MXPA05000361A

MXPA05000361A - Metodos de tratamiento de infecciones microbianas en humanos y animales.

Info

Publication number: MXPA05000361A
Application number: MXPA05000361A
Authority: MX
Inventors: Minerva Amorette Hughes
Original assignee: Fasgen Llc
Priority date: 2002-07-09
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2005-09-20
Also published as: AU2003248896B2; KR20050047519A; SG149701A1; EP1539147A4; CN101721412A; AU2003248896A1; EA200500177A1; IL166122A0; BRPI0312654A2; JP2005533834A; ZA200500166B; JP4493494B2; CA2491573A1; US20060135568A1; WO2004004712A1; CN1671384A; EP1539147A1

Abstract

Se describe un metodo de tratamiento de un sujeto con una infeccion provocada por microbios, que comprende la administracion de un compuesto al sujeto. El compuesto es capaz de disminuir los niveles de ATP en el microbio por al menos 10% en comparacion con controles despues de 24 horas en una prueba in vitro, sin matar las celulas del mamifero durante el mismo periodo de tiempo. La disminucion de los niveles de ATP se mide por: (1) retirar las celulas del sitio de prueba y colocarlas sobre hielo; (2) cosechar las celulas a 4°C por centrifugacion y romperlas con agitacion en lecho en un amortiguador de extraccion de ATP; (3) retirar los desechos celulares por centrifugacion a 4°C, dejando un sobrenadante que contiene ATP; (4) medir la cantidad de ATP presente en el sobrenadante por un ensayo de bioluminiscencia a 4°C.

Description

METODOS DE TRATAMIENTO DE INFECCIONES MICROBIANAS EN HUMANOS Y ANIMALES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las infecciones basadas en microbios permanecen como un problema de salud pública mayor en los Estados Unidos y en todo el mundo. Por ejemplo, la tuberculosis representa un problema de salud significativo en los Estados Unidos y globalmente . La tuberculosis (TB) es la causa que conduce a la muerte debido a un agente infeccioso simple en el mundo. Se cree que aproximadamente 1,860 millones de personas o 32% de la población mundial se infectan con Mycobacterium tuberculosis (M. tb. ) . Existen aproximadamente 8 millones de nuevos casos activos de TB por año y aproximadamente 2 millones de muertes . Esto se traduce en una tasa de mortalidad de 200 personas cada hora y 5000 personas cada día. Los pacientes con infección por VIH demuestran una susceptibilidad significativamente incrementada a M. tb. con un riesgo aproximado de 50 veces de incremento sobre pacientes sin VIH (12, 45) . Similarmente, la velocidad de la progresión de TB latente hacia la enfermedad activa después de la infección inicial es mayor del 40% en comparación a aproximadamente 5% en individuos no infectados con VIH. Con la expansión continua deL VIH globalmente, particularmente REF161285 en Asia y en el subcontinente Indio, se puede esperar que se incremente la incidencia y la mortalidad de TB solamente. La incidencia incrementada en las cepas de M. tb. resistentes a uno o más agentes de primera línea, estándares, intensifica la necesidad de la identificación del desarrollo de nuevos objetivos y fármacos. MDR-TB (tuberculosis resistente a múltiples fármacos) es difícil y caro de tratar, ya . que está asociada con tasas de mortalidad significativamente mayores que TB susceptible a fármaco. En ausencia de prevención y medidas terapéuticas efectivas, MDR-TB se volverá un problema incrementado e incontrolable. Existe una necesidad significativa de fármacos mejorados contra la tuberculosis con toxicidad reducida, actividad contra MDR-TB, mecanismos alternativos de acción, y actividad contra la enfermedad latente . A pesar de los avances en la prevención y el tratamiento de tuberculosis en las pasadas cinco décadas, persisten obstáculos signif cativos antes de que se pueda anticipar el control de esta enfermedad. El estándar actual de estrategias de cuidado son difíciles de implementar y mantenerse, particularmente en países no industrializados, de bajo ingreso, los cuales carecen de recursos financieros o inf aestructura para soportar un programa de control de TB que incluya todo o que sea efectivo. El surgimiento de MDR-TB amenaza revertir mucho del progreso realizado hasta la fecha en el control de TB. Diversas clases promisorias de fármacos están en desarrollo incluyendo rifamicinas que actúan a largo plazo, fluoroquinolonas , oxazolidinonas , y nitroimidazoles . Sin embargo, dada la proporción exitosa de nuevos compuestos que están en uso clínico - aproximadamente 0.5% - existe una necesidad de descubrir e identificar nuevos objetivos micobacterianos únicos a desarrollar. No hay fármacos nuevos antimicobacterianos con nuevos mecanismos de acción que se hayan desarrollado en los pasados treinta años.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN Un objetivo de esta invención es proporcionar un método de tratamiento de una infección provocada por microbios, por administración de un compuesto, que interfiere con el metabolismo de la energxa central del microbio. Un objetivo adicional de la invención comprende la administración de un compuesto que inhibe la síntesis de ATP en microbios y que interfiere con la respiración celular de tales microbios. Un objetivo m s de la invención comprende la administración de un compuesto que provocará una disminución en los niveles de ATP [M] de al menos 10% con relación al control.

