotina provee una etiqueta de afinidad que puede ser usada para purificar el ADN copiado del ADN genómico o cualquiera otra de las moléculas de ADN que no son de interés. Las moléculas biotiniladas pueden ser purificadas usando una matriz recubierta de estreptavidina como se mostró en la FIG. 1F, que incluye pero no está limitado a placas de alto recubrimiento, transparente, Streptawell, de Roche Molecular Biochemicals (número de catálogo 1 645 692, como se enlistó en Roche Molecular Biochemicals, catálogo 2001 Biochemicals) .

El producto de la PCR de cada lugar cromosomal de interés es colocado en pozos separados de placas recubiertas de estreptavidina. Alternativamente, los productos de PCR de los lugares cromosomales de interés pueden ser acumulados y colocados en una matriz recubierta de estreptavidina, que incluyen pero no están limitados a las placas High-Bind, transparentes, Streptawell, de Roche Molecular Biochemicals (número de catálogo 1 645 692, como se listó en Roche Molecular Biochemicals, catálogo 2001 Biochemicals) . El ADN amplificado también puede ser separado del ADN de plantilla usando métodos no afines conocidos en la técnica, por ejemplo, electroforesis de gel de poliacrilamida que usa protocolos estándar.

IV. Digestión de ADN Amplificado El ADN amplificado puede ser digerido con una enzima de restricción que reconoce una secuencia que se ha proporcionado en el primer o segundo cebador que usa protocolos estándar conocidos dentro de la técnica (FIGS. 6A-6D) . La enzima usada depende del sitio de reconocimiento de restricción generado con el primero o segundo cebador. Ver sección de "Diseño de Cebador", arriba, para detalles sobre los sitios de reconocimiento de restricción generados en cebadores. Las enzimas de restricción Tipo IIS son extremadamente útiles en que cortan aproximadamente 10-20 pares base exteriores del sitio de reconocimiento. Preferiblemente, las enzimas de restricción de Tipo IIS usadas son aquellas que generan una colgadura 5' y una terminación 3' rebajada, que incluyen pero no están limitadas a BceA I y BsmF I (ver por e emplo Tabla 1) . En la mayoría de las modalidades preferidas, el segundo cebador (ya sea delantero o inverso) , contienen una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción para BsmF I o BceA I . La enzima de restricción de Tipo IIS BsmF I reconoce la secuencia de ácido nucleico GGGAC, y corta 14 nucleótidos del sitio de reconocimiento en el estándar antisentido y 10 nucleótidos del sitio de reconocimiento en 'la hebra sentido. La digestión con BsmF I genera una colgadura 5' de cuatro (4) bases. Por ejemplo, si el segundo cebador es diseñado de manera que después de la amplificación el sitio de reconocimiento de enzima de restricción es 13 bases del lugar cromosomal de interés, luego después de la digestión, el lugar cromosomal de interés es la primera base en la colgadura 5' (lectura 3' a 5')/ y la terminación 3' rebajada es una base en la dirección 5' del lugar cromosomal de interés. La terminación rebajada 3' puede ser rellenada con un nucleótido que es complementario al lugar cromosomal de interés. Una base de la colgadura puede ser rellenada usando didesoxinucleótidos . Sin embargo, 1, 2, 3, ó 4 bases de la colgadura pueden ser rellenadas usando desoxinucleótidos o una mezcla de didesoxinucleótidos y desoxinucleótidos . La enzima de restricción BsmF I corta diez (10) nucleótidos de ADN del sitio de reconocimiento en la hebra sentido y catorce (14) nucleótidos del sitio de reconocimiento en la hebra antisentido. Sin embargo, en una manera dependiente de la secuencia, la enzima de restricción BsmF I también corta once (11) nucleótidos del sitio de reconocimiento en la hebra sentido y quince (15) nucleótidos del sitio de reconocimiento en la hebra antisentido. Así, dos poblaciones de moléculas de ADN existen después de la digestión: moléculas de ADN cortadas en 10/14 y moléculas de ADN cortadas en 11/15. Si el sitio de reconocimiento para BsmF I es 13 bases del lugar croraosomal de interés en el producto amplificado, las moléculas de ADN cortadas en la posición 11/15 generarán una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés en la segunda posición de la colgadura (lectura 3' y 5')· La terminación rebajada 3' de las moléculas de ADN puede ser rellenada con nucleótidos etiquetados. Por ejemplo, si los didesoxinucleótidos etiquetados son usados, la terminación rebajada 3' de las moléculas cortadas en 11/15 puede ser rellenada con una base, que corresponde a la base en la dirección ascendente del lugar cromosomal de interés, y la terminación rebajada 3' de las moléculas cortadas en 10/14 puede ser rellenada con una base, que corresponde al lugar cromosomal de interés. Las moléculas de ADN que han sido cortadas en la posición 10/14 y las moléculas de ADN que han sido cortadas en la posición 11/15 pueden ser separadas por tamaño, y los nucleótidos incorporados son detectados. Esto permite la detección del nucleótido antes del lugar cromosomal de interés, detección del lugar cromosomal de interés, y potencialmente los tres pares bases después del lugar cromosomal de interés . Alternativamente, si la base en dirección ascedente del lugar cromosomal de interés y el lugar cromosomal de interés son nucleótidos diferentes, entonces la terminación rebajada 3' de las moléculas cortadas en 11/15 pueden ser rellenada con desoxinucleótido que es complementario a la base en la dirección ascedente. El desoxinucleótido que permanece es lavado, y el sitio del lugar cromosomal de interés puede ser rellenado con desoxinucleótidos etiquetados, desoxinucleótidos no etiquetados, didesoxinucleótidos etiquetados, o didesoxinucleótidos no etiquetados. Después de la reacción de rellenado, el nucleótido puede ser detectado por cualquier método apropiado. Así, después de la primera reacción de rellenado con dNTP, la terminación rebajada 3' de las moléculas cortadas en 10/14 y 11/15 está en dirección ascendente desde el lugar cromosomal de interés. La terminación rebajada 3' ahora puede ser rellenada en una base, la cual corresponde al lugar cromosomal de interés, dos bases, tres bases o cuatro bases. La enzima de restricción BceA I reconoce la secuencia de ácido nucleico ACGGC y corta 12 (doce) nucleótidos del sitio de reconocimiento en la hebra sentido y 14 (catorce) nucleótidos del sitio de reconocimiento en la hebra antisentido. Si la distancia del sitio de reconocimiento para BceA I en el segundo cebador está diseñada para estar trece (13) bases del lugar cromosomal de interés (ver FIGS . 4A-4D) , la digestión con BceA I generará una colgadura 5' de dos bases, la cual contiene el lugar cromosomal de interés, y una terminación rebajada 3' que están en la dirección ascendente del lugar cromosomal de interés . El lugar cromosomal de interés es el primer nucleótido en la colgadura 5' (lectura 3' y 5' ) · El corte alternativo también es visto con la enzima de restricción BceA I, aunque en una frecuencia mucho menor que es vista con BsmF I . La enzima de restricción BceA I puede cortar trece (13) nucleótidos del sitio de reconocimiento en la hebra sentido y quince (15) nucleótidos del sitio de reconocimiento en la hebra antisentido. Así, existen dos poblaciones de moléculas de ADN: moléculas de ADN cortadas en 12/14 y moléculas de ADN cortadas en 13/15. Si el sitio de reconocimiento de enzima de restricción está 13 bases del lugar cromosomal de interés en el producto amplificado, las moléculas de ADN cortadas en la posición 13/15 producen una colgadura 5', la cual contiene el lugar cromosomal de interés en la segunda posición de la colgadura (lectura 3' a 5')· Los didesoxinucleótidos etiquetados pueden ser usados para ocupar la terminación rebajada 3' de las moléculas de ADN. Las moléculas de ADN cortadas en 13/15 tendrán la base en la dirección 5' del lugar cromosomal de interés ocupado, y las moléculas de ADN cortadas en 12/14 tendrán el sitio del lugar cromosomal de interés ocupado. Las moléculas de ADN cortadas en 13/15 y aquellas cortadas en 12/14 pueden ser separadas por el tamaño, y el nucleótido incorporado es detectado. Así, el corte alternativo puede ser usado para obtener información adicional de secuencia. Alternativamente, si las dos bases en la colgadura 5' son diferentes, la terminación rebajada 3' de las moléculas de ADN, que fueron cortadas en 13/15, pueden ser ocupadas con el desoxinucleotido complementario a la primera base en la colgadura, y el exceso de desoxinucleotido sacado por lavado. Después del rellenado, la terminación rebajada 3' de las moléculas de ADN que fueron cortadas en 12/14 y las moléculas que fueron cortadas en 13/15 está en la dirección ascendente del lugar cromosomal de interés. Las terminaciones rebajadas 3' pueden ser llenadas con cualquiera de los didesoxinucleótidos etiquetados, didesoxinucleótidos no etiquetados, desoxinucleótidos etiquetados, o desoxinucleótidos no etiquetados. Si los cebadores proporcionan diferentes sitios de restricción para algunos de los lugares cromosomales de interés que fueron copiados, todas las enzimas de restricción necesarias pueden ser agregadas juntas para digerir el ADN copiado simultáneamente. Alternativamente, los productos de digestión de restricción diferentes pueden estar hechos en secuencia, por ejemplo, usando una enzima de restricción a un tiempo, de manera que solamente el producto que es específico para esa enzima de restricción es digerido. Las condiciones de digestión óptimas de la enzima de restricción, incluyen pero no se limitan a, la concentración de enzima, temperatura, condiciones de la solución amortiguadora y el tiempo de digestión se puede optimizar para cada enzima de restricción. Por ejemplo, un corte alternativo que se observa con la enzima de restricción de tipo IIS BsmF I se puede reducir, si se desea, al efectuar la digestión de la enzima de restricción, a temperaturas inferiores que incluyen pero no se limitan a, 25-16°, 16-12°C, 12-8°C, 8-4°C, ó 4-0°C.

V. Incorporación de los Nucleotidos Etiquetados La digestión con la enzima de digestión que reconoce la secuencia en el segundo cebador genera una terminación 3 ' rebajada y una colgadura 5', la cual contiene el lugar cromosomal de interés. (FIG. 1G) . La terminación 3' rebajada puede ser llenada en el uso de la colgadura 5' como una plantilla en la presencia de un nucleótido no etiquetado o etiquetado o una combinación de ambos nucleótidos no etiquetado y etiquetado. Los nucleótidos pueden estar etiquetados con cualquier tipo de grupo químico o porción que se permite para la detección incluyendo pero no está limitada a moléculas radioactivas, moléculas fluorescentes, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, haptenos, carbohidratos, biotina, derivados de biotina, porciones fosforescentes, porciones luminiscentes, porciones electroquimioluminiscentes, porciones cromáticas, y porciones que tienen una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica o conductividad eléctrica. Los nucleótidos pueden ser etiquetados con una o más de un tipo de grupo o porción química. Cada nucleótido puede ser etiquetado con el mismo grupo químico o porción. Alternativamente, cada nucleótido diferente puede ser etiquetado con un grupo o porción química diferente. Los nucleótidos etiquetados pueden ser d TP, ddNTP, o una mezcla de ambos dNTP y ddNTP. Los nucleótidos no etiquetados pueden ser dNTP, ddNTP o una mezcla de ambos dNTP y ddNTP. Cualquier combinación de nucleótidos puede ser usada para incorporar nucleótidos que incluyen pero no están limitados a desoxinucleótidos no etiquetados, desoxinucleótidos etiquetados, didesoxinucleótidos no etiquetados, didesoxinucleótidos etiquetados, una mezcla de desoxinucleótidos etiquetados y no etiquetados, una mezcla de didesoxinucleótidos etiquetados y no etiquetados, una mezcla de desoxinucleótidos etiquetados y didesoxinucleótidos etiquetados, una mezcla de desoxinucleótidos etiquetados y didesoxinucleótidos no etiquetados, una mezcla de desoxinucleótidos no etiquetados y didesoxinucleótidos no etiquetados, una mezcla de desoxinucleótidos no etiquetados y didesoxinucleótidos etiquetados, didesoxinucleótido análogo, desoxinucleótido análogo, una mezcla de didesoxinucleótido análogo y desoxinucleótido análogo, nucleotido fosforilado análogo, trifosfatos 2-desoxinucleótido-5' y trifosfatos 2'-desoxinucleótido modificados . Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 1H, en la presencia de una polimerasa, la terminación rebajada 3' puede ser llenada con d TP fluorescente usando la colgadura 5' como plantilla. La incorporación de ddNTP puede ser detectada usando cualquier método apropiado que incluye pero no está limitado a detección de fluorescencia. Todos los cuatro nucleótidos pueden estar etiquetados con grupos fluorescentes diferentes, los cuales - permitirán una reacción para ser realizada en la presencia de todos los cuatro nucleótidos etiquetados. Alternativamente, pueden ser realizadas cuatro reacciones de "rellenado" separadas para cada lugar cromosomal de interés; 'cada una de las cuatro reacciones contendrán un nucleotido etiquetado diferente (por ejemplo, ddATP*, ddTTP*, ddUTP*, o ddCTP* , donde * indica un nucleotido etiquetado) . Cada nucleotido puede estar etiquetado con grupos químicos diferentes o los mismos grupos químicos. Los nucleótidos etiquetados pueden ser didesoxinucleótidos o desoxinucleótidos En otra modalidad, los nucleótidos pueden ser etiquetados con colorantes fluorescentes que incluyen pero no están limitados a fluoresceina, pireno, 7-metoxicumarina, azul Cascade. TM. , Alexa Flur 350, Alexa Flur 430, Alexa Flur 488, Alexa Flur 532, Alexa Flur 546, Alexa Flur 568, Alexa Flur 594, Alexa Flur 633, Alexa Flur 647, Alexa Flur 660, Alexa Flur 680, AMCA-X, dialquilaminocumarina, azul Pacífico, azul Marina, BODIPY 493/503, BODIPY Fl-X, DTAF, verde Oregon 500, Dansyl-X, 6-FAM, verde Oregon 488, verde Oregon 514, verde-X de rodamina, verde Rhodol, Calceina, Eosina, bromuro de etidio, NBD, TET, 2 ', ', 5 ', 7 ' tetrabromosulfonfluoresceina, B0DIPY-R6G, BODIPY-F1 BR2 , BODIPY 530/550, HEX, BODIPY 558/568, BODIPY-TMR-X. , PyMPO, BODIPY564/570 , TAMRA, BODIPY 576/589, Cy3, rojo Rodamina -x, BODIPY 581/591, carboxiXrodamina, Texas Red-X, BODIPY-TR-X. , Cy5, SpectrumAqua, verde Spectrum #1, verde Spectrum #2,. naranja Spectrum, rojo Spectrum, o naftofluoresceina. En otra modalidad, la reacción Me relleno" puede ser ¦ realizada con d TP etiquetados fluorescentemente, en donde los nucleótidos son etiquetados con grupos fluorescentes diferentes . Los nucleótidos incorporados pueden ser detectados por _ cualquier método apropiado que incluye pero no está limitado a Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia (TERF) . En otra modalidad, una mezcla de tanto ddNTP etiquetados como dNTP no etiquetados puede ser usada para ocupar la terminación 3' rebajada de la secuencia de ADN que contiene el SNP o lugar cromosomal de interés. Preferiblemente, la colgadura 5' consiste de más de una base, que incluye pero no está limitada a 2, 3, 4, 5, 6 ó más de 6 bases. Por ejemplo, si la colgadura 5' consiste de la secuencia "XGAA" , donde X es el lugar cromosomal de interés, por ejemplo SNP, entonces el relleno con una mezcla de ddNTP etiquetados y dNTP no etiquetados producirá varios fragmentos de ADN diferentes. Si un ddNTP etiquetado es incorporado en la posición "X" , la reacción terminará y una base etiquetada única será incorporada. Sin embargo, si un dNTP no etiquetado es incorporado, la polimerasa continúa para incorporar otras bases hasta que un ddNTP etiquetado es incorporado. Si los primeros dos nucleótidos incorporados fueron dNTP, y el tercero es un ddNTP, la terminación rebajada 3' estará prolongada por tres bases . Este fragmento de ADN puede ser separado de los otros fragmentos de ADN que fueron prolongados por las bases 1, 2, ó 4 por tamaño. Una mezcla de ddNTP etiquetada y dNTP no etiquetada permitirá a todas las bases de la colgadura ser ocupadas, y provee información de secuencia adicional alrededor del lugar cromosomal de interés, por ejemplo SNP (ver FIGS. 7E y 9D) .

Después de la incorporación del nucleótido etiquetado, el ADN amplificado puede ser digerido con una enzima de restricción que reconoce la secuencia provista por el primer cebador. Por ejemplo, en la FIG. 11, el ADN amplificado es digerido con una enzima de restricción que une a la región "a" , la cual libera el fragmento de ADN que contiene el nucleótido incorporado para formar la matriz de estreptavidina . Alternativamente, un cebador de cada par de cebadores para cada lugar cromosomal de interés puede ser acoplado a una matriz de soporte sólido que incluye, pero no está limitada a un pozo de una -placa de microtitulación. Por ejemplo, las placas de microtitulación recubiertas de estreptavidina pueden ser usadas para la reacción de amplificación con un par de cebadores, en donde un cebador es biotinilado. Primero, los cebadores biotinilados son unidos a las placas de microtitulación recubiertas de estreptavidina. Luego, las placas son usadas como recipientes de reacción para amplificación de PCR de los lugares cromosomales de interés. Después de que la reacción de amplificación es completada, los cebadores en exceso, sales y plantilla de ADN pueden ser removidos por lavado. El ADN amplificado permanece anexado a la placa de microtitulación. El ADN amplificado puede ser digerido con una enzima de restricción que reconoce una secuencia sobre el segundo cebador y genera una colgadura 5' , la cual contiene el lugar cromosomal de interés. Los fragmentos digeridos pueden ser removidos por lavado. Después de la digestión, el sitio SNP o lugar cromosomal de interés es expuesto en la colgadura 5'. La terminación 3' rebajada es ocupada con un nucleótido etiquetado, que incluye pero no está limitado a, dd TP fluorescente en la presencia de una polimerasa. El ADN etiquetado puede ser liberado en el sobrenadante en la placa de microtitulación por digestión con una enzima de restricción que reconoce una secuencia en la región 5' del primer cebador. En otra modalidad, un nucleótido puede ser usado para determinar la secuencia de alelos múltiples de un gen. Un nucleótido que termina la reacción de prolongación puede ser usado para determinar la secuencia de alelos múltiples de un gen. En un alelo, el nucleótido de terminación es complementario a los lugares cromosomales de interés en la colgadura 5' del alelo. El nucleótido está incorporado y termina la reacción. En un alelo diferente, el nucleótido de terminación no es complementario al lugar cromosomal de interés, lo cual permite a un nucleótido de no terminación ser incorporado al lugar cromosomal de interés del alelo diferente. Sin embargo, el nucleótido de terminación es complementario a un nucleótido en la dirección 3 ' del lugar cromosomal de interés en la colgadura 5' del alelo diferente. La secuencia de los alelos puede ser determinada mediante análisis de los patrones de incorporación del nucleotido de terminación. El nucleotido de terminación puede ser etiquetado o no etiquetado. En otra modalidad, el nucleotido de terminación es un nucleotido que termina o impide la reacción de alargamiento que incluye pero no está limitada a un didesoxinucleótido, un didesoxinucleótido derivado, un didesoxinucleótido análogo, un didesoxinucleótido homólogo, un didesoxinucleótido con un grupo químico de azufre, un desoxinucleótido, un desoxinucleótido derivado, un desoxinucleótido homólogo, un desoxinucleótido análogo, y un desoxinucleótido con un grupo químico de azufre, trifosfato de arabinosida, un trifosfato de arabinosida análogo, un trifosfato de arabinosida homólogo, o un derivado de arabinosida. En otra modalidad, un nucleotido de terminación · etiquetado con una etiqueta de porción de generación de señal, que incluye pero no está limitada a un colorante fluorescente, puede ser usado para determinar la secuencia de los alelos de un lugar cromosomal de interés . El uso de un nucleotido único etiquetado con una etiqueta de porción de generación de señal elimina cualquier dificultad que pueda surgir cuando se usan porciones fluorescentes diferentes. Además, utilizando un nucleotido etiquetado con una etiqueta de porción de generación de señal para determinar la secuencia de los alelos de un lugar cromosomal de interés reduce el número de reacciones, y elimina los errores de pipeteado . Por ejemplo, si el segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento de enzima de restricción para BSmPI, la digestión generará una colgadura 5' de 4 bases. El segundo cebador puede ser diseñado de manera que el lugar cromosomal de interés esté localizado en la primera posición de la colgadura. Una colgadura representativa está representada abajo, donde R representa el lugar cromosomal de interés: 5' CAC 3' GTG R T G G Posición de colgadura 1 2 3 4 Un nucleótido con una etiqueta de porción de generación de señal puede ser usado para determinar si el sitio variable es homocigótico o heterocigótico . Por ejemplo, si el sitio variable es adenina (A) o guanina (G) , luego cualquiera la adenina o guanina puede ser usada para determinar la secuencia de los alelos del lugar cromosomal de interés, con tal de que haya una adenina o guanina en la colgadura en posición 2, 3, ó 4. Por ejemplo, si el nucleótido en posición 2 de la colgadura es timidina, la cual es complementaria a adenina, luego el ddATP etiquetado, dCTP no etiquetado, dGTP , y dTTP pueden ser usados para determinar la secuencia de los alelos del lugar cromosomal de interés. El ddATP puede ser etiquetado con cualquier porción de generación de señal que incluye pero no está limitado a una tinta fluorescente. Si el ADN de plantilla es homocigótico para adenina, luego el ddATP* etiquetado será incorporado en posición 1 complementaria a la colgadura en los alelos, y no se verá la incorporación de nucleótido en la posición 2, 3 ó 4 complementaria a la colgadura. Alelo 1 5'CCC A* 3'GGG T T G G Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC A* 3'GGG T T G G Posición de colgadura 1 2 3 4 Una señal será vista que corresponde a la incorporación de ddATP etiquetada en posición 1 complementaria a la colgadura, lo cual indica que la individual es homocigótico para adenina en esta posición. Este método de etiquetado elimina cualquier dificultad que pueda surgir del uso de diferentes . colorantes que tienen coeficientes de quantum diferentes .

Guanina Homocigótica : Si la plantilla de ADN es homocigótica para guanina, entonces el ddATP no será incorporado en la posición 1 complementaria para la colgadura, sino el ddATP será incorporado en la primera posición disponible, la cual en este caso es la posición 2 complementaria a la colgadura. Por ejemplo, si la segunda posición en la colgadura corresponde a una timidina, entonces: Alelo 1 5'CCC G A* 3'GGG C T G G Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC G A* 3'GGG C T G G Posición de colgadura 1 2 3 4 Una señal será vista que corresponde a la incorporación de ddATP en la posición 2 complementaria a la colgadura, lo cual indica que la individual es homocigótico para guanina. Las moléculas que son rellenadas en posición 2 complementaria a la colgadura tendrán un peso molecular diferente que las moléculas rellenadas en la posición 1 complementaria a la colgadura . Condición Heterocigótica : Alelo 1 5'CCC A* 3'GGG T T G G Posición de colgadura . 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC G A* i 3'GGG C T G G Posición de colgadura 1 2 3 4 Serán vistas dos señales; la primera señal corresponde al ddATP ocupado en posición uno complementaria a la colgadura y la segunda señal corresponde a la ddATP ocupada en posición 2 complementaria a la colgadura. Las dos señales pueden estar separadas basadas en peso molecular; el alelo 1 y el alelo 2 serán separadas mediante un par base único, lo cual permite la detección fácil y cuantificación de las señales . Las moléculas rellenadas en posición uno pueden ser distinguidas de las moléculas rellenadas en posición dos que usa cualquier método que discrimina con base en el peso molecular que incluye pero no está limitado a electroforesis de gel, electroforesis de gel capilar, secuenciamiento de ADN, y espectrometría de masa. No es necesario que el nucleótido sea etiquetado con una porción química; las moléculas de ADN que corresponden a los alelos diferentes pueden ser separadas con base en el peso molecular. Si la posición 2 de la colgadura no es complementaria a adenina, es posible que las posiciones 3 ó 4 puedan ser complementarias a adenina. Por ejemplo, la posición 3 de la colgadura puede ser complementaria a la adenina de nucleótido, en tal caso el ddATP etiquetado puede ser usado para determinar la secuencia para ambos alelos. Homocigó icos para adenina: Alelo 1 5'CCC A* 3'GGG T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC A* 3'GGG T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 Homocigoticos para guanina Alelo 1 5'CCC 3'GGG Posición de colgadura Alelo 2 5'CCC 3'GGG Posición de colgadura Heterocigótico : Alelo 1 5'CCC A* 3'GGG T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC G C A* 3'GGG C G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 Serán vistas dos señales; la primera señal corresponde al ddATP llenado en posición 1 complementaria a la colgadura y la segunda señal corresponde al ddATP llenado en posición 3 complementaria a la colgadura. Las dos señales pueden ser separadas con base en el peso molecular; el alelo 1 y el alelo 2 serán separados por dos bases, las cuales pueden ser detectadas usando cualquier método que discrimina basado en peso molecular. Alternativamente, si las posiciones 2 y 3 no son complementarias a adenina (esto es, las posiciones 2 y 3 de la colgadura corresponden a guanina, citosina, o adenina) pero la posición 4 es complementaria a adenina, el ddATP puede ser usado para determinar la secuencia de ambos alelos . Homocigótico para adenina: Alelo 1 5'CCC A* 3'GGG T G G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC A* 3'GGG T G G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Una señal será vista que corresponde al peso molecular de las moléculas rellenadas con ddATP en posición uno complementaria a la colgadura, la cual indica que la individual es homocigótico para adenina en el sitio variable. Homocigótico para guanina: Alelo 1 5'CCC G C C A* 3'GGG C G G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC G C C A* 3'GGG C G G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Será vista una señal que corresponde al peso molecular de las moléculas rellenadas en la posición 4 complementaria a la colgadura, lo cual indica que el individual es homocigótico para guanina. Heterocigótico : Alelo 1 5'CCC A* 3'GGG T G G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC G C C A* 3'GGG C G G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Serán vistas dos señales; la primera señal corresponde al ddATP llenado en posición uno complementaria a la colgadura y la segunda señal corresponde al ddATP ocupada en posición 4 complementaria a la colgadura. Las dos señales pueden estar separadas basadas en peso molecular; el alelo 1 y el alelo 2 serán separados mediante tres bases, lo cual permite la detección fácil y cuantificación de las señales. Las moléculas rellenadas en posición 1 y aquellas rellenadas en posición 4 pueden ser distinguidas con base en el peso molecular. Como se discutió arriba, si el sitio variable contiene cualquiera: adenina o guanina, cualquiera de la adenina etiquetada o la guanina etiquetada pueden ser usadas para determinar la secuencia de ambos alelos. Si las posiciones 2, 3 , ó 4 de la .colgadura no son complementarias a adenina pero una de las posiciones es complementaria a una guanina, entonces el ddGTP etiquetado puede ser usado para determinar si el ADN de plantilla es homocigótico o heterocigótico para adenina o guanina. Por ejemplo, si la posición 3 en la colgadura corresponde a una citosina entonces las señales siguientes serán esperadas si el ADN de plantilla es homocigótico para guanina, homocigótico para adenina, o heterocigótico : Homocigóticos para guanina: Alelo 1 5'CCC G* 3'GGG C T C T Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC G* 3'GGG C T C T Posición de colgadura 1 2 3 4 Será vista una señal que corresponde al peso molecular de las moléculas ocupadas con ddGTP en la posición uno complementaria a la colgadura, lo cual indica que el individual es homocigótico para guanina. Homocigóticos para adenina: Alelo 1 5'CCC A A G* 3'GGG T T C T Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC A A G* 3'GGG T T C T Posición de colgadura 1 2 3 4 Será vista una señal que corresponde al peso molecular de las moléculas ocupadas en la posición 3 complementaria a la colgadura, lo cual indica que el individual es homocigótico para adenina en el sitio variable. Heterocigótico : Alelo 1 5'CCC G* 3'GGG C T C T Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCC A A G* 3'GGG T T C T Posición de colgadura 1 2 3 4 Serán vistas dos señales; la primera señal corresponde al ddGTP llenado en posición uno complementaria a la colgadura y la segunda señal corresponde al ddGTP llenado en la posición 3 complementaria a la colgadura. Las dos señales pueden ser separadas con base en su peso molecular; el alelo 1 y el alelo 2 serán separados por dos bases, lo cual permite la detección fácil y cuantificaeión de las señales. En otra modalidad, el nucleótido etiquetado con una porción química única, que se usa para determinar la secuencia de los alelos de interés, puede analizarse por uan variedad de métodos que incluyen pero no se limitan a detección de fluorescencia, gel de secuenciado de ADN, electroforesis capilar en una máquina de secuenciado de ADN automatizada, electroforesis de microcanal, y otros métodos de secuenciado, espectrometría de masa, tiempo de vuelo de espectrometría de masa, espectrometría de masa de cuatro polos, espectrometría de masa de sector magnético, espectrometría de masa de sector eléctrico, espectrometría infrarroja, espectrometría ultravioleta, amperometría palentiostática, o por técnicas de hibridización de ADN que incluyen técnica de inmunotransferencia Southern, técnicas de inmunotransferencia de abertura, técnicas de inmunotransferencia de punto, y microconfiguracion de ADN, en donde los fragmentos de ADN serían útiles ya sea como ^sondas" y "objetivos", ELISA, fluorimetría, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (F ET) , SNP-IT, microplaquetas de genes, HuSNP, configuración de perlas, ensayo TaqMan, ensayo Invader, extensión de masa, método MassCleave® (hMC) . Algunas enzimas de restricción de tipo IIS también despliegan cortado alternativo como se discutió arriba. Por ejemplo, BsmFI cortará en 10/14 y 11/15 desde el sitio de reconocimiento. Sin embargo, los patrones de cortado no son mutuamente exclusivos; si el patrón de cortado 11/15 es visto en una secuencia particular, el cortado 10/14 también es visto. Si la enzima de restricción BsmF I corta en 10/14 del sitio de reconocimiento, la colgadura 5' será a 2X3X4. Si BsmF I corta en 11/15 del sitio de reconocimiento, la colgadura 5' será 0X1X2 3 · Si la posición X0 de la colgadura es complementaria al nucleótido etiquetado, el nucleótido etiquetado será incorporado en la posición X0 y provee un nivel adicional de certidumbre de calidad. Esto provee información de secuencia adicional. Por ejemplo, si el sitio variable es adenina o guanina, y la posición 3 en la colgadura es complementaria para adenina, el ddATP etiquetado puede ser usado para determinar el genotipo en el sitio variable. Si la posición 0 de la colgadura 11/15 contiene el nucleótido complementario a adenina, el ddATP será llenado y será vista una señal adicional . Heterocigótico : 10/14 Alelo 1 5'CCA A* 3'GGT T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 10/14 Alelo 2 5'CCA G C A* 3'GGT C G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 11/15 Alelo 1 5'CC A* 3'GG T T G T Posición de colgadura 0 1 2 3 11/15 Alelo 2 5' CC A* 3'GG T C G T Posición de colgadura 0 1 2 3 Serán vistas tres señales; una corresponde al ddATP incorporado en la posición 0 complementaria a la colgadura, una corresponde al ddATP incorporado en la posición 1 complementaria a la colgadura, y una corresponde al ddATP incorporado en la posición 3 complementaria a la colgadura. Las moléculas ocupadas en la posición 0, 1, y 3 complementarias a la colgadura difieren en peso molecular y pueden ser separadas usando cualquier técnica que discrimina con base en el peso molecular que incluye pero no están limitadas a electroforesis de gel, y espectrometría de masa.

Para la cuantificacion de la relación de un alelo a otro • alelo o cuando la determinación de la cantidad relativa de una secuencia de ADN mutante en la presencia de la secuencia de ADN de tipo silvestre, debe ser usado un método preciso y altamente sensitivo de detección. El corte alterno expuesto por las enzimas de restricción de tipo IIS puede aumentar la dificultad de determinación de relaciones de un alelo a otro alelo porque la enzima de restricción puede no exponer el patrón de corte alterno (11/15) sobre los dos alelos igualmente. Por ejemplo, el alelo 1 puede estar cortado en 10/14 80% del tiempo, y.11/15 20% del tiempo. Sin embargo, debido a que los dos alelos pueden diferir en secuencia, el alelo 2 puede ser cortado en 10/14 90% del tiempo, y 11/15 20% del tiempo. Para propósitos de cuantificación, el problema de corte alterno puede ser eliminado cuando el nucleótido en la posición 0 de la colgadura no es complementario al nucleótido etiquetado. Por ejemplo, si los sitios variables corresponden a adenina o guanina, y la posición 3 de la colgadura es complementaria a adenina (esto es, una timidina está localizada en la posición 3 de la colgadura) , el ddATP etiquetado puede ser usado para determinar el genotipo del sitio variable. Si la posición 0 de la colgadura generada por las propiedades de corte 11/15 no es complementaria para adenina, (esto es, la posición 0 de la colgadura corresponde a guanina, citosina, o adenina) no se verán signos adicionales de los fragmentos que fueron cortados 11/15 del sitio de reconocimiento. La posición 0 complementara a la colgadura puede ser ocupada con nucleótido no etiquetado, que elimina cualquier complejidad vista del patrón de corte alterno de enzimas de restricción. Este método provee un método altamente preciso para cuantificación de la relación de un sitio variable que incluye pero no está limitado a una mutación, o un polimorfismo de nucleótido único.

Por ejemplo, si SNP X puede ser adenina o guanina, este método de etiquetado permite la cuantificación de los alelos que corresponden a adenina y los alelos que corresponden a guanina, sin determinar si la enzima de restricción muestra cualquier diferencia entre los alelos con consideración a los patrones de corte alternos. Heterocigótico : 10/14 Alelo 1 5'CCG A* 3'GGC T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 10/14 Alelo 2 5'CCG G C A* 3'GGC C G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 La colgadura generada por las propiedades de corte alterno de BsmFI está representada abajo: 11/15 Alelo 1 5' CC 3'GG C T G T Posición de colgadura 0 1 2 3 11/15 Alelo 2 5'CC 3'GG C C G T Posición de colgadura 0 1 2 3 Después de rellenar con el ddATP etiquetado y dGTP no etiquetado, dCTP, dTTP, pueden ser generadas las siguientes moléculas : 11/15 Alelo 1 5'CC G A* 3'GG C T G T Posición de colgadura 0 1 2 3 11/15 Alelo 2 5'CC G G C A* 3'GG C C G T Posición de colgadura 0 1 2 3 Serán vistas dos señales; una que corresponde a las moléculas ocupadas con ddATP en posición uno complementaria a la colgadura y una correspondiente a las moléculas ocupadas con ddATP en la posición 3 complementaria a la colgadura. La posición 0 de la colgadura 11/15 está ocupada con un nucleotido no etiquetado, el cual elimina cualquier dificultad en la cuantificación de una relación para el nucleotido en el sitio variable sobre el alelo 1 y el nucleotido en el sitio variable sobre el alelo 2. Cualquier nucleotido puede ser usado incluyendo adenina, derivados de adenina, adenina homologa, guanina, derivados de guanina, guanina homologa, citosina, derivados de citosina, citosina homologa, timidina, derivados de timidina, o timidina homologa, o cualquier combinación de adenina, derivados de adenina, adenina homologa, guanina, derivados de guanina, guanina homologa, citosina, derivados de citosina, citosina homologa, timidina, derivados de timidina, o timidina homologa. El nucleótido puede ser etiquetado con cualquier grupo químico o porción, que incluye pero no está limitado a moléculas radioactivas, moléculas fluorescentes, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, haptenos, carbohidratos, biotina, derivados de biotina, porciones fosforescentes, porciones luminiscentes, porciones electroquimioluminiscentes, porciones cromáticas, y porciones que tienen una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica o conductividad eléctrica. El nucleótido puede ser etiquetado con una o más de un tipo de grupo químico o porción. En otra modalidad, los nucleótidos etiquetados y no etiquetados pueden ser usados . Cualquier combinación de desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos puede ser usada incluyendo pero no limitada a didesoxinucleótidos etiquetados y desoxinucleótidos etiquetados; didesoxinucleótidos etiquetados y desoxinucleótidos no etiquetados; didesoxinucleótidos no etiquetados y desoxinucleótidos no etiquetados; y didesoxinucleótidos no etiquetados y desoxinucleótidos etiquetados. En otra modalidad, los nucleótidos etiquetados con una porción química pueden ser usados en la reacción PCR. Los nucleótidos no etiquetados luego son usados para rellenar las colgaduras 5' generadas después de digestión con la enzima de restricción. Un nucleótido de terminación no etiquetado puede ser usado en la presencia de nucleótidos no etiquetados para determinar la secuencia de los alelos de un lugar cromosomal de interés . Por ejemplo, si el DTTP etiquetado fue usado en la reacción PCR, la siguiente colgadura 5' puede ser generada después de digestión con BsmFI : 10/14 Alelo 1 5'CT*G A 3'GAC T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 10/14 Alelo 2 5'CT*G G C A 3'GAC C G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 El ddATP no etiquetado, el dCTP no etiquetado, el dGTP no etiquetado, y el dTTP no etiquetado pueden ser usados para rellenar la colgadura 5'. Serán generadas dos señales; una señal corresponde a las moléculas de ADN con ddATP etiquetado en la posición 1 complementaria a la colgadura y la segunda señal corresponde a las moléculas de ADN ocupadas con ddATP no etiquetado en la posición 3 complementaria a la colgadura.

Las moléculas de ADN pueden ser separadas con base en el peso molecular y pueden ser detectadas por la fluorescencia del dTTP, el cual fue incorporado durante la reacción de PCR. Los sitios de los lugares cromosomales de ADN etiquetado de interés pueden ser analizados mediante una variedad de métodos que incluyen pero no están limitados a detección de fluorescencia, gel de secuenciamiento de ADN, electroforesis capilar sobre una máquina de secuenciamiento de ADN automatizada, electroforesis de microcanal, y otros métodos de secuenciamiento, espectrometría de masa, tiempo de espectrometría de masa de tiempo de vuelo, espectrometría de masa de cuatro polos, espectrometría de masa de sector magnético, espectrometría infrarroja de espectrometría de masa de sector eléctrico, espectrometría ultravioleta, amperometría palentiostática o por técnicas de hibridación de ADN que incluye técnica de inmunotransferencia Southern, técnica de inmunotransferencia de ranura, técnica de inmunotransferencia de punto, y microconfiguraciones de ADN, en donde los fragmentos de ADN pueden ser usados como ambos : "sondas" y "objetivos", ELISA, fluorimetría, y Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia (TERF) , SNP-IT, microplaquetas de genes, HuSNP, configuración de perlas, ensayo TaqMan, ensayo Invader, extensión de masa, método MassCleave® (hMC) . Este método de etiquetado es extremadamente sensible y permite la detección de alelos de un lugar cromosomal de interés que están en varias relaciones que incluyen pero no están limitadas a 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:5-1:10, 1:11-1:20, 1:21-1:30, 1:31-1:40, 1:41-1:50, 1:51-1:60, 1:61-1:70, 1:71-1:80, 1:81-1:90, 1:91-1:100, 1:101-1:200, 1:250, 1:251-1:300, 1:301-1:400, 1:401-1:500, 1:501-1:600, 1:601-1:700, 1:701-1:800, 1:801-1:900, 1:901-1:1000, 1:1001-1:2000, 1:2001-1:3000, 1:3001-1:4000, 1:4001-1:5000, 1:5001-1:6000, 1:6001-1:7000, 1:7001-1:8000, 1:8001-1:9000, 1:9001-1:10,000, 1:10,001-1:20,000, 1:20,001-1:30,000, 1:30,001-1:40,000, 1:40,001-1:50,000, y mayores de 1:50,000. Por ejemplo, este método de etiquetado permite a un nucleótido etiquetado con una porción de generación de señal a ser usada para determinar la secuencia de los alelos en un lugar cromosomal de SNP, o detectar un alelo mutante entre una población de alelos normales, o detectar un alelo que codifica resistencia antibiótica de una célula de bacteria entre alelos de bacteria sensible antibiótica, o detecta un alelo de un virus resistente a un fármaco de entre alelos de virus sensibles a fármacos, o detecta un alelo de una cepa bacterial no patogénica entre alelos de una cepa bacterial patogénica . Como se mostró arriba, un nucleótido único puede ser usado para determinar la secuencia de los alelos en un lugar cromosomal particular de interés. Este método es usado especialmente para determinar si un individuo es homocigótico o heterocigótico para una mutación particular o para determinar la secuencia de los alelos en un sitio de SNP particular. Este método de etiquetado elimina cualquier error provocado por los coeficientes de quantum de varias tintas. Esto también permite la reacción para proceder en un recipiente de reacción único que incluye pero no está limitado a un pozo de una placa de microtitulación, o un tubo eppendorf sencillo. Este método de etiquetado es usado especialmente para la detección de señales genéticas múltiples en el mismo ejemplo. Por ejemplo, este método es usado para la detección del ADN fetal en la sangre, suero, o plasma de una mujer embarazada, la cual contiene tanto el ADN el materno como el ADN fetal. El ADN materno y el ADN fetal pueden estar presentes en la sangre, suero o plasma en relaciones tales como 97:3; sin embargo, el método descrito arriba puede ser usado para detectar el ADN fetal . Este método de etiquetado puede ser usado para detectar dos, tres, o cuatro señales genéticas diferentes en la población muestra. Este método de etiquetado es especialmente útil para la detección de un alelo mutante que está entre una población grande de alelos de tipo silvestre. Además, este método de etiquetado permite la detección de una célula mutante única en una población grande de células de tipo silvestre. Por ejemplo, este método de etiquetado puede ser usado para detectar una célula cancerosa única entre una población grande de células normales. Típicamente, las células cancerosas tienen mutaciones en la secuencia del ADN. La secuencia de ADN mutante puede estar identificada aún si existe un antecedente grade de secuencia de ADN de tipo silvestre. Este método de etiquetado puede ser usado para separar por exclusión, detectar, o diagnosticar cualquier tipo de cáncer que incluye pero no est limitado a cáncer de colon, renal, de mama, de vejiga, de hígado, de riñon, de cerebro, de pulmón, de próstata y cáncer de la sangre que incluye leucemia. Este método de etiquetado también puede ser usado para detectar organismos patogénicos, que incluyen pero no están limitados a bacterias, hongos, virus, protozoarios, y micobacterias . Este también puede ser usado para discriminar entre cadenas patogénicas de microorganismos y cadenas no patogénicas de microorganismos que incluyen pero no están limitados a bacterias, hongos, virus, protozoarios, y micobacterias. Por ejemplo, existen varias cepas de Escherichia coli (E. coli), y la mayoría son no patogénicas. Sin embargo, varias cepas, tales como E. coli 0157 son patogénicas. Existen diferencias genéticas entre cepas de E. coli no-patogénicas y E. coli patogénicas. El método descrito arriba de etiquetado puede ser usado para detectar organismos patogénicos en una población grande de organismos no patogénicos, los cuales algunas veces no están asociados con la flora normal de un individuo.

VI. Análisis del lugar de interés Los lugares cromosomales de interés se pueden analizar por una diversidad de métodos incluyendo pero no se limitan a, detección por fluorescencia, gel formado de secuencias de ADN, electroforesis capilar en una maquina formadora de secuencias de ADN automatizada (por ejemplo, en analizador genético ABI Prism 3100 o el analizador genético ABI Prism 3700), electroforesis de microcanal, y otro métodos de formador de secuencias, formación de secuencias, formación de secuencias dideoxi de Sanger, espectrometría de masas, espectrometría de masas de tiempo de vuelo, espectrometría de masas de cuatro polos, espectrometría de masas de espectro magnético, espectrometría de masas de sector eléctrico, espectrometría infrarroja, espectrometría ultravioleta, amperometría palentiostática, o por técnicas de hibridación de ADN que incluyen técnica de inmunotransferencia Southern Blot, técnica de inmunotransferencia de ranura, técnica de inmunotransferencia de punto, y microconfiguración de ADN, en donde los fragmentos de ADN serían útiles como "sondas" y "objetivos", ELISA, fluorimetría , polarización por fluorescencia, transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET) , SNP-IT, microplaquetas de genes, HuSNP, configuración de perlas, ensayo TaqMan, ensayo Invader, extensión de masa, método MassCleave® (hMC) . Los lugares cromosomales de interés se pueden analizar usando electroforesis de gel seguida por la detección de fluorescencia del nucleótido incorporado. Otros métodos para analizar o leer los lugares cromosomales de interés es usar un lector de placas fluorescentes o un fluorímetro directamente en las placas recubiertas con estreptavidina de 96 pozos. La placa se puede colocar sobre un lector de placas fluorescentes o escáner tal como el Typhoon Pharmacia 9200 para leer cada lugar cromosomal de interés. Alternativamente, los productos por PCR del lugar cromosomal de interés se pueden acumular y después "rellenar" (FIG. 10) , se pueden separar los productos por tamaño usando cualquier método apropiado para el mismo, y luego analizarse usando una diversidad de técnicas incluida pero no limitada a la detección por fluorescencia, gel formador de secuencias de ADN, electroforesis capilar en una máquina formadora de secuencias de ADN automatizadas, electroforesis de microcanal, otros métodos formadores de secuencias, formación de secuencias dideoxi de Sanger, técnicas de hibridación de ADN que incluyen la técnica de inmunotransferencia Southern, técnica de inmunotransferencia de ranura, técnica de inmunotransíerencia de punto y microconfiguración de ADN, espectrometría de masa, espectrometría de masa de tiempo de vuelo, espectrometría de masa de cuatro polos, espectrometría de masa de sector magnético, espectrometría de masa de sector eléctrico, espectrometría infrarroja, espectrometría ultravioleta, amperometría palentiostátic . Por ejemplo, se puede usar la electroforesis con gel de poliacrilamida para separar el ADN por tamaño y se puede escanear el gel para determinar el color de la fluorescencia en cada banda (usando por ejemplo, una maquina formadora de secuencias de ADN ABI 377 o un Pharmacia Typhoon 9200) . En otra modalidad, la secuencia del lugar cromosomal de interés puede ser determinada por la detección de la incorporación de un nucleótido que es 3 ' al lugar cromosomal de interés, en donde el nucleótido es un nucleótido diferente de los nucleótidos posibles en el lugar cromosomal de interés. Esta modalidad es usada especialmente para el secuenciamiento y detección de los SNP. La eficiencia y velocidad a la cual las polimerasas de ADN incorporan los nucleótidos varía para cada nucleótido. De acuerdo con los datos del Human Genome Pro ect (Proyecto del Genoma Humano) , el 99% de todos los SNP son binarios . La secuencia del genoma humano puede ser usada para determinar el nucleótido que es 3 ' para el SNP de interés . Cuando el nucleótido que es 3 ' para el sitio SNP difiere de los nucleótidos posibles en el sitio SNP, un' nucleótido de que uno o más que una base 3' para el SNP puede ser usado para determinar la identidad del SNP . Por ejemplo, suponiendo que la identidad de SNP X sobre el cromosoma 13 se va a determinar. La secuencia del genoma humano indica que el SNP X puede ya sea ser adenosina o guanina y que un nucleótido 3' al lugar cromosomal de interés es una timidina. Un cebador que contiene un sitio de reconocimiento de enzima de restricción de BsmF I, el cual está diseñado para ser 13 bases del lugar cromosomal de interés después de la amplificación, es usado para amplificar un fragmento de ADN que contiene SNP X. La digestión con la enzima de restricción BsmF I genera una colgadura 5' que contiene el lugar cromosomal de interés, el cual puede ser ya sea adenosina o guanina. Los productos de digestión pueden ser divididos en dos reacciones de "rellenado" : una contiene dTTP, y la otra reacción contiene dCTP. Si el lugar cromosomal de interés es homocigótico para guanina, solamente las moléculas de ADN que fueron mezcladas con dCTP serán rellenadas. Si el lugar cromosomal de interés es homocigótico para adenosina, solamente las moléculas de ADN que fueron mezcladas con dTTP serán rellenadas. Si el lugar cromosomal de interés es heterocigótico, las moléculas de ADN que fueron mezcladas con dCTP serán rellenadas así como las moléculas de ADN que fueron mezcladas con dTTP. Después del lavado para remover el exceso de dNTP, las muestras son rellenadas con el ddATP etiquetado, el cual es complementario al nucleótido (timidina) que es 3' del lugar cromosomal de interés. Las moléculas de ADN que fueron rellenadas por la reacción previa serán rellenadas con ddATP etiquetado. Si el individuo es homocigótico para adenosina, las moléculas de ADN que fueron mezcladas con dTTP serán rellenadas subsecuentemente con el ddATP etiquetado. Sin embargo, las moléculas de ADN que fueron mezcladas con dCTP, podrían no haber incorporado aquel nucleótido, y por lo tanto, podrían no incorporar el ddATP. La detección de ddATP etiquetado solamente en moléculas que fueron mezcladas con dTTP indica que la identidad del nucleótido en SNP X en el cromosoma 13 es adenosina. En otra modalidad, la separación por exclusión de escala grande para la presencia o ausencia de mutaciones de nucleótido único puede ser desarrollada. Pueden ser amplificados de uno a decenas a centenas a miles de lugares cromosomales de interés en un cromosoma único o en cromosomas múltiples con cebadores como se describió arriba en la sección de "Diseño de Cebador" . Los cebadores pueden diseñados de manera que todos los lugares cromosomales amplificados de interés son de un tamaño diferente (FIG. 2). Los lugares cromosomales de interés múltiples pueden ser de una muestra de ADN de un individuo que representa los lugares cromosomales de interés múltiples en un cromosoma único, cromosomas múltiples, genes múltiples, un gen único, o cualquier combinación de estos . Cuando los datos humanos están siendo analizados, la secuencia conocida puede ser una secuencia específica que ha sido determinada de un individuo (que incluye por ejemplo, el individuo cuyo ADN está siendo analizado constantemen e) , o puede ser una secuencia de consenso de manera que se publica como parte del genomá humano.

Relación de alelos al lugar cromosomal de interés heterocigotico En una modalidad, la relación de alelos en un lugar cromosomal de interés heterocigotico se puede calcular. La intensidad de un nucleótido en el lugar cromosomal de interés se puede cuantificar usando cualquier número de programas de computadora incluyendo pero no se limitan a, GeneScan e ImagenQuant . Por ejemplo, para un SNP heterocigotico, existen 2 nucíeótidos y cada uno pudiera representar una relación 1:1. En una modalidad preferida, la relación de SNP heterocigotico se puede calcular. En una modalidad, la relación para un nucleótido variable en los alelos en un lugar cromosomal de interés heterocigotico se puede calcular. La intensidad de cada nucleótido variable presente en el lugar cromosomal de interés se puede cuantificar usando cualquier número de programas dé computadora incluido pero no se limitan a, GeneScan e ImageQuant . Por ejemplo, para un SNP heterocigótico, habrán dos nucleótidos presentes y cada uno puede estar presente en una relación 1:1. En una modalidad referida, la relación de SNP heterocigótico múltiple se puede calcular. En otra modalidad, la relación de alelos a un lugar cromosomal e interés heterocigótico en un cromosoma se suma y compara con la relación de alelos en un lugar cromosomal de interés heterocigótico en un cromosoma diferente. En una modalidad preferida, la relación de alelos en los lugares heterocigoticos múltiples de interés en un cromosoma se suma y compara a la relación de alelos en lugares múltiples heterocigoticos de interés en un cromosoma diferente. La relación obtenida de SNP 1, SNP2, SNP3 , SNP 4, etc, en el cromosoma 1 se puede sumar. Esta relación luego se puede comparar con la relación obtenida de SNP A, SNP B, SNP C, SNP D, etc. Por ejemplo, se pueden analizar 100 SNP en el cromosoma 1. De estos 100 SNP, se supone que 50 son heterocigoticos. La relación en los alelos en los SNP heterocigoticos en el cromosoma 1 se puede sumar, y debe dar una relación de aproximadamente 50:50. Similarmente , de los 100 SNP analizados en el cromosoma 21, se supone que 50 son heterocigoticos. La relación de alelo en los SNP heterocigoticos en el cromosoma 21 se suma. Con un número normal de cromosoma, la relación debe ser de aproximadamente 50:50, y así no debe haber diferencia entre la relación obtenida del cromosoma 1 y 21. Sin embargo, si hay una copia adicional del cromosomal 21, se suministra un alelo adicional y la relación debe ser de aproximadamente 66:33. Así, la relación para los nucleótidos en los SNP heterocigoticos se puede usar para detectar la presencia o ausencia de anormalidades cromosomales . Se puede detectar cualquier anormalidad cromosomal incluyendo la aneuploidia, poliploidia, inversión, una trisomía, una monosomía, duplicación, eliminación, eliminación de una parte de un cromosoma, adición de una parte de un cromosoma, inserción, un fragmento de un cromosoma, una región de un cromosoma, re-configuración cromosomal y trans-ubicación . El método es especialmente útil para la detección de la trisomía 13, trisomía 18, trisomía 21, XXY y XYY . La presente invención proporciona un método para cuantificar una relación para los alelos en el lugar cromosomal de interés heterocigótico. El lugar cromosomal de interés incluye pero no se limita a, polimorfismos nucleótidos sencillos, mutaciones. No hay necesidad de amplificar la secuencia completa de un gen o cuantificar la cantidad de un producto de gen particular. La presente invención no se soporta en una PCR cuantitativa.

Detección de las anormalidades cromosomales fetales Como se discutió arriba en la sección titulada "plantilla de ADN" , se puede obtener el ADN de plantilla de una muestra de una mujer embarazada, en donde el ADN de plantilla comprende un ADN de plantilla y un ADN de plantilla materno y un ADN de fetal. En una modalidad, el ADN de plantilla se obtiene de la sangre de una mujer embarazada. En una modalidad preferida, el ADN de plantilla se obtiene del plasma del suero de la sangre de una mujer embarazada. En una modalidad, el ADN de plantilla de la muestra una mujer embarazada comprende el ADN de plantilla materno y el ADN de plantilla fetal . En otra modalidad, el ADN de plantilla materno se obtiene de cualquier ácido nucleico que contiene una fuente que incluye pero no se limitan a, células, tejidos, sangre, suero, plasma, saliva, orina, lágrimas, secreción vaginal, fluido linfático, fluido cerebro espinal, secreción mucosa, fluido peritoneal, fluido ascítico, materia fecal, o exudados del cuerpo, y se forma en secuencias para identificar lugares cromosomales de interés homocigóticos o heterocigóticos , que son los lugares cromosomales de interés analizados en el ADN de plantilla obtenido de la muestra de una mujer embarazada.

En una modalidad preferida, la secuencia de los alelos de los lugares cromosomales de interés múltiples, en el ADN de plantilla materno se determina para identificar lugares de interés homocigót cos. En otra modalidad, la secuencia de alelos de los lugares de interés múltiples en el ADN de plantilla materno se determina para identificar lugares heterocigóticos de interés. La secuencia de los alelos de los lugares de interés múltiples en el ADN de plantilla materno se puede determinar en una reacción sencilla o en reacciones múltiples. Por ejemplo, si 100 lugares de interés maternos en el cromosoma 21 y 100 lugares de interés maternos en el cromosoma 1 se analizan, se predecirían aproximadamente 50 lugares de interés en cada cromosoma para ser homocigóticos y 50 para ser heterocigóticos. Los 50 lugares de interés homocigóticos o los 50 lugares de interés homocigóticos o los 50 lugares homocigóticos o heterocigóticos de interés, o cualquier combinación de los lugares de interés homocigóticos o heterocigóticos en cada cromosoma se pueden analizar usando el ADN de plantilla de la muestra de la mujer embarazada. El lugar cromosomal de interés en el ADN de plantilla de la muestra de la mujer embarazada se analiza usando los métodos de amplificación, aislamiento, digestión, relleno y detección antes descritos . Los mismos cebadores usados para analizar el lugar cromosomal de interés en el ADN de plantilla materna, se usan para separar por exclusión el ADN de plantilla de la muestra de una mujer embarazada. Se puede usar cualquier número de lugares cromosmomales de interés en el ADN de plantilla a partir de la muestra de la mujer embarazada. Por ejemplo, 1, 1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-500, 500-1000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000 o más de 4000 lugares de interés maternos homocigóticos se pueden analizar en el ADN de plantilla a partir de la muestra de la mujer embarazada. En una modalidad preferida, se analizan los lugares de interés múltiples en cromosomas múltiples. A partir de la población de los lugares de interés maternos homocigóticos, habrán lugares de interés homocigóticos o heterocigóticos , del ADN de plantilla a partir de la muestra de la mujer embarazada, los lugares de interés heterocigóticos pueden además analizar. En los lugares de interés heterocigóticos, se puede realizar la relación de alelos para determinar el número de cromosomas que están presentes. El porcentaje de ADN fetal presente en la muestra de la mujer embarazada se pueden calcular al determinar la relación de alelos en un lugar heterocigótico de interés y un cromosoma que no se asocia típicamente con una anormalidad cromosorna1. En una modalidad preferida, la relación de alelos en los lugares de interés heterocigóticos múltiples sobre un cromosoma se pueden usar para determinar el porcentaje de ADN fetal. Por ejemplo, el cromosoma 1, que es el cromosoma más grande en el genoma humano, se puede usar para determinar el porcentaje del ADN fetal. Por ejemplo, supongamos que SNP X es homocigótico en el ADN de la plantilla materna (A/A) . En SNP X, el ADN de plantilla de la muestra de la mujer embarazada puede contener el ADN fetal y el ADN materno, es heterocigótico (A/G) . La guanina del nucleótido representa el ADN fetal debido a que en SNP X la madre es homocigótica y así se atribuye la guanina al ADN fetal . Se puede usar la guanina en SNP X para calcular el porcentaje del ADN fetal en la muestra. Alternativamente, se pueden examinar lugares múltiples de interés sobre dos o más cromosomas para determinar el porcentaje del ADN fetal. Por ejemplo, se pueden examinar lugares múltiples de interés en los cromosomas 13 y 18 para determinar el porcentaje del ADN fetal debido a que no son viables los organismos con anormalidades cromosórnales en el cromosoma 13 y 18. Alternativamente, para un feto masculino, se puede usar un marcador en el cromosoma Y para determinar la cantidad de ADN fetal presente en la muestra. Se puede hacer un panel de diluciones en serie usando el ADN de plantilla aislado de la muestra a partir de una mujer embarazada y efectuarse el análisis PCR cuantitativo. Se pueden efectuar dos reacciones por PCR: una reacción PCR para amplificar un marcador en el cromosoma Y, por ejemplo SRY y la otra reacción para amplificar una reacción en cualquiera de los cromosomas autosomales. Se puede calcula la cantidad de ADN fetal usando la fórmula siguiente: ADN fetal en porcentaje: (última dilución detectada del cromosoma Y/última dilución detectada del cromosoma autosomal) *2*100. Si en SNP A, la madre es homocigótica A/A, y el feto es heterocigótico A/G, entonces se puede usar la relación de A:G para detectar las anormalidades cromosomales . Si el ADN fetal es del cincuenta por ciento (50%) del ADN en la sangre materna, entonces el SNP A en donde el nucleótido materno es una adenina y el otro nucleótido es una guanina, se esperarla la relación de adenina (dos adenina del ADN de plantilla materno y una del ADN de plantilla fetal) a la guanina (a partir del ADN de plantilla fetal) que sea 25:75 ó 0.33. Sin embargo, si el feto tiene una trisomía de este cromosoma en particular, y se contribuye el cromosoma adicional por la madre, y así está presente un nucleótido adicional de adenina, entonces se esperaría la relación de 0.5 (50 (G)/(2*50 A maternal + 2*50 A fetal). Así, se detectaría un incremento del 8% entre la relación obtenida de un cromosoma presente en las dos copias, y un cromosoma presente en una condición de trisomla. Por otro lado, si contribuye el cromosoma adicional por el padre, y así, está presente una guanina adicional, entonces se esperaría la relación de 0.66 (2*50 para el alelo fetal G/ (2*50 alelo A maternal + 50 para alelo A fetal) . Sin embargo, si el ADN fetal es de 40% del ADN en la sangre materna, la relación esperada sin una trisomía es de 0.25 (40 para el alelo G fetal/2*60 para el alelo A maternal + 1*60 para alelo A fetal) . Si el feto tiene una trisomía, y el cromosoma adicional es suministrado por la madre, la relación esperada seria de 0.20 (40 para el alelo G fetal/ (2*60 para alelo A maternal + 2*40 para el alelo A fetal) . Una diferencia del 5% entre las relaciones obtenidas del cromosoma presente en la dos copias y el cromosoma presente en la condición de Trisomía se detecta. En otra modalidad, se pueden examinar lugares cromosomales múltiples de interés en los cromosomas múltiples . Las relaciones para los alelos en cada lugar heterocigótico de interés en un cromosoma, se pueden sumar y comparar a las relaciones para los alelos en cada lugar de interés en un cromosoma diferente . Los cromosomas que se comparan pueden ser de origen humano, que incluyen pero no se limitan a, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 X e Y. La relación obtenida de los cromosomas múltiples se puede comparar con la relación obtenida para un cromosoma sencillo o partir de cromosomas múltiples . En una modalidad, uno de los cromosomas usados en esta comparación puede ser el cromosoma 13, 16; 18, 21, 22, X o Y. En una modalidad preferida, se comparan las relaciones en los cromosomas 13, 18, y 21. Por ejemplo, suponiendo un 40% de ADN fetal en la muestra de la mujer embarazada, la relación de los alelos en el lugar de interés heterocigótico en el cromosoma 1 será de 0.25 (40 para el alelo G fetal/ (2*60 para el alelo A maternal + 40 para el alelo A fetal) . Similarmente, la relación de los alelos en el lugar cromosomal de interés en el cromosoma 21 estará presenten en una relación de 0.25. Sin embargo, en un feto con trisomía 21 en donde el cromosoma adicional esta contribuido por la madre, los nucleótidos en un lugar heterocigótico de interés en el cromosoma 21 estarán presentes en una relación de 0.20 (40 para alelo G fetal/60*2 para alelo A maternal + 40*2 para alelo A fetal) . En contraste la relación con el cromosoma 1 permanecerá a 0.25, y así la diferencia del 5% en las relaciones significará un cromosoma adicional. Se pueden analizar de uno a decenas a cientos a miles de lugares de interés . En otra modalidad, los lugares de interés en el ADN de plantilla de la muestra de la mujer embarazada pueden formar genotipos sin identificación previa de los lugares de interés eterocigóticos y omocigó icos . No es necesario formar genotipos del ADN de plantilla antes del análisis del ADN de plantilla que contiene el ADN tanto maternal como fetal . La relación e los alelos al lugar cromosomal de interés puede usarse para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal el ADN de plantilla de la muestra de una mujer embarazada contiene tanto el ADN de plantilla maternal como el ADN de plantilla fetal . Existen 3 posibilidades en cada SNP para el ADN de plantilla materna o el ADN de plantilla fetal: heterocigóticos, homocigóticos para el alelo 1, u homocigóticos para el alelo 2. Las relaciones posibles de nucleótidos para un SNP que es una adenina o una guanina se muestran en la Tabla II. Las relaciones presentadas en la Tabla II se calculan con el ADN fetal al 50% del ADN en la muestra de una mujer embarazada.

Tabla II. Relaciones para los nucleótidos para un SNP heterocigótico SNP Fetal SNP Maternal A/A G/G A/G A/A 100%A N/A 75%A, 25%G G/G N/A 100%G 25%A, 75%G A/G 75%A, 25%G 25%A, 75%G 50%A, 50%G Existen tres relaciones de nucleótidos : 100% de un nucleótido sencillo, 50:50, ó 75:25. Estas relaciones variarán dependiendo de las cantidades de ADM fetal presente en una muestra de una mujer' embarazada. Sin embargo, el porcentaje del ADN fetal debe ser constante independientemente del cromosoma analizado. Por lo tanto, si están presentes los cromosomas en dos copias, se observarán las relaciones antes calculadas . Por otro lado, estos porcentajes variarán cuando se presente en un cromosoma adicional. Por ejemplo, suponiendo que SNP X pueden ser adenina o guanina, y que el porcentaje de ADN fetal de la mujer embarazada sea del 50%. El análisis de los lugares de interés en el cromosoma 1 proporcionarán las relaciones arriba discutidas: 100:0, 50:50, y 75:25. Las relaciones posibles para un SNP que sea A/G con un cromosoma adicional se suministran en la Tabla III.

Tabla III: Relaciones de nucleótidos a un SNP cuando está presente una copia adicional de un cromosoma SNP Fetal SNPX Maternal A/A/A G/G/G A/G/G A/A/G A/A 100% A N/A 60%A, 40%G 80%A, 20%G G/G N/A 100%G 20%A, 80%G 40%A, 60%G A/G 80%A, 20%G 20%A, 80%G 40%A, 60%G 60%A, 40%G Las relaciones posibles parar los alelos en un SNP heterocigótico con una copia adicional de un cromosoma son: 0:100, 40:60, y 20:80. Dos de estas relaciones, 40:60 y 20:80 difieren de las relaciones de los alelos en los SNPs heterocigóticos obtenidos con dos copias de un cromosoma. Como se discute arriba, las relaciones para los nucleótidos en un SNP heterocigótico dependen de la cantidad del ADN fetal presente en la muestra. Sin embargo, las relaciones, cualesquiera que sean, permanecerán constantes a través de los cromosomas a menos que haya una anormalidad cromosomal . La relación de los alelos en los lugares heterocigóticos de interés en un cromosoma se pueden comparar para la relación con los alelos en un lugar heterocigótico de interés en un cromosoma diferente. Por ejemplo, la relación de lugares múltiples de interés en un cromosoma 1 (la relación en SNP 1, SNP 2, SNP 3, SNP 4, etc.) se puede comparar para la relación de los lugares múltiples de interés en el cromosoma 21 (la relación en SNP A, SNP B, SNP C, SNP D , etc.). Se puede comparar cualquier cromosoma con cualquier otro cromosoma. No hay límites en cuanto al número que se puede comparar de cromosomas . Con referencia de vuelta a los datos en las Tablas II y III, las relaciones para los nucleótidos en un SNP heterocigótico en el cromosoma 1, que está presente en dos copias, fueron 25:75 y 50:50. Por otro lado, la relación para los nucleotidos en un SNP heterocigótico en el cromosoma 21, que estaba presente en tres copias, fueron 40:60 y 20:80. La diferencia entre estas dos relaciones indica una anormalidad cromosomal . Las relaciones se pueden pre-calcular para un rango completo de grados variables de ADN fetal presentes en el suero materno. Las Tablas II y III demuestran que los lugares de interés homocigóticos y heterocigóticos maternos se pueden usar para detectar la presencia de una anormalidad cromosomal fetal . El ejemplo anterior ilustra como las relaciones para nucleotidos en los SNP heterocigóticos se pueden usar para detectar la presencia de un cromosoma adicional . Se pueden usar el mismo tipo de análisis para detectar re-configuraciones cromosomales , trans-ubicaciones, mini-cromosomas, duplicaciones de regiones de cromosomas, monosomías, eliminaciones de regiones de cromosomas y fragmentos de cromosomas . El método no requiere la formación de genotipos de la madre o del padre, sin embargo, puede darse para reducir el número de SON que se necesitan para analizarse con la muestra de plasma. La presente invención no cuantifica la cantidad de un producto de gen fetal, ni tampoco es l utilidad de la presente invención limitada al análisis de los genes que se encuentran en el cromosoma Y. La presente invención no se soporta meramente en la detección de un ácido nucleico paternalmente heredado, más bien, la presente invención proporciona un método que permite la relación de alelos heredados maternalmente hasta fetalmente en los lugares cromosomales de interés, incluyendo los SNP, a ser calculados . En otra modalidad, un alelo sencillo en el lugar cromosomal de interés puede usarse para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal y detectar un trastorno genético en un feto. En una modalidad preferida, el alelo maternal en el lugar cromosomal de interés se usa para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal en un feto. La madre biológica puede formar un genotipo para identificar un lugar cromosomal homocigótico de interés. Similarmente, el padre biológico puede formar un genotipo para identificar un lugar cromosomal de interés homocigótico. Los lugares cromosomales de interés en donde el ADN de plantilla maternal es homocigótico para un alelo y el ADN de plantilla paternal es homocigótico para el otro alelo se analiza usando el ADN de plantilla obtenido del plasma de la madre, que contienen ADN de plantilla tanto maternal como fetal . Cualquier número de lugares cromosomales de interés puede analizarse incluyendo pero no se limita a 1, 1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-500, 500-1000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-8000, 8000-16000, 16000-32000 o más de 32000 lugares cromosomales de interés. En una modalidad preferida, la señal del genoma maternal y el alelo fetal, que se hereda de la madre, en el lugar cromosomal de interés se cuantifica. Por ejemplo, si la colgadura 5', que se genera después de la digestión con la enzima tipo IIS, se rellena con un nucleótido que se etiqueta fluorescentemente, la intensidad del pigmento incorporado puede cuantificarse ADN de Plantilla Maternal - Homocigótico para Adenina Alelo 1 5'CCG A* 3 ' GGC T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCG A* 3 'GGC T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 ADN de Plantilla Paterna - Homocigótico para Citosina Alelo 1 5'CCG C* 3 'GGC G G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCG C* 3 'GGC T G Posición de colgadura 1 2 3 4 ADN de Plantilla en el plasma — tanto ADN de plantilla maternal como ADN de plantila fetal ADN de plantilla maternal -- Homocigótico para Adenina Alelo 1 5'CCG A* 3'GGC T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCG A* 3'GGC T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 ADN de Plantilla Fetal - Homocigótico Alelo 1 5'CCG A* 3'GGC T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCG ddC 3'GGC T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 El ADN de plantilla obtenido del plasma de una mujer embrazada se rellena con ddATP etiquetado, ? ddCTP no etiquetado (descrito como ddC arriba) , ddGTP, y ddTTP. El ADN de plasma contiene dos alelos de adenina maternales, y un alelo de adenina fetal . Al rellenar con ddATP etiquetado y ddCTP no etiquetado, sólo el alelo maternal y el alelo fetal heredados de la madre se detectan. El alelo paternal no se detecta de esta manera. Las reacciones de rellenado pueden realizarse como se describe en los Ejemplos de abajo. Un lugar cromosomal de interés sencillo puede analizarse o múltiples lugares cromosomales de interés . La intensidad del alelo maternal en múltiples lugares cromosomales de interés puede cuantificarse . Un promedio puede calcularse para un cromosoma y compararse al promedio obtenido por un diferente cromosoma. Por ejemplo, la intensidad promedio del alelo maternal y el alelo fetal heredado de la madre en el cromosomal 1 puede compararse a la intensidad promedio del alelo maternal y el alelo fetal heredados de la madre en los cromosomas 13, 18, ó 21. En una modalidad preferida, los cromosomas 13, 15, 18, 21, 22, X e Y, cuando aplica, se compara . La señal de un lugar cromosomal de interés puede ser más fuerte que otro lugar cromosomal de interés . sin embargo, no hay razón para que la señal del lugar cromosomal de interés en un cromosoma sea más fuerte que la señal del lugar cromosomal de interés en otro cromosoma . Aunque la señal de varios lugares cromosomales de interés puede ser variable, la variación podrá apreciarse a través del genoma. La señal promedio del lugar cromosomal de interés será la misma cuando cualesquiera de los cromosomas se compara. Las condiciones de la reacción PCR pueden optimizarse de manera que una cantidad equivalente de producto PCR se produce. Por ejemplo, la concentración de los cebadores, la concentración de los nucleótidos, y el número de ciclos para cada lugar cromosomal de interés puede optimizarse. Además, las reacción de relleno pueden darse bajo condiciones tales que cualquier incremento en un alelo específico puede detectarse. Las condiciones de reacción de relleno pueden optimizarse para detectar cualquier incremento en el alelo de interés, incluyendo, pero no se limita a, la concentración de reactivos, el tiempo de la reacción de relleno, y la temperatura de la reacción. Con un cariotipo genético normal, la señal en cada lugar cromosomal de interés comprende una señal del genoma maternal, y la señal del alelo fetal, que se hereda de la madre. El porcentaje de ADN fetal en la muestra se mantiene constante, sin tener en cuenta el cromosoma que se analiza. Por ejemplo, si en SNP X, el genoma maternal es A/A, y el genoma paternal es G/G, entonc4es el genoma fetal será A/G, y el alelo de adenina fetal comprenderá un porcentaje específico de la señal del alelo de adenina. Si el porcentaje de ADN es del 20% en el plasma maternal, entonces el alelo de adenina fetal contribuirá al 20% de la señal para el alelo de adenina. La contribución del alelo fetal, que se hereda de la madre, será constante para cualquier lugar cromosomal de interés que se analiza. Cuando hay una anormalidad cromosomal, la señal del genoma maternal y el alelo fetal, que se hereda de la madre, en el lugar cromosomal de interés difiere de la señal observada para otros cromosomas. Por ejemplo, con una trisomia, la señal en el lugar cromosomal de interés comprenderá el genoma maternal y dos alelos fetales, que se heredan de la madre. La señal del lugar cromosomal de interés para el cromosoma que está presente en tres copias, hará la contribución de un alelo fetal adición, que alterará la señal de los alelos en estos lugares cromosomales de interés . En otra modalidad, una relación puede calcularse usando un alelo sencillo y un ADN estándar de cantidad conocida. En una modalidad preferida, la relación se calcula usando los alelos del genoma maternal, y el alelo fetal, el cual se hereda de la madre, y un ADN estándar. La madre biológica puede formar genotipo para identificar un lugar cromosomal homocigótico de interés. Similarmente, el padre biológico puede formar un genotipo para identificar un lugar cromosomal de interés homocigótico. Los lugares cromosomales de interés en donde el ADN de plantilla maternal es homocigótico para un alelo y el ADN de plantilla paternal es homocigótico para el otro alelo se analiza usando el ADN de plantilla obtenido del plasma de la madre, que contiene el ADN de plantilla tanto maternal como fetal . En una modalidad preferida, la señal del genoma maternal y el alelo fetal, que se hereda de la madre, en el lugar cromosomal de interés se cuantifica. Por ejemplo, si la colgadura 5' , que se genera después de la digestión con la enzima tipo IIS, se rellena con un nucleotido que se etiqueta fluorescentemente, la intensidad del pigmento incorporado puede cuantificarse ADN de Plantilla en el Plasma - tanto Adn de plantilla maternal como ADN de plantilla fetal ADN de plantilla maternal -- Homocigótico para Adenina Alelo 1 5'CCG A* 3'GGC T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'CCG 3'GGC Posición de colgadura ADN de Plantilla fetal - Homocigótico Alelo 1 5'CCG A* 3 ' GGC G G Posición de colgadura 1 2 Alelo 2 5'CCG ddC 3'GGC T G T G Posición de colgadura 1 2 3 4 El ADN de plantilla obtenido del plasma de una mujer embrazada se rellena con ddATP etiquetado, y ddCTP no etiquetado (descrito como ddC arriba), ddGTP, y ddTTP. El ADN de plasma contiene dos alelos de adenina maternales, y un alelo de adenina fetal . Al rellenar con ddATP etiquetado y ddCTP no etiquetado, sólo el alelo maternal y el alelo fetal heredados de la madre se detectan. Un lugar cromosomal de interés sencillo o múltiples lugares cromosomales de interés pueden analizarse. Para cada lugar cromosomal de interés, se diseña una molécula de ADN para migrar alrededor de la misma posición del lugar cromosomal de interés. En una modalidad preferida, la molécula de ADN es de cantidad conocida. Se calcula una relación usando los alelos del genoma maternal y el alelo fetal, que se hereda de la madre, y la molécula de ADN se diseña para migrar alrededor de la misma posición como el lugar cromosomal de interés. Por ejemplo, si el lugar cromosomal de interés se diseña para migrar a 30 pares base, la molécula de ADN puede diseñarse para migrar alrededor de 30 pares base que incluyen, pero no se limitan a 20-25, 25-30, 30-35, 35-45 y más de 45. Los alelos del genoma maternal y el alelo fetal, que se heredan de la madre, y la molécula de ADN estándar pueden analizarse en la misma reacción o pueden analizarse en una reacción separada. Los alelos del genoma maternal y el alelo fetal, que se heredan de la madre, y la molécula de ADN estándar pueden analizarse en el mismo carril de un gel o pueden analizarse en carriles separados de un gel . El uso de moléculas de ADN estándares de cantidad conocida, que se diseñan para migrar a la misma posición como el lugar cromosomal de interés, serán correctas por varios factores que incluyen pero no se limita a la intensidad de las bandas con relación a la ubicación en el gel . La relación de múltiples lugares cromosomales de interés en un cromosoma puede cuantificarse, y se calcula un promedio. El promedio puede compararse al promedio obtenido de otro cromosoma. La relación se usa para indicar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal. El análisis de los alelos del genoma maternal y el alelo fetal también permite la detección de un gen sencillo o trastornos genéticos de genes múltiples. Cualquier cromosoma de cualquier organismo se puede analizar usando los métodos de la invención. Por ejemplo, en los humanos, el cromosoma 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X o Y se pueden analizar usando los métodos de la invención. La relación para los alelos en el lugar heterocigótico de interés sobre cualquier cromosoma se pueden comparar con la relación para los alelos en el lugar heterocigótico de interés sobre cualquier otro cromosoma. Así, la presente invención proporciona una técnica no invasiva que es independientemente del aislamiento de células fetales, para una detección rápida, precisa y definitiva de anormalidades de cromosomas en un feto. La presente invención también proporciona un método no invasivo para determinar la secuencia de ADN de un feto. La presente invención se puede usar para detectar cualquier alteración en la secuencia de genes en comparación con la secuencia de tipo silvestre incluyendo pero limitando a una mutación de punto, giro de estructura de lectura, transición, transversión, adición, inserción, eliminación, adición-eliminación, giro de estructura, sentido equivocado, mutación reversa y alteración microsatélite .

Detección de las Anormalidades Cromosomales Fetales Usando Repeticiones Cortas en Tándem Las repeticiones cortas en Tándem (SRTs) son secuencias cortas de ADN, normalmente de 2-5 pares base de longitud, que se repiten varias veces en una forma de cabeza a cola. Las secuencias de ADN repetidas en tándem se distribuyen a lo largo del genoma humano y muestran una variabilidad suficiente entre los individuos en una población. Los minisatélites tiene repeticiones de núcleo con 9-80 pares base . En otra modalidad, las repeticiones cortas en tándem, se puede usar para detectar anormalidades cromosomales fetales. Se puede obtener el ADN de plantilla a partir de una mezcla que contiene ácido nucleico que incluye pero no se limitan a, células, tejido, sangre, suero, plasma, saliva, orina, lágrimas, secreción vaginal, fluido linfático, fluido cerebroespinal, secreción mucosa, fluido peritoneal, fluido ascitico, materia fecal o exudados del cuerpo. En otra modalidad, se agrega un inhibidor de la lisis celular a la muestra que contiene el ácido nucleico. En una modalidad preferida, se obtiene el ADN de plantilla de la sangre de una mujer embarazada. En otra modalidad, se obtiene el ADN de plantilla del plasma o suero de la sangre de una mujer embarazada . El ADN de plantilla obtenido de la sangre de una mujer embarazada, contendrá el ADN fetal y el ADN materno. El ADN fetal comprende STR de la madre y del padre. La variación entre los STR entre la madre y el padre se puede usar para detectar la anormalidades cromosomales. Se pueden diseñar cebadores para amplificar las repeticiones cortas en tándem. Se puede usar cualquier método de amplificación que incluye pero no se limita a, la reacción en cadena de polimerasa, reacción de secuencias auto-sostenidas, reacción en cadena de ligasa, amplificación rápida de extremos de ADNc, reacción en cadena de polimerasa y reacción en cadena de ligasa, amplificación del fago Q-beta, amplificación del desplazamiento de hebra y reacción en cadena de polimerasa con extensión de traslape de empalme. En una modalidad preferida, se usa PCR. Cualquier número de repeticiones cortas de tándem se puede analizar, que incluye pero no se limitan a, 1-5, 5-10, 10-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-1000 y más de 1000. Se pueden analizar las repeticiones cortas en tándem en una reacción de PCR o en reacciones múltiples PCR. En una modalidad preferida, se analizan los STR de cromosomas múltiples . Después de la amplificación, se pueden analizar los productos PCR por cualquier número de método que incluyen pero no se restringen a electroforesis de gel y espectrometría de masa. El ADN de plantilla de la mujer embarazada comprende STR de origen materno y paterno. Los STR de origen paterno representan el ADN fetal . Los STR paternos y maternos pueden ser idénticos en longitud o puede diferir los STR maternos y paterno. Los STR heterocigóticos son aquellos de los cuales difieren el materno y paterno en longitud. La cantidad de cada producto PCR se puede cuantificar para cada PCR heterocigótico . Con un número normal de cromosomas, la cantidad de cada producto PCR debe ser de aproximadamente igual. Sin embargo con un cromosoma extra, estará presente uno de los productos PCR de STR en una mayor cantidad. Por ejemplo, los STR múltiples en el cromosoma 1, se pueden analizar el ADN de plantilla obtenido de la sangre de la -mujer embarazada. Cada STR ya sea de origen materno o paterno, debe estar presente en aproximadamente la misma cantidad. Similarmente, con dos cromosomas 21, cada STR debe estar presente aproximadamente en la misma cantidad. Sin embargo, con una trisomía 21, uno de los productos PCR de STR, cuando el materno y el paterno difieren en longitud (un STR heterocigótico) debe estar presente en mayor cantidad. Se puede comparar la relación de cada STR heterocigótico sobre un cromosoma con la relación de cada STR heterocigótico en un cromosoma diferente, en donde una diferencia indica la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal .

Kits Los métodos de la invención son practicados más convenientemente mediante la provisión de los reactivos usados en los métodos en la forma de kits. Un kit preferiblemente contiene uno o más de los siguientes componentes: instrucciones escritas para el uso del kit, soluciones amortiguadoras apropiadas, sales, detergentes de extracción de ADN, cebadores, nucleótidos, nucleótidos etiquetados, materiales de modificación de terminación 5', y si se desea, agua de la pureza apropiada, confinado en recipientes o paquetes separados, tales componentes permiten al usuario del kit extraer la muestra de ácido nucleico apropiado, y analizar la misma de acuerdo a los métodos de la invención. Los cebadores que son provistos con el kit variarán, dependiendo del propósito del kit y el ADN que se desea evaluar usando el kit. También puede ser diseñado un kit para detectar un polimorfismo de nucleótido único deseado o de una variedad, especialmente aquellos asociados con una condición o enfermedad no deseada. Por ejemplo, un kit puede comprender, entre otros componentes, un conjunto o conjuntos de cebadores para amplificar uno o más lugares cromosomales de interés asociados con le enfermedad de Huntington. Otro kit puede comprender, entre otros componentes, un conjunto o conjuntos de cebadores para genes asociados con una predisposición a desarrollar la diabetes tipo I o tipo II. Todavía, otro kit puede comprender, entre otros componentes, un conjunto o conjuntos de cebadores para genes asociados con una predisposición a desarrollar enfermedad del corazón. Los detalles de los usos para tales kits se proporcionan en la sección siguiente de "Utilidades" .

Utilidades Se pueden usar los métodos de la invención cuando se desee conocer el genotipo de un individuo. El método de la invención es especialmente útil para la detección de trastornos genéticos . El método de la invención es especialmente útil como una técnica no invasiva para la detección de trastornos genéticos en un feto. En una modalidad preferida, el método de la invención proporciona un método para la identificación de polimorfismos de nucleótidos sencillos. En una modalidad preferida, el método es útil para detectar anormalidades cromosomales que incluyen pero no se limitan a, trisomías, monosomías , duplicaciones, eliminaciones, adiciones, re-configuraciones cromosomales, trans-ubicaciones y otros anueplodias. El método es especialmente útil para la detección de anormalidades cromosomales en un feto. En una modalidad preferida, el método de la invención proporciona un método para identificación de la presencia de una enfermedad en un feto, especialmente una enfermedad genética que surge como un resultado de la presencia de una secuencia genómica, u otra condición biológica que es deseada para identificar en un individuo para el cual se desea conocer la misma. La identificación de tal secuencia en el sujeto está basada en que la presencia de la secuencia genómica puede ser usada, por ejemplo, para determinar si el feto es un portador o para valorar si el feto está predispuesto a desarrollar un cierto rasgo, condición o enfermedad genética. El método de la invención es usado especialmente en evaluación genética prenatal de padres e hijos . En la Tabla IV están enlistados ejemplos de algunas de las enfermedades que pueden ser diagnosticadas por esta invención.

TABLA IV Acondroplasia Adrenoleucodistrofía, Enlazada en X Agammaglobulinemia, Enlazada en X Síndrome de Alagille Síndrome de Retraso mental Enlazado a X de Talasemia- Alfa Enfermedad de Alzheimer Enfermedad de Alzheimer, Familiar de Comienzo Temprano Esclerosis Lateral Amiotrófica General Síndrome de Insensibilidad de Andrógeno Síndrome de Angelman Ataxia General, Hereditaria Ataxi -Telangiectasia Distrofia Muscular .de Becker (También Las Distrofinopatí s) Síndrome de Beckwith-Wiedemann Beta-Thalasemia Deficiencia de Biotinidasa Síndrome Branguiootorenal Cáncer de Mama/Ovario Hereditario BRCAl y BRCA2 Cáncer de Mama CADASIL Enfermedad de Canavan Cáncer Neuropatía Hereditaria de Charcot-Marie-Tooth Neuropatía de Charcot-Marie-Tooth Tipo 1 Neuropatía de Charcot-Marie-Tooth Tipo 2 Neuropatía de Charcot-Marie-Tooth Tipo 4 Neuropatía de Charcot-Marie-Tooth Tipo X Síndrome de Cockayne Cáncer de Colon Aracnodactilia Contractural , Congénita Síndromes de Craniosinostosis (Relacionado con FGFR) Fibrosis Cística Cistinosis Sordera y Pérdida de Audición Hereditaria DRPLA (Atrofia Dentatorubral-Palidoluisiana) Síndrome DiGeorge (también Síndrome de Eliminación 22qll) Cardiomiopatía Dilatada, Enlazada en X Síndrome de Down (Trisomía 21) Distrofia Muscular de Dichenne (también Las Distrofinopatias) Distonía, Primaria de Comienzo Temprano (DYT1) Las Distrofinopatias Síndrome de Ehlers-Danlos, forma cifoscoliótica Síndrome de Ehlers-Danlos, Tipo Vascular Epidermolisis Bulosa Simple Exostosis, Múltiple Hereditaria Distrofia Muscular Facioscapulohumeral Trombofilia de Leiden de Factor V Poliposis Adenomatosa Familiar (FAP) Fiebre del Mediterráneo Familiar Síndrome de X Frágil Ataxia de Friedreich Demencia Frontotemporal con Parkinsonismo-17 Galactosemia Enfermedad de Gaucher Hemocromatosis Hereditaria Hemofilia A Hemofilia B Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria Pérdida de Audición y Sordera, No sindrómica, DFNA (Conexina 26) Pérdida de Audición y Sordera, No sindrómica, DFNB1 (Conexina 26) Paraplejia Espástica Hereditaria Síndrome de Hermansky-Pudlak Deficiencia de Hexosaminidasa A (también Sachs Tay) Enfermedad de Huntington Hipocondroplasia Ictiosis, Congénita, Autosomal Recesiva Pigmento de Incontinencia Enfermedad de Kennedy (también Atrofia Muscular Espinal y Bulbar) Enfermedad de Krabbe Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber Leucemias por Síndrome de Lesch-Nyhan Síndrome de Li-Fraumeni Distrofia Muscular de Extremidad-Girdle Deficiencia de Lipoproteína de Lipasa Familiar Lisencefalia Síndrome de Marfan MELAS (Encefalomiopatia Mitocondrial, Acidosis Láctica, y Episodios Similares al Infarto) Monosomías Neoplasia Endocrina Múltiple Tipo 2 Exostosis Múltiple Hereditaria, Distrofia Muscular Congénita Distrofia Miotónica Diabetes Insipidus Nefrogénica Neurofibromatosis 1 Neurofibromatosis 2 Neuropatía con Propensión a Parálisis de Presión Hereditaria Enfermedad de Nieman-Pick Tipo C Enfermedad de Norrie por Síndrome de Rompimiento de Nijmegen Albinismo Oculocutáneo Tipo 1 Distrofia Muscular Oculofaringea Cáncer de Ovario Síndrome de Pallister-Hall Enfermedad de Parkxnson Juvenil Tipo Parkin Enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher Síndrome de Pendred Síndrome de Peutz-Jeghers, Deficiencia de Hidroxilasa de Fenilalanina Síndrome de Prader-Willi Deficiencia de Hormona Pituitaria combinada Relacionada-PR0P1 (CPHD) Cáncer de Próstata Retinitis Pigmentosa Retinoblastoma Síndrome de Rothmund-Thomson .

Síndrome de Smith-Lemli-Opitz Paraplejla Espastica Hereditaria Atrofia Muscular Espinal y Bulbar (también Enfermedad de Kennedy) Atrofia Muscular Espinal Ataxia Espinocerebelar Tipo 1 Ataxia Espinocerebelar Tipo 2 Ataxia Espinocerebelar Tipo 3 Ataxia Espinocerebelar Tipo 6 Ataxia Espinocerebelar Tipo 7 Síndrome de Stickler (Artrooftalmopatia) Tay-Sachs (también GM2 Gangliosidoses) Trisomías Complejo de Esclerosis Tuberosa Síndrome de Usher Tipo I Síndrome de Usher Tipo II Síndrome Velocardiofacial (también 22gll Síndrome de Eliminación) Síndrome de Von Hippel-Lindau Síndrome de Williams Enfermedad de Wilson Adrenoleucodistrofia enlazada a X Agammaglobulinemia Enlazada en X Cardiomiopatia Dilatada Enlazada en X (también Las Distrofinopatias) Síndrome de Retraso mental de Facies Hipotónicas X-enlazado El método de la invención es útil para separación por exclusión de un individuo en lugares cromosomales de interés múltiples, asi como en decenas, centenas, o aún en miles de lugares cromosomales de interés asociados como un rasgo genético o enfermedad genética por secuenciamiento de los lugares cromosomales de interés que están asociados con el rasgo o estado de enfermedad, especialmente aquellos más frecuentemente asociados con el rasgo o condición. La invención es útil para analizar un conjunto particular de enfermedades que incluyen pero no están limitadas a enfermedad del corazón, cáncer, trastornos endocrinos, trastornos inmunes, trastornos neurológicos, trastornos músculo esqueléticos, trastornos oftalmológicos, anormalidades genéticas, trisomías, monosomías, transversiones, translocalización, trastornos de piel, y enfermedades familiares . El método de la invención también se puede usar para confirmar o identificar la relación de un ADN de una secuencia desconocida con un ADN de origen o secuencia conocido, por ejemplo, para su uso en pruebas de maternidad o paternidad y similares . Habiendo descrito ahora generalmente la invención, la misma se entenderá mejor con referencia a ciertos ejemplos específicos que se incluyen en la presente para propósitos de ilustración solamente y no se pretende que sean limitantes a menos que se especifique de otra manera.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son solamente ilustrativos y no están proyectados para limitar el alcance de la invención como está definido por las reivindicaciones .

EJEMPLO 1 Las secuencias de ADN fueron amplificadas por PCR, en donde el paso de combinación de pares base en el ciclo 1 fue realizado a una temperatura específica, y luego se incrementó en el ciclo 2, y además se incrementó en el ciclo 3 para el propósito de reducción de la amplificación no específica. El TM1 del ciclo 1 de PCR fue determinado mediante el cálculo de la temperatura de fusión de la región 3 ' , lo cual combina en pares base al ADN de plantilla, del segundo cebador. Por ejemplo, en la FIG. IB, el TM1 puede ser alrededor de la temperatura de fusión de la región "c" . La temperatura de combinación de pares base fue aumentada en el ciclo 2 , a TM2 , la cual fue alrededor de la temperatura de fusión de la región 3', lo cual combina los pares base a la temperatura del ADN, del primer cebador. Por ejemplo, en la FIG. 1C, la temperatura de combinación de pares base (TM2) corresponde a la temperatura de fusión de la región xb" . En el ciclo 3 , la temperatura de combinación de pares base ue aumentada a TM3 , la cual fue alrededor de la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador. Por ejemplo, en la FIG. ID, la temperatura de combinación de pares base (T 3) corresponde a la temperatura de fusión de la región "c" + la región "d" . Los ciclos que quedan de amplificación fueron realizados a TM3.

Preparación del ADN de plantilla El ADN de plantilla fue preparado de una muestra de 5 mi de sangre obtenida por venipunción de un voluntario humano con consentimiento informado. La sangre fue recolectada de 36 voluntarios. El ADN de plantilla fue aislado de cada muestra de sangre usando QIAamp ADN Blood Midi Kit suministrado por QIAGEN (Número de catálogo 51183) . Siguiendo el aislamiento, el ADN de plantilla de cada uno de los 36 voluntarios fue acumulado para más análisis.

Diseño de Cebadores Fueron analizados los siguientes cuatro polimorfismos de nucleótido único: SNP HC21S00340, el número de identificación como se asignó por la Base de Datos cSNP 21 de Cromosoma Humano, (FIG. 3, pista 1) localizado en el cromosoma 21; SNP TSC 0095512 (FIG. 3, pista 2) localizado en el cromosoma 1, SNP TSC 0214366 (FIG. 3, pista 3) localizado en el cromosoma 1; y SNP TSC 0087315 (FIG. 3, pista 4) localizado en el cromosoma 1. La base de datos de SNP Consortium Ltd puede ser accederse en http : //snp . cshl . org/, dirección de sitio web efectiva a partir de Febrero 14, 2002. El SNP HC21S00340 fue amplificado usando los siguientes cebadores : Primer cebador : 5 ' TAGAATAGCACTGAATTCAGGAATACAATCATTGTCAC 3 ' Segundo cebador: 5 'ATCACGATAAACGGCCAAACTCAGGTTA 3 ' El SNP TSC0095512. fue amplificado usando los siguientes cebadores : Primer cebador : 5 'AAGTTTAGATCAGAATTCGTGAAAGCAGAAGTTGTCTG 3 ' Segundo cebador : 5 ' TCTCCAACTAACGGCTCATCGAGTAAAG 3 ' El SNP TSC0214366 fue amplificado usando los siguientes cebadores : Primer cebador : 5 'ATGACTAGCTATGAATTCGTTCAAGGTAGAA7AATGGAA 3 ' Segundo cebado : 5 ' GAGAATTAGAACGGCCCAAATCCCACTC 3 ' El SNP TSC 0087315 fue amplificado usando los siguientes cebadores : Primer cebador: 5 ' TTACAATGCATGAATTCATCTTGGTCTCTCAAAGTGC 3 ' Segundo cebador : 5 ' GGACCATAAACGGCCAAAAACTGTAAG 3 ' Todos los cebadores fueron diseñados de manera que la región 3 ' fueron complementarios a cualquiera de las secuencias en la dirección ascendente o en la dirección descendente flanqueando cada lugar cromosomal de interés y la región 5' contiene un sitio de reconocimiento de enzima de restricción. El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en la terminación 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Eco I . El segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BceA I .

Reacción PCR Todos los cuatro lugares cromosomales de interés fueron amplificados del ADN genómico de plantilla usando PCR (Patentes de EUA Nos. 4,683,195 y 4,683,202) . Los componentes de la reacción PCR fueron como siguen: 40 ng de ADN de plantilla, 5 µ? de primer cebador, 5 µ? de segundo cebador, la Mezcla Maestra HotStarTaq IX fue obtenida de Qiagen (No. de catálogo 203443) . La Mezcla Maestra HotStarTaq contenía polimerasa de ADN, solución amortiguadora de PCR, 200 µ? de cada dNTP, y 1.5 mM MgCl2.

La amplificación de cada ADN de plantilla que contenía el SNP de interés fue realizada usando tres series diferentes de temperaturas de combinación de pares base, aquí se refirió a una temperatura de combinación de pares base de severidad baja, temperatura de combinación de pares base de severidad media y, temperatura de combinación de pares base de severidad alta. A pesar de todo el protocolo de temperatura de combinación de pares base, cada reacción de PCR consistió de 40 ciclos de amplificación. Las reacciones de PCR fueron realizadas usando el it de Mezcla Maestra HotStarTaq suministrado por QIAGEN. Como se indicó por el fabricante, las reacciones fueron incubadas a 95°C por 15 min antes del primer ciclo de PCR. El paso de desnaturalización después de cada paso de extensión fue realizado a 95 °C por 30 seg. La reacción de combinación de pares base se realizó a una temperatura que permitió la extensión eficiente sin ningún incremento en la temperatura . La reacción de combinación de pares base de severidad baja comprendió tres temperaturas de combinación de pares base diferentes en cada uno de los tres primeros ciclos. La temperatura de combinación de pares base para el primer ciclo fue de 37°C por 30 seg.; la temperatura de combinación de pares base para el segundo ciclo fue de 57 °C por 30 seg.; la temperatura de combinación de pares base para el tercer ciclo fue de 64 °C por 30 seg. La combinación de pares base se realizó a 64°C por ciclos subsecuentes hasta completar. Como se muestra en la fotografía del gel (FIG. 3A) , se observaron bandas múltiples después de la amplificación de la plantilla de ADN que contiene SNP TSC 0087315 (pista 4) . La amplificación de SNP HC21S00340 (pista 1) , SNP TSC0095512 (pista 2) , y SNP TSC0214366 (pista 3) generaron una banda sencilla de alta intensidad y una banda de intensidad débil que fue de peso molecular superior. Cuando las condiciones de temperatura baja de combinación de pares base se usaron, el producto de tamaño correcto se generó y este fue el producto predominante en cada reacción. La reacción de combinación de pares base de severidad media comprendió tres diferentes combinación de pares base en cada uno de los primeros tres ciclos . La temperatura de combinación de los pares base para el primer ciclo fue de 40°C durante 30 segundos; la temperatura de combinación de los pares base para el segundo sitio fue de 60 °C durante 30 segundos; y la temperatura de combinación de los pares base para el tercer ciclo fue de 67°C por 30 segundos. La combinación de los pares base se efectúo a 67°C por ciclos posteriores hasta su terminación. Similar a lo que se observo bajo condiciones de combinación de pares base de baja severidad. La amplificación de la plantilla de ADN que contiene SNP TSC0087315 (FIG 3B, pista 4) generó bandas múltiples bajo condiciones de severidad media. La amplificación de otros tres fragmentos de ADN que contienen SNPs (pista 1-3) produjo una banda sencilla. Estos resultados demuestran que las temperaturas variables de combinación de los pares base se pueden usar para limpiamente amplificar lugares cromosomales de interés a partir del ADN genómico con un cebador que tiene una longitud de combinaciones de los pares base de 13 bases . La reacción de combinación de pares base de alta severidad comprendió tres diferentes temperaturas de combinación de pares base en cada uno de los primeros tres ciclos . La temperatura de f sión de pares base del primer ciclo fue de 46°C por 30 segundos, la temperatura de combinación de pares base de segundo ciclo fue de 65°C por 30 segundos; y la temperatura de combinación de pares base para el tercer ciclo fue de 72 °C durante 30 segundos. La combinación de pares base se efectuó a 72 °C para los ciclos posteriores hasta su terminación. Como se muestra en la fotografía del gel (FIG. 3C) , la amplificación de la plantilla de ADN que contiene SNP TSC0087315 (pista 4) usando las temperaturas de combinaciones de pares base de alta severidad generó una banda sencilla del peso molecular correcto. Al elevar la temperaturas de combinación de pares para cada uno de los primeros tres ciclos, se eliminó una amplificación no específica. La amplificación del fragmento de ADN que contiene SNP TSC0095512 (pista 2) generó una banda sencilla. Los fragmentos de ADN que contienen SNPs HC12S00340 (pista 1) y TSC0214366 (pista 3) fallaron a ejemplificar temperaturas de combinaciones de pares de alta severidad, sin embargo, en las temperaturas de combinación de pares base de severidad media, estos fragmentos de ADN que contienen SNPs amplificados como una banda sencilla. Estos resultados demuestran que las temperaturas de combinación de pares base variables se pueden usar para reducir productos PCR no específicos como se demuestra para el fragmento de ADN que contiene SNP TSC0087315 (FIG. 3, pista 4) .

EJEMPLO 2 Los SNPs de los cromosomas 1 (TSC0095512) , 13 (TSC0264580) y 21 (HC21S00027) se analizaron. SNP TSC0095512 se analizó usando dos diferentes conjuntos de cebadores y SNP HC21S00027 se analizó usando dos tipos de reacciones para la incorporación de nucleótidos.

Preparación del ADN de plantilla Se preparó el ADN de plantilla a través de una muestra de 5 mi de sangre obtenida por venipunción de un voluntario humano con un consentimiento informado. Se aisló el ADN de plantilla usando el kit Midi de sangre QIAmp suministrado por QIAGEN (número de catálogo 51183) . El ADN de plantilla se aisló de acuerdo a las instrucciones en el kit. Después del aislamiento, el ADN de plantilla de treinta . y seis voluntarios humanos se acumularon juntos y se cortaron con la enzima de restricción EcoRI . Se efectuó la digestión de la enzima de restricció según las instrucciones del fabricante.

Diseño de cebadores SNP HC21S00027 se amplificó por PCR usando el siguiente conjunto cebador. Primer cebador: 5 'ATAACCGTATGCGAATTCTATAATTTTCCTGATAAAGG3 ' Segundo cebador : 5 ' CTTAAATCAGGGGACTAGGTAAACTTCA3 ' El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en la terminación del extremo 5', y la secuencia de nucleótidos para la enzima de restricción EcoRI . El segundo cebador contenido en la secuencia del nucleótido para la enzima de restricción BsmF I (FIG. 4A) . También, SNP HC21S00027 se amplificó por PCR usando el mismo primer cebador, pero un segundo cebador diferente con las siguiente secuencia: Segundo cebador: 5 ' CTTAAATCAGACGGCTAGGTAAACTTCA3 ' Este segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BceA I (FIG. 4B) . SNP TSC0095512 se amplificó por PCR usando los siguientes cebadores: Primer cebador : 5 ' AGTTTAGATCAGAATTCGTGAAAGCAGAAGTTGTCTG3 ' segundo cebador: 5 ' CTCCAACTAGGGACTCATCGAGTAAAG3 ' El primer cebador tuvo una etiqueta de biotina en la terminación 5' y contenía un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para EcoRI . El segundo cebador contenía un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para BsmFI (FIG.4C) . También, SNP TSC0095512 se amplificó usando el mismo primer cebador y un segundo cebador diferente con la siguiente secuencia: Segundo cebador: 5 ' TCTCCAACTAACGGCTCATCGAGTAAAG3 ' Este segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BceA I (FIG. 4D) . SNP TSC0264580, que se localiza en el cromosoma 13, se amplificó con los siguientes cebadores: Primer cebador : 5 'AACGCCGGGCGAGAATTCAGTTTTTCAACTTGCAAGG3 ' Segundo cebador: 5 ' CTACACATATCTGGGACGTTGGCCATCC3 ' El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en la terminación del extremo 5' y tenía un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para EcoRI . El segundo cebador contenía un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción para BsmF I .

Reacción por PCR Se amplificaron todos los lugares cromosomales de interés a partir de ADN genómico de plantilla usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, patentes de E.U.A. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas aquí como referencia). En este ejemplo, los lugares cromosomales de interés se amplificaron en tubos de reacción por separado pero también se pudieron amplificar juntos en una reacción PCR sencilla. Para una especificidad aumentada, se usó un PCR de "arranque en caliente" . Se efectuaron las reacciones por PCR usando kit Mix aster TostarTaq suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y el cebador por reacción se pueden optimizar para cada lugar cromosomal de interés pero en este ejemplo, 40 ng del ADN genómico humano de plantilla y 5 µ de cada cebador se usaron. Se efectuaron cuarenta ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95°C por 15 minutos y 15 segundos; (2) 37°C por 30 segundos; (3) 95°C por 30 segundos; (4) 57°C por 30 segundos; (5) 95°C por 30 segundos; (6) 64 °C por 30 segundos; (7) 95°C por 30 segundos; (8) Repetir las etapas 6 y 7 treinta y nueve (39) veces; (9) 72 °C por 5 minutos. En el primer ciclo de PCR, la temperatura de combinación de los pares base fue de alrededor desde la temperatura de fusión de la región de combinación de los pares base 3' de los segundos cebadores que fue 37°C. La temperatura de combinación de los pares base del segundo ciclo de PCR fue alrededor de la temperatura de fusión de la región 3', que combina los pares base con el ADN de plantilla del primer cebador que tenía 57°C. La temperatura de combinación de los pares base en el tercer ciclo de PCR fue de alrededor de la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador que fue de 64°C. La temperatura de combinación para los ciclos restantes fue de 64°C. El escalamiento de la temperatura de combinación de los pares base de TM1 a TM2 hasta TM3 en los primeros tres ciclos de PCR mejora ampliamente la especificidad. Estas temperaturas de combinación de pares base son representativas, y el técnico experimentado entenderá las temperaturas de combinación de los pares base para cada ciclo dependen de los cebadores específicos usados. Las temperaturas y tiempos para la desnaturalización, combinación de pares base y extensión, se puede optimizar al intentar diversos entornos y usando los parámetros que produjeron los mejores resultados. Los esquemas de los productos PCR para SNP HC21S00027 y SNP TSC095512 se muestran en las figuras FIGS . 5A-5D.

Purificación del fragmento de interés Los productos por PCR se separaron del ADN de plantilla genómico. Cada producto de PCR se dividió en cuatro pozos de reacción por separado de una placa Streptawell transparente, High-Bind de Roche Diagnostics GmbH (número de catálogo 1 645 692, como se enlista en Roche Molecular Biochemicals , 2001, Biochemicals Catalog) . Los primeros cebadores están contenidos en una etiqueta de biotina 5' de manera que los productos PCR se enlazaron a los pozos recubiertos con estreptatividina mientras que el ADN de plantilla genómico no lo hizo. La reacción de enlace de estreptatividina se efectúo usando un Thermomixer (Eppendorf) a 1000 rpm por 20 minutos a 37 °C. Se aspiró cada pozo para retirar el material sin enlazar, y se lavó 3 veces con IX PBS , con un mezcla suave ( andpal et al., Nucí. Acids Res. 18: 1789-1795 (1990); Kaneoka et al., Biotechniques 10: 30-34 (1991); Green et al., Nucí. Acids Res. 18:6163-6164 (1990)) .

Digestión de enzimas de restricción de fragmentos aislados Se digirieron los productos purificados por PCR con la enzima de restricción y se enlazó al sitio de reconocimiento incorporado en los productos PCR del segundo cebador, las plantillas de ADN que contiene SNP HC21S00027 (FIG. 6A y 6B) y SNP TSC0095512 (FIG. 6C y 6D) se amplificaron en reacciones por separado usando dos diferentes segundos cebadores. FIG. 6A (SNP HC21S00027) y FIG. 6C (SNP TSC0095512) detallan los productos PCR después de la digestión con la enzima de restricción BsmF I (New England Biolabs número de catálogo R0572S) . FIG. 6B (SNP HC21S00027) y FIG. 6D (SNP TSC009512) detallan los productos PCR después de la digestión con la enzima de restricción BceA I (New England Biolabs, número de catálogo R0623S) . Los productos de digestión se efectuaron en los pozos Streptawells siguiendo las instrucciones suministradas con la enzima de restricción. El fragmento de ADN que contiene SNP TSC0264580 se digirió con BSMF I. Después de la digestión con la enzima de restricción adecuada, se lavaron 3 veces los pozos con PBS para retirar los fragmentos desdoblados.

Incorporación del Nucleótido Etiquetado El producto de digestión de la enzima de restricción antes descrita produjo un fragmento de ADN con una colgadura 5' que contiene el sitio SNP o el lugar cromosomal de interés y un extremo rebajado 3'. La colgadura 5' funcionó como una plantilla permitiendo la incorporación de un nucleótido o nucleótidos en presencia de una polimerasa de ADN. Para cada SNP, se efectuaron cuatro reacciones por separado de llenado, cada una de las cuatro reacciones contenía un dideoxinucleótido etiquetado fluorescentemente diferente (ddATP, ddCTP, ddGTP, o ddTTP) . Se agregaron los siguientes componentes a cada reacción de relleno: 1 µ? del dideoxinucleótido etiquetado fluorescentemente, 0.5 µ? de los ddNTPS no etiquetados (40 µ?) , que contenían todos los nucleótidos excepto el nucleótido que se etiquetó fluorescentemente, 2 µ? de solución amortiguadora 10X de secuenasa, 0.25 µ? de secuenasa, y agua como fue necesaria para una reacción de 20 µ? . Todas las reacciones de relleno se efectuaron a 40°C por 10 minutos. Se adquirieron nucleótidos etiquetados no fluorescentemente de Fermentas Inc. (Hanover, MD) . Todos los otros reactivos de etiquetado se obtuvieron de Amersham (Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565) . En presencia de los ddNTPs etiquetados fluorescentemente, la terminación rebajada 3 ' se extendió en una base lo cual corresponde al SMP o lugar cromosomal de interés (FIG. 7A-7D) . Una mezcla de los ddNTPs etiquetados y dNTPs sin etiquetar también se usó para la reacción de "llenado" para SNP HC21S00027. Las condiciones de "llenado" fueron como se describen arriba, excepto que una mezcla que contiene 40 µ de los dNTPs no etiquetados, 1 µ? de ddATP etiquetado fluorescentemente, 1 µ? de ddCTP etiquetado fluorescentemente, 1 µ? de ddGTP etiquetado fluorescentemente y 1 µ? ddTTP se usó. Los ddNTPs fluorescentes se obtuvieron de Amersham (Termo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565; Amersham no publicó la concentraciones de los nucíeótidos fluorescentes) . El SNP HC21S00027 se digirió con la enzima de restricción BsmF I, que generó una colgadura 5' de cuatro bases. Como se muestra en FIG. 7E, si el primer nucleótido incorporado es un dideoxinucleótido etiquetado, la terminación rebajada 3' se llena por una base, permitiendo la detección de SNP o lugar cromosomal de interés. Sin embargo, si el primer nucleótido incorporado es un dNTP, la polimerasa continua para incorporar nucíeótidos hasta que un ddNTP se completa. Por ejemplo, los primeros dos nucíeótidos se pueden llenar con dNTPs, y el tercer nucleótido con un ddNTP, permitiendo la detección del tercer nucleótido en la colgadura. Así, la secuencia de la colgadura completa 5' se puede determinar, lo cual incrementa la información obtenida de cada SNP o lugar cromosomal de interés . Después de etiquetar, cada Strepta ell se enjuagó con IX PBS (100 µ?) tres veces. Los fragmentos de ADN llenados luego se liberaron de los Streptawell por digestión con la enzima de restricción EcoRI de acuerdo con las instrucciones del fabricante que se suministraron con la enzima (FIGS. 8A-8D) . Se efectuó la digestión por 1 hora a 37 °C con agitación a 120 rpm.

Detección del lugar cromosomal de interés Después de la liberación de la matriz de estreptavidina , 2-3 µ? de la muestra de 10 µ? se cargó en una charola de membranas de 48 pozos (The Gel Company, número de catálogo TAM48-01) . La muestra en la charola se absorbió con un 48 Flow embrane Comb (The Gel Company, número de catálogo ??48) , y se insertó dentro de un gel de acrilamida 36 cm 5% (urea) (Bio Whittaker Molecular Applications, Long Ranger Run gel Packs, número de catálogo 50691) . La muestra se trató por electroforesis en el gel a 3000 voltios por 3 minutos. Se retiró la cresta de la membrana y el gel se corrió por 3 horas en una máquina formadora de secuencias automatizada ABI 377. El nucleótido etiquetado incorporado se detectó por fluorescencia. Como se muestra en FIG. 9A, a partir de una muestra de treinta y seis (36) individuos, uno de dos nucleó idos ya sea adenosina o guanina, se detectó en SNP HC21S00027. Estos son los dos nucleótidos reportados que existen en SNP HC21S00027 (www. snp . schl . org/snpsearch . shtml) . Uno de los dos nucleótidos, ya sea guanina o citosina, se detectó en SNP TSC0095512 (FIG. 9B) . Los mismos resultados se obtuvieron ya sea que el mismo lugar de interés se amplifique con un segundo cebador que contiene un sitio de reconocimiento para BceA I o el segundo cebador que contiene un sitio de reconocimiento para BsmF I. Como se muestra en FIG. 9C, uno de los dos nucleótidos se detectó a SNP TSC02S4580, que fue adenosina o citosina. Estos son los dos nucleótidos reportados a este sitio SNP (www. snp. schl . org/snpsearch. shtml) . Además, se detectó una timidina en una base en una dirección ascendente del lugar cromosomal de interés. En una forma dependiente de la secuencia, BsmF I corta algunas de -las moléculas de ADN en la posición 10/14 y otras moléculas de ADN que tienen la misma secuencias en la posición 11/15. Cuando la enzima de restricción BsmF I corta a 11 nucleótidos fuera en la hebra de sentido y 15 nucleótidos fuera en la hebra antisentido, la terminación 3' rebajada esta a una base en dirección ascendente del sitio SNP. La secuencia de SNP TSC0264580 indico que la base inmediatamente precedente al sitio SNP fue una timidina. La incorporación de un ddNTP etiquetado en esta posición generó un fragmento de una base más pequeña que el fragmento que se cortó en la posición 10/14. Así, las moléculas de ADN cortadas en la posición 11/15 proporcionan una información de identidad acerca de la base que precede inmediatamente al sitio SNP, y las moléculas de ADN cortadas en la posición 10/14 proporcionan información de identidad acerca del sitio SNP. El SNP HC21S00027 se amplificó usando un segundo cebador que contiene el sitio de reconocimiento para BsmF I . Una mezcla de los ddNTPs etiquetados y los dNTPs se usó para llenar la colgadura 5' generada por la digestión con BsmF I. Si se incorporan un dNTP, la polimerasa continúa incorporando los nucleótidos hasta que se incorpora un ddNTP. Una población de fragmentos de ADN, cada uno se difiere de una base se generó, lo cual permite la secuencia completa de la colgadura a determinarse . Como se muestra en la FIG.9D, se detectó una adenosina, que fue complementaria el nucleotido (una timidina) que precede inmediatamente al SNP lugar cromosomal de interés. Este nucleotido se detectó debido a que la propiedad del corte 11/15 BsmF I, que se describe con mayor detalle arriba. Una guanina y una adenosina se detectaron en el sitio SNP, que son los dos nucleótidos reportados para este sitio SNP (FIG. 9A) . Se detectaron los dos nucleótidos en el sitio SNP debido a que los pesos moleculares de los colorantes difieren lo cual permite la separación de los dos nucleótidos. El siguiente nucleotido detectado fue una timidina, que es complementaria al nucleotido inmediatamente en la dirección descendente del sitio SNP. El siguiente nucleotido detectado fue una guanina que fue complementaria las dos bases del nucleotido en la dirección descendente del sitio SNP.

Finalmente, se detectó una adenosina que fue complementaria al tercer nucleótido en la dirección descendente del sitio SNP. Se obtuvo la información de secuencias no solamente para el sitio SNP sino para el nucleótido que precede inmediatamente al sitio SNP y a los siguientes tres nucleótidos . Ninguno de los lugares cromosomales de interés contenía una mutación. Sin embargo, si uno de los lugares cromosomales de interés alojaba una mutación que incluye pero no se limita a, una mutación de punto, inserción, eliminación, transubicación, o cualquier combinación de las mutaciones, se puede identificar por comparación a la secuencia publicada o de consenso. La comparación de las secuencias atribuidas a cada uno de los lugares cromosomales de interés a la secuencia relacionada nativa que no es de enfermedades del gen en cada lugar cromosomal de interés determina la presencia o ausencia de una mutación en esa secuencia. El hallazgo de una mutación en la secuencia luego se interpreta por la presencia de la enfermedad indicada o una pre-disposición a desarrollar la misma como sea adecuado en este individuo. Las cantidades relativas de la secuencia mutada contra la normal o no mutada se pueden evaluar para determinar si el sujeto tiene uno o dos alelos de la secuencia mutada, ? así si el sujeto es un portador si la mutación indicada resulta en una condición dominante o recesiva.

EJEMPLO 3 Cuatro lugares cromosomales de interés de cromosoma 1 y dos lugares cromosomales de interés de cromosoma 21 se amplificaron en reacciones por separado de PCR, se acumularon juntas y se analizaron. Se diseñaron los cebadores de manera que cada lugar cromosomal de interés amplificado será de un tamaño diferente lo cual permitió la detección de los lugares cromosomales de interés .

Preparación del ADN de plantilla El ADN de plantilla se prepara a partir de una muestra de 5ml de sangre obtenida por venipunción de un voluntario humano con consentimiento informado. Se aisló el ADN de plantilla usando el Kit Midi de sangre ADN QIAmp suministrado ~ por QIAGEN (número de catálogo 51183) . Se aisló el ADN de plantilla según las instrucciones incluidas en el kit. Se aisló el ADN de plantilla a partir de 36 voluntarios humanos y luego se acumuló en una muestra sencilla para análisis adicional .

Diseño de cebadores SNP TSC 0087315 se amplificó usando los siguientes cebadores : Primer cebador: 5 ' TTACAATGCATGAATTCATCTTGGTCTCTCAAAGTGC3 ' Segundo cebador: 5 ' TGGACCATAAACGGCCAAAAACTGTAAG3 ' SNP TSC0214366 se amplificó usando los siguientes cebadores : Primer cebador: 5 ATGACTAGCTATGAATTCGTTCAAGGTAGAAAATGGAA3 ' Segundo cebador : 5 ' GAGAATTAGAACGGCCCAAATCCCACTC3 ' SNP TSC 0413944 se amplificó con los siguientes cebadores: Primer cebador: 5 ' TACCTTTTGATCGAATTCAAGGCCAAAAATATTAAGTT3 ' Segundo cebador 5 ' TCGAACTTTAACGGCCTTAGAGTAGAGA3 ' SNP TSCO095512 se amplificó con los siguientes cebadores : Primer cebador: 5 'AAGTTTAGATCAGAATTCGTGAAAGCAGAAGTTGTCTG3 ' Segundo cebador 5 ' TCTCCAACTAACGGCTCATCGAGTAAAG3 ' SNP HC21S00131 se amplificó con los siguientes cebadores : Primer cebador : 5 ' CGATTTCGATAAGAATTCAAAAGCAGTTCTTAGTTCAG3 ' Segundo cebador: 5 ' TGCGAATCTTACGGCTGCATCACATTCA3 ' SNP HC21S00027 se amplificó con los siguientes cebadores : Primer cebador: 5 'ATAACCGTATGCGAATTCTATAATTTTCCTGATAAAGG3 ' Segundo cebador: 5 'CTTAAATCAGACGGCTAGGTAAACTTCA3 ' Para cada SNP, el primer cebador contenía un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI y tuvo una etiqueta y biotina en la terminación del extremo 5'. El segundo cebador usado para amplificar cada SNP contenía un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BceA I.

Reacción por PCR Las reacciones por PCR se efectuaron como se describe en el Ejemplo 2 excepto que se usaron las siguientes temperaturas de combinación de los pares bases : las temperaturas de combinación de los pares base del primer ciclo de PCR fue de 37°C por 30 segundos, la temperatura de combinación de los pares base para el segundo sitio PCR fue de 57°C durante 30 segundos, y la temperatura de combinación de los pares base para el tercer ciclo de PCR fue de 64°C por 30 segundos. Todos los ciclos posteriores tuvieron una temperatura de combinación de pares base de 6 °C durante 30 segundos. Se efectuaron treinta y siete (37) ciclos de PCR.

Después del PCR, se retiró un 1/4 del volumen de cada reacción y se combinó en un tubo sencillo.

Purificación del Fragmento de Interés Los productos por PCR (ahora combinados en una muestra y referidos como la muestra) se separaron del ADN de plantilla genómico como se describe en el Ejemplo 2, excepto que la muestra se enlazó a un pozo sencillo de una placa de microtitulación.

Digestión de la enzima de restricción de fragmentos aislados La muestra se digirió con la enzima de restricción BceA I, que se une al sitio de reconocimiento en el segundo cebador. Las digestiones de las enzimas de restricción se efectuaron siguiendo las instrucciones suministradas con la enzima. Después de que se digiere la enzima de restricción, se lavaron los pozos 3 veces con IX PBS .

Incorporación de nucleótidos El producto de digestión de la enzima de restricción antes descrito produjo moléculas de ADN con una colgadura 5' que contiene el sitio SNP o lugar cromosomal de interés y un extremo rebajado 3' . La colgadura 5' funcionó como una plantilla que permite la incorporación de un nucleótido en presencia de una polimerasa de ADN.

Se usaron los siguientes componentes para la reacción de llenado: 1 µ? de ddATP etiquetado fluorescentemente; 1 µ? de ddTTP etiquetado fluorescentemente; 1 µ? de ddGTP etiquetado fluorescentemente; 1 µ? de ddCTP etiquetado fluorescentemente; 2 µ? de 10X de solución amortiguadora de secuenasa, 0.25 µ? de secuenasa y agua como se necesita para una reacción de 20 µ? . La reacción de llenado se efectuó a 40°C durante 10 min. Todos los reactivos de etiquetado se obtuvieron de Amersham (Kit de núcleo secuenciador y ciclo terminador de colorante de secuenasa- Thermo (US 79565) ; la concentración del dd TPS proporciono en el kit es de propiedad y no publicada por Amersham) . En presencia de los ddNTPs etiquetados fluorescentemente, la terminación rebajado 3 ' se llenó por una base que corresponde al SNP o lugar cromosomal de interés . Después de la incorporación del nucleótido, el Streptawell se enjuagó con IX PBS (100 µ?) tres veces. Los fragmentos de ADN "llenados" se liberaron del Streptawell por digestión con la enzima de restricción EcoRI siguiendo las instrucciones del fabricante. Se efectúo la digestión por 1 hora a 37°C con agitación a 120 rpm.

Detección del lugar cromosomal de interés Después de la liberación de la matriz de estreptavidina, 2-3 µ? de la muestra de 10 µ? se cargó en una charola de membranas de 48 pozos (The Gel Company, número de catálogo TAM48-01) . La muestra en la charola se absorbió con un 48 Flo Membrane Comb (The gel Company, número de catálogo AM48) , y se insertó dentro de un gel de acrilamida 36 cm al 5% (urea) (Bio Whittaker Molecular Applications, Long Ranger Run gel Packs, número de catálogo 50691) . La muestra se trató por electroforesis en el gel a 3000 voltios por 3 minutos . Se retiró la cresta de la membrana y el gel se corrió por 3 horas en una maquina formadora de secuencias automatizada ABI 377. El nucleótido etiquetado incorporado se detectó por fluorescencia. Los cebadores se diseñaron de manera que cada lugar cromosomal se interés amplificado difería en tamaño. Como se muestra en la Figura 10, cada lugar cromosomal de interés amplificado diferido por alrededor de 5-10 nucleótidos que permitió que se separen los lugares cromosomales de interés uno del otro por electroforesis de gel. Se detectaron 2 nucleótidos para SNP TSC0087315, que fueron guanina y citosina. Estos son los dos nucleótidos que se reporta que existen como SNP TSC0087315 (www. snp . schl . org/snpsearch . shtml) . La muestra comprendió un ADN de plantilla de 36 individuos y debido a que las moléculas de- ADN que incorporaron una guanina difirieron en peso molecular de aquellas que incorporaron una citosina, que observaron bandas diferentes para cada nucleótido. Se detectaron dos nucleotidos en SNP HC21S00027, que fueron guanina y adenosina (FIG. 10) . Los dos nucleotidos reportados para este sitio SNP son guanina y adenosina (www . snp . schl . org/snpsearch. shtml) . Como se discutió arriba, la muestra contenía el ADN de plantilla de treinta y seis individuos y uno esperaría que ambos nucleotidos se representaron en la muestra. El peso molecular de los fragmentos de ADN que incorporaron una guanina fue diferente de los fragmentos de ADN que incorporaron una adenosina que permitiría que se detectaran ambos nucleotidos. La citosina de nucleótido se detectó en SNP TSC0214366 (FIG. 10) . Los dos nucleotidos que reportaron existir en esta posición SNP son timidina y citosina. La guanina de nucleótido se detectó en SNP TSC0413944 (FIG. 10) . Los 2 nucleotidos reportados para esta SNP son guanina y citosina (http : //snp . cshl . org/snpsearch. shtml) . La citosina de nucleótido que se detectó a SNP TSCO0955112 (FIG. 10) . Los 2 nucleotidos reportados para este sitio SNP son guanina y citosina (htt : //snp. cshl . org/snpsearch . shtml) . El nucleótido detectado en SNP HC21S00131 fue guanina. Los 2 nucleotidos reportados para este sitio SNP son guanina y adenosina (http : //snp . cshl . org/snpsearch . shtml) . Como se discutió arriba, la muestra comprendía plantillas, la muestra comprendía plantilla de ADN de 36 individuos y uno esperaría que ambos nucleotidos estuvieran representados en los sitios SNP. Para SNP TSC0413944, TSC0095512, TSC0214366 y HC21S00131, se detectó uno de los dos nucleotidos . Es probable que ambos nucleotidos reportados para estos sitios SNP estén presentes en la muestra pero que un colorante fluorescente tenga supremacía sobre el otro. El peso molecular de las moléculas de ADN que incorporaron un nucleótido no permitieron la separación eficiente de las moléculas de ADN que incorporaron al otro nucleótido. Sin embargo, los SNP se separaron fácilmente uno del otro y para cada SNP, se incorporó un nucleótido adecuado. Se determinaron las secuencias de los lugares cromosomales múltiples de interés a partir de cromosomas múltiples que se trataron como una muestra sencilla después de PCR. Una reacción sencilla que contiene ddNTPs etiquetado fluorescentemente se etiquetó con la muestra que contenía lugares cromosomales de interés múltiples. Alternativamente, 4 reacciones separadas de llenado se pueden efectuar en donde cada reacción, tiene un nucleótido etiquetado fluorescentemente (ddATP, ddTTP, ddGTP, o ddCTP) y ddNTPs sin etiquetar (ver Ejemplo 2, FIGS . 7A-7D y FIGS . 9A-C) . Cuatro reacciones separadas de "llenado" permitirán la detección de cualquier nucleótido que esté presente en los lugares cromosomales de interés. Por ejemplo, si se analiza una muestra que contiene lugares cromosomales de interés múltiples a partir de un individuo sencillo, y el individuo es heterocigótico en uno o más de un lugar de interés, se pueden usar cuatro reacciones separadas de "relleno" para determinar los nucleótidos en los lugares de interés heterocigóticos . También, cuanto se analiza una muestra que contiene plantillas de individuos múltiples, cuatro reacciones por separado de "relleno" permitirán la detección de los nucleótidos presentes en la muestra, independientemente de que tan frecuente se encuentre el núcleotido en el lugar cromosomal de interés. Por ejemplo, si una muestra contiene plantillas de ADN de 50 individuos y 49 de los individuos tienen una timidina en el lugar cromosomal de interés, y un individuo tiene una guanina, el desempeño de cuatro reacciones de "relleno" separadas en donde cada reacción de "relleno" se opera en una pista separada de un gel tal como en FIGS. 9A-6C, permitirá la detección de la guanina. Cuando se analiza una muestra que comprende plantillas múltiples de ADN, las reacciones múltiples de "relleno" mejorarán la necesidad de distinguir nucleótidos múltiples en un sitio sencillo de interés por diferencias en masa. En este ejemplo, se analizaron los polimorfismos múltiples de nucleótidos sencillo. También es posible determinar la presencia o ausencia de mutaciones incluyendo mutaciones de punto, transiciones, trans- ersiones, trans-ubicaciones, inserciones, y eliminaciones de lugares cromosomales de interés múltiples. Los lugares cromosomales de interés múltiples pueden ser un cromosomal sencillo de cromosomas múltiples. Los lugares de interés múltiples pueden ser desde un gen sencillo o desde genes múltiples. La secuencia de lugares de interés múltiples que provocan o predisponen a un genotipo de enfermedad se pude determinar. Por ejemplo, se pueden amplificar de uno a decenas a cientos a miles de genes implicados en el cáncer o en cualquier otra enfermedad. Se pueden diseñar los cebadores de manera que cada lugar de interés amplificado difiere en tamaño. Después de PCR, -los lugares de interés amplificados se pueden combinar y tratar como una muestra sencilla. Alternativamente, los lugares de interés múltiples se pueden amplificar en una reacción de PCR o el número total de lugares de interés por ejemplo 100, se puede dividir en muestras, por ejemplo 10 lugares de interés por cada reacción PCR y luego después acumularse. Como se demuestra en la presente, la secuencia de lugares múltiples de interés se pueden determinar. Así en una reacción, la secuencia de uno a diez a cientos a miles de genes que predisponen o provocan un genotipo de enfermedad se pueden determinar.

EJEMPLO 4 La capacidad para determinar la secuencia o detectar las anormalidades cromosomales de un feto usando el ADN fetal libre de una m¾3-er—embarazada, se han obstaculizado por el bajo porcentaje de ADN fetal libre. Al incrementar el porcentaje ADN fetal libre se incrementaría la detección de la mutación, inserción, eliminación, transversión, monosomía, trisomía, trisomia 21, trisomía 18, trisomía 13, XY, XXX, otras aneuploidias, eliminación, adición, amplificación, transubicación, y reconfiguración. El porcentaje de ADN fetal en plasma obtenido de una muj^i 1 uinLa_La¿ada , se determinó en ausencia o en presencia de inhibidores de la lisis celular. Se usó un marcador genético en el cromosoma Y para calcular el porcentaje de ADN fetal.

Preparación del ADN de plantilla Se preparó la plantilla de ADN a partir de una muestra de 5mi de sangre obtenida por punción en la vena de un voluntario humano con consentimiento informado . Se formaron alícuotas de sangre en dos tubos (Fischer Scientific, 9 mi EDTA tubos Vacuette número de catálogo NC9897284) . Formaldehído (25 µ?/ml de sangre) se agregó a uno de los tubos . La muestra en el otro tubo permaneció sin tratar excepto por la presencia de EDTA. Los tubos se hicieron girar a 1000 rpm por 10 minutos. Se transfirieron dos mililitros del sobrenadante (el plasma) de cada muestra a un nuevo tubo y se hicieron girar 3000 rpm por 10 minutos. Se usaron 800 µ? de cada muestra para purificación por ADN. Se aisló el ADN usando el Kit Qiagen Midi para purificación de ADN de las células de sangre (Mini kit de sangre QIAmp AND número de catálogo 51183) . Se eluyó el ADN en 100 µ? de agua destilada. Se obtuvieron dos plantillas de ADN: una de la muestra de sangre tratada con EDTA y una de la muestra de sangre tratada con EDTA y formaldehído .

Diseño del cebador Se usaron dos conjuntos diferentes de cebador: un conjunto de cebador fue específico para el cromosoma Y, y así específico para el ADN fetal, y el otro conjunto cebador se diseñó para amplificar el gen de la fxbrosis cística que está presente en el ADN de plantilla materna y el ADN de plantilla fetal. En este ejemplo, el primer y segundo cebador se diseñaron de manera que las secuencias completas 5' y 3' de cada cebador se combinó a los pares base de ADN de plantillas. En este ejemplo, el feto tenía un genotipo XY y el cromosoma Y se usó como una presencia del ADN fetal . Se diseñaron los siguientes cebadores para amplificar el gen SRY y cromosoma Y. Primer cebador 5 ' TGGCGATTAAGTCAAATTCGC 3 ' Segundo cebador 5 CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT 3' Los cebadores diseñados para amplificar cualquier gen, o región de una región, o cualquier parte de cromosoma se pueden usar para detectar el ADN materno y fetal . En este ejemplo, se diseñaron los siguientes cebadores para amplificar el gen de la fibrosis cística. Primer cebador 5' CTGTTCTGTGATATTATGTGTGGT 3' Segundo cebador 5' AATTGTTGGCATTCCAGCATTG 3' Reacción por PCR El gen SRY y el gen de la fibrosis cística se amplificaron a partir del ADN genómico de plantilla usando PCR (Patentes de E.U. Nos. 4,683 y 4,683,202). Para una especificidad aumentada se usó un PCR de "partida en caliente" . Se efectuaron las reacciones por PCR usando el kit HotStarTaq Master Mix suministrado por Qiagen (catálogo No. 203443) . Para amplificación del gen SRY, el ADN eluido de la columna de purificación Qiagen se diluyó en serie 1:2. Para la amplificación del gen de la fibrosis cística, el ADN de la columna de purificación Qiagen se diluyó 1:4 y luego se diluyó en serie 1:2. Se usaron los siguientes componentes para cada reacción por PCR: 8µ1 de ADN de plantilla (diluido o sin diluir) , ?µ? de cada cebador (5µ?) , ??µ? de una mezcla HotStar Taq. Se utilizaron las siguientes condiciones por PCR. (1) 95°C para 15' (2) 94°C para 1' (3) 54°C para 15' ' (4) 72°C para 30' ' (5) repetir las etapas 2 6 4 para 45 ciclos (6) 10' a 72°C.

Cuantificación del ADN fetal Las plantillas de ADN que se eluyeron de las columnas Qiagen se diluyeron en serie a las siguientes concentraciones: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048 y 1:4096. La amplificación de gen CRY se efectuó usando las plantillas que estaban sin diluir 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512. Se efectuó la amplificación del gen de la fibrosis cística usando las plantillas de ADN que se diluyeron 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048 y 1:4096. La misma serie de dilución se efectuó con las plantillas de ADN que se purificaron de la muestra de plasma tratada con EDTA solamente y la muestra de plasma tratada con EDTA y formaldehído.

Los resultados de la reacciones por PCR usando la plantilla de ADN que se aisló de la muestra de plasma tratada con EDTA se muestran en la figura 11A. El gen SRY se amplificó a partir de una plantilla de ADN no diluida y también la muestra que se diluyo 1:2 (FIG 11A) . El gen SRY no se amplificó en las siguientes siete diluciones en serie. Por otro lado el gen de fibrosis cística se detectó en las diluciones en serie hasta 1:256. Se espera una mayor presencia del gen de la fibrosis cística debido al mayor porcentaje del ADN materno presente en el plasma. La última muestra de dilución que suministró la amplificación de producto de genes se supuso que tenía una copia de gen de fibrosis cística por el gen SRY. Los resultados de la reacción PCR que usan la plantilla de ADN que se aisló de la muestra de plasma tratada con formaldehído y EDTA se muestran en la FIG 11B. Se amplificó el gen SRY a partir de la plantilla sin diluir y también en la muestra que se diluyó 1:2 (FIG. 11B) . EL gen SRY no se amplificó en las siguientes seis diluciones. Sin embargo en la dilución 1:256 se detectó el gen SRY. Es improbable que la amplificación en la muestra 1:256 represente una señal real debido a que las previas seis diluciones en serie fueron todas negativas para la amplificación de SRY. La amplificación del gen SRY en esta muestra fue probablemente un artefacto experimental que resulta de un alto número de ciclos PCR usados. Así, no se usó la muestra 1:256 al calcular la cantidad de ADN fetal presente en la muestra. Se detectó la amplificación del gen de fibrosis cística en la muestra que se diluyó 1:16 (FIG 11B) . La presencia de formalina evita la lisis de células maternas y así hay un mayor porcentaje de ADN materno en la muestra. Esto está en un contraste fuerte con la muestra que se trató con ETDA, lo cual apoya una amplificación hasta una dilución de 1:256. El porcentaje de ADN fetal presente en el plasma materno se calculó usando la fórmula siguiente: % de ADN fetal = (cantidad de gen SRY/cantidad del gen de fibrosis cística) *2* 100. La cantidad del gen SRY se representa por un valor superior de dilución en el cual se amplifica el gen. Similarmente la cantidad del gen de fibrosis cística se representa por el valor de dilución más elevado en el cual se amplifica. La fórmula contiene un factor de multiplicación de dos (2), que se usa para normalizar para el hecho que hay solamente una copia del gen SRY (localizada en el cromosoma Y) , mientras que hay dos copias del gen de fibrosis cística. Para el ejemplo anterior, el porcentaje de ADN fetal presente en la muestra que se trató solamente con EDTA fue de 1.56% (2/256*2*100). El porcentaje reportado de ADN fetal presente en el plasma está entre 0.39-11.9% (Pertl and Bianc i, Obstetrics and Gynecology, Vol . 98, No. 3,483-490 (2001) . El porcentaje de ADN fetal presente en la muestra tratada con formalina y EDTA fue de 25% (2/16*2*100) . El experimento se repitió varias veces y cada vez la presencia de formalina incrementó el porcentaje global de ADM fetal. El porcentaje de ADN fetal a partir de 18 muestras de sangre con o sin formalina, se calculó como se describe arriba con la excepción de que las diluciones en serie de 1:5 efectuaron. Cuando se efectuaron las diluciones 1:5, la última dilución en serie que permitió la detección del gen SRY o del gen de fibrosis cística puede haber tenido un copia del gen o puede haber tenido cuatro copias del gen. Los resultados de las 18 muestras con o sin formalina se resumen en la Tabla V. El bajo intervalo supone que la última muestra de dilución tuvo una copia de los genes y el alto rango supone que la dilución tuvo cuatro copias de los genes.

Tabla V. ADN fetal en porcentaje medio con o sin formalina Muestra Rango inferior Rango superior Formalina 19.47 43.69 Sin formalina 7.71 22.1 Se logró un incremento global en el ADN fetal al reducir la lisis de células maternas y así al reducir la cantidad de ADN materno presente en la muestra. En este ejemplo se usó formaldehído para evitar la lisis de las células, sin embargo, se puede usar cualquier gene que evite la lisis de la células o incremente la integridad estructural de la célula. Se pueden usar dos o más de dos inhibidores de la lisis celular. El incremento en el ADN fetal en el plasma materno permite que se determine la secuencia del ADN fetal, y proporcione una detección rápida de secuencias anormales de ADN o anormalidades cromosomales que incluyen pero no se limitan a mutación de punto, giro en la estructura de lectura, transición, transversión, adición, inserción, eliminación, adición, eliminación, giro de estructura, sentido equivocado, mutación inversa, y alteración de raicrosatélite, trisomía, monosomia, otras aneuploidias, amplificación, reconfiguración, transubicación, transversión, eliminación, adición, amplificación, fragmento, transubicación, y reconfiguración.

EJEMPLO 5 Se analiza una plantilla de ADN de un individuo con un genotipo de trisomía 21. Tres lugares cromosomales de interés se analizan en el cromosoma 13 y dos lugares cromosomales de interés se analizan en el cromosoma 21.

Preparación del ADN de Plantilla El ADN de plantilla se preparó a partir de una muestra de 5 mi de sangre obtenida por venipunctura de un voluntario humano con su consentimiento informado. El voluntario humano se ha ubicado su genotipo previamente para tener un cromosoma 21 adicional (trisomía 21) . El ADN de plantilla se aisló usando el kit QIAamp DNA Blood Midi suministrado por QIAGEN (número de catálogo 51183) .

Diseño del Cebador Se analizaron los siguientes cinco polimorfismos de nucleótido sencillos: SNP TSC 0115603 ubicado en el cromosoma 21; SNP TSC 03209610 ubicado en el cromosoma 21; SNP TSC 0198557 ubicado en el cromosoma 13; y SNP TSC 0200347 ubicado en el cromosoma 13. La plantilla de ADN de otro individuo se usó como un control interno. El SNP TSC 0200347, que se identificó previamente como que es homocigótico para guanina, se usó como el control interno . La base de datos de SNP Consortium Ltd puede accederse en http : //snp . cshl . org/ , sitio de la red efectivo desde el 1 de abril de 2002. El SNP TSC 0115603 se amplificó usando los siguientes cebadores : Primer Cebador: 5 ' GTGCACTTACGTGAATTCAGATGAACGTGATGTAGTAG3 ' Segundo Cebador: 5 ' TCCTCGTACTCAACGGCTTTCTCTGAAT3 ' El primer cebador fue biotinilado en la terminación 5', y contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para Eco I . El segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para la enzima de restricción BceA I . El SNP TSC 0309610 se amplificó usando los siguientes cebadores : Primer Cebador: 5 ' CCGGAACACTAGAATTCTTATTTACATACACACTTGT3 ' Segundo Cebador : 5 ' CGATAAGGTAGACGGCAACAATGAGAA3 ' El primer cebador contiene un grupo biotina en la terminación 5', y un sitio de reconocimiento de enzima de restricción para la enzima de restricción EcoR I . El segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para BceA I . El SNP (ss) 813773 expuesto (número de acceso asignado por la Base de datos SNP(ss) expuesta NCBI) se amplificó con los siguientes cebadores: Primer- Cebador: 5 ' CGGTAAATCGGAGATTCAGAGGATTTAGAGGAGCTAA 3 ' Segundo Cebador: 5 ' CTCACGTTCGTTACGGCCATTGTGATAGC 3 ' El primer cebador contiene un grupo biotina en la terminación 5', y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoR I . El segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para BceA I . El SNP TSC 0198557 se amplificó con los siguientes cebadores : Primer Cebador: 5 ' GGGGAAACAGTAGAATTCCATATGGACAGAGCTGTACT 3 ' Segundo Cebador: 5 ' TGAAGCTGTCGGACGGCTTTGCCCTCTC 3 ' El primer cebador contiene un grupo biotina en la terminación 5', y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoR I . El segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento de enzima de restricción para BceA I . El SNP TSC 0197279 se amplificó con los siguientes cebadores : Primer Cebador: 5 ' TGGGCAGTTATGAATTCACTACTCCCTGTAGCTTGTT 3 ' - Segundo Cebador: 5 ' GATTGGCGCGAACGGCACTCAGAGAAGA 3 ' El primer cebador contiene un grupo biotina en la terminación 5', y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción para EcoR I. El segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BceA I.

El SNP TSC 0200347 se amplificó con los siguientes cebadores : Primer Cebador : 5 ' CTCAAGGGGACCGAATTCGCTGGGGTCTTCTGTGGGTC 3 ' Segundo Cebador: 5 ' AGGGCGGCGTGACGGCCAGCCAGTGGT3 ' El primer cebador contiene un grupo biotina en la terminación 5', y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción para EcoR I . El segundo cebador contiene el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BceA I.

Reacción PCR Todos los cinco lugares cromosomales de interés se amplifican del ADN de plantilla genómica usando PCR (Patentes E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202). Para una especificidad incrementada, se usó PCR de "inicio en caliente" . Las reacciones PCR se realizaron usando el Kit HotStarTaq Master Mix suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y el cebador por reacción pueden optimizarse para cada lugar cromosomal de interés; en este ejemplo, 40 ng del ADN genómico humano de plantilla y 5 µ? de cada cebador se usaron. Se realizaron treinta y ocho ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR para SNP TSC 0115603, SNP TSC 0309610, y SNP TSC 02003437: (1) 95°C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 42 °C durante 30 segundos; (3) 95 °C durante 30 segundos; (4) 60 °C durante 30 segundos ; (5) 95 °C durante 30 segundos; (6) 69°C durante 30 segundos; (7) 95 °C durante 30 segundos; (8) Repetir etapas 6 y 7 treinta y nueve (37) veces; (9) 72 °C durante 5 minutos. Se usaron las siguientes condiciones PCR para SNP SS813773, SNP TSC 0198557, y SNP TSC 0197279: (1) 95 °C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 37°C durante 30 segundos; (3) 95 °C durante 30 segundos; (4) 57 °C durante 30 segundos; (5) 95 °C durante 30 segundos; (S) 64 °C durante 30 segundos; (7) 95 °C durante 30 segundos; (8) Repetir las etapas 6 y 7 treinta y nueve (37) veces ; y (9) 72°C durante 5 minutos. En el primer ciclo de cada PCR, la temperatura de combinación de sus pares base fue de alrededor de la temperatura de fusión de la región combinada en sus pares base 3' del segundo cebador. La temperatura de combinación de sus pares base en el segundo ciclo de PCR fue de alrededor de la temperatura de fusión de la región 3', que se combina en sus pares base al ADN de plantilla, del primer cebador. La temperatura de combinación en sus pares base en el tercer ciclo de PCR, fue de alrededor de la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador. Escalando la temperatura de combinación en sus pares base de TM1 a TM2 a TM3 en los primeros tres ciclos de PCR mejora ampliamente la especificidad. Estas temperaturas de combinación en sus pares base son representativas, y el técnico experto entenderá que las temperaturas de combinación en sus pares base dependen de los cebadores específicos usados . Las temperaturas y tiempos para desnaturalizar, combinar en sus pares base, y extensión, pueden optimizarse al tratar varias colocaciones y usando los parámetros que proporcionan los mejores resultados.

Purificación del Fragmento de Interés Los productos PCR se separaron de los componentes de la reacción PCR usando el Kit de purificación Qiagen' s MinElute PCR siguiendo las instrucciones del fabricante (número de catálogo 28006) . Los productos PCR se eluyeron en 20µ1 de agua destilada. Para cada SNP amplificada, un microlitro de producto PCR, 1 µ? de ADN de control interno amplificado (SNP TSC 0200347) , y 8µ1 de agua destilada se mezclaron. Cinco microlitros de cada muestra se colocaron en dos pozos de reacción separados de una placa de microtitulación Pierce Strepta ell (número de catálogo 15501) . Los primeros cebadores contienen una etiqueta de biotina 5' de manera que los productos PCR se enlazan a los pozos recubiertos con estreptavidina, mientras que el ADN de plantilla genómica no. La reacción de enlace de estreptavidina se realizó usando un mezclador térmico (Eppendorf) a 150 rpm durante 1 hora a 45 °C. cada pozo se aspiró para remover el material no enlazado, y se lavó tres veces con IX PBS, con mezcla suave ( andpal et al., Nucí. Acids Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka et al., Biotechniques 10:30-34 (1991); Green et al., Nucí. Acids Res. 18:6163-6164 (1990)).

Digestión de la Enzima de Restricción de Fragmentos Aislados Los productos PCR purificados se digirieron con la enzima de restricción que enlaza el sitio de reconocimiento que se incorpora en los productos PCR del segundo cebador. Los productos PCR purificados se digirieron con la enzima de restricción BceA I (New England Biolabs, número de catálogo R0623S) . Los digeridos se efectuaron en los pozos de la placa microtitulada siguiendo las instrucciones suministrados con la enzima de restricción. Después de la digestión con la enzima de restricción apropiada, los pozos se lavaron tres veces con PBS para remover los fragmentos desdoblados .

Incorporación del N cleótido Etiquetado La digestión de la enzima de restricción antes descrita produjo un fragmento de ADN con una colgadura 5', que contiene el SNP y un extremo rebaj ado 3 ' . La colgadura 5 ' funcionó como una plantilla permitiendo la incorporación de un nucleótido o nucleotidos en presencia de una polimerasa de ADN. Para cada SNP, se efectuaron dos reacciones de llenado; cada reacción contenía un dideoxinucleótido etiquetado fluorescentemente diferente (ddATP, ddCTP, ddGTP, o ddTTP, dependiendo de los nucleotidos reportados que existen en un SNP particular) . Por ejemplo, los nucleotidos de adenina y timidina se han reportado en SNP TSC 0115603. Por lo tanto, el producto PCR digerido para SNP TSC 0115603 se mezcló con ya sea ddATP fluorescentemente etiquetada o ddTTP fluorescentemente etiquetada. Cada reacción contiene ddGTP fluorescentemente etiquetada para el control interno. Se agregaron los siguientes componentes a cada relleno en la reacción: 2 µ? de un conjugado dideoxinucleótido-ROX (dependiendo de los nucleotidos reportados para cada SNP) , 2µ1 de conjugado ddATP-ROX (control interno), 2.5µ1 de solución amortiguadora de 10X secuenasa, 2µ1 de secuenasa, y agua como sea necesario para 25µ1 de reacción. Todos los rellenos en las reacciones se efectuaron a 45°C por .45 minutos, sin embargo, pueden usarse periodos de tiempo de incorporación más cortos. Se adquirieron los ddNTP etiquetado no fluorescentemente de Fermentas Inc. (Hanover, MD) . Los conjugados ddNTP-ROX se obtienen de Perkin Elmer. En presencia de los ddNTPs etiquetados fluorescentemente, la terminación rebajada 3' se extendió en por base, lo cual corresponde al SNP o lugar cromosomal de interés. Después de etiquetar, cada Streptawell se enjuaga con IX PBS (???µ?) tres veces. Los fragmentos de ADN "rellenados" se liberan entonces de los Streptawells por digestión con la enzima de restricción EcoR I siguiendo las recomendaciones del fabricante. La digestión se realizó durante 1 hora a 37°C con agitación a 120 rpm.

Detección del Lugar Cromosomal de Interés Después de liberar la matraz de estreptavidina, 3 µ? de la muestra de ??µ? se cargaron en una charola de membrana de 48 pozos (The Gel Company, número de catálogo TAM48-01) . La muestra en la charola se adsorbió con un Conjunto de Membrana de Flujo 48 (The Gel Company, número de catálogo AM48) , y se insertó en un gel de acrilamida al 5% (urea) de 36 cm (BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, número de catálogo 50691) . La muestra se procesó por electroforesis en el gel a 3000 voltios durante 3 minutos, se removió el conjunto de membrana, y el gel se corrió durante 3 horas en una máquina secuenciadora automatizada ABI 377. El nucleótido etiquetado incorporado se detectó por fluorescencia. Como se aprecia en la Figura 12, el SNP TSC 0115603 se "rellenó" con ddTTP etiquetado (línea 1) y en una reacción separada con ddATP etiquetado (línea 3) . La relación calculada entre los nucleótidos, usando los datos en bruto, fue 66:34, lo que es consistente con la relación teórica de 66:33 para -el SNP en el cromosoma 21 en un individuo con trisomía 21. tanto el ddTTP y ddATP se etiquetaron con el mismo pigmento fluorescente para minimizar la variabilidad en las eficiencias de incorporación de los pigmentos . Sin embargo, los nucleótidos con diferentes etiquetas fluorescente o cualquier etiqueta detectable pueden usarse. Es preferible calcular los coeficientes de incorporación cuando se usan etiquetas diferentes. Cada relleno en la reacción se realiza en un pozo separado de manera que es posible que pueda haber una variabilidad en el enlace de ADN entre los pozos de la placa microtitulada. Para contar la variabilidad potencial del enlace de ADN a las placas recubiertas con estreptavidina, se usa un control interno. El control interno (SNP TSC 0200347), que es homocigótico para guanina, se agregó a la muestra antes de dividir la muestra en dos pozos separados, y de esta manera, una cantidad igual del control interno deberá presentarse en cada pozo. La cantidad de ddGTP incorporado puede fijarse entre las dos reacciones. Si la cantidad de ADN en cada pozo es igual, la cantidad de ddGTP incorporado deberá ser igual debido a que la reacción se realiza bajo condiciones de saturación, con las condiciones de saturación definidas como condiciones que soportan la incorporación de un nucleótido en cada molécula de plantilla. Usando el control interno, la relación de ddATP a ddTTP incorporado fue 63.4:36.6. Esta relación fue muy similar con la relación obtenida con los daros en bruto, lo que indica que hay diferencias menores en los dos rellenos en las reacciones para un SNP particular.

Tabla VI. Frecuencias de Alelo en SNP Múltiples en Plantilla de ADN de un Individuo con Trisomía 21 SNP Alelo Area Relación Control Área Pico Normalizada Relación Pico de Alelo Interno de Alelo (%) SC A 5599 66 723 5599 63.4 0115603 T 2951 34 661 3227 ( (723/661) *2951) 36.6 TSC T 4126 64 1424 4126 66.8 0309610 c 2342 36 1631 2045 ( (1424/1631) *2342 33.2 SS813773 A 4199 46 808 4199 41 C 4870 54 647 6082 ( (803/647) *4870) 59 TSC T 3385 55 719 3385 49 0198557 C 2741 45 559 3525 719/559*2741) 51 TSC T 8085 53 2752 8085 50.7 0197279 C 7202 47 2520 7865 (2752/2520*7202 49.3 El SNP TSC 0309610 se rellenó con ddTTP (carril 3) o ddCTP (carril 4) (Figura 12) . La reacción calculada para los nucleótidos, usando los datos en bruto, fue 64:36. Ambos ddTTP y ddCTP se etiquetaron con el mismo pigmento fluorescente. Después de la normalización al control interno, como se discute arriba, la relación de alelo calculada de ddTTP a ddCTP fue 66.8:33.2 (Tabla VI). Nuevamente, tanto la relación calculada de los datos en bruto como la relación calculada usando el control interno son muy similares a la relación teórica de 66.6:33.4 para un SON en el cromosoma 21 de un individuo con trisomía. Para demostrar que las relaciones de 66:33 para nucleótidos en SNPS heterocigotos representan lugares cromosomales en cromosomas presentes en las tres copias, los SNP en el cromosoma 13 se analizaron. El individuo del cual se obtiene la muestra de sangre, previamente se ha identificado su genotipo con un cromosoma 13 maternal, y un cromosoma 13 paternal . El SNP (ss) 813773 expuesto se rellenó con ddATP (carril 5) o ddCTP (carril 6) (Figura 12) . La relación calculada para los nucleótidos a este SNP heterocigoto, usando los datos en bruto, fue 46:54. Esta relación está dentro del 10% de la relación esperada de 50:50. De manera importante, la relación no se aproxima a la relación 66:33 esperada que es una copia adicional de un cromosoma.

Después de la normalización para el control interno, la relación calculada fue 41:59. Contrario al resultado esperado, la normalización para el control interno incrementa la discrepancia entre la relación calculada y la relación teórica. Este resultado puede representar el error experimental que se presenta al procesar en alícuotas las muestra de ADN. También, es posible que la enzima de restricción usada para generar la colgadura, que se usa como la plantilla para la reacción de "relleno" , preferiblemente corte una plantilla de ADN sobre la otra plantilla de ADN. Las dos plantillas difieren, con respecto al nucleótido en el sitio SNP, y de esta manera puede tener influencia en el corte . Los cebadores pueden diseñarse de tal manera que los nucleótidos adyacentes al sitio de corte sean los mismos, independientemente del nucleótido en el sitio SNP (discutido después en la sección titulada "Diseño de Cebador"). El SNP TSC 0198557, que es un cromosoma 13, se rellenó con ddTTP (carril 7) en una dirección y ddCTP (línea 8) en otra (Figura 12) . La relación calculada para los nucleótidos en este SNP, usando los datos en bruto, fue 55:45. Después de la normalización para el control interno, la relación de alelo calculada de T:C fue 49:51. La relación normalizada fue más cercana a la relación teórica de 50:50 para un individuo con dos copias de cromosoma 13.

El SNP TSC 0197279, que está en el cromosoma 13, se rellenó con ddTTP (carril 9) en una reacción y ddCTP (carril 10) en otra (Figura 12) . La relación calculada para los nucleótidos en este SNP, usando los datos en bruto, fue 53:47. Después de la normalización para el control interno, la relación de alelo calculada de T:C fue 50.7:49.3. Esto es consistente con la relación teórica de 50:50 para un individuo con sólo dos copias del cromosoma 13. La relación de los nucleótidos en dos de los SNP analizados en el cromosoma 13 fue de aproximadamente 50:50. Un SNP, ss813773, que muestra una relación de 46:54, y cuando se normalizan al control interno, la relación fue 41:59. Estas relaciones desviadas de la esperada 50:50, pero al mismo tiempo, las relaciones no indican un cromosoma extra, que se indica con la relación de 66:33. Mientras los datos de este SNP particular no son concluyentes , no representa un positivo falso. No se daría una conclusión en los datos de este SNP. Sin embargo, los otros dos SNP proporcionan datos que indican un número normal de cromosomas . Es preferible analizar los SNP múltiples en un cromosoma que incluye, pero no se limitan a, 1-5, 5-10, 10-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900- 1000, 1000-2000, 2000-3000, y más de 3000. Preferiblemente, el promedio de las relaciones para un cromosoma particular se usarán para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosorna1. Sin embargo, todavía es posible analizar un lugar cromosomal de interés. En el caso que se obtengan datos inconclusos, otro lugar cromosomal de interés puede analizarse. El individuo del cual se obtiene la plantilla de ADN previamente se ha identificado su genotipo con trisomía 21, y las frecuencias de alelo en SNP en el cromosoma 21 indica la presencia de un cromosoma 21 adicional. El cromosoma adicional contribuye con un nucleótido adicional para cada SNP, y de esta manera altera la relación 50:50 tradicional en el SNP heterocigoto . Estos resultados son consistentes para los SNP múltiples, y son específicos para aquellos encontrados en el cromosoma 21. las frecuencias de alelo para SNP en el cromosoma 13 dan las relaciones esperadas de aproximadamente 50:50. Estos resultados demuestran que este método de detección SNP pueden usarse para detectar anormalidades crpmosomales que incluyen, pero no se limitan a, transubicaciones, transversiones, monosomias, trisomía 21, trisomía 18, trisomía 13, otros aneoploídes, eliminaciones, adiciones, amplificaciones, transubicaciones y reconfiguraciones .

EJEMPLO 6 Se obtuvo el ADN genómico a partir de 4 individuos después de que se obtuvo su consentimiento informado. Seis SNP en el cromosoma 13 (TSC0837969, TSC0034767, TSC1130902, TSC0597888, TSC0195492, TSC0607185) se analizaron usando el ADN de plantilla. Se pueden encontrar usando la información referente a estos SNP en el siguiente sitio de la web (http: //sn . cshl . org/snpsearch. shtml) activo el 11 de Febrero de 2003) . Un nucleótido sencillo etiquetado con un colorante fluorescente, se usó para hacer el genotipo de los individuos en seis sitios seleccionados SNP. Los cebadores se diseñaron para permitir que los seis SNP se analizaran en una reacción sencilla.

Preparación del ADN de plantilla Se preparó el ADN de plantilla a partir de una muestra de 9 mi de sangre obtenida por venipunsión en la vena de un voluntario humano con su consentimiento informado. Se aisló el ADN de plantilla usando el Kit QIAmp DNA Blood Midi suministrado por QIAGEN (número de catálogo 51183) . Se aisló el ADN de plantilla según las instrucciones incluidas en el kit.