Un objetivo adicional de la invención comprende un método de tratamiento de un sujeto con una infección provocada por microbios, que comprende la administración de una cantidad efectiva del compuesto a un sujeto en necesidad de tratamiento, en donde el compuesto produce sobreexpresión de la subunidad b de ATP-sintasa. Un objetivo adicional de esta invención es proporcionar ciertos compuestos que, cuando se administran a personas o animales con una infección microbiana, pueden tratar la infección a través de los mecanismos descritos anteriormente : La figura 1 muestra la estructura general y la función de ATP-sintasa. La figura 2 muestra los perfiles de electroforesis en gel de proteina, bidimensionales de BCG control vs tratados con OSA (100 pg/ml) a 4 horas postratamiento. Las figuras 3A y 3B son la comparación de expresión de atpf, que codifica para la subunidad b de ATP-sintasa (Rvl306) y hsp, (Rv0251c) en el desarrollo de BCG en presencia o ausencia de OSA. La figura 4 es el experimento de curso de tiempo que mide el nivel de ATP en cultivos de BCG tratados con OSA o diciclohexilcarbodiimida comparados con controles no tratados . Las figuras 5A-5B son la concentración de ATP/CETJ en BCG después de 5 minutos de exposición a OSA, inhibidores conocidos de respiración y agentes antimicobacterianos. Las figuras 6A y 6B muestra la potenciación de la actividad inhibitoria de OSA a baja concentración de etanol (0.05%) contra M. tuberculosis. La figura 7 muestra una comparación de los efectos de OSA (100 µ / l) , DCCD (100 µg/ml) , y TTFA (100 //g/ml) sobre síntesis de ácido micólico después de 10 minutos de exposición en cultivos de fase logarítmica temprana de BCG.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La figura 1, que se deriva de Dimroth, et al., "Operation of the F (U) motor of the ATP synthase," (2000) 1458: 374-38S muestra esquemáticamente la estructura de F1F0.ATP sintasa (ATPasa) . ATPasa utiliza la energía de la fuerza motriz de protones para generar ATP. Este complejo enzimático consiste de sectores transmembranales (F0) y citosólicos (Fl) . El movimiento de protones a través del componente F0, se piensa que se acopla reversiblemente a la síntesis de ATP o a la hidrólisis en sitios catalíticos sobre Fl . En E. coli , Fl y F0 consisten de las siguientes subunidades, a3ß3?de, y aib2Ci2, respectivamente. En general, las subunidades homologas se encuentran en mitocondrias y cloroplastós , aunque pueden existir diferencias entre los sistemas procarióticos y eucarióticos . La síntesis de ATP se impulsa por el movimiento de protones a través de F0. Sin embargo, la estructura completa y el mecanismo de acoplamiento no se han establecido totalmente . La reticulación de la subunidad b con otro componente de la membrana FO (subunidad c) en E. coli dio como resultado el desacoplamiento de hidrólisis de ATP y bombeo de protones accionado por ATP. Similarmente , se encontró una mutación de desacoplamiento en E. coli que afecta la subunidad b de FO involucrando una sustitución de aminoácido simple, que anula toda la función enzimática. Este fenotipo sugiere un papel funcional para la subunidad b en el acoplamiento de translocación de protones a- catálisis. La interacción de la subunidad b con componentes de Fl puede ser tanto dinámica como estructural por naturaleza. Más recientemente, Struglics y colaboradores han mostrado que la subunidad b de mitocondrias se fosfórala reversiblemente . Los autores sugieren que el papel fisiológico de tal fosforilación puede controlar la estabilidad de la interacción de F0-F1 y por lo tanto regular el acoplamiento de energía en el motor de F0-F1. Como tal, la subunidad b de FO podría jugar un papel tanto estructural como funcional en la operación de ATPasa. La inhibición de este complejo particular podría ocurrir a través de la interacción directa con la subunidad b o un componente membranal asociado de FO, dando como resultado un deterioro significativo de la generación de ?? . El estudio significativo de este posible mecanismo se ha emprendido con n-octansulfonilacetamida (OSA) un compuesto de la clase cc-sulfonilcarboxamidas , que tiene actividad potente in vitro contra micobacterias patógenas. OSA se describe en la Solicitud PCT No. PCT/US98/17830, la cual se incorpora por referencia en la presente. La identificación del objetivo enzimático de OSA en bacilos Calmette-Guérin (BCG, por sus siglas en inglés) se intentó utilizando electroforesis en gel de proteína bidimensional y secuenciamiento subsecuente de proteínas sobreexpresadas en presencia del compuesto. El tratamiento de OSA en BCG dio como resultado la sobreexpresión de 2 proteínas relativamente pequeñas (¾ 18 kD) : la subunidad b de ATP-sintasa (F1F0 ATPasa) codificada por el gen atpF y una proteína de choque térmico pequeña, hsp (Rv0251c) . RT-PCR reveló un incremento notable en el nivel de expresión de hsp y a un menor grado de la subunidad b de ATP-sintasa, un patrón consistente con el observado en los geles bidimensionales . Para evaluar si estos resultados podrían representar una respuesta potente generalizada al daño celular, se llevaron a cabo perfiles proteicos bidimensionales en presencia de cerulenina, un compuesto antimicobacteriano potente, e isoniazida, otro potente compuesto anti-TB. Ni el tratamiento con cerulenina, ni con isoniazida dio como resultado la sobreexpresión de la protelna en BCG, indicando que OSA funciona a través de un mecanismo diferente al de la cerulenina o al de isoniazida. Se obtuvo información adicional mediante la comparación de perfiles proteicos bidimensionales de M. smegmatis con BCG tratados con OSA. Previamente, se había reportado que M. smegmatis fue intrínsecamente resistente a OSA en concentraciones hasta el límite de solubilidad (100 µ9/p?1) . Los homólogos de ambas proteínas BCG se buscaron por una investigación de BLAST de la secuencia genómica de M. smegmatis disponible a través del Instituto para la Investigación Genómica, Rockville, D (http//w w. tigr.org) y se encontró que están presentes en M. smegmatis. Sin embargo, existen regiones de disimilitud entre las dos. La subunidad b parece escasamente similar entre estas dos especies micobacterianas (63% idéntica, 75% similar) , sin embargo, el hsp es menor así (42% idéntico, 54% similar) . Los pesos moleculares estimados para la subunidad b y los homólogos de hsp son de 16 y 18 kD, respectivamente. Sin embargo, ninguna proteína consistente con estos pesos moleculares o pl ' s fue sobreexpresada en M. smegmatis tratada con OSA. La sobreexpresion de la subunidad b de ATP-sintasa indica el posible involucramiento de ATP-sintasa, ya sea directo o indirecto, en la ruta objetivo de OSA. Con base en estas observaciones, se emprendieron experimentos de punto de tiempo simple y curso de tiempo para determinar los niveles de ATP [M] en presencia de OSA en comparación con DCCD, un inhibidor de ATP-sintasa no específico, conocido. Los niveles de ATP [M] disminuyeron significativamente después del tratamiento con OSA y DCCD en todas las pruebas de puntos de tiempo. No solamente estuvo esta disminución reproducible para ambos compuestos, sino que ocurrió muy rápidamente en tan poco tiempo como cinco minutos después de la exposición. Para determinar si este efecto era específico del compuesto o el resultado de una respuesta generalizada al estrés, se probaron fármacos antimicobacterianos adicionales e inhibidores de la respiración para su habilidad para afectar el nivel de ATP[M] en puntos de tiempo correspondientes. Los agentes antimicobacterianos de primera línea incluyeron INH, RIF, STR, EMB, y cerulenina. Los inhibidores de la respiración incluyeron dicumarol (un inhibidor de deshidrogenasa alternativo) , Rot (un inhibidor del complejo I) , y TTFA (un inhibidor del complejo II) . Todos los fármacos de primera línea se utilizaron en niveles comparables al de OSA (16x sus respectivos MIC's en BCG) . Significativamente, no se detectó disminución apreciable en el nivel de ATP [M] en cinco minutos después de la exposición para cualquiera de los fármacos de primera línea o los inhibidores respiratorios probados. La única excepción fue TTFA, un inhibidor específico del complejo II, que demuestra una disminución moderada en el nivel de ATP [M] en cinco minutos. Esto no es sorprendente ya que este inhibidor específicamente se dirige al objetivo de succinato-deshidrogenasa (complejo II), que es una parte integral del ciclo de TCA. Sin este complejo enzimático, el ciclo de TCA se daña severamente. Como resultado, la respiración aeróbica se llega a dañar, haciendo lenta la producción de ATP. Por lo tanto, OSA minimizó el efecto del inhibidor DCCD de ATP-sintasa, no específico, perfectamente documentado. En comparación, otros agentes antimicobacterianos fallaron para producir un efecto similar. Se condujeron estudios similares con los siguientes compuestos : La prueba de estos compuestos reveló resultados similares como se muestra con OSA; es decir, mostraron una habilidad para disminuir los niveles de ATP[M] en puntos de tiempo correspondientes, en comparación con los controles. La disminución inducida por OSA en el nivel de ATP se acompañó por la sobreexpresión de hsp (Rv0251c) . Sin limitar el alcance de la invención, esto sugiere la posibilidad de que la respuesta al choque térmico puede estar enlazada a la sensibilidad de energía/regulación en micobacterias . Hsp (Rv0251c) codifica para una proteina relativamente pequeña de 150 aminoácidos y es un miembro de la familia hsp20 ó µ-cristalina de proteínas de choque térmico pequeñas. Recientemente, Stewart et al (2002), demostraron que hsp (denominado acr2 por los autores) fue el gen más inducible al calor en el genoma micobacteriano . Hsp también se acomoda en un operón aparente con Rv0250c y Rv0249c. La regulación de hsp involucra el represor de choque térmico, HspR y un factor s? sigma ECF. El último está también suprarregulado durante la tensión oxidativa o detergente y lleva similitud marcada al a-cristalino (acr) (antígeno de 14 kDa) de M. tuberculosis (41% de identidad sobre 98 aminoácidos) . La respuesta al choque térmico es ubicua y permite que las células sobrevivan bajo condiciones de estrés tanto normal como dañino. Esta supervivencia frecuentemente requiere cambios globales en la expresión génica. La mayoría de las proteínas de choque térmico son consideradas como chaperones moleculares, que ayudan en el pliegue de proteínas/degradación y previenen la agregación proteica. En general, las proteínas de choque térmico tienen especificidad de sustrato relativamente grande. Sin embargo, la evidencia emergente ha identificado la existencia de chaperones específicos de enzima, que son esenciales para la formación de complejos enzimáticos específicos. Los ejemplos de chaperones específicos de enzima incluyen los genes de levadura ATP10, ATP11, y ATP12, los cuales codifican proteínas que se requieren para el ensamble de ATP-sintasa. Se han identificado chaperones específicos de enzima, adicionales que son necesarios para la formación de citocromo-oxidasa, succinato-reductasa (complejo II) , y NADH-ubiquinon-oxidorreductasa (complejo I) . Muchos de estos chaperones específicos de enzima caen en la clase Hsp20 de chaperones moleculares. Adicionalmente, algunos chaperones moleculares son sujetos a la regulación de redox. El papel funcional completo de la micobacteria hsp es ampliamente desconocido. Sin embargo, existe la posibilidad de que esta proteína de choque térmico pueda jugar un papel en el ensamble específico de enzima/regulación de ATP-sintasa u otros complejos asociados en la cadena respiratoria. Hsp también puede representar una versión micobacteriana de una proteína de choque térmico regulada por redox. - La conclusión de la interferencia mediada por OSA en el metabolismo de energía central se reforzó adicionalmente por la potenciación de actividad con etanol . Se sabe que las micobacterias pueden utilizar bajas concentraciones de etanol y otros alcoholes de cadena corta como fuentes de carbono. El etanol es un sustrato respiratorio, que se oxida reversiblemente al acetaldehído con la reducción concomitante de NAD por alcohol-deshidrogenasa . La oxidación subsecuente de acetaldehído produce ácido acético, el cual es posteriormente convertido a acetil-CoA en una reacción dependiente de ATP. Acetil-CoA, es una molécula crítica en el metabolismo central. La oxidación de acetil-CoA a través del ciclo de TCA impulsa la producción de energía celular. De este modo, se interconectan el metabolismo de etanol y la respiración. Investigadores anteriores han mostrado que el etanol incrementa la velocidad de síntesis de ATP en mitocondrias de mamíferos, como resultado de la producción incrementada de NADH + H+ que conduce a flujo de protones elevado a través de la cadena respiratoria. Las proporciones de ATP/O se incrementan después de la adición de etanol, lo que indica una conversión energética incrementada entre la respiración y la síntesis de ATP. En este estudio, es- improbable que el etanol y OSA compartan el mismo objetivo. Sin embargo, acetil-CoA elevado en etanol y NADH + H+ serían dañinos para la célula en el caso en que ATP-sintasa u otros componentes de la cadena respiratoria se dañaran. En tal caso, sería posible la potenciación de OSA y etanol. La inhibición de la síntesis de ATP y la interferencia con la respiración celular podría producir múltiples efectos a la baja. Éstos incluyen una disminución en la síntesis dependiente de energía de . otras macromoléculas , tales como ácidos micólicos. Previamente, reportamos que OSA disminuye los niveles de ácido micólico en BCG, sin efecto aparente sobre intermediarios en esta ruta biosintética . Esta observación estuvo en agudo contraste al patrón de inhibición de micolato observado con tiolactomicina y cerulenina, conocidos inhibidores de sintasa de ácido graso. Estos hallazgos indican que la inhibición de la síntesis de ácido micólico por OSA y otras -sulfonilcarboxamidas , podría involucrar un mecanismo alternativo diferente de la inhibición de sintasa de ácido graso . El uso de compuestos que puedan disminuir selectivamente los niveles de ATP, como OSA y los compuestos I-VIII, ayudarán en el tratamiento tanto de pacientes que actualmente sufren de TB (incluyendo MDR-TB) , y millones de pacientes potenciales cuya enfermedad oculta inactiva se podría convertir en activa como resultado de la inmunosupresión u otra enfermedad sistémica. Tales compuestos también se podrían utilizar contra una variedad de otros microorganismos, tales como M. aviura-intracellulare, M. leprae, M. paratuberculosis, M. ulcerans, y Rhodococcus, y pueden ser utilizados tanto en humanos como en animales, tales como caballos, ganado vacuno, ovejas, cabras , y otros rumiantes . El tratamiento de acuerdo a la invención involucra administrar un compuesto que disminuye selectivamente los niveles de ATP en microorganismos a un sujeto en tratamiento. Las composiciones farmacéuticas que contienen cualesquiera compuestos tales se pueden administrar por la ruta parenteral (subcutáneamente, intramusculármente, intravenosamente, intraperitonealmente, intrapleuralmente, intravesiculármente, o intratecalmente) , tópica, oral, rectal, nasal, o inhalación, como se necesite por el compuesto, portador farmacéutico, o enfermedad. Los compuestos se formulan preferentemente en composiciones f rmacéuticas que contienen el compuesto y un portador farmacéuticamente aceptable. La concentración del agente activo dependerá de su solubilidad en el portador, y se puede determinar fácilmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Similarmente , la dosis utilizada en una formulación particular se determinará por el microbio particular contra el cual se empleará. La composición farmacéutica puede comprender otros componentes, siempre y cuando éstos no nieguen la efectividad del compuesto activo. Los portadores farmacéuticos son bien conocidos, y una persona de experiencia en la técnica puede seleccionar el o los correctos, dependiendo de la ruta particular de administración. La dosis y la duración de la terapia dependerán de una variedad de factores, incluyendo el índice terapéutico de los fármacos, tipo de enfermedad, edad del paciente, peso del paciente, y tolerancia de toxicidad. La dosis usualmente se elegirá para lograr los niveles de concentración en suero desde aproximadamente 1 ng hasta 100 µg/tül, típicamente de 0.1 µ /t?1 hasta 10 µg/ml . Preferentemente, los niveles de dosis inicial se seleccionarán con base en su habilidad para lograr concentraciones ambientales mostradas que sean efectivas en modelos in vi tro e in vivo y en pruebas clínicas . La dosis de un fármaco particular y la duración de la terapia para un sujeto particular se pueden determinar por un médico experto utilizando procedimientos farmacológicos estándares observando los factores anteriores . La respuesta al tratamiento se puede monitorear por análisis de sangre o de niveles de fluidos corporales del compuesto activo, medición de actividad del compuesto o sus niveles en tejidos relevantes, o monitoreo del estado de enfermedad del sujeto. El médico experto ajustará la dosis y la duración de la terapia con base en la respuesta al tratamiento, revelada por estas mediciones. El compuesto, por supuesto, será administrado a un nivel inferior al nivel que mataría al sujeto, y preferentemente a un nivel inferior al que podría dañar irreversiblemente las funciones vitales . La administración a un nivel que matara algunas células del paciente que pudieran ser regeneradas (por ejemplo células endometriales) no se excl ye .

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, el alcance de la invención. Micobacterias y condiciones de crecimiento. Se utilizaron en este estudio Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) M. bouis BCG (BCG, cepa Pasteur, ATCC 35734) y M. smegmatis (me2 6 l-2c) . Las cepas se mantuvieron sobre placas de agar Lowenstein-Jensen o placas de agar Middlebrook 7H10 (Difco, Detroit, Michigan) . Para todos los ensayos, los cultivos de BCG se desarrollaron a 37°C sobre un agitador rotatorio a fase semilogarítmica (DO = ASOo 0.3 - 0.4) .

Compuestos. Soluciones de reserva y de trabajo de n-Octansulfonilacetamida (OSA, Craig Townsend, Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland) , diciclohexilcarbodiimida, un inhibidor específico de ATP-sintasa (DCCD, ICN, Costa Mesa, California) , tenoiltrifluoroacetona, un inhibidor respiratorio del complejo II (TTFA, ICN) , rotenona, un inhibidor respiratorio del complejo I (Rot, ICN) , y cerulenina, un inhibidor de sintasa de ácido graso (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), se constituyeron en sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma) . .Las soluciones de reserva de isoniazida (INH) , estreptomicina (STR) , y etambutol (EMB) (todos de Sigma) se prepararon en agua estéril. Las soluciones iniciales de reserva de rifampina (Sigma) se constituyeron en metanol con diluciones subsecuentes en agua estéril . Preparación de Compuestos I, II, IV, VI, y VIII La síntesis de cada uno de estos compuestos inició con ácido 3-sulfonilundecanoico ("IX"), que se preparó siguiendo el procedimiento descrito en J. Med. Chem. 2000 43 (17) 3304.

Compuesto I A un matraz de fondo redondo, secado a la flama, que contenia 3 mi' de cloruro de metileno anhidro, se agregó ácido 3-sulfonilundecanoico IX, 150 mg, 0.6 mmol, y 1,1-carbonildiimidazol (CDI) , , (102 mg, 0.63 mmol), bajo una atmósfera inerte. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente se agregó clorhidrato de 2-cloroetilamina (73 mg, 0.63 mmol) y la reacción se agitó por 3 horas adicionales. El trabajo acuoso proporciona la amida cruda X (145 mg, 88%) con rendimientos satisfactorios. La amida X se utilizó cruda para química posterior. (CDC13, 300 Hz) d 6.86 (s amplio, 1H) , 3.87 (s, 2H) , 3.67-3.65 (m, 4H), 3.15 (t, J = 8.1 Hz, 2H) , 1.89-1.80 (m, 2H) , 1.40-1.26 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H) . Amida X (110 mg, 0.33 mmol) se disolvió en 1.5 mi de hidróxido de potasio metanólico (5% p/v) . Después de agitar a temperatura ambiente por 2 horas, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó dos veces con salmuera, se secó y se concentró a vacio. La oxazolina cruda se purificó por cromatografía instantánea en columna (1:1 Hex/EtOAc) para proporcionar 70 mg, 73% de rendimiento, del producto deseado I; punto de fusión 53-55 °C ½ (CDCI3, 400 MHz) d 4.37 (t, J = 9.6 Hz, 2H) , 3.95 (s, 2H) , 3.95 (t, J = 9.4 Hz, 2H) , 3.22 (t, J = 8.2 Hz, 2H) , 1.90-1.79 (m, 2H) , 1.46-1.42 (m, 2H) , 1.30-1.23 (m, 12H) , 0.87 (t, J = 6.0 Hz, 3 H) .