Diseñó de los Cebadores: El SNP TSC0837969 se amplificó usando el siguiente unto de cebador: Primer cebador: 5 ' GGGCTAGTCTCCGAATTCCACCTATCCTACCTTATGTC 3 ' Segundo cebador: 5 ' TAGCTGTAGTTAGGGACTGTTCTGAGCAC 3 ' El primer cebador tuvo una etiqueta de biotina en la terminación 5' y contenía un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción para EcoRI . El primer cebador se diseñó para combinar 44 bases desde el lugar cromosomal de interés. El segundo cebador contenía un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción para BsmF I . El SNP TSCO034767 se amplificó usando el siguiente conjunto de cebador: Primer cebador : 5 ' CGAATGCAAGGCGAATTCGTTAGTATAACACAGTGCA 3 ' Segundo cebador : 5 'AAGACTGGATCCGGGACCATGTAGAATAC 3 ' El primer cebador tuvo una etiqueta de biotina en la terminación 5' y contenia un sitio de reconocimiento para una ¦enzima de restricción para EcoRI . El primer cebador se diseñó para combinar 50 bases del lugar cromosomal de interés. El segundo cebador contenía un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción para BsmF I. El SNP TSC1130902 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador : 5' CTAACCATTGCGAATTCAGGGCAAGGGGGGTGAGATC 3 ' Segundo cebador: 5 ' TGACTTGGATCCGGGACAACGACTCATCC 3 ' El primer cebador tuvo una etiqueta de biotina en la terminación 5' y contenía un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción para EcoRI . El primer cebador se diseñó para combinar 60 bases de lugar cromosomal de interés. El segundo cebador contenía un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción para BsmF I . El . SNP TSC0597888 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5 'ACCCAGGCGCCAGAATTCTTTAGATAAAGCTGAAGGGA 3 ' Segundo cebador: 5 ' GTTACGGGATCCGGGACTCCATATTGATC 3 ' El primer cebador tuvo una etiqueta de biotina en la terminación 5' y contenía un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción para EcoRI . El primer cebador se diseñó para combinar 70 bases desde el lugar cromosomal de interés. El segundo cebador contenía un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción para BsmF I . El SNP TSC0195492 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5 ' CGTTGGCTTGAGGAATTCGACCAAAAGAGCCAAGAGAA Segundo cebador : 5 'AAAAAGGGATCCGGGACCTTGACTAGGAC 3 ' El primer cebador tenía una etiqueta de biotina en la terminación 5' y contenía un sitio de reconocimiento de enzima de restricción para EcoRI . El primer cebador se diseñó para combinar 80 bases desde el lugar de cromosomal interés. El segundo cebador tenía un sitio de reconocimiento de enzima de restricción para BsmF I . El SNP TSC0607185 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer Cebador: 5 'ACTTGATTCCGTGAATTCGTTATCAATAAATCTTACAT 3 ' Segundo Cebador: 5 ' CAAGTTGGATCCGGGACCCAGGGCTAACC 3 ' El primer cebador tenía una etiqueta de biotina en la terminación 5' y contenía un sitio de reconocimiento de enzima de restricción para EcoRI . El primer cebador se diseñó para combinar 90 bases desde el lugar de cromosomal interés. El segundo cebador tenía un sitio de reconocimiento de enzima de restricción para BsmF I. Se amplificaron todos los lugares cromosomales de interés a partir de ADN genómico de plantilla usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, patentes de E.U.A. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas aquí como referencia). En este ejemplo, . los lugares cromosomales de interés se amplificaron en tubos de reacción por separado pero también se pudieron amplificar juntos en una reacción PCR sencilla. Para una especificidad aumentada, se usó un PCR de "arranque en caliente" . Se efectuaron las reacciones por PCR usando kit Mix Master HotStarTaq suministrado por QIAGEN (número de catalogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y el cebador por reacción se pueden optimizar para cada lugar cromosomal de interés pero en este ejemplo, 40 ng del ADN genómico humano de plantilla y 5 µ? de cada cebador se usaron. Se efectuaron 40 ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95°C por 15 minutos y 15 segundos; (2) 37°C por 30 segundos; (3) 95°C. por 30 segundos; (4) 57°C por 30 segundos; (5) 95 °C por 30 segundos; (6) 64°C por 30 segundos; (7) 95°C por 30 segundos; (8) Repetir las etapas 6 y 7 treinta y nueve (39) veces; (9) 72°C por 5 minutos. En el primer ciclo de PCR, la temperatura de combinación de los pares base fue de alrededor desde la temperatura de fusión de la región de combinación de los pares base 3' de los segundos cebadores que fue 37°C. La temperatura de combinaciones del segundo ciclo de PCR fue alrededor de la temperatura de fusión de la región 3', que combina los pares base con el ADN de plantilla del primer cebador que tenía 57 °C. La temperatura de combinación de los pares base en el tercer ciclo de PCR fue de alrededor de la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador que fue de 64 °C. La temperatura de combinación para los ciclos restantes fue de 64 °C. La escalación de la temperatura de combinación de los pares base de TM1 a T 2 hasta TM3 en los primeros tres ciclos de PCR mejor ampliamente la especificidad. Estas temperaturas de combinación de pares base son representativas, y el técnico experimentado entenderá las temperaturas de combinación de los pares base para cada ciclo dependen de los cebadores específicos usados. Las temperaturas y tiempos para la desnaturalización, combinación de pares base y extensión, se puede optimizar al intentar diversos entornos y usando los parámetros que produjeron los mejores resultados. En este ejemplo, el primer cebador se diseñó para combinarse con los pares base a diversas distancias desde el lugar cromosomal de interés, el técnico experimentado entiende que la ubicación para combinación de los pares base en el primer cebador puede ser 5-10, 11-15, 160-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-110, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-140, 141-160, 161-180, 181-200, 201-220, 221-240, 241-260, 261-280, 281-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, o mayor de 500 bases desde el lugar cromosomal de interés .

Purificación del Fragmento de Interés Se separaron los productos por PCR a partir del ADN de plantilla genómico. Después de la reacción por PCR, ¾ del volumen de cada reacción de PCR de una se mezcló junto en un pozo de una placa Streptawell, transparente, High-Bind píate from Roche Diagnostics GmbH (número de catalogo 1 645 692, en listados en Roche Molecular Biochemicals , 2001 Biochemicals Catalog) . Los primeros cebadores contenía una etiqueta de biotina 5' de manera que los productos por PCR unidos a los pozos recubiertos por estreptavidina mientras que el ADN de plantilla genómico no lo hizo. Se efectuó la reacción de enlace de estreptavidina usando un Thermomixer (Eppendorf) a 1000 rpm por 20 minutos, a 37°C. Cada pozo se aspiró para retirar el material sin enlazar y se lavó 3 veces con IX •PBS, con mezclado suave. (Kandpal et al., Nucí. Acids Res. 18: 1789-1795 (1990); Kaneoka et al., Biotechniques 10: 30-34 (1991); Green et al., Nucí. Acids Res. 18: 6163-6164 (1990) ) .

Digestión de enzimas de restricción de los fragmentos aislados Los productos de PCR purificados se digirieron con la enzima de restricción BsmF I, que se enlaza al sitio de reconocimiento incorporado en los productos PCR del segundo cebador. Los productos de digestión se efectuaron en los Streptawells siguiendo las instrucciones suministradas con la enzima de restricción. Después de la digestión, se lavaron 3 veces los pozos con PBS para retirar los fragmentos desdoblados.

Incorporación del nucleótido etiquetado La digestión de la enzima de restricción con BsmF I produjo un fragmento de ADN con una colgadura 5' que contenía el sitio SNP o lugar cromosomal de interés y una terminación rebajada 3'. La colgadura 5' funcionó como una plantilla permitiendo la incorporación de un nucleótido o nucleótidos en presencia de una polimerasa de ADN. A continuación, se muestra un esquema de una colgadura 5' para SNP TSC0837969. No se reproduce la secuencia completa de ADN, solamente la porción para demostrar la colgadura (en donde R indica el sitio variable) . 5'TTAA 3'AATT R A C A Posición de colgadura 1 2 3 4 Los nucleótidos observados para TSC0837969 en la hebra de sentido 5' (aquí detallada como la hebra de arriba) son adenina y guanina. La tercera posición en la colgadura en la hebra antisentido corresponde a la citosina, que es complementaria a la guanina. Ya que este sitio variable puede ser adenina o guanina, el ddGTP etiquetado fluorescentemente en presencia de dCTP, dTTP y dATP sin etiquetar se usó para determina la secuencia de ambos alelos . Las reacciones de llenado para un homocigótico individual para guanina, homocigótico para adenina o heterocigoto se diagraman a continuación.

Homocigótico para guanina en TSC 0837969: Alelo 1 5'TTAA G* 3'AATT C A C A Posición de colgadura 1 1 3 4 Alelo 2 5'TTAA G* 3'AATT C A C A Posición de colgadura 1 2 3 4 El ddGTP etiquetado se incorpora en la primer posición de la colgadura. Solamente se observa una señal, que corresponde a las moléculas llenas con el ddGTP etiquetado en la primer posición de la colgadura.

Homocigótico para la adenina TSC 0837969: Alelo 1 5'TTAA A T G* 3'AATT T A C A Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'TTAA A T G* 3'AATT T A C A Posición de colgadura 1 2 3 4 El dATP no etiquetado se incorpora en una posición 1 de la colgadura, y el dTTP no etiquetado se incorpora en una posición 2 de la colgadura. El ddGTP se incorpora en una posición 3 de la colgadura. Solamente se observará una señal, las moléculas completadas con ddGTP en la posición 3 tendrán un peso molecular diferente de las moléculas llenadas en la posición 1, lo cual permite una fácil identificación de los homocigoticos individuales para adenina o guanina. Heterocigoto en TSC0837969: Alelo 1 5'TTAA G* 3'AATT C C A Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'TTAA A T G* 3'AATT T A C A Posición de colgadura 1 2 3 4 Se observarán dos señales, una señal corresponde a la moléculas de ADN usadas con ddGTP en la posición 1 y una segunda señal que corresponde a las moléculas completadas en las posición 3 de la colgadura. Las dos señales se pueden separar usando cualquier técnica que separe con base en el peso molecular incluido pero no limitado a electxoforesis por gel . A continuación, se muestra un esquemático de la colgadura 5' para SNP TSC003476 . No se reproducen la secuencia completa de ADN, solamente la porción para demostrar la colgadura (en donde R indica el sitio variable) . A C A R GTGT3 ' CACA5 ' 4 3 2 1 Posición de colgadura Los nucleótidos observados para TSC0034767 en la hebra de nucleótidos 5' detallada (aquí como la hebra superior) son citosina y guanina. La segunda posición en la colgadura corresponde a la adenina, que es complementaria a timidina. La tercera posición en la colgadura corresponde a la citosina, que es complementaria a la guanina. El ddGTP etiquetado fluorescentemente en presencia de dCTP, dTTP, y dATP sin etiquetar se usa para determinar la secuencias de ambos alelos . En este caso, el segundo cebador combina los pares bases en la dirección ascendente del lugar cromosomal de interés, y así la reacción de llenado sucede en la hebra antisentido (detallada asi como la hebra del fondo) . Ya sea que se puede rellenar la hebra de sentido o la hebra antisentido dependiendo si el segundo cebador que contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción tipo IIS se combina en los pares base en la dirección ascendente o dirección descendente del lugar cromosomal de interés. A continuación, una esquema de la colgadura 5' para SNP TSC1130902 se muestra. No se reproduce la secuencia completa del ADN, solamente una porción para demostrar la colgadura (en donde indica el sitio variable) . 5 ' TTCAT 3'AAGTA R T C C Posición de colgadura 1 2 3 4 Los nucleótidos observados para TSC1130902 en la hebra de sentido 5' (descrita aquí como la hebra superior) son adenina y guanina. La segunda posición en la colgadura corresponde a una timidina, y la tercera posición en la colgadura corresponde a la citosina, que es complementaria a la guanina. El ddGTP etiquetado fluorescentemente en presencia de dCTP, dTTP y dATP sin etiquetar se usa para determinar la secuencia de ambos alelos. A continuación se muestra un esquema de una colgadura 5' para SNP TSC0597888. No se reproduce la secuencia completa de ADN, solamente en la porción para demostrar la colgadura (en donde R indica el sitio variable) . T C T R ATTC3 ' TAAG5 ' 4 3 2 1 Posición de colgadura Los nucleótidos observados para TSC0597888 en la hebra de sentido 5' (detallados aquí como la hebra superior) son citosina y guanina. La tercera posición en la colgadura corresponde a la citosina, que es complementaria a la guanina. El ddGTP etiquetado fluorescentemente en presencia de dCTP, dTTP y dATP sin etiquetar se usa para determinar la secuencia de ambos alelos. A continuación, se muestra un esquema de una colgadura 5' para SNP TSC0607185. La secuencia completa de ADN no se reproduce, solamente la porción para demostrar la colgadura (en donde R indica el sitio variable) . C C T R TGTC3 ' ACAG5 ' 4 3 2 1 Posición de colgadura Los nucleótidos observados para TSC0607185 en la hebra de sentido 5' (detallada aquí como la hebra de arriba) son citosina y timidina. En este caso, el segundo cebador se combina los pares base en la dirección ascendente del lugar cromosomal de interés que permite que se rellene la hebra anti-sentido . La hebra anti-sentido (detallada aquí como la hebra del fondo) se llenara con guanina o adenina. La segunda posición en la colgadura 5' es timidina, que es complementaria a la adenina, y la tercera posición en la colgadura corresponde a la citosina que es complemen ria a la guanina. La ddGTP etiquetada fluorescentemente en presencia de dCTP, dTTP, y dATP no etiquetada se usa para determinar la secuencia de ambos alelos . Abajo, se muestra una esquemática de la colgadura 5' para SNP TSC0195492. La secuencia de ADN completa no se reproduce, sólo la porción para demostrar la colgadura. 5' ATCT 3' TAGA R A C A Posición de colgadura 1 2 3 4 Los nucleótidos observados en este sitio son citosina y guanina en la hebra sentido (aquí se describe como la hebra superior) . La segunda posición en la colgadura 5' es adenina, que es complementaria a timidina, y la tercera posición en la colgadura corresponde a citosina, que es complementaria a la guanina. La ddGTP etiquetada fluorescentemente en presencia de dCTP, dTTP, y dATP no etiquetada se usa para determinar la secuencia de ambos alelos. Como se demuestra arriba, la secuencia de ambos alelos de las seis SNP puede determinarse al etiquetar con ddGTP en presencia de dATP, dTTP, y dCTP no etiquetado. Los siguientes componentes se agregan a cada uno para rellenar en la reacción: ?µ? de ddGTP etiquetado fluorescentemente, 0.5µ1 de ddNTP no etiquetado (40µ?) , que contiene todos los nucleótidos excepto guanina, 2µ1 de solución amortiguadora de secuenasa 10X, 0.25µ1 de secuenasa, y agua como sea necesario para una reacción de 20µ1. El rellenado se realizó a 40°C durante 10 minutos. se adquiere la ddNTP etiqueta no fluorescentemente de Fermentas Inc. (Hanover, MD) . Todos los otros reactivos etiquetados se obtienen de Amersham (Termo Sequenasa Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565) . Después de etiquetar, cada Streptawell se enjuaga con PBS IX (???µ?) tres veces. Los fragmentos de ADN "rellenos" se liberan entonces de los Streptawells por digestión con la enzima de restricción EcoRI, de conformidad con las instrucciones del fabricante que se suministran con la enzima. La digestión se realiza durante 1 hora a 37°C con agitación a 120 rpm.

Detección del lugar cromosomal de interés Después de liberar de la matriz de estreptavidina, la muestra se carga en una línea de 36 cm de un gel de acrilamida al 5% (urea) (BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, número de catálogo 50691) . La muestra se procesó por electroforesis en el gel a 3000 voltios durante 3 minutos. El gel se corrió durante 3 horas en un aparato secuenciador (Secuenciador Hoefer SQ3) . El gel se removió del aparato y se escaneó en el Formador de Imágenes de Modo Variable Typhoon 9400. El nucleotido incorporado etiquetado se detectó por fluorescencia. Como se muestra en la Figura 11, el ADN de plantilla en las líneas 1 y 2 para SNP TSC0837969 es homocigótico para adenina. La siguiente reacción de relleno se espera que se presente si la individual es homocigótica para adenina: Homocigótica para adenina a TSC 0837969: 5'TTAA ? T G* 3'AATT A C A Posición de colgadura 1 2 3 4 Se incorporó la dATP no etiquetada en la primera posición complementariamente a la colgadura. La dTTP no etiquetada se incorpora en la segunda posición complementariamente a la colgadura. La ddGTP etiquetada se incorporó en la tercera posición complementariamente a la colgadura. Sólo en una banda se aprecia, que migra a alrededor de la posición 46 del gel de acrilamida. Esto indica que la adenina fue el nucleótido rellenado en una posición. Si la guanina de nucleótido se ha rellenado, deberá esperarse una banda en la posición 44.

Sin embargo, el ADN de plantilla en los carriles 3 y 4 para SNP TSC0837969 fue heterocigoto . Las siguientes reacciones rellenas se esperan si el individual es heterocigoto : Heterocigoto en TSC0837969: Alelo 1 5'TTAA G* 3'AATT C A C A Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'TTAA A T G* 3 ' AATT T A C A Posición de colgadura 1 2 3 4 Se aprecian dos bandas distintas; una banda corresponde a las moléculas rellanadas con ddGTP en la posición 1 complementaria a la colgadura (el alelo G) , y la segunda banda corresponde a las moléculas rellenadas con ddGTP en la posición 3 complementariamente a la colgadura (el alelo A) . las dos bandas se separaron con base en las diferencias en el peso molecular usando electroforesis en gel . Se usa un nucleótido fluorescentemente etiquetado ddGTP para determinar que el individuo fue heterocigoto en el sitio SNP. Este es el primer uso de un nucleótido sencillo para detectar efectivamente la presencia de dos diferentes alelos. Para SNP TSC0034767, el ADN de plantilla en las lineas 1 y 3 es heterocigoto para citosina y guanina, como se evidencia por las dos distintas bandas. La banda más baja corresponde al ddGTP rellenado en la posición 1 complementariamente a la colgadura. La segunda banda de peso molecular ligeramente mayor corresponde al ddGTP rellenado en la posición 3, lo que indica que la primera posición en la colgadura se rellena con el dCTP no etiquetado, lo que permite que la polimerasa continúe incorporando nucleótidos hasta el ddGTP incorporado en la posición 3 complementariamente a la colgadura. El ADN de plantilla en los carriles 2 y 4 fue homocigótico para guanina, como se evidencia por una banda sencilla de peso molecular mayor que si ddGTP se rellena en la primera posición complementariamente a la colgadura. Para SNP TSC1130902, el ADN de plantilla en los carriles 1, 2, y 4 es homocigótico para adenina en el sitio variable, como se pone en evidencia por una banda de mayor peso molecular sencilla que migra a alrededor de la posición 62 en el gel. El ADN de plantilla en la línea 3 es heterocigoto en el sitio variable, como se indica por la presencia de dos bandas distintas. La banda inferior corresponde a las moléculas rellenadas con ddGTP en la posición 1 complementariamente a la colgadura (el alelo de guanina) . La banda de peso molecular mayor corresponde a las moléculas rellenadas con ddGTP en la posición 3 complementariamente a la colgadura (el alelo de adenina) . Para SNP TSC0597888, el ADN de plantilla en los carriles 1 y 4 fue homocigotico para citosina en el sitio variable; el ADN de plantilla en la pista 2 fue heterocigoto en el sitio variable, y el ADN de plantilla en la pista 3 fue homocigotico para guanina. Las reacciones de rellenado esperadas se colocan en diagrama a continuación: Homocigotico para citosina: Alelo 1 T ' C T G ATTC3 ' G* A C TAAG5 ' 4 3 2 1 Posición de colgadura Alelo 2 ATTC3 ' TAAG5 ' Posición de colgadu: Homocigotico para guanina: o 1 T C T C ATTC3 ' G* TAAG5 ' 4 3 2 1 Posición de colgadura Alelo 2 ATTC3 ' TAAG5 ' Posición de colgadura Heterocigoto para guanina/citosina: Alelo 1 T C T G ATTC3 TAAG5 ' Posición de colgadura Alelo 2 T C T C ATTC3 TAAG5 ' Posición de colgadura La plantilla de ADN omocigótica para guanina en el sitio variable exhibe una banda sencilla, que corresponde a" las moléculas de ADN rellenadas con ddGTP en la posición 1 complementariamente a la colgadura. Estas moléculas de ADN son de peso molecular más bajo en comparación con las moléculas de ADN rellenadas con ddGTP en la posición 3 de la colgadura (ver línea 3 para SNP TSC0597888) . Las moléculas de ADN difieren por dos bases en el peso molecular. El ADN de plantilla homocigótico para citosina en el sitio variable, exhibe una banda sencilla, que corresponde a las moléculas de ADN rellenadas con ddGTP en la posición 3 complementariamente a la colgadura. Estas moléculas de ADN migran a un peso molecular mayor que las moléculas de ADN rellenadas con ddGTP en la posición 1 (ver carriles 1 y 4 para SNP TSC0597888) . El ADN de plantilla heterocigoto en el sitio variable exhibe dos bandas; una banda correspondiente a las moléculas de ¦ ADN rellenadas con ddGTP en la posición 1 complementariamente a la colgadura y fue de peso molecular inferior, y la segunda banda correspondiente a las moléculas de ADN rellenadas con ddGTP en la posición 3 complementariamente a la colgadura, y fue de peso molecular mayor (ver carril 3 para SNP TSC0597888) . Para SNP TSC0195492, el ADN de plantilla en los carriles 1 y 3 fue heterocigoto en el sitio variable, lo que se demuestra por la presencia de dos bandas distintas. El ADN de plantilla en la pista 2 fue homocigotico para guanina en el sitio variable. El ADN de plantilla en la pista 4 fue homocigotico para citosina. Sólo una banda se aprecia en la línea 4 para este SNP, y tiene un peso molecular mayor que las moléculas de ADN rellenadas con ddGTP en la posición 1 complementariamente a la colgadura (comparar carriles 2, 3 y 4) . Los alelos observados para SNP TSC0607185 se reportan como citosina o timidina. Para consistencia, el SNP en consorcio denota los alelos observados como aparecen en la hebra sentido (www . snp . schl . org/snpsearch . shtml) ; sitio de la red activo desde el 11 de febrero de 2003) . Para este SNP, el segundo cebador combinado en sus pares base en dirección ascendente del lugar cromosomal de interés, lo que permite que la reacción de rellenado se presente en la hebra antisentido después de la digestión con BsmFl . El ADN de plantilla en las pistas 1 y 3 fue heterocigoto ; el ADN de plantilla en la pista 2 fue homocigótico para timidina, y el ADN de plantilla en la pista 4 fue homocigótico para citosina. La hebra antisentido se rellenó con ddGTP, de manera que el nucleotido en la hebra sentido corresponde a la citosina. Los marcadores de peso molecular pueden usarse para identificar las posiciones de las bandas esperadas. Alternativamente, para cada SNP analizado, puede usarse una muestra heterocigótica, lo que identificará precisamente la posición de las dos bandas esperadas. Como se demuestra en la Figura 11, un nucleotido etiquetado con un colorante fluorescente puede usarse para determinar la identidad de un sitio variable, que incluye, pero no se limita a, SNP y mutaciones de nucleotido sencillas. Típicamente, para determinar si un individuo es homocigótico o heterocigoto en el sitio SNP, se realizan reacciones múltiples usando un nucleotido etiquetado con un pigmento y un segundo nucleotido etiquetado con un segundo pigmento. Sin embargo, esto introduce problemas en resultados comparables debido a que los dos pigmentos tienen coeficientes cuánticos diferentes . Aún si los nucleótidos diferentes se etiquetan con el mismo pigmento, los coeficientes cuánticos son diferentes. El uso de un nucleótido sencillo etiquetado con un pigmento elimina cualesquiera de los errores de los coeficientes cuánticos de pigmentos diferentes . En este ejemplo, se usa ddGTP etiquetado fluorescentemente. Sin embargo, el método se aplica para un nucleótido marcado con cualquier porción que genera una señal incluyendo, pero no se limitan a, la molécula radioactiva, molécula fluorescente, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, hapteno, carbohidratos, biotina, derivado de biotina, porción fosforescente, porción luminiscente, porción electroquimioluminiscente, porción cromática, y porción que tiene una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica o conductividad eléctrica. Además, pueden usarse ddATP, ddTTP, o ddCTP etiquetados. El ejemplo anterior usa la tercera posición complementaria a la colgadura como un indicador del segundo alelo. Sin embargo, la segunda o cuarta posición de la colgadura pueden usarse como tal (ver Sección de Incorporación de Nucleótidos) . Adicionalmente, la colgadura se genera con la enzima BsmF I tipo IIS; sin embargo, cualquier enzima que corta el ADN a una distancia desde su sitio de enlace, puede usarse incluyendo, pero no se limitan a, las enzimas enlistadas en la Tabla I. También, en el ejemplo anterior, el nucleótido inmediatamente precedente al sitio SNP no fue guanina en la hebra que se rellenó. Esto elimina cualesquiera de los efectos de las propiedades de corte alternativas de la enzima de restricción de tipo IIS a removerse. Por ejemplo, en SNP TSC0837969, el nucleótido en dirección ascendente del sitio SNP en la hebra sentido fue una adenina. Si BsmF I exhibe propiedades de corte alternas, se generarían las siguientes colgaduras para el alelo de adenina y el alelo de guanina: Alelo G-ll/15 Corte 5 'TTA 3'AAT T C A C Posición de colgadura 0 1 2 3 Alelo G después del rellanado 5' TTA A G* 3'AAT T C A C Posición de colgadura 0 1 2 3 Alelo A 11/15 Corte 5 'TTA 3'AAT T T A C Posición de colgadura 0 1 2 3 Alelo A después del rellenado 5 ' TTA A A T G* 3'AAT T T A C Posición de colgadura 0 1 2 3 Para el alelo de guanina, la primera posición en la colgadura podría rellenarse con dATP, lo que permitirá que la polimerasa incorpore ddGTP en la posición 2 complementariamente a la colgadura. Esto no detectará la diferencia entre las moléculas cortadas en la posición 10/14 o moléculas cortadas en la posición 11/15. Para el alelo de adenina, la primera posición complementaria a la colgadura se rellenaría con dATP, la segunda posición se rellenaría con dATP, la tercera posición se rellenaría con dTTP, y la cuarta posición se rellenaría con ddGTP. No habría diferencia en los pesos moleculares entre las moléculas cortadas a 10/14 o las moléculas cortadas a 11/15. Las únicas diferencias corresponderían a si las moléculas de ADN contienen una adenina en el sitio variable o una guanina en el sitio variable. Como se observa en la Figura 11, posicionar la región que combina en sus pares base del primer cebador permite que SNP múltiples se analicen en una línea sencilla de un gel . También, cuando se usa el mismo nucleótido con el mismo pigmento, puede realizarse la reacción de rellenado sencilla. En este ejemplo, se analizan 6 SNP en una línea. Sin embargo, cualquier número de SNP incluyen, pero no se limitan a, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-100, 101-120, 121-140, 141-160, 161-180, 181-200, y más de 200 pueden analizarse en una reacción sencill . Adicionalmente, un nucleótido etiquetado usado para detectar ambos alelos puede mezclarse con un segundo nucleótido etiquetado para detectar un conjunto diferente de SNP con tal de que ninguno de los nucleótidos que se etiquetan se presente inmediatamente antes del sitio variable (complementariamente al nucleótido en la posición 0 del corte 11/15) . Por ejemplo, el SNP X supuesto puede ser guanina o timidina en el sitio variable y tiene la siguiente colgadura 5' generada después de la digestión con BsmF I: SNP X 10/14 5'TTGAC Alelo G 3'AACTG Posición de colgadura SNP X 11/15 5 ' TGA Alelo G 3'AACT Posición de colgadura SNP X 10/14 5'TTGAC Alelo T 3'AACTG Posición de colgadura SNP X 11/15 5 ' TTGA Alela T 3'AACT Posición de colgadura 0 1 2 3 Después de la reacción de rellenado con ddGTP etiquetado, el dATP, dCTP, y dTTP no etiquetado, se podrían generar las siguientes moléculas: SNP X 10/14 5 ' TGAC G* Alelo G 3'AACTG C A c T Posición de colgadura 1 2 3 4 SNP X 11/15 5' TTGA c G* Alelo G 3'AACT G C A C Posición de colgadura 0 1 2 3 SNP X 10/14 5 ' TGAC T T G* Alelo T 3'AACTG A A C T Posición de colgadura 1 2 3 4 SNP X 11/15 5 ' TGA c T T G* Alelo T 3'AACT G A A C Posición de colgadura 0 1 2 3 La SNP Y ahora supuesta puede ser adenina o timidina y tiene las siguientes colgaduras 5' generadas después de la digestión con BsmF I.

SNP Y 10/14 5'GTTT Alelo A 3'CAAA T G T A Posición de colgadura 1 2 3 4 SNP Y 11/15 5'GTT Alelo A 3'CAAA A T G T Posición de colgadura 0 1 2 3 SNP Y 10/14 5'GTTT Alelo T 3'CAAA A G T A Posición de colgadura 1 2 3 4 SNP Y 11/15 5'GTT Alelo T 3'CAAA A A G T Posición de colgadura 0 1 2 3 Después de rellenar con ddATP etiquetado y dCTP, dGTP, y dTTP no etiquetado, se generarían las siguientes moléculas: SNP Y 10/14 5'GTTT A* Alelo A 3'CAAA T G T A Posición de colgadura 1 2 3 4 SNP Y 11/15 5'GTT T A* Alelo A 3'CAAA A T G T Posición de colgadura SNP Y 10/14 5'GTTT T c A* Alelo T 3'CAAA A G T A Posición de colgadura 1 2 3 4 SNP Y 11/15 5'GTT T T C A* Alelo T 3'CAAA A A G T Posición de colgadura 0 1 2 3 En este ejemplo, se usan ddGTP etiquetado y ddATP etiquetado para determinar la identidad de ambos alelos de SNP X y SNP Y respectivamente. El nucleótido inmediatamente precedente (el nucleótido complementario a la posición 0 de la colgadura del SNP X corte 11/15 no es guanina o adenina en la hebra que se rellena. Similarmente, el nucleótido inmediatamente precedente SNPY no es guanina o adenina en la hebra que se rellena. Esto permite que la reacción de rellenado para ambas SNP se presente en una reacción sencilla con ddGTP etiquetado, ddATP etiquetado, y dCTP y dTTP no etiquetado. Esto reduce el número de reacciones que se necesitan para realizar e incrementar el número de SNP que pueden analizarse en una reacción. Los primeros cebadores para cada SNP pueden diseñarse para combinarse en sus pares base a diferentes distancias del lugar cromosomal de interés, lo que permite que las SNP migren a diferentes posiciones en el gel . Por ejemplo, el primer cebador usado para amplificar SNP X puede combinarse en sus pares base a 30 bases del lugar cromosomal de interés, y el primer cebador usado para amplificar SNP Y puede combinarse en sus pares base a 35 bases del lugar cromosomal de interés. También, los nucleótidos pueden etiquetarse con pigmentos fluorescentes que emiten a espectros que no se traslapan. Después de correr el gel, el gel puede escanearse a una longitud de onda específica para un pigmento. Sólo aquellas moléculas etiquetadas con ese pigmento podrán emitir la señal . El gel puede entonces escanearse a una longitud de onda para el segundo pigmento. Sólo aquellas moléculas etiquetadas con tal pigmento emitirán la señal. Este método permite la máxima compresión para el número de SNP que pueden analizarse en una reacción sencilla. En este ejemplo, el nucleótido precedente al sitio variable en la hebra que se rellena no es adenina o guanina, y el nucleótido que sigue el sitio variable no puede ser adenina o guanina en la hebra de sentido. Este método puede trabajar con cualquier combinación de nucleótidos etiquetados, y el técnico habilidoso entendería cuales reacciones de etiquetado pueden mezclarse y aquellas que no. Por ejemplo, si una SNP se etiqueta con timidina y una segunda SNP se etiqueta con citosina, las SNP pueden etiquetarse en una reacción sencilla si el nucleótido inmediatamente precedente a cada sitio variable no es timidina o citosina en la hebra sentido y el nucleótido inmediatamente después del sitio variable no es timidina o citosina en la hebra sentido. Este método permite que las señales de un alelo se comparen a la señal de un segundo alelo sin agregar la complejidad de determinar el grado de corte alterno, o tener que corregir los coeficientes cuánticos de los pigmentos. Este método es especialmente útil cuando se trata de cuantificar una relación de un alelo a oro. Por ejemplo, este método es útil para detectar anormalidades cromosomales . La relación de alelos a un sitio heterocigoto se espera que esté alrededor de 1:1 (un alelo A y un alelo G) . Sin embargo, si un cromosoma extra está presente, la relación se espera que sea de alrededor de 1:2 (un alelo A y 2 alelos G o 2 alelos A y 1 alelo G) . Este método es especialmente útil cuando se trata de detectar ADN fetal en presencia de ADN materno. Además, este método es útil para detectar dos señales genéticas en una muestra. Por ejemplo, este método puede detectar células mutante en presencia de células de tipo silvestre. Por ejemplo, este método puede detectar células mutantes en presencia de células de tipo silvestre (ver Ejemplo 5) . Si una célula mutante contiene una mutación en la secuencia de ADN de un gen particular, este método puede usarse para detectar la secuencia de ADN mutante en presencia de la secuencia de ADN de tipo silvestre. La relación de ADN mutante a ADN de tipo silvestre puede cuantificarse debido a que se usa un nucleótido sencillo etiquetado con una porción generada sencilla.

EJEMPLO 7 Los métodos no invasores para la detección de varios tipos de cáncer tiene el potencial para reducir la morbilidad y mortalidad de la enfermedad. Varias técnicas para la detección temprana de tumores colorrectales se han desarrollado, incluyendo colonoscopía, enemas de bario, y sigmoidoscopía, pero se limitan en uso debido a que las técnicas son invasoras, lo que causan una baja relación de apego del paciente . Las pruebas genéticas no invasoras pueden ser útiles para identificar tumores colorrectales en etapa temprana . En 1991, los investigadores identificaron el gen coli poliposis adenomatoso (APC) , el cual juega un papel crítico en la formación de tumores colorrectales ( inzler et al., Science 253:661-665, 1991). El gen APC reside en el cromosoma 5q21-22 y un total de 15 exones codifican para una molécula de ARN de 8529 nucleótidos, lo que produce una proteína APC 300 Kd. La proteína se expresa en numerosos tipos de célula y es esencial para la adhesión celular. Las mutaciones en el gen APC generalmente inician la neoplasia colorrectal (Tsao, J. , et al., Am, J. Ptahol . 145:531-534, 1994). Aproximadamente el 95% de las mutaciones en el gen APC resultan en mutaciones sin sentido/cambio de estructura. Las mutaciones más comunes se presentan en los codones 1061 y 1309; las mutaciones en estos codones cuentan para 1/3 de todas las mutaciones de línea de germen. Con respecto a las mutaciones somáticas, el 60% se presenta con los codones 1286-1513, que es alrededor del 10% de la secuencia codificada. Esta región se llama la Región Cluster de mutación (MCR) . Numerosos tipos de mutaciones se han identificado en el gen APC e incluyen las substituciones de nucleótido (ver Tabla VII) , errores de empalme (ver Tabla VIII) , eliminaciones pequeñas (ver Tabla IX) , inserciones pequeñas (ver Tabla X) , inserciones/eliminaciones pequeñas (ver Tabla XI) , eliminaciones gruesas (ver Tabla XII) , inserciones gruesas (ver Tabla XIII) , y reconfiguraciones comple as (ver Tabla XIV) . Los investigadores han intentado identificar células que albergan mutaciones en el gen APC en muestras evacuadas (Traverso, G. Et al., New England Journal of Medicine, Vol 346:311-320, 2002). Aunque las mutaciones APC se encuentran en casi todos los tumores, alrededor de 1 en 250 células en la muestra evacuada tiene la mutación en el gen APC; la mayoría de las células son células normales que se han sacado en las heces. Adicionalmente, el ADN humano representa alrededor de un billonésimo del ADN total encontrado en las muestras evacuadas ; la mayoría del ADN es bacterial . La técnica empleada por Traverso et al . , sólo detecta mutaciones que resultan en una proteína truncada. Como se discute arriba, numerosas mutaciones en el gen APC se han implicado en la formación de tumores colorrectales . Así, todavía existe la necesidad por una técnica no invasora, altamente sensible, para la detección de tumores colorrectales. Abajo, los métodos se describen para la detección de dos mutaciones en el gen APC. Sin embargo, cualquier número de mutaciones puede analizarse usando los métodos descritos en la presente.

Preparación del ADN de Plantilla El ADN de plantilla se purifica de una muestra que contiene células de colon que incluyen, pero no se limitan a, una muestra evacuada. El ADN de plantilla se purifica usando los procedimientos descritos por Ahlquist et al . (Gastroenterology, 119:1219-1227, 2000). Si las muestras evacuadas se congelan, las muestras se descongelan a temperatura ambiente, y se homogenizan con un agitador de evacuaciones Extractor (Exact Laboratories, Maynard, Mass.). Después de la homogenización, un equivalente de 4 gramos de evacuación de cada muestra se centrífuga a 2536 x g durante 5 minutos, las muestras se centrifugan una segunda vez a 16,500 x g durante 10 minutos. Los sobrenadantes se incuban con 20µ1 de RNasa (0.5 mg por mililitro) durante 1 hora a 37°C. El ADN se precipita con un volumen 1/10 de 3 mol de acetato de sodio por litro y un volumen igual de isopropanol . El ADN se disuelve en 5 mi dé TRIS-EDTA (0.01 mol de Tris por litro (pH 7.4) y 0.001 mol de EDTA por litro.

Diseño de Cebadores Para determinar si una mutación reside en el codón 1370, se usan los siguientes cebadores: Primer cebador: 5 ' GTGCCAAAGGCCTGAATTCCCAGGCACAAAGCTGTTGAA3 ' Segundo cebador: 5 ' TGAAGCGAACTAGGGACTCAGGTGGACTT El primer cebador contiene una etiqueta de biotina en la terminación del extremo 5', y la secuencia de nucleótido para la enzima de restricción EcoRI . El segundo cebador contiene la secuencia de nucleótido para la enzima de restricción BsmF I . Para determinar si se presenta una eliminación pequeña en el codón 1302, se usan los siguientes cebadores: Primer cebador: 5 ' GATTCCGTAAACGAATTCAGTTCATTATCATCTTTGTC3 ' Segundo cebador: 5' CCATTGTTAAGCGGGACTTCTGCTATTTG3 ' El primer cebador tiene una etiqueta de biotina en la terminación 5' y contiene un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para EcoRI . El segundo cebador contiene un sitio de reconocimiento de enzima de restricción para BsmF I.

Reacción PCR Los lugares cromosomales de interés se amplifican del ADN genómico de plantilla usando la reacción de cadena de polimerasa (PCR, Patentes E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas en la presente para referencia) . Los lugares cromosomales de interés se amplifican en tubos de reacción separados; también pueden amplificarse juntos en una reacción PCR sencilla. Para especificidad incrementada, se usa una reacción PCR de "inicio caliente", por ejemplo, al usar el Kit de Mezcla HotStarTaq aster suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad del ADN de plantilla y el cebador por reacción se optimizan para cada lugar cromosomal de interés, pero en este ejemplo, 40 ng del ADN genómico humano de plantilla y 5µ? de cada cebador se usan. Se realizan cuarenta ciclos de PCR. Se usan las siguientes condiciones de PCR: (1) 95°C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 37°C durante 30 segundos; (3) 95°C durante 30 segundos; (4) 57°C durante 30 segundos; (5) 95°C durante 30 segundos; (6) 64°C durante 30 segundos; (7) 95°C durante 30 segundos,- (8) se repiten las etapas 6 y 7 treinta y nueve (39) veces ; (9) 72 °C durante 5 minutos. En el primer ciclo de PCR, la temperatura del combinado en sus pares base es de alrededor de la temperatura de fusión de la región combinada en sus pares base 3 ' de los segundos cebadores, que es 37°C. La temperatura del combinado en sus pares base en el segundo ciclo de PCR es de alrededor de la temperatura de fusión de la región 3 ' , que se combina en sus pares base para el ADN de plantilla, del primer cebador, que es 57°C. La temperatura de combinación en sus pares base en el tercer ciclo de PCR es de alrededor de la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador, que es 6 °C. La temperatura de combinación en sus pares base para el resto de los ciclos es de 64°C. Escalando la temperatura de combinación en sus pares base de TM1 a TM2 a TM3 en los primeros tres ciclos de PCR, mejora ampliamente la especificidad. Estas temperaturas de combinado en sus pares base son representativas, y el técnico experto entenderá que las temperaturas del combinado en sus pares base para cada ciclo dependen de los cebadores específicos usados. Las temperaturas y tiempos para desnaturalizar, combinar en sus pares base, y la extensión, se optimizan al tratar varias colocaciones y usando los parámetros que proporcionan los mejores resultados.

Purificación del Fragmento de Interés Los productos PCR se separan del ADN de plantilla genómico. Cada producto PCR se divide en cuatro pozos de reacción separados de una placa de alto enlace, Streptawell, transparente, de Roche Diagnostics GmbH (número de catálogo 1 645 692, como se enlista en Roche Molecular Biochemicals, catálogo 2001 Biochemicals) . Los primeros cebadores contienen una etiqueta de biotina 5' de manera que los productos PCR unidos a los pozos recubiertos con estreptavidina, mientras que el ADN de plantilla genómico no. La reacción de enlace de estreptavidina se realiza usando un mezclador térmico (Eppendorf) a 1000 rpm durante 20 minutos a 37°C. Cada pozo se aspira para remover el material no unido, y se lava tres veces con IX PBS, con mezclado suave (Kandpal et al., Nucí. Acids Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka et al., Biotechniques 10:30-34 (1991); Green et al., Nucle. Acids Res. 18:6163-6164 (1990) ) . Alternativamente los productos PCR se colocan en un pozo sencillo de una placa de estreptavidina para realizar la reacción de incorporación de nucleotido en un pozo sencillo.

Digestión de Enzima de Restricción de Fragmentos Aislados Los productos PCR purificados se digieren con la enzima de restricción BsmF I (New England Biolabs número de catálogo R0572S) , que une al sitio de reconocimiento incorporado en los productos PCR del segundo cebador. Se realizan las digestiones en los Streptawells siguiendo las instrucciones suministradas con la enzima de restricción. Después de la digestión con la enzima de restricción apropiada, los pozos se lavan tres veces con PBS para remover los fragmentos desdoblados .

Incorporación del Nucleotido Etiquetado La enzima de restricción digerida descrita arriba proporciona un fragmento de ADN con una colgadura 5' , que contiene la lugar cromosomal de interés y un extremo 3 ' de entrada. La colgadura 5' funciona como una plantilla que permite la incorporación de un nucleotido o nucleótidos en presencia de la polimerasa de ADN. Para cada lugar cromosomal de interés, se realizan cuatro rellenos separados en las reacciones; cada una de las cuatro reacciones contiene ddNTP fluorescentemente etiquetado (ddATP, ddTTP, ddGTP, o ddCTP) . Los siguientes componentes se agregan a cada relleno en la reacción: 1 µ? de ddNTP fluorescentemente etiquetado, 0.5 µ? de ddNTP no etiquetados (40 µ ) , que contiene todos los nucleótidos excepto el nucleótido que se etiqueta fluorescentemente, 2 µ? de solución amortiguadora secuenasa 10X, 0.25 µ? de secuenasa, y agua como sea necesario para una reacción 20µ1. El relleno se realiza en las reacciones a 40°C durante 10 minutos. Los ddNTP etiquetados un fluorescentemente se adquieren de Fermentas Inc. (Hanover, MD) . Todos los otros reactivos etiquetantes se obtienen de Amersham (Kit Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core, US 79565) . En presencia de ddNTP etiquetados fluorescentemente, la terminación 3' de entrada se extiende por una base, que corresponde a la lugar cromosomal de interés . Una mezcla de ddNTP etiquetados y dNTP no etiquetados también puede usarse para la reacción de rellenado. Las condiciones de "rellenado" son como se describe arriba excepto que una mezcla que contiene 40µ? de dNTP no etiquetados, ?µ? de ddATP etiquetado fluorescentemente, ?µ? de ddTTP etiquetado fluorescentemente, ?µ? de ddCTP etiquetado fluorescentemente, y ?µ? de ddGTP se usan. Los ddNTP fluorescentes se obtienen de Amersham (Kit Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core, US 79565; Amersham no publica las concentraciones de los nucleótidos fluorescentes) . La lugar cromosomal de interés se digiere con la enzima de restricción BsmF I, que genera una colgadura 5' de cuatro bases. Si el primer nucleótido incorporado es un ddNTP etiquetado, la terminación de entrada '3 ' se rellena por una base, lo que permite la detección del lugar cromosomal de interés. Sin embargo, si el primer nucleótido incorporado es un d TP, la polimerasa ¦ continúa incorporando nucleótidos hasta que el ddNTP se rellena. Por ejemplo, los dos primeros nucleótidos pueden rellenarse con dNTP, y el tercer nucleótido con ddNTP, permite la detección del tercer nucleótido en la colgadura. De esta manera, la secuencia de la colgadura 5' completa se determina, lo que incrementa la información obtenida de cada SNP o lugar cromosomal de interés. Este tipo de reacción de relleno es especialmente útil cuando se detecta la presencia de inserciones, eliminaciones, inserciones y eliminaciones, recolocaciones, y transubicaciones . Alterna ivamente, un nucleótido etiquetado con un pigmento sencillo se usa para determinar la secuencia del lugar cromosomal de interés. Ver Ejemplo 6. Este método elimina cualesquiera de los errores potenciales cuando se usan diferentes pigmentos, que tienen diferentes coeficientes cuánticos . Después de etiquetar, cada Streptawell se enjuaga con IX PBS (???µ?) tres veces. Los fragmentos de ADN "rellenados" se liberan de los Streptawells por digestión con la enzima de restricción EcoRI , de conformidad con las instrucciones del fabricante que se suministran con la enzima. La digestión se realiza durante 1 hora a 37°C con agitación a 120 rpm.

Detección del lugar cromosomal de interés Después de liberarse de la matriz de estreptavidina, la muestra se carga en una línea de un gel de acrilamida al 5% (urea) de 36 cm (Bio Whittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, número de catálogo 50691) . La muestra se procesa por electroforesis en el gel a 3000 voltios durante 3 minutos . El gel se corrió durante 3 horas usando un aparato procesador de secuencia (secuenciador Hoefer SQ3) . El nucleótido etiquetado incorporado se detecta por fluorescencia. Para determinar si cualquiera de las células contiene mutaciones en el codón 1370 del gen APC cuando se realizan reacciones de rellenado separadas, las lineas del gen que corresponden a la reacción de rellenado para ddATP y ddTTP se analizan. Si sólo se presentan células normales, la línea correspondiente a la reacción de rellenado con ddATP es una señal brillante. No se detecta señal para la reacción de "rellenado" con ddTTP. Sin embargo, si la muestra del paciente contiene células con mutaciones en el codón 1370 del gen APC, la línea correspondiente a la reacción de rellenado con ddATP es una señal brillante, y la señal se detecta de la línea correspondiente a la reacción de rellenado con ddTTP. La intensidad de la señal de la línea correspondiente para la reacción de rellenado con ddTTP indica el número de células mutantes en la muestra. Alternativamente, un nucleótido etiquetado se usa para determinar la secuencia de los alelos en el codón 1370 del gen APC. En el codón 1370, la secuencia normal es ???, lo que codifica para la lisina de aminoácido. Sin embargo, una substitución de nucleótido se ha identificado en el codón 1370, lo que se asocia con tumores colorrectales . Específicamente, un cambio de A hasta T (AAA-TAA) típicamente se encuentra en el codón 1370, lo que resulta en un codón de detención. Se realiza una reacción de rellenado sencilla usando ddATP etiquetado, y dTTP, dCTP, y dGTP no etiquetado. Un nucleótido sencillo etiquetado con un pigmento fluorescente se usa para determinar la presencia de ambas secuencias de ADN, mutante y normal, que codifican para el codón 1370. La secuencia de ADN relevante se describe abajo con la secuencia correspondiente al codón 1370 en negrita: 5' CCCAAAAGTCCACCTGA 3' GGGTTTTCAGGTGGACT Después de digerir con BsmF I , se produce la siguiente colgadura : 5' CCC 3' GGG T T T T Posición de colgadura 1 2 3 4 Si la muestra del paciente no tiene células que alojan una mutación en el codón 1370, se aprecia una señal correspondiente a la incorporación de ddATP etiquetado. 5 ' CCC A* 3' GGG T T T T Posición de colgadura 1 2 3 4 Sin embargo, si la muestra del paciente tiene células con mutaciones en el codón 1370 del gen APC, se aprecia una señal, que corresponde a la secuencia normal en el codón 1370, y se aprecia una segunda señal, que corresponde a la secuencia mutante en el codón 1370. Las señales se identifican claramente como diferentes en peso molecular.

Colgadura de la secuencia de ADN normal : CCC GGG T T T T Posición de colgadura 1 2 3 4 Secuencia de ADN normal después del relleno: CCC A* GGG T T T T Posición de colgadura 1 2 3 4 Colgadura de la secuencia de ADN mutante: CCC GGG A T T T Posición de colgadura 1 2 3 4 Secuencia de ADN mucante después del relleno: CCC T A* GGG A T T T Posición de colgadura 1 2 3 4 Las dos señales se aprecian cuando el alelo mutante está presente. Las moléculas de ADN mutante se rellenan con una base después de las moléculas de ADN de tipo silvestre. Las dos señales se separan usando cualquier método que discrimina con base en el peso molecular. Se usa un nucleótido etiquetado (ddATP) para detectar la presencia de tanto la secuencia de ADN de tipo silvestre como la secuencia de ADN mutante. Este método de etiquetado reduce el número de reacciones que se necesitan para realizar y permitir asegurar la cuantificación para el número de células mutantes en la muestra del paciente. El número de células mutantes en la muestra se usa para determinar la prognosis del paciente, el grado y la severidad de la enfermedad. Este método de etiquetado elimina las complicaciones asociadas con usar diferentes pigmentos, que tienen distintos coeficientes cuánticos. Este método de etiquetado también elimina errores asociados con las reacciones de pipetado. Para determinar si cualesquiera de las células contienen mutaciones en el codón 1302 del gen APC cuando se realizan reacciones de rellenado, las líneas del gen que corresponden a la reacción de rellenado para ddTTP y ddCTP se analizan. La secuencia de ADN normal se describe abajo con la secuencia codificada para el codón 1302 en letras negritas.

Secuencia Normal: 5 'ACCCTGCAAATGCAGAA 3 ' GGGACGTTTATCGTCTT Después de digerir, se produce la siguiente colgadura 5' : 5 'ACCC 3'TGGG A C G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Después de la reacción de rellenado, se incorpora el ddTTP etiquetado. 5 'ACCC T* 3'TGGG A C G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Una eliminación de una base sencilla de la secuencia APC, que codifica típicamente para el codón 1302, se ha asociado con tumores colorrectales . La secuencia de ADN mutante se describe abajo con la secuencia relevante en negritas : Secuencia Mutante: 5 'ACCCGCAAATAGCAGAA 3 ' GGGCGTTTATCGTCTT Después de la digestión: 5'ACC 3'TGG G C G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Después de rellenar: 5'ACC 3'TGG Posición de colgadura Si no hay mutaciones en el gen APC, la señal no se detecta para la reacción de rellenado con ddCTP*, pero se detecta una señal brillante para la reacción de rellenado con ddTTP* . Sin embargo, si hay células en la muestra del paciente que tienen mutaciones en el gen APC, las señales se aprecian para las reacciones de rellenado con ddCTP* y ddTTP* .

Alternativamente, se realiza una reacción de rellenado sencilla usando una mezcla que contiene dNTP no etiquetados, ddATP fluorescentemente etiquetado, ddTTP fluorescentemente etiquetado, ddCTP fluorescentemente etiquetado, y ddGTP fluorescentemente etiquetado. Si no hay eliminación, se incorpora el ddTTP etiquetado. 5 ' ACCC T* 3'TGGG A C G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Sin embargo, si la T se ha eliminado, se incorpora ddCTP* etiquetado. 5 ' ACCC* 3'TGGG C G T Posición de colgadura 1 2 3 4 Las dos señales se separaron por peso molecular debido a la eliminación del nucleótido de timidina. Si se presentan células mutantes, se generan dos señales en la misma línea, pero se separan por un par base sencillo (este principio se demuestra en la Figura 9D) . La eliminación provoca un cambio en el peso molecular de los fragmentos de ADN, lo que permite una reacción de rellenado sencilla para usarse para detectar la presencia de células tanto normales como mutantes. En el ejemplo anterior, los métodos para la detección de una substitución de nucleótido y una eliminación pequeña se describen. Sin embargo, los métodos se usan para la detección de cualquier tipo de mutación, incluyendo, pero no se limitan a, substituciones de nucleótido (ver Tabla VII) , errores de empalme (ver Tabla VIII) , eliminaciones pequeñas (ver Tabla IX) , inserciones pequeñas (ver Tabla X) , inserciones/eliminaciones pequeñas (ver Tabla XI) , eliminaciones gruesas (ver Tabla XII) , inserciones gruesas (ver Tabla XIII) , y reconfiguraciones complejas (ver Tabla XIV) . Además, los métodos arriba descritos se usan para la detección de cualquier tipo de enfermedad, que incluyen, pero no se limitan a, aquellas enlistadas en la Tabla IV. Adicionalmente, cualquier tipo de gen imitante se detecta usando las invenciones descritas en la presente que incluyen, pero no se limitan a, genes asociados con las enfermedades enlistadas en la Tabla IV, BRCA1, BRCA2 , MSH6, SH2 , MLH1, RET, PTEN, ATM, H-RAS, p53 , ELAC2 , CDG1, APC, AR, PMS2, MLH3 , CYP1A1, GSTP1, GSTM1, AXIN2 , CYP19, MET, NATI, CDKN2A, NQ01, trc8, RAD51 , PMS1, TGFBR2 , VHL, MC4R, POMC, NR0B2 , UCP2 , PCSK1, PPARG, ADRB2, UCP3 , glurl, cart, SORBS1, LEP, LEPR, SIM1, TNF, IL-6, IL-1, IL-2, IL-3, IL1A, TAP2 , THPO, TRB, NBS1, RB15, LIF, MPL, RUN 1 , Her-2, receptor glucocorticoide, receptor de estrógeno, receptor tiroide, p21, p27, K-RAS, N-RAS, proteína retinoblastoma, gen Wiskott-Aldrich (WAS) , Factor V Leiden, Factor II (protrombina) , reductasa de tetrahidrofolato de metileno, fibrosis cística, receptor LDL, receptor HDL, gen de superóxido dismotasa, gen SOS, genes involucrados en la regulación del óxido nítrico, genes involucrados en la regulación del ciclo celular, genes supresores del tumor, oncogenes, genes asociados con la neurodegeneración, genes asociados con la obesidad. Las abreviaturas correspondientes a las proteínas como se enlistan en la Base de Datos de Mutación del Gen Humano, que se incorpora en la presente para referencia (www. archive . uwcm. ac. uk/uwcm) dirección del sitio en la red activo desde el 12 de febrero del 2003) . El ejemplo anterior demuestra la detección de células mutantes y alelos mutantes de la muestra fecal . Sin embargo, los métodos descritos en la presente se usan para la detección de células mutantes de cualquier muestra biológica que incluyen, pero no se limitan a, muestra de sangre, muestra de suero, muestra de plasma, muestra de orina, fluido espinal, fluido linfático, semen, secreción vaginal, fluido ascítico, saliva, secreción de mucosa, fluido peritoneal, muestra fecal, exudados corporales, fluido de mama, aspirados de pulmón, células, te idos, células o extractos individuales de tales fuentes que contienen el ácido nucleico del mismo, y estructuras subcelulares tales como mitocondria o cloroplastos . Además, los métodos descritos en la presente se usan para la detección de células imitantes y ADN mutado de cualquier número de fuentes que contienen ácido nucleico, que incluyen, pero no se limitan a, muestras forenses, de alimento, arqueológicas, de agricultura o inorgánicas. El ejemplo anterior se dirige a la detección de mutaciones en el gen APC. Sin embargo, las invenciones descritas en la presente se usan para la detección de mutaciones en cualquier gen que se asocia con o está predispuesto a la enfermedad (ver Tabla XV) . Por ejemplo, la hipermetilación del promotor Pl S-transferasa glutatión (GSTPl) es la alteración de ADN más común en el cáncer de la próstata. El estado de metilación del promotor se determina usando bisulfito de sodio y los métodos se describen en la presente. El tratamiento con bisulfito de sodio convierte los residuos de citosina no metilados en uracilo, y dejan las citosinas no metaladas sin cambio. Usando los métodos descritos en la presente, se diseñan un primer y segundo cebador para amplificar las regiones del promotor GSTPl que se metilan frecuentemente. Abajo, la región del promotor GSTPl se muestra antes del tratamiento con bisulfito de sodio : Antes del tratamiento con bisulfito de sodio: 5 ' CCGCTACA 3 ' TGGCGATCA A continuación, la región del promotor GSTPl se muestra después del tratamiento con bisulfito de sodio, amplificación PCR, y digestión con la enzima de restricción tipo IIS BsmF I: No metilado 5'ACC 3'TGG U G A T Posición de colgadura 1 2 3 4 Metilado 5'ACC 3'TGG C G A T Posición de colgadura 1 2 3 4 El ddATP etiquetado, dCTP, dGTP, y dTTP no etiquetados se usan para rellemaSf ¾s colgaduras 5 ' . Se generan las siguientes moléculas No metilada 5 'ACC A* 3'TGG U G A T Posición de colgadura 1 2 3 4 Metilada 5'ACC G C T A* 3'TGG C G A T Posición de colgadura 1 2 3 4 Se aprecian dos señales; una corresponde a las moléculas de ADN rellenadas con ddATP en una posición complementaria a la colgadura (no metilada) , y la otra corresponde a las moléculas de ADN rellenadas con ddATP en la posición 4 complementariamente a la colgadura (metilada) . Las dos señales se separan con base en el peso molecular. Alternativamente, las reacciones de rellenado se realizan en reacciones separadas usando ddGTP etiquetado en una reacción y ddATP etiquetado en otra reacción. Los métodos descritos en la presente se usan para separar el cáncer de la próstata y también para monitorear el progreso y severidad de la enfermedad, el uso de un nucleótido sencillo para detectar las secuencias tanto metiladas como no metiladas permite la cuantificación exacta y proporciona un alto nivel de sensibilidad para las secuencias metiladas, que es una herramienta útil para la detección temprana de la enfermedad .

La información contenida en las Tablas VII-XIV se obtiene de la Base de Datos Human Gene utation. Con la información proporcionada en la presente, el técnico experto entenderá como aplicar estos métodos para determinar la secuencia de los alelos para cualquier gen. Un gran número de genes y sus mutaciones asociadas puede encontrarse en el siguiente sitio de la red: www. archive . uwcm. ac . uk/uwcm.

TABLA VII: ¦ SUBSTITUCIONES DE UCLEOTIDO Codón Nucleótido Aminoácido Fenotipo 99 CGC-TGG Arg-Trp Coli poliposis adenomatosa 121 AGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 157 TGG-TAG Trp-Term Coli poliposis adenomatosa 159 TAC-TAG Tyr-Term Coli poliposis adenomatosa 163 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 168 AGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 171 AG -ATT Ser-Ile Coli poliposis adenomatosa 181 CAA-TAA Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 190 GAA-TAA Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 202 GAA-TAA Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 208 CAG-CGG Gln-Arg Coli poliposis adenomatosa 208 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 213 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 215 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 216 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 232 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 233 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 247 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 267 GGA-TGA Gly-Term Coli poliposis adenomatosa 278 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 280 TCA-TGA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 280 TCA-TAA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 283 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 302 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 332 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 358 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 405 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 414 CGC-TGC, Arg-Cys Coli poliposis adenomatosa 422 GAC-TAG Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 423 TGG-TAG Trp-Term Coli poliposis adenomatosa 424 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 433 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 443 GAA-TAA Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 457 TCA-TAA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 473 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 486 TAC-TAG Tyr-Term Coli poliposis adenomatosa 7 499 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 500 TAT-TAG Tyr-Term Coli poliposis adenomatosa 541 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 553 TGG-TAG Trp-Term Coli poliposis adenomatosa 554 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 564 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 577 TTA-TAA Leu-Term Coli poliposis adenomatosa 586 AAA-TAA Lys-Term Coli poliposis adenomatosa 592 TTA-TGA Leu-Term Coli poliposis adenomatosa 593 TGG-TAG Trp-Term Coli poliposis adenomatosa 593 TGG-TGA Trp-Term Coli poliposis adenomatosa 622 TAC-TAA Tyr-Term Coli poliposis adenomatosa 625 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 629 TTA-TAA Leu-Term Coli poliposis adenomatosa 650 GAC-TAG Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 684 TTG-TAG Leu-Term Coli poliposis adenomatosa 685 TGG-TGA Trp-Term Coli poliposis adenomatosa 695 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 699 TGG-TGA Trp-Term Coli poliposis adenomatosa 699 TGG-TAG Trp-Term Coli poliposis adenomatosa 713 TCA-TGA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 722 AGT-GGT Ser-Gly Coli poliposis adenomatosa 747 TCA-TGA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 764 TTA-TAA Leu-Term Coli poliposis adenomatosa 1075 TAT-TAG Tyr-Term Coli poliposis adenomatosa 1102 TAC-TAG Tyr-Term Coli poliposis adenomatosa 1110 TCA-TGA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1114 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 1123 CAA-TAA Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1135 TAT-TAG Tyr-Term Coli poliposis adenomatosa 1152 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1155 GAA-TAA Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 1168 GAA-TAA Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 1175 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1176 CCT-CTT Pro-Leu Coli poliposis adenomatosa 1184 GCC-CCC Ala-Pro Coli poliposis adenomatosa 1193 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1194 TCA-TGA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1198 TCA-TGA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1201 TCA-TGA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1228 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1230 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1244 CAA-TAA Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1249 TGC-TGA Cys-Term Coli poliposis adenomatosa 1256 CAA-TAA Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1262 TAT-TAA Tyr-Term Coli poliposis adenomatosa 1270 TGT-TGA Cys-Term Coli poliposis adenomatosa 1276 TCA-TGA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1278 TCA-TAA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1286 GAA-TAA Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 1289 TGT-TGA Cys-Term Coli poliposis adenomatosa 1294 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1307 ???-??? Ile-Lys Cáncer colorrectal, predisposición a, asociación 1309 GAA-TAA Gl -Term Coli poliposis adenomatosa 1317 GAA-CAA Glu-Gln Cáncer colorrectal, predisposición a 1328 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1338 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1342 ???-??? Leu-Term Coli poliposis adenomatosa 1342 TTA-TGA Leu-Term Coli poliposis adenomatosa 1348 AGG-TGG Arg-Trp Coli poliposis adenomatosa 1357 GGA-TGA Gly-Term Coli poliposis adenomatosa 1367 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1370 ???-??? Lys-Term Coli poliposis adenomatosa 1392 TCA-TAA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1392 TCA-TGA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1397 GAG-TAG Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 1449 AAG-TAG Lys-Term Coli poliposis adenomatosa 1450 CGA-TGA Arg-Term Coli poliposis adenomatosa 1451 GAA-TAA Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 1503 TCA-TAA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1517 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1529 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1539 TCA-TAA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1541 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 1564 ???-??? Leu-Term Coli poliposis adenomatosa 1567 TCA-TGA Ser-Term Coli poliposis adenomatosa 1640 CGG-TGG Arg-Trp Coli poliposis adenomatosa 1693 GAA-TAA Glu-Term Coli poliposis adenomatosa 1822 GAC-GTC Asp-Val Coli poliposis adenomatosa, ¿asociación con? 2038 CTG-GTG Leu-Val Coli poliposis adenomatosa 2040 CAG-TAG Gln-Term Coli poliposis adenomatosa 2566 AGA-AAA Arg-Lys Coli poliposis adenomatosa 2621 TCT-TGT Ser-Cys Coli poliposis adenomatosa 2839 CTT-TTT Leu-Phe Coli poliposis adenomatosa TABLA VIII : SUBSTITUCIONES DE NUCLEOTIDO Donador/ Ubicación Substitución Fenotipo aceptor relativa ds -1 G-C Coli poliposis adenomatosa as -1 G-A Coli poliposis adenomatosa as -1 G-C Coli poliposis adenomatosa ds +2 T-A Coli poliposis adenomatosa as -1 G-C Coli poliposis adenomatosa as -1 G-T Coli poliposis adenomatosa as -1 G-A Coli poliposis adenomatosa as -2 A-C Coli poliposis adenomatosa 5 as -5 A-G Coli poliposis adenomatosa ds +3 A-C Coli poliposis adenomatosa as -1 · G-A Coli poliposis adenomatosa ds +1 G-A Coli poliposis, adenomatosa as -1 G-T Coli poliposis adenomatosa 10 ds +1 G-A Coli poliposis adenomatosa as -1 G-A Coli poliposis adenomatosa ds +1 G-A Coli poliposis adenomatosa ds +3 A-G Coli poliposis adenomatosa ds +5 G-T Coli poliposis adenomatosa as -1 G-A Coli poliposis adenomatosa as -6 A-G Coli poliposis adenomatosa as -5 A-G Coli poliposis adenomatosa as -2 A-G Coli poliposis adenomatosa ds +2 T-C Coli poliposis adenomatosa as -2 A-G . Coli poliposis adenomatosa ds +1 G-A Coli poliposis adenomatosa ds +1 G-T Coli poliposis adenomatosa ds +2 T-G Coli poliposis adenomatosa 25 TABLA IX: ELIMINACIONES PEQUEÑAS DE APC Las letras en negrita indican el codón. Las letras en minúsculas representan la eliminación. Donde las eliminaciones se extienden más allá de la región codificada, se proporciona otra información de posición. Por ejemplo, la abreviatura 5'UTR representa la región no traducida 5', y la abreviatura E616 significa la unión de 6 exones/6 intrones. 179 TCCTTacaaACAGATATGA Coli poliposis adenomatosa 185 ACCaGAAGGCAATT Coli poliposis adenomatosa 196 ATCAGagTTGCGATGGA Coli poliposis adenomatosa 213 CGAGCaCAG_E515_GTAAGTT Coli poliposis adenomatosa 298 CACtcTGCACCTCGA Coli poliposis adenomatosa 329 GATaTGTCGCGAAC Coli poliposis adenomatosa 365 AAAGActCTGTATTGTT Coli poliposis adenomatosa 397 GACaaGAGAGGCAGG Coli poliposis adenomatosa 427 CATGAacCAGGCATGGA Coli poliposis adenomatosa 428 GAACCaGGCATGGACC Coli poliposis adenomatosa 436 AATCCaa_E9I9_gTATGTTCTCT Coli poliposis adenomatosa 440 GCTCCtGTTGAACATC Coli poliposis adenomatosa 455 AAACTtTCATTTGATG Coli poliposis adenomatosa 455 AAACtttcaTTTGATGAAG Coli poliposis adenomatosa 472 CTAcAGGCCATTGC Coli poliposis adenomatosa 472 TAAATTAG_110E1l_GGgGACTAC Coli poliposis adenomatosa AGGC 478 TTATtGCAAGTGGAC Coli poliposis adenomatosa 486 TACGgGCTTACTAAT Coli poliposis adenomatosa 494 AGTATtACACTAAGAC Coli poliposis adenomatosa 495 ATTACacTAAGACGATA Coli poliposis adenomatosa 497 CTAaGACGATATGC Coli poliposis adenomatosa 520 TGCTCtaTGAAAGGCTG Coli poliposis adenomatosa 526 ATGAGagcacttgtgGCCCAACTAA Coli poliposis adenomatosa 539 GACTTaCAGCAG_E12112_GTAC Coli poliposis adenomatosa 560 AAAAAgaCGTTGCGAGA Coli poliposis adenomatosa 566 GTTGgaagtGTGAAAGCAT Coli poliposis adenomatosa 570 AAAGCaTTGATGGAAT Coli poliposis adenomatosa 577 TTAGaag TAAAAAG_E13I13_GT Coli poliposis adenomatosa A 584 ACCCTcAAAAGCGTAT Coli poliposis adenomatosa 591 GCCTtATGGAATTTG Coli poliposis adenomatosa 608 GCTgTAGATGGTGC Coli poliposis adenomatosa 617 GTTggcactcttacttaccGGAGCC Coli poliposis adenomatosa AGAC 620 CTTAC11acCGGAGCCAGA Coli poliposis adenomatosa 621 ACTTaCCGGAGCCAG Coli poliposis adenomatosa 624 AGCcaGACAAACACT Coli poliposis adenomatosa 624 AGCCagacAAACACTTTA Coli poliposis adenomatosa 626 ACAaacaCTTTAGCCAT Coli poliposis adenomatosa 629 TTAGCcATTATTGAAA Coli poliposis adenomatosa 635 GGAGgTGGGATATTA Coli poliposis adenomatosa 638 ATATtACGGAATGTG Coli poliposis adenomatosa 639 TTACGgAATGTGTCCA Coli poliposis adenomatosa 657 AGAgaGAACAACTGT Coli poliposis adenomatosa 659 TATTTCAG_114E15_GCaaatcct Coli poliposis adenomatosa aagagagAACAACTGTC 660 AACTgtCTACAAACTT Coli poliposis adenomatosa 665 TTAttACAACACTTA Coli poliposis adenomatosa 668 CAC11 AAATCTCAT Coli poliposis adenomatosa 673 AGTttgacaatagtCAGTAATGCA Coli poliposis adenomatosa 768 CACTTaTCAGAAACTT Coli poliposis adenomatosa 769 TTATcAGAAACTTTT Coli poliposis adenomatosa 770 TCAGAaACTTTTGACA Coli poliposis adenomatosa 780 AGTCcCAAGGCATCT Coli poliposis adenomatosa 792 AAGCaAAGTCTCTAT Coli poliposis adenomatosa 792 AAGCaaGTCTCTATGG Coli poliposis adenomatosa 793 CAAAgTCTCTATGGT Coli poliposis adenomatosa 798 GATTatGTTTTTGACA Coli poliposis adenomatosa 802 GACACcaatcgacatGATGATAATA Coli poliposis adenomatosa 805 CGACatGATGATAATA Coli poliposis adenomatosa 811 TCAGacaaTTTTAATACT Coli poliposis adenomatosa 825 TA tTGAATACTAC Coli poliposis adenomatosa 827 AATAcTACAGTGTTA Coli poliposis adenomatosa 830 GTGTTacccagctcctctTCATCAA Coli poliposis adenomatosa GAG 833 AGCTCcTCTTCATCAA Coli poliposis adenomatosa 836 TCATcAAGAGGAAGC Coli poliposis adenomatosa 848 AAAGAtaGAAGTTTGGA Coli poliposis adenomatosa 848 AAAGatagaagTTTGGAGAGA Coli poliposis adenomatosa 855 GAACgCGGACTTGGT Coli poliposis adenomatosa 856 CGCGgaattGGTGTAGGCA Coli poliposis adenomatosa 856 CGCGgAATTGGTCTA Coli poliposis adenomatosa 879 CAGaTCTCCACCAC Coli poliposis adenomatosa 902 GAAGAcagaAGTTCTGGGT Coli poliposis adenomatosa 907 GGGTcTACCACTGAA Coli poliposis adenomatosa 915 GTGACaGATGAGAGAA Coli poliposis adenomatosa 929 CATACacatTCAAACACTT Coli poliposis adenomatosa 930 ACACAttcaAACACTTACA Coli poliposis adenomatosa 931 CA tCAAACACTTA Coli poliposis adenomatosa 931 CATTcAAACACTTAC Coli poliposis adenomatosa 933 AACac ACAATTTCAC Coli poliposis adenomatosa 935 TACAat tcact AGTCGGAAA Coli poliposis adenomatosa 937 TTCActaaGTCGGAAAAT Coli poliposis adenomatosa 939 AAGtcggAAAATTCAAA Coli poliposis adenomatosa 946 ACATgTTCTATGCCT Coli poliposis adenomatosa 954 TTAGaaTACAAGAGAT Coli poliposis adenomatosa 961 AATgATAGTTTAAA Coli poliposis adenomatosa 963 AGTTTaAATAGTGTCA Coli poliposis adenomatosa 964 TTAaataGTGTCAGTAG Coli poliposis adenomatosa 973 TATGgTAAAAGAGGT Coli poliposis adenomatosa 974 GGTAAaAGAGGTCAAA Coli poliposis adenomatosa 975 AAAAgaGGTCAAATGA Cáncer de tiroides 992 - AGTAAgTTTTGCAGTT Cáncer de tiroides 993 AGGtttgcagttaTGGTCAATAC Coli poliposis adenomatosa 999 CAAtacccagCCGACCTAGC Coli poliposis adenomatosa 1023 ACACcAATAAATTAT Coli poliposis adenomatosa 1030 AAAtATTCAGATGA Coli poliposis adenomatosa 1032 TCAGatgagCAGTTGAACT Coli poliposis adenomatosa 1033 GATGaGCAGTTGAAC Coli poliposis adenomatosa 1049 TGGGaAAGACCCAAA Coli poliposis adenomatosa 1054 CACAtaataGAAGATGAAA Coli poliposis adenomatosa 1055 ATAAtagaaGATGAAATAA Coli poliposis adenomatosa 1056 ATAGAaGATGAAATAA Coli poliposis adenomatosa 1050 ATAAAacaaaGTAGCAAAG Coli poliposis adenomatosa 1061 AAAcaaaGTGAGC AAG Coli poliposis adenomatosa 1061 AAACaaAGTGAGCAAA Coli poliposis adenomatosa 1062 CAAAgtgaGCAAAGACAA Coli poliposis adenomatosa 1065 •CAAAGacAATCAAGGAA Coli poliposis adenomatosa 1067 CAAtcaaGGAATCAAAG Coli poliposis adenomatosa 1071 CAAAgtACAACTTATC Coli poliposis adenomatosa 1079 ACTGagAGCACTGATG Coli poliposis adenomatosa 1082 ACTGAtgATAAACACCT Coli poliposis adenomatosa 1084 GATaaacACCTCAAGTT Coli poliposis adenomatosa 1086 CACCtCAAGTTCCAAC Coli poliposis adenomatosa 1093 TTTGgACAGCAGGAA Coli poliposis adenomatosa 1098 TGTgtTTCTCCATAC Coli poliposis adenomatosa 1105 CGGgGAGCCAATGG Coli poliposis adenomatosa 1110 TCAGAaACAAATCGAG Coli poliposis adenomatosa 1121 ATTAAtcaaAATGTAAGCC Coli poliposis adenomatosa 1131 CAAgAAGATGACTA Coli poliposis adenomatosa 1134 GACTAtGAAGATGATA Coli poliposis adenomatosa 1137 GATgataaGCCTACCAAT Coli poliposis adenomatosa 1146 CGTTAcTCTGAAGAAG Coli poliposis adenomatosa 1154 GAAGaagaaGAGAGACCAA Coli poliposis adenomatosa 1155 GAAGaagaGAGACCAACA Coli poliposis adenomatosa 1156 GAAgagaGACCAACAAA Coli poliposis adenomatosa 1168 GAAgagaaACGTCATGTG Coli poliposis adenomatosa 1178 GATTAtagt11aAAATATGCCA Coli poliposis adenomatosa 1181 TTAAaATATGCCACA Coli poliposis adenomatosa 1184 GCCacagaTATTCCTTCA Coli poliposis adenomatosa 1185 ACAgaTATTCCTTCA Coli poliposis adenomatosa 1190 TCACAgAAACAGTCAT Coli poliposis adenomatosa 1192 AAAcaGTCATTTTCA Coli poliposis adenomatosa 1198 TCAaaGAGTTCATCT Coli poliposis adenomatosa 1207 AAAAcCGAACATATG Coli poliposis adenomatosa 1208 ACCgaacATATGTCTTC Coli poliposis adenomatosa 1210 CATatGTCTTCAAGC Coli poliposis adenomatosa 1233 CCAAGtTCTGCACAGA Coli poliposis adenomatosa 1249 TGCAaaGTTTCTTCTA Coli poliposis adenomatosa 1259 ATAcaGACTTATTGT Coli poliposis adenomatosa 1260 CAGACttATTGTGTAGA Coli poliposis adenomatosa 1268 CCAaTATGTTTTTC Coli poliposis adenomatosa 1275 AGTtCATTATCATC Coli poliposis adenomatosa 1294 CAGGAaGCAGATTCTG Coli poliposis adenomatosa 1301 ACCCtGCAAATAGCA Coli poliposis adenomatosa 1306 GAAAtaaaAGAAAAGATT Coli poliposis adenomatosa 1307 ATAaAAGAAAAGAT Coli poliposis adenomatosa 1308 AAAgaaaAGATTGGAAC Coli poliposis adenomatosa 1308 AAAGAaaagaTTGGAACTAG Coli poliposis adenomatosa 1318 GATCcTGTGAGCGAA Coli poliposis adenomatosa 1320 GTGAGcGAAGTTCCAG Coli poliposis adenomatosa 1323 GTTCcAGCAGTGTCA Coli poliposis adenomatosa 1329 CACCctagaaccAAATCCAGCA Coli poliposis adenomatosa 1336 AGACtgCAGGGTTCTA Coli poliposis adenomatosa 1338 CAGgGTTCTAGTTT Coli poliposis adenomatosa 1340 TCTAgTTTATCTTCA Coli poliposis adenomatosa 1342 TTATcTTCAGAATCA Coli poliposis adenomatosa 1352 GTTgAATTTTCTTC Coli poliposis adenomatosa 1361 CCCTCCAAAAGTGGT Coli poliposis adenomatosa 1364 AGTggtgCTCAGACACC Coli poliposis adenomatosa 1371 AGTCCacCTGAACACTA Coli poliposis adenomatosa 1372 CCACCtGAAAGAGTATG Coli poliposis adenomatosa 1376 TATGttCAGGAGACCC Coli poliposis adenomatosa 1394 GATAgtTTTGAGAGTC Coli poliposis adenomatosa 1401 ATTGCcAGCTCCGTTC Coli poliposis adenomatosa 1415 AGTGGcATTATAAGCC Coli poliposis adenomatosa 1426 AGCCcTGGACAAACC Coli poliposis adenomatosa 1427 CCTGGaCAAACCATGC Coli poliposis adenomatosa 1431 ATGCcACCAAGCAGA Coli poliposis adenomatosa 1454 AAAAAtAAAGCACCTA Coli poliposis adenomatosa 1461 GAAaAGAGAGAGAG Coli poliposis adenomatosa 1463 AGAgagaGTGGACCTAA Coli poliposis adenomatosa 1464 GAGAgTGGACCTAAG Coli poliposis adenomatosa 1464 GAGAgtGGACCTAAGC Coli poliposis adenomatosa 1464 GAGagTGGACCTAAG Coli poliposis adenomatosa 1492 GCCaCGGAAAGTAC Coli poliposis adenomatosa 1493 ACGGAaAGTACTCCAG Coli poliposis adenomatosa 1497 CCAgATGGATTTTC Coli poliposis adenomatosa 1503 TCAtccaGCCTGAGTGC Coli poliposis adenomatosa 1522 TTAagaataaTGCCTCCAGT Coli poliposis adenomatosa 1536 GAAACagAATCAGAGCA Coli poliposis adenomatosa 1545 TCAAAtgaaaACCAAGAGAA Coli poliposis adenomatosa 1547 GAAaACCAAGAGAA Coli poliposis adenomatosa 1550 GAGAaagaGGCAGAAAAA Coli poliposis adenomatosa 1577 GAATgtATTATTTCTG Coli poliposis adenomatosa 1594 CCAGCcCAGACTGCTT Coli poliposis adenomatosa 1596 CAGACtGCTTCAAAAT Coli poliposis adenomatosa 1823 TTCAaTGATAAGCTC Coli poliposis adenomatosa 1859 AATGAttctTTGAGTTCTC Coli poliposis adenomatosa 1941 CCAGAcagaGGGGCAGCAA Tumores desmoldes 1957 GAAaATACTCCAGT Coli poliposis adenomatosa 1980 AACaATAAAGAAAA Coli poliposis adenomatosa 1985 GAACCtATCAAAGAGA Coli poliposis adenomatosa 1986 CCTaTCAAAGAGAC Coli poliposis adenomatosa 1998 GAACcAAGTAAACCT Coli poliposis adenomatosa 2044 AGCTCcGCAATGCCAA Coli poliposis adenomatosa 2556 TCATCccttcctcGAGTAAAGCAC Coli poliposis adenomatosa 2643 CTAATttatCAAAATGGCAC Coli poliposis adenomatosa TABLA X: INSERCIONES PEQUEÑAS Codon Inserción Fenotipo 157 T Coli poliposis adenomatosa 170 AGAT Coli poliposis adenomatosa 172 T Coli poliposis adenomatosa 199 G Coli poliposis adenomatosa 243 AG Coli poliposis adenomatosa 266 T Coli poliposis adenomatosa 357 A Coli poliposis adenomatosa 405 •C Coli poliposis adenomatosa 413 T Coli poliposis adenomatosa 416 A Coli poliposis adenomatosa 457 G Coli poliposis adenomatosa 473 A Coli poliposis adenomatosa 32 503 ATTC Coli poliposis adenomatosa 519 C Coli poliposis adenomatosa 528 A Coli poliposis adenomatosa 561 A Coli poliposis adenomatosa 608 A Coli poliposis adenomatosa 620 CT Coli poliposis adenomatosa 621 A Coli poliposis adenomatosa 623 TTAC Coli poliposis adenomatosa 627 A Coli poliposis adenomatosa 629 ' Coli poliposis adenomatosa 636 GT Coli poliposis adenomatosa 639 A Coli poliposis adenomatosa 704 T Coli poliposis adenomatosa 740 ATGC Coli poliposis adenomatosa 764 T Coli poliposis adenomatosa 779 TT Coli poliposis adenomatosa 807 AT Coli. poliposis adenomatosa 827 AT Coli poliposis adenomatosa 831 A Coli poliposis adenomatosa 841 CTTA Coli poliposis adenomatosa 865 CT Coli poliposis adenomatosa 865 AT Coli poliposis adenomatosa 900 TG Coli poliposis adenomatosa 921 G Coli poliposis adenomatosa 927 A Coli poliposis adenomatosa 935 A Coli poliposis adenomatosa 936 C Coli poliposis adenomatosa 975 A Coli poliposis adenomatosa 985 T Coli poliposis adenomatosa 997 A Coli poliposis adenomatosa 1010 TA Coli poliposis adenomatosa 1085 C Coli poliposis adenomatosa 1085 AT Coli poliposis adenomatosa 1095 A Coli poliposis adenomatosa 1100 GTTT Coli poliposis adenomatosa 1107 GGAG Coli poliposis adenomatosa 1120 G Coli poliposis adenomatosa 1166 A Coli poliposis adenomatosa 1179 T Coli poliposis adenomatosa 1187 A Coli poliposis adenomatosa 1211 T Coli poliposis adenomatosa 1256 A Coli poliposis adenomatosa 1265 T Coli poliposis adenomatosa 1267 GATA Coli poliposis adenomatosa 1268 T Coli poliposis adenomatosa 1301 A Coli poliposis adenomatosa 1301 C Coli poliposis adenomatosa 1323 A Coli poliposis adenomatosa 1342 T Coli poliposis adenomatosa 1382 ? Coli poliposis adenomatosa 1458 GTAG Coli poliposis adenomatosa 1463 AG Coli poliposis adenomatosa 1488 ? Coli poliposis - adenomatosa 1531 A Coli poliposis adenomatosa 1533 ? Coli poliposis adenomatosa 1554 A Coli poliposis adenomatosa 1555 ? Coli poliposis adenomatosa 1556 ? Coli poliposis adenomatosa 1563 GACCT Coli poliposis adenomatosa 1924 ?? Tumores desmoldes TABLA XI: INSERCIONES/ELIMINACIONES PEQUEÑAS Ubicación Eliminación Inserción Fenotipo /codon 538 GAAGAcTTACAGCAGG gaa Coli poliposis adenomatosa 620 CTTACttaCCGGAGCCAG ct Coli poliposis adenomatosa 728 AATctcatGGCAAATAGG ttagcagctttaa Coli poliposis adenomatosa 971 GATGgtTATGGTAAAA taa Coli poliposis adenomatosa TABLA XII: ELIMINACIONES GRUESAS 2 kb incluyendo ej . 11 Coli poliposis adenomatosa 3 kb I10E11-1.5 kb a I12E13- Coli poliposis adenomatosa 170bp 335bp nt. 1409-1743 ej.11-13 Coli poliposis adenomatosa 6kb incl . Ej . 14 Coli poliposis adenomatosa 817 bp I13E14-679 a I13E14+138 Coli poliposis adenomatosa Ej . 11-15M Coli poliposis adenomatosa Ej . 11-3 'UTR Coli poliposis adenomatosa ej . 15A - ej . 15F Coli poliposis adenomatosa Ej. 4 Coli poliposis adenomatosa Ej . 7 , 8 y 9 Coli poliposis adenomatosa ej . 8 a más allá ej . 15F Coli poliposis adenomatosa Ej . 8 - ej . 15F Coli poliposis adenomatosa Ej . 9 Coli poliposis adenomatosa > lOmb (del 5q22) Coli poliposis adenomatosa TABLA XIII: INSERCIONES Y DUPLICACIONES GRUESAS Descripción Fenotipo Inserción de 14bp nt . 3816 Coli poliposis adenomatosa Inserción de 22 bp nt . 4022 Coli poliposis adenomatosa Duplicación de 43 bp cd. 1295 Coli poliposis adenomatosa Inserción de 337 bp de Alu I Tumores desmoldes secuencia cd. 1526 TABLA XIV: RECOLOCACIONES DE COMPLEJO (VERSIONES INCLUIDAS) A-T nt. 4893 Q1625H, Del C nt. Coli poliposis adenomatosa 4897 cd. 1627 Del 1099 bp I13E14-728 a Coli poliposis adenomatosa E14I14+156, ins 126 bp Del 1601 bp E14I14+27 a Coli poliposis adenomatosa E14I14+1627, ins 180 bp Del 310 bp, ins. 15 bp nt. 4394, Coli poliposis adenomatosa cd 1464 Del A y T cd. 1395 Coli poliposis adenomatosa Del TC nt 4145, Del TGT nt . 4148 Coli poliposis adenomatosa Del T, nt. 983, Del. 70 bp, nt. Coli poliposis adenomatosa 985 Del. nt. 3892-3903, ins ATTT Coli poliposis adenomatosa TABLA XV: APLICACIONES DE DIAGNOSTICO Tipo de Marcador Aplicación Referencia cáncer Mama Detección de Usando los métodos aquí D. Xie et descritos diseñar el Her2/Neu - al., J, Nati segundo cebador de manera polimorfismo Cáncer tal que después de la PCR, en el codón y la digestión con la Institute, 655 enzima de restricción se 92, 412 genere una colgadura 5' (GTC/valina a (2000) que contiene una secuencia ATC/isoleucina de ADN para el codón 655 K.S. ilson [Val (655) lie] ) de Her2/Neu. Se puede et al . , Am J detectar o cuantificar Panthol . , Her2/Neu como un marcador posible para el cáncer de 161, 1171 mama. Los métodos aquí (2002) descritos pueden detectar L . Newman el alelo mutante y el alelo normal, aun cuando Cáncer el alelo mutante sea -una Control , 9 , fracción pequeña de una 473 (2002) ADN total . La terapia de herceptina para cáncer de mama se basa en la separación por exclusión para Her2. Entre mas pronto se pueda detectar el alelo mutante, se puede suministrar más rápido la terapia . 2 Mama/ Hipermetiláción Los métodos aquí M. Esteller Ovarico de BRCA1 descritos pueden usarse et al . , New para diferenciar entre England Jnl tumores que resultan de Med, 344, 539 la mutaciones heredadas (2001) BRCA1 y aquellas de la metilación anormal no heredada del gen Vej iga Análisis de Los métodos aquí W.G.Bas et microsatelite descritos se pueden al., Clinical del ADN de aplicar a un análisis de Cáncer Res, tumor libre en un microsatélite y a un 9, 257 (2003) orina, suero y análisis de mutación plasma FGFR3 para la detección M. Utting et del cáncer de vej iga . al . , Clincal Los métodos aquí C ncer Res . , descritos proporcionan 8,35 (2002) un método no invasor para la detección del L. Mao, D. cáncer de ve iga Sindransky et al., Science, 271, 669 (1996) 0 Pulmón Análisis de Los métodos aquí T. Liloglou et microsatélite descritos se pueden usar al . , Cáncer del ADN del para detectar las Research, esputo mutaciones en las 61,1624, muestras de esputo y se (2001) pueden notablemente M. Tockman et reforzar la precisión de al . , Cáncer la selección de cáncer Control, 7, 19 de pulmón preclínico (2000) . Field et al . , Cáncer Research, 59, 2690 (1999) Cérvico Análisis del Los métodos aquí N. Muñoz et genotipo HPV descritos se pueden usar al New para detectar el Sngland Jnl genotipo HPV a partir de Med, 348, 518 una preparación de (2003) muestra cervical Cuello y Alteraciones Los métodos aquí descritos M. Spafford et cabeza especificas de se pueden usar para al . Clinical tumor en detectar cualquiera de los Cáncer células 23 marcadores de Research, 17, mucosales microsatélite que se 607 (2001) orales asocian con carcinoma de A. El-Naggar exfoliadas célula escamosa de cabeza et al., J. (marcadores de y cuello (H SCC) . Mol. Diag., 3, microsatélite) 164 (2001) Colo- Separación por Los métodos agui B. Ryan et rrectal exclusión para descritos se pueden usar al. Gut, 52, la mutación en para detectar las 101 (2003) los genes K- mutaciones K-ras 2 que ras2 y APC. se puede usar como un indicador de prognosis para el cáncer colorrectal . APC (ver ejemplo 5) Próstata Hipermetilacion Los métodos aquí P . Cairns et GSTPl descritos se pueden usar al Clin Can. para detectar la Res, 7, 2727 hipermetilacion de GSTPl (2001) en orina de pacientes con cáncer de próstata, esto puede ser un indicador mas preciso que el PSA.