Compuesto II A un matraz de fondo redondo, secado a la flama, que contenia 3 mi de cloruro de metileno anhidro, se agregó ácido 3-sulfonilundecanoico IX (150 mg, 0.6 mmol) y CDI, (102 mg, 0.63 mmol), bajo una atmósfera inerte. La mezcla .se agitó a temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente se agregó hidrazida isonicotinica (86 mg, 0.63 mmol) y la reacción se agitó por 6.5 horas adicionales. La mezcla de reacción se concentró a vacio y la hidrazida cruda II se purificó por cromatografía instantánea (98% EtOAc/2% ácido acético) para dar un sólido blanco, 122 mg, 56%. ""? (??30-<¾, 400 Hz) d 10.98 (s amplio, 1H) , 10.57 (s amplio, 1H) , 8.77 (s amplio, 2H) , 7.78 (d x d, Ji = 1.2 Hz, J2 = 5.4 Hz, 2H) , 4.21 (s, 2H) , 3.30 (t, J = 8 Hz) , 1.76-1.68 (m, 2H) , 1.42-1.34 (m, 2H), 1.30-1.23 (m, 12H) , 0.84 (t, J = 6.8'Hz) Compuesto IV A un matraz de fondo redondo, secado a la flama, que contenia 3 mi de cloruro de metileno anhidro, se agregó ácido 3-sulfonilundecanoico, 158.4 mg (0.6 mmol) , y 1,1-carbonildiimidazol (CDI) , 115.7 mg (0.72 mmol), bajo una atmósfera inerte. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente se agregó hidrazida 2-furoica, 90 mg (0.72 mmol) y la reacción se agitó por 3 horas adicionales. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó dos veces con bicarbonato de sodio saturado, tres veces con HC1 diluido, y una vez con NaCl saturado. Los materiales orgánicos se secaron con sulfato de magnesio y se concentraron bajo presión reducida. El producto crudo IV se recristalizó a partir de EtOAc/Hex (3:1) para dar un polvo café claro (147 mg, 66%) ; punto de fusión 130-131°C; 1H (DMS0-d6, 400 MHz) d 10.53 (s, 1H) , 10.38 (s, 1H) , 7.90 (d x d, Ja = 0.4 Hz, J2 = 1.6 Hz, 1H) , 7.24 (d x d, Jl = 0.6 Hz, J2 = 3.4 Hz), 6.65 (d x d, Jl = 1.6 Hz, J2 = 3.6 Hz) , 4.17 (s, 1H) , 3.28 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 1.75-1.67 (m, 2H) , 1.42-1.33 (m, 2H) , 1.30-1.23 (m, 12H) , 0.84 (t, J = 6.8 Hz, 3 H) .

Compuesto VI A un matraz de fondo redondo, secado a la flama, que contenia 3 mi de cloruro de metileno anhidro, se agregó ácido 3-sulfonilundecanoico (163 mg, 0.62 mmol) , CDI (113.9 mg, 0.74 mmol), bajo una atmósfera inerte. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente se agregó trietilamina (TEA) (89 µ?, 0.63 mmol), y clorhidrato de 4-clorofenilhidrazina (115 mg, 0.62 mmol) y la reacción se agitó por 2 horas adicionales. El producto crudo VI se purificó por cromatografía instantánea (40% EtOAc/60% Hex) . (112 mg, 46% de rendimiento) . ½ (DMSO-d6, 400 MHz) d 10.13 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 8.14 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 7.18- 7.14 (m, 2H), 6.78-6.72 (m, 2H) , 4.12 (s, 2H) , 3.24 (t, J = 7.8 Hz, 3H) , 1.74-1.66 Hz (m, 2H) , 1.40-1.32 (m, 2H) , 1.30- 1.23 (m, 12H) , 0.84 (t, J = 6.8 Hz, 3 H) .

Compuesto VIII A un matraz de fondo redondo, secado a la flama, que contenia 3 mi de cloruro de metileno anhidro, se agregó ácido 3-sulfonilundecanoico (300 mg, 1.1 mmol), CDI (214 mg, 1.3 mmol), bajo una atmósfera inerte. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente se agregó TEA (154 µ?, 1.1 mmol), y clorhidrato de metil- glicinato (138 mg, 1.1 mmol) y la reacción se agitó por 4 horas adicionales. El éster crudo VIII se purificó por cromatografía instantánea (50-100% EtOAc/Hex) para dar un sólido blanco (202 mg, 56%); punto de fusión 82-84°C; aH (CDC13, 400 Hz) d 7.13 (s amplio, 1H) , 4.07 (d, J = 6 Hz, 2H) , 3.93 (s, 2H) , 3.77 (s, 3H) , 3.23 (t, J = 8 Hz, 2H) , 1.90-1.82 (2H, m) 1.46-1.40 (m, 2H) , 1.30-1.25 (m, 12H) , 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3 H) ; 13C (CDCI3, 100 MHz).

Preparación del Compuesto III Este compuesto se preparó en una síntesis de 2 etapas, primero mediante la preparación del compuesto 7 a partir de ácido (±) -o¡-Metilen-Y-butirolacton-5-octil-4-carboxilico (C75) . C75 se puede preparar ' como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,981,575. 7 A una solución de C75 (30 mg, 0.12 mmol) en CH3CN (0.9 mi) se agregó óxido de tris- (2-oxo-3-oxazolinil) fosfina (91.7 mgr 0.2 mmol) , etanolamina (7.8 µ?, 0.13 mmol) y NEt3 (0.04 mi, 0.3 mmol) y la solución se dejó agitar por 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se vació en una solución de NH4C1 (sat) /HC1 1 N (10 mi, 3:1) y se extrajo con 3 porciones de 15 mi de Et20. Los materiales orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron, se evaporaron y se sometieron a cromatografía (35% EtOAc/Hexanos ) para dar el compuesto 7 (32 mg, 91%) después de cromatografía instantánea (50% EtOAc/Hexanos-100% EtOAc/2% CH3C02H) . RMN aH (300 MHz, CDC13) d 0.86 (t, J = 6.9 Hz, 3 H) , 1.24 (s, 10H) , 1.35-1.48 (m, 2H) , 1.64-1.75 (m, 2H) , 3.40-3.57 (m, 3H) , 3.74 (t, J = 5 Hz, 2H) , 4.73-4.79 (dt, J= 5.7 7 Hz, 1H) , 5.82 (d, J = 2 Hz, 1H) , 6.42 (d, J = 2 Hz, 1H) .

Al compuesto 7 (44.9 mg, 0.15 mmol) en CH2C12 (0.7 mi) se agregó dimetilaminopiridina (DMAP, 4 mg, 0.03 mmol) e isocianato de alilo (20 µ?, 0.22 mmol) y la solución se dejó agitar a temperatura ambiente por 1 hora. La mezcla se vació en NH4C1 (sat 10 mi) y se extrajo con 3 porciones de 10 mi de CH2CI2. Los materiales orgánicos se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio y se evaporaron para proporcionar el producto crudo 15. La cromatografía instantánea (EtOAc) proporcionó el producto puro 15 (19 mg, 33%) . RMN ½ (300 MHz , CDCI3) d 0.85 (t, J = 6 Hz, 3 H) , 1.24 (m, 11H) , 1.35-1.48 (m, 1H) , 1.62-1.79 (m, 2H) , 3.38-3.40 (m, 1H) , 3.51-3.52 (m, 2H) , 3.78 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 4.20-4.21 (m, 2H) , 4.73-4.79 (m, 1H) , 4.96 (t amplio, 1H) , 5.09-5.20 (m, 2H) , 5.75-5.86 (m, 1H) , 5.79 (d, J = 2.3 Hz, 1H) , 6.38 (d, J = 2.3 Hz, 1H) .

Preparación de los Compuestos V y VII Este compuesto se preparó en una síntesis con diversos intermediarios. En la primera etapa, el compuesto 23 se preparó como sigue: 23 A una mezcla de LiHMDS (6.2 mi, 6.20 mmol, 1 en THF) en THF (9.7 mi) a -78°C se agregó (±) -1 (1.00 g, 5.75 mmol) en THF (9.60 mi) por cánula gota a gota, y la solución resultante se agitó por 30 minutos a -78 °C. Posteriormente, se agregó a través de una cánula triflato de octilo (1.63 g, 6.20 mmol) en THF (4 mi) a -78°C. Después de agitación a -78°C por 2 horas, se agregó HC1 1 N (10 mi) y la solución se extrajo con 3 porciones de 15 mi de Et20. Los materiales orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se evaporaron. La cromatografía instantánea (2% EtOAc/Hexanos) dio el material 23 puro como una mezcla 2:1-6:1 de diastereoisómeros separables (1.33 g, 81%). RMN 1H (300 MHz, CDC13) d 0.86 (t, J = 6.5 Hz, 3 H) , 0.99 (s, 9H) , 1.24-1.26 (m, 12H) , 1.54 (s, 3H) , 1.72-1.84 (m, 2H) , 5.13 (s, 1H) ; RMN 13C (75 MHz, CDC13) d 13.9, 22.6, 24.9, 25.1, 25.9, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 35.2, 41.2, 55.3, 86.5, 177.7. IR (NaCl) 3443, 2929, 1829, 1769 cm"1; Análisis Calculado para C16H30OzS: C, 67.0; H, 10.6; Encontrado: C, 66.3; H, 10.5.

HRMS (El) m/z calculado para C16H3o02S+ (M+) 286.1967 observado 286.1969. Posteriormente, se preparó el compuesto 26: 25 26 Al compuesto 23 (650 mg, 2.27 mmol) en EtOH (14.1 mi) se agregó NaOEt (2.1 M) (2.16 mi, 4.54 mmol) (recién preparado a partir de metal Na (200 mg, 8.3 mmol) en EtOH (4.0 mi)) y la solución se dejó agitar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la solución se vació en NH4Cl(sat)/HCl 1 N (25 mi, 3:1) y esta mezcla se extrajo con 3 porciones de 20 mi de Et2Ü. Los materiales orgánicos combinados se lavaron con 3 porciones de 25 mi de H20, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se evaporaron para dar el compuesto crudo 25. Al compuesto 25 disuelto en 26 mi de CH2C12 a 0°C se agregó NEt3 (0.5 mi, 3.49 mmol) y cloruro de alquinilo (0.3 mi, 3.49 mmol). Después de 40 minutos a 0°C, se agregó 30 mi de H4Cl(sat) y la solución se extrajo con CH2CI2. Los materiales orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se evaporaron. La cromatografía instantánea (5% EtOAc/Hexanos) dio el compuesto puro 26 (542 mg, 79%). RMN¾ (300 Hz, CDC13) d 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 3H) ; 1.22-1.27 (m, 15H) , 1.61 (s, 3H) , 1.75-1.84 (m, 2H) , 2.26 (s, 3H) , 4.18 (q, J = 7.1 Hz, 2H) ; R N13C (75 MHz, CDC13) d 13.9, 14.1, 22.6, 23.4, 24.4, 29.1, 29.2, 29.6, 30.3, 31.8, 38.3, 55.8, 61.5, 173.1, 195.8. IR (NaCl) 3430, 1868, 1693, 1644 citf1; Análisis Calculado para C15H28O3S : C, 62.5; H, 9.78; Encontrado: C, 62.6; H, 9.83. A partir del compuesto 26, se preparó el compuesto 32: 32 Al compuesto 26 (500 mg, 1.7 mmol) en 27 mi de tolueno a -78 °C se agregó LiHMDS (4.3 mi, 4.3 mmol, 1.0 M en THF) y la solución se dejó calentar lentamente a -5°C. La solución se vació en 40 mi de HC1 1 N y se extrajo con 3 porciones de. 25 ral de EtOAc. Los materiales orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se evaporaron. La cromatografía instantánea (20% EtOAc/2% CH3C02H/Hexanos) dio el compuesto 32 (308 mg, 73%). RMN ¾ (300 MHz, CDCI3) (tautómero ceto) d 0.86 (t, J = 6 Hz, 3H) , 1.19-1.24 (m, 10H) , 1.48-1.53 (m, 2H) , 1.65 (s, 3H) , 1.77- 1.85 (m, 1H) , 1.94-2.01 (m, 1H) , 3.36 (s, 2H) ; RMN1H (300 MHz, McOD) (tautómero enol) 0.87-0.89 (m, 3H) , 1.29 (m, 10H) , 3.29 (s, 3H) , 1.81-1.87 (m, 2H) ; RMN13C (75 MHz, MeOD) (tautómero enol) d 14.7, 23.8, 26.4, 27.1, 30.5, 30.6, 30.8, 33.2, 39.8, 61.3, 103.1 (m) , 189.8, 197.8 IR (NaCl) 3422, 1593 cnf1; Análisis Calculado para C13H22O2S: C, 64.4; H, 9.15; Encontrado: C, 64.3; H, 9.10. Posteriormente, se preparó el compuesto 50: A partir del compuesto 32 (60 mg, 0.25 mmol) y bromoacetato de ter-butilo (73 µ?, 0.49 mmol) siguiendo el procedimiento general H, se obtuvo el compuesto 50 (62 mg, 70%) después de cromatografía instantánea (15% EtOAc/Hexanos) . RMN 1H (300 MHz, CDC13) d 0.86 (t, J = 7 Hz, 3H) , 1.24 (s, 12H) , 1.49 (s, 9H) , 1.68 (s, 3H) , 1.83-1.86 (m, 2H) , 4.43 (s, 2H) , 5.19 (s, 1H) ; RMN 13C (75 MHz, CDC13) d 14.0, 22.6, 25.2, 26.3, 28.1, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 38.9, 59.7, 68.5, 83.4, 102.1, 165.2, 185.5, 193.4. Análisis Calculado para C19H32O4S: C, 64.0; H, 9.05; Encontrado: C, 64.1; H, 9.08. En seguida, se preparó el compuesto 53 como sigue: Al compuesto 50 (65 mg, 0.18 mmol) disuelto en 1.4 mi de CH2CI2 se agregó ácido trifluoroacético (TFA) (0.7 mi) y la solución se agitó a temperatura ambiente por 4 horas. Los solventes se evaporaron y el material crudo se sometió a cromatografía (20% EtOAc/2% CH3C02H/Hexanos ) para dar el compuesto 53 puro (48 mg, 89%) . R N 2H (300 MHz, CDC13) d 0.86 (t, J = 6.9 Hz, 3H) , 1.24 (s, 11H) , 1.47-1.48 (m, 1H) , 1.68 (s, 3H) , 1.84-1.88 (m, 2H) , 4.62 (s, 2H) , 5.31 (s, 1H) ; RMN13C (75 MHz, CDC13) d 14.1, 22.6, 25.1, 26.1, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 38.9, 60.1, 67.7, 102.4, 169.8, 185.8, 195.4. IR (NaCl) 3442, 1645 cm"1; Análisis Calculado para C15H2 O4S: C, 59.9; H, 8.05; Encontrado: C, 60.0; H, 8.09. Finalmente, a partir del compuesto 53, se preparó el compuesto V. A una solución enfriada a 0°C del compuesto 53 (100 mg, 0.33 mmol) en 1.61 mi de CH2C12 se agregó clorhidrato de 1- [3- (dimetilamino) propil]-3-etilcarbodiimida (EDC) (128 mg, 0.43 mmol), DMAP (6.0 mg, 0.05 mmol), e hidrazida 2-furoica (54 mg, 0.43 mmol) . Esta mezcla se agitó a 0°C por 30 minutos, ..Luego se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó por 12 horas . La solución se vació en H4C1 (10 mi, sat) y se extrajo con 3 porciones de 10 mi de CH2CI2. Los materiales orgánicos combinados se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se evaporaron para dar el compuesto crudo V. La cromatografía instantánea (10% EtOAc/Hex) dio el compuesto puro V (91 mg, 68%). R N1!! (400 MHz, CDCl3) d 0.84 (t, J = 6.6 Hz, 3H) , 1.21 (m, 11H) , 1.43-1.47 (m, 1H) , 1.66 (s, 3H) , 1.81-1.86 (m, 2H) , 4.64 (s, 2H) , 5.42 (s, 1H) , 6.47 (dd, J = 1.6, 3.6 Hz, 1H) , 7.16 (d, J = 4 Hz, 1H) , 7.45 (m, 1H) , 9.32 (d, J = 4 Hz, 1H) , 9.44 (d, J = 4 Hz, 1H) ; RMN13C (100 MHz, CDCI3) d 14.0, 22.6, 25.3, 26.0, 29.2, 29.3, 29.5, 31.7, 38.8, 59.7, 69.1, 103.0, 112.3, 116.5, 145.1, 145.4, 156.4, 164.2, 184.8, 193.9. El compuesto VII también se preparó a partir del compuesto 53, como sigue: Al compuesto 53 (100 mg, 0.33 mmol) y clorhidrato de 4-clorofenilhidrazina (76.8 mg, 0.43 mmol) siguiendo el mismo procedimiento general que se utilizó para preparar el compuesto V (74 mg, 53%) después de cromatografía instantánea (50% EtOAc/Hex) . RMN XH (300 MHz, CDC13) d 0.86 (t, J = 6 Hz, 3H) , 1.24 (m, 11H) , 1.46-1.54 (m, 1H) , 1.71 (s, 3H) , 1.82-1.90 (m, 2H) , 4.57 (s, 2H) , 5.39 (s, 1H) , 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.18 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.38 (s, 1H) , 8.09 (s, 1H) ; .RMN13C (100 MHz, CDCl3) d 14.1, 22.6, 25.3, 26.1, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 38.8, 59.7, 69.7, 103.2, 114.7, 126.4, 145.8, 129.2, 165.9, 184.3,' 193.5. IR (NaCl) 2957, 1695, 1658, 1609 cm'1.