VIH CARDIOLOGÍA Insuficieneia Polimorfism Los métodos aquí K. Sitia11 et cardiaca o sinérgico descritos se pueden al. New Eng, congestiva de los usar para formar los Jnl Med., receptores genotipos de estos 347, 1135 adrenérgicos lugares cromosomales (2002) betal y y se pueden ayudar a alfa2c identificar a personas que tiene alto riesgo de insuficiencia cardiaca.

EJEMPLO 8 Los polimorfismos de nucleótido sencillos (SNP) representan la forma más común de variación de secuencia; se han estimado tres millones con SNP común con una frecuencia de población de sobre el 5% para presentarse en el genoma humano. Un mapa genético usando estos polimorfismos como una guía se ha desarrollado (http: //research.marshfieldclinic. org/genetics/; dirección de Internet desde el 13 de febrero de 2003) . La frecuencia de alelo varía del SNP al SNP; la frecuencia de alelo de un SNP puede ser de 50:50, mientras que la frecuencia de alelo de otro SNP puede ser 90:10. Entre más cercana la frecuencia del alelo esté en 50:50, más posiblemente cualquier individuo particular será heterocigoto a tal SNP. El consorcio de SNP proporciona una información de frecuencia de alelo para algunos SNP, pero no para otros. www . snp. chsl . org . La frecuencia de alelo para un SNP particular proporciona información valiosa como para la utilidad de tal SNP para el método de separación por exclusión prenatal no invasor descrito en el Ejemplo 5. Aunque todos los SNP pueden usarse, los SNP con frecuencias de alelo cercanas a 50:50 son preferibles. Brevemente, la sangre maternal contiene ADN fetal. El ADN maternal puede distinguirse del ADN fetal al examinar los SNP en donde la madre es homocigótica . Por ejemplo, en SNP X, el ADN material puede ser homocigoto para guanina. Si el ADN de plantilla obtenido del plasma de una hembra preñada es heterocigoto , como se demuestra por la detección de señales correspondientes al un alelo de adenina y un alelo de guanina, el alelo de adenina puede usarse como una guía para el ADN fetal (ver ejemplo 5) . Entre más cercana la frecuencia del alelo de un SNP esté a 50:50, más posiblemente habrá diferencia de alelo en un SNP particular entre el ADN material y el ADN fetal . Por ejemplo, si en el SNP X los alelos observados son adenina y guanina, y eí SNP tiene una frecuencia de alelo de 90 (A): 10(G), es posible que tanto madre y padre sean homocigotos para adenina en tal SNP particular. De esta manera, tanto el ADN maternal como el ADN fetal será homocigoto para adenina, y así no se distingue la señal del ADN fetal. Sin embargo, si en SNP X la frecuencia de alelo es 50:50, y la madre es homocigótica para adenina, la probabilidad es mayor de que el ADN paternal contenga un alelo de guanina en SNP X. Abajo, se proporciona un método para determinar la frecuencia de alelo para un SNP. Se analizan siete SNP localizados en el cromosoma 13. El método se puede aplicar a cualquier SNP que incluyen, pero no se limitan a, los SNP en cromosomas humanos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X e Y.

Preparación del ADN de Plantilla Para determinar la frecuencia de alelo de un SNP particular, el ADN obtenido de doscientos cincuenta individuos después de que han garantizado su consentimiento informado. De cada individuo, se colectó una muestra de 9 mi de sangre en un tubo estéril (Fischer Scientific, 9 mi EDTA tubos Vacuette, número de catálogo NC9897284) . Los tubos se giran a 1000 rp durante diez minutos. El sobrenadante (el plasma) de cada muestra se removió, y un mililitro de la muestra de sangre restante, que se refiere comúnmente como el "recubrimiento de piel humana" se transfirió a un tubo nuevo. Un mililitro de 1XPBS se agregó a cada muestra. Se aisló el ADN de plantilla usando el kit QIAmp DNA Blood Midi suministrado por QIAGEN (número de catálogo 51183) . El ADN de plantilla se aisló como por las instrucciones incluidas en el kit. De cada individuo, 0.76µg del ADN se agrupó junto, y el ADN agrupado se usó en todas las reacciones posteriores.

Diseño de Cebadores El SNP TSC0903430 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5 ' GTCTTGCATGTAGAATTCTAGGGACGCTGCTTTTCGTC3 ' Segundo cebador : 5' CTCCTAGACATCGGGACTAGAATGTCCAC3 ' El primer cebador contuvo un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, y se diseñó para combinar pares básicos de ochenta y dos bases del lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BsmF I . La SNP TSC0337961 se amplificó usando el siguiente conjunto de cebadores: Primer cebador: 5'ACACAAGGCAGAGAATTCCAGTCCTGAGGGTGGGGGCC3 ' Segundo cebador: 5 ' CCGTGTTTTAACGGGACAAGCTGTTCTTC3 ' El primer cebador contuvo un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI , y se diseñó para combinar pares básicos de noventa y dos bases del lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BsmFI . La SNP TSC0786441 se amplificó usando el siguiente conjunto de cebadores: Primer cebador: 5 ' GTAGCGGAGGTTGAATTCTATATGTTGTCTTGGACATT3 ' Segundo cebador: 5 ' CATCAGTAGAGTGGGACGAAAGTTCTGGC3 ' El primer cebador contuvo un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, y se diseñó para combinar pares básicos de ciento cuatro bases del lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BsmF I. La SNP TSC1168303 se amplificó usando el siguiente conjunto de cebadores: Primer cebado : 5'ATCCACGCCGCAGAATTCGTAT.TCATGGGCATGTCAAA3 ' Segundo cebador : 5 ' CTTGGGACTATTGGGACCAGTGTTCAATC3 ' El primer cebador contuvo un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, y se diseñó para combinar pares básicos de sesenta y cuatro bases del lugar cromosomal de interés. El segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BsmF I. La SNP TSC0056188 se amplificó usando el siguiente conjunto de cebadores: Primer cebador : 5 ' CCAGAAAGCCGTGAATTCGTTAAGCCAACCTGACTCCA3 ' Segundo cebador : 5 ' TCGGGGTTAGTCGGGACATCCAGCAGCCC3 ' El primer cebador contuvo un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, y se diseñó para combinar pares básicos de ochenta y dos bases del lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BsmF I.

La SNP TSC0466177 se amplificó usando el siguiente conjunto de cebadores: Primer cebador: 5 ' CGAAGGTAATGTGAATTCCAAAACTTAGTGCCACAATT3 ' Segundo cebador: 5 'ATACCGCCCAACGGGACAGATCCATTGAC3 ' El primer cebador contuvo un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Eco I, y se diseñó para combinar pares de noventa y dos bases del lugar cromosotnal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BsmF I. La SNP . SC0197424 se amplificó usando el siguiente conjunto de cebadores: Primer cebador: 5 'AGAAACCTGTAAGAATTCGATTCCAAATTGTTTTTTGG3 ' Segundo cebador: 5 ' CGATCATAGGGGGGGACAGGAGAGAGCAC3 ' El primer cebador contuvo un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, y se diseñó para combinar pares básicos de ciento cuatro bases del lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BsmF I. El primer cebador se diseñó para combinar pares básicos en varias distancias del lugar cromosomal de interés. El técnico experto comprende que la ubicación de la combinación de pares básicos del primer cebador puede ser cualquier distancia del lugar cromosomal de interés que incluye pero no se limita a 5-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-10, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-140, 141-160, 161-180, 181-200, 201-220, 221-240, 241-260, 261-280, 281-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-1000, 1001-2000, 2001-3000, o mayor que 3000. Todos los lugares de interés se amplificaron a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción de la cadena polimerasa (PCR, patentes norteamericana Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas aquí por referencia). En este ejemplo, los lugares de interés se amplificaron en tubos de reacción por separado pero que pueden también amplificarse junto con una reacción PCR sencilla. Para incrementar la especificidad, se usó un PCR "inicio en caliente" . Las reacciones PCR se realizaron usando un kit Mix Master HotStarTaq suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad del ADN de plantilla y cebador por reacción puede optimizarse para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, 40 ng del ADN genómico de plantilla de humano (una mezcla de ADN de plantilla de 245 individuos) y se usó 5 µ de cada cebador. Se realizaron . cuarenta ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones de PCR. (1) 95°C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 37°C durante 30 segundos; (3) 95 °C durante 30 segundos; (4) 57°C durante 30 segundos; (5) 95 °C durante 30 segundos; (6) 64°C durante 30 segundos; (7) 95°C durante 30 segundos; (8) repetir las etapas 6 y 7, treinta y nueve (39) veces ; (9) 72°C durante 5 minutos. En el primer ciclo de PCR, la temperatura de la combinación de pares básicos fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región de la combinación de pares básicos 3' de los cebadores secundarios, la cual fue de 37°C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el segundo ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región 3', que combina pares básicos para el ADN de plantilla, del primer cebador, que fue de 57°C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el tercer ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador, que fue de 6 °C. La temperatura de la combinación de pares básicos para los ciclos restantes fue de 64 °C. Al realizar una escala de la temperatura de la combinación de pares básicos a partir de TM1 a TM2 a TM3 en los primeros tres ciclos de PCR mejora ampliamente la especificidad. Estas temperaturas de la combinación de pares básicos son representativas, y el técnico experto comprenderá que las temperaturas de la combinación de pares básicos para cada ciclo dependen de los cebadores específicos usados. Las temperaturas y tiempos para desnaturalizar, combinar pares básicos y de extensión, pueden optimizarse mediante varios entornos de prueba usando los parámetros que producen los mejores resultados. Purificación del fragmento de interés Los productos de PCR se separaron de los reactivos de PCR no usados. Después de la reacción de PCR, se mezclaron ¾ del volumen de la reacción para SNP TSC0903430, SNP TSC0337961 y SNP TSC0786441 al mismo tiempo en un tubo de la reacción sencilla. La mitad de los volúmenes de reacción de los SNP TSC1168303, TSC0056188, TSC0466177 y TSC0197424 se agruparon juntos en un tubo de reacción sencilla. Los cebadores no usados y los nucleótidos se eliminaron de la reacción usando kits de purificación PCR Qiagen MinElute (Qiagen, Número de catálogo 28004) . Las reacciones se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante proporcionadas en las columnas . Digestión de la enzima de restricción de los fragmentos aislados Los productos de PCR purificados se digirieron con la enzima de restricción BsmF - 1, que enlazan al sitio de reconocimiento incorporado en los productos de PCR del segundo cebador. Los productos de digestión se llevaron a cabo en tubos eppendorf siguiendo las instrucciones proporcionadas con la enzima de restricción. Incorporación del nucleótido etiquetado Los productos de digestión de la enzima de restricción con BsmF I produjo un fragmento de ADN con una colgadura 5' contenida en el sitio SNP o lugar cromosomal de interés, y un extremo retirado 3'. La colgadura 5' funcionó como una plantilla que permite la incorporación de un nucleótido o nucleótidos en presencia de una polimerasa de ADN. Como se discutió en detalle en el ejemplo 6, la secuencia de ambos alelos de un SNP puede determinarse con un nucleótido etiquetado en presencia de otros nucleótidos no etiquetados . Los siguientes componentes se añadieron a cada relleno en la reacción: 1 µ? del ddGTP etiquetado fluorescentemente, 0.5 µ? de ddNTP no etiquetados (40 µ?) , que contienen todos los nucleótidos excepto guanina, 2 µ? de la solución amortiguadora secuenasa lOx, 0.25 µ? de la Secuenasa y el agua como fuera necesario para una reacción de 20 µ? . El relleno en la reacción se realizó a 40°C durante 10 minutos. La secuenasa fue la polimerasa de ADN usada en este ejemplo. Sin embargo, cualquier polimerasa de ADN puede usarse para una reacción en relleno, que incluye pero no se limita a E. coli de polimerasa de ADN, fragmento Kleno de E. coli de la polimerasa I de ADN, polimerasa de ADN T7, polimerasa de ADN T4, polimerasa Taq, polimerasa de ADN Pfu, polimerasa de ADN Vent, polimerasa del bacteriófago 29 y la polimerasa de ADN genómica REDTaq™. El ddNTP etiquetado no fluorescente se compró de Fermentas Inc. (Hanover, MD) . Todos los otros reactivos de etiqueta se obtuvieron de Amersham (Kit Core Sequencing Cycle Terminator Dye Sequenase Termo, US 79565) . Detección del Lugar cromosomal de interés La muestra se cargó en una pista de 36 cm de gel de acrilamida (urea) al 5% (Bio Whittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, número de catálogo 50691) . La muestra se sometió a una electroforesis en el gel a 3000 voltios durante 3 minutos. El gel se hizo correr durante 3 horas en un aparato de secuenciación (Secuenciador Hoefer SQ3) . El gel se eliminó del aparato y se escaneó en el escáner de modo Variable 9400 Typhoon. El nucleótido etiquetado incorporado se detectó mediante fluorescencia. Después, una colgadura 5' esquemática del TSC0056188 se reprodujo (cuando R indica el sitio variable) . La secuencia completa no se muestra, solo una porción de la colgadura. 5'CCA 3'GGT ' R T C C Posición de colgadura 1 2 3 4 Como se discute con detalle en el ejemplo 6, un nucleótido etiquetado con una porción química pude usarse para determinar la secuencia de los alelos de un lugar cromosomal de interés. Los nucleótidos observados para TSC0056188 en la hebra de sentido 5' (descrito aquí como la hebra superior) son adenina y guanina. La tercera posición en la colgadura en la hebra antisentido es citosina, la cual es complementaria a la guanina. Como el sitio variable puede ser adenina o guanina, ddGTP etiquetado fluorescentemente en presencia de dCTP no etiquetado, dTTP, el dATP se usa para determinar la secuencia de ambos alelos . Las reacciones en relleno para un homocigoto individual de guanina, homocigoto de adenina o heterocigoto se esquematizan abajo. Homocigoto de adenina: 5'CCA A A G* 3'GGT T T C C Posición de colgadura 1 2 3 4 Homocigoto de guanina: 5 ' CCA G* 3'GGT C T C C Posición de colgadura 1 2 3 4 Heterocigoto : Alelo 5'CCA G* 3'GGT C T C C Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 5'CCA A A G* 3'GGT T T C C Posición de colgadura 1 2 3 4 Como se observa en la figura 14, se detectan dos bandas para SNP TSC0056188. La banda inferior correspondiente a las moléculas de ADN llenas con ddGTP en una posición complementaria para la colgadura, la cual es representativa del alelo de guanina. La banda más alta, separada por una banda sencilla de la banda inferior, correspondiente a las moléculas de ADN llenas con ddGTP en la posición 3 complementaria a la colgadura. Esta banda representó el alelo de adenina. La intensidad de cada banda fue intensa, indicando que cada alelo estuvo bien representada en al población. La sNP TSC0056188 es representativa de un SNP con una frecuencia de alelo alta. Después, una colgadura 5' esquemática generada después de la digestión con BsmF para SNP TSC0337961 se reprodujo (cuando R indica el sitio variable) . La secuencia completa no se muestra, solo una porción de la colgadura. 5 ' CCA 3'GGT R G C T Posición de colgadura 1 2 3 4 Los nucleótidos observados de SNP TSC0337961 en la hebra de sentido 5' (descrito aquí como la hebra superior) son adenina y guanina. La tercera posición en la colgadura de la hebra antisentido fue citosina, la cual es complementaria a la guanina. Como el sitio variable puede ser adenina o guanina, el ddGTP etiquetado fluorescentemente en presencia de dTTP, dCTP no etiquetado, el dATP se usó para determinar la secuencia de ambos alelos. Las reacciones del relleno para un homocigoto individual de guanina, homocigoto de adenina o heterocigoto se esquematizan abajo. Homocigoto para la guanina: 5 ' GCCA G* 3'CGGT C G C T Posición de . colgadura 1 2 3 4 Heterocigoto para la adenina: 5 ' GCCA A C G* 3'CGGT T G C T Posición de colgadura 1 2 3 4 Heterocigoto Alelo 1 5 'GCCA G* 3'CGGT C G C T Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5 'GCCA A C G* 3'CGGT T G C T Posición de colgadura 1 2 3 4 Como se observa en la figura 14 , se observó una banda que migra a la posición de la banda de peso molecular bajo esperado. Esta banda representa las moléculas de ADN llenas 47 con ddGTP en una posición complementaria a la colgadura, que representa el alelo de guanina. No se detectó la banda correspondiente para las moléculas de ADN llenas con ddGTP en la posición 3 complementaria a la colgadura. La SNP TSC0337961 es representativa de un SNP que no es muy variable dentro de la población. De los siete SNP analizados, cuatro de los SNP (TSC1168303, TSC0056188, TSC0466177 y TSC0197424 tuvieron frecuencias altas de alelos. Dos bandas de alta intensidad se observaron para cada uno de los cuatro SNP, indicando que ambos alelos fueron bien representados en la población. Sin embargo, no es necesario que los SNP tengan frecuencias de alelo de 50:50 para que sean útiles. Todos los SNP proporcionan información útil. Los métodos descritos aquí proporcionan una técnica rápida para determinar la frecuencia de alelos de un SNP, o cualquier sitio variable que incluye pero no se limita a señalar las mutaciones. Las frecuencias de alelos de 50 :50, 51 :49, 52: 48, 53:47, 54:46, 55 :46, 57:43, 58 :42, 59 :41, 60 :40, 61 :39, 62 :38, 63 :37, 64:36, 65:35, 66 :34, 67 :33, 68 :32, 69 :31, 70 :30, 71:29, 72:28, 73:27, 74 :26, 75 :25, 76 :24, 77:23, 78 :22 , 79:21, 80:20, 81:19, 82 :18, 83 :17, 84 :16, 85 :15, 86 :14, 87 : 13 , 88:12, 89:11, 90 :10, 91 : 9, 92 :8, 93: 7, 94:6, 95 : 5, 96 :4, 97:3, 98:2, 99:1 y 100:0 pueden ser útiles. Se observaron dos bandas para SNP TSC0903430. Una banda, 4 la banda con peso molecular inferior representa las moléculas de ADN llenas con ddGTP etiquetadas. Una banda de intensidad más débil se observó para las moléculas llenas con ddGTP etiquetadas en la posición 3 complementaria a la colgadura, la cual representa el alelo de citosina. El SNP TSC0903430 representa un SNP con una variación de frecuencia de alelos baja. En la población, la mayoría de los individuos llevan el alelo guanina, pero el alelo de citosina se encuentra aún presente . Una banda de intensidad alta se observó para SNP TSC0337961 y la SN TSC0786441. La banda detectada para SNP TSC0337961 y SNP TSC0786441 corresponden a las moléculas de ADN llenas con ddGTP en la posición 1 complementaria a la colgadura. No se detectó una señal de las moléculas de ADN que pudieran haberse llenado en una posición 3 complementaria a la colgadura, que podrían representar el alelo secundario. El SNP TSC0337961 y SNP TSC0786441 representan SNP con poca variabilidad en la población. Como se demuestra en la figura 14, El primer cebador usado para amplificar cada lugar cromosomal de interés puede diseñarse para combinar pares básicos en varias distancias del lugar cromosomal de interés . Esto permite que los SNP múltiples sean analizados en al misma reacción. Al diseñar El primer cebador para combinar pares básicos en distancias especificas del lugares de interés, cualquier número de 49 lugares puede analizarse en una reacción sencilla que incluye pero no se limita a 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91-100, 111-120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190, 191-200, 201-300, 301-400, 401-500, y mayores de 500. Como se discutió en el ejemplo 6, algunos tipos de enzimas de restricción del tipo II muestran patrones de corte alternos. Por ejemplo, la enzima de restricción BsmF tipo IIS típicamente cortes de 10/14 de su sitio de enlace; sin embargo, la enzima puede cortar también 11/15 de su sitio de enlace. Para eliminar el efecto del corte alterno, el nucleótido etiquetado usado para la reacción de relleno de tal forma que no sea complementario en al posición 0 de la colgadura generada por el corte 11/15 (discutido en detalle en el ejemplo 16) . por ejemplo, si su etiqueta con ddGTP, el nucleótido que precede al sitio variable de la hebra llena, no debe ser guanina. La colgadura 11/15 generada por BsmF I para el SNP TSC0056188 se describe abajo, con el sitio variable en negritas: Colgadura 11/15 para TSC0056188 Alelo 1 5' CC 3'GG T C T C Posición de colgadura 0 1 2 3 Alelo 2 5 ' CC 3'GG T T C C Posición de colgadura 0 1 2 3 Después de la reacción en relleno con ddGTP etiquetado, dATP no etiquetado, dTTP y dCTP, se generan las siguientes moléculas : 11/15 Alelo 1 5' CC A G* 3'GG T C T C Posición de colgadura 0 1 2 3 11/15 Alelo 2 5'CC A A A G* 3'GG T T T C Posición de colgadura 0 1 2 3 Se observaron dos señales; una banda correspondiente a las moléculas llenas con ddGTP en una posición de la colgadura, y otra banda correspondiente a las moléculas llenas con ddGTP en la posición 3 complementaria a la colgadura. Estas son las mismas moléculas generadas después de la reacción en relleno de la colgadura 10714. Así, las dos bandas pueden compararse sin cualquiera de los cortes alternos. Este método de etiquetación con un nucleótido sencillo elimina cualquier error' generado a partir de las propiedades de corte alternos de las enzimas . Los métodos descritos aquí se aplican para determinar la frecuencia de alelos de cualquier SNP, que incluye pero no se limita a SNP en los cromosomas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X e Y.

EJEMPLO 9 Por definición, los SNP heterocigotos , difieren por un nucleótido. En el SNP heterocigoto, el alelo 1 y el alelo 2 pueden presentarse en una relación 1:1. Sin embargo, es posible que la polimerasa de ADN pueda incorporar un nucleótido en una proporción más segura que otros nucleótidos, así, la proporción observada de un SNP heterocigoto puede diferir de la relación 1:1 teóricamente esperada . Después, los métodos se describen de tal forma que permiten un cálculo seguro y eficiente para la relación esperada del alelo 1 al alelo 2 en el SNP heterocigoto. Preparación del ADN de plantilla El ADN de plantilla se obtuvo a partir de veinticuatro individuos después de que la aprobación ha sido concedida. De cada individuo, una muestra de 9 mi de sangre se recogió en un tubo estéril (Fischer Scientific, tubos de Vacuette EDTA, número de catálogo NC9897284) . Los tubos se hicieron girar a 1000 r.p.m. durante diez minutos sin interrupción. El sobrenadante (el plasma) de cada muestra se retiró y un mililitro de la muestra sanguínea restante que es referida comúnmente como la "cubierta esponjosa" se trasfirió a un nuevo tubo. Un mililitro de PBS se añadió IX a cada muestra.

El ADN de plantilla se aisló usando un kit Midi Blood de ADN QIAmp proporcionado por QIAGEN (número de catálogo 51183) . El ADN de plantilla se aisló conforme a las instrucciones incluidas en el kit . Diseño de Cebadores SNP TSC0607185 se amplificó usando el siguiente conjunto de cebadores : primer cebador : 5 ' ACTTGATTCCGTGAATTCGTTATCAATAAATCTTACAT3 ' segundo cebador: 5 ' CAAGTTGGATCCGGGACCCAGGGCTAACC3 ' SNP TSC1130902 se amplificó usando el siguiente conjunto de cebadores : primer cebador : 5 ' TCTAACCATTGCGAATTCAGGGCAAGGGGGGTGAGATC3 ' segundo cebador : 5 ' TGACTTGGATCCGGGACAACGACTCATCC3 ' El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI . El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmFI . El primer cebador se diseñó para combinar pares básicos en varias distancias del lugar cromosomal de interés . El primer cebador para SNP TSC0607185 se diseñó para combinar pares básicos de noventa bases del lugar cromosomal de interés. El primer cebador para el SNP TSC1130902 se diseño para combinar pares básicos de sesenta bases del lugar cromosomal de interés . Todos los lugares de interés se amplificaron a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción de la cadena polimerasa (PCR, patentes norteamericanas Nos. 4, 683,195 y 4,683,202 incorporada aquí por referencia). En este ejemplo, el lugares de interés se amplificó en tubos, de reacción por separado pero que podrían amplificarse también al mismo tiempo en una reacción de PCR sencilla. Para incrementar la especificidad, se usó PCR de "inicio, en caliente" . Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando el kit Mix Master HotStar Taq proporcionada por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de cebador y de ADN de plantilla por reacción pueden optimizarse para cada lugar cromosomal de interés pero en este ejemplo se usaron 40 ng del ADN genómico de humano de plantilla y 5 µ? de cada cebador. Se realizaron cuarenta ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones de PCR: (1) 95°C durante 15 minutos y 15 segundos ; (2) 37°C durante 30 segundos ; (3) 95°C durante 30 segundos ; (4) 57°C durante 30 segundos ; (5) 95°C durante 30 segundos ; (6) 64°C durante 30 segundos ; (7) 95°C durante 30 segundos ; (8) repetir las etapas 6 y 7, treinta veces ; (9) 72°C durante 5 minutos. En el primer ciclo de PCR, la temperatura de la combinación de pares básicos fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región de la combinación de pares básicos 3' de los cebadores secundarios, la cual fue 37°C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el segundo ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región 3', que combina pares básicos al ADN de plantilla, del primer cebador, que fue de 57°C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el tercer ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador, fue de 64°C. La temperatura de la combinación de pares básicos para los ciclos restantes fue de 64°C. Al realizar una escala de la temperatura de la combinación de pares básicos a partir de TM1 a T 2 a TM3 en los primeros tres ciclos de PCR mejora ampliamente la especificidad. Estas temperaturas de la combinación de pares básicos son representativas, y el técnico experto comprenderá que las temperaturas de la combinación de pares básicos para cada ciclo dependen de los cebadores específicos usados. Las temperaturas y tiempos para desnaturalizar, combinar pares básicos y de extensión, pueden optimizarse mediante varios entornos de prueba usando los parámetros que producen los mejores resultados.

Purificación del fragmento de interés Los productos de PCR se separaron del ADN de plantilla genómico. Una parte de la reacción de PCR se trasfirió a un pozo de un a placa de enlace elevado, transparente, Pozo Strepta ell de Roche Diagnostics GMBH (número de catálogo 1 645 692, como se lista en Roche Molecular Biochemicals, catálogo Biochemicals 2001) . Los primeros cebadores contuvieron una etiqueta 5' de biotina enlazando así los productos de PCR a los pozos revestidos con estreptavidina mientras que para la plantilla genómica no se hizo lo mismo. La reacción de enlace de estreptavidina se realizó usando un termomezclador (Eppendorf) a 1000 r.p.m. durante 20 minutos a 37°C. Cada pozo se aspiró para retirar el material no enlazado, se lavó tres veces con PBS IX, con un mezclado moderado (Kandpal et al., Nucí. Acids. Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka et al., Biotechniques 10.30-34 81991); Green et al., Nucí. Acids Res. 18:6163-6164,(1990)). Digestión de la enzima de restricción de los fragmentos aislados Los productos de PCR purificados se digirieron con la enzima de restricción BsmF 1, que enlazan al sitio de reconocimiento incorporado en los productos de PCR del segundo cebador. Los productos de digestión se llevaron a cabo en los pozo Streptawells siguiendo las instrucciones proporcionadas con la enzima de restricción. Después de la digestión, los pozos se lavaron tres veces con PBS para retirar los fragmentos escindidos. Incorporación del nucleotido etiquetado Los productos de digestión de la enzima de restricción con BsmF I producen un fragmento de ADN con una colgadura 5' contenida en el sitio SNP o lugar cromosomal de interés, y un extremo retirado 3'. La colgadura 5' funcionó como una plantilla que permite la incorporación de un nucleotido o nucleótidos en presencia de una polimerasa de ADN. Como se discutió detalladamente en el ejemplo 6, la secuencia de ambos alelos de un SNP puede determinarse usando un nucleotido etiquetado en presencia de otros nucleótidos no etiquetados. Los siguientes componentes se añadieron a cada relleno en la reacción: 1 µ? de ddGTP etiquetado fluorescentemente, 0.5 µ? de ddNTP no etiquetado (40 µ?) , que contienen todos los nucleótidos excepto guanina, 2 µ? de la solución amortiguadora secuenasa lOx, 0.25 µ? de la Secuenasa y el agua como fuera necesario para una reacción de 20 µ? . El relleno en la reacción se realizó a 40°C durante 10 minutos. La ddNTP etiquetada fluorescentemente se compró de Fermentas Inc. (hanover. MD) . Todos los reactivos de etiqueta se obtuvieron de Amersham (Termo secuenasa Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565) . Después del etiquetado, cada pozo Streptawell se enjuagó con PBS IX (100 µ?) tres veces. Los fragmentos "en relleno" se liberaron entonces de los pozo Streptawells mediante la digestión con la enzima de restricción EcoRI, de acuerdo a las instrucciones del fabricante que son suministradas con la enzima. La digestión se realizó durante 1 hora a 37°C con agitación a 120 r.p.m. Detección del Lugar cromosomal de interés Las muestras se cargaron en una pista de 36 cm de gel de acrilamida (urea) al 5% (Bio Whittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, número de catálogo 50691) . Las muestras se sometieron a una electroforesis en gel a 30.00 voltios durante 3 minutos. El gel se hizo correr durante 3 horas en un aparato de secuenciación (Secuenciador Hoefer SQ3) . El gel se eliminó del aparato y se escaneó en el escáner de modo Variable 9400 Typhoon. El nucleótido etiquetado incorporado se detectó mediante fluorescencia. Se extrajo un recuadro alrededor de cada banda y la intensidad de la banda se calculó usando un programa de escáner de modo variable Typhoon 9400. Después, se muestra una colgadura esquemática 5' para SNP TSC0607185. La secuencia de ADN completa no se reproduce, solo la porción que demuestra la colgadura (en donde R indica el sitio variable) . C C T R TGTC 3' ACAG 5' 4 3 2 1 Posición de colgadura Los nucleótidos observados en el sitio variable para TSC0607185 en la hebra de sentido 5' (descritos aquí como la hebra superior) son ' citosina y timidina (descrita aquí como R) . En este caso, el segundo cebador que combina pares básicos el lugar cromosomal de interés, que permite la reacción en relleno se presenta en la hebra antisentido (descrita aquí como la hebra profunda) . La hebra antisentido se llenará en la guanina o adenina. La segunda -posición en la colgadura 5' es timidina, la cual es complementaria a la adenina, y la tercera posición en la colgadura corresponde a la citosina, que es complementaria a la guanina. La ddGTP etiquetada fluorescentemente en presencia de dCTP no etiquetada, dTTP, el dATP se usó para determinar la secuencia de ambo alelos . Después de la reacción en relleno, se generaron las siguientes moléculas de ADN: C C T C TGTC 3' alelo 1 G* ACAG 5' 4 3 2 1 posición de colgadura C C T T TGTC 3' alelo 1 G* A A - ACAG 5' 4 3 2 1 posición de colgadura Las colgaduras generadas por un corte BsmF I 11/15 a partir del sitio de reconocimiento en TSC0607185 se describe ab jo : C T R T GTC 3' 11/15 CAG 5' 3 2 1 0 posición de colgadura Como se usa ddGTP etiquetado para la reacción en relleno, no se generará una nueva señal del corte de las moléculas 11/15 del sitio de reconocimiento. La posición 0 complementaria para la colgadura se llenó en un dATP no etiquetado. Se observaron solamente señales generadas a partir de moléculas llenas con ddGTP etiquetado en la posición 1 complementaria a la colgadura o moléculas llenas con ddGTP etiquetado en la posición 3 complementaria a la colgadura . Cinco de los veinticuatro individuos fueron heterocxgotos de SNP TSC0607185. Como se muestra en la figura 15, se detectaron dos bandas. La banda de peso molecular inferior corresponde a las moléculas de ADN llenas con ddGTP en la posición 1 complementaria a la colgadura. El peso molecular más alto corresponde a las moléculas de ADN llenas con ddGTP en la posición 3 complementaria a la colgadura. La relación de los dos alelos se calculó para cada una de las cinco muestras de heterocigoto (ver la tabla XVI) . La relación promedio del alelo 2 al alelo 1 fue 1.000 con una desviación estándar de 0.444. Por lo tanto, la relación de alelos a SNP TSC0607185 fue altamente consistente. la relación de alelos se calculó experimentalraente para un SNP particular se refiere después como el valor "p" del SNP. El análisis de SNP TSC0607185 proporcionará consistentemente una relación de alelos 1:1, con la condición que el número de genomas analizados es de una cantidad suficiente que no se genere un error de muestreo estadístico. Si la muestra contuvo un número bajo de genomas, es estadísticamente posible que los cebadores combinen pares básicos en un cromosoma sobre otro cromosoma. Por ejemplo, si la muestra contiene 40 genomas, que corresponde a un total de 40 cromosomas del alelo 1 y 40 cromosomas del alelo 2, los cebadores pueden combinar pares básicos 40 cromosomas del alelo 1 pero solamente 35 cromosomas del alelo 2. Esto podría provocar que el alelo 1 se amplifique preferentemente para el alelo 2, que podría alterar la relación del alelo 1 al alelo 2. Este problema se elimina teniendo un número suficiente de genomas en la muestra. El SNP TSC0607185 representa un SNP en donde las diferencias en el nucleótido en el sitio variable no afecten la reacción de PCR, o digestión con al enzima de restricción o la reacción en relleno. El uso de un nucleótido etiquetado con un tinte fluorescente asegura que las bandas de un alelo puedan compararse de manera segura a las bandas para el segundo alelo. No existen complicaciones adicionales al tener que comparar entre las dos pistas diferentes, o tener que corregir los coeficientes cuánticos de los tintes. Adicionalmente, cualquier efecto de las propiedades de corte alternas de las enzimas de restricción IIS han sido eliminadas . TABLA XVI: Relación del alelo 2 al alelo 1 en los SNP TSC0607185 y TSC1130902.

SNP TSC0607185 SNP TSC1130902 Después, se muestra una -colgadura 5' esquemática para SNP TSC1130902. La secuencia de ADN completa no se reproduce, solamente la porción que demuestra la colgadura (cuando R indica el sitio variable) . 5 ' TCAT 3'AAGTA R T C C Posición de colgadura 1 2 3 4 Los nucleótidos observados de TSC1130902 en la hebra de sentido 5' (descrito aquí como la hebra superior) son adenina y guanina. La segunda posición en la colgadura corresponde a un timidina y una tercera posición en la colgadura corresponde a la citosina que es complementaria a la guanina. La ddGTP etiquetada fluorescentemente en presencia de dCTP no etiquetado, dTTP, el dATP se usa para determinar la secuencia de ambos alelos . Después de la reacción en relleno, son generadas las siguientes moléculas de ADN: Alelo 1 5'TTCAT G* 3'AAGTA C T C C posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5'TTCAT A A G* 3'AAGTA T T C C ' Posición de colgadura 1 2 3 4 Como se muestra en al figura 15, se detectan dos bandas. la banda de peso molecular inferior corresponde a las moléculas de ADN llenas en el ddGTP etiquetado en al posición 1 complementari a la colgadura (el alelo G) . La banda de peso molecular más alto, separada por una base sencilla de la banda inferior corresponde a las moléculas de ADN llenas con ddGTP en al posición 3 complementaria a la colgadura (el alelo A) . Cinco de los veinticuatro individuos son heterólogos para SNP TSC1130902. Como se muestra en al figura 15, la banda corresponde al alelo 1 fue más intensa que la banda que corresponde al alelo 2. Esto se observó para cada uno de los cinco individuos . La intensidad actual de la banda que corresponde al alelo 1 varía de individuo a individuo, pero siempre es más intensa que la banda que corresponde al alelo 2. Para los cinco individuos, la relación promedio del alelo 2 al alelo 1 fue de 0.74116, con una desviación estándar de 0.017018. El ADN de plantilla se .preparó a partir de cinco diferentes individuos. Se realizaron reacciones de PCR por separado, digestiones de enzima de restricción por separado y reacciones de relleno por separado. Sin embargo, para cada ADN de plantilla, la relación del alelo 2 al alelo 1 fue alrededor de 0.75. El valor ¾p" para este SNP fue altamente consistente . Por ejemplo, para el SNP TSC1130902, el valor "p" fue 0.75. Cualquier desviación de este valor, proporciona la muestra que contiene una cantidad adecuada de genomas para eliminar los errores de muestreo, indicará que existen un número de copias anormales del cromosoma 13. Si existe una copia adicional del alelo 2, el valor "p" será más alto que el 0.75 esperado. Sin embargo, si existe una copia adicional del alelo 1, el valor "p" será más bajo que el 0.75 esperado. Con el valor "p" cuantificado para un SNP particular, el SNP puede usarse para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal . Un valor "p" correcto medido para un SNP sencillo será suficiente para detectar la presencia de una anormalidad cromosomal . Existen muchas posibles explicaciones para que la proporción de un alelo a otro alelo en algunos SNP varía a partir de la relación teóricamente esperada 1:1. Primera, es posible que la polimerasa de ADN incorpore un nucleótido más rápido que otro nucleótido. Como los alelos son amplificados por PCR, incluso una preferencia ligera de un nucleótido sobre · otro puede provocar una variación de la relación esperada 1:1. Esta preferencia potencial de un nucleótido sobre otro no se observa durante la reacción en relleno debido a que se usa el nucleótido etiquetado sencillo con un tinte. Es posible también, que el nucleótido variable en el sitio SNP tenga influencia sobre la proporción de desnaturalización de los dos alelos. Si el alelo 1 contiene una guanina y el alelo 2 contiene una adenina, la diferencia entre la resistencia de los enlaces para estos nucleótidos puede afectar la proporción en al cual las hebras de ADN se separan. Nuevamente, es importante mencionar que los alelos son ejemplificados por PCR generando diferencias muy sutiles que pueden provocar un gran impacto en el resultado final . Es posible también, que el nucleótido variable en el sitio SNP influencie la proporción en al cual las dos hebras se templen después de la separación. Alternativamente, es posible que la enzima de restricción tipo IIS corte un alelo preferiblemente para el otro alelo. Como se discutió arriba, las enzimas de restricción tipo IIS se cortan a una distancia del sitio de reconocimiento, es posible que el nucleótido variable en el sitio SNP influencie la eficiencia de la digestión de la enzima de restricción. Es posible que algunos SNP de la enzima de restricción corte un alelo con una eficacia del 100%, mientras se corta el otro alelo con una eficacia del 90%. Sin embargo, el hecho de que la relación del alelo 1 al alelo 2 se desvía de la relación teóricamente esperada 1:1, no influencia o reduce la utilidad del SNP. Como se demostró arriba, el valor "p" para cada SNP es consistente entre los distintos individuos . El valor "p" para cualquier SNP puede calcularse analizando el ADN de plantilla de cualquier número de heterologos individuales que incluyen pero no se limitan a 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91-100, 101-110, 111-120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190, 191-200, 201-210, 211-220, 221-230, 231-240, 241-250, 251-260, 261-270, 271-280, 281-290, 291-300, y mayores de 300. Los métodos descritos en la presente permiten determinar el valor "p" para cualquier SNP. Es posible que algunos SNP tengan un comportamiento más consistente que otros SNP. En el genoma humano existen más de 3 millones de SNP; no es posible especular de cómo será su comportamiento. El valor "p" para cada SNP tendrá que determinarse experimentalmente . Los métodos descritos en al presente permiten la identificación de SNP que tienen una consistencia alta y valores "p" reproducibles .

EJEMPLO 10 Como se discutió en el ejemplo 9, la relación de un alelo a otro alelo en un SNP particular puede variar de la relación teóricamente esperada 50:50. Estos SNP pueden usarse para detectar la presencia de cromosomas adicionales con la condición que la relación de un alelo a otro alelo permanece linealmente en individuos con enfermedades cromosomales . Por ejemplo, en el SNP X si el porcentaje del alelo 1 al alelo 2 es 75:25, el porcentaje esperado del alelo 1 al alelo 2 par un individuo con síndrome de Down debe ajustarse propiamente para reflejar 1 variación del porcentaje esperado en este SNP. El porcentaje del alelo 1 al alelo 2 para el SNP TSC0108992 en el cromosoma 21 se calculó usando un ADN de plantilla de cuatro individuos y ADN de plantilla de un individuo con el síndrome de Down. Como se demostró abajo, el porcentaje de un alelo a otro alelo fue consistente y permanece lineal en un individuo con síndrome de Down.

Preparación del ADN de plantilla El ADN se obtuvo a partir dé cuatro individuos con una cariotipo genético normal y un individuo identificado, que tiene una copia extra del cromosoma 21 (síndrome de Down) . El consentimiento aprobado se obtuvo de parte de todos los individuos. El consentimiento aprobado se obtuvo también de los parientes de los individuos con síndrome de Down. Para cada individuo, se recogió una muestra de 9 mi de sangre en un tubo estéril (Fischer Scientific, tubos vacuette de 9 mi de EDTA, número de catálogo NC9897284) . El ADN de plantilla se aisló usando el kit Midi Blood de ADN QIAmp por QIAGEN (número de catálogo 51183) . El ADN de plantilla se aisló conforme a las instrucciones incluidas en el kit. Diseño de los cebadores El SNP TSC0108992 se amplificó usando el primer conjunto de cebadores : primer cebador : 5 ' CTACTGAGGGCTCGTAGATCCCAATTCCTTCCCAAGCT3 ' segundo cebador : 5 'AATCCTGCTTTAGGGACCATGCTGGTGGA3 ' El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI . El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmF I . El SNP TSC0108992 se amplificó a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción de la cadena polimerasa (PCR, patente norteamericana Nos. 4,683,195 y 4,683,202 incorporadas aquí por referencia) . Para una especificidad incrementada, se usó PCR "inicio en caliente" . Las reacciones de PCR se realizaron usando un kit Mix Master HotStarTaq proporcionadas por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y la reacción por cebador puede optimizarse para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, se usaron 50 ng del ADN de plantilla genómico de humano y 5 µ? de cada cebador. Se realizaron treinta y ocho ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones de PCR. (1) 95°C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 37°C durante 30 segundos; (3) 95 °C durante 30 segundos; (4) 57 °C durante 30 segundos; (5) 95 °C durante 30 segundos; (6) 64 °C durante 30 segundos; (7) 95 °C durante 30 segundos ; (8) repetir las etapas 6 y 7, treinta y siete (37) veces ; (9) 72 °C durante 5 minutos. En el primer ciclo de PCR, la temperatura de la combinación de pares básicos fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región de la combinación de pares básicos 3' de los cebadores secundarios, la cual fue 37°C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el segundo ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región 3', que combina pares básicos al ADN de plantilla, del primer cebador, que fue de 57°C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el tercer ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador, que fue 64 °C. La temperatura de la combinación de pares básicos para los ciclos restantes fue 64°C. Al realizar una escala de la temperatura de la combinación de pares básicos a partir de TM1 a T 2 a TM3 en los primeros · tres ciclos de PCR mejora ampliamente la especificidad. Estas temperaturas de la combinación de pares básicos son representativas, y el técnico experto comprenderá que las temperaturas de la combinación de pares básicos para cada ciclo dependen de los cebadores específicos usados. Las temperaturas y tiempos para desnaturalizar, combinar pares básicos y de extensión, pueden optimizarse mediante varios entornos de prueba usando los parámetros que producen los mejores resultados. Purificación del fragmento de interés Los productos de PCR se separaron del ADN de la plantilla genómico.. Cada reacción de PCR se deslizó en dos muestras y se transfirió a dos pozos separados de un pozo Streptawell , transparente, placa de enlace alto de GMBH de diagnósticos Roche (numero de catálogo 1 645 692 , se listan en Roche Molecular Biochemicals, catálogo Biochemiclas 2001) . Para cada reacción de PCR, existen dos replicados; cada uno en un pozo por separado de una placa de microtitulación . El primer cebador contenia una etiqueta 5' de manera que los productos PCR se enlazan a los pozos revestidos con estreptavidina mientras que el ADN de plantilla no lo hacen, la reacción de enlace de estreptavidina se realizó usando un termomezclador (Eppendorf) a 1000 r.p.m. durante 20 minutos a 37 °C. Cada pozo se aspiró para eliminar el material no enlazado y se lavó tres veces con PBS IX. con mezclado moderado ( andpal et al., Nucí. Acids Res. 18:1789-1795 (1990); kaneoka et al., Biotechniques 10:30-34 (1991); Green et al., Nucí. Acids Res. 18:6163-6164 (1990)). Digestión de la enzima de restricción de fragmentos aislados Los productos de PCR purificados se digirieron con al enzima de restricción BsmF I, que enlaza el sitio de reconocimiento incorporado en los productos de PCR del segundo cebador. Los digestivos se desarrollaron en los pozo Streptawells siguiendo las instrucciones suministradas con la enzima de restricción. Después de digestión, los pozos se lavaron tres veces con PBS IX para eliminar los fragmentos escindidos . Incorporación de núcleotidos etiquetados La digestión de la enzima de restricción con BsmF I produjo un fragmento de ADN con una colgadura 5' que contuvo un sitio SNP o lugar cromosomal de interés y un extremo 3' apartado, la colgadura 5' funcionó como una plantilla que permite la incorporación de un nucleótido o nucleótidos en presencia de una polimerasa de ADN. Como se discutió en el ejemplo 6, la secuencia de ambos alelos de un SNP puede determinarse con un nucleótido etiquetado en presencia de otros nucleótidos no etiquetados. Los siguientes componentes se añadieron a cada relleno en la reacción: 1 µ? de ddTTP etiquetado fluorescentemente, 0.5 µ? de ddNTP no etiquetados (40 µ?) , que contuvo todos los nucleótidos excepto timidina, 2 µ? de uan solución amortiguadora secuenasa 10X, 0.25 µ? de Secuenasa y agua como se a necesario para una reacción de 20 µ? . El relleno en la reacción se realizó a 40 °C durante 10 minutos. El ddNTP etiquetado no fluorescentemente se adquirió de Fermentas Inc. (Hanover, MD) . Otros reactivos de etiqueta se obtuvieron de Amersham (kit Core Sequencing Cycle Terminator Dye Sequenase Termo, US 79565) . Después del etiquetado, cada pozo Streptawell se enjuagó con PBS IX (100 µ?) tres veces. Los fragmentos de ADN "rellenos" se liberaron a partir de pozo Streptawells mediante la digestión con la enzima de restricción EcoRI, de acuerdo a las instrucciones de fabricación que son suministrados con la enzima. La digestión se realizó durante 1 hora a 37°C con agitación a 120 r.p.m. Detección del Lugar cromosomal de interés Las muestras se cargaron en las pistas de un gel de 36 cm de acrilamida (urea) al ' 5% (Bio Whi-ttaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, número de catálogo 50691) . La muestra se sometió a una electroforesis en el gel a 3000 voltios durante 3 minutos. El gel se hizo correr durante 3 horas en un aparato de secuenciación (Secuenciador Hoefer SQ3) . El gel se eliminó del aparato y se escaneó en el escáner de modo Variable 9400 Typhoon. El nucleótido etiquetado incorporado se detectó mediante fluorescencia. Se extrajo un recuadro alrededor de cada banda y la intensidad de la banda se calculó usando un programa de escáner de modo variable Typhoon 9400. Después, se muestra una colgadura 5' esquemática del SNP TSC0108992. La secuencia de ADN no se reproduce, solo una porción para demostrar la colgadura (en donde la R indica el sitio variable) . GTCC3' G A C R CAGG5' 4 3 2 1 posición de colgadura Los nucleótidos observados para SNP TSC0108992 son adenina y timidina en la hebra sentido (descritos aquí como la hebra superior) . La posición 3 de la colgadura corresponde a la adenina, que es complementaria a la timidina. El ddTTP etiquetado se usó en presencia- de dATP no etiquetado, dCTP, y dGTP. Después de la reacción en relleno con ddTTP etiquetado, se generaron las siguientes moléculas de ADN: _* T G A GTCC 3' alelo 1 G A C T CAGG 5' 4 3 2 1 Posición de colgadura _* T GTCC 3' alelo 2 G A C A CAGG 5' 4 3 2 1 Posición de colgadura No existe dificultad en comparar los valores obtenidos del alelo 1 al alelo 2 debido a que un nucleótido etiquetado se usó para la reacción en relleno, y la reacción en relleno para ambos alelos presentados en un tubo sencillo. Las propiedades de corte alternas de BsmF I no podrían influenciar este análisis debido a que la colgadura 11/15 podrían llenarse justo como la colgadura 10714. Los esquemas de colgadura en relleno en 11/15 se describen abajo: T G A G TCC3' 11/15 A C T C AGG5' 3 2 1 0 posición de colgadura TCC3 ' 11/15 alelo 2 AGG5' posición de colgadu Como se observa en la figura 16, se observan dos bandas para cada muestra del ADN de plantilla. El peso molecular inferior corresponde a las moléculas de ADN llenas con ddTTP en una posición complementaria a la colgadura, y la banda del peso molecular más alto corresponde a las moléculas de ADN llena con ddTTP en la posición 3 complementaria a la colgadura. El porcentaje del alelo 2 al alelo 1 fue altamente consistente. (Ver la tabla XVII). Además, para cualquier individuo dado, los replicados de la reacción PCR mostraron resultados similares (ver la Tabla XVII) . El porcentaje del alelo 2 al alelo 1 se calculó dividiendo el valor del alelo 2 por la suma de los valores del alelo 1 y el alelo 2 (alelo 2/ (alelo 1 + alelo 2)). A partir de cuatro individuos, el porcentaje promedio del alelo 2 al alelo 1 fue 0.4773 con una desviación estándar de 0.0097. El porcentaje del alelo 2 al alelo 1 en el ADN de plantilla aislado de un individuo con síndrome de Do n fue de 0.3086. El porcentaje teóricamente esperado del alelo 2 al alelo 1 usando el ADN de plantilla de un individuo es de 0.50. Sin embargo, el porcentaje determinando experimentalmente fue de 0.4773. El porcentaje teóricamente esperado del alelo 2 al alelo 1 para un individuo con una copia extra de cromosomas 21 es 0.33. El porcentaje determinado experimentalmente del alelo 2 al alelo 1 para el SNP TSC0108992 fue de 0.3086.

La desviación del porcentaje teóricamente esperado es altamente consistente y permanece lineal. La siguiente formula demuestra que el porcentaje del alelo 2 al alelo 1 en el SNP TSC0108992 permanece lineal aún en el ADN de plantilla obtenido de un individuo con una copia extra del cromosoma 21: 0.47 X 0.50 0.33 X = 0.3102 Si el porcentaje del alelo 2 al alelo 1 que usan un ADN de plantilla obtenido de un individuo normal se determina para ser 0.47, entonces el porcentaje del alelo 2 al alelo 1 que usan el ADN de plantilla de un individuo con síndrome de Down debe ser 0.3102. La relación determinada experimentalmente fue 0.3086 con una desviación estándar de 0.00186. No existe diferencia entre el porcentaje predicho y el porcentaje determinado experimentalmente del alelo 2 al alelo 1 en el ADN de plantilla de un individuo con síndrome de Down. El porcentaje de un alelo a otro alelo en un SNP particular es altamente consistente, reproducible y lineal, esto demuestra que cualquier SNP con respecto al porcentaje calculado para un alelo a otro, pueden usarse para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad cromosomal .

TABLA XVII. Porcentaje del alelo 2 al alelo 1 en la SNP TSC0108992.

EJEMPLO 11 El porcentaje del alelo 2 al alelo 1 para un SNP particular ¦ es altamente consistente. La desviación estadísticamente significativa de la relación determinada experimentalmente indica la presencia de una anormalidad cromosomal . Después, el porcentaje del alelo 2 al alelo 1 en SNP TSC0108992 en el cromosoma 21 se calculó usando el ADN de plantilla de un individuo normal y el ADN de plantilla de un individuo con síndrome de Down. Las mezclas que contienen varias cantidades de ADN normal y ADN del síndrome de Down se prepararon y se analizaron en una forma ciega. Preparación del ADN de plantilla El ADN se obtuvo a partir de un individuo con un cariotipo genético normal y un individuo identificado que tiene una copia extra del cromosoma 21 (síndrome de Down) . El consentimiento informado se obtuvo de ambos individuos. El consentimiento informado se obtuvo también por parte de los parientes de los individuos del síndrome de Down. Para cada individuo, se recogió una muestra sanguínea en un tubo estéril (Fischer Scientific, tubos vacuette de 9 mi de EDTA, número de catálogo NC9897284) . El ADN de plantilla se aisló usando un kit Midi Blood de ADN QIAmp suministrado por QIAGEN (número de catálogo 51183) . El ADN de plantilla se aisló conforme a las instrucciones incluidas en el kit. Mezclas del ADN de plantilla El ADN de plantilla del individuo con el cariotipo normal y el ADN de plantilla del individuo con una copia extra del cromosoma 21 se diluyó a una concentración de 10 ng/µ? . Cuatro mezclas de ADN de plantilla normal y ADN de plantilla del síndrome de Down se elaboraron en la siguiente forma : Mezcla 1: 32 µ? del ADN Normal + 8 µ? del ADN del síndrome de Down Mezcla 2: 28 µ? del ADN Normal + 12 µ? del ADN del síndrome de Down. Mezcla 3: 20 µ? del ADN Normal + 20 µ? del ADN del síndrome de Down Mezcla 4: 10 µ? del ADN Normal + 30 µ? del ADN del síndrome de Down. Tres reacciones de PCR por separado se fijaron para el ADN de plantilla normal y el ADN de plantilla de un individuo con síndrome de Down. Así mismo, para cada muestra se fijaron tres reacciones de PCR por separado. Diseño de cebadores El SNP TSC0108992 se amplificó usando el siguiente conjunto de cebadores: primer cebador: 5' CTACTGAGGGCTCGTAGATCCCAATTCCTTCCCAAGCT3' segundo cebador: 5 'AATCCTGCTTTAGGGACCATGCTGGTGGA3' El primer cebador contenía- una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI . El segundo cebador contenía el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BsmF I. El SNP TSC0108992 se amplificó a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción de la cadena polimerasa (PCR, patente norteamericana Nos. 4,683,195 y 4,683,202 incorporadas aquí por referencia) . Para una especificidad incrementada, se usó PCR "inicio en caliente". Las reacciones de PCR se realizaron usando un kit Mix Master HotStarTaq proporcionadas por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y la reacción por cebador puede optimizarse para cada lugar cromosomal de interés pero en este ejemplo, 50 ng del ADN genómico de humano de plantilla y se usaron 5 uM de cada cebador. Se realizaron treinta y ocho ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones de PCR. (1) 95°C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 37 °C durante 30 segundos; (3) 95°C durante 30 segundos; (4) 57°C durante 30 segundos; (5) 95 °C durante 30 segundos; (6) 64 °C durante 30 segundos; (7) 95 °C durante 30 segundos; (8) repetir las etapas 6 y ? , treinta y siete (37) veces ; (9) 72°C durante 5 minutos. En el primer ciclo de PCR, la temperatura de la combinación de pares básicos fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región de la combinación de pares básicos 3' de los cebadores secundarios, la cual fue 37 °C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el segundo ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región 3' , que combina pares básicos al ADN de plantilla, del primer cebador, que fue de 57 °C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el tercer ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador, que fue de 64 °C. La temperatura de la combinación de pares básicos para los ciclos restantes fue de 64 °C. Al realizar una escala de la temperatura de la combinación de pares básicos a partir de T 1 a TM2 a TM3 en •los primeros tres ciclos de PCR mejora ampliamente la especificidad. Estas temperaturas de la combinación de pares básicos son representativas, y el técnico experto comprenderá que las temperaturas de la combinación de pares básicos para cada ciclo depender, de los cebadores específicos usados. Las temperaturas y tiempos para desnaturalizar, combinar pares básicos y de extensión, pueden optimizarse mediante varios entornos de prueba usando los parámetros que producen los mejores resultados. Purificación del fragmento de interés Los productos de PCR se separaron del ADN de la plantilla genómico. Cada reacción de PCR se deslizó en 'dos muestras y se transfirió a dos pozos separados de un pozo Streptawell, transparente, una placa de enlace alto de GMBH de diagnósticos Roche (numero de catálogo 1 645 692, se listan en Roche Molecular Biochemicals, catálogo Biochemiclas 2001) . Para cada reacción de PCR, existen dos replicados; cada uno en un pozo por separado de una placa de microtitulación . El primer cebador contenia una etiqueta 5' de manera de manera que los productos PCR se enlazan a los pozos revestidos con estreptavidina mientras que el ADN de plantilla no lo hacen. La reacción de enlace de estreptavidina se realizó usando un termomezclador (Eppendorf) a 1000 r.p.m. durante 20 minutos a 37°C. Cada pozo se aspiró para eliminar el material no enlazado y se lavó tres veces con PBS IX, con mezclado moderado (Kandpal et al., Nucí. Acids Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka et al., Biotechniques 10:30-34 (1991); Green et al., Nucí. Acids Res. 18:6163-6164 (1990)). Digestión de la enzima de restricción de fragmentos aislados Los productos de PCR purificados se digirieron con la enzima de restricción BsmF I, que enlaza el sitio de reconocimiento incorporado en los productos de PCR del segundo cebador. Los productos de digestión se desarrollaron en los Streptawells siguiendo las instrucciones suministradas con la enzima de restricción. Después de digestión, los pozos se lavaron tres veces con PBS IX para eliminar los fragmentos escindidos. Incorporación de nucleotidos etiquetados La digestión de la enzima de restricción con BsmF I produjo un fragmento de ADN con una colgadura 5' que contuvo un sitio SNP o lugar cromosomal de interés y un extremo 3' apartado. La colgadura 5 ' funcionó como una plantilla que permite la incorporación de un nucleótido o nucleótidos en presencia de una polimerasa de ADN. Como se discutió en el ejemplo 6, la secuencia de ambos alelos de un SNP puede determinarse con un nucleótido etiquetado en presencia de otros nucleótidos no etiquetados. Los siguientes componentes se añadieron a cada relleno en la reacción: 1 µ? de ddTTP etiquetado fluorescentemente, 0.5 µ? de ddNTP no etiquetados (40 µ?) , que contuvo todos los nucleótidos excepto timidina, 2 µ? de una solución amortiguadora secuenasa 10X, 0.25 µ? de Secuenasa y agua como se a necesario para una reacción de 20 µ?. El relleno en la reacción se realizó a 40 °C durante 10 minutos. El ddNTP etiquetado no fluorescentemente se adquirió de Fermentas Inc. (Hanover, MD) . Otros reactivos de etiqueta se obtuvieron de Amersham (kit Core Sequencing Cycle Terminator Dye Sequenase Termo, US 79565) . Después del etiquetado, cada pozo Streptawell se enjuagó con PBS IX (100 µ?) tres veces. Los fragmentos de ADN "rellenos" se liberaron a partir de pozo Streptawell mediante la digestión con la enzima de restricción EcoRI, de acuerdo a las instrucciones de fabricación que se suministraron con la enzima. La digestión se realizó durante 1 hora a 37 °C con agitación a 120 r.p.m. Detección del Lugar cromosomal de interés Las muestras se cargaron en las pistas de un gel de 36 cm de acrilamida (urea) al 5% (Bio Whittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, número de catálogo 50691). La muestra se ¦ sometió a una electroforesis en el gel a 3000 voltios durante 3 minutos. El gel se hizo correr durante 3 horas en un aparato de secuenciación (Secuenciador Hoefer SQ3) . El gel se eliminó del aparato y se escaneó en el escáner de modo Variable 9400 Typhoon. El nucleótido etiquetado incorporado se detectó mediante fluorescencia. Se extrajo un recuadro alrededor de cada banda y la intensidad de la banda se calculó usando un programa de escáner de modo variable Typhoon 9400. Como se observa en las figuras 17 A-F, se ven dos bandas . La banda de peso molecular inferior correspondiente a las moléculas de ADN llenas con ddTTP en una composición complementaria a la colgadura. La banda de peso molecular más alto correspondiente a las moléculas de ADN llenas con ddTTP en la posición 3 complementaria a la colgadura. El experimento se realizó en una forma ciega. Los tubos se codificaron de manera que se conoció que tubo corresponde a cada ADN de plantilla. Después, se analizaron los geles, cada tubo se agrupó en las siguientes categorías: ADN de plantilla normal, ADN de plantilla del síndrome de Down, una mezcla 3:1 de ADN de plantilla del síndrome de Down a un ADN normal, mezcla 1.1 de ADN de plantilla normal a un ADN de plantilla del síndrome de Down, mezcla de 1:2.3 de ADN de plantilla del síndrome de Down a un ADN de plantilla normal, y una mezcla 1:4 de ADN de plantilla de síndrome de Down a un ADN de plantilla normal. Cada replicado de cada reacción de PCR se agrupo exitosamente en la categoría apropiada, que demuestra que el método puede usarse para detectar ADN anormal aún si representa solamente un porcentaje pequeño del ADN total. El porcentaje del alelo 2 al alelo 1 para cada replicado de las tres reacciones PCR del ADN de plantilla normal se exhiben en la Tabla XVIII (ver también Figura 17A) . El porcentaje promedio del alelo 2 al alelo 1 se calcula al dividir el valor del alelo 2 por la suma de los valores del alelo 1 y el alelo 2 (alelo 2/ (alelo 1 + alelo 2)), lo que resulta en un promedio de 0.50025 con una desviación estándar de 0.002897. De esta manera, el alelo 1 y el alelo 2 se presentan en una relación de 50:50. Aunque la intensidad de las bandas varía de una reacción PCR a otra (comparar reacción 1 con reacción 3), no hay diferencia en la intensidad con la reacción PCR. Adicionalmente, los valores obtenidos para los dos replicados de las reacciones PCR son muy similares. La mayoría de la variación está entre las reacciones PCR y posiblemente se atribuye a los errores de pipeteado . El porcentaje del alelo 2 al alelo 1 para cada replicado de las tres reacciones PCR del ADN de plantilla de síndrome de Down, se exhiben en la Tabla XVIII (ver Figura 17B) . El porcentaje del alelo 1 al alelo 1 se calcula al dividir el valor del alelo 2 por la suma de los valores para el alelo 1 y el alelo 2 (alelo 2/alelo 1+ alelo 2) . Lo que resulta en un promedio de 0.301314 con una desviación estándar de 0.012917. es claro aún sobre el análisis del gel a simple vista, que el alelo 1 está presente en un número de copias mayor que el alelo 2 (ver Figura 17B) . Nuevamente, la mayoría de la variación se presenta entre las reacciones PCR y no con el replicado de una reacción PCR. La mayoría de la variación estadística posiblemente resultará de errores de pipeteo. El análisis de un SNP sencillo fue suficiente para detectar la presencia de la anormalidad cromosomal. Un SNP se proporciona suficientemente de manera que el valor "p" del SNP se conoce y que hay un número adecuado de genomas de manera que el error en el . muestreo estadístico no se introduce en el análisis. En este experimento, hay aproximadamente 5,000 genomas en cada reacción. Las reacciones que consisten de una mezcla de ADN de plantilla de síndrome de Down a un ADN de plantilla normal a una relación de 3:1 son claramente distinguibles del ADN de plantilla normal, y las otras mezclas de ADN (ver Figura 17C) . el porcentaje calculado del alelo 2 al alelo 1 fue 0.319089 con una desviación estándar de 0.004346 (ver Tabla XVIII). Similarmente, las reacciones que consisten de una mezcla de ADN de plantilla de síndrome de Down para el ADN de plantilla normal a relaciones de 1:1, y 1:2.3 son distinguibles (ver Figura 17D y 17E) y los valores son estadísticamente importantes de todas las otras reacciones (ver Tabla XVIII) . Como la cantidad de ADN de plantilla normal se incrementa, el porcentaje del alelo 2 al alelo 1 se incrementa. Con una mezcla de ADN de plantilla de síndrome de Down para ADN de plantilla normal de 1:4, el porcentaje de alelo 2 a alelo 1 fue 0.397642, con una desviación estándar de 0.001903 (ver Figura 17F) . La diferencia entre este valor y el valor obtenido del ADN de plantilla normal es estadísticamente importante. De esta manera, los métodos descritos en la presente permiten la detección de una anormalidad cromosomal aún cuando la muestra no es una muestra homogénea de ADN anormal. Como se describe arriba, la presencia de una fracción pequeña de ADN con un número de copia anormal de cromosomas puede detectarse aún entre una gran presencia de ADN normal. Es claro, aún a simple vista, que la cantidad de ADN normal se incrementa, y la cantidad de ADN de síndrome de Down se reduce, la intensidad de las bandas que corresponden a los alelos 1 y 2 se ecualiza. El ejemplo anterior analiza un SNP localizado en el cromosoma 21. Sin embargo, cualquier SNP puede analizarse en cualquier cromosoma que incluye, pero no se limita a los cromosomas humanos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, e Y, y los cromosomas fetales 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, e Y. Además, los cromosomas de los organismos no humanos pueden analizarse usando los métodos anteriores. Cualquier combinación de cromosomas puede analizarse. En el ejemplo anterior, una copia extra de un cromosoma se detecto. Sin embargo, pueden usarse los mismos métodos para detectar monosomias .

TABLA XVIII. Porcentaje del alelo 2 al alelo 1 en SNP TSC0108992 usando el ADN de plantilla normal y el ADN de plantilla de síndrome de Down. ADN de Plantilla Normal Alelo 1 Alelo 2 2/(2+1) 1A 2602115 2604525 0.500231 IB 2855846 1812750 0.505884 2A 1954765 1741929 0.498353 2B 2084476 2068106 0.498029 3A 2044147 2035719 0.498967 3B 1760291 1760543 0.500036 Media 0.50025 STD 0.002897 Síndrome de Dovm Alelo 1 Alelo 2 2/(2+1) 1A 4046926 1595581 0.282779 IB 4275341 1736260 0.288818 2A 2875698 1299509 0.311244 2B 2453615 1069635 0.303593 3A 3169338 1426643 0.310411 3B 3737440 1687286 0.311036 Media 0.301314 STD 0.012917 3 : 1 (Do n : Normal) Alelo 1 Alelo 2 2/(2+1) 1A 4067623 1980770 0.327487 IB 4058506 1899853 0.318855 2A 2315044 1085860 0.319286 2B 2686984 1243406 0.316357 3A 3880385 1790764 0.315767 3B 3718661 1724189 0.316781 Media 0.319089 STD 0.004346 1:1 (Down: Normal) Alelo 1 Alelo 2 2/ (2+1) 1A 3540255 1929840 0.352798 IB 4004085 2161443 0.350569 2A 2358009 1282132 0.35222 2B 2158132 1238377 0.364603 3A 3052330 1648677 0.350707 3B 3852682 2024012 0.344413 Media 0.352552 STD 0.006618 1:2.3 (Down : Normal) Alelo 1 Alelo 2 2/(2+1) 1A 3109326 1942597 0.384526 IB 3392477 2118011 0.38436 2A 2824213 1758428 0.383715 2B 2069889 1249545 0.376433 3A 2335128 1433016 0.380298 3B 2916772 1797965 0.38135 Media 0.38178 STD 0.003128 1 : (Down : Normal) Alelo 1 Alelo 2 2/ (2+1) 1? 3066524 2039636 0.399446 IB 3068284 2038770 0.399207 2A 2325477 1542526 0.398791 2B 2366122 1562218 0.397679 3A 2151205 ¦ 1403120 0.394764 3B 2397046 1571360 0.395968 Media 0.397642 STD 0.001903 EJEMPLO 12 Como se discute arriba en el Ejemplo 9, la relación para el alelo 1 al alelo 2 a un SNP heterocigoto es constante. Sin embargo, un factor que puede tener influencia en la relación del alelo 1 al alelo 2 a un SNP heterocigoto es un número inferior de genomas. Por ejemplo, si hay 40 genomas, lo que significa que hay un total de 40 cromosomas del alelo 1 y 40 • cromosomas del alelo 2, es estadísticamente posible que los cebadores puedan combinarse en sus pares base a 40 de los cromosomas con el alelo 1, pero sólo 30 de los cromosomas con el alelo 2. Esto afectará la relación del alelo 1 al alelo 2, y puede tener una influencia errónea en el valor "p" para el SNP particular. Típicamente, la amplificación genómica completa, que emplea PCR de oligonucleótido degenerado, se usa para incrementar bajas cantidades de muestras de ADN genómico. Los oligonucleótidos de 8, 10, 12, ó 14 bases se usan para amplificar el genoma. Es a través de esto que los cebadores se combinan en sus pares base aleatoriamente a través del genoma, y amplifican una muestra de ADN genómico pequeño en cientos de veces más de ADN para análisis genético. Los métodos descritos en la presente explotan el hecho de que típicamente el genoma completo no es de interés. Los lugares cromosomales de interés particulares localizados en un cromosoma, o en múltiples cromosomas o en cromosomas que representan el genoma completo, se seleccionan para análisis. Aún si los lugares cromosomales de interés se localizan en cromosomas para el genoma completo, se prefiere que amplifiquen la región de aquellos cromosomas que contienen los lugares cromosomales de interés. Para superar el límite de un número bajo de genomas, que f ecuentemente se observa con ADN fetal obtenido del plasma de una hembra preñada, puede usarse un método de multiplexado para incrementar el número de genomas. El método descrito abajo amplifica preferiblemente el cromosoma o cromosomas que contienen los lugares de interés .

Preparación del ADN de Plantilla Se colectó una muestra de sangre de 9 mi en un tubo estéril de un voluntario humano después de garantizar su consentimiento informado. (Fischer Scientific, tubos de 9 mi EDTA Vacutte, número de catálogo NC9897284) . Los tubos se giraron a 1000 rpm durante diez minutos. El sobrenadante (el plasma) de cada muestra se removió, y un mililitro de la muestra de sangre restante, que se refiere comúnmente como la "recubierta del cuerpo humano" se transfiere a un tubo nuevo. Un mililitrio de IX PBS se agregó a cada muestra. El ADN de plantilla se aisló usando el Kit QIAmp DNA Blood Midi suministrado por QIAGEN (número de catálogo 51183) .