Ensayos de proteína: micobacterias y cultivos. Se agregaron ya sea DMSO (diluyente) , OSA (6.25 y 100 g/ml) , cerulenina (24 /¿g/ml) o isoniazida (1.0 ^g/ml) a 20 mi de control y cultivos tratados, respectivamente. Después de incubación adicional por 24 horas bajo las mismas condiciones, 2 mi de alícuotas de células se cosecharon por centrifugación (13,000 x g por 30 segundos), el sobrenadante se retiró, y el proceso se repitió una vez utilizando IX PBS. Los contenidos celulares de cada tubo se dividieron en 2 a 3 Eppendorfs (escasamente de 3 a 5 unidades OD por tubo) , y se agregaron 250 µ? de una solución de lisis que contenía urea 3 M (Sigma) , 0.5% Tritón X-100 (Sigma) , 500 mg de ditiotreitol (DTT) (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland) y 500 µ? de Pharmalyte (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) . Subsecuentemente, también se agregaron fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (Sigma) (100 /xg/ml) y leupeptina (2 ^g/ml) (Sigma) . Las mezclas que contenían las células y la solución de lisis se agitaron en lecho a velocidad máxima por 60 segundos en un agitador de lecho Biospec Mini-8 utilizando esferas de vidrio de 200-300 µta (Sigma) . Este proceso se repitió dos veces por muestra con intervalos de 30 segundos sobre hielo entre las agitaciones . El contenido de cada tubo se centrífugo (13,000 x g) un mínimo de 30 segundos y se eliminó el sobrenadante ,que contenía proteína. Se determinó la concentración de proteína utilizando un ensayo colorimétrico estandarizado (Coomassie Plus, Pierce, ockford, Illinois) y estándares de BSA (Pierce) en un espectrofotómetro Shimadzu UC-1201. Las muestras cuantificadas se tomaron en alícuotas y se congelaron a -70°C.

Ensayos de proteína: curso de tiempo. BCG de reserva (500 mi) se dividió en alícuotas de 150 mi y se agregaron ya sea DMSO u OSA (100 a los cultivos control y tratado respectivos seguidos por incubación y aireación a 37 °C por 1 hora. Se retiraron alícuotas de 20 mi de cada cultivo a intervalos por hora durante las primeras 4 horas después de la adición del compuesto, con puntos de tiempo extra a 16, 24 y 48 horas. Las células se cosecharon por centrifugación a baja velocidad, se lavaron una vez en agua destilada estéril, y se congelaron a -70 °C. Ensayos de proteína: geles 2-D y secuenciamiento de objetivos potenciales. Aproximadamente 250 µg de cada muestra de proteína se mezclaron con una solución que contenía urea 8 M, 0.5% de Tritón X-100, Pharmalyte 3-10, DTT, y unos pocos granos de azul de Bromofenol (Sigma) (240 µ? de volumen total/muestra) . Esta mezcla se utilizó para • rehidratar las tiras de pH de acrilamida comercialmente preparadas (gradiente 4-7) toda la noche a temperatura ambiente utilizando protocolos estándares del fabricante (Pharmacia Biotech) . Las tiras completamente rehidratadas se sometieron posteriormente a un sistema de gel proteico bidimensional de acuerdo a protocolos estandarizados (Pharmacia Biotech) [primera dimensión - 16 horas a 20°C, seguido por equilibrio de tiras de gel individuales en una solución que contenía Tris-HCl (pH 6.8), urea (8 M) , glicerol (30%) (Sigma) , SDS (1 mg/ml) ) (Sigma) y ya sea DTT o yodoacetamida (Sigma), respectivamente]. Después del equilibrio, las tiras se aplicaron a geles de acrilamida comercialmente preparados (245 x 110 x 0.5 mm, gradiente 8- 18%, Pharmacia) y se corrieron por 2 horas a 15°C siguiendo los protocolos estándares del fabricante (Pharmacia) . Se adquirieron estándares de peso molecular (intervalo del tamaño: 14 kD a 200 kD) de Gibco BRL, Life Technologies y se cargaron 10 µ? por gel. Se dio la visualizacion de proteínas por el azul de Coomassie (Sigma) tinción de geles toda la noche. La tinción en exceso se retiró con 2 a 3 lavados de metanol : agua : cido acético (9:9:2, Sigma). Las proteínas de interés provenientes de 4 geles se combinaron y los fragmentos de gel extirpados se lavaron dos veces en acetonitrilo al 50%. Se dio el secuenciamiento de proteína subsecuente por Microquímica de Harvard (Cambridge, Massachusetts) .

Extracción de ARN. El ARN total se extrajo con 1 mi de reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California) de cultivos de 15 mi de BCG tratado toda la noche ya sea con DMSO (diluyente) u OSA. Posteriormente, las células bacterianas se homogeneizaron en un miniagitador de lecho por 30 segundos (dos veces) y se agregó cloroformo al lisado bacteriano. El ARN total se precipitó con isopropanol, se lavó con etanol y se resuspendió en agua destilada (ADNasa, AR asa libre, Invitrogen) . El ARN total se digirió con ADNasa I (Qiagen, Valencia, California) y se purificó con minieguipo Rneasy (Qiagen) . La trascripción inversa a ADNc se dio utilizando 2 g de ARN y Super Script II, ARNasa H-transcriptasa inversa (Invitrogen) .

Protocolo de PCR. La amplificación de PCR se realizó en un ciclador térmico Perkin Elmer 2400. Cada reacción de PCR contenía 2 µ? de ADNc, MgCl 2.5 mM, dNTP's 0.2 mM (Invitrogen), y 2.5 unidades de Polimerasa Taq (Invitrogen) . Los parámetros de amplificación involucraron 30 ciclos con 1 minuto a 95°C, 1.5 minutos a 60°C, y 2 minutos a 72 °C. Se llevó a cabo el alargamiento a 72 °C por 10 minutos. Subsecuentemente, la temperatura se ajustó a 4°C. Los productos de reacción se evaluaron por electroforesis en gel de agarosa.

Hibridación de Southern. Los productos de PCR se transfirieron sobre membranas de nylon (Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana) por manchado de Southern con SSC 20X. Subsecuentemente, las membranas individuales se hibridaron con un fragmento de PCR marcado con 11-dUTP Digoxigenina especifica del gen a 42 °C toda la noche. - Posteriormente la sonda se retiró y la membrana se lavó en amortiguador de astringencia bajo (2X SSC, 0.1% SDS) y alto (0.5% SSC, 0.1% SDS) a temperatura ambiente a 68°C por 15 minutos (dos veces), respectivamente. El ácido nucleico marcado con Dig se detectó utilizando un equipo quimioluminiscente come cialmente disponible (Roche) .

Ensayos ATP. Se agregaron ya sea diluyente u OSA (100 g/ml o 16X de MIC calculado) a 120 mi de cultivos de BCG. Los agentes antimicobacterianos adicionales, también se probaron a concentraciones comparables a las utilizadas para OSA (16X sus respectivos MIC's). Éstas incluyeron cada uno de los compuestos I - VIII, isoniazida (INH, 1.6 g/ml) , rifampin (RIF, 32 g/ml) , estreptomicina (STR, 32 µg/ml) , etambutol (EMB , 32 g/ml) , y cerulenina a dos concentraciones (1.5 Mg/ml y 24 g/ml) . Los inhibidores de cadena respiratoria, conocidos, probados incluyeron DCCD (100 íig/ml) , un inhibidor específico de ATP-sintasa, TTFA (100 9/t?1) un inhibidor específico del complejo II respiratorio, Rot (25 /xg/ml) un inhibidor específico del complejo I respiratorio, y dicumarol (DC, 7 µg/ml) un inhibidor alternativo de deshidrogenasa. Los ensayos de punto de tiempo simple y múltiple, iniciales se llevaron a cabo mediante la eliminación de alícuotas del cultivo (30 mi) a 1, 3, y 24 horas, y se colocaron inmediatamente sobre hielo. Todas las manipulaciones posteriores se condujeron a 4°C. Los cursos de tiempo adicionales se dieron a 5, 30 y 180 minutos utilizando el mismo procedimiento. Las células se cosecharon por centrifugación y se rompieron por agitación en lecho con esferas de vidrio de 200-300 µt? en un amortiguador de extracción ATP (Tris 100 mM, EDTA 4 mM, pH 7.5) a fuerza máxima por un total de 2 minutos . El desecho celular se eliminó por centrifugación (13,000 x g por 15 minutos), y el ATP que contenía el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio. Se utilizó un ensayo de bioluminiscencia ATP comercialmente disponible (Roche Diagnostics) para la determinación del nivel de ATP en las muestras tratadas versus el control . Las unidades de luz relativa se midieron en un luminómetro Wallac Víctor2 . Se determinaron las cuentas de colonias (CFU's/ml) para cada cultivo por colocación en placas de alícuotas a agar M7H10-ADC, y se incubaron por 3 semanas en C02 al 5% a 37°C. Se calculó el nivel de ATP [M] por CFU de grupos tratados versus no tratados; los ATP relativos [M] se calcularon luego por normalización de los valores tratados a controles. La significancia estadística se calculó utilizando una prueba t de Student de 2 colas .

Actividad de OSA en presencia de etanol. La actividad in vitro de OSA en presencia de etanol, un sustrato respiratorio, se determinó utilizando una modificación del procedimiento de desarrollo radiométrico BACTEC estándar (44) . En resumen, los inóculos se prepararon a partir de cultivos de M. tuberculosis mantenidos en placas de agar de Lowenstein-Jensen (Difco, Detroit, Michigan) utilizando esferas de vidrio y fluido de dilución comercialmente disponible (Becton Dickinson, Sparks, Maryland) . Las suspensiones micobacterianas se agitaron en vórtice con esferas de vidrio y se dejaron asentar por 30 minutos. El sobrenadante se ajustó hasta 1.0 McFarland de estándar y se inoculó (0.1 mi) en cada botella de BACTEC 12B. Se agregó OSA a las botellas individuales a las siguientes concentraciones finales: 1.5 g/ml, 3.0 /zg/ml, 6.25 µg/ml, 12.5 zg/ml, y 25.0 /zg/ml. La concentración final de etanol, utilizada para la prueba de combinación fue de 0.05%. Las combinaciones de estreptomicina (0.05 g/ml, 1.0 /ig/ml, y 2.0 jug/ml) y etanol también se probaron para determinar si los efectos sinérgicos observados para OSA eran específicos del compuesto o generalizables a un fármaco antimicobacteriano alternativo. Todas las botellas se incubaron a 37°C, y se registró diariamente el índice de crecimiento (GI) de cada botella .

Tratamiento de BCG con OSA y otros inhibidores de la cadena respiratoria y marcación por pulso de lxpido con 14C-acetato. BCG (50 mi) se desarrolló aeróbicamente a 37 °C en M7H9-ADC-Tween (Difco, Detroit, Michigan) para la fase logarítmica temprana (DO = A6oo 0.2) . En este tiempo, se agregaron 1 µa/ l de ácido acético [1,214C] (Amersham, Arlington Heights, Illinois) y ya sea diluyente (DMSO) , OSA (100 zg/ml) , DCGD (100 /¿g/ml) , o TTFA (100 //g/ml) , a cultivos respectivos y se incubaron bajo las mismas condiciones por 10 minutos. Los cultivos se colocaron inmediatamente sobre hielo y las células se cosecharon por centrifugación a 3,000 x g por 15 minutos a 4°C.

Preparación y análisis de ácidos micólicos . La extracción de ácido micólico se realizó como se describe previamente en las publicaciones tales como Dobson, G. , et al., "Systematic analysis of complex mycobacterial lipids," en Chemical Methods in Bacterial Systematics, páginas 237-265, M. Goodfellow y D. Minnikin (eds.), Academic Press, London (1985), y Minnikin, D., et al., "Extraction of mycobacterial mycolic acids and other long-chain compounds by an alkaline methanolysis procedure," Journal of Microbiological Methods, 2:243-249 (1984). En resumen, los lipidos extraíbles polares y no polares se retiraron de volúmenes iguales de células (60 mg de peso húmedo) de acuerdo a los protocolos establecidos de las referencias anteriores. Las células desgrasadas resultantes que contenían ácidos micolicos enlazados se sometieron a hidrólisis alcalina en metanol (1 mi) , 30% KOH (1 mi) y tolueno (0.1 mi) a 75°C toda la noche y subsecuentemente se enfriaron a temperatura ambiente. La mezcla posteriormente se acidificó a pH 1 con HCl al 3.6% y se extrajo 3 veces con éter dietilico. Los extractos combinados se secaron bajo N2. Se prepararon ésteres metílicos de ácido graso de ácidos micolicos por mezcla de diclorometano (1 mi) , una solución de catalizador (1 mi) (26) , y yodomet no (25 mi) , por 30 minutos, se centrifugaron y se desechó la fase superior. La fase baja se secó bajo N2. Se determinó la incorporación de 1C-acetato en ácidos micolicos por conteo de cintilación (contador de cintilación de múltiples propósitos Beckman LS6500) y los valores se expresaron como un porcentaje de los controles no tratados. La comparación de los efectos de OSA (100 µg/ l) , DCCD (100 ig/ml) , y TTFA (100 //g/ml) en la síntesis de ácido micólico después de 10 minutos de exposición en los cultivos de fase logarítmica temprana de BCG se muestra en la figura 7.