Diseño de los cebadores Multiplexados Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares base en varias regiones en el cromosoma 21 para incrementar el número de copias de los lugares cromosórnales de interés localizados en el cromosoma 21. Los cebadores son de 12 bases en longitud. Sin embargo, los cebadores de cualquier longitud pueden usarse que incluyen, pero no se limitan a, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76-85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125, y mayores a 125 bases. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares base tanto para la hebra sentido como la hebra antisentido. Nueve SNP ubicados en el cromosoma 21 se analizan TSC0397235, TSC0470003, TSC1649726, TSC1261039, TSC0310507, TSC1650432, TSC1335008, TSC0128307, y TSC0259757. Cualquier número de SNP pueden analizarse e incluyen, pero no se limitan a, 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-2000, 2001-3000, 3001-4000, 4001-5000, 5001-6000, 6001-7000, 7001-8000, 8001-9000, 9001-10,000 y mayor de 10,000. Para cada uno de los 9 SNP, se diseña un cebador base 12 para combinarse en sus pares base aproximadamente 130 bases en dirección ascendente de los lugares cromosomales de interés, y un cebador de 12 bases se diseñó para combinarse en sus pares base aproximadamente 130 bases en dirección descendente de los lugares cromosomales de interés (en la presente se refieren como los cebadores multiplexados ) . Los cebadores multiplexados pueden diseñarse para combinarse en sus pares base a cualquier distancia de los lugares cromosomales de interés que incluyen, pero no se limitan a, 10-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91-100, 101-110, 111-120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190, 191-200, 201-210, 211-220, 221-230, 231-240, 241-250, 251-260, 261-270, 271-280, 281-290, 291-300, 301-310, 311-320, 321-330, 331-340, 341-350, 351-360, 361-370, 371-380, 381-390, 391-400, 401-410, 411-420, 421-430, 431-440, 441-450, 451-460, 461-470, 471-180, 481-490, 491-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-2000, 2001-3000, 3001-4000, 4001-5000, y mayores a 5000 bases. Además, más de un conjunto de cebadores multiplexados puede usarse para un SNP que incluyen, pero no se limitan a, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10-20, 21-30, 31-40, 41-50, y más de 50. Además, 91 conjuntos de cebadores delantero y reverso se usaron para amplificar otras regiones del cromosoma 21, para un total de 100 conjuntos de cebadores (200 cebadores en la reacción) . Estos 91 conjuntos de cebadores se usaron para demostrar que se puede usar un gran número de cebadores en una reacción sencilla sin producir un gran número de bandas no especificas. Cualquier número de cebadores se puede usar en la reacción incluyendo pero no se limitan a, 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-2000, 2001-3000, 3001-4000, 4001-5000, 5001-6000, 6001-7000, 7001-8000, 8001-9000, 9001-10,000, 10,001-20,000, 20,001-30,000 y más de 30,000. Los cebadores multiplex se diseñaron para tener los mismos nucleótidos en la terminación 3' del cebador. En este caso, los cebadores mutiplex terminaron en "??", en donde A indica adenina. Los cebadores se diseñaron de esta manera para minimizar la formación de cebador dimero. Sin embargo, los cebadores deben terminar en algunos nucleótidos que incluyen pero no se limitan a, adenina, guanina, citosina, timidina, cualquier combinación de adenina y guanina, cualquier combinación de adenina citosina, cualquier combinación de adenina o timidina, cualquier combinación de adenina o citosina, cualquier combinación de guanina o timidina, o cualquier combinación de citosina o timidina. Además los cebadores multiplex pueden tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más de 10 de los mismos nucleótidos en la terminación 3' . ¦ Los cebadores multiplex para SNP TSC0397235 fueron: Cebador delantero: 5 ' CAAGTGTCCTAA 3' Cebador inverso: 5 ' CAGCTGCTAGAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0470003 fueron: Cebador delantero: 5 ' GGTTGAGGGCAA3 ' Cebador inverso: 5 ' CACAGCGGGTAA3 · ebadores multiplex para SNP TSC 1649726 fueron Cebador delantero: 5 ' TTGACTTTTTAA3 ' Cebador inverso: 5 'ACAGAATGGGAA3 ' ebadores multiplex para SNP TSC1261039 fueron: Cebador delantero: 5 ' TGCAGGTCACAA3 ' Cebador inverso: 5 ' TCTTCTTATAA3 ' ebadores multiplex para SNP TSC0310507 fue Cebador delantero: 5 ' GGACAACCTAA3 ' Cebador inverso: 5 ' TGGTGTTCAGAA3 ' ebadores multiplex para SNP TSC1650432 fueron: Cebador delantero: 5 ' CAGCATATGAA3 ' Cebador inverso: 5 ' GTTGCCACACAA3 ' ebadores multiplex SNP TSC 1335008 fueron Cebador delantero: 5 ' CCCAGCTAGCAA3 ' Cebador inverso: 5 ' GGGTCACTGTAA31 Los cebadores multiplex para SNP TSC0128307 fueron: Cebador delantero: 5 ' TTAAATACCCAA31 Cebador inverso: 5 ' TTAGGAGGTTAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0259757 fueron: Cebador delantero: 51 CACAGAATCAA31 Cebador inverso: 5 ' CGCTGAGGTCAA3 ' Noventa y un (91) conjuntos adicionales de los primeros, cuya separación en sus pares base a varias regiones a lo largo del cromosoma 21, se incluyen en la reacción: Conjunto 1: Cebador delantero: 5 'AAGTAGAGTCAA3 ' Cebador inverso: 5 ' CTTCCCATGGAA3 ' Conjunto 2: Cebador delantero: 5 ' TTGGTTATTAAA3 ' Cebador inverso: 5 ' CAACTTACTGAA31 Conjunto 3: Cebador delantero 51 CACTAAGTGAAA31 Cebador inverso: 5 ' CTCACCTGCCAA3 ' Conjunto 4: Cebador delantero 5 ' ATGCATATATAA3 ' Cebador inverso: 5 ' AGAGATCAGCAA3 ' Conjunto 5: Cebador delantero 51 ATATTTTTCAA3 ' Cebador inverso: 5' CAGAAAGCAGAA3 ' Conjunto 6: Cebador delantero 5 ' GTATTGGGTTAA3 ' Cebador inverso: 5 ' CTGACCCAGGAA3 ' Conjunto 7: Cebador delantero 5 ' CAGTTTTCCCAA3 ' Cebador inverso: 5 ' AGGGCACAGGAA3 ' Conjunto 8: Cebador delantero 51 GTATCAGAGGAA3 ' Cebador inverso: 5 ' GCATGAAAAGAA3 ' Conjunto 9: Cebador delantero 5 ' GATTTGACAGAA3 ' Cebador inverso: 5 ' TACAGTTTACAA3 ' Conjunto 10: Cebador delantero 5 ' GTGATTTTTAA31 Cebador inverso: 5 ' TATGTTCTCAA3 ' Conjunto 11: Cebador delantero 5 ' CAAGTACTTGAA3 ' Cebador inverso: 5 ' CTTGTGTGGCAA3 ' Conjunto 12: Cebador delantero 5 ' AGACTTCTGCAA3 ' Cebador inverso: 5 ' GTTGTCTTTCAA3 ' Conjunto 13: Cebador delantero 5 ' GGGACACTCCAA3 ' Cebador inverso: 5 'ATTATTATTCAA3 ' Conjunto 14: Cebador delantero 51ACA GA GACAA3 ' Cebador inverso: 51 TCAATTATAGAA3 ' Conjunto 15: Cebador delantero 51 CTATGGGCTGAA31 Cebador inverso: 5 ' GTGTGCCTGAA3 ' Conjunto 16: Cebador delantero 5 ' CCATTTGTTGAA3 ' Cebador inverso: 5 ' CTCCATCAAAA3 ' Conjunto 17: Cebador delantero 5 'AATGCTGACAAA3 ' Cebador inverso: 51 TTCATGTCCAA3 ' Conjunto 18: Cebador delantero 51GGCCTCTTGGAA31 Cebador inverso : 51 TCATTTTTTGAA31 Conjunto 19: Cebador delantero 5 ' GGACTACCATAA31 Cebador inverso : 5 'AGTCACTCAGAA3 ' Conjunto 20 : Cebador delantero 5 ' CCTTGGCAGGAA3 ' Cebador inverso: 5 ' TTTCTGGTAGAA3 ' Conjunto 21 : Cebador delantero 51 CCCCCCCCCGAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GCCCAGGCAGAA3 ' Conjunto 22; Cebador delantero 5 ' GAATGCGAAGAA3 ' Cebador inverso: 51 TTAGGTAGAGAA31 Conjunto 23 : Cebador delantero; 51 TGCTTTGGTCAA3 ' Cebador inverso: 51 GCCCATTAATAA3 ' Conjunto 24 : Cebador delantero 5 ' TGAGATCTTTAA3 ' Cebador inverso : 5 ' CAGTTTGTTCAA3 ' Conjunto 25 : Cebador delantero 51 GCTGGGCAAGAA3 ' Cebador inverso: 5 'AGTCAAAGTCAA31 Conjunto 26 : Cebador delantero 51 TCTCTGCAGTAA3 ' Cebador inverso : 51 TGAATAACTTAA3 ' Conjunto 27: Cebador delantero 5 ' CGGTTAGAAAAA31 Cebador inverso : 51 CATCCCTTTCAA3 ' Conjunto 28: Cebador delantero 5 ' TCTCTTTCTGAA3 * Cebador inverso: 5 ' CTCAGATTGTAA3 ' Conjunto 29: Cebador delantero 5 ' TTTGCACCAGAA3 ' Cebador inverso: 51 GGTTAACATGAA3 ' Conjunto 30: Cebador delantero 5 'ATTATCAACTAA3 ' Cebador inverso: 5 ¦ GCCATTTTGTAA3 ' Conjunto 31 : Cebador delantero 5 ' GATCTAGATGAA31 Cebador inverso : 5 ' TTAATGTATTAA3 ' Conjunto 32 : Cebador delantero 5 ' CTAGGGAGACAA3 ' Cebador inverso : 5 ' TGGAGGAGACAA3 ' Conjunto 33 : Cebador delantero; 51 CATCACATTTAA31 Cebador inverso: 5 ' GGGGTCCTGCAA3 ' Conjunto 34: Cebador delantero 5 ' CAGTTGTGCTAA31 Cebador inverso : 5 ' CTGCAGCCTAA3 ' Conjunto 35 : Cebador delantero 51 GAGTCATTTAAA31 Cebador inverso : 5 ' CTATGGATTAA3 ' Conjunto 36: Cebador delantero 5 ! CAAAAAGTAGAA3 ' Cebador inverso : 5 ' ATATACTCCAA3 ' Conjunto 37: Cebador delantero 5 ' CGTCCAGCACAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GGATGGTGAGAA3 ' Conjunto 38: Cebador delantero 5 * TCTCCTTTGTAA3 ' Cebador inverso: 5 ' TCGTTATTTCAA3 ¦ Conjunto 39: Cebador delantero 5 ' GATTTTATAGAA31 Cebador inverso : 51AGACATAAGCAA31 Conjunto 40 : Cebador delantero 5 ' TTCACCTCACAA31 Cebador inverso : 5 ' GGATTGCTTGAA3 ' Conjunto 41: Cebador delantero 5 'ACTGCATGTGAA3 ' Cebador inverso: 5 'TTTATCACAGAA3 ' Conjunto 42 : Cebador delantero 51 TCAGTAACACAA3 ' Cebador inverso : 5 ' TACATCTTTGAA3 ' Conjunto 43: Cebador delantero 51 TTGTTTCAGTAA3 ' Cebador inverso : 5 · ATGAGCATCAA3 ' Conjunto 44: Cebador delantero 5 ' CTCAGCAGGCAA3 · Cebador inverso : 51ACCCCTGTATAA31 Conjunto 45 : Cebador delantero 5 ' TCTGCTCAGCAA3 ' Cebador inverso : 5 ¦ GTTCTTTTTTAA31 Conjunto 46: Cebador delantero 51 GTGATAATCCAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GAGCCCTCAGAA31 Conjunto 47: Cebador delantero 5 ' TTTATTGGTTAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GGTACTGGGCAA3 ' Conjunto 48 : Cebador delantero : 5 'AGTGTTTTTCAA3 ' Cebador inverso: 5 ' TGTTATTGGTAA3 ' Conjunto 49 : Cebador delantero 5 ' GCGCATTCACAA3 ' Cebador inverso : 51 AACAAAAGCAA31 Conjunto 50 : Cebador delantero 5 ' TATATGATAGAA3 ' Cebador inverso : 51 TCCCAGTTCCAA3 ' Conjunto 51: Cebador delantero 51AAAGCCCATAAA3 ' Cebador inverso: 5 · TGTCATCCACAA3 ' Conjunto 52 : Cebador delantero 5 ' TTGTGAATGCAA3 ' Cebador inverso : 51 GTATTCATACAA3 ' Conjunto 53 : Cebador delantero 51 GACATAGGGAA3 ' Cebador inverso: 5 'AGCAAATTGCAA3 ' Conjunto 5 : Cebador delantero 51AGTAGATGTTAA3 ' Cebador inverso : 5 'AAAAGATAATAA3 ' Conjunto 55: Cebador delantero 5 'ACCTCATGGGAA31 Cebador inverso : 5 ' TGGTCGACCTAA3 * Conjunto 56: Cebador delantero 51 TTGCATGGTAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GCGGCTGCCGAA3 ' Conjunto 57: Cebador delantero 5 ' CAGGAGTCTAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GCCTACCAGGAA31 Conjunto 58: Cebador delantero ; 51ATCTTCTGTTAA31 Cebador inverso: 51AGGTAAGGACAA3 ' Conjunto 59: Cebador delantero 5 ' TGCTTTGAGGAA3 ' Cebador inverso : 51AACAGTTTTAAA3 ' Conjunto 60: Cebador delantero 5 » TTAAATGTTTAA3 ' Cebador inverso : 5 'ATAGAAAATCAA3 ' Conjunto 61: Cebador delantero 5 ' GTGTTGTGTTAA3 ' Cebador inverso : 51 GAGGACCTCGAA31 Conjunto 62 : Cebador delantero 51 GAGGCTGAGAA31 Cebador inverso : 51 GGTATTTATTAA3 ' Conjunto 63 : Cebador delantero : 51ATTTATCTGGAA31 Cebador inverso: 5 'AGTGCAAACTAA3 ¦ Conjunto 64: Cebador delantero : 51 GAACACCTTAA3 ' Cebador inverso : 51AATTTTTTCTAA3 ' Conjunto 65: Cebador delantero 5 ' TTACTATTATAA3 ' Cebador inverso : 5 ! GCTATAGTGAA31 Conjunto 66: Cebador delantero 51 GGACTATGGAA3 · Cebador inverso : 5 ' CTGCAGTCCGAA31 Conjunto 67: Cebador delantero 51 GCTACTGCCCAA3 ' Cebador inverso : 5 ' TCACATGGTGAA3 ' Conjunto 68: Cebador delantero 51 GTGGCTCTGGAA3 ' Cebador inverso: 5 ' GAATTCCATTAA3 ' Conjunto 69: Cebador delantero 5 *TGGGGTGTCCAA31 Cebador inverso : 5 ' GCAAGCTCCGAA31 Conjunto 70 : Cebador delantero 51ATGTTTTTTCAA3 ' Cebador inverso : 51AGATCTGTTGAA31 Conjunto 71: Cebador delantero 51AAGTGCTGTGAA3 ' Cebador inverso : 5 'ACTTTTTTGGAA3 ' Conjunto 72 : Cebador delantero 5 'AATCGGCAGGAA3 ' Cebador inverso : 51 GGCATGTCACAA3 ' Conjunto 73 : Cebador delantero 5 'AGGAAGAAAGAA31 Cebador inverso : 5 ' CAGTTTCACCAA3 ' Conjunto 74: Cebador delantero 5 ' CACAGAATTTAA31 Cebador inverso: 51 AGAATAAGTAA3 ' Conjunto 75: Cebador delantero 5 ' GGGATAGTACAA3 ' Cebador inverso : 5 ' TCCCATGATAA3 ' Conjunto 76: Cebador delantero 51 TGATTAGTTGAA31 Cebador inverso : 51 GCATTCAGTGAA3 ' Conjunto 77: Cebador delantero 5 'AGGGAATATTAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GACCTTAGGTAA3 ' Conjunto 78: Cebador delantero 51 TCTTTTCACAA31 Cebador inverso : 51 CCAAACTAAGAA31 Conjunto 79: Cebador delantero 51 GTGCTCTTAGAA31 Cebador inverso: 5 'ATGAGTTTAGAA3 ' Conjunto 80 : Cebador delantero 51ATGAGCATAGAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GACAAATGAGAA3 ' Conjunto 81: Cebador delantero 51AAACCCAGAGAA31 Cebador inverso; 5 ' CCTCACACAGAA31 Conjunto 82: Cebador delantero 51 CACACTGTGGAA3 ' Cebador inverso : 51 CACTGTACCCAA3 ' Con unto 83 : Cebador delantero: 5 * GTAGTATTTCAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GGATACACTAA3 ' Conjunto 84: Cebador delantero 5 ' CCCATGATTCAA3 ' Cebador inverso : 51 TCATAGGAGGAA3 ' Conjunto 85: Cebador delantero 51AGGAAAGAGAAA3 ' Cebador inverso : 5 'ATATGGTGATAA3 ' Conjunto 86: Cebador delantero 51 GATGCCATCCAA3 ' Cebador inverso : 5 'ATACTATTTCAA31 Conjunto 87: Cebador delantero 5 ' GTGTGCATGGAA3 ' Cebador inverso : 5 'AGGTGTTGAGAA31 Conjunto 88: 4 5 Cebador delantero: 5 ' CAGCCTGGGCAA3 ¦ Cebador inverso : 5 ' GGAGCTCTACAA31 Conjunto 89: Cebador delantero: 5 'AACTAAGGTTAA3 ' Cebador inverso: 51AACTTATGTTAA3 ' Conjunto 90 : 'Cebador delantero: 5 'ATCTCAACAGAA3 ' Cebador inverso : 5 ' TAACAATGTGAA3 ' Conjunto 91: Cebador delantero: 5 ¦AAGGATCAGGAA3 ' Cebador inverso : 5 ' CTCAAGTCTTAA3 ' PC Multiplex Las regiones en el cromosoma 21 que rodean a los SNP TSC0397235, TSC0470003, TSC1649726, TSC1261039, TSC0310507, TSC1650432, TSC1335008, TSC0128307, y TSC0259757 se amplificaron a partir del ADN de plantilla genómico usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, Patentes de E.U.A.

Nos. 4,683,195 y 4,683,202, que se incorporan aquí como referencia) . Esta reacción por PCR utilizó cebadores que combinaron aproximadamente 130 bases en dirección ascendente y en dirección descendente de los lugares cromosomales de interés . Se usó para incrementar el número de copias de los lugares cromosomales de interés para eliminar algunos errores que pudieran resultar de un número bajo de genomas. Para una especificidad incrementada, se usó PCR "inicio en caliente" . Las reacciones de PCR se realizaron usando un kit Mix Master HotStarTaq proporcionadas por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y la reacción por cebador puede optimizarse para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, se usaron 50 ng del ADN de plantilla genómico de humano y 5 µ? de cada cebador. Dos microlitros de cada cebador delantero e inverso, a concentraciones de 5 mM se acumularon en un tubo microcentrífugo y se mezclaron. Ocho microlitros de la mezcla cebadora se usaron en un volumen total de reacción PCR de 40 µ? (1.5 µ? de ADN de plantilla, 10.5 µ? de agua estéril, 8 µ? de mezcla de cebador, y 20 ul de HotStar Taq) . Se efectuaron veinticinco ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones por PCR: (1) 95°C durante 15 minutos; (2) 95°C durante 30 segundos; (3) 4°C durante 30 segundos; (4) 37°C durante 30 segundos; (5) Etapas repetidas 2-4 veinticuatro (24) veces; (6) 72 °C durante 10 minutos. Las temperaturas y tiempos para desnaturalización, combinación de pares base y extensión, se pueden optimizar al intentar diversas configuraciones y usando los parámetros que producen los mejores resultados. En otra modalidad, los lugares cromosomales de interés se amplifican usando oligonucleotidos de 6 bases, oligonucleotidos de 7 bases, oligonucleotidos de 8 bases, oligonucleotidos de 9 bases, oligonucleotidos de 10 bases, oligonucleotidos de 11 bases, oligonucleotidos de 12 bases, oligonucleotidos de 13 bases, oligonucleotidos de 14 bases u oligonucleotidos de más de 14 bases. En una modalidad preferida, se usan oligonucleotidos de 6 bases, oligonucleotidos de 7 bases, oligonucleotidos de 8 bases, oligonucleotidos de 9 bases, oligonucleotidos de 10 bases, oligonucleotidos de 11 bases u oligonucleotidos de 12 bases para amplificar los lugares cromosomales de interés. En otra modalidad, se puede usar cualquier número de oligonucleotidos incluyendo pero no limitado a, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-100, 100-500, 500- 1000, 1000-2000, 2000-4000, 4000-8000, 8000-10,000 o más de 10,000. Con un número pequeño de oligos aleatorios, la concentración de oligos es lo suficientemente grande para permitir la amplificación eficiente y todavía, el número de oligos es lo suficientemente pequeño que no provoca interferencia entre los oligos. Esto permite la amplificación eficiente del genoma. En otra modalidad, las secuencias en dirección ascendente y dirección descendente de los lugares cromosomales de interés, se analizan para identificar una secuencia de 6 bases, 7 bases, 8 bases, 9 bases, 10 bases, 11 bases o 12 bases, que está presente en la secuencia en la dirección ascendente o descendente para cada lugar cromosomal de interés. En otra modalidad, se puede usar cualquier número de oligonucleótidos de 6 bases para amplificar los lugares cromosomales de interés, incluyendo pero no limitado a 1-10, 10-50, 50-100, 100-200, 200-500 o más de 500. En otra modalidad, se puede incrementar el número de lugares cromosomales de interés a partir de un número pequeño de genomas al amplificar un número limitado de los lugares de interés, seguido por la eliminación del los cebadores, y la amplificación de los lugares cromosomales de interés restantes. No tienen que multiplexarse todos los lugares cromosomales de interés en una reacción. Se puede multiplexar cualquier número de lugares cromosomales de interés determinados experimentalmente en una reacción simple, que incluyen pero no se limitan a 1-5, 5-10, 10-25, 25-50, 50- 100, 100-200, 200-400, o más de 400. Después de incrementar el número de copias de estos lugares cromosomales de interés, se puede pasar la muestra a través de una columna que permita que se enlacen los productos amplificados y se retiren los cebadores y dNTP sin usar. Después de eluir los productos enlazados de la columna, se pueden amplificar diferentes lugares cromosomales de interés en una reacción sencilla. Esto reduce la cantidad de interacción entre los cebadores . También se pueden usar otros métodos de amplificación genómica para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, que incluyen pero no se limitan a preamplificación de la extensión del cebador (PEP) (Zhang et al, PNAS, 89:5847-51, 1992), PCR cebado de oligonucleótido degenerado (DOP-PCR) (Telenius et al, Genomics, 13:718-25, 1992) , amplificación por desplazamiento de hebras usando polimerasa de ADN a partir del bacteriófago 29, lo cual somete una replicación de círculo rodante (Dean et al, Genomic Research 11:1095-99, 2001), amplificación por desplazamiento múltiple (patente de E.U.A. 6,124,120), kits de amplificación de genoma entero REPLI-g™, y PCR etiquetada.

Purificación del Fragmento de Interés Se retiraron en exceso los cebadores y nucleótidos de la reacción usando los kit de purificación Qiagen MinElute PCR (Qiagen, número de catálogo 28004) . Las reacciones se efectuaron siguiendo las instrucciones del fabricante suministradas con las columnas. El ADN se eluyó en 100 µ? de agua estéril . Reacción dos PCR SNP TSC0397235 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 ' TTAGTCATCGCAGAATTCTACTTCTTTCTGAAGTGGGA31 Segundo cebador: 51 GGACAGCTCGATGGGACTAATGCATACTC3 ' El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, y se diseñó para combinar 103 bases desde el lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmFI . SNP TSC0470003 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 ' GTAGCCACTGGTGAATTCGTGCCATCGCAAAAGAATAA3 ' Segundo cebador: 5 'ATTAGAATGATGGGGACCCCTGTCTTCCC3 ' El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, y se diseñó para combinar 80 bases desde el lugar cromosomal de interés. El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmFI . SNP TSC 1649726 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5 'ACGCATAGGAAGGAATTCATTCTGACACGTGTGAGATA3 · Segundo cebador: 51 GAAATTGACCACGGGACTGCACACTTTTC31 El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, y se diseñó para combinar 113 bases desde el lugar cromosomal de interés. El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmFI.

SNP TSC1261039 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador : 5 ' CGGTAAATCGGAGAATTCAAGTTGAGGCATGCATCCAT3 ' Segundo cebador: 5 ' TCGGGGCTCAGCGGGACCACAGCCACTCC31 El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI , y se diseñó para combinar 54 bases desde el lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmFI.

SNP TSC0310507 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 ' TCTATGCACCACGAATTCAATATGTGTTCAAGGACATT3 ' Segundo cebador: 5 ' TGCTTAATCGGTGGGACTTGTAATTGTAC31 El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI , y se diseñó para combinar 93 bases desde el lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmFI . SNP TSC1650432 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 · CGCGTTGTATGCGAATTCCCTGGGGTATAAAGATAAGA31 Segundo cebador : 5 ' CTCACGGGAACTGGGACACCTGACCCTGC3 ' El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI , y se diseñó para combinar 80 bases desde el lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmF I.

SNP TSC 1335008 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador : 5 ' GTCTTGCCGCTTGAATTCCCATAGAAGAATGCGCCAAA3 ' Segundo cebador: 5 ' TTGAGTAGTACAGGGACACACTAACAGAC3 ' El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Eco I , y se diseñó para combinar 94 bases desde el lugar cromosomal de interés. El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmF I.

SNP TSCO 128307 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5 'AATACTGTAGGTGAATTCTTGCCTAAGCATTTTCCCAG3 ¦ Segundo cebador; 51 GTGTTGACATTCGGGACTGTAATCTTGAC3 ' El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, y se diseñó para combinar 54 bases desde el lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmF I .

SNP TSC0259757 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: ¦ 51 TCTGTAGATTCGGAATTCTTTAGAGCCTGTGCGCTGAG3 ' Segundo cebador: 51 CGTACCAGTACAGGGACGCAAACTGAGAC31 El primer cebador contenía una etiqueta de biotina en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, y se diseñó para combinar 100 bases desde el lugar cromosomal de interés . El segundo cebador contenía el sitio de restricción para la enzima de restricción BsmF I.

Todos los lugares de interés se amplificaron a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción de la cadena polimerasa (PCR, patentes norteamericana Nos. 4,683,195 y 4,683,202 incorporada aquí por referencia). En este ejemplo, el lugares de interés se amplificó en tubos de reacción por separado pero que podrían amplificarse también al mismo tiempo en una reacción de PCR sencilla. Para incrementar la especificidad, se usó PCR de "inicio en caliente" . Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando el kit ix Master HotStar Taq proporcionado por QIAGEN (número de catálogo 203443) Un microlitro del eluido de la reacción de multiplexado (producto PCR eluido dé la columna inElute) se usó como ADN de plantilla para cada reacción PCR. Cada SNP se amplificó en triplicado cuando la muestra de multiplexado se usó como la plantilla. Como control, cada SNP se amplificó desde 15 ng del ADN de plantilla original (ADN que no experimenta la reacción de multiplexado) . La cantidad del ADN de plantilla y el cebador por reacción, puede optimizarse para cada lugar cromosomal de interés, pero en este ejemplo, se usó 5 µ? de cada cebador. Se realizaron cuarenta ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones de PCR: (1) 95°C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 37°C durante 30 segundos; (3) 95 °C durante 30 segundos; (4) 57°C durante 30 segundos ,- (5) 95°C durante 30 segundos; (6) 64°C durante 30 segundos; (7) 95°C durante 30 segundos; (8) repetir las etapas 6 y 7, treinta y nueve (39) veces ; (9) 72 °C durante 5 minutos. En el primer ciclo de PCR, la temperatura de la combinación de pares básicos fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región de la combinación de pares básicos 3' de los cebadores secundarios, la cual fue 37 °C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el segundo ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región 3', que combina pares básicos al ADN de plantilla, del primer cebador, que fue de 57°C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el tercer ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador, fue de 64°C. La temperatura de la combinación de pares básicos para los ciclos restantes fue de 64 °C. Al realizar una escala de la temperatura de la combinación de pares básicos a partir de TM1 a TM2 a TM3 en los primeros tres ciclos de PCR mejora ampliamente la especificidad. Estas temperaturas de la combinación de pares básicos son representativas, y el técnico experto comprenderá que las temperaturas de la combinación de pares básicos para cada ciclo dependen de los cebadores específicos usados. Las temperaturas y tiempos para desnaturalizar, combinar pares básicos y de extensión, pueden optimizarse mediante varios entornos de prueba usando los parámetros que producen los mejores resultados.

Análisis en Gel de Agarosa Cuatro microlitros de una reacción PCR de veinte microlitros para cada SNP del ADN de plantilla original, se analizó por electroforesis en gel de agarosa (ver Figura 18A) . Cuatro microlitros de una reacción PCR de veinte microlitros para cada SNP que se amplificó de la plantilla de multiplexado, se analizó por electroforesis en gel de agarosa (ver Figura 18B) . Como se aprecia en la Figura 18A, para 8/9 de los SNP amplificados del ADN de plantilla original, una banda sencilla de alta intensidad se aprecia (pistas 1-3, y 5-9) . La banda migra en la posición correcta para cada uno de los 8 SNP. La amplificación de TSC1261039 del ADN de plantilla original produce una banda de alta intensidad, que migra a la posición correcta, y una banda tenue de peso molecular más bajo (carril 4) . Sólo se aprecian dos bandas, y las bandas podrían distinguirse claramente con base en el peso molecular. El método PCR descrito en la presente permite amplificaciones limpias de los lugares cromosomales de interés del ADN genómico sin ninguna concentración o enriquecimiento de los lugares cromosomales de interés . Como se aprecia en la Figura 18B, los cebadores usados para amplificar los SNP TSC0397235, TSC0470003, TSC0310507, y TSC0128307 del ADN de plantilla multiplexado produce una banda sencilla de alta intensidad, que migra en la posición correcta (carriles 1, 2, 5 y 8) . No se introducen bandas adicionales a pesar del hecho de que la reacción de multiplexado contiene doscientos cebadores. Aunque los cebadores multiplexados fueron de 12 bases en longitud y posiblemente se combinan en sus pares base para secuencias adicionales diferentes a aquellas ubicadas en el cromosoma 21, los productos no se aprecian ya que las bandas no se amplifican en la segunda reacción PCR. La segunda reacción PCR emplea cebadores específicos para los lugares cromosomales de interés y se usan oligonucleótidos asimétricos y se colocan en escala las temperaturas de combinado en sus pares base, lo que permite la amplificación específica del genoraa (ver Ejemplo 1) . La amplificación de TSC1649726 del ADN de plantilla de multiplexado produce una banda de alta intensidad y dos bandas débiles, que podrían distinguirse claramente con base en el peso molecular (ver Figura ¦ 18B, carril 3) . La amplificación de TSC1261039 del ADN de plantilla multiplexado produce una banda de alta intensidad del peso molecular correcto y una banda débil de peso molecular más bajo (ver Figura 18B, carril 4) . La banda de bajo peso molecular tiene el mismo tamaño como la banda observada de la amplificación de TSC1261039 del ADN de plantilla original (comparar la Figura 18A, carril 4 con la Figura 18B, carril 4) . De esta manera, la amplificación de TSC1261039 del ADN de plantilla multiplexado no introduce ninguna banda no específica adicional . La amplificación de los SNP TSC1650432, TSC1335008, y TSC0259757 del ADN de plantilla multiplexado, produce una banda de alta intensidad, que migra a la posición correcta, y una banda más débil (carriles 6, 7, y 9) . Para los SNP TSC1650432 y TSC0259757, la banda más débil fue de peso molecular más bajo, y claramente se distingue de la banda de interés (ver Figura 18B, carriles 6 y 9) . Para SNP TSC1335008, la banda más débil fue de peso molecular ligeramente más alto. Sin embargo, la banda correcta puede identificarse al comparar a los productos de amplificación de TSC1335008 del ADN de plantilla original, (comparar Figura 18A, carril 7 y Figura 18B, carril 7) . Las condiciones de PCR 4 9 pueden también optimizarse de TSC1335008. Todos los 9 SNP se amplifican bajo las condiciones iguales exactas, lo que produce bandas claramente distinguibles para los SNP amplificados .

Purificación del fragmento de interés Los productos de PCR se separaron del ADN de plantilla genómico. Una parte de la reacción de PCR se trasfirió a un pozo de un a placa de enlace elevado, transparente, Pozo Streptawell de Roche Diagnostics GMBH (número de catálogo 1 645 692, como se lista en Roche Molecular Biochemicals, catálogo Biochemicals 2001) . Los primeros cebadores contuvieron una etiqueta 5' de biotina enlazando así los productos de PCR a los pozos revestidos con estreptavidina mientras que para la plantilla genomica no se hizo lo mismo. La reacción de enlace de estreptavidina se realizó usando un termomezclador (Eppendorf) a 1000 r.p.m. durante 20 minutos a 37°C. Cada pozo se aspiró para retirar el material no enlazado, se lavó tres veces con PBS IX, con un mezclado moderado (Kandpal et al., Nucí. Acids. Res. 18:1789-1795 (1990); kaneoka et al., Biotechniques 10.30-34 81991); Green et al., Nucí. Acids Res. 18:6163-5164(1990)). Digestión de la enzima de restricción de los fragmentos aislados Los productos de PCR purificados se digirieron con la enzima de restricción BsmF 1, que enlazan al sitio de reconocimiento incorporado en los productos de PCR del segundo cebador. Los productos de digestión se llevaron a cabo en los pozos Streptawell siguiendo las instrucciones proporcionadas con la enzima de restricción. Después de la digestión, los pozos se lavaron tres veces con PBS para retirar los fragmentos escindidos .

Incorporación del nucleótido etiquetado Los productos de digestión de la enzima de restricción con BsmF I produciendo un fragmento de ADN con una colgadura 5' contenida en el sitio SNP o lugar cromosomal de interés, y un extremo retirado 3'. La colgadura 5' funcionó como una plantilla que permite la incorporación de un nucleótido o nucleótidos en presencia de una polimerasa de ADN. Como se discutió detalladamente en el ejemplo 6, la secuencia de ambos alelos de un SNP puede determinarse usando un nucleótido etiquetado en presencia de otros nucleótidos no etiquetados. Los siguientes componentes se añadieron a cada relleno en la reacción: 1 µ? de ddGTP etiquetado fluorescentemente, 0.5 µ? de ddNTP no etiquetado (40 µ?) , que contienen todos los nucleótidos excepto guanina, 2 µ? de la solución amortiguadora secuenasa 10x, 0.25 µ? de la Secuenasa y el agua como fuera necesario para una reacción de 20 µ? . El relleno en la reacción se realizó a 40°C durante 10 minutos.

La dd TP etiquetada fluorescentemente se compró de Fermentas Inc. (Hanover. MD) . Todos los reactivos de etiqueta se obtuvieron de Amersham (Termo secuenasa Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565) . Después del etiquetado, cada pozo Streptawell se enjuagó con PBS IX (100 µ?) tres veces. Los fragmentos "en relleno" se liberaron entonces de los pozos Streptawell mediante la digestión con la enzima de restricción Eco I, de acuerdo a las instrucciones del fabricante que son suministradas con la enzima. La digestión se realizó durante 1 hora a 37°C con agitación a 120 r.p.m.

Detección del Lugar cromosomal de interés Las muestras se cargaron en una pista de 36 cm de gel de acrilamida (urea) al 5% (Bio Whittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, número de catálogo 50691) . Las muestras se sometieron a una electroforesis en gel a 3000 voltios durante 3 minutos. El gel se hizo correr durante 3 horas en un aparato de secuenciación (Secuenciador Hoefer SQ3) . El gel se eliminó del aparato y se escaneó en el escáner de modo Variable 9400 Typhoon. El nucleótido etiquetado incorporado se detectó mediante fluorescencia. Se extrajo un recuadro alrededor de cada banda y la intensidad de la banda se calculó usando un programa un software ImageQuant .

A continuación, se describe una esquemática de la colgadura 5' para TSC047003 después de la digestión con BsmF I: 5 ' CTCT 3 ' GAGA R A C C Posición de colgadura 1 2 3 4 Los nucleótidos observados de TSC0470003 son adenina y guanina en la hebra sentido (descrita en la presente como la hebra superior) . La tercera posición de la colgadura corresponde a la citosina, que es complementaria a la guanina. El ddGTP etiquetado se usa en presencia de dATP, dCTP, y dTTP no etiquetado. Las esquemáticas de las moléculas de ADN después de la reacción de rellenado, se describen a continuación : Alelo 1 5 'CTCT G* 3 'GAGA C A C C Posición de colgadura 1 2 3 4 Alelo 2 5 'CTCT A T G* 3 ' GAGA T A C C Posición de colgadura 1 2 3 4 Se aprecian dos bandas; la banda de peso molecular más bajo corresponde a las moléculas de ADN rellenadas con ddGTP en la posición 1 complementariamente a la colgadura y la banda de peso molecular más alto corresponde a las moléculas de ADN rellenadas con ddGTP en la posición 3 complementaria a la colgadura (ver Figura 19) . Se calculó el porcentaje del alelo 2 al alelo 1 en TSC047003 después de la amplificación del ADN de plantilla original y el ADN de plantilla muítiplexado . El uso de un nucleótido fluorescentemente etiquetado para detectar ambos alelos en una reacción sencilla, reduce la cantidad de error que se introduce a través de las reacciones de pipeteado, y el error que se introduce a través de los coeficientes cuánticos de pigmentos diferentes . Para SNP TSC047003, el porcentaje del alelo 2 al alelo 1 se calculó al dividir el valor del alelo 2 por la suma de los valores para el alelo 2 y el alelo 1. El porcentaje del alelo 1 al alelo 1 para TSC047003 en el ADN de plantilla original se calculó por ser 0.539 (ver tabla XIX) . Se efectuaron 3 reacciones por PCR para cada SNP en el ADN de plantilla multiplexado. El porcentaje promedio del alelo 2 al alelo 1 para TSC047003 en el ADN multiplexado fue de 0.49 con una desviación estándar de 0.0319 (ver tabla XIX) . No hubo una diferencia estadísticamente importante entre porcentaje obtenido sobre el ADN de plantilla y el ADN de plantilla multiplexado . Para SNP TSC1261039, el porcentaje del alelo 2 al alelo 1 para TSC1261039 en el ADN de plantilla original se calculó por ser 0.44 (ver tabla XIX) . Se efectuaron 3 reacciones por PC para cada SNP en el ADN de plantilla multiplexado (ver FIG. 19B) . El porcentaje promedio del alelo 2 al alelo 1 para TSC1261039 en el ADN multiplexado fue de 0.468 con una desviación estándar de 0.05683 (ver tabla XIX) . No hubo una diferencia estadísticamente importante entre los porcentajes del alelo 2 al alelo 1 obtenido en el ADN de plantilla original y el ADN de plantilla multiplexado.. La variación que se observa en el porcentaje del alelo 2 al alelo 1 para TSC1261039 en el ADN de plantilla multiplexado se debió probablemente a reacciones de pipeteado. La variación se puede reducir al incrementar el número de replicados. Con un gran número de replicados se puede obtener en porcentaje con una variación estadísticamente mínima. Similarmente, no hubo diferencias estadísticas entre el porcentaje del alelo 2 al alelo 1 sobre el ADN de plantilla original y sobre el ADN de plantilla multiplexado para SNP TSC0310507 y TSC1335008 (ver tabla XIX y FIGS . 19C y 19D) . Así, se puede usar una reacción multiplex para incrementar el número de regiones cromosomales que contienen los lugares de interés sin afectar el porcentaje de un alelo al otro en sitios variables.

Tabla XIX. Porcentaje del alelo 2 al alelo 1 en diver SNP con o sin multiplexar . TSC047003 Alelo 1 Alelo 2 2/(2+1) IA 5535418 6487873 0.539608748 MI 4804358 4886716 0.504249168 M2 5549389 5958585 0.517778803 M3 8356275 7030245 0.45690936 Media (M1-M3) 0.49297911 STDEV 0.031961429 TSC1261039 Alelo 1 Alelo 2 2/ (2+1) IA 3488765 2768066 0.442407027 MI 3603388 2573244 0.41660957 M2 4470423 5026872 0.529295131 M3 4306015 36694012 0.46008898 Media (M1-M3) 0.46866456 STDEV 0.056830136 TSC0310507 Alelo 1 Alelo 2 2/ (2+1) IA 2966511 2688190 0.475390299 MI 4084472 2963451 0.420471535 M2 4509891 4052892 0.47331481 M3 7173191 4642069 0.39288759 Media (M1-M3) 0.428891312 STDEV 0.040869352 TSC1335008 Alelo 1 Alelo 2 2/(2+1) IA 2311629 2553016 0.524810341 MI 794790 900879 0.531282343 M2 1261568 1780689 0.5853184 M3 1165156 1427840 0.550653 Media (M1-M3) 0.555751248 STDEV 0.027376412 Los métodos aquí descritos utilizan dos reacciones diferentes de amplificación para amplificar los lugares cromosomales de interés . En la primera reacción por PCR, se diseñaron los oligonucleótidos para combinar los pares en la dirección ascendente y la dirección descendente de los lugares cromosomales de interés. A diferencia de la amplif cación genómica tradicional, estos cebadores no se degeneraron y se combinaron a una distancia especifica desde los lugares cromosomales de interés. Sin embargo, debido a la longitud de los cebadores es probable que los cebadares se combinen en los pares base a otros cebadores del genoma. Estos cebadores se usaron para incrementar la cantidad del ADN disponible para el análisis genético. La segunda reacción de PCR emplea los métodos descritos en los ejemplos 1-6. Los cebadores se diseñan para amplificar los lugares cromosomales de interés y la secuencia se determina en los lugares cromosomales de interés. Las condiciones de la segunda reacción por PCR permite la amplificación específica de los lugares cromosomales de interés a partir del ADN de plantilla multiplexado . Si hubiera algunos productos no específicos de la reacción multiplex, no impediría la amplificación de los lugares cromosomales de interés. No hay diferencia estadística en los porcentajes del alelo 2 al alelo 1 en los 4 SNP analizados, independientemente de si se efectuó la amplificación de ADN de plantilla original o el ADN de plantilla multiplexado. Los SNP analizados en este ejemplo se localizaron en el cromosoma humano 21. Sin embargo, se pueden aplicar los métodos al ADN humano y no humano- incluyendo pero no se limitado a los cromosomas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X y Y. El método multiplex también se puede aplicar al análisis de mutaciones genéticas que incluyen pero no se limitan a, substituciones, inserciones, eliminaciones y re-cqnfiguraciones de nucleótidos . Los métodos anteriores se pueden usar para incrementar la cantidad de ADN disponibles para un análisis genético cuando se hace el ADN de plantilla de inicio que es limitado en cantidad. Por ejemplo, la lesiones pre-malignas y pre-invasoras con células malignas constituyen usualmente una fracción pequeña de las células en el espécimen, lo cual reduce el número de análisis genético que se pueden aquí efectuar. Los métodos aquí descritos se pueden usar para incrementar la cantidades de ADN maligno disponible para el análisis genético. También, el número de genomas fetales presente en la sangre materna a menudo es bajo, los métodos aquí descritos se pueden usar para incrementar la cantidad del ADN fetal .

EJEMPLO 13 El plasma generado de la sangre de una hembra preñada contiene ADN de plantilla materno y ADN de plantilla fetal. Como se discutió previamente, el porcentaje ADN fetal en el plasma materno varia para cada sujeto femenino con preñez. Sin embargo, se puede determinar el porcentaje del ADN fetal al analizar los SNP en donde el ADN de plantilla materno es homocigótico y el ADN de plantilla obtenido del plasma despliega un patrón heterocigótico . Por ejemplo, supongamos que SNP X puede ser adenina o guanina, y ADN materno para SNP X es homocigótico para guanina. El método de etiquetado descrito en el ejemplo 6 se puede usar para determinar la secuencia de ADN de plantilla en una muestra de plasma. Si la muestra de plasma contiene el ADN fetal que es heterocigótico en SNP X, se esperan las siguientes moléculas de ADN después de la digestión con la enzima de restricción de tipo IIS de BsmF I, y la reacción de relleno con el ddGTP etiquetado, dATP , dTTP y dCTP sin etiquetar. Alelo materno 1 5 ' GGGT G* 3 ' CCCA C T C A Alelo materno 2 5 ' GGGT G* 3 ' CCCA C T C A Alelo fetal 1 5 ' GGGT G* 3 ' CCCA C T c A Alelo fetal 2 5 ' GGGT A A G* 3 ' CCCA T T C A Se observan dos señales , una señal corresponde moléculas de ADN llenas con ddGTP en una posición uno complementaria a la colgadura y la segunda señal corresponde a las moléculas de ADN llenas con ddGTP en la posición 3 complementaria a la colgadura. Sin embargo, el ADN materno es homocigótico para la guanina, lo cual corresponde las moléculas de ADN llenas en la posición uno complementaria a la colgadura. La señal de las moléculas de ADN rellenas con ddGTP en la posición 3 complementaria la colgadura, corresponden al alelo de adenina que representa el ADN fetal, Esta señal se convierte en un guía para el ADN fetal, y se puede usar para medir la cantidad del ADN fetal presente en la muestra de plasma. No hay diferencia entre la cantidad del ADN. fetal de un cromosoma al otro. Por ejemplo, el porcentaje del ADN fetal en cualquier individuó del cromosoma 1, es igual que el porcentaje del ADN fetal del cromosoma 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X y Y. Así, la relación de alelo calculada para SNP en un cromosoma se puede comparar con la relación de alelo para el SNP en el otro cromosoma . Por ejemplo, la relación de alelo para SNP en el cromosoma 1 debe ser igual a la relación de alelos para SNP en los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X y Y. Sin embargo, si el feto tiene una anormalidad cromosomal incluyendo pero no limitado a trisomía o monosomía, la relación para el cromosoma que está presente en el número de copias anormales diferirá de la relación a los otros cromosomas . Se recolectó la sangre de una hembra preñada después del consentimiento informado que se había obtenido. Se usó la muestra de sangre para demostrar que el ADN fetal se puede detectar en el plasma materno al analizar los SNP en donde el ADN materno fue homocigótico y el mismo SNP despliega un patrón heterocigotico a partir del ADN obtenido del plasma de una mu er embarazada.

Preparación del plasma de sangre entera Se aisló plasma de 4 tubos que contiene cada uno 9 mi de sangre (Fischer Scientific, tubos de 9 mi EDTA Vacuette, número catalogo NC9897284) . La sangre se obtuvo por punción en la vena de una mujer embarazada de quien se tenía el consentimiento informado. Después de recolectar la sangre, se agregó formaldehído (25 µ?/ml de sangre) a cada uno de los tubos. Se colocaron los tubos a 4°C hasta el embarque. Se embarcaron los tubos a través de Federal Express en un contenedor de espuma que contiene un empaque de hielo. La sangre se centrifugó a 1000 rpm por 10 minutos. El freno en la centrífuga no se utilizó. Esta etapa de centrifugación se repitió. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se giró a 3,000 rpm por 10 minutos. No se usó el freno en la centrífuga. El sobrenadante de cada uno de los 4 tubos se acumuló y se formaron alícuotas en los 2 tubos. Se almacenó el- lasma a -80°C hasta que se purificó el ADN. Se aisló el ADN de plantilla usando el Kit Midi para sangre de ADN de QIAmp suministrado por QIAGEN (número de catálogo 51183) . Se aisló el ADN de plantilla según las instrucciones incluidas en el kit. El ADN de plantilla de plasma se eluyó en un volumen final de 20 microlitros.

Aislamiento del ADN materno Después de que se retiró el plasma de la muestra arriba descrita, 1 mililitro de la muestra arriba de sangre remanente que se requiere comúnmente como un recubrimiento esponj oso se transfirió a un nuevo tubo . Se agregó 1 mililitro de IX PBS a la muestra. Se aisló el ADN de plantilla usando el Kit Midi de sangre QIAmp suministrado por QIAGEN (número de catálogo 51183) . Identificación de los SNP maternos omocigóticos El ejemplo 8 describe un método para identificar los SNP que son altamente variables dentro de la población o para identificar los SNP heterocigóticos para un individuo dado. Los métodos como se describen en el ejemplo 8 se aplicaron al ADN de plantilla materno para identificar los SNP en el cromosoma 13 en donde el ADN materno fue homocigótico . Se puede separar por exclusión cualquier número de SNP. El número de SNP para separar por exclusión es proporcional al número de los SNP heterocigóticos en el ADN fetal que se necesita analizar. Como se describe en detalle en el ejemplo 6, un nucleótido etiquetado se puede usar para determinar la secuencia de ambos alelos en un SNP particular. Los SNP para los cuales se puede determinar la secuencia con el ddGTP etiquetado en presencia de dATP, dTTP, y dCTP sin etiquetar se escogieron de este ejemplo. Sin embargo, los SNP para los cuales se pueden determinar la secuencia con el ddATP, ddCTP o ddTTP etiquetado también se pueden usar. Adicionalmente, los SNP analizados pueden escogerse de manera tal que todos sean etiquetados con el mismo nucleótido o cualquier combinación de los 4 nucleotidos. Por ejemplo, si 400 SNP se van a seleccionar, se pueden escoger 100 de manera tal que se determine la secuencia con el ddATP etiquetado, se pueden escoger 100 de manera que la secuencia se determina con el ddTTP etiquetado, 100 se pueden escoger de manera que se determina la secuencia con ddGTP etiquetado, y 100 se pueden escoger de manera que las secuencias se determinen con el ddCTP etiquetado, o cualquier combinación de los 4 nucleotidos etiquetados . Se identificaron 29 SNP en donde el ADN materno fue homocigótico : TSC0052277, TSC1225391, TSC0289078, TSC1349804, TSC0870209, TSC0194938, TSC0820373, TSC09002859, TSC0501510, TSC1228234, TSC0082910, TSC0838335, TSC0818982, TSC0469204, TSC1084457, TSC0466177, TSC1270598, TSC1002017, TSC1104200, TSC0501389, TSC0039960, TSC0418134, TSC0603688, TSC0129188, TSC1103570, TSC0813449, TSC0701940, TSC0087962 y TSC0660274. Los SNP heterocigoticos variarán de individuo a individuo.

Diseño de los cebadores multiplex Un número bajo de copias de los genomas fetales está presente típicamente en el plasma materno. Para incrementar el número de copias de los lugares cromosomales de interés localizados en el cromosoma 13, se diseñaron cebadores para combinar los pares base aproximadamente 15 ó 30 bases en la dirección ascendente y 130 en la dirección ascendente de cada uno de los lugares cromosomales de interés. Esto se hizo para reducir el error de muestreo estadístico que puede suceder cuando se trabajan en un número bajo de genomas que puede tener influencia en la relación de un alelo al otro (ver ejemplo 11) . Los cebadores tuvieron 12 bases de longitud. Sin embargo, se pueden usar cebadores de cualquier longitud incluyendo pero no se limitan a, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45 46-55, 56-65, 66-75, 76-85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125 y más de 125 bases . Se diseñaron los cebadores para combinar los pares base en la hebra de sentido y en la hebra anti-sentido .

Los cebadores se diseñaron para terminar en la terminación 3 ' en el dinucleótido "AA" para reducir la formación de cebador-dímeros . Sin embargo, se pueden diseñar los dímeros hasta un extremo en cualquiera de los cuatro nucleótidos y en cualquier combinación de los cuatro nucleótidos . Los cebadores multiplex para SNP TSC0052277 fueron: Cebador delantero: 51 GACATGTTGGAA3 ' Cebador inverso : 5 'ACTTCCAGTTAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC 1225391 fueron: Cebador delantero: 5 ' GTTTCCTGTTAA3 ' Cebador inverso 51 CGATGATGACAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0289078 fueron: Cebador delantero 5 ' GAGTAGAGACAA3 ' Cebador inverso 5 ' TCCCGGATACAA31 Los cebadores multiplex para SNP TSC 1349804 fueron: Cebador delantero: 51 CATCCTCTAGAA3 ' Cebador inverso : 5 ' ATTCCTGAGAA31 Los cebadores multiplex para SNP TSC0870209 fueron: Cebador delantero: 5 'AGTTTGTTTTAA31 Cebador inverso : 51 ATAAACGATAA31 Los cebadores multiplex para SNP TSC0194938 fueron: Cebador delantero: 5 * TTTGACCGATAA3 ' Cebador inverso : 5 ' TGACAGGACCAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0820373 fueron Cebador delantero: 51 TTATTCATTCAA3 ' Cebador inverso : 5 'AGTTTTTCACAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0902859 fueron Cebador delantero: 5 ' CACCTCCCTGAA3 ' Cebador inverso : 5 ' CCAGATTGAGAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0501510 fueron Cebador delantero: 51 GTG CCACCAA3 ' Cebador inverso : 5 ' CTTCTATTCCAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC1228234 fueron: Cebador delantero: 5 ' TCACAATAGGAA31 Cebador inverso : 5 ' ACAAGTGAGAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0082910 fueron: Cebador delantero: 51 GAGTTTTCGTAA31 Cebador inverso : 51 GTGTGCCCCCAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0838335 fueron Cebador delantero: 51 GCACCACTGCAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GAACACAATGAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0818982 fueron Cebador delantero : 5 ' TATCCTATTCAA3 ' Cebador inverso : 5 ¦ CAACCATTATAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0469204 fueron Cebador delantero : 5 ' TATGCTTTACAA3 ' Cebador inverso : 5 ' TTGTTTACCAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC1084457 fueron: Cebador delantero: 5 'AGGAAATTAGAA31 Cebador inverso : 5 ' GTTAGA ??3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0466177 fueron: Cebador delantero: 5 ' ATTTGGAGGAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GGCATTTGTCAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC 1270598 fueron Cebador delantero: 5 'ATACTCCAGGAA3 ' Cebador inverso : 5 ' CAGCCTGGACAA31 Los cebadores multiplex para SNP TSC 1002017 fueron Cebador delantero: 51 CCATTGCAGTAA31 Cebador inverso : 5 'AGGTTCTCATAA31 Los cebadores multiplex para SNP TSC1104200 fueron: Cebador delantero : 51 GTCATCATTAA3 ' Cebador inverso : 5 ' GGTATTTGCAA31 Los cebadores multiplex para SNP TSC0501389 fueron Cebador delantero: 5 ' TAGGGTTTGTAA3 ' Cebador inverso : 5 ' CCCTAAGTAGAA31 Los cebadores multiplex para SNP TSC0039960 fueron Cebador delantero : 51 GTATTTCTTTAA31 Cebador inverso: 51 GAGTCTTCCCAA31 Los cebadores multiplex para SNP TSC0418134 fueron Cebador delantero : 5 ' CAGGTAGAGTAA31 Cebador inverso : 5 ' ATAGGATGTGAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0603688 fueron Cebador delantero : 5 ' CAATGTGTATAA3 ' Cebador inverso: 51AGAGGGCATCAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0129188 fueron Cebador delantero: 51 CCAGTGGTCTAA3 ' Cebador inverso: 5 ' TAAACAATAGAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC1103570 fueron: Cebador delantero: 51 GCACACTTTTAA3 ' Cebador inverso : 51ATGGCTCTGCAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0813449 fueron Cebador delantero: 5 ' GTCATCTTGTAA3 ' Cebador inverso: 5 ' TGCTTCATCTAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0701940 fueron Cebador delantero: 5 'AGAAAGGGGCAA3 ' Cebador inverso : 5 ' CTTTTCTTTCAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0087962 fueron Cebador delantero: 5 ' CTACTCTCTCAA3 ' Cebador inverso: 5 'ACAGCATTATAA3 ' Los cebadores multiplex para SNP TSC0660274 fueron Cebador delantero: 5 ' ACTGCTCTGGAA3 ' Cebador inverso: 5 ' GCAGAGGCACAA3 ' Multiplex PCR Las regiones en el cromosoma 13 que rodean a los 29 SNP antes mencionados, se amplificaron a partir del ADN de plantilla genómico usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, Patentes de E.U.A. Nos. 4,S83,195 y 4,683,202, que se incorporan aquí como referencia) . Esta reacción por PCR utilizó cebadores que combinaron aproximadamente 150 bases en dirección ascendente y en dirección descendente de los lugares cromosomales de interés. Se mezclaron cincuenta y ocho cebadores juntos y se usaron en una reacción sencilla para amplificar el ADN de plantilla. Esta reacción se usó para incrementar el número de copias de los lugares cromosomales de interés para eliminar algunos errores que pudieran resultar de un número bajo de genomas. Para una especificidad incrementada, se usó PCR "inicio en caliente" . Las reacciones de PCR se realizaron usando un kit Mix Master HotStarTaq proporcionadas por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y la reacción por cebador puede optimizarse para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, se usaron 20 µ? del ADN de plantilla de plasma. Dos microlitros de cada cebador delantero e inverso, a concentraciones de 5 mM se acumularon en un tubo microcentrífugo y se mezclaron. Cuatro microlitros de la mezcla cebadora se usaron en un volumen total de reacción PCR de 50 µ? (20 µ? de ADN de plantilla de plasma, 1 µ? de agua estéril, 4 µ? de mezcla de cebador, y 25 µ? de HotStar Taq) . Se efectuaron veinticinco ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones por PCR: (1) 95°C durante 15 minutos; (2) 95°C durante 30 segundos; (3) 4°C durante 30 segundos; (4) 370C durante 30 segundos ; (5) Etapas repetidas 2-4 veinticuatro (24) veces; (6) 72°C durante 10 minutos. Las temperaturas y tiempos para desnaturalización, combinación de pares base y extensión, se pueden optimizar al intentar diversas configuraciones y usando los parámetros que producen los mejores resultados. Otros métodos de amplificación genómica también se pueden usar para incrementar el número de copias de los lugares cromosomales de interés, que incluyen pero no se limitan a preamplificación de la extensión del cebador (PEP) (Zhang et al., PNAS, 89:5847-51, 1992), PCR de cebado de oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR) (Telenius, et al., Genomics 13:718-25, 1992), amplificación del desplazamiento de hebras usando ADN polimerasa a partir del bacteriófago 29, que se somete a una replicación de círculo de rodillo (Dean et al., Genomic Research 11:1095-99, 2001), amplificación de desplazamiento múltiple (Patente de E.U.A. 6,124,120), kit (s) de amplificación de genoma completo REPLI-g™, y PCR etiquetada. Purificación del fragmento de interés. Los cebadores sin usar y los nucleótidos se retiraron de la reacción al usar los kit(s) de purificación Qiagen MinElute PCR (Qiagen, número de catálogo 28004) . Las reacciones se efectuaron siguiendo las instrucciones del fabricante suministradas con las columnas. Se eluyó el ADN en 100 µ? de agua estéril . Reacción dos PCR Diseño de Cebadores SNPTSC0052277 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5 ' CTCCGTGGTATGGAATTCCACTCAAATCTTCATTCAGA3 ' Segundo cebador : 51ACGTCGGGTTACGGGACACCTGATTCCTC31 SNP TSC1225391 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador -. Primer cebador: 5 ' TACCATTGGTTTGAATTCTTGTTTCCTGTTAACCATGC3 ' Segundo cebador: 51 GCCGAGTTCTACGGGACAGAAAAGGGAGC3 ' SNP TSC0289078 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 ' TGCAGTGATTTCGAATTCGAGACAATGCTGCCCAGTCA3 ' Segundo cebador : 5 ' TCTAAATTCTCTGGGACCATTCCTTCAAC31 SNP TSC 1349804 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 51ACTAACAGCACTGAATTCCATGCTCTTGGACTTTCCAT31 Segundo cebador : 5 ' TCCCCTAACGTTGGGACACAGAATACTAC3 ' SNP TSC0870209 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 ' GTCGACGATGGCGAATTCCTGCCACTCATTCAGTTAGC3 ' Segundo cebador: 5 ' GAACGGCCCACAGGGACCTGGCATAACTC3 ' SNP TSCO 194938 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5 ' TCATGGTAGCAGGAATTCTGCTTTGACCGATAAGGAGA3 ' Segundo cebador : 51ACTGTGGGATTCGGGACTGTCTACTACCC31 SNP TSC0820373 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 'ACCTCTCGGCCGGAATTCGGAAAAGTGTACAGATCATT3 ' Segundo cebador : 5 ' GCCGGATACGAAGGGACGGCTCGTGACTC3 ¦ SNP TSC0902859 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 ' CCGTAGACTAAAGAATTCCCTGATGTCAGGCTGTCACC31 Segundo cebador: 51ATCGGATCAGTCGGGACGGTGTCTTTGCC3 ' SNP TSC0501510 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 ' GCATAGGCGGGAGAATTCCCTGTGTCCACCAAAGTCGG3 ' Segundo cebador: 51 CCCACATAGGGCGGGACAAAGAGCTGAAC3 ' SNP TSC 1228234 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5 ' GGCTTGCCGAGCGAATTCTAGGAAAGATACGGAATCAA31 Segundo cebador: 5 ' AACCCTCATACGGGACTTTCATGGAAGC3 ' SNP TSC0082910 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 'ATGAGCACCCGGGAATTCTGATTGGAGTCTAGGCCAAA31 Segundo cebador: 5 ' GCTCACCTTCTGGGACGTGGCTGGTCTC3 ' SNP TSC0838335 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 51ACCGTCTGCCACGAATTCTGGAAAACATGCAGTCTGGT3 ' Segundo cebador: 51 TACACGGGAGGCGGGACAGGGTGATTAAC31 SNP TSC0818982 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador : 5 ¦ CTTAAAGCTAACGAATTCAGAGCTGTATGAAGATGCTT3 ' Segundo cebador: 5 ' ACGCTAAAGGGGGGACAACATAATTGGC31 SNP TSC0469204 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador : 5 ' TGTAAGAACGAGAATTCTGCAACCTGTCTTTATTGAA3 ' Segundo cebador : 5 ' CTTCACCACTTTGGGACACTGAAGCCAAC3 ' SNP TSC 1084457 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 51 AACCATTGATTTGAATTCGAAATGTCCACCAAAGTTCA3 ' Segundo cebador: 51 TGTCTAGTTCCAGGGACGCTGTTACTTAC31 SNP TSC0466177 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador : 5 ' CGAAGGTAATGTGAATTCTGCCACAATTAAGACTTGGA31 Segundo cebador: 51ATACCGGTTTTCGGGACAGATCCATTGAC3 ' SNP TSC1270598 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador : 5 ' CCTGAAATCCACGAATTCCACCCTGGCCTCCCAGTGCA31 Segundo cebador: 51 AGATGGTAGGTGGGACAGGACTGGCTTC31 SNP TSC1002017 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 ' GCATATCTTAGCGAATTCCTGTGACTAATACAGAGTGC31 Segundo cebador : 5 ' CCAAATATGGTAGGGACGTGTGAACACTC3 ' SNP TSC1104200 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 51 TGCCGCTACAGGGAATTCATATGGCAGATATTCCTGAA31 Segundo cebador : 5 5 'ACGTTGCGGACCGGGACTTCCACAGAGCC3 ' SNP TSC0501389 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 ' CTTCGCCCAATGGAATTCGGTACAGGGGTATGCCTTAT3 ¦ Segundo cebador: 5 ' TGCACTTCTGCCGGGACCAGAGGAGAAAC3 ' SNP TSC0039960 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador : 5 ' TGTGGGTATTCTGAATTCCACAAAATGGACTAACACGC3 ' Segundo cebador: 5 'ACGTCGTTCAGTGGGACATTAAAAGGCTC3 ' SNP TSC0418134 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador : 5 ' GGTTATGTGTCAGAATTCTGAAACTAGTTTGGAAGTAC3 ' Segundo cebador: 5 ' GCCTCAGTTTCGGGGACAGTTCTGAGGAC3 ' SNP TSC0603688 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5 ' GTAACACGGCCGAATTCCTCATTTGTATGAAATAGGT31 Segundo cebador: 5 'AATCTAACTTGAGGGACCGGCACACACAC3 ' SNP TSC0129188 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 5' AGTGTCCCTTAGAATTCGCAGAGACACCACAGTGTGC 3' Segundo cebador : 5' TTTGCTACAGTCGGGACCCTTGTGTGCTC 3' SNP TSC 1103570 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador 5' AGCCATCACTAGAATTCAATACCATGTGTGAGCrCAA 3' Segundo cebador: 5' AATCCTGCTTCCGGGACCTAACTTTGAAC 3' SNP TSC 0813449 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5' TTTCATTTTCTGGAATTCCTCTAATGATTTTCTGGAGC 3' Segundo cebador: 5' CGTCGCCGCGTAGGGACTTTTTCTTCCAC 3' SNP TSC 0701940 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5' TTACTTAATCCTGAATTCGAGAAAAGCCATGTTGATAA 3' Segundo cebador : 51 CATGGGTCGCTGGGACTTTGCCCTCTGC3 ' SNP TSC0087962 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador: Primer cebador: 5 'ACTAACAGCACTGAATTCATTTTACTATAATCTGCTAC3 ' Segundo cebador: 5 ¦ GTTAGCCGAGAAGGGACTGTCTGTGAAGC31 - SNP TSC0660274 se amplificó usando el siguiente conjunto cebador : Primer cebador: 51AAATATGCAGCGGAATTCGTAAGTGACCTATTAATAAC31 Segundo cebador : 51 GCGATGGTTACGGGGACAGCCAGGCAACC3 ' Cada primer cebador tuvo una etiqueta de biotina en la terminación 5' y contenía un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para EcoRI y se diseñó para combinar los pares base a una distancia específica del lugar cromosomal de interés . Esto permite que se efectúe una reacción sencilla para los lugares cromosomales de interés ya que cada lugar cromosomal de interés migrará en una posición diferente (con base en la posición de combinación de los pares base de el primer cebador) . El segundo cebador contiene un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para BsmFI . Todos los lugares de interés se amplificaron a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción de la cadena polimerasa (PCR, patentes norteamericana Nos. 4, 683,195 y 4,683,202 incorporada aguí por referencia) . En este ejemplo, el lugares de interés se amplificó en tubos de reacción por separado pero que podrían amplificarse también al mismo tiempo en una reacción de PCR sencilla. Para incrementar la especificidad, se usó PCR de ¾ inicio en caliente". Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando el kit Mix Master HotStar Taq proporcionada por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de cebador y de ADN de plantilla por reacción pueden optimizarse para cada lugar cromosomal de interés. Un microlitro del ADN multiplexado de plantilla que se eluyó de la columna MiniElute, se usó en la reacción de PCR para cada lugar cromosomal de interés, y se usaron 5 UM de cada cebador. Los veintinueve SNP descritos anteriormente también se amplificaron del ADN materno (15 ng de ADN se usó en la reacción por PCR; las concentraciones de cebador fueron como se establecieron arriba) . Se realizaron cuarenta ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones de PCR: (1) 95°C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 37°C durante 30 segundos; (3) 5°C durante 30 segundos; (4) 57 °C durante 30 segundos ; (5) 95°C durante 30 segundos; (6) 64°C durante 30 segundos; (7) 95°C durante 30 segundos; (8) repetir las etapas 6 y 7, treinta y nueve (39) veces ; (9) 72 °C durante 5 minutos. En el primer ciclo de PCR, la temperatura de la combinación de pares básicos fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región de la combinación de pares básicos 3' de los cebadores secundarios, la cual fue 37°C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el segundo ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la región 3', que combina pares básicos al ADN de plantilla, del primer cebador, que fue de 57 °C. La temperatura de la combinación de pares básicos en el tercer ciclo de PCR fue aproximadamente la temperatura de fusión de la secuencia completa del segundo cebador, fue de 64°C. La temperatura de la combinación de pares básicos para los ciclos restantes fue de 64°C. Al realizar una escala de la temperatura de la combinación de pares básicos a partir de TMl a T 2 a TM3 en los primeros tres ciclos de PCR mejora ampliamente la especificidad. Estas temperaturas de la combinación de pares básicos son representativas, y el técnico experto comprenderá que las temperaturas de la combinación de pares básicos para cada ciclo dependen de los cebadores específicos usados . Las temperaturas y tiempos para desnaturalizar, combinar pares base y extensión se pueden optimizar al intentar diversas configuraciones y usar los parámetros que producen los mejores resultados. En este ejemplo, el primer cebador se diseño para combinar los pares base a diversas distancias desde el lugar cromosomal de interés . El técnico experimentado entiende que la ubicación de combinación de los pares base del primer cebador pueden ser 5-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81-85,86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-110, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-140, 140-160, 160-180, 180-200, 200-220, 220-240, 240-260, 260-280, 280-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, o más de 500 bases del lugar cromosomal de interés . Purificación del fragmento de interés Los productos de PCR se separaron del 7ADN de plantilla genómico. Una parte de la reacción de PCR se trasfirió a un pozo de un a placa de enlace elevado, transparente, Pozo Streptawell de Roche Diagnostics GMBH (número de catálogo 1 645 692, como se lista en Roche Molecular Biochemicals, catálogo Biochemicals 2001) . Alternativamente los productos de PCR se pueden acumular en un pozo sencillo debido a que el primer cebador se diseñó para permitir que los lugarés cromosomales de interés se separen con base en el peso molecular. Los primeros cebadores contuvieron una etiqueta 5' de biotina enlazando así los productos de PCR a los pozos revestidos con estreptavidina mientras que para la plantilla genómica no se hizo lo mismo. La reacción de enlace de estreptavidina se realizó usando un termomezclador (Eppendorf) a 1000 r.p.m. durante 20 minutos a 37°C. Cada pozo se aspiró para retirar el material no enlazado, se lavó tres veces con PBS IX, con un mezclado moderado (Kandpal et al., Nucí. Acids. Res. 18:1789-1795 (1990); kaneoka et al., Biotechniques 10.30-34 81991); Green et al., Nucí. Acids Res. 18:6163-6164 (1990) ) .

Digestión de la enzima de restricción de los fragmentos aislados Los productos de PCR purificados · se digirieron con la enzima de restricción BsmF 1, que enlazan al sitio de reconocimiento incorporado en los productos de PCR del segundo cebador. Los productos de digestión se llevaron a cabo en los pozos Streptawell siguiendo las instrucciones proporcionadas con la enzima de restricción. Después de la digestión, los pozos se lavaron tres veces con PBS para retirar los fragmentos escindidos. Incorporación del nucleotido etiquetado Los productos de digestión de la enzima de restricción con BsmF I produciendo un fragmento de ADN con una colgadura 5' contenida en el sitio SNP o lugar cromosomal de interés, y un extremo retirado 3' . La colgadura 5' funcionó como una plantilla que permite la incorporación de un nucleotido o nucleótidos en presencia de una polimerasa de ADN.

Como se demostró en el ejemplo 6, la secuencia de ambos alelos de un SNP puede determinarse al llenar en la colgadura con un nucleótido etiquetado en presencia de otros nucleotidos no etiquetados. Los siguientes componentes se añadieron a cada relleno en la reacción: 1 µ? de ddGTP etiquetado fluorescentemente, 0.5 µ? de ddNTP no etiquetado (40 µ?) , que contienen todos los nucleotidos excepto guanina, 2 µ? de la solución amortiguadora secuenasa lOx, 0.25 µ? de la Secuenasa y el agua como fuera necesario para una reacción de 20 µ? . El relleno en la reacción se realizó a 40°C durante 10 minutos. La ddNTP etiquetada fluorescentemente se compró de Fermentas Inc . (Hanover MD) . Todos los otros reactivos de etiquetado se obtuvieron de Amersham ¦ (Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 795S5) . Después del etiquetado, cada pozo Strepta ell se enjuagó con PBS IX (100 µ?) tres veces. Los fragmentos "en relleno" se liberaron entonces de los pozos Streptawell mediante la digestión con la enzima de restricción EcoRI, de acuerdo a las instrucciones del fabricante que son suministradas con la enzima. La digestión se realizó durante 1 hora a 37 °C con agitación a 120 r.p.m. Detección del lugar cromosomal de interés. Después de la liberación de matriz de estreptavidina, la muestra se cargó en una pista de 36cm 5% de acrilamida en gel (urea) (BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, número de catálogo 50691) . La muestra se trató por electroforesis en el gel a 3000 voltios por 3 minutos. El gel se corrió por 3 horas en un aparato de secuencia (Hoefer SQ3 Sequencer) . Se retiró el gel del aparato y se escaneó en un formador de imágenes del modo variable Typhoon 9400. El nucleótido etiquetado incorporado se detectó por fluoresceneia. A continuación se detalla una colgadura 5' esquemática para el SNP TSC0838335.· No se reproduce la secuencia completa solamente una porción para la detallar la colgadura (en donde R indica el sitio variable) . 10/14 5' TAA 3' ATT R A C A posición de colgadura 1 2 3 4 Los nucleótidos observados para TSC0838335 son adenina y guanina en la hebra de sentido 5' (detallada aquí como la hebra superior) . El nucleótido en la posición tres de la colgadura correspondió a la citosina que es complementaria a la guanina. Se puede usar el ddGTP etiquetado para determinar la secuencia del alelo en presencia del dATP, dCTP y dTTP sin etiquetar . La enzima de restricción BsmFI se usa para crear la colgadura 5' que corta típicamente del 10/14 desde el sitio de reconocimiento. En momentos, el BsmFI cortará 11/15 desde el sitio de reconocimiento y genera la siguiente colgadura. 11/15 5/ A 3?? T R A C posición de colgadura 0 1 2 3 La posición 0 en la colgadura es timidina que es complementaria por adenina. La posición 0 complementaria a la colgadura se lleno con el dATP sin etiquetar y así después de la reacción de relleno, las mismas columnas exactas se generaron ya sea que la enzima se corte en 10/14 o 11/15 desde el sitio de reconocimiento. Las moléculas de ADN generadas después de la reacción de rellenado se detallan a continuación.

G alelo 10/14 5' ??? G* 3' ATT C A C A Posición de colgadura 1 2 3 4 G alelo 11/15 5' TA A 3 ' AT T Posición de colgadura 0 A alelo 10/14 5' ???? 3' ATTT Posición de colgadura A alelo 11/15 5' TA A A T G* 3' AT T T A C 0 1 2 3 El ADN de plantilla materno amplificado para TSC0838335, desplegó una banda sencilla que migra en la posición esperada de la banda de peso molecular superior la cual correspondió al alelo A (ver la figura 20 pista 1) . El ADN de plantilla materno se homocigótico para la adenina en SNP TSC0838335. Sin embargo, en la pista 2 la amplificación del ADN de plantilla multiplexado para TSC0838335 aislado del plasma del mismo individuo desplegó dos bandas, una banda de peso molecular inferior que correspondió al alelo G y la banda de peso molecular se correspondió al alelo A. El ADN de plantilla aislado del plasma de un sujeto femenino con preñez contiene el ADN de plantilla materno y el ADN de plantilla fetal. Como se observa en la figura 20 pista 1, el ADN de plantilla materno fue homocigótico para la adenina en este SNP (se compara con las pistas. 1 y 2) . El alelo G representó el ADN fetal. Las señales del ADN de plantilla materno y el ADN de plantilla fetal se han diferenciado claramente. El alelo G se convierte en una guia para el alelo fetal y se puede usar para medir la cantidad de ADN fetal presente en la muestra. Adicionalmente, una vez que el porcentaje del ADN fetal en el plasma materno se ha determinado para una muestra dada, cualquier desviación de este porcentaje indica una anormalidad cromosomal. Ere método proporciona un primer método no invasivo para la detección de anormalidades cromosomales fetales. Como se observa en la figura 20, pista 3, el análisis del ADN materno para SNP TSC0418134 generó una banda sencilla que migró en la posición esperada de la banda de peso molecular superior que correspondió al alelo de adenina. Similarmente, el análisis del ADN de plantilla multiplexado aislado del plasma materno dio una banda sencilla la cual migró en la posición esperada del alelo de adenina (ver figura 20, pista 4) . El ADN materno y el ADN fetal son homocigóticos para la adenina TSC0418134. A continuación se detalla un esquema de la colgadura 5' para TSC0129188 en donde R indica el sitio variable. 10/14 5' TCA 3' AGTA R A C T Posición de colgadura 1 2 3 4 La dirección ascendente del nucleótido del sitio variable (R) no corresponde a la guanina en la hebra de sentido. Asi, la colgadura 5' generada por las propiedades de corte de 11/15 de BsmFI se rellenarán de forma idéntica con la colgadura 5' generada por el corte 10/14. El ddGTP etiquetado en presencia del dATP, dTTP, y dCTP sin etiquetar se uso para la reacción de relleno. Las moléculas de ADN generadas después de la reacción de relleno se detallan a continuación.

Alelo A 10/14 5' TCAT A T G* 3' AGTA T A C T Posición de colgadura 1 2 3 4 G alelo 10/14 5' G* . 3' AGTA C A C T Posición de colgadura 1 2 3 4 El análisis del ADN materno para SNP TSC0129188 dio una banda sencilla que correspondió con las moléculas de ADN rellenas con ddGTP en la posición 1 complementaria a la colgadura que representó el alelo G (ver figura 20 pista 5) . No se detectó ninguna banda para el alelo de adenina lo que indica que el ADN materno es homocigótico para la guanina. En contraste, el análisis del ADN de plantilla multiplexado del plasma materno que contiene ADN materno y ADN fetal dio dos bandas diferentes (ver figura 20 pista 6) . La banda de peso molecular inferior correspondió al alelo G mientras que- el peso molecular correspondió al alelo A. El alelo A representa el ADN fetal asi, se ha desarrollado un método que permite la separación del ADN materno y las señales de ADN fetal si la complejidad adicional de tener células aisladas fetales. Además, no se requiere una muestra del ADN paterno para detectar las diferencias entre el ADN materno y el ADN fetal. El análisis del ADN materno para SNP TSC0501389 dio una banda sencilla que migró en la posición de -peso molecular superior que corresponde al alelo A. No se detectó ninguna banda que corresponda al alelo G. Similarmente el análisis del ADN de plantilla multiplexado del plasma materno para SNP TSC0501389 dio una banda sencilla que migró en una posición de peso molecular que corresponde al alelo A. El ADN de plantilla materno y el ADN de plantilla fetal fueron homocigóticos para la adenina en SNP TSC0501389. El ADN materno y el ADN de plantilla del plasma se originaron de la misma muestra. Una muestra que se obtuvo a través de un procedimiento no invasor proporcionó una huella genética para la madre y el feto. De los veintinueve SNP para los cuales fue homocigótica el ADN de plantilla materna el ADN de plantilla fetal fue heterocigótico en dos de los veintinueve SNP. El ADN fetal fue homocigótico para el mismo alelo como el ADN de plantilla materno en los 27 SNP restantes (no se muestran los datos) . Al comparar el alelo homocigótico del ADN de plantilla materno y el ADN de plantilla de plasma en un SNP dado proporciona un nivel añadido de control de calidad. No es posible que el ADN de plantilla materno y el ADN de plantilla de plasma sean homocigóticos para alelos diferentes en el mismo SNP. Si esto se observa indicaría que ha sucedido un error en el procesamiento. Los métodos aquí descritos demuestran que la señal genética materna se pueden separar y distribuir de la señal genética fetal en una muestra de plasma materno. Los SNP analizados del ejemplo anterior localizados en el cromosoma 13, sin embargo, se puede localizar cualquier cromosoma incluyendo el cromosoma humano 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X e Y, y los cromosomas fetales 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X e Y. Además los mérodos aquí descritos se pueden usar para detectar el ADN fetal en cualquier muestra biológica incluye pero no sé limita a células, tejidos, suero, plasma, saliva, orina, lágrimas, secreciones vaginales, sangre del cordón umbilical, vellosidades coriónicas, fluido amniótico, tejidos embriónicos, fluido linfático, fluido cerebro espinal, secreciones de la mucosa, fluido peritoneal, fluido ascítico, material fecal, o exudados del cuerpo.

Los métodos aquí descritos demuestran que el porcentaje del ADN fetal en la muestra materna se pueden determinar al analizar los SNP en donde el ADN materno es homocigótico y el ADN aislado del plasma del sujeto con preñez es heterocigótico. Se puede usar el porcentaje del ADN fetal para determinar si el genotipo fetal tiene algunos trastornos cromosomales . Por ejemplo, si el porcentaje del ADN fetal presente en la muestra se calcula para hacer 30% por análisis del cromosoma 1 (las anormalidades cromosomales que involucran el cromosoma 1 terminan temprano en el embarazo) , entonces cualquier desviación del ADN fetal al 30% es indicadora de una anormalidad cromosomal. Por ejemplo si con el análisis de un SNP o SNP múltiples en el cromosoma 18, el porcentaje del ADN fetal es mayor del 30%, esto indicaría que una copia adicional del cromosoma 18 está presente. El porcentaje calculado del ADN fetal a partir de cualquier cromosoma se puede comparar con cualquier otro cromosoma. En particular el porcentaje del ADN fetal en el cromosoma 13 se puede comparar al porcentaje del ADN fetal en los cromosomas 18 y 21. Este análisis se ayuda por el conocimiento de la relación esperada de un alelo al otro alelo en cada SNP. Como se discutió en el ejemplo 9, no todos los SNP heterocigóticos despliegan relaciones de 50:50. El conocimiento de la relación esperada de un número al otro reduce el número global de sitios variables que se deben analizar. Sin embargo, aun sin el conocimiento de la relaciones esperadas para los diversos SNP, el porcentaje del ADN fetal se puede calcular al analizar un número de SNP. Cuando el tamaño de muestreo de SNP es- suficientemente grande la variación estadística que resulta de los valores de las relaciones esperadas se eliminará. Además los SNP maternos heterocigóticos también proporciona información valiosa. El análisis no se limita a los SNP maternos homocigóticos . Por ejemplo, si un SNP heterocigótico en el ADN materno la relación del alelo 1 al alelo 2 es 1:1, entonces en el ADN de plantilla de plasma la relación debe permanecer 1:1 al menos que el ADN fetal lleve una anormalidad cromosomal. Los métodos anteriores también se puede usar para detectar mutaciones en el ADN fetal incluyendo pero no limitado a mutaciones de punto, transiciones, transversiones, transubicaciones, inserciones, eliminaciones y duplicaciones. Como se observa en la figura 20, el ADN fetal se puede diferenciar fácilmente del ADN materno. Los métodos anteriores se puede usar para determinar la secuencia de cualquier lugar cromosomal de interés por cualquier gen.

EJEMPLO 14 El plasma aislado de la sangre de' una mujer embarazada contiene ADN de plantilla materna y ADN de plantilla fetal. Como se discute arriba, se pueden determinar las anormalidades cromosomales fetales por el análisis de los SNP en donde el ADN de plantilla materna es homocigótico y el ADN de plantilla obtenido del plasma despliega un patrón heterocigótico . Por ejemplo, supongamos que SNP X puede ser adenina o guanina, y ADN materno para SNP X es homocigótico para guanina. El método de etiquetado descrito en el ejemplo 6 se puede usar para determinar la secuencia de ADN de plantilla en una muestra de plasma. Si la muestra de plasma contiene el ADN fetal que es heterocigótico en SNP X, se esperan las siguientes moléculas de ADN después de la digestión con la enzima de restricción de tipo IIS de BsmF I, y la reacción de relleno con el ddGTP etiquetado, dATP, dTTP y dCTP sin etiquetar . Alelo materno 1 5'GGGT G* 3'CCCA C T C A Alelo materno 2 5'GGGT G* 3'CCCA C T C A Alelo fetal 1 5'GGGT G* 3'CCCA C T C A Alelo fetal 2 5'GGGT A A G* 3'CCCA T T C A Se observan dos señales, una señal corresponde a las moléculas de ADN llenas con ddGTP en una posición uno complementaria a la colgadura y la segunda señal corresponde a las moléculas de ADN llenas con ddGTP en la posición 3 complementaria a la colgadura. Sin embargo, el ADN materno es homocigótico para la guanina, lo cual corresponde a las moléculas de ADN llenas en la posición uno complementaria a la colgadura. La señal de las moléculas de ADN rellenas con ddGTP en la posición 3 complementaria la colgadura, corresponden al alelo de adenina que representa el ADN fetal, Esta señal se convierte en un guia para el ADN fetal, y se puede usar para medir la cantidad del ADN fetal presente en la muestra de plasma. · No hay diferencia entre la cantidad del ADN fetal de un cromosoma al otro. Por ejemplo, el porcentaje del ADN fetal en cualquier individuó del cromosoma 1, es igual que el porcentaje del ADN fetal del cromosoma 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X y Y. Asi, la relación de alelo calculada para SNP en un cromosoma se puede comparar con la relación de alelo para el SNP en el otro cromosoma. Por ejemplo, la relación de alelos para SNP en el cromosoma 1 debe ser igual a la relación de alelos para SNP en los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X y Y. Sin embargo, Si el feto tiene una anormalidad cromosomal incluyendo pero limitado a trisomia o monosomia, la relación para el cromosoma que está presente en el número de copias anormales diferirá de la relación a los otros cromosomas. Para recapitular el escenario in vivo de sangre de una mujer embarazada, se mezcló el ADN materno con ADN aislado de su hijo, quien se diagnosticó previamente con Trisomia 21 en diversas relaciones para representar porcentajes variables del ADN fetal. Por ejemplo, para replicar el escenario in vivo del ADN fetal al 50% en sangre materna, se mezclaron cantidades iguales del ADN materno con el ADN aislado de su hijo con síndrome de Down. El ADN materno se analizó para identificar los SNP homocigóticos y luego se analizaron estos SNP usando la mezcla de ADN materna al 50% y ADN con síndrome de Down al 50%. La relación del alelo 1 al alelo 2 en el SNP heterocigótico en el cromosoma 13 se comparó con la relación del alelo 1 al alelo 2 en los SNP heterocigóticos en el cromosoma 21. Se analizaron 4 muestras diferentes, una muestra con 100% del ADN de un niño con síndrome de Down, una muestra de ADN al 75% del niño con síndrome de Down y ADN al 25% de la madre del niño, una muestra con ADN al 50% del niño con síndrome de Down y ADN al 50% de la madre del niño, y una muestra con ADN al 40% del niño con síndrome de Down y ADN al 60% de la madre del niño. Se analizó el ADN materno para identificar los SNP homocigóticos . El ADN aislado del niño con síndrome de Down formó genotipos para identificar los SNP heterocigóticos . Luego se formaron genotipos de las muestras con un SNP en donde el ADN materno fue homocigótico y el ADN del niño fue heterocigótico . Para cada muestra se analizaron 10 veces estos SNP .

Recolección de la muestras de sangre Un estudio aprobado por el Consejo de Revisión Interna, se diseño para permitir la recolección de muestras de sangre de niños que padecen del síndrome de Down y de sus padres. Para este estudio se recolectó la sangre de la madre, del padre y del niño con síndrome de Down. Se otorgó por los padres el consentimiento informado para recolectar la sangre del niño con síndrome de Down así como el niño. Se recolectó sangre en tubos EDTA Vacuette de 9 mi (número de catálogo NC9897284) . Se almacenaron los tubos a 4°C hasta que estuvieron listos para el procesamiento.

Aislamiento del plasma y células maternas Se almacenó la sangre a 4°C hasta el procesamiento. Se hicieron girar los tubos a 1000 rpm por 10 minutos en una centrífuga con un poder de frenado fijado en 0. Los tubos se hicieron girar una segunda vez a 1000, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000 y mayor que 1000 bases .

Amplificación de los lugares de Interés Para cada SNP que formó genotipo, se usó una reacción PCR para amplificar los lugares de interés. Se efectuaron las reacciones PCR en placas de 96 pozos. Se distribuyó el primero y segundo cebador (3 µ? de una concentración de reserva de 1.25 µ?) para cada SNP en un pozo de una placa de microtitulación . Se fijaron 8 placas de 96 pozos para el cromosoma 21 y 8 placas de 96 pozos para el cromosoma 13. Después de que se distribuyeron los cebadores en los pozos de las placas de microtitulación, se agregó a cada pozo una mezcla que contiene el ADN genómico y los reactivos HotStar PC. Cada reacción PCR contenia 3 µ? de cada cebador 7.µ1 de la mezcla Tostar Tap Master, 0.5 µ? de agua y 1 µ? de ADN genómico (10 ng/µ?) . Las condiciones del ciclo de PCR fueron como siguen: (1) 95°C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 37 °C durante 30 segundos; (3) 95 °C durante 30 segundos; (4) 52°C durante 30 segundos; (5) 95 °C durante 30 segundos; (6) 58 °C durante 30 segundos; (7) 95°C durante 30 segundos; (8) etapas repetidas 6 y 7 treinta y siete (37) veces; (9) 12°C durante 5 minutos.

Purificación, del fragmento de interés . Después de la reacción PCR, 3 µ? del producto PCR generado con un primer cebador diseñado para producir un producto de 30 pares de bases, 3 µ? del producto PCR generado con un primer cebador diseñado para producir un producto de 40 pares de bases, 3 µ? del producto PCR generado con un primer cebador diseñado para producir un producto de 50 pares de bases, 3 µ? del producto PCR generado con un primer cebador diseñado para producir un producto de 60 pares de bases, 3 µ? del producto PCR generado con un primer cebador diseñado para producir un producto de 70 pares de bases, 3 µ? del producto PCR generado con un primer cebador diseñado para producir un producto de 80 pares de bases, 3 µ? del producto PCR generado con un primer cebador diseñado para producir un producto de 90 pares de bases, 3 µ? del producto PCR generado con un primer cebador diseñado para producir un producto de 100 pares de bases, se mezclaron juntos en un pozo de una placa transparente Streptawell, High-Bind de Roche Diagnostics GMBH (número de catálogo 1 645 692, como se enlista en el Roche Molecular Biochemicals, 2001 Biochemicals Catalog) . Los primeros cebadores contenían una etiqueta de biotina 5' de manera que los productos de PCR enlazados a los pozos recubiertos con estreptavidina mientras que el ADN de plantilla genómico no se enlazaba. Se llevó a cabo la reacción de enlace de estreptavidina utilizando un Thermomixer (Eppendorf) a 1000 rpm durante 20 minutos a 37 °C. Cada pozo se aspiró para retirar el material sin enlazar y se lavó 3 veces con IX PBS, con un mezclado suave (Kandpal et al., Nucí. Acids Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka et al., Biotechniques 10:30-34 (1991); Green et al., Nucí. Acids Res. 18:61-63-6164 (1990)). Digestión de la enzima de restricción de los fragmentos aislados Los productos de PCR purificados se digirieron con la enzima de restricción BsmF 1, que enlazan al sitio de reconocimiento incorporado en los productos de PCR del segundo cebador. Los productos de digestión se llevaron a cabo en los pozos Streptawell siguiendo las instrucciones proporcionadas con la enzima de restricción. Después de la digestión, los pozos se lavaron tres veces con PBS para retirar los fragmentos escindidos. Incorporación del nucleotido etiquetado Los productos de digestión de la enzima de restricción con BsmF I producen un fragmento de ADN con una colgadura 5' contenida en el sitio SNP o lugar cromosomal de interés, y un extremo retirado 3' . La colgadura 5' funcionó como una plantilla que permite la incorporación de un nucleótido o nucleótidos en presencia de una polimerasa de ADN. Como se discute en detalle en el Ejemplo 6, un nucleótido sencillo etiquetado con una porción química se puede usar para determinar la secuencia en un SNP. Los lugares de interés amplificados se acumularon en el pozo de estreptavidina basado en el tamaño y en el nucleótido utilizado en la reacción de relleno. La secuencia de los SNP que se determinó al usar un nucleótido de guanina se acumuló en conjunto. Similarmente, la secuencia de los SNP que se determinaron al usar un nucleótido de adenina se acumuló en conjunto, la secuencia de los SNP que se determinó al usar un nucleótido de timidina se acumuló en conjunto, y la secuencia de los SNP que se determinó al usar un nucleótido de citosina se acumuló en conjunto. Así, como una reacción típica de llenado que contiene 8 lugares amplificados, en el intervalo de 30-120 productos de pares de bases, se determinó la secuencia de todos los 8 utilizando un nucleótido sencillo etiquetado con una porción química. Se puede acumular en conjunto cualquier número de lugares amplificados. Los siguientes componentes se añadieron a cada relleno en la reacción: 1 µ? de didesoxinucleótido etiquetado fluorescentemente (ddGTP para reacciones de llenado en G, ddATP para reacciones de llenado en A, ddTTP para reacciones de llenado en timidina y ddCTP para reacciones de llenado en citosina) , 0.5 µ? de dNTP no etiquetado (40 µ?) , que contienen todos los nucleótidos excepto el nucleótido etiquetado, 2 µ? de la solución amortiguadora secuenasa lOx, 0.25 µ? de la Secuenasa y el agua como fuera necesario para una reacción de 20 µ?. El relleno en la reacción se realizó a 40 °C durante 10 minutos. La ddNTP etiquetada fluorescentemente se compró de Fermentas Inc. (Hanover MD) . Todos los otros reactivos de etiquetado se obtuvieron de Amersham (Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565) . Después del etiquetado, cada pozo Strepta ell se enjuagó con PBS IX (100 µ?) tres veces. Los fragmentos "en relleno" de ADN se liberaron entonces de los pozos Streptawell mediante la digestión con la enzima de restricción EcoRI, de acuerdo a las instrucciones del fabricante que son suministradas con la enzima. La digestión se realizó durante 1 hora a 37°C con agitación a 120 r.p.m. Detección del lugar cromosomal de interés . Después de la liberación de la matriz de estreptavidina, la muestra se cargó en una pista de 36cm de acrilamida al 5% en gel (urea) (BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, número de catálogo 50691) . La muestra se trató por electroforesis en el gel a 3000 voltios por 3 minutos. El gel se corrió por 3 horas en un aparato de formación de secuencias (Hoefer SQ3 Sequencer) . Se retiró el gel del aparato y se escaneó en un formador de imágenes del modo variable Typhoon 9400. El nucleótido etiquetado incorporado se detectó por fluorescencia. Los SNP homocigóticos se identificaron .

Identif cación de los SNP he erocigóticos con la plantilla de Trisomía 21. El ADN aislado del individuo con síndrome de Down (el niño de la madre al que se le formó el genotipo anterior) se analizó para identificar los SNP heterocigóticos . Los mismos 768 SNP en el cromosoma 13 y los mismos 768 SNP en el cromosoma 21 que se analizaron con el ADN materno, formaron genotipos utilizando los métodos descritos en el ejemplo 6. Se puede analizar cualquier número de SNP y se puede localizar los SNP en el cromosoma humano 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X o Y. Preferiblemente, los SNP que forman genotipos tienen frecuencias de alelos de 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 o 90:10. como se describe en el ejemplo 8 se puede determinar la frecuencia del alelo de cualquier SNP dado. El proceso para la formación de genotipos de los SNP con el ADN aislado del individuo con síndrome de Down fue como se describe para el ADN materno. Se identificaron los SNP heterocigóticos . Los SNP que fueron homocigóticos para el ADN mateno y heterocigóticos para el ADN aislado del individuo con síndrome de Down se analizaron además utilizando las muestras que contenían mezclas del ADN materno y ADN del síndrome de Down .

Generación de las muestras que contienen ADN materno y ADN del síndrome de Down El ADN y el ADN obtenido de su niño que tenía síndrome de Down se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro . Se mezclaron el ADN materno y el ADN del niño juntos a diversos porcentajes para representar la situación del ADN fetal en circulación en la sangre materna. Se analizaron los siguiente porcentajes: 100% de ADN de síndrome de Down, 75% de ADN de síndrome de Down, 50% de ADN de síndrome de Down y 40% de ADN de síndrome de Down, . Se calculó la relación de cada SNP heterocigótico al dividir el valor obtenido por el alelo 1 por el valor obtenido para el alelo 2. Por ejemplo, si SNP X puede ser adenina (A) o guanina (G) se calcula la relación en SNP X ao dividir el valor obtenido para la adenina por el valor obtenido para la guanina. Para la muestra que contiene 100% de ADN de síndrome de Down, 62 SNP en el cromosoma 13 que fueron homocigóticos con el ADN materno y heterocigóticos con el ADN aislado del individuo con síndrome de Down se analizaron. Se analizaron para el cromosoma 21, 49 SNP que fueron homocigóticos con el ADN materno y heterocigóticos con el ADN aislado del individuo con síndrome de Down. Los 62 SNP en el cromosoma 13 y 49 SNP en el cromosoma 21 se analizaron 10 veces por separado. Como se muestra en la Tabla XX, para cada uno de los 10 ensayos, la relación del alelo 1 al alelo 2 en el cromosoma 13 fue de aproximadamente 1 como se esperaba. Para el cromosoma 13 hay una copia del alelo 1 y una copia del alelo 2. El promedio de los 10 ensayos fue de 1.051 con una desviación estándar de 0.085. Con una Trisomía 21, hay 2 copias de un alelo que se heredan usualmente de la madre y una copia del otro alelo. La relación esperada es de aproximadamente 0.5 (una copia del alelo/2 copias del alelo 2) como se muestra en la Tabla XX, 1 relación para el cromosoma 21 varía desde un bajo de 0.462 hasta un alto . de 0.634. Para cada ensayo, la relación obtenida para el cromosoma 21 fue significativamente diferente de la relación obtenida en el cromosoma 13. La relación promedio para los 10 ensayos fue de 0.531 con un desviación estándar de 0.049. Se repitió el experimento 10 veces de manera que se pudiera obtener una verdadera medición estadística. Si se usaran 10 diferentes muestras genéticas, serían diferentes los SNP que cumplieran con los criterios (homocigoto materno, heterocigoto del niño con síndrome de Down) , haciendo difícil comparar de muestra a muestra. El análisis estadístico reveló un valor de confianza de 99.9% que las relaciones obtenidas en el cromosoma 13 y en el cromosoma 21 representan diferencias verdaderas más que fluctuaciones numéricas aleatorias en valor. El método Ravgen identificó la presencia de la anormalidad cromosomal. Para la muestra que contiene 75% del ADN del síndrome Down y 25% del ADN materno, 62 SNP en el cromosoma 13 y 50 SNP en el cromosoma 21 se analizaron, a menos que se establezca de otra manera. Para diversas pruebas, no se pudieron cuantificar todos los SNP debido a que las bandas que corresponden a ciertos SNP estaban débiles. Esto puede haberse provocado por una pobre amplificación PCR, pobre enlace a la placa de estreptavidina, o un débil reacción de llenado . Para el ensayo 3, se analizaron 61 SNP en el cromosoma 13. Para el ensayo 4, se analizaron 49 SNP en el cromosoma 21. con referencia al ensayo 5, se analizaron 47 SNP en el cromosoma 21 y 61 SNP en el cromosoma 13. Para el ensayo 7 se analizaron 49 SNP en el cromosoma 21 y 61 SNP en el cromosoma 13. Para el ensayo 8 se analizaron 49 SNP en el cromosoma 21 y 59 SNP para el cromosoma 13. Para los ensayos 9 y 10 se analizaron 59 SNP en el cromosoma 13. La relación esperada en el cromosoma 13 para un SNP heterocigótico es 0.6. Si ambos cromosomas maternos contienen un nucleótido de adenina y el genoma del síndrome de Down comprende un cromosoma con un nucleótido de adenina y un cromosoma con un nucleótido de guanina entonces la relación de G:A es 0.75 (.75 (alelo A del síndrome de Down) +0.25 +0.25 (alelos A maternos)), que es 0.6. Para los 10 ensayos, las relaciones obtenidas para el cromosoma 13 varían desde 0.567 hasta 0.645. El promedio para los 10 ensayos fue de 0.609 con una desviación estándar de 0.032 (ver Tabla XX). La relación esperada para el cromosoma 21 en una condición de Trisomía es 0.375. Si ambos cromosomas maternos contienen un nucleótido de adenina y el genoma del síndrome de Down comprende de dos cromosomas con un nucleótido de adenina y un cromosoma con un nucleótido de guanina, entonces la relación de G:A es 0.75/(0.75 + 0.75 (alelos A del síndrome de Down) +0.25 (alelos A maternos)), que es 0.375. Para los diez ensayos, la relaciones obtenidas para el cromosoma 21 varían desde 0.350 a 0.4125, con un promedio de 0.384 y una desviación estándar de 0.017 (ver tabla XX). El análisis estadístico revelo un valor de confianza de 99.9% que las relaciones obtenidas en el cromosoma 13 y cromosoma 21 representaron diferencias verdaderas mas que fluctuaciones numéricas aleatorias en valor. El método Ravgen identificó la presencia de la normalidad cromosomal en presencia de ADN maternal 25%. Con respecto a la muestra que contiene 50% de ADN del sindrome de Down, se analizaron 46 SNPs en el cromosoma 13 y 35 SNPs en el cromosoma 21 al menos que se establezca de otra manera. Para el ensayo 1, 45 SNP en el cromosoma 13 se analizaron. Para el ensayo 2, 44 SNP en el cromosoma 13 se analizaron. Para el ensayo 3, 42 SNP en el cromosoma 13 se analizaron. Para el ensayo 4, 44 SNP en el cromosoma 13 y 34 SNPs en el cromosoma 21 se analizaron. Para el ensayo 5, 34 SNPs en el cromosoma 21 se analizaron. Para el ensayo 7 y 8, 44 y 41 SNPs en el cromosoma 13, respectivamente se analizaron. Para el ensayo 9, 44 SNPs en el cromosoma 13 y 34 SNPs con el cromosoma 21 se analizaron. Para el ensayo 10, 44 SNPs en el cromosoma 13 se analizaron. La relación esperada en el SNP heterocigótico en el cromosoma 13 para la muestra al 50% 0.33. Si los cromosomas maternos contienen ambos un nucleótido de adenina y el genoma del sindrome de Down comprende un cromosoma con un nucleótido de adenina y un cromosoma con un nucleótido de guanina, luego la relación de G:A es 0.50/(.50 (alelo A de sindrome de Down) +0.50 +0.50 (alelos A materno)), que es 0.33. Para los diez ensayos la relaciones obtenidas para el cromosoma 13 varían desde 0.302 a 0.347. El promedio para los diez ensayos fue de 0.324 con una desviación estándar de 0.013 (ver tabla XX).

La relación esperada para el cromosoma 21 en una condición de Trisomia es 0.25. Si los cromosomas maternos contienen ambos nucleótidos de adenina y el genoma del síndrome de Down comprende dos cromosomas con un nucleótido de adenina y un cromosoma con un nucleótido de guanina, entonces la relación de G:A es 0.50/(0.50 + 0.50 (alelos A del síndrome de Dov/n) + 050 + 0.50 (alelos A maternos)), que es 0.25. Para los diez ensayos, las relaciones obtenidas para el cromosoma 21 varían de 0.230 a 0.275, con un promedio de 0.244 con una desviación estándar de 0.015 (ver tabla XX) . El análisis estadístico revelo un valor de confianza de 99.1% que las relaciones obtenidas en el cromosoma 13 y en el cromosoma 21 representan diferencias verdaderas, mas que fluctuaciones numéricas aleatorias en valor. El método Ravgen identifica la presencia de la anormalidad cromosomal en presencia del 50% de ADN materna. Para la muestra que contiene ADN de síndrome de Down al 40%, 60 SNP a los cromosomas 13 y 48 SNP en el cromosoma 21 se analizaron al menos que se establezca de otra manera. Para el ensayo 1, 47 SNP en el cromosoma 21 se analizaron. Para los ensayos 2-4, 59 SNP en el cromosoma 13 y 47 SNP en el cromosoma 21 se analizaron. Para los ensayos 5 y 6, 46 SNP en el cromosoma 21 se analizaron. Para los ensayos 7, 48 SNP en el cromosoma 13 SNP se analizaron. Para los ensayos 8, 46 SNP en el cromosoma 21 se analizaron. Y para los ensayos 9 y 10, 47 SNP en el cromosoma 21 se analizaron. La relación esperada en el SNP heterocigótico en el cromosoma 13 para la muestra al 40% 0.25. Si los cromosomas maternos contienen ambos un nucleótido de adenina y el genoma del síndrome de Down comprende un cromosoma con un nucleótido de adenina y un cromosoma con un nucleótido de guanina, luego la relación de G:A es 0.40/(.40 (álelo A de síndrome de Down) +0.60 +0.60 (alelos A materno)), que es 0.25. Para los diez ensayos la relaciones obtenidas para el cromosoma 13 varían desde 0.254 a 0.285. El promedio para los diez ensayos fue de 0.269 con una desviación estándar de 0.009 (ver tabla XX) . La relación esperada para el cromosoma 21 en una condición de Trisomía es 0.2. Si los cromosomas maternos contienen ambos nucleótidos de adenina y el genoma del síndrome de Down comprende dos cromosomas con un nucleótido de adenina y un cromosoma con un nucleótido de guanina, entonces la relación de G:A es 0.40/(0.40 + 0.40 (alelos A del síndrome de Down) + 0.60 + 0.60 (alelos A maternos)), que es 0.2. Para los diez ensayos, las relaciones obtenidas para el cromosoma 21 varían de 0.216 a 0.249, con un promedio de 0.23 con una desviación estándar de 0.011 (ver tabla XX). El análisis estadístico revelo un valor de confianza de 94.3% que las relaciones obtenidas en el cromosoma 13 y en el cromosoma 21 representan diferencias verdaderas, mas que fluctuaciones numéricas aleatorias en valor. El método Ravgen identifica la presencia de la anormalidad cromosomal en presencia del 60% de ADN materna. La presencia de la Trisomia 21 se identifica con el método Ravgen en diversas muestras que contenían diversos porcentajes del ADN anormal. Cada porcentaje del ADN anormal se analizó 10 veces por separado, y cada vez, se identificó la presencia de la condición anormal. La relación del alelo 1 al alelo 2 aun SNP heterocigótico múltiple en el cromosoma 13 se calculo y se promediaron las relaciones. Se hizo lo mismo con los SNP localizados en el cromosoma 21. la relación obtenida para los SNP heterocigóticos en el cromosoma 13 fue estadísticamente diferente de la relación obtenida en el cromosoma 21. Las relaciones obtenidas en el cromosoma 13 y 21 fueron cercanas a los valores matemáticamente predichos. En este ejemplo, el intervalo de confianza para las muestras con 100% de ADN de síndrome de Down y 75% de ADN de síndrome de Down fue 99.9% y el intervalo de confianza para la muestra fue con 50% de ADN de síndrome de Down fue 99.1% que es alrededor de la precisión reportada para la amniocentesis . El intervalo de confianza para la muestra que contiene 40% de ADN de síndrome de Down fue de 94.3%, que es más precisa que las pruebas actualmente comercializadas no invasivas para diagnósticos prenatales. Como se discutió arriba, alrededor de 60 SNP en el cromosoma 13 y 50 SNP en el cromosoma 21 se analizaron. Para incrementar el intervalo de confianza para las muestras que contienen 40% de ADN fetal o menores, se puede analizar un número mayor de SNP. El método Ravgen proporciona una forma altamente precisa y efectiva en costo para el ADN de secuencia, de manera que la formación de secuencias de un número de SNP no es difícil. La precisión de la prueba se determina por el número de SNP que forman secuencias. Para una mayor precisión con las muestras que contengan porcentajes inferiores de ADN, se pueden analizar más SNP. Alternativamente, se pueden usar los métodos descritos en esta solicitud para asegurar que las muestras contengan un porcentaje mayor de ADN fetal. En este ejemplo, una muestra que contiene un ADN de síndrome de Down del 40% que ^representa el ADN fetal en la sangre materna se analizó. Se pueden analizar muestras de sangre materna con cualquier porcentaje de ADN fetal incluyendo pero no limitado a 0.0001-1%, 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-50%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, y 90-100%: Tabla XX. El método Ravgen identifica anormalidades cromosomales en muestras que contienen 40% de ADN con síndrome de Down. 100% DS ADN -75% DS ADN Relación 13 21 Esperado 13 21 Esperado crom. 21 21 Ensayo 1 0.959 0.5708 0.49 0.637 .3764 0.389 Ensayo 2 0.916 0.5024 0.48 0.567 .3894 0.362 Ensayo 3 1029 0.4616 0.51 0.651 .3707 0.394 Ensayo 4 0.967 0.5123 0.491 0.580 .3901 0.367 Ensayo 5 1.037 0.6339 0.51 0.645 .4125 0.392 Ensayo 6 1.111 0.5425 0.53 0.645 .3743 0.392 Ensayo 7 1.154 0.495 0.54 0.594 .3974 0.373 Ensayo 8 1.135 0.5276 0.532 0.583 .3901 0.368 Ensayo 9 1.148 0.5619 0.534 0.579 .3899 0.367 Ensayo 1.057 0.4976 0.52 0.609 .350 0.378 10 Promedio 1.051 .531 0.512 .609 0.384 0.378 Desv . .085 .049 .032 .017 Est . -50% DS ADN -40% DS ADN Relación 13 21 Esperado 13 21 Esperado crom. 21 21 Ensayo 1 0.347 0.275 0.258 0.277 0.239 0.217 Ensayo 2 0.316 0.237 0.24 0.265 0.249 0.21 Ensayo 3 0.338 0.247 0.253 0.266 0.227 0.21 Ensayo 4 0.331 0.264 0.249 0.254 0.216 0.202 Ensayo 5 0.330 0.241 0.248 0.274 0.246 0.215 Ensayo 6 0.324 0.240 0.244 0.268 0.22 0.211 Ensayo 7 0.318 0.233 0.241 0.275 0.227 0.216 Ensayo 8 0.302 0.230 0.231 0.258 0.228 0.21 Ensayo 9 0.315 0.238 0.240 0.285 0.231 0.222 Ensayo 0.318 0.235 0.241 0.266 0.218 0.21 10 Promedio 0.324 0.244 0.244 0.269 0.23 0.212 Desv. 0.013 0.015 0.009 0.011 Est .

EJEMPLO 15 Como se discutió en el ejemplo 4 anterior, el uso de inhibidores de la lisis celular, estabilizadores de membrana celular o reactivos de reticulados, se puede utilizar para incrementar el porcentaje del ADN fetal en la sangre materna. En este ejemplo, los métodos para el aislamiento del ADN fetal libre se describen, los cuales minimizan la cantidad de la lisis de células maternas. El efecto de la formalina en sesenta y nueve (69) muestras de sangre materna a partir de 27 prácticas clínicas localizadas en 16 diferentes estados se analizaron. Se agregó la formalina a todas las muestras recolectadas de mujeres embarazadas, y se calculó el porcentaje de ADN fetal usando una análisis de dilución en serie seguido por PCR. Se usó un marcador genético en el cromosoma Y para calcular el porcentaje del ADN fetal.

Recolección de las muestras de sangre De acuerdo con el estudio aprobado IRB, se recolectaron muestras de sangre de mujeres embarazadas después de que se habla obtenido su consentimiento. Las muestras de sangre se recibieron de 27 diferentes sitios clínicos operando en 16 diferentes estados localizados a lo largo de los E.U. se recolectaron muestras de sangre tanto de mujeres que llevaban fetos masculinos y femeninos, sin embargo, aquí se reportan los resultados obtenidos de mujeres que llevaban los fetos masculinos, ya que el cromosoma Y es el marcador aceptado cuando se cuantifican porcentajes del ADN fetal. Se recolectó la sangre por cualquier método o proceso que resulte en un incremento substancial en la relación del ADN fetal/ADN materno en el suero resultante o en el plasma después de un procesamiento adecuado. Como se usa en la presente, un incremento substancial en la relación del ADN fetal/ADN materno, es que cual se puede detectar por los métodos como se describe en la presente. Tales métodos o procesos resultan típicamente en un incremento substancial en la relación de ADN fetal/ADN materno de alrededor de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 100% o más de la relación de ADN fetal/ADN materno que se encuentran muestras de sangre recolectadas por procedimientos estándar. En otras modalidades, se recolecta la sangre por cualquier método o proceso que resulte en un incremento substancial en la cantidad del ADN fetal en comparación con la cantidad del ADN total recuperado o detectado en el suero o plasma resultante después del procesamiento. Tales métodos o procesos resultaran típicamente en un incremento substancial de manera que el ADN fetal recuperado o detectado es de alrededor de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% o más del ADN total recuperado o detectado en el plasma procesado o muestra de suero. Se' proporcionaron todos los sitios clínicos con un kit usado para el procedimiento de venipunción que incluye agujas de calibre 21, tubos EDTA Vacuette de 9 mi (número de catálogo NC9897284] una jeringa que contiene 0.225 mi de solución amortiguadora neutral al 10% que contiene formaldehído (4% w/v) , un paquete de hielo, y un recipiente de embarque. Se les instruyó a los sitios clínicos agregar el formaldehído inmediatamente después de retirar la sangre y de invertir suavemente los tubos. Los métodos o procesos de recolección de muestras de sangre también pueden incluir otras etapas que resulten en una lisis celular disminuida o reducida. Por ejemplo, se pueden modificar dispositivos de recolección de sangre para disminuir la lisis celular debido a fuerzas de corte en la aguja de recolección, jeringa o en los tubos usados. Por ejemplo, se pueden emplear agujas de calibre grande para reducir el corte celular o tubos vacutainer se pueden modificar para reducir la velocidad del flujo de sangre. Aislamiento de plasma Se puede usar cualquier método para aislar el plasma de los componentes de las células de la sangre después de la recolección, pero se prefieren los métodos en donde la lisis celular se evita substancialmente, reduce o inhibe. La sangre se almacena a 4°C hasta el procesamiento. Se implementaron métodos para el - aislamiento del plasma para reducir la cantidad de la lisis de células maternas. Se hicieron girar los tubos a 1000 rpm por 10 minutos en una centrifuga, con un poder de frenado y un poder de aceleración fijado en cero, para prevenir, reducir o inhibir substancialmente la lisis celular y/o el mezclado de glóbulos sanguíneos en los componentes dentro del plasma. Los tubos se hicieron girar una segunda vez a 1000 rpm durante 10 minutos con un poder de frenado (centrifuga detenida por desaceleración natural) y poder de aceleración fijado en cero. El sobrenadante (el plasma) de cada muestra se transfirió cuidadosamente a un nuevo tubo y se hizo girar a 3000 rpm por 10 minutos con el poder de frenado y aceleración fijado en cero. El sobrenadante (el plasma) de cada muestra se recolectó por medio de procedimientos para evitar substancialmente el mezclado de los componentes celulares en el plasma. Se tuvo gran cuidado en asegurar que la capa de color amarillento no se perturbara. Se puede dejar un porcentaje del sobrenadante en el tubo incluyendo pero no limitado a 0.001-1%, 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80% o más del 80%. En este ejemplo, se dejó alrededor de 0.5 mi del sobrenadante en el tubo para asegurar que el recubrimiento amarillento no se perturbara. Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo y se almacenó a -80°C.

Aislamiento de ADN Se aisló el ADN de la muestra de plasma usando el kit Qiagen Midi para purificación del ADN a partir de células sanguíneas, siguiendo la instrucción del fabricante (QIAmp DNA Blood Midi Kit, número de catálogo 51183). Se eluyó el ADN en 100 µ? de agua destilada. Sin embargo, se puede usar cualquier método de aislamiento del ADN incluyendo gradientes con cloruro de cesio, gradientes, gradientes de sacarosa, gradientes de glucosa, protocolos de centrifugación, ebullición, sistemas de purificación Qiagen, kit de purificación de sangre de ADN Qia, kit maxi plásmido de HiSpeed, kit de plásmido QIAfilter, sistemas de purificación de ADN Promega, sistemas basados en partículas paramagnéticas angeSil, tecnología Wizard, kit de purificación de ADN genómico Wizard, sistemas de purificación de Amersham, kit de purificación de ADN de sangre genómico GFX, sistemas de purificación Invitrogen Life Technologies, sistema de purificación CONCERT, sistemas de purificación Mo Bio Laboratories, kit UltraClean BloodSpin, y kit de ADN de sangre UlraClean. El técnico experimentado entiende que se pueden modificar protocolos del fabricante para incrementar el rendimiento de ADN. Por ejemplo, el kit Midi Qiagen para purificación de ADN, recomienda el uso de una solución amortiguadora IX AL. Sin embargo, se puede usar cualquier concentración de solución amortiguadora AL si el rendimiento de ADN en sus incrementos incluye pero no se limita a, solución amortiguadora 0.1-0.5 X AL, solución amortiguadora 0.5-1X AL, solución amortiguadora 1X-2X AL, solución amortiguadora 2-3X AL, solución amortiguadora 3-4X AL, y mayor que solución amortiguadora 5X AL. El técnico experimentado entiende que no se limitan las modificaciones y manipulaciones de los reactivos a la solución amortiguadora AL.

Cuantificacion del porcentaje de ADN fetal El porcentaje de ADN fetal presente en la muestra de plasma materno se calculó usando un análisis de dilución en serie seguido por PCR. Se utilizaron dos conjuntos diferentes de cebadores: un conjunto cebador fue especifico para el cromosoma Y, y así especifico para el ADN fetal, y el otro conjunto cebador se usó para amplificar del gen de la fibrosis quística que esta presenta tanto en el ADN de plantilla materna y como en el ADN de plantilla fetal. Diseño del cebador Se diseñaron los siguientes cebadores para amplificar el gen S Y en el cromosoma Y: Cebador en dirección ascendente: 5 ' TGGCGATTAAGTCAAATTCGC3 ' Cebador en dirección descendente: 5 ' CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT3 ' Se diseñaron los siguientes cebadores para amplificar el gen de la fibrosis quística.

Cebador en dirección ascendente: 5 ' CTGTTCTGTGATATTATGTGTGGT3 ' cebador en dirección descendente: 5' AATTGTTGGCATTCCAGCATTG3 ' Reacción PCR El gen SRY y el gen de fibrosis quística se amplificaron a partir del ADN genómico de plantilla utilizando PCR (Patentes de E.U.A. Nos. 4, 683, 195 y 4,683,202). Para una especificidad aumentada, se utilizó un PCR de inicio caliente. Se llevaron a cabo las reacciones por PCR usando el kit Mix Master HotStarTaq suministrado por Qiagen (Catálogo No. 203443). Para la amplificación del gen SRY, el ADN diluido de la columna de purificación Qiagen se diluyó en serie 1:2. Para la amplificación del gen de la fibrosis quística, el ADN eluido de la columna de purificación Qiagen se diluyó 1:4 y luego se diluyó en serie 1:2. Se utilizaron los siguientes componentes para cada reacción PCR: 8 µ? de ADN de plantilla (diluido o sin diluir) , 1 µ? de cada cebador (5 µ?) , 10 µ? de la mezcla HotStar. Se utilizaron -las siguientes condiciones por PCR: (1) 95°C durante 15' (2) 94°C durante 1' (3) 54°C durante 15' ' (4) 72 °C durante 30' ' (5) Repetir las etapas 2-4 durante 45 ciclos. (6) 10' a 72°C Se llevó a cabo la amplificación del gen SRY utilizando las siguientes plantillas: sin diluir, diluida 1:2, diluida 1:4, diluida 1:8, diluida 1:16, diluida 1:32, diluida 1:64, diluida 1:128, diluida 1:256 y diluida 1:512. La amplificación del gen de la fibrosis quistica se llevó a cabo utilizando las siguientes plantillas: diluida 1:4, diluida 1:8, diluida 1:16, diluida 1:32, diluida 1:64, diluida 1:128, diluida 1:256, diluida 1:512, diluida 1:1024, diluida 1:2048 y diluida 1 : 4096. El porcentaje de ADN fetal presente en el plasma materno se calculo utilizando la fórmula siguiente: % de ADN fetal = (cantidad del gen SRY/cantidad del gen de fibrosis quistica) *2*100. Se represento la cantidad del gen SRY por el valor más elevado de dilución en el cual se amplificó el gen. Similarmente, se represento la cantidad del gen de fibrosis quistica por un valor mayor de dilución en cual se amplificó. La fórmula contiene un factor de multiplicación de dos (2) , que se usa para normalizar por el hecho de que hay solamente una copia del gen SRY (localizado en el cromosoma Y) , aunque hay dos copias del gen de fibrosis quistica. El efecto de la formalina en sesenta y nueve (69) muestras de sangre maternas, recolectadas de 27 prácticas clínicas localizadas en 16 diferentes estados, que abarcan de Washington a Massachussets se muestran en la tabla XXI. En este estudio, se agregó formalina a todas las muestras recolectadas de mujeres embarazadas, y se calculó el porcentaje del ADN fetal utilizando un análisis de dilución en serie seguido por PCR. Se llevaron a cabo las diluciones en serie y las amplificaciones por PCR por 4 diferentes científicos durante un periodo de 5 meses . Se recolectaron las muestras a partir de muj eres en edades de gestación que van desde 11 semanas a 28 semanas, estando la mayoría de las mujeres entre 16-19 semanas de gestación. Se presenta un resumen en la tabla XXIII . El porcentaje promedio del ADN fetal libre para las 69 muestras analizadas en la sangre materna fue de 33.6%. Lo et al . , reportaron concentraciones fetales de ADN de 3.4% en mujeres al final del primero a la mitad del segundo trimestre, que fue la edad gestacional de la mayoría de las mujeres en este estudio así, la adición de formalina condujo aproximadamente a un incremento de 10 veces en el porcentaje promedio del ADN fetal . Aunque el porcentaje calculado del ADN fetal en la sangre materna es impresionante, también es informativo para examinar el intervalo de los porcentajes de ADN fetal observados en este estudio. Alrededor del 6% de la mujeres (4/69) tuvo 3.125% de ADN fetal libre en la sangre materna, que fue el porcentaje más bajo del ADN fetal observado en este estudio. Otro 10.2% de mujeres tuvo 6.25% de ADN fetal el cual representa un incremento de dos veces sobre el promedio reportado en la literatura. El número total de mujeres que tuvieron menos del 10% de ADN fetal en la sangre I materna fue solamente de 16.0%. 58 % de las mujeres en este estudio tuvieron un % de ADN fetal de 25% o mayor. De manera importante, 26.0% de las mujeres tuvo un 50% o más de ADN fetal en la sangre materna. Los porcentajes de ADN fetal de esta magnitud no se han reportado, y representan una nueva herramienta para el campo de la genética prenatal . Hubieron 4 muestras recolectadas de mujeres a una edad gestacional de 11 semanas. Los porcentajes de ADN fetal en las muestras de sangre materna fueron como siguen: dos muestras a 12.5%; una muestra a 25% y una muestra a más de 50%. Así, se observo el efecto de la formalina en los porcentajes del ADN fetal con muestras recolectadas de mujeres en periodos gestacionales tempranos así como tardíos. No se limitó a la formalina el efecto de estabilización de' las membranas celulares y la reducción de la liberación del ADN libre. Se han probado varios tipos diferentes de agentes y combinaciones de agentes, que evitan la lisis celular y/o estabilizan las membranas celulares tales como el glutaraldehido y se ha observado que estos agentes también reducen la cantidad del ADN libre en la muestra de sangre (no se muestran los datos) . Los métodos antes descritos también puede incluir etapas de agregar un agente a la muestra de sangre al tiempo o cerca del tiempo de recolección para inhibir o impedir substancialmente la lisis celular o estabilizar las membranas celulares. Se puede agregar cualquier número de agentes que impida la lisis celular o estabilice las membranas celulares, o retícule las membranas celulares, a las muestras de sangre materna, incluyendo pero no limitado a formaldehído, y derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehido, y derivados de glutaraldehido, reticuladores, reticuladores de reactivos de amina primaria, reticuladores reactivos de sulfhidrilo, reducción de bisulfuro o adición de sulfhidrilo, reticuladores reactivos de carbohidratos, reticuladores reactivos de carboxilo, reticuladores fotoreactivos reticuladores de escisión, AEDP, APG, BASED, BMM(PE0)3, BM(PEO)4, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BS3, BSOCOES, DFDNB, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, sulfo-DST, sulfo-EGS, o los compuestos enlistados en la tabla XXIII. Se encuentran reticuladores adicionales que se pueden usar en el siguiente sitioweb: www.piercenet.com/products/ . Se puede agregar un agente que estabilice las membranas celulares a la muestra de sangre materna para reducir la lisis celular materna incluyendo pero no limitado a aldehidos, formaldehído de urea, formaldehído de fenol, DAME (dimetilaminoetanol) , colesterol, colesterol, derivados de colesterol, concentraciones altas de magnesio, vitamina E y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxílamina, bimoclomol, sucrosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, fenilacetato hopano tetral de isómero A, fenilacetato hopano tetral de isómero B, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, colesterol de hemisuccinato, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaguinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoina, perftorano, polivinilpirrolidona, fosfatidilserina, tegretol, ????, disodio cromglicato, nedocromil de sodio, fenitoina, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio o polaxamero 188. Cualquier concentración de agente que estabilice las membranas celulares, impida las lisis celular o retlcule membranas celulares se puede agregar. En una modalidad preferida, el agente que estabiliza las membranas celulares, impide las lisis celulares, o retícula las membranas celulares, se agrega una concentración que no impide u obstaculiza las reacciones posteriores. Aunque se han reportado porcentajes impresionantes de ADN fetal libre en muestras de sangre materna, se cree que se pueden lograr los porcentajes superiores al explicar cuidadosamente la importancia de la formalina a los médicos. Se verificaron muestras aleatoriamente para la presencia de formalina y se encontró que alrededor del 10% de las muestras no recibió formalina. Además, se observaron agregados en otro 10% de las muestras, lo que sugiere que la formalina no se había mezclado completamente con la sangre recolectada. Así, aunque la adición de formalina produjo un efecto impresionante, es probable que bajo condiciones controladas puede ser superior el porcentaje del ADN fetal libre. Además, se cree que los procedimientos para minimizar la hemolisis durante el procedimiento de punción en la vena y los recipiente de embarque controlados con temperatura (se embarcaron especímenes en un recipiente Styrofoam con empaque de hielo, pero hubo variación en la temperatura debido a que las muestras se embarcaron a distancias variables) puede provocar un incremento adicional en el % de ADN fetal libre. Se pueden usar agujas diseñadas para reducir la hemolisis durante el procedimiento de punción en la vena. También, se hace la hipótesis de que los procedimientos para aislar cuidadosamente el plasma ayudarían a asegurar una cantidad mínima de ADN materno en la muestra. Se implementaron procedimientos como se describen arriba, para reducir la lisis celular tales como parámetros de centrifugación suave y se permitió que los rotores se detuvieran sin fuerza externa (sin frenar) . También, se retiraron cuidadosamente el sobrenadante que contiene el ADN de plasma de la capa amarillenta que contiene el ADN materno. Estos procedimientos acoplados con la adición de formalina para evitar la lisis celular, resultaron en un incremento tremendo en el porcentaje del ADN fetal.

Tabla XXI. La formalina incrementa el porcentaje el ADN fetal libre en muestras de sangre recolectadas en sitios clínicos numerosos a partir de mujeres en diversas etapas de gestación. Muestra Gestación semanas Genoma Fetal/ mi % de ADN fetal 1 16 80 25 2 19 1066 >50 3 17 52 50 4 22 166 25 5 32 457 50 6 19 400 100 7 18 800 100 8 17 100 50 9 16 50 25 10 17 25 12.5 11 16 94.74 12.5 12 16 34.60 50 13 16 22.5 25 14 17 50 12.5 15 17 26.48 12.5 16 17 45.00 25 17 17 94.7 100 18 17 28.13 6.25 19 19 28.13 25 20 11.25 12.5 15 11.25 12.5 11 16.66 12.5 18 13.23 25 18 12.50 6.25 16 112.50 100 17 124.13 25 14 90.00 50 11 100.00 100 18 232.00 100 19 626.00 100 19 112.50 100 16 423.50 100 16 423.50 25 11 105.88 25 16 49.60 3.1 11 11.84 12.5 16 120.00 25 18 342.90 100 17 51.43 25 18 225.00 6.25 17 400.00 12.5 28 180.00 25 17 20.45 12.5 18 25.73 25 16 68.68 3.1 17 218.18 25 15 75.00 6.25 16 40.58 3.1 17 100.00 25 17 14.06 12.5 22 22.50 12.5 15 28.13 12.5 17 50.00 3.125 18 58.00 50 14 100.00 25 16 58.08 25 16 13.64 12.5 16 25.00 6.25 20 45.00 25 16 23.69 12.5 18 5.92 6.25 15 28.13 6.25 17 50.00 25 16 360.00 50 16 25.00 12.5 16 48.65 25 16 47.38 12.5 68 14 26.45 50 69 17 124.15 25 Promedio 17 131.15 33.6 Tabla XXII. La formalina incrementa el porcentaje del ADN fetal libre en muestras sanguíneas colectadas en numerosos sitios clínicos de mujeres en varias etapas de gestación.

Tabla XXIII. Una lista representativa de reticulantes que pueden usarse para impertir la lisis celular maternal.

Reticulante Abreviatura Acetiltioacetato de succinimidilo SATA trans-4- (maleimidilmetil) ciclohexano-1- SMCC carboxilato de succinimidilo 3- (2-piridilditio) ropionato de SPDP succinimidilo N- ( (2-piridilditio) etil) -4-azidosalicilamida PEAS; AET Ácido 4-azido-2 ,3,5, 6-tetrafluorobenzoico, ATFB, SE ester de succinimidilo Ácido 4-azido-2 ,3,5, 6-tetrafluorobenzoico, ATFB, éster de éster de STP, sal de sodio STP 4-azido-2 ,3,5, 6-tetrafluorobencil amina, clorohidrato Benzofenona-4-isotiocianato benzofenona-4-ma1eimida Ácido 4-benzoilbenzoico, éster de succinimidilo Disuccinimidilsuberato DSS Ditiobis (succinimidilpropionato) DSP 3,3' -Ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato) DTSSP Bis [2- SULFO BSOCOES (sulfosuccinimdooxicarboniloxi) etil] sulfona Bis [2- (succinimdooxicarboniloxi) etil] sulfona BSOCOES Disulfosuccinimdiltartrato SULFO DST Disuccinimdiltartrato DST Etilen glicolbis (succinimidilsuccinato) SULFO EGS Etilen glicolbis (sulfosuccinimidilsuccinato) EGS 1,2-Di [3'- (2'- DPDP3 piridilditio) propionamido] butano Bis (sulfosuccinimdil) suberato BSSS Succinimd.il-4- (p-maleimidofenil) butirato SMPB Sulfosuccinimdil-4- (p- SULFO SMPB maleimidofenil) butirato Ester de 3-Maleimidobenzoil-N- MBS hidroxisuccinimida Ester de 3-Maleimidobenzoil-N- SULFO MBS hidroxisulfosuccinimida N-Succinimidil (4-yodoacetil) aminobenzoato SIAB N-Sulfosuccinimidil (4- SULFO SIAB yodoacetil) aminobenzoato Succinimidil-4- (N- SMCC ma1eimidometi1) cic1ohexano-1-carboxi1ato Sulfosuccinimidil-4- (N- SULFO SMCC maleimidometi1) cic1ohexano-1-carboxilato Succinimidil-6- [3- (2- NHS LC SPDP piridilditio) ropionamido) hexanoato Sulfosuccinimidil-6- [3- (2- SULFO NHS LC piridilditio) propionamido) hexanoato SPDP N-Succinimdil-3 - (2-piridilditio) propionato SPDP N-Hidroxisuccinimidilbromoacetato NHS BROMOACETATO N-Hidroxisuccinimidilyodoacetato NHS YODOACETATO Clorohidrato de hidrazida del ácido 4- (N- MPBH Maleimidofenil) butí ico Clorohidrato de hidrazida del ácido 4- (N- MCCH Maleimidometi1) ciclohexano-1-carboxí1ico Clorohidrato de hidrazida del ácido m- MBH Maleimidobenzoico N- (epsilon- SULFO EMCS Maleimidocaproiloxi) sulfosuccinimida N- (epsilon-Maleimidocaproiloxi) succinimida EMCS N- (p-Maleimidofenil) isocianato PMPI Hidrazida N- (kappa-ácido KMUH Maleimidoundecanoico) Succinimidil-4- (N-maleimidometil) - LC SMCC ciclohexano-1-carboxi (6-amidocaproato) Ester de N- (gamma- SULFO GMBS Maleimidobutriloxi) sulfosuccinimida Succinimidil-6- (beta- SMPH ma1eimidopropionarnidohexanoato) Ester de N- (kappa- SULFO KMUS Maleimidoundecanoiloxi) sulfosuccinimida N- (gamma-Maleimidobutirloxi) succinimida GMBS Clorohidrato de dimetiladipimidato DMA Clorohidrato de dimetilpimelimidato DMP Clorohidrato de dimetilsuberimidato DMS Clorohidrato de Metil-p-hidroxibenzimidato, MHBH (reactivo 98% Wood) Reactivo amina Bis [sulfosuccinimidil] suberato BS3 Bis [2- BSOCOES ( succinimidooxicarboniloxi) etil] sulfona Disuccinimidil glutarato DSG DSP (Reactivo Lomant ) 1 , 5-Difluoro-2 , 4-dinitrobenceno DFDNB Ditiobis [succinimidilpropionato DTBP Bis- [b- (4-Azidosalicilamido) etil] disulfuro BASED Reactivo de sulfhidrilo BM [PEO] 3(1, 8-bis-Maleimidotrietilenglicol BM [PEO] 3 BM [PEO] (1, 11-bis-Maleimidotetraetilenglicol BM [PEO] 4 1 , 4-bis- aleimidobutano BMB 1 , 4 bis-Maleimidil-2 , 3 -dihidroxibutano BMDB Bis-Maleimidohexano BMH Bis-Maleimidoetano BMOE 1, 4 -Di- [3"- (2'-piridilditio) - DPDPB propionamido] butano Ditio-bis-maleimidoetano DTME 1, 6-Hexano-bis-vinilsulfona HBVS p-Azidobenzoil hidrazida ABH Reactivo de Amina- Sulfhidrilo Ester de N- [a-Maleimidoacetoxi] succinimida AMAS N- [4- (p-Azidosalicilamido) butil] -3'- (2'- APDP piridilditio) ropionamida Ester de N- [ß-Maleimidopropiloxi] succinimida BMPS Ácido N-e-Maleimidocaproico EMCA Ester de N-e-Maleimidocaproiloxi] succinimida E CS Ester de N- [g- GMBS Maleimidobutiriloxi] succinimida Ácido N-k-Maleimidoundecanoico MUA Succinimidil-4- (N- LC-SMCC Maleimidometil) ciclohexano-1-carboxi- (6-amidocaproato Succinimidil 6- (3- [2-piridilditio] - LC-SPDP propionamido) exanoato Ester de m-Maleimidobenzoil-N- MBS hidroxisuccinimida Succinimidil 3- [bromoacetamido] ropionato SBAP Yode-acetato de N-Succinimidilo SIA N-Succinimidil [4-yodoacetil] aminobenzoato SIAB Succinimidil 4- [liSMCC ma1eimidometi1] cic1ohexano-1-carboxi1ato Succinimidil 4- [p-maleimidofenil] butirato SMPB Succinimidil-6- [ß- SMPH maleimidopropionamido] hexanoato -Succinimidiloxicarbonil-metil-a- [2- SMPT piridilditio] tolueno N-Succinimidil 3- [2-piridilditio] - SPDP propionamido Ester de N-e- Sulfo-EMCS Maleimidocaproiloxi] sulfosuccinimida Ester de N- [g- Sulfo-GMBS Maleimidobutiriloxi] sulfosuccinimida Ester de N- [k- Sulfo-KMUS Maleimidoundecanoiloxi] sulfosuccinimida -Sulfosuccinimidil-6-metil-a- (2- Sulfo-LC-SMPT piridilditio) toluamido] hexanoato Sulfosuccinimidil 6- (3 ' - [2-piridilditio] - Sulfo-LC-SPDP-propionamido) hexanoato Ester de m-Maleimidobenzoil-N- Sulfo-MBS hidroxisulfosuccinimida N-Sulfosuccinimidil [4- Sulfo-SIAB yodoacetil] aminobenzoato Sulfosuccinimidil 4- [N- Sulfo-SMCC maleimidometi1] cic1ohexano-1-carboxi1ato Sulfosuccinimidil-4- (P- Sulfo-SMPB aleimidofenil) Butirato Grupos amino N-5-Azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida ANB-NOS Metil N-succinitnidil adipato MSA Ácido N-Hidroxisuccinimidil-4- NHS-ASA azidosalicilico N-Succinimidil (4-azidofenil) -1,3'- SADP ditiopropionato Sulfosuccinimidil 2- [7-amino-4- SAED metilcoumarin-3-acetamido] etil-1 , 3 'ditiopropionato Sulfosuccinimidil 2 [m-azido-o- SA D nitrobenzamido] -etil-1,3' -ditiopropionato N-Succinimidil-6- [4 ' -azido-2 ' - SA PAH nitrofenilamino] hexanoato Sulfosuccinimidil-2 - [p- SASD azidosalicilamido] etil-1,3' -ditiopropionato Sulfosuccinimidil- SFAD [perfluoroazidobenzamido] etil-1, 3' -ditiopropionato N-Hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato Sulfo-HSAB Sulfosuccinimidil [4-azidosalicilamido] - Sulfo- HS-LC-ASA hexanoato N-Sulfosuccinimidil (4-azidofenil) -1,3'- Sulfo-SADP ditiopropionato N-Sulfosuccinimidyl-6- [4' -azido-2' - Sulfo-SANPAH nitrofenilamino] hexanoato p-Azidofenil glioxal monohidrato APG Ácido ?-ß-Maleimidopropionico BMPA Reactivo de carbohidrato-Fotoreactivo N-Succinimidil-S-acetiltiopropionato SATP Reactivo de Sulfidril-Carbohidrato Clorohidrato de hidracina 4- (4-N- MPBH Maleimidofenil) butírico Hidrazida de 3- (2-?iridilditio)propionilo PDPH Reactivo de sulfidrilo-carbonilo (aldehido) /carboxilo Hidrazida del N- [ácido ß- BMPH Maleimidopropionico] »TFA Hidrazida del ácido N-e-Maleimidocaproico EMCH Hidrazida del ácido N- [k- KMUH Maleimidoundecanoico] N- [p-Maleimidofenil] isocianato PMPI TFCS EJEMPLO 16 Las anormalidades cromosomales fetales se determinan al analizar los SNP en donde el ADN de plantilla materno es homocigótico y el ADN de plantilla obtenido del plasma es heterocigótico . El plasma que se aisla de la sangre de una mujer embarazada, contiene tanto ADN de plantilla materno como ADN de plantilla fetal. Se puede usar cualquier número de métodos de detección de SNP para analizar el ADN materno y del plasma. Se puede usar cualquier microconfiguracion de ADN que incluye pero no se limita a configuraciones comercialmente disponibles y no comercialmente disponibles. Se puede diseñar una microconfiguracion de ADN para que contenga los SNP localizados en el cromosoma o cromosomas de interés, que incluyen pero no ¦ se limitan a una microconfiguracion de ADN que contiene los SNP localizados en los cromosomas 13, 18, y 21, una microconfiguracion de ADN que contiene los SNP localizados en los cromosomas 13 y 18, una microconfiguracion de ADN que contiene los SNP localizados en los cromosomas 13 y 21, una microconfiguracion de ADN que contiene los SNP localizados en los cromosomas 18 y 21, una microconfiguración de ADN que contiene los SNP localizados en los cromosomas 13, 18, 21, 15, 22, X, Y, una microconfiguración de ADN que contiene los SNP localizados en cada uno de los cromosomas autosomales y cada uno de los cromosomas del sexo, una microconfiguración de ADN que contiene los SNP localizados en el cromosoma 13, una microconfiguración de ADN que contiene los SNP localizados en el cromosoma 18, una microconfiguración de ADN que contiene los SNP localizados en el cromosoma 21, una microconfiguración de ADN que contiene los SNP localizados en el cromosoma 15, una microconfiguración de ADN que contiene los SNP localizados en el cromosoma 17, una microconfiguración de ADN que contiene los SNP localizados en el cromosoma 22, una microconfiguración de ADN que contiene los SNP localizados en un cromosoma simple, y una microconfiguración de ADN que contiene los SNP localizados en cromosomas múltiples. En este ejemplo, los SNP se analizan por las configuraciones GeneChip HuSNP de Affymetrix, sin embargo, 'se puede usar cualquier número de configuraciones de ADN, que incluyen pero no se limitan a configuraciones GeneChip, configuraciones GenFlex Tag, configuración de mapeo 10K Array, otras configuraciones de Affymetrix, y otras configuraciones de ADN.

Recolección de las Muestras de Sangre De acuerdo con un estudio aprobado por el IRB, se recolectaron muestras de sangre de mujeres embarazadas después de que se otorgó consentimiento por escrito. La sangre se recolectó en tubos de 9 mi EDTA Vacuette (número de catálogo NC9897284) y 0.225 mi de solución amortiguada neutral al 10% que contiene formaldehído (4% p/v) , se agregan a cada tubo, y cada tubo se invierte suavemente. Los tubos se almacenan a 4°C hasta que están listos para procesarse. Se puede agregar cualquier número de agentes que impidan la lisis -celular o que estabilicen las membranas celulares o reticulen las membranas celulares a los tubos que incluye pero no se limita a formaldehído, y derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehído, y derivados de glutaraldehído, reticuladores , reticuladores reactivos de amina primaria, reticuladores reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de bisulfuro, reticuladores reactivos de carbohidratos, reticuladores reactivos de carboxilo, reticuladores fotoreactivos , reticuladores que se dividen, AEDP, APG, BASED, BM(PEO)3, BM(PEO)4, BMB, BMDB, B H, BMOE, BS3 , BSOCOES, DFD B, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, Sulfo-EGS o los compuestos listados en la Tabla XXIII. Se puede agregar cualquier concentración de agente que estabilice las membranas celulares, impida la lisis celular o reticule las membranas celulares. En una modalidad preferida, el agente que estabiliza las membranas celulares, impide la lisis celular, o retícula las membranas celulares, se agrega a una concentración que no impide u obstaculiza las reacciones posteriores. Se puede agregar un agente que estabilice las membranas celulares a la muestra de sangre materna para reducir la lisis celular materna que incluye pero no se limita a aldehidos, urea formaldehído, fenol formaldehído, DMAE (dimetilaminoetanol) , colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol, sacarosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, hopano tetral fenilacetato isómero A, hopano tetral fenilacetato isómero B, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoína, perftoran, polivinilpirrolidona, fosfatidilserina, tegretol, PABA, cromglicato de disodio, nedocromil sodio, fenitoína, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio, o polaxámero 188.

Aislamiento de Plasma y Células Maternas Se almacena la sangre a 4°C hasta procesarse. Los tubos se hacen girar a 1000 rpm durante diez minutos en una centrífuga con un poder de frenado fijado en cero. Los tubos se hacen girar una segunda vez a 1000 rpm durante diez minutos. El sobrenadante (el plasma) de cada muestra se transfiere a un nuevo tubo y se hace girar a 3000 rpm durante diez minutos con el ajuste de freno en cero. El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo y se almacena a -80°C. Aproximadamente dos mililitros de la "capa amarillenta," que contiene las células maternas, se coloca en un tubo separado y se almacena a -80°C.

Aislamiento del ÁDN Se aisla el ADN de la muestra de plasma usando el kit Qiagen Midi para purificación de ADN de células de sangre, siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAmp DNA Blood Midi Kit, Número de catálogo 51183) . Se eluye el ADN en 100 µ? de agua destilada. El kit Qiagen Midi también se usa para aislar el ADN de las células maternas contenidas en la wcapa amarillenta . " Identificación de SNP Maternales Homocigóticos Ensayo H SNP El ensayo HuSNP se hace como se describe por K. Lindblad-Toh. et al. (Nature Biotechnology, Vol . 18, 1001-1005) . La configuración GeneChip® HuSNP™ se creee que permite bases completas de genomas al rastrear simultáneamente cerca de 1,500 SNPs dispersas a través del genoma. En este ejemplo, la configuración HuSNP se usa como una configuración representativa de Affymetrix, y y no significa que limite el uso de otras configuraciones que incluyen pero no se limitan a GeneChip CYP450, y configuraciones a la medida de Affymetrix que se diseñan para cubrir los requerimientos específicos del usuario.

Amplificación PCR Se ensaya el ADN materno de acuerdo con el protocolo HuSNP suministrado por Affymetrix Inc. Para cada muestra, 24 acumulados de pares de cebador (50-100 lugares/acumulado a 50 nM cada uno) se mezclan con 5 ng de ADN materno., 5 m gCl2, 0.5 mM d TPs, 1.25 U Amplitaq Gold (PE Biosystems, Foster City, CA) , y la solución amortiguadora suministrada en 12.5 µ? por acumulado. Se desnaturalizan las muestras durante 5 min a 95°C seguido por 30 ciclos de 95°C durante 30 s, 52°C + 0.2°C/ciclo por 55s, y 72°C durante 3Os; 5 ciclos de 95°C durante 30 s, 58°C por 55s, y 72°C durante 3Os y una extensión final de 72°C por 7 min. Se hace una dilución 1:1000 de cada acumulado al agregar 1 µ? del producto de amplificación hasta 999 µ? de ddH20. Después, 2.5µ1 de la dilución 1:1000 se transfieren a una placa nueva y se amplifican con 0.8µ? de cebador T7 biotinilado y 0.8 uM de cebador T3 biotinilado, 4mM MgCl2, 0.4 mM dNTPs, 2.5 U Taq y la solución amortiguadora suministrada en 25 µ? por 8 min a 95°C, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 30 s, 55°C por 90s, y 72°C durante 30 s, y una extensión final de 72°C por 7 min.

Luego, 1.5µ1 de cada acumulado se prueban para amplificación en un gel de agarosa al 3%. Para cada muestra, el resto de cada uno de los 24 acumulados se mezcla y carga sobre una columna de giro Microcon-10 (Amicon Bioseparations , Bedford, MA) . Se concentraron las muestras al girar la columna durante 20 min a 13,000 g a temperatura ambiente y se eluyeron al invertir la columna y centrifugar durante 3 min a 3,000 g. Se ajustaron los volúmenes a 60 µ? . Se puede diseñar una configuración a la medida al usar solamente los SNP que son de interés. Por ejemplo, se puede diseñar una configuración a la medida que contenga SNP que se localicen en los cromosomas 1, 13, 21, 18, 15, X, y Y. Adicionalmente, se puede amplificar cualquier número de SNP incluyendo los SNP localizados en cualquier cromosoma humano que incluye el cromosoma 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X o Y. Se escogen dos SNP representativos del cromosoma 13 y dos SNP representativos sobre el cromosoma 21. La ubicación genómica y la secuencia de los SNP se puede encontrar en el consorcio SNP (http://snp.cshl.org). Si no están presentes estos SNP sobre la configuración, se pueden escoger diferentes SNP. SNP TSC0466917 (C/G) , el cual se localiza en el cromosoma 13, se amplifica usando los siguientes cebadores: Cebador en la dirección ascendente : 5' CCAGCTGGTAGAACTT 3' Cebador en la dirección descendente: 5' CCCAATAGACCTATAG 3' SNP TSC1172576 (T/A) , el cual se localiza en el cromosoma 13, se amplifica usando los siguientes cebadores: Cebador en la dirección ascendente : 5' TAGCAGAATCTCTCAT 3' Cebador en la dirección descendente : 5' AGAGTATCTCATTTGTT 3' SNP TSC0271628 (A/G) , el cual se localiza en el cromosoma 21, se amplifica usando los siguientes cebadores: Cebador en la dirección ascendente: 5' AGGAAATTGTGAAGTA 3' Cebador en la dirección descendente: 5' TAACTCACTCACTATC 3' SNP TSC0069805 (C/T) , el cual se localiza en el cromosoma 21, se amplifica usando los siguientes cebadores: Cebador en la dirección ascendente: 5' CTGCTGAGTCATAGTC 3' Cebador en la dirección descendente : 5' TGTTCTTTGAATCAAC 3' Hibridación a las Configuraciones de Sonda GeneChip, Lavado y Tinción 5-30 µ? de la muestra (dependiendo de la intensidad del lote de chips) se diluyen en cloruro de tetrametilamonio 3 (TMACl) , 2mM del oligonucleótido de control Bl (suministrado por Affymetrix) , solución de Denhardt 5X, 100 µg/ml de ADN de esperma de arengue, 5 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris pH7.8, y 0.01% Tween 20 en un volumen de 135 µ? y se desnaturaliza durante 10 min a 95°C. Después de dos minutos sobre hielo, las muestras se cargan sobre los chips HuSNP y se hibridizan durante 16 h a 44°C y 40 r.p.m.

Cada chip se lavó y se tiñó sobre fluidos Affymetrix. Se lavaron los chips durante dos ciclos de dos mezclas con 6X SSPET (Bio Whitaker, Víalkersville, MD) (6X SSPE (cloruro de sodio, fosfato de sodio, EDTA de sodio) + 0.01% Triton-X-100) a 25°C, y por seis ciclos de cinco mezclas con 4X SSPET (4X SSPE + 0.01% Tritón X-100) a 35°C. Se tiñeron los chips durante 30 min a 25°C con 50 µ<3/t?1 de estreptavidina-ficoertrina y 0.25 mg/ml de anticuerpo biotinilado anti-estreptavidina en 6X SSPE, solución de Denhardt IX, y 0.01% Tween 20 en un volume de 500 µ? . El chip se llenó con SX SSPET después de seis lavados de cuatro mezclas con 6X SSPET a 25°C. Después de los procedimientos de hibridación, lavado y tinción, las configuraciones de sonda HuSNP se exploraron usando el escáner HP GeneArray (HuSNP Mapping Assay Manual Affymetrix P/N 700308) .

Exploración Las configuraciones de sonda HuSNP se exploran usando el escáner HP GeneArray según el HuSNP Mapping Assay Manual (Affymetrix P/N 700308) . Se pueden usar otros escáneres que incluyen pero no se limitan al lector AlphaArray™. Se hacen automáticamente las llamadas de genotipo a partir de las intensidades de señal de hibridación recolectadas, por el software versión 5.0 de Affymetrix Microarray Suite. Cada alelo de un SNP se representa por cuatro o cinco sondas complementarias con diferentes ubicaciones de la posición base de SNP dentro de las sondas de 20 nucleótidos. Cada una de estas sondas., a su vez, se aparean con una sonda de la misma secuencia, excepto por una no coincidencia central en o cerca de la posición SNP, pretendida para corregir el valor de fluorescencia para el enlace no específico a la sonda. Cada SNP forma genotipos. Los SNP localizados en los cromosomas 13 y 21, en donde el ADN materno es homocigótico, se analizan con el ADN aislado del plasma.

Análisis del ADN aislado del plasma materno Después de que se analiza el ADN materno y se identifican los SNP homocigóticos , estos SNP se analizan con el ADN aislado del plasma. Un número de bajas copias de genomas fetales está típicamente presente en el plasma materno. Para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, que son los SNP a los cuales el ADN materno es homocigótico, los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases a aproximadamente 130 bases en dirección ascendente y 130 bases en dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés. Esto se hace para reducir el error de muestreo estadístico que puede suceder cuando se trabaja con un número bajo de genomas, que pueden tener influencia en la relación de un alelo al otro (ver Ej emplo 11 ) .

Diseño de Cebadores Multiplex Los cebadores tienen 12 bases de longitud. Sin embargo, se pueden usar cebadores de cualquier longitud que incluye pero no se limita a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76-85, 86-95, -96-105, 106-115, 116-125, y más de 125 bases. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases tanto a la hebra sentido como a la hebra antisentido. Los SNP homocigóticos maternos varían de muestra a muestra de manera que no se proporcionan aquí secuencias definidas. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases alrededor de 130 bases en dirección ascendente y descendente de los SNP homocigót icos maternos. Los cebadores se diseñan para finalizar en la terminación 3' en el dinucleótido "AA" para reducir la formación de dímeros del cebador. Sin embargo, se pueden diseñar los cebadores para terminar en cualquiera de los cuatro nucleótidos y en cualquier combinación de los cuatro nucleótidos.

PCR Multiplex Las regiones en la dirección ascendente y en la dirección descendente de los SNP homocigóticos maternos se amplifican a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, Patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas en la presente como referencia) . Esta reacción PCR utiliza cebadores que se combinan en sus pares de bases aproximadamente 130 bases en la dirección ascendente y en la dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés. Se mezclan juntos los cebadores y se usan en una reacción sencilla para amplificar el ADN de plantilla. Esta reacción se hace para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, lo cual elimina el error generado a partir de un número bajo de genomas. Para una especificidad mejorada, se utiliza una reacción PCR de "inicio en caliente" . Las reacciones PCR se llevan a cabo usando el kit HotStarTaq Master Mix Kit suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y cebador por reacción se optimiza para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, se usan los 20 µ? de ADN de plantilla de plasma. Dos microlitros de cada cebador delantero y reverso, a concentraciones de 5 mM, se acumulan y mezclan en un tubo microcentrífugo sencillo. Se usan cuatro microlitros de la mezcla del cebador en un volumen total de reacción PCR de 50 µ? (20µ1 de ADN de plantilla de plasma, 1 µ? de agua estéril, 4 µ? de mezcla de cebador, y 25 µ? de HotStar Taq. Se llevaron a cabo veinticinco ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95 °C por 15 minutos; (2) 95 °C durante 30 segundos; (3) 4°C durante 30 segundos; (4) 37 "C durante 30 segundos; (5) Repetir etapas 2-4 veinticuatro (24) veces; (6) 72 "C durante 10 minutos. Las temperaturas y los tiempos para desnaturalización, combinación de pares de bases, y extensión, se optimizan al tratar diversos parámetros y usando los parámetros que producen los mejores resultados . También se pueden usar otros métodos de amplificación genómica para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés que incluyen pero no se limitan a preamplificación de la extensión del cebador (PEP) (Zhang et al., PNAS , 89:5847-51, 1992), PCR cebada con oligonucleótido degenerado (DOP-PCR) (Telenius, et al., Genomics 13:718-25, 1992), amplificación por desplazamiento de hebras al usar la polimerasa del ADN del bacteriófago 29, la cual se somete a una replicación en círculo rodante (Dean et al., Genomic Research 11:1095-99, 2001), amplificación de desplazamiento múltiple (Patente de E.U.A. 6,124,120), REPLI-g™ its de amplificación completa de genoma, y PCR etiquetada . Es importante asegurar que la región amplificada contenga secuencias de combinación de pares de bases para los cebadores que se usan con el Ensayo HuSNP . Al adquirir la configuración HuSNP, cada SNP y los cebadores usados para amplificar cada SNP se pueden identificar. Con este conocimiento, se diseñan los cebadores multiplex para abarcar regiones de combinación de pares de bases para los cebadores en la configuración HuSNP.

Purificación del Fragmento de Interés Se retiran de la reacción los cebadores sin usar y los nucleótidos al usar Kits de purificación Qiagen MinElute PCR (Qiagen, Número de catálogo 28004) . Las reacciones se llevan a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante suministradas con las columnas. Se eluye el ADN en 100 µ? de agua estéril. 5 µ? de cada lugar cromosomal amplificado, se mezclan juntos Ensayo HuSNP, lavado, tinción y exploración Se ensaya el ADN acumulado con el ensayo HuSNP como se describió anteriormente. Los procedimientos de lavado, tinción ? exploración son como se describió anteriormente. Se forma el genotipo de cada SNP. Los SNP se localizan en cromosomas 13 y 21, en donde el ADN materno es homocigótico, y Se cuantifica el ADN aislado del plasma que es heterocigótico. Cuantificación La intensidad de la señal para cada alelo en un heterocigoto es SNP que se cuantifica. Como se discutió anteriormente, la relación esperada del alelo 1 al alelo 2 se puede usar para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosorna1. Si el genoma materno es homocigótico en SNP X (A/A) , y el ADN de plasma es heterocigótico en SNP X (A/G) , entonces el G representa la señal fetal diferente. La relación de G:A depende del porcentaje de ADN fetal presente en la sangre materna. Por ejemplo, si la muestra contiene ADN fetal al 50%, entonces la relación esperada es 0.33 (1 alelo fetal G/ (2 alelos maternos A + 1 alelo fetal A) ) . Esta relación debe ser constante para todos los cromosomas que están presentes en dos copias. La relación que se obtiene para los SNP en el cromosoma 13 debe ser la misma que la relación que se obtiene para el cromosoma 21. Sin embargo, si el genoma fetal contiene una copia adicional del cromosoma 21, entonces la relación para este cromosoma se desviará de la relación esperada. La relación esperada para una condición de Trisomía con ADN fetal al 50% en la sangre materna es 0.25. Así, al analizar los SNP en donde el genoma materno es homocigótico, y el ADN que se aisla del plasma es heterocigótico, se pueden detectar las anormalidades cromosomales del feto . Este ejemplo explica el uso de los ensayos Affymetrix HuSNP Arrays, pero no pretende limitar el uso de las configuraciones. Se puede usar cualquier configuración de ADN que incluye pero no se limita a las configuraciones de ADN enlistadas en la tabla XXIV, o configuraciones de ADN disponibles de cualquiera de las empresas enlistadas en la tabla XXIV o XXV. Se pueden hacer las configuraciones a la medida de ADN para detectar anormalidades cromosomales fetales en la sangre materna, usando cualquier número de productos o servicios que incluyen pero no se limitan a, aquellos enlistados en las tablas XXIV, XXV, XXVI y XXVII.

Tabla XXIV: Características de algunos formatos de microconfiguración por hibridación. Compañía Nombre Método de Etapa de Lectura Comercial configuración Hibridación Affymetrix, GeneCnip Síntesis 10, 000- Flúores Inc. , fotolitográfi 260, 000 cencía ca in si tu oligo (en chips) de fracciones -20-25 probadas con meroligos 30-40 sobre discos fragmentos de silicón de que se cortan nucleótidos en trozos o etiquetados chips de 1.25 con ADNc o cm2 o 5.25 cm2 AUN antisentido Agilent Programa de Configuraciones Technologies acceso de diseñadas microconfig personalizadas uraciones de ADN Amersham Configura Biosciences ciones CodeLink BD PharMiirgen Membrana Humana 1 RiboScreen CLDTECH Atlas Variable Variable Variable Humano Atlas Glass Humano 1.2 Atlas Gl Humano II Atlas Glass Humano 1.2 III Atlas Humano Cáncer Atlas Humano Apoptosis Atlas Humano ADNc del cáncer 5 Atlas Humano Cardiovascu lar Atlas Humano ADNc Ciclo celular Atlas Humano Interacción celular Atlas Humano Receptor de citocinas Atlas Humano Configuraci ón de hematología Atlas Humano Neurobiolog ia Atlas Humano Oncogen Atlas Humano Configuraci ón de esfuerzo Atlas Humano Toxicología Atlas Humano Atlas Human Tumor Configuraci ón Atlas Human Oncogene Configuraci ones personaliza das Atlas 41 Configurad ones seleccionad as personaliza das Atlas Brax, 1000 oligos oligo en un "chip sintético universal" Espectro corto probado con metría sintetizado ácidos de masa fuera de nucleicos chips etiquetados Display Descubrimie Usa PCR de Systems nto de despliegue Biotech configurad diferencial ón de de fragmento placas de de exhibición restricción del Gen Humano Gene Logic, READS™ Configuración Trozos con Inc. , es de Sondas canales de chip por microscópico flu o s con sondas unidas en sus paredes Configurad Genmed ones del perfil Star Servicios de separación por exclusión SNP, Genometrix Universal configuración Inc. , Arrays ™ es propietarias de 96 pozos X 250 Genomic Chips Secuencias Solutions Cáncer relacionadas GenMAP con el cáncer manchadas por duplicado Hyseq Inc. , HyChip™ Muestras de Manchas de Radio ADN de 500- ADNc de 64 isótopos 2000 nt muestras impresas probadas con sobre 8,000 7-mer membranas de oligos 0.6 cm2 (HyGnostics) (HyGnostics) o -18 cm2 <=55,000 (Gene manchas de Discovery) ADNc probadas con 300 7-mer oligo (Gene Discovery) 5-mer oligos Manchas oligo Fluoresc impresos Universal 1024 eneia fabricados en sondas con como ADNc de una configuración muestra de 10 es de 1,15 kb etiquetadas cm2 sobre con 5-mer vidrio oligo y ligasa (HyChip) Incyte GEM Impresión <=1000 Fluoresc Pharmaceutica Piezoelectric (eventualmen encia y ls, Inc. a para el te 10,000) radioiso manchado de o1igo/mancha topo fragmentos s de mediante PCR fragmentos y síntesis en PCR probados chips de con ARN oligos etiquetado UsJKHAL'l'iVIA Configuración por afinidad de oro Mergen Sistema de microconfigur aciones de ADN ExpressChip Molecular Storm® ADNc de 500- -10,000 Fluoresc Dynamics, Inc Fluorlmager 5000 nt manchas de encia ® impresos por ADNc formaron pluma sobre sondas con -10 cm2 en ADNc de placas de muestras vidrio etiquetadas con 200-400 nt Motorola Configura ción CodeLink MWG-Biotech Servicio Biochip autorizado por Affymatrix NEN Life ICROMAX Science ADNc Humano Products MICROMAX fosfatasas y quinasas Humanas Factores de transcripci ón humanos MICROMAX Genes supresores del tumor y oncogenes humanos MICROMAX Tecnologías Colágeno Operon humano OpArray apoptosis humana OpArray Envejecimie nto y resistencia humana OpArray Origene Smartset 1 Tecnologies Humano SmartArray Smartset 2 Humano SmartArray Smartset 3 Humano SmartArray Smartset4 Humano SmartArray Nanogen Microchip -20-mer 25, 64, 400 Fluoresc Semi oligos (y encía conductor prefabricados eventualment capturados e 10,000) sobre manchas oligo electroactiva manchas s en discos polarizadas de silicio para mejorar que son la cortan en hibridizació chips de <=1 n para ADNc cm2 de 200-400 nt de muestras etiquetadas Toxicología Configura molecular ción del Fase 1 Gene Humano 350 ProtoGene Tecnología Configuración <=8, 000 Fluoresc Laboratories FlexChip de basada en una manchas encia ADN tensión de la oligo superficie : formadas en Síntesis en sondas con chips de 40- ácidos 50-mer oligos nucleicos de sobre trozos muestras de vidrio de etiquetadas 9 cm2 vía la de 200-400 impresión de nt una configuración de tensión superficial R&D Systems Configura ción de expresión de citocinas humanas Configura ción de expression de la apoptosis humana Research Liberado Genetics nes I-VII de microconfig uraciones en filtros de genes humanos Liberación I de microconfig uraciones en filtros de genes "llamados genes" humanos Liberación I de microconfig uraciones de filtros de genes específicos de próstata Microcon figuración de filtros de genes específicos de ovarios humanos Micro configura 10 ciones de filtros de genes específicos de seno 15 humano Liberación I de microconfig uración de filtros de genes específicos de colón humano 25 icrocon figuración de filtros de genes de piel humana Dermarray Radius Servicios Biosciences de configura ción a la medida osetta Microconf ig Impharmatics uraciones FlexJet de ADN; Resolver™ Sequencm SpectrcChip Inpresión off250 ubicaciones Espectrcme Iv&ssArray set de por tria de configuración; Spectrochips masa alrededor de 20- interrogados 25 mer oligos mediante la desorción de láser y espectrometría de masa SEQWRIGH Servicios de conf gura ción Sigma-Genosys Configuraci ones del gen de citocinas humanas Panorama Configuraci ones de apóptosis humana Panorama Stratagene Microcon figuración descubierta Gene Connectio SuperArray Kit GEArray de apóptosis humana 55 Kit GEArray y reguladores de la familia Bcl-2 de la apoptosis-4 humana Apoptosis 10 humana 5/TMF y Kit Ras Network GEArray Kit GEArray 15 p53 humana Kit GEArray Toxicidad/E sfuerzo humano 20 Kit GEArray del ciclo celular 1, 2 humano 25 Kit GEArray Trayectoria Detector humana Kit GEArray Jak-Stat humano Kit GEArray Trayectoria 10 AKT y quinasa P13 humana Kit GEArray de 15 Trayectoria NFkB humana Kit GEArray de citocinas 20 communes humanas 25 Kit GEArray del receptor de interleucin a humana Kit GEArray de la respuesta inf lamatori a humana GEArrays de selección humana Synteni, UniGEM™ ADNcs de 500- Manchas de Fluoresce Inc . , 5, 000 nt ADNc <=10, 000 ncia (adquirida impresos en una formadas en por Incyte punta sobre sondas con Pharmaceutica trozos de 200-400 nt de ls, Inc . ) vidrio de ~4 ADNc de cm muestras etiquetadas 7 TeleChem Configurad International ones Flex- , Inc. Chips personaliza das Configurad ones personaliza das eChips Configurad ones de Discovery Chip Vysis Inc. Kit de microconfig uraciones AmpliOnc The Germán Macrochips de Alrededor de Fluoresc Cáncer PNA 1, 000 encia/es Institute prototípicos manchas en pectrome con síntesis un trozo de tría de en chips de 8 x 12 cm masa sondas usando química f-moc o t-moc 55 Tabla XXV: Compañías que producen configuraciones, o dispositivos e instrumentaciones involucradas en la producción de las configuraciones. COMPA IA PRODUCTO/INVESTIGACION Dirección del sitio de Red ACLARA Chips plásticos y sistemas BioSciences, microfluidos basados en Inc . microfluidos "Lab-On-A- Chip" Patente de los E.ü. 5,750,015: "Method and device for moving molecules by the application of a plurality of electrical fields") . Advanced BIO-CD™: plataforma de http : //www.aat- Array discos compactos para la Configuración. com Technology detección de ADN S.A. Aff metrix, Configuraciones GeneChip® http : //www. affymetri Inc . , que incluyen VIH, p450, x. com p53, toxicologia de rata con configuraciones U34.

Agilent Una compañía subsidiaria de http : //www. agilent . c Technologies , Hewlett-Packard Company, om Inc proyecta expander su presencia en el Mercado de Ciencias de la vida por medio de la introducción de un nuevo programa de microconfiguración de ADN. Esta tecnología hace uso de una tecnología de impresión de inyección de tinta para fabricar sus microconfiguraciones de ADN basadas en oligos. Licenciada por Ed Southern/OGT. Bioanalizador de AR y ADN basado en LabChip™. Alpha Alpha Innotech proporciona htt : //www. alpha- Innotech soluciones que forman imágenes tec.net Cor . de bioinformática para el descubrimiento genético diseñado para adquirir, manejar y analizar la fluorescencia, o^imioluminiscencia o portaobjetos, placas, geles, manchas o películas de microconfiguraciones colorimétricas Amersham Generador de manchas de la http : //www. apbiotech Biosciences configuración Lucidea, . com procesador de placas automatizadas, detector de manchas, sistema de registro . AlphaGene, ADNc de longitud completa Inc . FLEX™ y construcción de la colección MicroFLEX; Perfil de expresión del gen de alto rendimiento; Secuenciación del ADN de alto rendimiento; Bioinformática Applied Configuración WoRx es un Precisión, escáner de Inc . microconfiguración basado en una fuente de luz de amplio campo que combina posibilidades de longitud de onda ilimitadas con un software de procesamiento de imágenes y automatización.

Asper Ltd. Extensión cebadora configurada (APEX) y Asper ChipReader 003 AVIVA Dedicada a la aplicación del Biosciences descubrimiento de ' una Corp. tecnología de biochips de esfuerzos múltiples para genómica y proteomica. La compañía está desarrollando un sistema integrado de muestra a resultado de AVIChip™ con un énfasis en la preparación de muestras biológicas y manipulación molecular basada en chips. El sistema AVIChip™ separará y transportará una variedad de ARm, u otras moléculas a partir de las muestras biológicas crudas y realizarán simultáneamente un amplio rango de análisis bioquímicos y biológicos. La tecnología AVIVA permite un análisis biológico rápido, seguro, automatizado y de alto rendimiento en los sistemas de biochips integrados que proporcionan nuevas metodologías para el desarrollo de fármacos y el diagnóstico clínico.

Axon El software de escáner y Instruments, microconfiguración Inc . integrados escanea simultáneamente placas de microconfiguraciones en dos longitudes de onda usando un sistema de escaneo láser dual que muestra imágenes a partir de dos longitudes de onda y una relación de imagen que son recibidas en tiempo real; $50,000 dólares) BioArray Montaje electrocinético Solutions , controlado por luz de LLC partículas próximas a las superficies (LEAPS) , que permite un montaje de cuentas y células controlado por computadora en configuraciones planas dentro de un compartimento fluido cerrado en miniatura en la superficie de un disco semiconductor.

BioCat Distribuidor de catálogos y http : //biocat . de conf guraciones personalizadas bioDevice Proporciona servicios de Partners, consultoria para la comunidad de microconfiguraciones en el área de la instrumentación y la óptica. BioDiscovery, ImaGene™, software de Inc . procesamiento de imagen especial y extracción de datos; CloneTracker : Bases de datos de clones, placas, portaobjetos y ofrecen herramientas para el diseño de configuración e interfaces para configuradores ; GeneSight: Poderoso software de análisis de expresión que ofrece métodos estadísticos así como herramientas de visualización, Biomedical MACROscope™ para Photometrics , microconfiguraciones Inc . , genéticas de lectura en colaboración con el consorcio de Canadian Genetic Microarray BioRobotics MicroGrid, para Ltd. configuración de oligonucleótidos o clones de ADNc en placas de vidrio y chips plásticos) Caliper LabChips™ basados en Technologies microfluidos Corp Capital Creado para desarrollar y Biochip Corp comercializar varias tecnologías de biochips .

Cartesian PixSys PA Series: para un Technologies, sistema manual liquido Inc . automático para crear configuraciones de alta densidad para una investigación genómica. Sean. Array 3000: ün sistema que forma imágenes fluorescentes para biochips de microconfiguraciones . Cellomics , ArrayScan™, "Separación por Inc . exclusión de alto contenido" basado en células (HCS) para el descubrimiento de fármacos . Cepheid Microfluidos Clinical Diagnósticos médicos de ADN Micro basados en microchips; Sensors, Inc . detección de ADN detectado directamente vía una transferencia de electrones . Clondiag Chip Trabajando en la generación Technologies y aplicación de microconfiguraciones de ADN. Configuración Vende varias http : //www. clontech . de ADNc Configuraciones humanas. com humano Atlas™ de Clontech CombiMatrix Tecnología de núcleo de Corporation CombiMatrix' es el circuito integrado Lab-on-a-Chip .

Estos circuitos integrados contienen configuraciones dé micro electrodos que se dirigen individualmente usando una circuiteria lógica en el chi . Compugen Plataforma de descubrimiento del fármaco LEADS™ para identificar direccionamientos del fármaco basados en el análisis de EST (Etiqueta de la secuencia expresada) y base de datos genómicos, la expresión resulta de chips y proteomicos, y detección y calificación del polimorfismo; análisis y diseño de chips de ADN.

Corning Proporciona la tecnología Science de microconfiguración de Products Corning placas revestidas División con amino silano CMT-GAPS y cámara de hibridización CMT.

Cruachem Ltd., Fabricación de bloques de U.K construcción de fosforamidita para la síntesis del ADN. CuraGen Corp. GeneCalling™ y Análisis de Expresión cuantitativa (QEA™) , CuraMode, CuraTox diaDexus, LLC Especializado en usar tecnología de microconfiguración para los diagnósticos moleculares.

Display Descubrimiento de placas Systems ARRAY (sobre 2400 Biotech, Inc, fragmentos de ADNc expresados); ofrecerán rápidamente más de 40,000 genes humanos y de ratón formados DNAmicroarray Ofrece servicios de . com análisis y síntesis de microconfiguraciones de ADN de alta densidad "hechos a la medida" . Erie Fabricación de microplacas Scientific para microconfiguraciones .

Company Exiqon Chips y placas de http : //www. exiqon. co Microconfiguraciones m Expression La compañía se formó para Analysis Inc proporcionar análisis de expresión del gen y procesamiento Genechip usando microconfiguraciones Affymetrix Genechip. Febit Sistema para formar htt : //febit . com genotipos o perfil de expresión del gen. Gene Logic, Flow-thru Chip™: tiene Inc . cientos de miles de canales microscópicos discretos que pasan completamente a través de estos. Las moléculas de sondas se unen a la superficie interna de estos canales, y direccionan el flujo de las moléculas a través de los canales, que están en proximidad cercana con las sondas. Esta proximidad facilita la hibridización. READS™, Análisis de enzimas de restricción de secuencias expresadas diferencialmente para capturar y analizar el perfil de expresión del gen completo de una célula o tipo de tejido para identificar objetivos del fármaco . Geneka Placas de Biotechnology microconfiguraciones Inc . basadas en oligonucleótidos, el P.R.O.M. (Microconfiguración de oligonucleótidos reguladores proteómicos) . 35-45-meros Genemachines OmniGrid, placas de vidrio Genomic o membranas de nylon. Instrumentati on Services, Inc .

GeneSean Tecnología Biochip; alto- http : // ww. genescan- rendimiento en la europe . com producción de biochips. General Microposicionamiento y Scanning Inc escaneo por láser, fabricación del Sistema de Escaneo de Biochips de MicroArray™) . Llamados ahora GSI Lumonics Genisphere Proporciona kits http : //www .genispher etiquetados e . com • fluorescentemente para las configuraciones de expresión del gen. La tecnología usa ácidos nucleicos altamente ramificados-dendrimeros . Genetic Instrumentación para el MicroSystems análisis basado en Inc . microconfiguración de ADN. Adquirida por Affymetrix Genicon Desarrolló una generación Sciences Corp de señal ultra sensible y tecnología de una plataforma de detección basada en dispersión de Luz de Resonancia (RLS) para la detección simple y eficiente, medición y análisis e interacciones biológicas . Genometrix Bioscanner™, GeneView®, Inc . Universal Arrays™, Risk-Tox Genomic Sistema robótico modular htt : //www.genomicso Solutions , Flexys™, Los productos de lutions . com análisis de configuración GeneTAC™ y Genomic Integrator™ automatizan la formación de imágenes y análisis de microconfiguraciones de genes . GENPAK Inc Sistema de microconfiguraciones robóticas genpakARRAY 21 y sistema de microconfiguración manual genSTATIOM 3XL GeSiM El Nano-Plotter se basa en un principio de conducción Inc . rnicrofabricación e com información avanzada para crear configuraciones en donde 250,000 sensores discretos se fijan en una sonda de diámetro de la cabeza de un alfiler. Tecnología: "BeadArray" Incyte GEM MicroArrays, Genomics , conf guración GeneJet™, Inc . Base de datos LifeSeq® con 100,000 genes, y software de microconfiguración Life Arra . IntegriDerm, Produce Inc microconfiguraciones de ADN DermArray para la investigación dermatológica.

JMAR 1 s Diseñador y fabricador de Precisión sistemas de exposición a UV Systems, Inc y alineación oculta diseñados específicamente para las fabricaciones de bio-chips. También producen sistemas de microposición personalizada para un equipo de micromanchado y metrología dimensional de alta resolución y sistemas de inspección por defecto para asegurar la calidad de los biochips y las microconfiguraciones de ADN. Lab-on-a- Proporciona información Chip . com enfocada en todas las tecnologías Lab-on-a-Chip . Esta incluye documentos publicados, noticias, eventos, productos nuevos, suministros, enlaces de búsqueda, trabajos y foros de discusión. Labman HDMS : Formador de manchas de Automa ion microconfiguraciones de Ltd. , alta densidad Labman Lambda Kits de biochips listos htt : //www. lambda. at para usar para formar genotipos y detección de SNP. Lifecodes Sistema de Corp. microconfiguraciones Lifecodes :LMAS Lynx Megasort™ es un proceso basado en cuentas que proporciona un análisis de ADN diferencial. Medway Diseños MEDWAY desarrolla, fabrica y comercializa dispositivos médicos para diagnósticos, sistemas robóticos, instrumentos ópticos, marcadores moleculares fluorescentes, microchips de tamiz. Mergen Ltd Microconfiguración de oligonucleótidos ExpressChip™ Memorec Tecnología PIQOR para htt : //www.memorec . c Stoffel producir configuraciones de om ADNc humanas y murinos genéricos y personalizadas. MetriGenix La configuración 4D utiliza Inc un diseño de circulación patentado que optimiza el área de la superficie para la relación de volumen, tiene tiempos de hibridización más cortos que proporcionan una capacidad de enlace/señal superior y es más fácil para manejar que los biochips planos. Micralyne Fabrica componentes de Inc . películas delgadas, de silicio, y de vidrio micromecanizados para usarse en microfluidos .

MicroFab Fabrica una tecnología de Technologies , impresión de inyección de Inc . tinta por goteo piezoeléctrica para fluidos de microdosificación Micronics, Microfluidos basados en Inc sistemas para la aplicación de diagnósticos de laboratorio clínicos: Microcytometer™, H-Filter™, T-Sensor™, y O.R.C.A. /xFluidics Molecular Storm® y Fluorlmager® Dynamics , I c Molecular Análisis de bits genéticos Tool , Inc GBA¾' Genomatic™. Adquiridos mediante Biocomputer Orchid el 14 de Septiembre de 1998. Mosaic Kits de pantallas activadas Technologies, EZ-RAYS™ para Inc . , microconfiguraciones de ADN. Motorola Tecnología de almohadilla htt : // ww .motoróla .

BioChip de gel 3 D licenciada del com/lifesciences Systems Laboratorio Nacional de Argonne; Sistema de configuración Codelink. MWG Biotech Sistemas automáticos de htt : //mwgatccn.mwgd chips personalizados, na . com microconfiguraciones basadas en oligos. Nanolytics Desarrollo de Tecnología de síntesis de configuración personalizadas . Nanogen Dirección electrónica, htt : // ww. nanogen. c concentración e ora hibridización; estaciones de trabajo automáticas NanoChip para el análisis SNP y STR. EN Life Sistema I de Science microconfiguraciones de Products ADNc humanos MICROMAX™ para el análisis de expresión del gen diferencial . Operon Densidad baja (320 o 370 Technologies, genes, 70-meros) Inc . microConfiguraciones OpArrays™ Orchid Tecnología SNP-IT, chips htt : //www. orchid. co BioSciences , microfluidos, que aplican m Inc . procesos de microfabricación en vidrio, silicio y otros materiales para crear estructuras tridimensionales . Contenidas dentro de estos dispositivos son canales capilares pequeños menores a un milímetro de ancho. OriGene Ofrece chips SmartArray™ Technologies (Humano) , que incluyen Inc . receptores de hormonas nucleares, factores de transcripción homeocaja/b- zip/HLH, factores de transcripción de tejido especifico/inducible y quinasas de fosfotirosin . Oxford Gene microconfiguración basada http : //www. ogt . co .uk Technology en Oligos Ltd Packard Placas revestidas con http : //www packardbi Bioscience Hidrogel, software de oscience . com (División of análisis de datos y PerkinElmer) escáner, configuradores . Packard Configu ador BioChip Instrument Company PamGene B.V. Tecnología por medio de http : //www pamgene . c flujos para om microconfiguraciones PanVera Microconfiguraciones de http : //www .panvera . c inteligencia . ora PE Applied TaqMan Assay, Ensayo http: //lifesciences .

Biosystems TaqMan, Ensayo de tintes perkinelmer . com Verde I SYBER, Sistema de preparación de micromuestras integradas para el análisis genético. PharmaSeq, Ensayo para el diagnóstico Inc de ADN Multiplex basado en un microtranspondedor . Phase-1 Toxicologia molecular y de Molecular alto rendimiento usando Toxicology, chips de genes (Licenciado Inc . por Xenometrix) PicoRapid Picoconfiguraciones . htt : // ww. icorapid Technologie Picoplacas y servicio de . de teñido con microconfiguraciones . Protogene Configuración por tensión Laboratories de la superficie en un substrato de vidrio; reactivos de "Impresión" que usan una tecnología suministrada por goteo Qiagen Operon Configuraciones http : //www. operon. co personalizadas y y m Configuración preparada de oligos R&D Systems La Configuración de expresión de la citocina permite determinar el nivel de ARN para aproximadamente 400 citocinas y factores relacionados en un experimento de hibridización estándar (cargado con una membrana de nylon) . Radius ADN, ARN, ANP, y chips de Biosciences microconfiguraciones . de proteínas . RELAB AG Desarrollo de Configuraciones BioChip para aplicaciones diagnósticas (oncología) . La plataforma GeneStick con configuraciones en palillos plásticos y un Nuevo formador de imágenes guimioluminiscente .

ResGen Microconfiguraciones http: //www.resgen. co Invitrogen GeneFilters m /configuraciones de tejidos VastArray/clones de longitud completa de fácil Expresión GeneStorm. RoboDesign El RoboArrayer está International integrado con un sistema de Inc . visión para permitir la cuantificación en tiempo real del tamaño de la mancha y su volumen durante el proceso de impresión. Rosetta Microconfigurciones de Inpharmatics oligonucleótidos de ADN FlexJet™ (sintetizados in- situ en un soporte de vidrio via un proceso de impresión de inyección de tinta) ; Sistema de Análisis de datos de expresión Resolver™ Scienion Configuraciones http : //www. scienion. personalizadas y genéticas de SciMatrix, Configuración Array Inc Works™, una línea completa de servicios de microconfiguración personalizada para la producción, proceso y análisis de microconfiguraciones , usando configuradores PixSys™ a partir de tecnologías Cartesianas. Se proporcionan también sistemas de microconfiguraciones ArrayEngine™ personalizados . Seguenom MassArray de ADN, BiomassPROBE, Biomass SIZE, BiomassSEQUENCE , BiomassSCAN, BiomassINDEX, y SpectroChip Sigma-Genosys Configuraciones del gen de htt : //www. sigma- Ltd la E. coli Panorama™ 4,290 genosys . com genes por Configuración SmartBead Tecnología de http : //www . smartbead Technologies microconfiguraciones 3D . cora UltraPlex™ para aplicaciones en la formación de genotipos y expresión de genes SuperConfigur Los sistemas de expresión htt : //ww . superarra ación Inc de genes (GEArray™) (humano y . com y ratón) son diseñados para el perfil de expresión del gen de trayectoria específica. SurModics, Fabricantes de placas Inc activadas 3D-Link™ para la producción de microconfiguraciones . Usan ADN de aminas modificadas para hibridizar en la superficie de la placa. Synteni, Inc. UniGEM™ Microconfiguración de Expresión del gen. TeleChem Ofrece partes del sistema International completo: ChipMaker, SmartChips, Arraylt, Cásete de hibridización, ScanArray 3000, Software de cuantificación ImaGene y Substratos de microconfiguraciones Super. Third Wave Desarrolla y comercializa Technologies, tecnologías de plataforma Inc de ácidos nucleicos a bajo costo, simples para alterar fundamentalmente el descubrimiento de la enfermedad, diagnóstico y tratamiento. Ensayo Invader° y tecnología CFLP° Tissue Array Estudio de expresión de la proteína y separación por exclusión in situ del ARNm. VBC Genomics Microconfiguraciones de http : //www.vbc- oligonucleótidos genomics . com personalizados y Servicios Genechip Affymetrix. V&P Suministra replicadores que Scientific, elaborarán Inc macroconfiguraciones en las membranas, o microconfiguraciones en 8 placas . Virtek Vision ChipReader™ es un sistema International enfocado en un láser de Inc alta sensibilidad para formar imágenes rápidas de las microconfiguraciones de ADN. Vysis, Inc. Hibridización genómica htt : //www. ysis . com comparativa con CGH; El sistema de microconfiguración GenoSensor incluye microconfiguración genómica, reactivos, instrumentación y software de análisis. Xanthon Desarrolla un sistema de detección electroquímica basada en microplacas multiplexadas para una separación por exclusión de alto rendimiento de compuestos para sus efectos en la expresión del gen. Basado en una medición de la oxidación de guanina en un electrodo. Xenometrix, Ensayo del perfil del gen y Inc . bioinformática para el análisis del perfil de inducción del gen . XENOPORE Corp Fabricante de placas de microscopio revestidas que' incluyen epoxi sililado, silanado, estreptavidina, quelato de níquel y muchas otras superficies .

Tabla XXVI : Configuración de la base de datos y herramientas en línea. Base de Datos Vision global GeneX Una lista amplia con una base de datos de expresión del gen y herramientas de análisis está disponible en el sitio del Genes del NCGR. Grupo Base de datos de la La base de datos de la expresión del gen de expresión del gen de la microconfiguracion (MGED) . microconfiguracion (MGED) se formó para facilitar la adopción de estándares para la anotación de experimentos de configuraciones de ADN y representación de datos, asi como para la introducción de los controles experimentales estándar y los métodos de normalización de los datos. Gene Expression Omnibus La reposición de la expresión (GEO de genes públicos Gene Expresión Omnibus (GEO) de la NCBI, en desarrollo. ArrayDB (htt : //genorae .nhgri .nih.go v/ rraydb/schema . html) en el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NHGRI) ^Array Center Esquema de configuración del Intituto Nacional del Cáncer expréssDB . Laboratorio George Church de la Escuela de Medicina de Harvard: una base de datos relacionada que contienen datos de expresión del ARN de una levadura . MAT Herramienta de Análisis de microconfiguraciones) en el Colegio de Medicina Albert Einstein: basado en Java, JDBC, y Sybase SQL. Esquema publicado por el consorcio GATC . GeneX : Un conjunto de herramientas y Base de datos de internet colaborativos para los datos de expresión del gen en el Centro Nacional para la Investigación del Genoma GenEx™ GenEx™ de Silicon Genetics es una base de datos de la red pública que permite a los científicos distribuir libremente y visualizar los datos de expresión del gen (texto e imagen) a partir de microconfiguraciones , chips de Affymetrix y tecnologías relacionadas. También puede generar dinámicamente diversas gráficas a partir de los datos observados, tales como planos difundidos, árboles, cubiertas, listas de pedido, gráficas de lineas o gráficas en posición física. Esta diseñada para almacenar anotaciones e interpretaciones en los experimentos terminados y puede acceso a los datos a partir de la Base de datos SQL como GATC o incluso a partir de los archivos de texto plano. Base de datos de microconfiguración Stanford (Oracle) Resultados de Resultados de microconfiguraciones de microconfiguraciones de ADNc de aDNc de Arabidopsis. Arabidopsis del (AFGC) Consorcio genómico Funcional de Arabidopsis . ArrayExpress ArrayExpress, se desarrolla en el Instituto de Bioinformática Europeo, que será un depósito de datos de expresión del gen basado en configuraciones públicas. Una asamblea Internacional en la base de datos Microarray Gene Expression, Noviembre 14-15, 1999. MicroArray Explorer El Dr. Peter Lemkin en el NCI (MAExplorer) , desarrolló un Java applet, Explorador MicroArray (MAExplorer) , que se usa comúnmente en el Programa de Anatomía del Genoma Humano. CLUSFAVOR El CLUSFAVOR del Dr. Leif Peterson: Perfiles de expresión del gen basado en microconfiguraciones de muestras grandes de partición usando un Análisis de componentes principales . SAGEmap SAGEmap: Un recurso de la expresión del gen público, Alex E. Lash et al., Genome Res. 2000 July 1; 10(7): p. 1051- 1060 J-Express Programa Java para analizar los datos de microconfiguración. SOM y PCA implementados por Bjarte Dysvik. icroArray Informatics en la EBI Tabla XXVII: Base de datos de microconfiguración en las páginas de la Web Proyecto Nombre Universidad Abberdeen aeFDM Consorcio Affymetrix & Molecular dynamics GATC Colegio de Medicina Albert Einstein MAT Otra base de datos de microconfiguración AMAD (Enero 1, 2000 - vi.01) Ecole Nórmale Supérieure (Base de datos Base de datos LGM privada) Ecole Nórmale Supérieure (Base de datos yMGV pública) Configuraciónexpre Instituto de Bioinformática Europeo ss Laboratorio George Church (Harvard) ExpréssDB Laboratorio Pevsner (Instituto Kennedy Dragón Krieger) Manchester bioinformatics maxd Centro Nacional para la información de la Geo Biotecnología (NCBI) NCI-LECB MAExplorer Instituto de Investigación del Genoma ArrayDB Humano (NIH) Servidor del Centro de Configuraciones del Base de datos Instituto Nacional del Cáncer (NIH-CIT) pArray NIEHS-NIH MAPS Centro de Supercomputo San Diego (SDSC) 2HAPI Silicon Genetics GenEx Stanford SMD Universidad de Pennsylvania RAD Young lab (White head institute-MIT) chipDB EJEMPLO 17 Las anormalidades cromosomales fetales se determinan al analizar los SNP en donde el ADN de plantilla materno es homocigótico y el ADN de plantilla obtenido del plasma es heterocigótico . El plasma que se aisla de la sangre de una mujer embarazada, contiene tanto ADN de plantilla materno como ADN de plantilla fetal. Se puede usar cualquier número de métodos de detección de SNP para analizar el ADN materno y del plasma. En este ejemplo, los SNP se analizan por el sistema de bioensayo CodeLink SNP, que se fabrica en un esfuerzo colaborativo por Motorola y Amersham Biosciences, sin embargo se pueden usar otros microconfiguraciones . Amersham vende la configuración CodeLink P450, que se diseña para formar genotipos en diversas regiones del P450, el cual se localiza en el cromosoma 6. Sin embargo, Amersham puede producir las configuraciones a la medida CodeLink que se pueden diseñar para analizar regiones de cualquier cromosoma incluyendo los cromosomas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X ó Y.

Recolección de las Muestras de Sangre De acuerdo con un estudio aprobado por el IRB, se recolectaron muestras de sangre de mujeres embarazadas después de que se otorgó consentimiento por escrito. La sangre se recolectó en tubos de 9 mi EDTA Vacuette (número de catálogo NC9897284) y 0.225 mi de solución amortiguada neutral al 10% que contiene formaldehído (4% p/v) , se agregan a cada tubo, y cada tubo se invierte suavemente. Los tubos se almacenan a 4°C hasta que están listos para procesarse. Se puede agregar cualquier número de agentes que impidan la lisis celular, que estabilicen las membranas celulares, o reticule las membranas celulares se puede agregar a los tubos que incluye pero no se limita a formaldehído, y derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehído, y derivados de glutaraldehído, reticuladores, reticuladores reactivos de amina primaria, reticuladores reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de bisulfuro, reticuladores reactivos de carbohidratos, reticuladores reactivos de carboxilo, reticuladores fotoreactivos, reticuladores que se dividen, AEDP, APG, BASED, BM(PEO)3, BM(PE0) , BMB, BMDB, BMH, ????, BS3 , BSOCOES, DFDNB, DMA, D P, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, Sulfo-EGS o los compuestos listados en la Tabla XXIII. Se puede agregar cualquier concentración de agente que estabilice las membranas celulares, impida la lisis celular, o reticulen las membranas celulares se puede agregar. En una ' modalidad preferida, el agente que estabiliza las membranas celulares o impide la lisis celular se agrega a una concentración que no impide u obstaculiza las reacciones posteriores. Se puede agregar un agente que estabilice las membranas celulares a la muestra de sangre materna para reducir la lisis celular materna que incluye pero no se limita a aldehidos, urea formaldehído, fenol formaldehído, DMAE (dimetilaminoetanol) , colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol , sacarosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, hopano tetral fenilacetato isómero A, hopano tetral fenilacetato isómero B, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoína, perftoran, polivinilpirrolidona, fosfatidilserina, tegretol, ????, cromglicato de disodio, nedocromil sodio, fenitoí a, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio, o polaxámero 188.

Aislamiento del ADN Se aisla el ADN de la muestra de plasma usando el kit Qiagen Midi para purificación de ADN de células de sangre, siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAmp DNA Blood Midi Kit, Número de catálogo 51183) . Se eluye el ADN en 100 µ? de agua destilada. El kit Qiagen Midi también se usa. para aislar el ADN de las células maternas contenidas en la "capa amarillenta . " Identificación de SNP Maternales Homocigóticos Bioconfiguración SNP CodeLink El CodeLink SNP es una solución de un sistema de bioconfiguración para formación de genotipos SNP de base amplia. El CodeLink SNP involucra un ensayo múltiplex que involucra la amplificación PCR y la fragmentación de amplicones, seguido por discriminación de alelos enzimática basada en la superficie y el etiquetado y detección basado en la configuración. Se suministran los reactivos para la configuración CodeLink en el kit de reactivos P450, que proporciona suficientes reactivos para 24 reacciones. La plataforma CodeLink™ consiste de un porta objetos de vidrio que sea tratado con silanos para generar la cobertura con grupos alquilo de cadena larga ( amakrishnan et al., Nucleic Acids Research, Vol . 30, No. 7, e30, April 1, 2002). Un prepolímero, que contiene un éster activado, de acrilamida se fotoacopla al porta objetos. El éster activado proporciona el sitio de colocación para los C6-amino-oligonucleótidos . Se depositan los oligonucleotidos terminados en 5 'Amina sobre el polímero usando robótica de dosificación. Se suministran los oligonucleotidos con un colorante derivado de fluoresceína que permite la exploración de cada porta objetos después de la dosificación. Para permitir la colocación de oligonucleotidos, se colocan los porta objetos de una cámara humidificada . Se bloquean los sitios adicionales y se lavan, enjuagan y secan los porta objetos previo a la colocación de una cámara de hibridización de polipropileno integrada. Se puede sintetizar una configuración CodeLink a la medida que contenga SNPs localizados en el cromosoma de interés; SNPs localizados en cualquier cromosoma se pueden analizar. En este ejemplo, una configuración CodeLink representativa con dos SNPs localizados en el cromosoma 21 (TSC0271628, TSC0069805) y dos SNPs localizados en el cromosoma 13 (TSC0466917, TSC1172576) se utilizan. Sin embargo, una configuración CodeLink con cualquier número de sondas para los SNPs, que incluye pero no se limitan a, 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91- 100, 101-110, 111-120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190, 191-200, 201-300, 301-400, 401- 500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-2000, 2001-3000, 3001-4000, 4001-5000, 5001-6000, 6001-7000, 7001-8000, 8001-9000, 9001-10,000 y más de 10,000 sondas se puede utilizar. Los SNPs que se usan se pueden localizar en un cromosoma simple, más de un cromosoma, o cualquier combinación de cromosomas. La configuración CodeLink consiste de una sonda de hebra sencilla colocada- a una superficie (esta disponible un diagrama detallado en htt : //ww 5.amershambiosciences . com/APTRIX/upp01077.nsf/Conté nt/codelink__snp) . El nucleótido más alejado de la superficie corresponde al lugar cromosomal de interés. Por ejemplo, SNP TSC09466917, el cual se localiza en el cromosoma 13, puede ser un nucleótido de citosina o un nucleótido de guanina. Se hacen dos tipos de sondas: TAAAAG y TAAAC. Las sondas se colocan con la guanina o citosina más alejada de la superficie. Las sondas pueden ser más largas o más cortas en la secuencia. Los nucleótidos en SNP TS1172576, el cual se localiza en el cromosoma 13, pueden ser timidina o adenina. Se hacen dos sondas: TACCGCATAT (SEQ ID NO: 712) y TACCGCATAA (SEQ ID NO: 713) . Las sondas para los SNPs en la configuración CodeLink pueden ser de la misma longitud o de longitudes diferentes. Los nucleótidos en SNP TSC0271628, el cual se localiza en el cromosoma 21, pueden ser adenina o guanina. Se hacen dos sondas: TTTCCACTCATCCAG y TTTCCACTCATCCAA. Las sondas para los SNP puede ser de la hebra sentido o antisentido del ADN.

Los nucleotidos en SNP TSC0069085, el cual se localiza en el cromosoma 21, pueden ser citosina o timidina. Se hacen dos sondas: TATCTTAATAC y TATCTTAATAT. Las sondas representativas para estos 4 SNPs se proporcionan anteriormente. Sin embargo, las sondas pueden ser más largas o más cortas en la secuencia y se pueden hacer para la hebra sentido o antisentido del ADN. Además, más de una sonda para cada SNP se puede usar. Se pueden usar sondas múltiples con secuencias diferentes o las mismas secuencias para el mismo SNP. Por ejemplo, una sonda para SNP TSC0069085 puede ser de 10 nucleotidos de longitud y otra sonda para SNP TSC0069085 puede ser de 20 nucleótidos de longitud. Alternativamente, una sonda para SNP TSC0069085 puede ser para la hebra sentido y una segunda sonda para SNP TSC0069085 puede ser para la hebra antisentido.

Amplificación PCR Una vez que se diseña la configuración CodeLink, el siguiente paso es la amplificación. Se puede usar cualquier método de amplificación, preferiblemente PCR. Se diseñan los cebadores para amplificar dos SNPs sobre el cromosoma 13 y dos SNPs localizados en el cromosoma 21 usando la información proporcionada en el consorcio SNP (http://snp.cshl.org). El técnico experimentado entenderá como diseñar los cebadores para cualquier otro SNP de interés .

SNP TSC0466917 (C/G) , el cual se localiza en el cromosoma 13, se amplifica usando los siguientes cebadores: Cebador en dirección ascendente: 5' CCAGCTGGTAGAACTT 3' Cebador en la dirección descendente : 5' CCCAATAGACCTATAG 3' SNP TSC1Í72576 (T/A) , el cual se localiza en el cromosoma 13, se amplifica usando los siguientes cebadores: Cebador en dirección ascendente: 5' TAGCAGAATCTCTCAT 3' Cebador en la dirección descendente : 5' AGAGTATCTCATTTGTT 3' SNP TSC0271628 (A/G) , el cual se localiza en el cromosoma 21, se amplifica usando los siguientes cebadores: Cebador en dirección ascendente: 5' AGGAAATTGTGAAGTA 3' Cebador en la dirección descendente: 5' TAACTCACTCACTATC 3' SNP TSC0069085 (C/T) , el cual se localiza en el cromosoma 21, se amplifica usando los siguientes cebadores: Cebador en dirección ascendente : 5' CTGCTGAGTCATAGTC 3' Cebador en la dirección descendente: 5' TGTTCTTTGAATCAAC 3' Las sondas de oligonucleótido pueden ser de cualquier longitud que incluye pero no se limitan a, 5-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-29, 30, 31-35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, y más de 75 bases de longitud. Se deben diseñar las condiciones PCR de acuerdo con la sugerencia del fabricante. Las condiciones representativas de PCR se suministran aquí. Los lugares cromosoraales de interés se amplifican en tubos de reacción por separado, pero también se pueden amplificar juntos en una reacción PCR sencilla. Para una especificidad mejorada, se usa una PCR de "inicio-en caliente" . Las reacciones PCR se llevan a cabo usando el kit HotStarTag Master Mix Kit suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y cebador por reacción se puede optimizar para cada lugar cromosomal de interés, pero en este ejemplo, se usan 40 ng de ADN genómico humano de plantilla y 5 µ? de cada cebador. Se llevan a cabo 40 ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95°C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 95 °C durante 30 segundos; (4) 57 °C durante 30 segundos; (5) 72 °C durante 30 segundos; (6) Repetir etapas 2-5 treinta y dos (32) veces; (7) 72 °C durante 5 minutos.

Purificación y Fragmentación por PCR Los productos PCR se purifican siguiendo procedimientos recomendados por los fabricantes de CodeLink. Se proporciona aquí un modo de purificación PCR. Se separan los productos PCR a partir de los componentes de la reacción PCR usando el kit de purificación Qiagen MinElute PCR siguiendo las instrucciones del fabricante (Número de catálogo 28006) . Los productos purificados PCR se fragmentan siguiendo los procedimientos recomendados por los fabricantes de CodeLink. Los productos PCR se pueden fragmentar usando enzimas que incluyen pero no se limitan a, DNasa o usando fuerzas mecánicas que incluyen pero no se limitan a, sonicación o fragmentación a través de una aguja. Hibridación Los productos de PCR purificados y fragmentados se hibridizan a configuraciones CodeLink siguiendo los procedimientos recomendados por los faricantes de CodeLink. Los procedimientos típicos de hibridación involucran hibridizar la sonda objetivo y el ADN de muestra en una solución que contiene detergentes moderados tales como SDS o Triton-100, sales, tales como MgCl2, y una solución amortiguadora tal como Tris o PBS. La reacción de hibridación se lleva a cabo actualmente con agitación moderada a 25-44°C durante 8-16 horas. Las reacciones de hibridación, se pueden efectuar usando el kit Shaker, disponible de Amersham Biosciences.

Alternativamente, se llevan a cabo las hibridaciones usando la charola de agitación de 12 placas de Motorola que contiene cámaras de hibridación. Los puertos de la cámara de hibridación se sellan con cintas de sello de 1 era (Motorola Life Sciences) y las charolas de agitación que contienen las placas se cargan en el incubador de agitación New Brunswick Innova™ 4080, con las cámaras de hibridización de cara arriba. Se incuban las placas durante 18 horas a 37°C, mientras se agitan a 3000 r.p.m. Pueden haber procedimientos y soluciones específicas para la hibridación con las configuraciones CodeLink. Los representantes en CodeLink no suministrarían los protocolos sin una compra previa de una configuración.

Extensión especifica de alelos Después de la hibridación, se lleva a cabo una reacción de extensión siguiendo los procedimientos recomendados por los fabricantes de CodeLink. Una reacción típica de extensión requiere la presencia de los nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , una polimerasa y una solución amortiguada que contiene las sales. La concentración de los nucleótidos y la polimerasa que se usa debe ser como se recomienda por los fabricantes de CodeLink. Se puede usar cualquier polimerasa de ADN que incluyen pero no se limitan a la polimerasa de ADN de E. coli, el fragmentos klenow de la polimerasa I de ADN de E. coli, polimerasa de ADN T7 , polimerasa de ADN T4 , polimerasa de ADN T5, polimerasa de la clase Klenow, polimerasa Taq, polimerasa de ADN Pfu, polimerasa Vent, bacteriófago 29, polimerasa de ADN genómico REDTaq™ o secuenasa. Preferiblemente, la polimerasa que se usa es la que se recomienda por los fabricantes de CodeLink.

Lavado, etiquetado y detección Después de la reacción de extensión, se lavan las configuraciones, preferiblemente con la solución recomendada por los fabricantes de CodeLink. Una solución típica de lavado contiene detergentes y sales en una solución amortiguada. Por ejemplo, las configuraciones se pueden lavar con una solución amortiguada de TNT (0.1 M Tris-HCl, pH 7.6, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20. Las configuraciones se lavan a una temperatura recomentada por los fabricantes de CodeLink que incluye pero no se limita a temperatura ambiente 10-16°C, 17-24°C, 25°C, 26-36°C, 37°C, 38-41°C, 42°C, 43-54°C, 55°C, o mayor de 55°C. La señal se desarrolla siguiendo el protocolo recomendado por los fabricantes de CodeLink. Se proporciona aquí un protocolo representativo. La señal se desarrolla utilizando una dilución de 1:500 de una estreptavidina-Alexa 647 (Molecular Probes) , durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se retira el colorante en exceso por lavado 4 veces con solución amortiguadora TNT, durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente. Se puede incrementar la intensidad de la señal al usar una dilución 1:200 de tiramida-cy3 en una solución amortiguadora de un diluyente de amplificación (PE/NEN) . Se enjuagan las placas con agua desionizada y se secan usando una pistola de nitrógeno. Las placas procesadas se exploran usando el scanner Axon GenePix con un ajuste de láser a 635 nra, el voltaje del tubo fotomultiplicador a 600 y la resolución de exploración a 10µ. Se exploran y analizan las placas usando un kit CodeLink™ SNP Software, que esta disponible de Amersham Biosciences. Se forma el genotipo de cada SNP. Los SNP se localizan en cromosomas 13 y 21, en donde el ADN materno es homocigótico, se analizan con el ADN aislado del plasma.

Análisis del ADN aislado del plasma materno Después de que se analiza el ADN materno y se identifican los SNP homocigóticos , estos SNP se analizan con el ADN aislado del plasma. Un número de bajas copias de genomas fetales está típicamente presente en el plasma materno. Para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, que son los SNP a los cuales el ADN materno es homocigótico, los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases a aproximadamente 130 bases en dirección ascendente y 130 bases en dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés . Esto se hace para reducir el error de muestreo estadístico que puede suceder cuando se trabaj a con un número baj o de genomas , que pueden tener influencia en la relación de un alelo al otro (ver Ejemplo 11) .

Diseño de Cebadores Multiplex Los cebadores tienen 12 bases de longitud. Sin embargo, se pueden usar cebadores de cualquier longitud que incluye pero no se limita a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76-85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125, y más de 125 bases. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases tanto a la hebra sentido como a la hebra antisentido. Los SNP homocigóticos maternos varían de muestra a muestra de manera que no se proporcionan aquí secuencias definidas. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases alrededor de 130 bases en dirección ascendente y descendente de los SNP homocigóticos maternos. Los cebadores se diseñan para finalizar en la terminación 3' en el dinucleótido "??" para reducir la formación de dimeros del cebador. Sin embargo, se pueden diseñar los cebadores para terminar en cualquiera de los cuatro nucleótidos y en cualquier combinación, de los cuatro nucleótidos.

PCR ultiplex Las regiones en la dirección ascendente y en la dirección descendente de los SNP homocigó'ticos maternos se amplifican a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, Patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas en la presente como referencia) . Esta reacción PCR utiliza cebadores que se combinan en sus pares de bases aproximadamente 130 bases en la dirección ascendente y en la dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés. Se mezclan juntos los cebadores y se usan en una reacción sencilla para amplificar el ADN de plantilla. Esta reacción se hace para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, lo cual elimina el error generado a partir de un número bajo de genomas. Para una especificidad mejorada, se utiliza una reacción PCR de "inicio en caliente" . Las reacciones PCR se llevan a cabo usando el kit HotStarTaq Master Mix Kit suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y cebador por reacción se optimiza para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, se usan 20 µ? de ADN de plantilla de plasma. Dos microlitros de cada cebador delantero y reverso, a concentraciones de 5 mM, se acumulan y mezclan en un tubo microcentrífugo sencillo. Se usan cuatro microlitros de la mezcla del cebador en un volumen total de reacción PCR de 50 µ? (20µ1 de ADN de plantilla de plasma, 1 µ? de agua estéril, 4 µ? de mezcla de cebador, y 25 µ? de HotStar Taq. Se llevaron a cabo veinticinco ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95°C durante 15 minutos; (2) 95°C durante 30 segundos; (3) 4°C durante 30 segundos; (4) 37°C durante 30 segundos; (5) Repetir etapas 2-4 veinticuatro (24) veces; (6) 72 °C durante 10 minutos. Las temperaturas y los tiempos para desnaturalización, combinación de pares de bases, y extensión, se optimizan al tratar diversos parámetros y usando los parámetros que producen los mejores resultados. También se pueden usar otros métodos de amplificación genómica para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés que incluye pero no' se limita a preamplificación de la extensión del cebador (PEP) (Zhang et al., PNAS, 89:5847-51, 1992), PCR cebada con oligonucleótido degenerado (DOP-PCR) (Telenius, et al., Genomics 13:718-25, 1992) , amplificación por desplazamiento de hebras al usar la polimerasa del ADN del bacteriófago 29, la cual se somete a una replicación en círculo rodante (Dean et al., Genomic Research 11:1095-99, 2001), amplificación de desplazamiento múltiple (Patente de E.U.A. 6,124,120), REPLI-g™ Kits de amplificación completa de genoma, y PCR etiquetada. Es importante asegurar que la región amplificada (hecha para incrementar el número de copias de los lugares cromosomales fetales de interés) contiene secuencias de combinación de pares base para los cebadores que se usan con el ensayo CodeLink. Al adquirir la configuración CodeLink, cada SNP y los cebadores usado para amplificar cada SNP se pueden identificar. Con este conocimiento, se diseñan los cebadores multiplex para abarcar regiones de combinación de pares de bases para los cebadores en la configuración HuSNP. Purificación del Fragmento de Interés Se retiran de la reacción los cebadores sin usar y los nucleótidos al usar Kits de purificación Qiagen MinElute PCR (Qiagen, Número de catálogo 28004) . Las reacciones se llevan a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante suministradas con las columnas. Se eluye el ADN en 100 µ? de agua estéril. 5 µ? de cada lugar cromosomal amplificado, se mezclan juntos Ensayo CodeLink, lavado, tinción y exploración Se ensaya el ADN acumulado con la configuración CodeLink como se describió anteriormente. El lavado, tinción y los procedimientos de exploración son como se describieron anteriormente . Se forma el genotipo de cada SNP. Los SNP se localizan en cromosomas 13 y 21, en donde el ADN materno es homocigótico, y Se cuantifica el ADN aislado del plasma que es heterocigótico .

Cuantificación La intensidad de la señal para cada alelo en un heterocigoto se cuantifica el SNP. Como se discutió anteriormente, la relación esperada del alelo 1 al alelo 2 se puede usar para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal . Si el genoma materno es homocigótico en SNP X (A/A) , y el ADN de plasma es heterocigótico en SNP X (A/G) , entonces el G representa la señal fetal diferente. La relación de G:A depende del porcentaje de ADN fetal presente en la sangre materna. Por ejemplo, si la muestra contiene ADN fetal al 50%, entonces la relación esperada es 0.33 (1 alelo fetal G/ (2 alelos maternos A + 1 alelo fetal A) ) . Esta relación debe ser constante para todos los cromosomas que están presentes en dos copias . La relación que se obtiene para los SNP en el cromosoma 13 debe ser la misma que la relación que se obtiene para el cromosoma 21. Sin embargo, si el genoma fetal contiene una copia adicional del cromosoma 21, entonces la relación para este cromosoma se desviará de la relación esperada. La relación esperada para una condición de Trisomía con ADN fetal al 50% en la sangre materna es 0.25. Así, al analizar los SNP en donde el genoma materno es homocigótico, y el ADN que se aisla del plasma es heterocigótico, se pueden detectar las anormalidades cromosomales del feto . Este ejemplo explica el uso de ensayos CodeLink, pero no pretende limitar el uso de las configuraciones. Se puede usar cualquier configuración de ADN que incluye pero no se limita configuraciones del ADN enlistado en la tabla XXIII, o configuraciones de ADN disponibles a partir de cualquiera de las empresas listadas en la tabla XXIV.

EJEMPLO 18 Las anormalidades cromosomales fetales se determinan al analizar los SNP en donde el ADN de plantilla materno es homocigótico y el ADN de plantilla obtenido del plasma es heterocigótico. El plasma que se aisla de la sangre de una mujer embarazada, contiene tanto ADN de plantilla materno como ADN de plantilla fetal. Se puede usar cualquier número de métodos de detección de SNP para analizar el ADN materno y del plasma. En este ejemplo, se analizan los SNP usando la plataforma de IIlumina BeadArray™, disponible de IIlumina en San Diego, CA.

Recolección de las Muestras de Sangre De acuerdo con un estudio aprobado por el IRB, se recolectaron muestras de sangre de mujeres embarazadas después de que se otorgó consentimiento por escrito. La sangre se recolectó en tubos de 9 mi EDTA Vacuette (número de catálogo NC9897284) y 0.225 mi de solución amortiguada neutral al 10% que contiene formaldehído (4% p/v) , se agregan a cada tubo, y cada tubo se invierte suavemente. Los tubos se almacenan a 4°C hasta que están listos para procesarse. Se puede agregar cualquier número de agentes que impidan la lisis celular o estabilicen las membranas celulares a los tubos, que incluyen pero no se limitan a formaldehído, y derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehído , y derivados de glutaraldehído, reticuladores , reticuladores reactivos de amina primaria, reticuladores reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de bisulfuro, reticuladores reactivos de carbohidratos, reticuladores reactivos de carboxilo, reticuladores fotoreactivos , reticuladores que se dividen, AEDP, APG, BASED, BM(PE0)3, BM(PE0)4, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BS3 , BSOCOES , DFDNB, DMA, DMP, DMS , DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS , HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, Sulfo-EGS o los compuestos listados en la Tabla XXIII. Cualquier concentración de agente que estabilice las membranas celulares o impida la lisis celular se puede agregar. En una modalidad preferida, el agente que estabiliza las membranas celulares o impide la lisis celular se agrega a una concentración que no impide u obstaculiza las reacciones posteriores. Se puede agregar un agente que estabilice las membranas celulares a la muestra de sangre materna para reducir la lisis celular materna que incluye pero no se limita a aldehidos, urea formaldehído, fenol formaldehido , DMAE (dimetilaminoetanol) , colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol, sacarosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, hopano tetral fenilacetato isómero A, hopano tetral fenilacetato isómero B, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoína, perftoran, polivinilpirrolidona, fosfatidilserina, tegretol, PABA, cromglicato de disodio, nedocromil sodio, fenitoína, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio, o polaxámero 188.

Aislamiento del ADN Se aisla el ADN de la muestra de plasma usando el kit Qiagen Midi para purificación de ADN de células de sangre, siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAmp DNA Blood Midi Kit, Número de catálogo 51183) . Se eluye el ADN en 100 µ? de agua destilada. El kit Qiagen Midi también se usa para aislar el ADN de las células maternas contenidas en la "capa amarillenta." Identificación de SNP Maternales Homocigóticos La tecnología de Illumina BeadArray™ consiste de un sistema de configuración basado en fibra óptica que se discute que permite un análisis genético completo muy elevado, miniaturizado . La configuración de 96 haces Sentrix Array™ de Illumina permite supuestamente el procesamiento paralelo de casi 150,000 SNPs . Los haces de fibras se fabrican para contener cerca de 50,000 hebras de fibra transmisoras de luz individuales. Cada as de fibra se convierte en una configuración al grabar primero químicamente un pozo microscópico al final de cada hebra de fibra dentro de un haz, lo cual crea hasta 50,000 pozos discretos microscópicos por haz. En un proceso por separado, se crean sensores al fijar un tipo específico de molécula a las perlas, cada perla tiene aproximadamente 3 mieras de diámetro. Para el análisis SNP, se coloca una secuencia particular de ADN a cada perla en un lote. Illumina establece que cientos de miles de moléculas del mismo tipo recubren a cada perla. Se combinan los lotes de perlas recubiertas para formar un acumulado específico para el tipo de configuración deseado. Para el análisis SNP, el acumulado de configuración supuestamente utiliza secuencias de ADN que no hacen una hibridación cruzada consigo mismas o con el ADN genómico conocido. A continuación, se crea una configuración autoensamblada . Al sumergir los haces en un acumulado de perlas premezclado, las perlas recubiertas se autoensamblan individualmente. Una perla por pozo, en el extremo de cada fibra en el as para crear la configuración. En la configuración formadora de genotipos SNP de Illumina, el acumulado de perlas consiste de hasta 1500 secuencias, las cuales se autoens mbl n en cada as de 50,000 fibras para crear una configuración con una redundancia de aproximadamente 30 veces. Los haces BeadArray se ensamblan en un dispositivo en forma de matriz que se denomina la configuración de la plataforma Arrays™, en donde cada haz de fibra de la configuración más grande coincide con un pozo de una placa de microtitulación estandarizada. Después del ensamble de la codificación, se utiliza un procedimiento de descodificación para determinar el tipo de perla que reside en cada núcleo de la fibra. Las moléculas de ADN se sintetizan utilizando la tecnología de síntesis de ADN a la medida Oligator™. El servicio de genotipos SNP de Illumina usando la tecnología BeadArray y otras tecnologías que han resultado de la tecnología BeadArray, se proporcionan en las instalaciones de Illumina o en las instalaciones que hayan recibido una licencia para la tecnología BeadArray. Se analizan las muestras del ADN materno utilizando BeadArrays que contienen sondas de oligonucleotidos para los SNPs. Las sondas de oligonucleotidos pueden ser para los SNPs localizados en cualquier cromosoma que incluye el cromosoma humano 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, y Y. Las BeadArrays se analizan para identificar los SNP, en donde el ADN de' plantilla materno es homocigótico . Los SNP identificados omocigóticos luego se analizan usando el ADN aislado del plasma materno.

Análisis del ADN aislado del plasma materno Después de que se analiza el ADN materno y se identifican los SNP .«homocigóticos, estos SNP se analizan con el ADN aislado del plasma. Un número de bajas copias de genomas fetales existe típicamente en el plasma materno. Para incrementar el número de—copias del lugar cromosomal de interés, que son los SNP a los cuales el ADN materno es homocigótico, los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases a aproximadamente 130 bases en dirección ascendente y 130 bases en dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés . Esto se hace para reducir el error de muestreo estadístico que puede suceder cuando se trabaja con un número bajo de genomas, que pueden tener influencia en la relación de un alelo al otro (ver Ejemplo 11) .

Diseño de Cebadores ultiplex Los cebadores tienen 12 bases de longitud. Sin embargo, se pueden usar cebadores de cualquier longitud que incluye pero no se limita a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18~Í.19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76- 85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125, y más de 125 bases. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases tanto a la hebra sentido como a la hebra antisentido. Los SNP homocigóticos maternos varían de muestra a muestra de manera que no se proporcionan aquí secuencias definidas. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases alrededor de 130 bases en dirección ascendente y descendente de los SNP homocigóticos maternos. Los cebadores se diseñan para finalizar en la terminación 3' en el dinucleótido "AA" para reducir la formación de dímeros del cebador. Sin embargo, se pueden diseñar los cebadores para terminar en cualquiera de los cuatro nucleotidos y en cualquier combinación de los cuatro nucleotidos.

PCR Multiplex Las regiones en la dirección ascendente y en la dirección descendente de los SNP homocigóticos maternos se amplifican a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, Patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas en la presente como referencia) . Esta reacción PCR utiliza cebadores que se combinan en sus pares de bases aproximadamente 130 bases en la dirección ascendente y en la dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés. Se mezclan juntos los cebadores y se usan en una reacción sencilla para amplificar el ADN de plantilla. Esta reacción se hace para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, lo cual elimina el error generado a partir de un número bajo de genomas. Para una especificidad mejorada, se utiliza una reacción PCR de "inicio en caliente" . Las reacciones PCR se llevan a cabo usando el kit HotStarTag Master Mix it suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y cebador por reacción se optimiza para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, se usan los 20 µ? de ADN de plantilla de plasma. Dos microlitros de cada cebador delantero y reverso, a concentraciones de 5 mM, se acumulan y mezclan en un tubo microcentrífugo sencillo. Se usan cuatro microlitros de la mezcla del cebador en un volumen total de reacción PCR de 50 µ? (20µ1 de ADN de plantilla de plasma, 1 µ? de agua estéril, 4 µ? de mezcla de cebador, y 25 µ? de HotStar Taq. Se llevaron a cabo veinticinco ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95 °C durante 15 minutos; (2) 95 °C durante 30 segundos; (3) 4°C durante 30 segundos; (4) 37 °C durante 30 segundos; (5) Repetir etapas 2-4 veinticuatro (24) veces; (6) 72 °C durante 10 minutos. Las temperaturas y los tiempos para desnaturalización, combinación de pares de bases, y extensión, se optimizan al tratar diversos parámetros y usando los parámetros que producen los mejores resultados. También se pueden usar otros métodos de amplificación genómica para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés que incluye pero no se limita a preamplificación de la extensión del cebador (PEP) (Zhang et al., PNAS, 89:5847-51, 1992), PCR cebada con oligonucleótido degenerado (DOP-PCR) (Telenius, et al., Genomics 13:718-25, 1992) , amplificación por desplazamiento de hebras al usar la polimerasa del ADN del bacteriófago 29, la cual se somete a una replicación en círculo rodante (Dean et al., Genomic Research 11:1095-99, 2001), amplificación de despl zamiento múltiple (Patente de E.U.A. 6,124,120), REPLI-g™ Kits de amplificación completa de genoma, y PCR etiquetada. Es importante asegurar que la región amplificada contenga secuencias de combinación de pares de bases para las sondas de oligonucleótidos en el BeadArray. Al adquirir el servicio BeadArray, se identifican cada SNP y los cebadores usados para analizar cada SNP.. Con este conocimiento, se diseñan los cebadores multiplex para abarcar regiones de combinación de pares de bases para los cebadores en el BeadArra .

Purificación del Fragmento de Interés Se retiran de la reacción los cebadores sin usar y los nucleótidos al usar its de purificación Qiagen MinElute PCR (Qiagen, Número de catálogo 28004) . Las reacciones se llevan a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante suministradas con las columnas. Se eluye el ADN en 100 µ? de agua estéril. 5 µ? de " cada lugar cromosomal amplificado, se mezclan juntos.

Tecnología BeadArray Se ensaya el ADN acumulado con el BeadArray como se describió anteriormente. Se forma el genotipo de cada SNP. Los SNP se localizan en cromosomas 13 y 21, en donde el ADN materno es omocigótico, y se cuantifica el ADN aislado del plasma que es heterocigótico . Cuantificación La intensidad de la señal para cada alelo en un heterocigoto se cuantifica el SNP. Como se discutió anteriormente, la relación esperada del alelo 1 al alelo 2 se puede usar para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal. Si el genoma materno es homocigótico en SNP X (A/A) , y el ADN de plasma es heterocigótico en SNP X (A/G) , entonces el G representa la señal fetal diferente. La relación de G:A depende del porcentaje de ADN fetal presente en la sangre materna. Por ejemplo, si la muestra contiene ADN fetal al 50%, entonces la relación esperada es 0.33 (1 alelo fetal G/ (2 alelos maternos A + 1 alelo fetal A) ) . Esta relación debe ser constante para todos los cromosomas que están presentes en dos copias. La relación que se obtiene para los SNP en el cromosoma 13 debe ser la misma que la relación que se obtiene para el cromosoma 21. Sin embargo, si el genoma fetal contiene una copia adicional del cromosoma 21, entonces la relación para este cromosoma se desviará de la relación esperada. La relación esperada para una condición de Trisomía con ADN fetal al 50% en la sangre materna es 0.25. Así, al analizar los SNP en donde el genoma materno es homocigótico, y el ADN que se aisla del plasma es heterocigótico, se pueden detectar las anormalidades cromosomales del feto. Este ejemplo explica el uso de la tecnología BeadArray de Illumina pero no pretende limitar el uso de las configuraciones. Se puede usar cualquier configuración de ADN que incluye pero no se limita a las configuraciones de ADN enlistados en la tabla XXIII, o configuraciones de ADN disponibles de cualquiera de las empresas enlistadas en la tabla XXIV.

EJEMPLO 19 Las anormalidades cromosomales fetales se determinan al analizar los SNP en donde el ADN de plantilla materno es homocigótico y el ADN de plantilla obtenido del plasma es heterocigótico . El plasma que se aisla de la sangre de una mujer embarazada, contiene tanto ADN de plantilla materno como ADN de plantilla fetal . Se puede usar cualquier número de métodos de detección de SNP para analizar el ADN materno y del plasma. En este ejemplo, se analizan los SNP usando el sistema MassArray™ de Sequenom, que utiliza el método homogéneo de Sequenom assCleave™ (hMC) .

Recolección de las Muestras de Sangre De acuerdo con un estudio aprobado por el IRB, se recolectaron muestras de sangre de mujeres embarazadas después de que se otorgó consentimiento por escrito. La sangre se recolectó en tubos de 9 mi EDTA Vacuette (número de catálogo NC9897284) y 0.225 mi de solución amortiguada neutral al 10% que contiene formaldehído (4% p/v) , se agregan a cada tubo, y cada tubo se invierte suavemente. Los tubos se almacenan a 4°C hasta que están listos para procesarse. Se puede agregar cualquier número de agentes que impidan la lisis celular o estabilicen las membranas celulares a los tubos que incluye pero no se limita a formaldehído, y derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehído, y derivados de glutaraldehído, reticuladores , reticuladores reactivos de amina primaria, reticuladores reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de bisulfuro, reticuladores reactivos de carbohidratos, reticuladores reactivos de carboxilo, reticuladores fotoreactivos , reticuladores que se dividen, AEDP, APG, BASED, BM(PEO)3/ BM(PEO)4, B B, B DB, BMH, BMOE, BS3 , BSOCOES, DPDNB, DMA, DMP, DMS, DPDPB , DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, Sulfo-EGS o los compuestos listados en la Tabla XXIII. Cualquier concentración de agente que estabilice las membranas celulares o impida la lisis celular se puede agregar. En una modalidad preferida, el agente que estabiliza las membranas celulares o impide la lisis celular se agrega a una concentración que no impide u obstaculiza las reacciones posteriores. Se puede agregar un agente que estabilice las membranas celulares a la muestra de sangre materna para reducir la lisis celular materna que incluye pero no se limita a aldehidos, urea formaldehído, fenol formaldehído, DMAE (dimetilaminoetanol) , colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol, sacarosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, hopano tetral fenilacetato isómero A, hopano tetral fenilacetato isómero B, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoína, perftoran, polivinilpirrolidona, fosf tidilserina, tegretol, PABA, cromglicato de disodio, nedocrorail sodio, fenito na, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio, o polaxámero 188.

Aislamiento del ADN Se aisla el ADN de la muestra de plasma usando el kit Qiagen Midi para purificación de ADN de células de sangre, siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAmp DNA Blood Midi Kit, Número de catálogo 51183) . Se eluye el ADN en 100 µ? de agua destilada. El kit Qiagen Midi también se usa para aislar el ADN de las células maternas contenidas en la "capa amarillenta." Identificación de SNP Maternales Homocigóticos Método direccionado de descubrimiento de SNP : hMC El método hMC de Seguenom usa un desdoblamiento específico de la base de nucleótidos para la formación de genotipos. Se miden los fragmentos desdoblados usando MALDI-TOF para generar una señal de tipo característica con base en la masa de cada fragmento para cualquier secuencia particular.

Diseño de cebadores Se necesitan cuatro cebadores para las dos reacciones PC (una reacción delantera y una reacción inversa) . El tamaño de intervalo recomendado para los amlicones PCR es 300-700 pares de base. Los cebadores contienen un promotor T-7 etiquetado hacia adelante o un cebador inverso para obtener un producto adecuado para la transcripción in vitro. Se incluye un inserto de 8 bases para evitar una formación de ciclos abortiva. El cebador que carece del promotor T-7 contiene una etiqueta de 10 -mero con objeto de valancear los cebadores. Los cebadores para un SNP se proporcionan a continuación. SNP TSC1172576 (T/A) , el cual se localiza en el cromosoma 13, se amplifica usando los siguientes cebadores para la siguiente reacción: Reacción delantera : Cebador en dirección ascendente : 5 ' CAGTAATACGACTCACTATAGGGGTCAGGATTAGCAGAATCTCTCAT 3 ' Cebador en la dirección descendente: 5' GCATTCTATGAGAGTATCTCATTTGTT 3' Reacción inversa: Cebador en dirección ascendente 5' CAGTAATACGACTCACTATAGGGGTCAGGAAGAGTATCTCATTTGTT 3 ' Cebador en la dirección descendente 5' GCATTCTATGTAGCAGAATCTCTCAT 3' La secuencia del promotor T-7 está en itálicas, el inserto de 8 bases se subraya, la secuencia de balance de 10 bases tiene un doble subrayado y están sin modificar las secuencias específicas de genes.

Amplificación PCR Se amplifican 5 nanogramos de ADN en un volumen de 5 µ? usando un formato de 384 microtitulación . Se usaron las siguientes condiciones PCR: 1) 94°C durante 15 minutos; 2) 94°C durante 20 segundos ; 3) 62°C durante 30 segundos; 4) 72°C durante 1 minuto; 5) Repetir etapas 2-4 44 veces; y 6) 72°C durante 3 minutos.

Desfosforilación Se agrega fosfatasa alcalina de camarón (SAP) (2 µ?) a cada reacción PCR de 5 µ? para desfosforilar los dNTPs desincorporados a partir de la reacción PCR. Se incuban las placas a 37°C durante 20 minutos. Luego se incuban las placas a 85°C durante 5 minutos.

Transcripción In Vitro Para cada reacción de transcripción, se necesitan 2 µ? de cóctel de transcripción y 2 µ? de muestra PCR/SAP. Agregar 2 µ? del cóctel de transcripción y 2 µ? de la muestra a PCR/SAP a una nueva placa de microtitulación. Las placas se incuban a 37°C durante 2 horas. Para información detallada referente a estos protocolos ver el capítulo "Processing homogeneous MassCLEAVE Reactions" en la guía del usuario de descubrimiento de SNP del manejador de líquidos MassARRAY para instrucciones, que está completamente incorporada en la presente como referencia.

Desdoblamiento de R Asa A Se agrega un cóctel de RNasa (2.5 µ?) a cada reacción (desdoblamiento T y desdoblamiento C) . Se incuban las placas a 37°C durante 1 hora. Dependiendo del nucleótido en el sitio SNP, se generan diversos fragmentos de diferentes pesos. Por ejemplo, 1 secuencia de ADN que rodea a SNP TSC1172576, el cual s localiza en el cromosoma 13, es como sigue: 5' CCGCATA T/A CTCAGCACA 3' 3 ' GGCGTAT A/T GAGTCGTGT 5' Después de PC , la transcripción in vitro y e desdoblamiento especifico de bases, se generan los siguiente, fragmentos para cada alelo: Para los fragmentos ATC y AAC, la diferencia en peso entre T y A se usa para determinar el genotipo en SNP TSC1172576. Similarmente, la diferencia en peso entre T y A en los fragmentos AGTTA y AGATA se usa para determinar el genotipo en SNP TSC1172576.

Acondicionamiento de la muestra Se agrega agua de doble destilación (20 µ?) a cada muestra dentro de la placa de 384 pozos. Se agrega a cada pozo resina limpia (G mg) . La placa se hace girar durante 9 minutos seguido por una centrifugación a 3200 X g. se recomienda que el agua siempre se agregue antes de Clean Resin.

Transferencia de muestras El producto de reacción hMC (10-15µ1) se dosifica en un SpectroCHIP® de 384 elementos. Para información adicional ver el capítulo "Dispensing MassCLEAVE Reaction Products onto SpectroCHIPs" en la guía del usuario del descubrimiento de SNP del nanodosificador MassARRAY para instrucciones.

Análisis de muestras Se adquieren los espectros de las cuatros reacciones de dsdoblamiento usando el sistema MassARRAY™. Para instrucciones adicionales, ver el capítulo "adquisición de espectro" en la guía del usuario del software RT de descubrimiento MassARRAY para instrucciones sobre la adquisición de espectros a partir de SpectroCHIPS®.

Análisis SNP Se analizan los resultados usando el software de análisis de descubrimiento SNP. Para instrucciones adicionales, ver el capítulo "análisis SNP" en la guía del usuario de software RT de descubrimiento MassARRAY para instrucciones sobre el uso del software de análisis de descubrimiento de SNP. Los componentes que son útiles para el procedimiento assARRAY incluyen el analizador MassARRAY™ (número de parte 004500), la versión 1.2 del software de descubrimiento MassARRAY™ (número de parte 11434) , el kit de inicio de descubrimiento de SNP MassARRAY™ (número de parte 10027) , y los métodos y macros de descubrimiento del SNP para manejo de líquidos (número de parte 11433) . La configuración de espectro CHIP se usa para configurar genotipos del ADN materno que siguen los protocolos y procedimientos recomendados del fabricante, que están disponibles después de aquisición de la configuración espectroCHIP . Los SNP a los cuales es homocigótico el ADN materno se usan para analizar el ADN aislado del plasma materno .

Análisis del ADN aislado del plasma materno Después de que se analiza el ADN materno y se identifican los SNP homocigóticos, estos SNP se analizan con el ADN aislado del plasma. Un número de bajas copias de genomas fetales existe típicamente en el plasma materno. Para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, que son los SNP a los cuales el ADN materno es homocigótico, los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases a aproximadamente 130 bases en dirección ascendente y 130 bases en dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés . Esto se hace para reducir el error de muestreo estadístico que puede suceder cuando se trabaja con un número bajo de genomas, que pueden tener influencia en la relación de un alelo al otro (ver Ejemplo 11) .

Diseño de Cebadores ultiplex Los' cebadores tienen 12 bases de longitud. Sin embargo, se pueden usar cebadores de cualquier longitud que incluye pero no se limita a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76-85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125, y más de 125 bases. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases tanto a la hebra sentido como a la hebra antisentido. Los SNP homocigóticos maternos varían de muestra a muestra de manera que no se proporcionan aquí secuencias definidas. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases alrededor de 130 bases en dirección ascendente y descendente de los SNP homocigóticos maternos . Los cebadores se diseñan para finalizar en la terminación 3' en el dinucleótido ,??" para reducir la formación de dímeros del cebador. Sin embargo, se pueden diseñar los cebadores para terminar en cualquiera de los cuatro nucleótidos y en cualquier combinación de los cuatro nucleótidos. PCR Multiplex Las regiones en la dirección ascendente y en la dirección descendente de los SNP homocigóticos maternos se amplifican a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción en cadena de polimerasa (PC , Patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas en la presente como referencia) . Esta reacción PCR utiliza cebadores que se combinan en sus pares de bases aproximadamente 130 bases en la dirección ascendente y en la dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés. Se mezclan juntos los cebadores y se usan en una reacción sencilla para amplificar el ADN de plantilla. Esta reacción se hace para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, lo cual elimina el error generado a partir de un número bajo de genomas. Para una especificidad mejorada, se utiliza una reacción PCR de "inicio en caliente" . Las reacciones PCR se llevan a cabo usando el kit HotStarTag aster Mix Kit suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y cebador por reacción se optimiza para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, se usan los 20 µ? de ADN de plantilla de plasma. Dos microlitros de cada cebador delantero y reverso, a concentraciones de 5 mM, se acumulan y mezclan en un tubo microcentrífugo sencillo. Se usan cuatro microlitros de la mezcla del cebador en un volumen total de reacción PCR de 50 µ? (20µ1 de ADN de plantilla de plasma, 1 µ? de agua estéril, 4 µ? de mezcla de cebador, y 25 µ? de HotStar Taq. Se llevaron a cabo veinticinco ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95 °C durante 15 minutos; (2) 95 °C durante 30 segundos; (3) 4°C durante 30 segundos; (4) 37 °C durante 30 segundos; (5) Repetir etapas 2-4 veinticuatro (24) veces; (6) 72 °C durante 10 minutos. Las temperaturas y los tiempos para desnaturalización, combinación de pares de bases, y extensión, se optimizan al tratar diversos parámetros y usando los parámetros que producen los mejores resultados. También se pueden usar otros métodos de amplificación genómica para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés que incluye pero no se limita a preamplificación de la extensión del cebador (PEP) (Zhang et al., PNAS, 89:5847-51, 1992), PCR cebada con oligonucleótido degenerado (DOP-PCR) (Telenius, et al., Genomics 13:718-25, 1992) , amplificación por desplazamiento de hebras al usar la polimerasa del ADN del bacteriófago 29, la cual se somete a una replicación en circulo rodante (Dean et al., Genomic Research 11:1095-99, 2001), amplificación de desplazamiento múltiple (Patente de E.U.A. 6,124,120), REPLI-g™ its de amplificación completa de genoma, y PCR etiquetada.

Es importante asegurar que la región amplificada contenga secuencias de combinación de pares de bases para los cebadores PCR en el método hMC de descubrimiento SNP dirigido .

Purificación del Fragmento de Interés Se retiran de la reacción los cebadores sin usar y los nucleótidos al usar Kits de purificación Qiagen MinElute PCR (Qiagen, Número de catálogo 28004) . Las reacciones se llevan a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante suministradas con las columnas. Se eluye el ADN en 100 µ? de agua estéril. 5 µ? de cada lugar cromosomal amplificado, se mezclan juntos Descubrimiento SNP dirigido : Método hMC Se ensaya el ADN acumulado con el método hMC como se describió anteriormente. Se forma el genotipo de cada SNP. Los SNP se localizan en cromosomas 13 y 21, en donde el ADN materno es homocigótico, y se cuantifica el ADN aislado del plasma que es heterocigótico . Sin embargo, también se pueden cuantificar si se desean los SNP localizados en otros cromosomas .

Cuantificación La intensidad de cada pico, en donde cada pico corresponde a un fragmento de ADN con un peso molecular especifico se cuantifica. Como se discutió an eriormente, la relación esperada del alelo 1 al alelo 2 se usa para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal . Si el genoma materno es homocigótico en SNP X (A/A) , y el ADN de plasma es heterocigótico en SNP X (A/G) , entonces el G representa la señal fetal diferente. Habrán algunos fragmentos que difieran en lo molecular, debido a la presencia del nucleótido G en SNP-X en el genoma fetal. Se cuantifica la intensidad del pico con el nucleótido A y se cuantifica la intensidad del pico que corresponde a los fragmentos con el nucleótido G. La relación de G:A depende del porcentaje de ADN fetal presente en la sangre materna . Por ejemplo, si la muestra contiene ADN fetal al 50%, entonces la relación esperada es 0.33 (1 alelo fetal G/ (2 alelos maternos A + 1 alelo fetal A) ) . Esta relación debe ser constante para todos los cromosomas que están presentes en dos copias. La relación que se obtiene para los SNP en el cromosoma 13 debe ser la misma que la relación que se obtiene para el cromosoma 21. Sin embargo, si el genoma fetal contiene una copia adicional del cromosoma 21, entonces la relación para este cromosoma se desviará de la relación esperada. La relación esperada para una condición de Trisomía con ADN fetal al 50% en la sangre materna es 0.25. Así, al analizar los SNP en donde el genoma materno es homocigótico, y el ADN que se aisla del plasma es heterocigótico, se pueden detectar las anormalidades cromosomales del feto. Este ejemplo explica el uso del método hMC de Sequenom, pero no se pretende que limite el uso de estas técnicas de espectrometría de masas .

EJEMPLO 20 Las anormalidades cromosomales fetales se determinan al analizar los SNP en donde el ADN de plantilla materno es homocigótico y el ADN de plantilla obtenido del plasma es heterocigótico. El plasma que se aisla de la sangre de una mujer embarazada, contiene tanto ADN de plantilla materno como ADN de plantilla fetal. Se puede usar cualquier número de métodos de detección de SNP para analizar el ADN materno y del plasma. En este ejemplo, se analizan los SNP usando el ensayo assArray™ Homogenous MassEXTEND™ (hME) de Sequenom.

Recolección de las Muestras de Sangre De acuerdo con un estudio aprobado por el IRB, se recolectaron muestras de sangre de mujeres embarazadas después de que se otorgó consentimiento por escrito. La sangre se recolectó en tubos de 9 mi EDTA Vacuette (número de catálogo NC9897284) y 0.225 mi de solución amortiguada neutral al 10% que contiene formaldehído (4% p/v) , se agregan a cada tubo, y cada tubo se invierte suavemente. Los tubos se almacenan a 4°C hasta que están listos para procesarse. Se puede agregar cualquier número de agentes que impidan la lisis celular o estabilicen las membranas celulares a los tubos que incluye pero no se limita a formaldehído, y derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehído, y derivados de glutaraldehído, reticuladores, reticuladores reactivos de amina primaria, reticuladores reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de bisulfuro, reticuladores reactivos de carbohidratos, reticuladores reactivos de carboxilo, reticuladores fotoreactivos, reticuladores que se dividen, AEDP, APG, BASED, BM(PE0)3, BM(PEO)4, B B , BMDB, BMH, BMOE, BS3 , BSOCOES, DFDNB, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP , DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, Sulfo-EGS o los compuestos listados en la Tabla XXIII. Cualquier concentración de agente que estabilice las membranas celulares o impida la lisis celular se puede agregar. En una modalidad preferida, el agente que estabiliza las membranas celulares o impide la lisis celular se agrega a una concentración que no impide u obstaculiza las reacciones posteriores. Se puede agregar un agente que estabilice las membranas celulares a la muestra de sangre materna para reducir la lisis celular materna que incluye pero no se limita a aldehidos, urea formaldehxdo, fenol formaldehído, D AE (dimetilaminoetanol) , colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol, sacarosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, hopano tetral fenilacetato isómero A, hopano tetral fenilacetato isómero B, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoína, perftoran, polivinilpirrolidona, fosfatidilserina, tegretol, PABA, cromglicato de disodio, nedocromil sodio, fenitoína, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio, o polaxámero 188.

Aislamiento de Plasma y Células Maternas Se almacena la sangre a 4°C hasta procesarse. Los tubos se hacen girar a 1000 rpm durante diez minutos en una centrífuga con un poder de frenado fijado en cero. Los tubos se hacen girar una segunda vez a 1000 rpm durante diez minutos. El sobrenadante (el plasma) de cada muestra se transfiere a un nuevo tubo y se hace girar a 3000 rpm durante diez minutos con el ajuste de freno en cero. El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo y se almacena a -80°C.

Aproximadamente dos mililitros de la "capa amarillenta," que contiene las células maternas, se coloca en un tubo separado y se almacena a -80°C.

Aislamiento del ADN Se aisla el ADN de la muestra de plasma usando el kit Qiagen Midi para purificación de ADN de células de sangre, siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAmp DNA Blood Midi Kit, Número de catálogo 51183) . Se eluye el ADN en 100 µ? de agua destilada. El kit Qiagen Midi también se usa para aislar el ADN de las células maternas contenidas en la ¾capa amari11enta . " Identificación de SNP Maternales Homocigóticos Ensayo MassARRAY homogéneo MassEXTEND™ de configuración de masas (hME) El ensayo homogéneo MassEXTEND™ (hME) utiliza una química de extensión de cebadores libre de etiquetas sin perlas para la formación de los genotipos. Cada uno de los productos del cebador tiene un peso molecular único que permite que se identifique con precisión el genotipo asociado utilizando espectrometría de masa o en reacciones múltiples. Amplificación de la plantilla El ADN materno aislado se amplifica (2.5 ng) en un volumen 5 µ? usando un formato de placas de 384 microtitulación. Se puede amplificar cualquier número de SNP, ya sea en una reacción sencilla, ya sea en una reacción sencilla o en reacciones múltiples. Los cebadores representativos que se usan para amplificar SNP TSC0271628 (A/G) , el cual se localiza en el cromosoma 21, se proporcionan a continuación: Cebador en dirección ascendente: 5' AGGAAATTGTGAAGTA 3' Cebador en la dirección descendente: 5' TAACTCACTCACTATC 3' Los cebadores pueden ser más largos o más cortos en la secuencia de nucleótidos . Las condiciones PCR recomendadas por los fabricantes del ensayo MassARRAY homogéneo de assEXTE D se siguen. Las condiciones representativas de PCR se proporcionan a continuación: (1) 95 °C durante 15 minutos y 15 segundos; (2) 95 °C durante 30 segundos; (4) 57 °C durante 30 segundos; (5) 72 °C durante 30 segundos; (6) Repetir etapas 2-5 treinta y dos (32) veces; (7) 72°C durante 5 minutos.

Desfosforilación Se agrega fosfatasa alcalina de camarón del Artico a las muestras que luego se incuban a 37°C durante 20 minutos. Esta etapa se hace para desfosforilar algunos nucleótidos remanentes, lo cual evita su incorporación e interferencia futuras con el ensayo MassEXTEND homogéneo . De configuración de masas. Luego se incuban las muestras a 85°C para inactivar el SAP al final al calor. Reacción hME Se diseña un cebador MassEXTEND para combinar los pares base cercanos al sitio polimórfico y se diseña para identificar ambos alelos del sitio polimórfico. Para SNP TSC0271628, un cebador representativo MassEXTEND es: 5' CTTTTTATGCCTTTCCACTCATCCA 3' la longitud del cebador MassEXTEND se diseña de acuerdo a las instrucciones proporcionadas por los fabricantes del ensayo MassARRAY homogéneo de MassEXTEND. El cebador MAssEXTEND, polimerasas de ADN, y un mezcla de cocktail de desoxinucleótidos (dNTPs) y didesoxinucleótidos (ddNTPs) se agrega a una reacción inicial de extensión de cebadores. Los productos de cebador específicos del alelo se generan que son generalmente de una a 4 bases más extensos que el cebador original EXTEND. Un cebador MASSEXTEND se hibridiza de manera cercana adyacente al sitio polimórfico siguiendo las condiciones recomendadas por los fabricantes del ensayo MassARRAY homogéneo MassEXTEND. Se seleccionan mezclas de nucleótidos para maximizar las diferencias de masas para todos los productos posibles MassEXTEND. Sé incorporan los dNTPS adecuados hasta que se incorpora uno dd TP sencillo y se finaliza la reacción. Los protocolos del fabricante se siguen para todas las etapas del ensayo hME. Los productos de reacción representativos para SNP TSC0271628 se proporcionan a continuación: Alelo A antes de la extensión del cebador Cebador MassEXTEND : CT TTTT ATGCCT T TCCACTCATCCA ADN de muestra : GAAAAATACGGAAAGGTGAGTAGGTTTCC Se identifica en negritas el sitio SNP. Después de la incubación con polimerasa de ADN, ddATP, dCTP, dGTP, y dTTP, se genera el siguiente producto: Alelo A después de la extensión del cebador Cebador MassEXTEND : CT TTTT ATGCCT T TCCACTCATCCAA* ADN de muestra : GAAAAATACGGAAAGGTGAGTAGGTTTCC Se incorpora el ddATP en el cebador. Ya sea ddNTPs etiquetados o sin etiquetar se pueden usar. 'El asterisco indica ddATP que esta sin etiquetar. Se genera después de la reacción de incorporación un cebador de 24 mero.

Alelo G ante de la extensión del cebador Cebador MassEXTE D : CT TTTT ATGCCT T TCCACTCATCCA ADN de muestra : GAAAAATACGGAAAGGTGAGTAGGTCTCC Se identifica en negritas el sitio SNP. Después de la incubación con polimerasa de ADN, ddATP, dCTP, dGTP, y dTTP, se genera el siguiente producto: Alelo G después de la extensión del cebador Cebador MassEXTEND: CT TTTT ATGCCT T TCCACTCATCCAGA* ADN de muestra: GAAAAATACGGAAAGGTGAGTAGGTCTCC Después de la reacción de incorporación, se genera un cebador de 25 mero. La diferencia en peso molecular entre el producto de reacción entre el alelo A (24 mero) y el producto de reacción G (25 meros) se usa para formar el genotipo de lugar cromosomal de interés.

Acondicionamiento de la muestra Se agrega la resina SpectroCLEAN™ a la reacción para retirar sales extrañas que interfieran con el análisis MALDI-TOF.

Transfe encia de muestras Se transfieren 15 ni de muestra a partir de la placa de 384-microtitulación y se forma puntos sobre la almohadilla de la microconfiguración 384 SpectroCHIP™ .

Análisis de muestra Se coloca el SpectroCHIP™ dentro del MALDI-TOF, el cual mide la masa de los productos de extensión. Una vez que se determina, se denomina el genotipo en tiempo real con el software SpectroTYPER™ RT. Se identifican los SNP a los cuales el ADN materno es homocigótico y se analizan con el ADN que se aisla del plasma.

Análisis del ADN aislado del plasma materno Después de que se analiza el ADN materno y se identifican los SNP homocigóticos , estos SNP se analizan con el ADN aislado del plasma. Un número de bajas copias de genomas fetales existe típicamente en el plasma materno. Para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, que son los SNP a los cuales el ADN materno es homocigótico, los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases a aproximadamente 130 bases en dirección ascendente y 130 bases en dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés . Esto se hace para reducir el error de muestreo estadístico que puede suceder cuando se trabaja con un número bajo de genomas, que pueden tener influencia en la relación de un alelo al otro (ver Ejemplo 11) .

Diseño de Cebadores últiplex Los cebadores tienen 12 bases de longitud. Sin embargo, se pueden usar cebadores de cualquier longitud que incluye pero no se limita a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76-85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125, y más de 125 bases. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases tanto a la hebra sentido como a la hebra antisentido. Los SNP homocigoticos maternos varían de muestra a muestra de manera que no se proporcionan aquí secuencias definidas. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases alrededor de 130 bases en dirección ascendente y descendente de los SNP homocigoticos maternos. Los cebadores se diseñan para finalizar en la terminación 3' en el dinucleótido "AA" para reducir la formación de dímeros del cebador. Sin embargo, se pueden diseñar los cebadores para terminar en cualquiera de los cuatro nucleotidos y en cualquier combinación de los cuatro nucleotidos .

PCR Múltiplex Las regiones en la dirección ascendente y en la dirección, descendente de los SNP homocigóticos maternos se amplifican a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, Patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas en la presente como referencia) . Esta reacción PCR utiliza cebadores que se combinan en sus pares de bases aproximadamente 130 bases en la dirección ascendente y en la dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés. Se mezclan juntos los cebadores y se usan en una reacción sencilla para amplificar el ADN de plantilla. Esta reacción se hace para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, lo cual elimina el error generado a partir de un número bajo de genomas. Para una especificidad mejorada, se utiliza una reacción PCR de "inicio en caliente" . Las reacciones PCR se llevan a cabo usando el kit HotStarTag aster ix suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y cebador por reacción se optimiza para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, se usan los 20 µ? de ADN de plantilla de plasma. Dos microlitros de cada cebador delantero y reverso, a concentraciones de 5 mM, se acumulan y mezclan en un tubo microcentrifugo sencillo. Se usan cuatro microlitros de la mezcla del cebador en un volumen total de reacción PCR de 50 µ? (20µ1 de ADN de plantilla de plasma, 1 µ? de agua estéril, 4 µ? de mezcla de cebador, y 25 µ? de HotStar Taq. Se llevaron a cabo veinticinco ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95 °C durante 15 minutos; (2) 95 °C durante 30 segundos; (3) 4°C durante 30 segundos; (4) 37°C durante 30 segundos; (5) Repetir etapas 2-4 veinticuatro (24) veces; (6) 72 °C durante 10 minutos. Las temperaturas y los tiempos para desnaturalización, combinación de pares de bases, y extensión, se optimizan al tratar diversos parámetros y usando los parámetros que producen los mejores resultados. También se pueden usar otros métodos de amplificación genómica para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés que incluye pero no se limita a preamplificación de la extensión del cebador (PEP) (Zhang et al., PNAS, 89:5847-51, 1992), PCR cebada con oligonucleótido degenerado (DOP-PCR) (Telenius, et al., Genomics 13:718-25, 1992) , amplificación por desplazamiento de hebras al usar la polimerasa del ADN del bacteriófago 29, la cual se somete a una replicación en círculo rodante (Dean et al., Genomic Research 11:1095-99, 2001), amplificación de desplazamiento múltiple (Patente de E.U.A. 6,124,120), REPLI-g™ Kits de amplificación completa de genoma, y PCR etiquetada.

Purificación del Fragmento de Interés Se retiran de la reacción los cebadores sin usar y los nucleótidos al usar Kits de purificación Qiagen MinElute PCR (Qiagen, Número de catálogo 28004) . Las reacciones se llevan a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante suministradas con las columnas. Se eluye el ADN en 100 µ? de agua estéril. 5 µ? de cada lugar cromosomal amplificado, se mezclan juntos Ensayo MassEXTEND homogéneo de conf guración de masas Se ensaya el ADN acumulado con el ensayo del hME como se describe arriba. Se forma el genotipo de cada SNP. Los SNP se localizan en cromosomas 13 y 21, en donde el ADN materno es homocigótico , y se cuantifica el ADN aislado del plasma que es heterocigótico .

Cuantificación La intensidad de cada pico, en donde cada pico corresponde a un fragmento de ADN con un peso molecular especifico, se cuantifica. Como se discutió anteriormente, la relación esperada del alelo 1 al alelo 2 se usa para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal . Si el genoma materno es homocigótico en SNP X (A/A) , y el ADN de plasma es heterocigótico en SNP X (A/G) , entonces el G representa la señal fetal diferente.

Habrán algunos fragmentos que difieran en lo molecular debido a la presencia del nucleotido G en SNP" X en el genoma fetal . Se cuantifica la intensidad del pico con el nucleotido A y se cuantifica la intensidad del pico que corresponde a los fragmentos con el nucleotido G. La relación de G:A depende del porcentaje de ADN fetal presente en la sangre materna. Por ejemplo, si la muestra contiene ADN fetal al 50%, entonces la relación esperada es 0.33 (1 alelo fetal G/ (2 alelos maternos A + 1 alelo fetal A) ) . Esta relación debe ser constante para todos los cromosomas que están presentes en dos copias. La relación que se obtiene para los SNP en el cromosoma 13 debe ser la misma que la relación que se obtiene para el cromosoma 21. Sin embargo, si el genoma fetal contiene una copia adicional del cromosoma 21, entonces la relación para este cromosoma se desviará de la relación esperada. La relación esperada para una condición de Trisomia con ADN fetal al 50% en la sangre materna es 0.25. Así, al analizar los SNP en donde el genoma materno es homocigótico, y el ADN que se aisla del plasma es heterocigótico, se pueden detectar las anormalidades cromosomales del feto. Este ejemplo explica el uso del ensayo (hME) MassEXTEND homogéneo de configuración de masas de Sequenom, pero no se pretende el uso de técnicas que diferencien moléculas con base en el peso molecular.

EJEMPLO 21 Las anormalidades cromosomales fetales se determinan al analizar los SNP en donde el ADN de plantilla materno es homocigótico y el ADN de plantilla obtenido del plasma es heterocigótico . El plasma que se aisla de la sangre de una mujer embarazada, contiene tanto ADN de plantilla materno como ADN de plantilla fetal. Se puede usar cualquier número de métodos de detección de SNP para analizar el ADN materno y del plasma. En este e emplo, se analizan los SNP usando el ensayo de Orchid SN -IT™. No obstante, se pueden usar también otros métodos de detección SNP con base en la extensión del cebador.

Recolección de las Muestras de Sangre De acuerdo con un estudio aprobado por el IRB, se recolectaron muestras de sangre de mujeres embarazadas después de que se otorgó consentimiento por escrito. La sangre se recolectó en tubos de 9 mi EDTA Vacuette (número de catálogo NC9897284) y 0.225 mi de solución amortiguada neutral al 10% que contiene formaldehído (4% p/v) , se agregan a cada tubo, y cada tubo se invierte suavemente. Los tubos se almacenan a 4°C hasta que están listos para procesarse. Se puede agregar cualquier número de agentes que impidan la lisis celular o estabilicen las membranas celulares a los tubos que incluye pero no se limita a formaldehído, y derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehido, y derivados de glutaraldehido, reticuladores , reticuladores reactivos de - amina primaria, reticuladores reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de bisulfuro, reticuladores reactivos de carbohidratos, reticuladores reactivos de carboxilo, reticuladores fotoreactivos, reticuladores que se dividen, AEDP, APG, BASED, BM(PEO)3, BM(PEO)4, BMB, B DB, BMH, BMOE, BS3 , BSOCOES, DFD B, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, Sulfo-EGS o los compuestos listados en la Tabla XXIII. Cualquier concentración de agente que estabilice las membranas celulares o impida la lisis celular se puede agregar. En una modalidad preferida, el agente que estabiliza las membranas celulares o impide la lisis celular se agrega a una concentración que no impide u obstaculiza las reacciones posteriores. Se puede agregar un agente que estabilice las membranas celulares a la muestra de sangre materna para reducir la lisis celular materna que incluye pero no se limita a aldehidos, urea formaldeh do, fenol formaldehído, DMAE (dimetilaminoetanol) , colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol, sacarosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, hopano tetral fenilacetato isómero A, hopano tetral fenilacetato isómero B, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoína, perftoran, polivinilpirrolidona, fosfatidilserina, tegretol, PABA, cromglicato de disodio, nedocromil sodio, fenitoína, citrato de zinc, mexitil, dilantin, ialuronato de sodio, o polaxámero 188.

Aislamiento del ADN Se aisla el ADN de la muestra de plasma usando el kit Qiagen Midi para purificación de ADN de células de sangre, siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAmp DNA Blood Midi it, Número de catálogo 51183) . Se eluye el ADN en 100 µ? de agua destilada. El kit Qiagen Midi también se usa para aislar el ADN de las células maternas contenidas en la "capa amarillenta . " Identificación de SNP Maternales Homocigóticos Ensayo SNP-IT™ El ensayo SNP-IT se basa en una extensión sencilla del cebador base. Previo al ensayo SNP-IT, se prepara un ensayo PCR que incluye el SNP de interés, usando un cebador sin modificar y un cebador modificado con fosforotiolato . Luego se hace el producto PCR de hebra sencilla usando exonucleasa, y se combina en sus pares base el ADN de hebra sencilla hasta un oligonucleótido SNP-IT inmovilizado en la superficie de una placa de microtitulación de 96 pozos. Después de la hibridación, sucede una extensión de base sencilla por la adición de la polimerasa de ADN y los terminadores etiquetados. La base incorporada se detecta utilizando anticuerpos específicos para la etiqueta seguida por detección colorimétrica . Se pueden hacer los análisis de datos visualmente o con el uso de un vector de placas de absorbancia .

Diseño de cebadores Para cada lugar cromosoma! de interés, el ensayo SNP-IT™ requiere de 3 cebadores. Los cebadores se diseñan para producir un amplicón de 100-50 pares de base. La secuencia del cebador SNP-IT que se diseña para combinar inmediatamente en dirección del sitio ascendente del sitio SNP, es la mejor secuencia disponible entre las hebras inferior y superior. La secuencia del cebador SNP-IT se diseña para minimizar la hibridación en si misma y otros sitios en el amplicón. Además, el cebador SNP-IT puede contener bases modificadas para evitar el auto cebado. La longitud de los cebadores se diseña de acuerdo con los fabricantes del ensayo SNP-IT. Los cebadores representativos para la amplificación y formación de genotipos de SNP TSC0069085, el cual se localiza en el cromosoma 21, se proporcionan a continuación: Cebador en dirección ascendente : 5' ATCACACTGGGGATC 3' Cebador en la dirección descendente : 5' CTAAACCTATGACTC 3' cebador SNP-IT 5' TTCACAGAGGATATCTTAATA 3' El cebador en dirección ascendente no se modifica y el cebador en la dirección descendente se modifica por fosforotiolato .

Recubrimientos de placas SNP-IT Cebador SNP-IT se agrega para recubrir los pozos de placas vacías de 96 pozos. Esta reacción típicamente se incuba durante la noche. Se siguen los protocolos y procedimientos del fabricante.

PCR Se amplifica el ADN de plantilla (15 ng) ya sea en un recipiente de reacción que incluye pero no se limita a un tubo eppendorf o un pozo de un placa de microtitulación. Se siguen los protocolos y procedimientos del fabricante para la reacción por PCR.

Exonucleasa Se trata el producto por PCR con exonucleasa para degradar la hebra no modificada. La hebra etiquetada con fosforotiolato protegida se usa en el ensayo SNP-IT. Se siguen los protocolos y procedimientos del fabricante para la reacción por exonucleasa.

Combinación de pares base Se transfiere el producto por PCR de hebra sencilla a una placa SNP-IT y se permite que forme un híbrido con el cebador SNP-IT. La reacción de combinación de pares base avanza típicamente durante una hora. Se siguen los procedimientos y protocolos del fabricante para la reacción de combinación de pares base .

Reacción SNP-IT El reactivo de extensión, que contiene la polimerasa de ADM, 2 nucleótidos de terminación etiquetados con fluoresceína o biotina, y 2 terminadores no etiquetados, se agrega al pozo SNP-IT que contiene la plantilla combinada en pares base y el complejo del cebador. Para SNP TSC0069085, ddCTP se etiqueta con fluoresceína y ddTTP se etiqueta con biotina, y los terminadores sin etiquetar son ddATP, y ddGTP. Se siguen los protocolos y procedimientos del fabricante para la reacción de extensión. La base específica SNP se incorpora por una extensión de base sencilla del cebador SNP-IT. Se lavan manualmente los cebadores o un lavador de placas para retirar el material sin incorporar. Se siguen los procedimientos y protocolos del fabricante para la reacción de lavado .

Detección Se agrega anti- fluoresceína etiquetada con fosfatasa alcalina (AP) a la placa y se deja enlazar a cualquiera de los terminadores etiquetados con fluoresceína incorporados . Se siguen los procedimientos y protocolos del fabricante para la reacción de etiquetado.

Se lavan las placas y luego se lleva a cabo el desarrollo del color usando pNPP como el substrato de detección. La absorbancia se lee a 405 nm para detectar el substrato pNPP coloreado con amarillo seguido por una etapa de lavado para retirar los reactivos de detección pMPP. Se siguen los protocolos y procedimientos del fabricante para el desarrollo de color y las etapas de lavado . Se agrega estreptavidina etiquetada con peroxidasa de raiz de rábano (HRP) a la placa y se deja enlazar con cualquier biotina incorporada en un terminador etiquetado. Se siguen los protocolos y procedimientos del fabricante para la reacción de etiquetado. Después de lavar, se lleva a cabo el. desarrollo del color usando TMB como el substrato de detección. Se lee la absorbancia a 620 nm para detectar el substrato TMB coloreado en azul .

Análisis Se gráfica la absorbancia para generar un gráfica dispersa a partir de la cual se hacen células de genotipo SNP en las cuales el ADN materno que es homocigótico se identifica y se analiza con el ADN aislado del plasma materno .

Análisis del ADN aislado del- plasma materno Después de que se analiza el ADN materno y se identifican los SNP homocigóticos , estos SNP se analizan con el ADN aislado del plasma. Un número de bajas copias de genomas fetales existe típicamente en el plasma materno. Para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, que son los SNP a los cuales el ADN materno es homocigótico, los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases a aproximadamente 130 bases en dirección ascendente y 130 bases en dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés . Esto se hace para reducir el error de muestreo estadístico que puede suceder cuando se trabaja con un número bajo de genomas, que pueden tener influencia en la relación de un alelo al otro (ver Ejemplo 11) .

Diseño de Cebadores Múltiplex Los cebadores tienen 12 bases de longitud. Sin embargo, se pueden usar cebadores de cualquier longitud que incluye pero no se limita a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76- 85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125, y más de 125 bases. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases tanto a la hebra sentido como a la hebra antisentido. Los SNP homocigóticos maternos varían de muestra a muestra de manera que no se proporcionan aquí secuencias definidas. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases alrededor de 130 bases en dirección ascendente y descendente de los SNP homocigóticos maternos . Los cebadores se diseñan para finalizar en la terminación 3' en el dinucleótido WM" para reducir la formación de dxmeros del cebador. Sin embargo, se pueden diseñar los cebadores para terminar en cualquiera de los cuatro nucleotidos y en cualquier combinación de los cuatro nucleotidos.

PCR Múltiplex Las regiones en la dirección ascendente y en la dirección descendente de los SNP homocigóticos maternos se amplifican a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, Patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas en la presente como referencia) . Esta reacción PCR utiliza cebadores que se combinan en sus pares de bases aproximadamente 130 bases en la dirección ascendente y en la dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés. Se mezclan juntos los cebadores y se usan en una reacción sencilla para amplificar el ADN de plantilla. Esta reacción se hace para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, lo cual elimina el error generado a partir de un número bajo de genomas. Para una especificidad mejorada, se utiliza una reacción PCR de "inicio en caliente" . Las reacciones PCR se llevan a cabo usando el kit HotStarTaq Master Mix Kit suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y cebador por reacción se optimiza para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, el 20 µ? de ADN de plantilla de plasma se usa. Dos microlitros de cada cebador delantero y reverso, a concentraciones de 5 mM, se acumulan y mezclan en un tubo microcentrifugo sencillo. Se usan cuatro microlitros de la mezcla del cebador en un volumen total de reacción PCR de 50 µ? (20µ1 de ADN de plantilla de plasma, 1 µ? de agua estéril, 4 µ? de mezcla de cebador, y 25 µ? de HotStar Taq. Se llevaron a cabo veinticinco ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95 °C durante 15 minutos; (2) 95 °C durante 30 segundos; (3) 4°C durante 30 segundos; (4) 37°C durante 30 segundos; (5) Repetir etapas 2-4 veinticuatro (24) veces; (6) 72 °C durante 10 minutos. Las temperaturas y los tiempos para desnaturalización, combinación de pares de bases, y extensión, se optimizan al tratar diversos parámetros y usando los parámetros que producen los mejores resultados. También se pueden usar otros métodos de amplificación genómica para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés que incluye pero no se limita a preamplificación de la extensión del cebador (PEP) (Zhang et al., PNAS, 89:5847-51, 1992), PCR cebada con oligonucleótido degenerado (DOP-PCR) (Telenius, et al., Genomics 13:718-25, 1992) , amplificación por desplazamiento de hebras al usar la polimerasa del ADN del bacteriófago 29, la cual se somete a una replicación en circulo rodante (Dean et al., Genomic Research 11:1095-99, 2001), amplificación de desplazamiento múltiple (Patente de E.U.A. 6,124,120), REPLI-g™ Kits de amplificación completa de genoma, y PCR etiquetada.

Purificación del Fragmento de Interés Se retiran de la reacción los cebadores sin usar y los nucleótidos al usar Kits de purificación Qiagen MinElute PCR (Qiagen, Número de catálogo 28004) . Las reacciones se llevan a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante suministradas con las columnas. Se eluye el ADN en 100 µ? de agua estéril. 5 µ? de cada lugar cromosomal amplificado, se mezclan juntos Ensayo SNP-IT Se ensaya el ADN acumulado con el ensayo SNP-IT como se describió arriba. Se forma el genotipo de cada SNP. Los SNP se localizan en cromosomas 13 y 21, en donde el ADN materno es homocigótico, y se cuantifica el ADN aislado del plasma que es heterocigótico.

Cuantificación La intensidad de la fluorescencia de cada alelo se cuantifica. Como se discutió anteriormente, la relación esperada del alelo 1 al alelo 2 se usa para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal . Si el genoma materno es homocigótico en SNP X (A/A) , y el ADN de plasma es heterocigótico en SNP X (A/G) , entonces el G representa la señal fetal diferente . Se cuantifica la intensidad del alelo con el nucleótido A y se cuantifica la intensidad del alelo con el nucleótido G. La relación de G:A depende del porcentaje de ADN fetal presente en la sangre materna. Por ejemplo, si la muestra contiene ADN fetal al 50%, entonces la relación esperada es 0.33 (1 alelo fetal G/ (2 alelos maternos A + 1 alelo fetal A) ) . Esta relación debe ser constante para todos los cromosomas que están presentes en dos copias. La relación que se obtiene para los SNP en el cromosoma 13 debe ser la misma que la relación que se obtiene para el cromosoma 21. Sin embargo, si el genoma fetal contiene una copia adicional del cromosoma 21, entonces la relación para este cromosoma se desviará de la relación esperada. La relación esperada para una condición de Trisomía con ADN fetal al 50% en la sangre materna es 0.25. Así, al analizar los SNP en donde el genoma materno es homocigótico, y el ADN que se aisla del plasma es heterocigótico, se pueden detectar las anormalidades cromosomales del feto . En este ejemplo, se etiquetan los nucleótidos del terminador con diferentes porciones químicas. Sin embargo, al utilizar los métodos descritos en esta solicitud (ver Ejemplo 6) , el ensayo SNP-IT se puede modificar para permitir la detección de ambos alelos con un terminador etiquetado sencillo . Este ejemplo explica el uso del ensayo Orchid de SNP-IT pero no pretende limitar el uso de otras técnicas que se basen en la extensión del cebador. El SNPstream 25K de Orchid, así como el software anexo que incluye pero no se limita a GetGenos™, QCreview™, y ValidGenos™, se puede también usar para detectar la presencia de anormalidades cromosomales en la sangre materna. Se puede encontrar información adicional acerca de estos productos en: http : //www. orchidbio . com/products/lsg/products/snpstream. asp .

EJEMPLO 22 Las anormalidades cromosomales fetales se determinan al analizar los SNP en donde el ADN de plantilla materno es homocigótico y el ADN de plantilla obtenido del plasma es heterocigótico . El plasma que se aisla de la sangre de una mujer embarazada, contiene tanto ADN de plantilla materno como ADN de plantilla fetal. Se puede usar cualquier número de métodos de detección de SNP para analizar el ADN materno y del plasma. En este ejemplo, se analizan los SNP usando el ensayo TaqMan® . Sin embargo, se pueden usar otros métodos que se soporten en el ensayo fluorogénico de la 5' nucleasa. Recolección de las Muestras de Sangre De acuerdo con un estudio aprobado por el IRB, se recolectaron muestras de sangre de muj eres embarazadas después de que se otorgó consentimiento por escrito. La sangre se recolectó en tubos de 9 mi EDTA Vacuette (número de catálogo NC9897284) y 0.225 mi de solución amortiguada neutral al 10% que contiene formaldehído (4% p/v) , se agregan a cada tubo, y cada tubo se invierte suavemente. Los tubos se almacenan a 4°C hasta que están listos para procesarse. Se puede agregar cualquier número de agentes que impidan la lisis celular o estabilicen las. membranas celulares a los tubos que incluye pero no se limita a formaldehído, y derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehído, y derivados de glutaraldehído, reticuladores , reticuladores reactivos de amina primaria, reticuladores reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de bisulfuro, reticuladores reactivos de carbohidratos, reticuladores reactivos de carboxilo, reticuladores fotoreactivos , reticuladores que se dividen, AEDP, APG, BASED, BM(PEO)3, BM(PEO)4, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BS3 , BSOCOES, DFD B, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, Sulfo-EGS o los compuestos listados en la Tabla XXIII. Cualquier concentración de agente que estabilice las membranas celulares o impida la lisis celular se puede agregar. En una modalidad preferida, el agente que estabiliza las membranas celulares o impide la lisis celular se agrega a una concentración que no impide u obstaculiza las reacciones posteriores. Se puede agregar un agente que estabilice las membranas celulares a la muestra de sangre materna para reducir la lisis celular materna que incluye pero no se limita a aldehidos, urea formaldehído, fenol formaldehído, DMAE (dimetilaminoetanol) , colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol, sacarosa, astaxantina, glucosa, amitriptilina, hopano tetral fenilacetato isómero ?, hopano tetral fenilacetato isómero B, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoína, ' erftoran, polivinilpirrolidona, fosfatidilserina, tegretol, PABA, croraglicato de disodio, nedocromil sodio, fenitoína, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio, o polaxámero 188.

Aislamiento del ADN Se aisla el ADN de la muestra de plasma usando el kit Qiagen Midi para purificación de ADN de células de sangre, siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAmp DNA Blood Midi Kit, Número de catálogo 51183) . Se eluye el ADN en 100 µ? de agua destilada. El kit Qiagen Midi también se usa para aislar el ADN de las células maternas contenidas en la "capa amarillenta." Identificación de SNP Maternales Homocigoticos Ensayo Taq an PE Biosystems tiene 2 instrumentos en su línea de producto del sistema de detección de secuencias, el sistema de detección de secuencias ABI Prism® 7700 y el sistema de detección de secuencias GeneAmp® 5700. Estos sistemas en tiempo real supuestamente pueden detectar los productos PCR cuando se acumulan durante la PCR y así permiten la cuantificación del ADN en la muestra. Una química disponible para su uso en los sistemas de detección ABI PRISM® 7700 y GeneAmp® 5700 es el ensayo fluorogénico de la 5' nucleasa o el ensayo TaqMan® que utiliza una sonda fluorogenica para permitir la detección de un producto especifico de PCR cuando se acumula por PCR. El diseño de sondas fluorogénicas patentado por PE Biosystems que incorpora al reportero debido en el extremo 5 ' y al agente de apagado en el extremo 3' ha ayudado con el diseño de las sondas TaqMan. La base para la cuantificación PCR en el instrumento ABI 7700 es medir continuamente la acumulación del producto por PCR usando una sonda de oligonucleótido fluorogenica etiquetada dual denominada la sonda TaqMan° que esta compuesta de un oligodesoxinucléotido corto (20-25 bases) que se etiqueta con 2 diferentes colorantes fluorescentes. En la terminación 5' está el colorante reportero y en la terminación 3 ' está el colorante de apagado . Esta secuencia de la sonda de oligonucleótido es homologa con una secuencia interna presente en el amplicón PCR. Cuando la sonda está intacta, sucede una transferencia de energía entre los 2 fluoróforos y se apaga la emisión del reportero por el agente de apagado (Livak et al., PCR Methods y Applications, 4:357-362, 1995a; Patente de E.U.A. No. 5,538,848; Patente de E.U.A. No. 5,723,591) . Durante la fase de extensión de PCR, la sonda se desdobla por la actividad de la 5' nucleasa de la polimerasa Taq, con lo cual se libera el reportero del agente de apagado de oligonucleótido y produce un incremento en la intensidad de emisión del reportero. El ABI Prism 7700 utiliza sistemas de fibra óptica que se conecta a cada pozo en un formato de charolas PCR de 96 pozos. La fuente de luz láser excita a cada pozo y una cámara CCD mide el espectro de fluorescencia y la intensidad de cada pozo para generar datos en tiempo real durante la ampliación PCR: El software ABI 7700 Prisma examina la intensidad de fluorescencias de los colorantes reportero y de apagado, y calcula el incremento en una intensidad de emisión de reportero normalizada durante el curso de la amplificación. Luego se grafican los resultados contra el tiempo representados por el número de ciclos, para producir una medida continua de ampliación PCR. Para proporcionar una cuantificación precisa del objetivo inicial en cada reacción PCR, se examina la gráfica de amplificación en un punto durante la fase log temprana de acumulación del producto. Esto se logra al asignar un umbral de fluorescencia arriba del respaldo y determinar el punto de tiempo en el cual cada gráfica de ampliación de muestra alcance el umbral (definido como el número de ciclos de umbral o CT) . Las diferencias en el número de ciclos de umbral se usan para cuantificar la cantidad relativa del objetivo PCR contenido dentro de cada tubo como se describió previamente. Para el análisis SNP, se puede diseñar una sonda Taq an para cada alelo del SNP. Se utiliza la emisión del reportero para determinar la presencia o ausencia de cada alelo en SNP. Por ejemplo, para un SNP que puede ser adenina o guanina, se diseñará la sonda TaqMan con un nucleótido complementario a la adenina y una sonda separada TaqMan se diseñará con un nucleótido a la guanina. Las 2 sondas TaqMan se pueden usar en recipientes de reacción por separado lo cual permite que se calcula la cantidad del alelo de adenina y la cantidad del alelo de guanina.

Diseño de Sondas y cebador Se pueden diseñar el cebador y las sondas usando el software Primer Express®. Se diseña primero la sonda y luego se diseñan los cebadores lo más cercano posibles a la sonda 7 sin traslaparlos. Se recomiendan ampliamente los amplicones de 50-150 pares de base. La sonda y los cebadores se deben diseñar usando las recomendaciones del fabricante . Para la sonda y los cebadores, el G/C está en el intervalo de 20-80%. Las sondas y el cebador se diseñan para evitar corridas de un nucleótido idéntico. Esto es especialmente verdad para la guanina, en donde se deben evitar corridas de cuatro o más Gs . Para la sonda, la TM es de alrededor de 68-70°C, y se diseña de manera que no haya guanina en la terminación 5' . También, se diseña la sonda de manera que haya más bases C que G. Para los cebadores, la TM es de alrededor de 58-60°C, y los cebadores se diseñan de manera que los cinco nucleótidos en la terminación 3' no tengan más de 2 bases G y/o C. Por ejemplo, los cebadores y sondas representativos para SNP TSC0271528 (A/G) , el cual se localiza en el cromosoma 21, se proporcionan a continuación: Cebador delantero (TM de 60°C) 5' AGTCTTGTAATACGACAGTC T 3' Cebador inverso (TM de 58°C) 5' CCATATCAATCAGTACTCTTG 3' Alelo A Sonda TaqMan (TM de 68°C; se indica en negrita el nucleótido variable en el SNP) 5' CCTTTCCACTCATCCAAAGGTTG 3' Alelo G Sonda TaqMan (TM de 70°C; se indica en negrita el nucleótido variable en el SNP) 5' CCTTTCCACTCATCCAGAGGTTG 3' La información referente a los SNP que circundan la secuencia, se encuentra en: http://www.snp.cshl.org. Al variar independientemente las concentraciones de cebador inverso y delantero, se pueden identificar las concentraciones que proporcionan las condiciones óptimas de ensayo. Se prueban intervalos de concentración del cebador de 50 n - 900 nM. Si el ADN materno es homocigótico para un alelo, por ejemplo, adenina, luego en la muestra que contiene la sonda TaqMan especifica para el nucleótido de guanina, no se separa el reportero del agente de apagado debido a que la sonda TaqMan no combina los pares de bases con el ADN de plantilla. Sin embargo, si el ADN materno es homocigótico, entonces se separará el reportero del agente de apagado en ambas muestras que contienen la sonda TaqMan específica para el alelo de guanina y muestras que contienen la sonda TaqMan específica para el alelo de adenina.

Solución de Reactivos La polimerasa recomendada para el ensayo TaqMan es la polimerasa de ADN AmpliTaq Gold. Se cree que el uso de la polimerasa de ADN AmpliTaq ' Gold reduce la cantidad de formación no específica de producto. La incorporación de la uracil n-glicosilasa AmpErase® (UNG) y dUTP proporciona protección contra la contaminación por arrastre por PCR. Para las reacciones por PCR, la mezcla Master TaqMan Universal PCR, que es un reactivo diseñado para proporcionar un desempeño óptimo para el ensayo TaqMans, se recomienda por el fabricante. La solución amortiguadora de reacción TaqMan, contiene 5.5 mM de MgCl2 , 200 nM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, 400 nM dUTP, 0.5 U de uracil ADN glicosilasa, y 1.25 U de AmpliTaq oro .

Parámetros de Ciclización Térmica La amplificación por PCR y detección para todas las combinaciones de sonda-cebador, se llevan a cabo con el sistema de detección de secuencias ABI 7700. Los parámetros de ciclo recomendados para el ensayo TaqMan se proporcionan a continuación: 1) 50°C por 2 min; 2) 95°C durante 10 min; 3) 95°C durante 15 seg; 4) 60°C por 1 min; 5) Repetir etapas 3-4 por 40 ciclos.

Cuantificación TaqMan Se generan estándares externos a partir de cantidades conocidas de AND que contiene el nucleótido de adenina en SNP TSC0271S28 y un nucleótido de guanina en SNP TSC0271628, abarcando 6 órdenes de magnitud (desde 5 x 10° hasta 5 x 106 copias) . El umbral de detección se fija en 10 veces la desviación estándar de la emisión de linea base media, calculada para los ciclos de PCR 3 a 15 (Stults et al., Applied and Envxronmental Microbiology, Vol. 67, No. 6, 2781-2789, 2001) . Se generan las curvas estándar relativas al ciclo de umbral de las concentraciones de AND con el software ABI Prism 7700 (disponible de Perkin Elmer) . Se identifican los SNP en los cuales los ADN maternos son homocigóticos , y se analizan con el ADN aislado de la muestra de plasma.

Análisis del ADN aislado del plasma materno Después de que se analiza el ADN materno y se identifican los SNP homocigóticos, estos SNP se analizan con el ADN aislado del plasma. Un número de bajas copias de genomas fetales existe típicamente en el plasma materno. Para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, que son los SNP a los cuales el ADN materno es homocigótico, los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases a aproximadamente 130 bases en dirección ascendente y 130 bases en dirección descendente de cada lugar croraosomal de interés . Esto se hace para reducir el error de muestreo estadístico que puede suceder .cuando se trabaja con un número bajo de genomas, que pueden tener influencia en la relación de un alelo al otro (ver Ejemplo 11) .

Diseño de Cebadores M ltiplex Los cebadores tienen 12 bases de longitud. Sin embargo, se pueden usar cebadores de cualquier longitud que incluye pero no se limita a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,· 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76-85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125, y más de 125 bases. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases tanto a la hebra sentido como a la hebra antisentido. Los SNP homocigóticos maternos varían de muestra a muestra de manera que no se proporcionan aquí secuencias definidas. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases alrededor de 130 bases en dirección ascendente y descendente de los SNP homocigóticos maternos. Los cebadores se diseñan para finalizar en la terminación 3' en el dinucleótido "7A7A" para reducir la formación de dímeros del cebador. Sin embargo, se pueden diseñar los cebadores para terminar en cualquiera de los cuatro nucleotidos y en cualquier combinación de los cuatro nucleotidos.

PC Multiplex Las regiones en la dirección ascendente y en la dirección descendente de los SNP homocigóticos maternos se amplifican a partir del ADN genómico de plantilla usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, Patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas en la presente como referencia) . Esta reacción PCR utiliza cebadores que se combinan en sus pares de bases aproximadamente 130 bases en la dirección ascendente y en la dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés. Se mezclan juntos los cebadores y se usan en una reacción sencilla para amplificar el ADN de plantilla. Esta reacción se hace para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés, lo cual elimina el error generado a partir de un número bajo de genomas. Para una especificidad mejorada, se utiliza una reacción PCR de "inicio en caliente" . Las reacciones PCR se llevan a cabo usando el kit HotStarTaq Master ix Kit suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y cebador por reacción se optimiza para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, se usan 20 µ? de ADN de plantilla de plasma. Dos microlitros de cada cebador delantero y reverso, a concentraciones de 5 mM, se acumulan y mezclan en un tubo microcentrifugo sencillo. Se usan cuatro microlitros de la mezcla del cebador en un volumen total de reacción PCR de 50 µ? (2?µ1 de ADN de plantilla de plasma, 1 µ? de agua estéril, 4 µ? de mezcla de cebador, y 25 µ? de Ho Star Tag. Se llevaron a cabo veinticinco ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95°C durante 15 minutos; (2) 95 °C durante 30 segundos; (3) 4°C durante 30 segundos; (4) 37 °C durante 30 segundos; (5) Repetir etapas 2-4 veinticuatro (24) veces; (6) 72 °C durante 10 minutos. Las temperaturas y los tiempos para desnaturalización, combinación de pares de bases, y extensión, se optimizan al tratar diversos parámetros y usando los parámetros que producen los mejores resultados. También se pueden usar otros métodos de amplificación genómica para incrementar el número de copias del lugar cromosomal de interés que incluye pero no se limita a preamplificación de la extensión del cebador (PEP) (Zhang et al., PNAS, 89:5847-51, 1992), PCR cebada con oligonucleótido degenerado (DOP-PCR) (Telenius, et al., Genomics 13:718-25, 1992) , amplificación por desplazamiento de hebras al usar la polimerasa del ADN del bacteriófago 29, la cual se somete a una replicación en círculo rodante (Dean et al., Genomic Research 11:1095-99, 2001), amplificación de desplazamiento múltiple (Patente de E.U.A. 6,124,120), REPLI-g™ Kits de amplificación completa de genoma, y PCR etiquetada. Es importante asegurar que la región amplificada contenga secuencias de combinación de pares de bases para las sondas de oligonucleótidos en el BeadArray. Al adquirir el servicio BeadArray, se identifican cada SNP y los cebadores usados para analizar cada SNP. Con este conocimiento, se diseñan los cebadores multiplex para abarcar regiones de combinación de pares de bases para los cebadores en el BeadArra .

Purificación del Fragmento de Interés Se retiran de la reacción los cebadores sin usar y los nucleótidos al usar Kits de purificación Qiagen MinElute PCR (Qiagen, Número de catálogo 28004) . Las reacciones se llevan a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante suministradas con las columnas. Se eluye el ADN en 100 µ? de agua estéril .

Ensayo Taq an Se ensaya el ADN amplificado con el Ensayo TaqMan como se describió anteriormente. Se forma el genotipo de cada SNP. Los SNP se localizan en cromosomas 13 y 21, en donde el ADN materno es homocigótico, y Se cuantifica el ADN aislado del plasma que es heterocigótico . Cuantificación Se cuantifica la intensidad fluorescente de la sonda específica de alelo de TaqMan. Como se discutió anteriormente, la relación esperada del alelo 1 al alelo 2 se usa para determinar la- presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal . Si el genoma materno es homocigótico en SNP X (A/A) , y el ADN de plasma es heterocigótico en SNP X (A/G) , entonces el G representa la señal fetal diferente. La intensidad fluorescente del alelo con el nucleótido A se cuantifica, y se cuantifica la intensidad del alelo con el nucleótido G. La relación de G:A depende del porcentaje de ADN fetal presente en la sangre materna. Por ejemplo, si la muestra contiene ADN fetal al 50%, entonces la relación esperada es 0.33 (1 alelo fetal G/ (2 alelos maternos A + 1 alelo fetal A) ) . Esta relación debe ser constante para todos los cromosomas que están presentes en dos copias. La relación que se obtiene para los SNP en el cromosoma 13 debe ser la misma que la relación que se obtiene para el cromosoma 21. Sin embargo, si el genoma fetal contiene una copia adicional del cromosoma 21, entonces la relación para este cromosoma se desviará de la relación esperada. La relación esperada para una condición de Trisomía con ADN fetal al 50% en la sangre materna es 0.25. Asi, al analizar los SNP en donde el genoma materno es homocigótico, y el ADN que se aisla del plasma es heterocigótico, se pueden detectar las anormalidades cromosomales del feto. Este ejemplo explica el uso del ensayo TaqMan, pero no pretende limitar el uso de otras técnicas que empleen la actividad de la 5' nucleasa. Por ejemplo, el colorante de hebra doble SYBR® Green I, también se puede usar con el sistema de detección de secuencias ABI PRIS 7700, y el sistema de detección de secuencias GeneAmp® 5700 para determinar la secuencia del ADN materno y fetal . El ensayo de colorante de hebra doble SYBR® Green I, se puede usar para detectar la presencia de anormalidades cromosomales en el feto en la sangre materna. El colorante de hebra doble SYBR® Green I, es un colorante de enlace al ADN de hebra doble altamente específico, que permite la detección de la acumulación de producto durante PCR. Sin embargo, el ensayo de colorante de hebra doble SYBR® Green I, detecta todos los AND de hebra doble incluyendo productos de reacción no específicos: la ventaja del ensayo de colorante de hebra doble SYBR® Green I, es que no requiere de una sonda. Se recomiendan los mismos parámetros de diseño de cebadores para el ensayo TaqMan y el ensayo de colorante de hebra doble SYBR® Green I (ver la sección de Diseño de cebadores en el Ejemplo 21) . Los parámetros de optimización del cebador para el ensayo TaqMan también deben seguirse por el ensayo de colorante de hebra doble SYBR® Green I. Además, no se deben correr ningunos controles de plantilla con las diversas concentraciones de cebadores . Adicionalmente, Applied Biosystems vende otros productos que se pueden usar para determinar la secuencia del ADN materno y fetal que incluye pero no se limita productos formadores de genotipos de SNP de Assays-on-Demand™, y productos formadores de genotipos de SNP de Assays-by-DesignSM. Habiéndose descrito ahora completamente la invención, se entenderá por aquellos expertos en la técnica que la invención se puede llevar a cabo con un intervalo amplio y equivalente de condiciones, parámetros y similares, sin afectar el alcance o espíritu de la invención o alguna modalidad de la misma. Todos los documentos, por ejemplo, publicaciones científicas, patentes y publicaciones de patentes aquí mencionadas, se incorporan referencia en su totalidad, al mismo grado documento en lo individual se indicara específica e individualmente para incorporarse como referencia en su totalidad. En donde el documento citado solamente proporcione la primera página del documento, se pretende el documento completo incluyendo las páginas restantes del documento .

EJEMPLO 23 Las anormalidades cromosomales fetales se determinan al analizar los SNP en donde el ADN de plantilla materno es homocigótico y el ADN de plantilla obtenido del plasma es heterocigótico . El plasma que se aisla de la sangre de una mujer embarazada, contiene tanto ADN de plantilla materno como ADN de plantilla fetal . Se puede usar cualquier número de métodos de detección de SNP para analizar el ADN materno y del plasma. En este ejemplo, los SNP se analizan por el ensayo de ThirdWave Technologies, Invader™ para Detección de Acidos Nucleicos. Sin embargo, se pueden usar otras técnicas que exploten y cuantifiquen las estructuras biológicas formadas en presencia de la secuencia correcta.

Recolección de las Muestras de Sangre De acuerdo con un estudio aprobado por el I B, se recolectaron muestras de sangre de mujeres embarazadas después de que se otorgó consentimiento por escrito. La sangre se recolectó en tubos de 9 mi EDTA Vacuette (número de catálogo NC9897284) y 0.225 mi de solución amortiguada neutral al 10% que contiene formaldehído (4% p/v) , se agregan a cada tubo, y cada tubo se invierte suavemente. Los tubos se almacenan a 4°C hasta que están listos para procesarse. Se puede agregar cualquier número de agentes que impidan la lisis celular o estabilicen las membranas celulares a los 84 tubos que incluye pero no se limita a formaldehído, y derivados de formaldehído, formalina, glutaraldehído, y derivados de glutaraldehído, reticuladores , reticuladores reactivos de amina primaria, reticuladores reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de bisulfuro, reticuladores reactivos de carbohidratos,. reticuladores reactivos de carboxilo, reticuladores fotoreactivos, reticuladores que se dividen, AEDP, APG, BASED, BM(PEO)3 BM(PEO)4, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BS3 , BSOCOES, DFDNB, DMA., DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, Sulfo-EGS o los compuestos listados en la Tabla XXIII. Cualquier concentración de agente que estabilice las membranas celulares o impida la lisis celular se puede agregar. En una modalidad preferida, el agente que estabiliza las membranas celulares o impide la lisis celular se agrega a una concentración que no impide u obstaculiza las reacciones posteriores. Se puede agregar un agente que estabilice las membranas celulares a la muestra de sangre maternas para reducir la lisis celular materna que incluye pero no se limita a aldehidos, urea formaldehído, fenol formaldehído, DMAE (dimetilaminoetanol) , colesterol, derivados de colesterol, altas concentraciones de magnesio, vitamina E, y derivados de vitamina E, calcio, gluconato de calcio, taurina, niacina, derivados de hidroxilamina, bimoclomol, sacarosa, 85 astaxantina, glucosa, amitriptilina, hopano tetral fenilacetato isómero A, hopano tetral fenilacetato isómero B, citicolina, inositol, vitamina B, complejo de vitamina B, hemisuccinato de colesterol, sorbitol, calcio, coenzima Q, ubiquinona, vitamina K, complejo de vitamina K, menaquinona, zonegran, zinc, extracto de ginkgo biloba, difenilhidantoxna, perftoran, polivinilpirrolidona, fosfatidilserina, tegretol, PABA, cromglicato de disodio, nedocromil sodio, _fenitoína, citrato de zinc, mexitil, dilantin, hialuronato de sodio, o polaxámero 188.

Aislamiento de Plasma y Células Maternas Se almacena la sangre a 4°C hasta procesarse. Los tubos se hacen girar a 1000 rpm durante diez minutos en una centrifuga con un poder de frenado fijado en cero. Los tubos se hacen girar una segunda vez a 1000 rpm durante diez minutos. El sobrenadante (el plasma) de cada muestra se transfiere a un nuevo tubo y se hace girar a 3000 rpm durante diez minutos con el ajuste de freno en cero. El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo y se almacena a -80°C. Aproximadamente dos mililitros de la "capa amarillenta," que contiene las células maternas, se coloca en un tubo separado y se almacena a -80°C.

Aislamiento del ADN Se aisla el ADN de la muestra de plasma usando el kit Qiagen Midi para purificación de ADN de células de sangre, siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAmp DNA Blood Midi Kit, Número de catálogo 51183) . Se eluye el ADN en 100 µ? de agua destilada. El kit Qiagen Midi también se usa para aislar el ADN de las células maternas contenidas en la "capa amarillenta." Identificación de SNP Maternales Homocigóticos Ensayo Invader™ de ThirdWave Technologies El ensayo Invader™, que se desarrolló por Third Wave Technologies (Madison, WI) , es un método isotérmico "libre de PCR" para la detección y análisis cuantitativo de ADN. El ensayo Invader produce y amplifica una señal no relacionada solamente en presencia de la secuencia objetivo correcta. El ensayo Invader™ se basa en un miembro termoestable de la familia de la endonucleasa de aleta de arqueobacterias (FEN) específica de la estructura, la cual desdobla moléculas de ácido nucleico en sitios específicos basados en la estructura más que en la secuencia. Cuando se usan con sondas formadoras de estructura para secuencias conocidas, las enzimas se desdoblan en una forma específica de la secuencia objetivo y la estructura. Las nucleasas usadas con los ensayos de Third Wave Technologies, se refieren como enzimas "Cleavase®" .

El ensayo Invader™ utiliza dos oligonucleótidos específicos del objetivo para crear el substrato complejo reconocido por las enzimas de Cleavase (L. DeFrancesco, The Scientist, 12(21) :16, 1998). El complejo del substrato se forma cuando el oligo Invader en dirección ascendente y la sonda de señal en dirección descendente, se hibridizan en tándem al ácido nucleico. La terminación 3' del oligo Invader debe traslapar el sitio de hibridación de la sonda de señal por al menos una base (Harrington et al.. Genes and Development, 8:1344-55, 1994). La terminación 5' de la sonda de señal tiene bases adicionales sin aparear, para formar la aleta 5'. Las enzimas de Cleavase desdoblan la sonda de señal en donde se traslapa el oligo Invader, liberando el extremo 5' . Las mezclas de reacción contienen una sonda de señal en exceso y se llevan cerca de la temperatura de fusión de la sonda. Se pueden desdoblar muchas sondas de señal de cada copia del objetivo, sin ciclos de temperatura. El traslape entre el oligo Invader y la sonda de señal es importante. Una no coincidencia colocada en el sitio del traslape, bloqueará el desdoblamiento al fragmentar el traslape, lo cual puede permitir la discriminación de los SNP y las mutaciones . El ensayo Invader utiliza dos etapas de desdoblamiento secuenciales . El extremo 5' de la sonda de señal liberada en la primera reacción no se detectó directamente. Más bien, un producto de desdoblamiento secundario es la fuente actual de la señal, detectada por transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET) . El producto de desdoblamiento primario, que es el extremo 5' liberado en la primera reacción, se usa como un oligo Invader que hibridiza a una sonda suministrada FRET en la reacción .secundaria. La sonda FRET se etiqueta con dos colorantes : un fluoróforo donador y un fluoróforo aceptor de apagado. Cuando la nucleasa desdobla la sonda secundaria, se separan los dos fluoróforos, se elimina el apagado y se detecta la señal de fluorescencia mejorada del colorante donador.

Diseño de Sondas Se diseñan las siguientes sondas para determinar la secuencia en SNP TSC1172576 (T/A) , el cual se localiza en el cromosoma 13 : Oligo Invader para el alelo T: 5' CATGCAGATATACCGCATAT 3' Oligo Invader para el alelo A: 5' CATGCAGATATACCGCATAA 3' Los oligonucleótidos Invader se diseñan para ser complementarios a una región de 18-22 bases inmediatamente en dirección ascendente de la sonda de señal, con una base adicional en la terminación 3' que "invade" la región hibridizada a la sonda de señal por una base.

Sonda de señal para el alelo T: GGTAGCATCTCTCAGCACAAGAG Sonda de señal para el alelo A: GGTAGCATCACTCAGCACAAGAG Se diseñan las sondas de señal para contener una región 3' que es complementaria a la -secuencia objetivo y al extremo 5' no complementario (la secuencia subrayada anterior) que se usa para la detección. Se etiquetan las sondas de señal en la terminación 5' con 6-carboxifluoresceina (TET) , hexacloro-6-carboxifluoresceina (HEX) , 6-carboxifluoresceina (FAM) . Sin embargo, se puede etiquetar la terminación 5' con cualquier porción química que incluye pero no se limita a un radioisótopo, molécula reportera fluorescente, molécula reportera quimioluminescente , anticuerpo, fragmento de anticuerpos, haptenos, biotina, derivado de biotina, fotobiotina, iminobiotina, digoxigenina, avidina, enzima, acridinio, azúcar, enzima, apoenzima, oligonucleótido homopolimérico, hormona, porción ferromagnética, porción paramagnética, porción diamagnética, porción fosforescente, porción luminiscente, porción electroquimioluminiscente, porción cromática, porción que tiene una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica o conductividad eléctrica y combinaciones de las mismas . Tanto las sondas de señal e invader, son complementarias a la hebra de AND de direccionamiento en sentido o antisentido, dependiendo de cual resulte en la formación del menor número de estructuras secundarias predecibles .

Amplificación PCR Se amplifica un fragmento de ADN que rodea el SNP TSC1172576 por PCR. Se proporcionan a continuación, la secuencia en la dirección ascendente y cebador en la dirección descendente: Cebador en dirección ascendente: 5' TAGCAGAATCTCTCAT 3' Cebador en la dirección descendente : 5' AGAGTATCTCATTTGTT 3' Se llevan a cabo las reacciones de amplificación en un volumen final de 100 µ? de 2 µ? que contienen el ADN genómico, 35 ?t??? de cada cebador, 50 µp? de cada desoxinucleótido (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., Poster City, CA) , solución amortiguadora 1 X PCRr (20 mM Tris-Hcl, 50 mM KC1 , 1.5 mM MgCl2, 0.05%Tween-20 , 0.05% NP40) , betaína 1 M, 5% dimetilsulfóxido (DMSO) , y 2.5 U de polimerasa Taq (Roche Boehringer Mannheim, Indianapolis , IN) . Las condiciones del ciclo de PCR consisten de una etapa de desnaturalización inicial a 95°C por 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 1 min, combinación de pares de bases a 68°C durante 1 min, y extensión a 72°C durante 1 min, y una extensión final a 72°C durante 5 min.

Reacción Invader Se agrega un microlitro de cada producto PCR a 0.5 pmol del oligonucleótido Invader adecuado, .10 ng de AND genómico humano (Promega Corp., adison, WI) como el portador y ácido morfolinopropansulfónico (MOPS) en solución amortiguadora (pH 8.0) a una concentración final de 10 mM en un volumen de 7 µ? . Las mezclas se desnaturalizaron durante 5 min a 95°C y luego se enfrió a la temperatura de reacción de 60°C. Las reacciones Invader se iniciaron por la adición de una mezcla que contiene 30 ng de Cleavase VIII (Third Wave Technologies, Inc., Madison, WI) 25 mM MgCl2, y 10 pmol del oligonucleótido de la sonda de señal adecuada en un volumen de 3 µ? . Se incubaron las mezclas de reacción durante 60 min. Las reacciones se finalizaron por la adición de 10 µ? de 95% formamida -10 mM EDTA (pH 8.0)- 0.05% violeta de cristal. Después de la finalización, se diluyeron las reacciones 1:10 in agua grado reactivo. Se cargaron muestras de 2 µ? y se trataron por electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizado al 24% (18 cm por 25.5 cm por mm) en un aparato formador de secuencias de fluorescencia automatizado (modelo 377, ??-???) . Se recolectaron los datos usando el conjunto C de filtro y se procesó con el software GeneScan. Además, se trataron por electroforesis 5 µ? de cada muestra en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 20% (acrilamida a bisacrilamida, 19:1), a 20 W. Se exploran los casetes de gel (20 cm por 20 cm por 0.5 mM) con un escáner fluorescente (FMBIO-100; Hitachi Corp, San Bruno, CA) al usar un filtro de 585 nm para las sondas etiquetadas como TET y HEX y un filtro de 505 nm para las sondas etiquetadas FAM. Con el ensayo Invader, también es posible llevar a cabo una segunda reacción de desdoblamiento, en donde el extremo 5' liberado de la sonda de señal se hibridiza a otra sonda, y se usa la transf rencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET) para detectar la presencia de un ácido nucleico específico. Se siguen los protocolos del fabricante cuando se usa la sonda FRET. Se determina el genotipo de cada SNP, al analizar la intensidad de fluorescencia de cada sonda de señal específica de alelo. Por ejemplo, para el SNP TSC1172576, la presencia del alelo T, se determina al analizar la cantidad de la sonda de señal 5' liberada, usando la sonda de señal de la sonda de señal del alelo T (como se describió anteriormente) . Similarmente, la presencia del alelo A se determina al analizar la cantidad de la sonda de señal 5' liberada de la sonda de señal del alelo A. Las reacciones se pueden llevar a cabo en un recipiente de reacción sencillo usando dos diferentes porciones químicas, que se pueden analizar bajo condiciones diferentes, o se pueden llevar a cabo las reacciones de los alelos A y T en dos recipientes de reacción por separado .

Diseño de Cebadores ultiplex Los cebadores tienen 12 bases de longitud. Sin embargo, se pueden usar cebadores de cualquier longitud que incluyen pero no se limitan a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76-85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125, y más de 125 bases. Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases tanto a la hebra sentido como a la hebra antisentido. Los SNP homocigóticos maternos varían de muestra a muestra de manera que no se proporcionan aquí secuencias definidas . Los cebadores se diseñan para combinarse en sus pares de bases alrededor de 130 bases en dirección ascendente y descendente de los SNP homocigóticos maternos . Los cebadores se diseñan para finalizar en la terminación 3' en el dinucleótido WAA" para reducir la formación de dxmeros del cebador. Sin embargo, se pueden diseñar los cebadores para terminar en cualquiera de los cuatro nucleótidos y en cualquier combinación de los cuatro nucleótidos.

PCR Multiplex Las regiones en la dirección ascendente y en la dirección descendente de los SNP homocigóticos maternos se amplifican a partir del ADN genomico de plantilla usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, Patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas en la presente como referencia) . Esta reacción PCR utiliza cebadores que se combinan en sus pares de bases aproximadamente 130 bases en la dirección ascendente y en la dirección descendente de cada lugar cromosomal de interés. Se mezclan juntos los cebadores y se usan en una reacción sencilla para amplificar el ADN de plantilla. Esta reacción se hace para incrementar el número de copias del lugar cromosoraal de interés, lo cual elimina el error generado a partir de un número bajo de genomas. Para una especificidad mejorada, se utiliza una reacción PCR de "inicio en caliente" . Las reacciones PCR se llevan a cabo usando el kit HotStarTag Master Mix Kit suministrado por QIAGEN (número de catálogo 203443) . La cantidad de ADN de plantilla y cebador por reacción se optimiza para cada lugar cromosomal de interés. En este ejemplo, se usan 20 µ? de ADN de plantilla de plasma. Dos microlitros de cada cebador delantero y reverso, a concentraciones de 5 mM, se acumulan y mezclan en un tubo microcentrífugo sencillo. Se usan cuatro microlitros de la mezcla del cebador en un volumen total de reacción PCR de 50 µ? (20µ1 de ADN de plantilla de plasma, 1 µ? de agua estéril, 4 µ? de mezcla de cebador, y 25 µ? de HotStar Taq. Se llevaron a cabo veinticinco ciclos de PCR. Se usaron las siguientes condiciones PCR: (1) 95°C durante 15 minutos; (2) 95°C durante 30 segundos; (3) 4°C durante 30 segundos; (4) 37 °C durante 30 segundos; (5) Repetir etapas 2-4 veinticuatro (24) veces; (6) 72 °C durante 10 minutos.

Las temperaturas y los tiempos para desnaturalización, combinación de pares de bases, y extensión, se optimizan al tratar diversos parámetros y usando los parámetros que producen los mejores resultados. También se pueden usar otros métodos de amplificación genómica para incrementar el número- de copias del lugar cromosomal de interés que incluye pero no se limita a preamplificación de la extensión del cebador (PEP) (Zhang et al., PNAS, 89:5847-51, 1992), PCR cebada con oligonucleótido degenerado (DOP-PCR) (Telenius, et al., Genomics 13:718-25, 1992) , amplificación por desplazamiento de hebras al usar la polimerasa del ADN del bacteriófago 29, la cual se somete a una replicación en círculo rodante (Dean et al., Genomic Research 11:1095-99, 2001), amplificación de desplazamiento múltiple (Patente de E.U.A. 6,124,120), REPLI-g™ Kits de amplificación completa de genoma, y PCR etiquetada. Es importante asegurar que la región amplificada contenga secuencias de combinación de pares de bases para las sondas de oligonucleótidos en el BeadArray. Con la adquisición del servicio BeadArray, cada SNP y los cebadores usados para analizar cada SNP se identifican. Con este conocimiento, se diseñan los cebadores multiplex para abarcar ?-egiones de combinación de pares de bases para los cebadores en el BeadArray.

Purificación del Fragmento de Interés Se retiran de la reacción los cebadores sin usar y los nucleótidos al usar Kits de purificación Qiagen MinElute PCR (Qiagen, Número de catálogo 28004) . Las reacciones se llevan a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante suministradas con las columnas. Se eluye el ADN en 100 µ? de agua estéril.

Ensayo Invader Se ensaya el ADN amplificado con el ensayo Invader como se describió anteriormente. Se forma el genotipo de cada SNP. Los SNP se localizan en cromosomas 13 y 21, en donde el ADN materno es homocigótico, y se cuantifica el ADN aislado del plasma que es heterocigótico .

Cuantificacion La intensidad fluorescente de la sonda de señal especifica del alelo se cuantifica. Como se discutió anteriormente, la relación esperada del alelo 1 al alelo 2 se usa para determinar la presencia o ausencia de una anormalidad cromosomal . Si el genoma materno es homocigótico en SNP X (A/A) , y el ADN de plasma es heterocigótico en SNP X (A/G) , entonces el G representa la señal fetal diferente. Se cuantifica la intensidad fluorescente del alelo con el nucleótido A y se cuantifica la intensidad del alelo con el nucleótido G. La relación de G:A depende del porcentaje de ADN fetal presente en la sangre materna. Por ejemplo, si la muestra contiene ADN fetal al 50%, entonces la relación esperada es 0.33 (1 alelo fetal G/ (2 alelos maternos A + 1 alelo fetal A) ) . Esta relación debe ser constante para todos los cromosomas que están presentes en dos copias . La relación que se obtiene para los SNP en el cromosoma 13 debe ser la misma que la relación que se obtiene para el cromosoma 21. Sin embargo, si el genoma fetal contiene una copia adicional del cromosoma 21, entonces la relación para este cromosoma se desviará de la relación esperada. La relación esperada para una condición de Trisomía con ADN fetal al 50% en la sangre materna es 0.25. Así, al analizar los SNP en donde el genoma materno es homocigótico, y el ADN que se aisla del plasma es heterocigótico, se pueden detectar las anormalidades cromosomales del feto. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las. siguientes reivindicaciones 1. Un método para preparar una muestra para análisis, caracter zado porque comprende aislar el ácido nucleico libre de una muestra que contiene ácido nucleico, en donde se ha agregado formalina a la muestra hasta una concentración seleccionada del grupo que consiste de: 0.0001-0.03%, 0.03-0.05%, 0.05-0.08%, 0.08-0.1%, 0.1-0.3%, 0.3-0.5%, 0.5-0.7%, 0.7-0.9%, 0.9-1.2%, 1.2-1.5%, 1.5-2%, y 2-3%. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra se obtiene de una fuente seleccionada del grupo que consiste de humano, no humano, mamífero, reptil, ganado, gato, perro, cabra, cerdo, puerco, mono, simio, gorila, toro, vaca, oso, caballo, oveja, aves de corral, ratón, rata, pez, delfín, ballena y tiburón. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la muestra se obtiene de una fuente humana . 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra se obtiene de una fuente seleccionada del grupo que consiste de: una célula, célula fetal, tejido, sangre, suero, plasma, saliva, orina, lágrima, secreción vaginal, sangre del cordón umbilical, vellosidad coriónica, fluido amniótico, tejido embriónico, fluido linfático, fluido cerebroespinal, secreción mucosa, fluido peritoneal, fluido ascítico, materia fecal, o exudados del cuerpo . 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la muestra es sangre. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5 , caracterizado porque la sangre se obtiene de una muestra de una hembra preñada . . El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la sangre se obtiene de un sujeto femenino con preñez cuando un feto está en una edad gestacional seleccionada del grupo que consiste de 0-4, 4-8, 8-12, 12-16, 16-20, 20-24, 24-28, 28-32, 32-36, 36-40, 40-44, 44-48, 48-52, y más de 52 semanas. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la muestra se obtiene del plasma de la sangre . 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de for alina en la muestra es 0.1%. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aislamiento del ácido nucleico comprende una etapa de centrifugación. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la etapa de centrifugación se lleva a cabo con la potencia de frenado de la centrífuga fijada en cero . 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porgue la etapa de centrifugación se lleva a cabo a una velocidad seleccionada del grupo que consiste de 0-50 rpm, 50-100 rpm, 100-200 rpm, 200-300 rpm, 300-400 rpm, 400-500 rpm, 500-600 rpm, 600-700 rpm, 700-800 rpm, 800-900 rpm, 900-1000 rpm, 1000-2000 rpm, 2000-3000 rpm, 3000-4000 rpm, 4000-5000 rpm, 5000-6000 rpm, 6000-7000 rpm, 7000-8000 rpm y más de 8000 rpm. 13. Un método para la detección de una anormalidad cromosomal en una muestra, el método caracterizado porgue comprende : (a) determinar la secuencia de alelos de un lugar cromosomal de interés en una muestra de ADN de plantilla, en donde la determinación de la secuencia de alelos comprende: (1) amplificación del lugar cromosomal de interés (2) hibridación de los lugares de interés amplificados a una configuración GeneCHIP (3) lavado de la configuración GeneCHIP (4) tinción de la configuración GeneCHIP con reactivos detectables, y (5) exploración de la configuración GeneCHIP. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el método de amplificación en (a) (1) se selecciona del grupo que consiste de: reacción en cadena de polimerasa, reacción de secuencia auto-sostenida, reacción en cadena de ligasa, amplificación rápida de los extremos de ADNc, reacción en cadena de polimerasa y reacción en cadena de lipasa, amplificación de fagos Q beta, amplificación por desplazamiento de hebras y reacción en cadena de polimerasa de extensión de traslape de empalme. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el método de amplificación es PCR. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el método de tinción comprende estreptavidina, ficoertrina y anti-estreptavidina biotinilada. 17. Un método para detectar una anormalidad cromosomal en una muestra, el método caracterizado porque comprende (a) determinar la secuencia de alelos de un lugar cromosomal de interés a partir del ADM de plantilla, en donde la determinación de secuencia de los alelos comprende: (1) amplificación del lugar cromosomal de interés; (2) fragmentación del amplicón; (3) hibridación de los amplicones fragmentados a las configuraciones CodeLink; (4) reacción de extensión para incorporar un nucleótido; y (5) detección de nucleótidos incorporados. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el método de amplificación se selecciona del grupo que consiste de: reacción en cadena de polimerasa, reacción de secuencia autosostenida, reacción en cadena de ligasa, amplificación rápida de terminaciones de ADNc, reacción en cadena de polimerasa y reacción en cadena de ligasa, amplificación de fagos Q-beta, amplificación por desplazamiento de hebras, y reacción en cadena de polimerasa de extensión de traslape de empalme. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el método de amplificación es por PCR. 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la fragmentación del amplicón es por digestión de exonucleasa. 21. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el nucleótido incorporado es un didesoxinucleótido o desoxinucleótido . 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el nucleótido incorporado se etiqueta con una molécula seleccionada del grupo que consiste de molécula radioactiva, molécula fluorescente, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, hapteno, carbohidrato, biotina, derivado de biotina, porción fosforescente, porción luminiscente, porción electroquimioluminiscente , · porción cromática y una porción que tiene una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica, o conductividad eléctrica. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el nucleótido etiquetado se etiqueta con una molécula fluorescente. 24. Un método para la detección de una anormalidad cromosomal en una muestra, el método caracterizado porque comprende : (a) determinar la secuencia de alelos de un lugar cromosomal de interés a partir del ADN de plantilla, en donde la determinación de la secuencia de los alelos comprende el uso de la tecnología BeadArray. 25. Un método para la detección de una anormalidad cromosomal en una muestra, el método caracterizado porque comprende: (a) determinar la secuencia de alelos de un lugar cromosomal de interés a partir del ADN de plantilla, en donde la determinación de la secuencia de los alelos comprende: (1) amplificación del lugar cromosomal de interés; (2) desfosforilación de los reactivos sin uso en (a) ; (3) reacción de transcripción in vitro de los productos de (b) ; (4) desdoblamiento de RNasa A de los productos de (c) ; (5) mezclar los productos de (d) con CleanResin; (6) productos de transferencia de (e) para SpectroCHIP; y (7) análisis del SpectroCHIP. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el método de amplificación se selecciona del grupo que consiste de: reacción en cadena de polimerasa, reacción de secuencia autosostenida, reacción en cadena de ligasa, amplificación rápida de terminaciones de ADNc, reacción en cadena de polimerasa y reacción en cadena de ligasa, amplificación de fagos Q-beta, amplificación por desplazamiento de hebras, y reacción en cadena de polimerasa de extensión de traslape de empalme. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el método de amplificación es por PCR. 28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la reacción de desfosforilación es con fosfatasa alcalina de camarón. 29. Un método para la detección de una anormalidad cromosomal en una muestra, el método caracterizado porque comprende: (a) determinar la secuencia de alelos de un lugar cromosomal de interés a partir del ADN de plantilla, en donde la determinación de la secuencia de los alelos comprende: (1) amplificación del lugar cromosomal de interés; (2) desfosforilación de los reactivos sin uso en (a) ; (3) hibridación de un cebador al lugar cromosomal de interés ; (4) incorporación de un nucleótido; (5) mezclar los productos de (d) con CleanResin; (6) transferencia de productos de (e) para SpectroCHIP; y (7) análisis del SpectroCHIP. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el método de amplificación se selecciona del grupo que consiste de: reacción en cadena de polimerasa, reacción de secuencia autosostenida, reacción en cadena de ligasa, amplificación rápida de terminaciones de ADNc, reacción en cadena de polimerasa y reacción en cadena de ligasa, amplificación de fagos Q-beta, amplificación por desplazamiento de hebras, y reacción en cadena de polimerasa de extensión de traslape de empalme. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el método de amplif cación es por PCR. 32. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la reacción de desfosforilación es con fosfatasa alcalina de camarón. 33. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la hibridación del cebador es adyacente al lugar cromosomal de interés. 34. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porgue el nucleótido incorporado es un didesoxinucleótido o desoxinucleótido . 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el nucleótido incorporado se etiqueta con una molécula seleccionada del grupo que consiste de molécula radioactiva, molécula fluorescente, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, hapteno, carbohidrato, biotina, derivado de biotina, porción fosforescente, porción luminiscente, porción electroquimioluminiscente, porción cromática y una porción que tiene una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica, o conductividad eléctrica. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el nucleótido etiquetado se etiqueta con una molécula fluorescente. 37. Un método para la detección de una anormalidad cromosomal en una muestra, el método caracterizado porque comprende; (a) determinar la secuencia de alelos de un lugar cromosomal de interés a partir del ADN de plantilla, en donde la determinación de la secuencia de los alelos comprende: (1) amplificación del lugar cromosomal de interés; (2) tratamiento con exonucleasa de los productos de (1) ; (3) ADN de hebra sencilla de (2) se combina con un oligonucleótido; (4) incorporación de un nucleótido usando la plantilla y cebador combinados en sus pares base de (3) ; (5) detección del nucleótido incorporado. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el método de amplificación se selecciona del grupo que consiste de: reacción en cadena de polimerasa, reacción de secuencia autosostenida, reacción en cadena de ligasa, amplificación rápida de terminaciones de ADNc, reacción en cadena de polimerasa y reacción en cadena de ligasa, amplificación de fagos Q-beta, amplificación por desplazamiento de hebras, y reacción en cadena de polimerasa de extensión de traslape de empalme. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el método de amplificación es por PCR. 40. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el cebador se hibridiza adyacente al lugar cromosomal de interés . 41. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el nucleótido incorporado es un didesoxinucleótido o desoxinucleótido . 42. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la reacción de incorporación comprende dos nucleótidos de terminación y dos nucleótidos sin terminación. 43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado- porgue el nucleótido incorporado se etiqueta con una molécula seleccionada del grupo que consiste de • molécula radioactiva, molécula fluorescente, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, hapteno, carbohidrato, biotina, derivado de biotina, porción fosforescente, porción luminiscente, porción electroquimioluminiscente, porción cromática y una porción que tiene una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica, o conductividad eléctrica. 44. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el nucleotido de terminación se etiqueta con una molécula selecciona del grupo que consiste de molécula radioactiva, molécula fluorescente, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, hapteno, carbohidrato, biotina, derivado de biotina, porción fosforescente, porción luminiscente, porción electroquimioluminiscente, porción cromática y una porción que tiene una resonancia de giro de electrón detectable, capacitancia eléctrica, constante dieléctrica, o conductividad eléctrica. 45. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el nucleotido etiquetado se etiqueta con una molécula fluorescente. 46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque los nucleótidos de terminación se etiquetan con una molécula fluorescente. 47. Un método para detectar una anormalidad cromosomal en una muestra, el método caracterizado porque comprende: (a) determinar la secuencia de alelos de un lugar cromosomal de interés a partir del ADN de plantilla, en donde la determinación de la secuencia de los alelos comprende: (1) amplificación del lugar cromosomal de interés, en donde la reacción de amplificación comprende un cebador delantero, un cebador inverso y una sonda que combina los pares base del lugar cromosomal de interés que esta dentro de la región del amplicón y además en donde la sonda contiene un colorante reportero en un extremo de la sonda y un colorante de detención en el otro extremo de la sonda y (2) detección de los productos PCR; en donde la cantidad del producto PCR se usa para determinar la presencia o ausencia de una secuencia genética específica. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porgue la amplificación es por PCR. 49. El método de conformidad con la reivindicación 47 , caracterizado porgue la sonda contiene un colorante reportero en el extremo 5 ' y en el extremo 3 ' contiene un colorante de detención. 50. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porgue los productos PCR se detectan usando el sistema de detección de secuencias ABI 7700. 51. El método de conformidad con las reivindicaciones 13, 17, 24, 25, 29, 37, y 47, caracterizado porgue se ha agregado un inhibidor de la lisis celular a la muestra 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el inhibidor de la lisis celular es formalina en un porcentaje seleccionado del grupo que consiste de: 0.0001-0.03%, 0.03-0.05%, 0.05-0.08%, 0.08-0.1%, 0.1-0.3%, 0.3-0.5%, 0.5-0.7%, 0.7-0.9%, 0.9-1.2%, 1.2-1.5%, 1.5-2%, y 2-3%. 53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la concentración de formalina en la muestra es 0.1%. 54. Una composición caracterizada porque comprende ADN fetal y el ADN materno, en donde el porcentaje del ADN fetal libre en el ADN libre total de la composición se selecciona del grupo que consiste de alrededor de 15-16% de ADN fetal, alrededor de 16-17% de ADN fetal, alrededor de 17-18% de ADN fetal, alrededor de 18-19% de ADN fetal, alrededor de 19-20% de ADN fetal, alrededor de 20-21% de ADN fetal, alrededor de 21-22% de ADN fetal, alrededor de 22-23% de ADN fetal, alrededor de 23-24% de ADN fetal, alrededor de 24-25% de ADN fetal, alrededor de 25-35% de ADN fetal, alrededor de 35-45% de ADN fetal, alrededor de 45-55% de ADN fetal, alrededor de 55-65% de ADN fetal, alrededor de 65-75% de ADN fetal, alrededor de 75-85% de ADN fetal, alrededor de 85-90% de ADN fetal, alrededor de 90-91% de ADN fetal, alrededor de 91-92% de ADN fetal, alrededor de 92-93% de ADN fetal, alrededor de 93-94% de ADN fetal, alrededor de 94-95% de ADN fetal, alrededor de 95-96% de ADN fetal, alrededor de 96-97% de ADN fetal, alrededor de 97-98% de ADN fetal, alrededor de 98-99% de ADN fetal, y alrededor de 99-99.7% de ADN fetal. 55. Una composición caracterizada porgue comprende un ADN fetal y un ADN materno, en donde el porcentaje del ADN fetal libre en el ADN libre total de la composición se selecciona del grupo que consiste de alrededor de 15-16% de ADN fetal, alrededor de 16-17% de ADN fetal, alrededor de 17-18% de ADN fetal, alrededor de 18-19% de ADN fetal, alrededor de 19-20% de ADN fetal, alrededor de 20-21% de ADN fetal, alrededor de 21-22% de ADN fetal, alrededor de 22-23% de ADN fetal, alrededor de 23-24% de ADN fetal, alrededor de 24-25% de ADN fetal, alrededor de 25-35% de ADN fetal, alrededor de 35-45% de ADN fetal, alrededor de 45-55% de ADN fetal, alrededor de 55-65% de ADN fetal, alrededor de 65-75% de ADN fetal, alrededor de 75-85% de ADN fetal, alrededor de 85-90% de ADN fetal, alrededor de 90-91% de ADN fetal, alrededor de 91-92% de ADN fetal, alrededor de 92-93% de ADN fetal, alrededor de 93-94% de ADN fetal, y alrededor de 94-95% de ADN fetal. 56. Un método de diagnóstico prenatal caracterizado porgue comprende analizar una composición que comprende ADN fetal y ADN materno, en donde el porcentaje del ADN fetal libre en el ADN libre total de la composición seleccionada del grupo que consiste de alrededor de 15-16% de ADN fetal, alrededor de 16-17% de ADN fetal, alrededor de 17-18% de ADN fetal, alrededor de 18-19% de ADN fetal, alrededor de 19-20% de ADN fetal, alrededor de 20-21% de ADN fetal, alrededor de 21-22% de ADN fetal, alrededor de 22-23% de ADN fetal, alrededor de 23-24% de ADN fetal, alrededor de 24-25% de ADN fetal, alrededor de 25-35% de ADN fetal, alrededor de 35-45% de ADN fetal, alrededor de 45-55% de ADN fetal, alrededor de 55-65% de ADN fetal, alrededor de 65-75% de ADN fetal, alrededor de 75-85% de ADN fetal, alrededor de 85-90% de ADN fetal, alrededor de 90-91% de ADN fetal, alrededor de 91-92% de ADN fetal, alrededor de 92-93% de ADN fetal, alrededor de 93-94% de ADN fetal, y alrededor de 94-95% de ADN fetal.