RESULTADOS Inicialmente , se intentó la identificación cualitativa y cuantitativa del objetivo proteico específico de OSA al examinar perfiles proteicos electroforéticos en gel, bidimensionales después de una exposición por 24 horas a OSA en BCG. Los investigadores anteriores utilizaron exitosamente un procedimiento similar para identificar el objetivo enzimático de isoniazida en M. tuberculosis como se describe en Mdlnli D. , et al., "Inhibition of a Mycobacterium tuberculosis ß-ketoacyl ACP synthase by isoniazid, " Science, 280:1607-1610 (1998). Como se muestra en la figura 2 (Derecha) , el tratamiento con OSA dio como resultado sobreexpresión significativa de dos proteínas relativamente pequeñas con pesos moleculares aproximados de 17 a 18 kD. Ambas proteínas fueron indetectables en los controles no tratados correspondientes (figura 2, Izquierda) . Ocurrió la sobreexpresión tanto en el MIC de OSA (6.25 g/ml) como en concentraciones hasta de 16 veces (16X) el MIC (100 /¿g/ml) en una manera dependiente de la dosis. Un experimento de curso de tiempo separado que utilizó marcación de pulso con 35S-metionina demostró que ambas proteínas se sobreexpresaron en tan poco como 3.5 horas después de la exposición a OSA. En comparación, el tratamiento de BCG ya sea con cerulenina o isoniazida, inhibidores antimicobacterianos potentes, fallaron para dar como resultado la sobreexpresion ya sea de la proteina a concentraciones de hasta 16X del MIC. Adicionalmente, ninguna proteína se sobreexpresó en M. smegmatis tratada con OSA, que es intrínsecamente resistente a este compuesto. El secuenciamiento de fragmentos de gel, bidimensionales , combinados que contenían cada una de las dos proteínas, demostró la especie más prominente por ser una proteína de choque térmico pequeña (hsp, Rv 0251c) de 17,786 daltones con un punto isoeléctrico (pl) de 5.0. La segunda proteína se identificó como la subunidad b de ATP-sintasa codificada por el gen atpF (Rvl306) , con un peso molecular de 18,325 daltones y un pl de 4.9. La sobreexpresion de ambas proteínas se confirmó por RT-PCR (figura 3) . Con base en los datos de las proteínas, que sugieren una posible conexión a ATP-sintasa vía la interacción con la subunidad b, se realizaron estudios de curso de tiempo durante 24 horas para examinar el efecto de OSA (100 /ml) sobre los niveles de ATP en BCG, en comparación a DCCD un inhibidor de ATP-sintasa conocido. Como se muestra en la figura 4 , los niveles de ATP [M] disminuyeron significativamente (46%) en BCG tratado con OSA versus los controles no tratados en una hora después de la exposición. Esta tendencia continuó en tres y 24 horas, con reducción de 54% y 85% en ATPtM], respectivamente. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas en cada punto de tiempo (p < 0.02). DCCD, un inhibidor de ATP-sintasa, también provocó reducción marcada en el nivel de ATP [M] con una disminución del 95% en todos los puntos de tiempo (p = 0.003) . Se observaron resultados similares para cada uno de los compuestos I - VIII. Se condujeron experimentos posteriores para determinar qué tan rápidamente ocurría el efecto de OSA sobre la concentración de ATP[ ]. Como se muestra en la figura 5 (Panel A) , OSA disminuyó significativamente el nivel de ATP en BCG tratados versus no tratados en tan poco como 5 minutos. Esta diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0.004) . También se observó una disminución estadísticamente significativa (p = 0.001) con DCCD, un inhibidor de ATP-sintasa específico. El tratamiento de TTFA, un inhibidor del Complejo II respiratorio, dio como resultado solamente una disminución moderada en ATP en el punto de tiempo correspondiente. Para determinar si el efecto de OSA sobre el nivel de ATP pudiera ser el resultado de una respuesta generalizada al estrés en BCG, se probaron agentes antimicobacterianos adicionales tales como INH, RIF, EMB, y STR, a concentraciones comparables a las utilizadas para OSA (16X sus respectivos MIC's, INH 1.6 µg/ml, RIF 32 g/ml, STR 32 9/p?1, EMB 32 ^g/ml, y cerulenina 24 g/ml) . Como se muestra en la figura 5 (Panel B) , el tratamiento de BCG con fármacos antimicobacterianos estándares (16X sus respectivos MIC's). no dieron como resultado diferencia apreciable en el nivel de ATP versus los controles no tratados en el punto de tiempo correspondiente de cinco minutos después de la exposición. Los compuestos adicionales probados incluyeron dicumarol, un inhibidor de deshidrogenasa alternativo, rotenona (Rot) , específico para NADH-deshidrogenasa (Complejo Respiratorio I) , y un inhibidor de sintasa de ácido graso, cerulenina. No se observó disminución apreciable en el nivel de ATP con este grupo de compuestos (figura 5, Panel C) . Debido al involucramiento posible de ATP-sintasa y otros componentes de la cadena respiratoria, se efectuaron estudios con OSA en presencia de etanol (0.05%) . El etanol es un sustrato respiratorio y se utilizó por diversos investigadores para estudiar la respiración celular, como se muestra, por ejemplo, en Beauvieux, M. P.; et al., "Ethanol perfusión increases the yield of oxidative phosphorylation in isolated liver of fed rats," Biochim. Biophys . Acta, 570:135-140 (2002) . Como se muestra en la figura 6, el etanol al 0.05% potenció los efectos de OSA sobre la inhibición del crecimiento, reduciendo el MIC desde 6.25 /¿g/ml en H37Rv de M. tuberculosis hasta <1.5 xg/ml. No se observó potenciación en la actividad entre etanol y estreptomicina. Previamente reportamos que el tratamiento de BCG con OSA daba como resultado una disminución en los ácidos micólicos, sin efecto aparente sobre los intermediarios en esta ruta. Una disminución significativa en el nivel de ATP pudo tener potencialmente efectos dañinos directos o indirectos sobre la biosíntesis de otras macromoléculas, incluyendo ácidos micólicos de la pared celular. Para investigar el papel de la síntesis de ATP y la respiración en la producción de ácido micólico, se evaluaron inhibidores de ATP-sintasa (DCCD) y el complejo respiratorio II (TTFA) y se compararon con OSA y controles no tratados en BCG. Se seleccionó un corto intervalo de tiempo de 10 minutos después de la exposición para asegurarse de que la inhibición en la síntesis de micolato no se debiera a la muerte celular. Como se muestra en la figura 6, los niveles de ácido micólico total disminuyeron en 79% con DCCD (100 g/ml) , 46% con TTFA (100 µg/ml) , y 43% con OSA (100 g/ml) en comparación a los controles no tratados . El Panel A de la figura 6 muestra la actividad de OSA en medios radiométricos BACTEC estándar sin etanol (concentraciones en µg/ml se indican en la leyenda) , mientras que el Panel B muestra la actividad de OSA, utilizando las mismas concentraciones y medios suplementados con etanol al 0.5%. NC muestra los resultados para un control no tratado . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo- contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método de tratamiento de un sujeto con una infección provocada por microbios, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad efectiva de un compuesto a un sujeto en necesidad de tratamiento, el compuesto es capaz de disminuir los niveles de ATP en el microbio por al menos 10% en comparación con los controles después de 24 horas en 'una prueba in vitro, y no mata las células del mamífero durante el mismo periodo de tiempo, la disminución en los niveles de ATP se midió por: (1) retiro de las células del sitio de prueba y colocarlas sobre hielo; (2) cosechar las células a 4 grados centígrados por centrifugación y romperlas con agitación en lecho en un amortiguador de extracción ATP; (3) retirar los desechos celulares por centrifugación a 4°C, dejando un sobrenadante con ATP; (4) medir la cantidad de ATP presente en el sobrenadante por un ensayo de bioluminiscencia a 4°C; en donde el compuesto no es de la fórmula R-S0n-Z-C0-Y, en donde n es 1 ó 2, R es un grupo hidrocarburo que tiene de 6 a 20 átomos de carbono, Z es una porción de enlace de hidrocarburo que puede contener un heteroátomo, e Y se selecciona de -NH, -0-CH2-C6H5, -CO-CO-O-CH3, y -0-CH3. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto es un humano. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto es un animal. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el sujeto se selecciona del grupo que consiste de caballos, ganado vacuno, cabras y ovejas. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste de: VII VIII 6. El método de conformidad con la reivindicación , caracterizado porque el compuesto es 7. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el compuesto es 8. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el compuesto es 9. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el compuesto es 10. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el compuesto es 11. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el compuesto es 12. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el compuesto es 13. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el compuesto es 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto se infecta con un microbio seleccionado del grupo que consiste de M. tuberculosis, M. avium-intracellulare, M. leprae, M. paratuberculosis, M. ulcerans, y Rhodococcus. 15. Un método de tratamiento de un sujeto con una infección provocada por microbios, caracterizado porque comprende la administración de un compuesto a un sujeto en necesidad de tratamiento, en donde el compuesto produce sobreexpresión de la subunidad b de la ATP-sintasa, y en donde además el compuesto no es de la fórmula R-SOn-Z-CO-Y, en donde n es 1 ó 2 ; R es un grupo hidrocarburo que tiene de 6 a 20 átomos de carbono, Z es una porción de enlace de hidrocarburo que puede contener un heteroátomo, e Y se selecciona de -NH, -0-CH2-C6H5, -C0-C0-0-CH3r y -0-CH3. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el sujeto es un humano. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el sujeto es un animal. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el sujeto se selecciona del grupo que consiste de caballos, ganado vacuno, y ovejas. 19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste de : 20. El método de conformidad con la reivindicación , caracterizado porque el compuesto es 21. El método de conformidad con la reivindicación , caracterizado porque el compuesto es a¾o¾cv V 22. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto es 23. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto es 25. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto es 1 26. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el compuesto es 27. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto es