KR20050047519A - 사람 및 동물에서의 미생물 감염의 치료방법 - Google Patents

사람 및 동물에서의 미생물 감염의 치료방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20050047519A
KR20050047519A KR1020057000353A KR20057000353A KR20050047519A KR 20050047519 A KR20050047519 A KR 20050047519A KR 1020057000353 A KR1020057000353 A KR 1020057000353A KR 20057000353 A KR20057000353 A KR 20057000353A KR 20050047519 A KR20050047519 A KR 20050047519A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
formula
atp
subject
osa
Prior art date
Application number
KR1020057000353A
Other languages
English (en)
Inventor
타운젠드크레이그에이.
디크제임스디.
패리쉬니콜엠.
휴즈미네르바아모레뜨
Original Assignee
파스젠, 엘엘씨.
더 존스 홉킨스 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 파스젠, 엘엘씨., 더 존스 홉킨스 유니버시티 filed Critical 파스젠, 엘엘씨.
Publication of KR20050047519A publication Critical patent/KR20050047519A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4409—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 4, e.g. isoniazid, iproniazid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/221—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin with compounds having an amino group, e.g. acetylcholine, acetylcarnitine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/381—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having five-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A61K31/421—1,3-Oxazoles, e.g. pemoline, trimethadione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/455—Nicotinic acids, e.g. niacin; Derivatives thereof, e.g. esters, amides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Heterocyclic Compounds Containing Sulfur Atoms (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 소정 화합물을 미생물 감염 대상에게 투여함을 포함하는, 미생물 감염 대상의 치료방법에 관한 것이다. 당해 화합물은 미생물 중의 ATP 수준을 동일한 기간 동안 포유동물 세포를 사멸시키지 않으면서 시험관내 시험에서 24시간 후에 대조군과 비교하여 10% 이상 감소시킬 수 있다. ATP 수준의 감소는 세포를 시험 위치로부터 제거하여 얼음 위에 놓는 단계(1), 세포를 원심분리에 의해 4℃에서 수거하여 ATP 추출 완충액에서 비드 타격에 의해 분쇄하는 단계(2), 세포 단편을 4℃에서의 원심분리로 제거하여 ATP 함유 상청액을 수득하는 단계(3) 및 4℃에서 생물발광 분석으로 상청액에 존재하는 ATP의 양을 측정하는 단계(4)에 의해 측정된다.

Description

사람 및 동물에서의 미생물 감염의 치료방법{Methods of treating microbial infections in humans and animals}
미생물 감염은 미국 및 전세계에서 공중 위생의 주요 논쟁점으로 남아 있다. 예를 들면, 결핵은 미국 및 세계적으로 중요한 공중 위생 문제로 남아 있다. 결핵(TB)은 세계에서 단일 감염제에 기인하는 주된 사망 원인이다. 대략 18억 6천만명 또는 세계 인구의 32%가 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis; M. tb.)로 감염되어 있다. 연간 약 8백만명의 새로운 활성 대상와 대략 2백만명의 사망자가 있다. 이는 매시간 200명 및 매일 5000명의 사망율로 해석된다. HIV 감염 대상은 HIV로 감염되지 않은 대상(12, 45)와 비교하여 대략 50배 증가된 위험성과 함께 현저히 증가된 M. tb. 감수성을 나타낸다. 유사하게는, 초기 감염 이후에 활성 질환에 대한 잠복성 TB의 진행 속도는 HIV 비감염 개체에서의 대략 5%와 비교하여 40%로 보다 빠르다. 세계적으로, 특히 아시아 및 인도 아대륙에서 HIV의 지속적인 확산과 더불어, TB의 발병 및 사망율도 증가할 것으로 예상된다.
하나 이상의 1차 표준 제제에 내성이 있는 M. tb. 균주에서의 발병 증가는 새롭고 신규한 표적의 확인 및 약물 개발의 필요성을 증대시킨다. MDR-TB(다중 약물 내성 결핵)은 약물 감수성 TB보다 현저히 높은 사망율과 관련될 뿐만 아니라 치료를 곤란하게 하고 치료에 고가의 비용이 들게 한다. 효과적인 예방 및 치료 수단의 부재하에, MDR-TB는 증가하고 제어불가능한 문제로 될 것이다.
감소된 독성, MDR-TB에 대한 활성, 또 다른 작용 기전 및 잠복성 질환에 대한 활성을 갖는 결핵 약물의 개선이 상당히 요망되고 있다. 과거 50년 동안과 비교하여 결핵의 예방과 치료에서의 진보에도 불구하고, 이러한 질환을 관리하기 전에 존재하는 상당한 장애를 예상할 수 있다. 보호 전략에 대한 현재의 기준은 특히 저소득의 비산업화 국가에서 이행과 유지를 어렵게 하고, 이러한 국가에서는 효과적인 또는 포괄적인 TB 관리 프로그램을 지원하기 위한 재원 또는 기반이 부족하다. MDR-TB의 출현은 현재까지 TB 관리에서 이루어진 다수의 진보에 역행하여 위협하고 있다.
장기간 지속하는 리파마이신, 플루오로퀴놀론, 옥사졸리디논 및 니트로이미다졸을 포함하는 몇가지 유망한 약물 부류가 개발 중에 있다. 그럼에도 불구하고, 임상용으로 제공되는 신규 화합물의 성공률은 대략 0.5%이기 때문에, 개발을 위한 새로운 독특한 미코박테리움 표적의 발견 및 확인이 요구되고 있다. 신규한 작용 기전을 갖는 어떠한 신규한 항미코박테리움 약물도 지난 30년간 개발되지 않았다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 미생물의 중심 에너지 대사를 간섭하는 소정 화합물을 투여하여 미생물 감염을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 미생물에서 ATP 합성을 억제하고 이러한 미생물의 세포 호흡을 간섭하는 소정 화합물의 투여를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은 대조군과 비교하여 ATP[M] 수준을 10% 이상 감소시킬 수 있는 소정 화합물의 투여를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은, ATP 신타제의 b-아단위를 과발현시키는 유효량의 화합물을 미생물 감염의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여함을 포함하는, 미생물 감염 대상의 치료방법을 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은, 미생물 감염된 사람 또는 동물에게 투여하는 경우, 상술된 기전을 통해 미생물 감염을 치료할 수 있는 특정한 화합물을 제공하는 것이다:
도면의 간단한 설명
도 1은 ATP 신타제의 일반 구조식 및 작용을 나타낸다.
도 2는 치료후 4시간에서 대조군 대 OSA 처리된 (100㎍/ml) BCG의 2차원 단백질 겔 전기영동 프로파일을 나타낸다.
도 3은 OSA의 존재 또는 부재하에 증식한 BCG에서 ATP 신타제의 b-아단위(Rv1306)를 암호화하는 atpf 및 hsp(Rv0251c)의 발현을 비교한 것이다.
도 4는 무처리 대조군과 비교하여 OSA 또는 디사이클로헥실카보디이미드로 처리한 BCG 배양물에서 ATP 수준을 측정하는 시간 과정 실험을 나타낸 것이다.
도 5는 OSA, 공지된 호흡 억제제 및 항미코박테리움 제제에 5분간 노출시킨 후의 BCG에서 ATP 농도/CFU를 나타낸 것이다.
도 6은 저농도의 에탄올(0.05%)에서 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 대한 OSA의 억제 활성의 상승작용을 나타낸 것이다.
도 7은 BCG의 초기 지수 상 배양물에서 10분간 노출시킨 후에 OSA(100㎍/ml), DCCD(100㎍/ml) 및 TTFA(100㎍/ml)가 미콜산 합성에 미치는 효과를 비교한 것이다.
문헌[참조: Dimroth, et al., "Operation of the F(0) motor of the ATP synthase," (2000) 1458: 374-386]으로부터 유도되는 도 1은 F1F0 ATP 신타제(ATPase)의 구조를 도식적으로 나타낸다. ATPase는 양성자 동력으로부터의 에너지를 이용하여 ATP를 생성한다. 이러한 효소 복합체는 트랜스막(FO) 및 세포졸 구역(F1)으로 이루어져 있다. FO 성분을 통한 양성자의 이동은 F1 위의 촉매 부위에서 ATP 합성 또는 가수분해에 역으로 결합되는 것으로 생각된다. 이. 콜라이(E. coli)에서, F1 및 F0은 다음 아단위, 즉 각각 α3β3γ3δε및 a1 b2c12로 이루어져 있다. 일반적으로, 상동성 아단위는, 원핵계와 진핵계 사이에서 차이가 존재할 수도 있지만, 미토콘드리아와 엽록체에서 발견된다. ATP 합성은 FO을 통한 양성자 이동에 의해 유도된다. 그러나, 결합의 완전한 구조와 기전은 충분히 확립되어 있지 않다.
이. 콜라이에서 b-아단위와 또 다른 F0 막 성분(아단위 c)와의 교차 결합은 ATP 가수분해와 ATP 유도된 양성자 펌핑의 비결합을 생성한다. 유사하게는, 비결합 돌연변이는, 모든 효소 기능을 소멸시키는, 단일 아미노산 치환을 수반하는 F0의 b-아단위에 영향을 미치는 이. 콜라이에서 발견되었다. 이러한 표현형은 촉매작용에 대한 양성자 전위의 결합에 있어서 b-아단위의 기능적 역할을 시사한다. b-아단위와 F1 성분과의 상호작용은 당연히 동적 및 구조적일 수 있다. 보다 최근에, 스트루글릭(Struglics) 등은 미토콘드리아의 b-아단위가 역으로 포스포릴화되는 것을 밝혔다. 당해 저자들은 이러한 포스포릴화의 생리학적 역할이 F0-F1 상호작용의 안정성을 조절함으로써 F0-F1 모터에서 에너지 결합을 조절할 수 있음을 시사한다. 그 자체로서, F0의 b-아단위는 ATPase의 작동에 있어서 구조적 및 기능적 역할을 담당할 수 있다. 이러한 특정한 복합체의 억제는 b-아단위, 또는 ATP 생성의 현저한 손상을 일으키는 F0의 막 결합 성분과의 직접적인 상호작용을 통해 발생할 수 있다.
이러한 가능한 기전에 대한 중요한 연구는, 병원체 미코박테리아에 대해 효능있는 시험관내 활성을 갖는, □-설포닐카복스아미드 부류의 화합물인 n-옥탄설포닐아세트아미드(OSA)를 사용하여 실시되었다. OSA는, 본원에서 참조문헌으로서 인용되는, PCT 출원 제PCT/US98/17830호에 기재되어 있다.
바실루스 칼메테-구에린(bacillus Calmette-Guerin; BCG)에서 OSA의 효소적 표적의 확인은 2차원 단백질 겔 전기영동 및 소정 화합물의 존재하에 과발현된 단백질의 후속적인 서열작성을 이용하여 시도되었다. BCG에서 OSA 처리는 2개의 비교적 작은 단백질(약 18kD), 즉 atpF 유전자에 의해 암호화된 ATP 신타제(F1F0 ATPase)의 b-아단위 및 작은 열 쇼크 단백질, hsp(Rv0251c)를 생성한다. RT-PCT은 hsp 발현 수준이 현저히 증가되고 ATP 신타제의 b-아단위의 발현 수준이 보다 적은 정도로 증가함을 나타냈고, 여기서 패턴은 2D 겔 위에서 관찰된 패턴과 일치한다.
이들 결과가 셀 손상에 대해 일반화된 응력 응답을 나타내는지를 평가하기 위해, 2차원의 단백질 분포는 효능 있는 항미코박테리아 화합물인 세룰레닌 및 또 다른 효능 있는 항-TB 화합물인 이소니아지드의 존재하에 수행되었다. 세룰레닌 처리와 이소니아지드 처리는 모두 BCG 속에서 어느 한 단백질의 과잉발현을 야기하지 않으며, 이는 OSA가 세룰레닌이나 이소니아지드보다 상이한 메카니즘을 통해 작동함을 나타낸다.
추가의 정보는 OSA 처리된 치구균(M.smegmatis)의 2차원 단백질 분포를 BCG와 비교함으로써 수득되었다. 이에 앞서, 치구균이 용해도 한도(100㎍/ml) 이하의 농도에서 OSA에 대해 본질적으로 내성을 갖는 것으로 보고되었다. 두 개의 BCG 단백질의 동족체는 매릴랜드주 락빌에 소재하는 유전자 연구 협회(The Institute for Genomic Research)(http//www.tigr.org)를 통해 이용 가능한 치구균 유전자 순서의 BLAST 조사에 의해 모색되었으며, 치구균 내에 존재함이 발견되었다. 그러나, 두 개 사이의 차이점의 영역이 존재한다. b-아단위는 이들 2개의 미코박테리아 종 사이에서 상당히 유사해 보이나(63% 동일, 75% 유사), hsp는 너무 적다(42% 동일, 54% 유사). b-아단위 및 hsp 동족체에 대해 추정된 분자량은 각각 16 및 18kD이다. 그러나, 이들 분자량 또는 pI와 일치하는 단백질도 OSA 처리된 치구균 속에서 과잉 발현되지 않았다.
ATP 신타아제의 b-아단위의 과잉발현은 OSA의 표적 경로에서 직접적인지 간접적인지를 ATP 신타아제의 가능한 연관성을 지시한다. 이들 관찰에 기초하여, 단일 시간 지점 및 시간 경과 실험에 착수하여 공지되어 있는 비특정 ATP 신타아제 억제제와 비교하여 OSA의 존재하에 ATP[M] 수준을 측정하였다. ATP[M] 수준은 시험된 전체 시간 지점에서 이하의 OSA 및 DCCD 처리를 현저하게 감소시켰다. 당해 감소는 두 개의 화합물에 대해 재현 가능할 뿐만 아니라, 5분간의 후-노출이 적은 한 매우 신속하게 일어난다.
당해 효과가 일반화된 응력 응답의 특정 화합물 또는 결과인지를 측정하기 위해, 추가의 항미코박테리아제 및 호흡 억제제를 상응하는 시간 지점에서 ATP[M] 수준에 영향을 미치는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 제1 라인 항미코박테리아제는 INH, RIF, STR, EMB 및 세룰레닌을 포함하였다. 호흡 억제제는 디쿠마롤(대안의 탈수소효소 억제제), Rot(착물 I 억제제) 및 TTFA(착물 II 억제제)를 포함하였다. 모든 제1 라인 약물은 OSA에 필적하는 수준으로 사용되었다. 현저하게, ATP[M] 수준의 뚜렷한 감소가, 시험한 제1 라인 약물 또는 호흡 억제제에 대한 5분간의 후-노출시 검출되지 않았다. 하나의 예외는 착물 II의 특정 억제제인 TTFA인데, 이는 5분에 ATP[M] 수준에서 적당한 감소를 입증하였다. 이는, 당해 억제제가 TCA 주기의 필수 부분인 석시네이트 탈수소효소(착물 II)를 특히 목표로 삼으므로 놀랍지 않다. 당해 효소 착물없이, TCA 주기는 심각하게 손상된다. 따라서, 호기성 호흡이 ATP의 생성을 늦추면서 손상된다.
따라서, OSA는 익히 기록되어 있는 비특이 ATP 신타아제 억제제 DCCD의 효과를 모방하였다. 비교하면, 다른 항미코박테리아제는 유사한 효과를 유도해 내지 못하였다. 다음의 화합물들을 사용하여 유사한 연구를 수행하였다:
화학식 I
화학식 II
화학식 III
화학식 IV
화학식 V
화학식 VI
화학식 VII
화학식 VIII
이들 화합물의 시험은 OSA를 사용하여 나타낸 바와 같이 유사한 결과를 나타내었다. 즉, 이들은 대조군과 비교하여, 상응하는 시간 지점에서 ATP[M] 수준을 감소시키는 능력을 나타내었다.
ATP 수준에서 OSA 유도된 감소는 hsp(Rv0251c)의 과잉발현에 의해 수행되었다. 본 발명의 범위를 한정하지 않고, 이는 열 쇽 응답이 미코박테리아 속의 에너지 감지/조절과 관련될 수 있는 가능성을 제안하였다. hsp(Rv0251c)는 159개의 아미노산의 비교적 작은 단백질을 암호화하고, 적은 열 쇽 단백질의 hsp20 또는 ?-결정성 군의 구성원이다. 최근, 스튜어트(Stewart)(2002) 등은 hsp(저자에 의해 acr2라고 불림)가 미코박테리아 유전체 속에서 열 유도성 유전자였음을 입증하였다. hsp는 또한 Rv0250c 및 Rv0249c를 사용하여 명백한 오페론 속에 배열된다. hsp의 조절은 열 쇽 억제물질, hspR 및 ECF 시그마 인자 σE를 포함한다. 후자는 또한 산화성 또는 세정 가압 동안 상향조정되며, 인형균(M.tuberculosis)의 α-결정체(arc)(14kDa 항원)와 상당히 유사한 점을 내포하고 있다(98개의 아미노산에 걸쳐서 41% 동일). 열 쇽 응답은 편재하며, 정상 응력 조건 및 유해한 응력 조건 둘 다하에 세포가 생존하도록 한다. 당해 생존은 종종 유전자 발현에서 전체적인 변화를 요구한다. 대부분의 열 쇽 단백질은 단백질 주름/분해를 보조하고 단백질 응집을 억제하는 분자 샤프롱으로서 간주된다. 일반적으로, 열 쇽 단백질은 비교적 큰 기질 특이성을 갖는다. 그러나, 최근의 증거는 특이 효소 착물의 형성에 필수적인 효소 특이 샤프롱의 존재를 확인하였다. 효소 특이 샤프롱의 예로, ATP 신타아제 집합체에 필요한 단백질을 암호화하는 효모 ATP10, ATP11 및 ATP12 유전자를 들 수 있다. 추가의 효소 특이 샤프롱은 시토크롬 산화효소, 석시네이트 환원효소(착물 II) 및 NADH-유비퀴논 산화환원효소(착물 I)의 형성에 필요한 것으로 확인되었다. 다수의 이들 효소 특이 샤프롱은 hsp20 부류의 분자 샤프롱이 된다. 추가로, 몇몇 분자 샤프롱이 산화환원 조절된다. 미코박테리아 hsp의 완전한 기능 역할은 대부분 공지되어 있지 않다. 그러나, 당해 열 쇽 단백질이 효소 특이 집합체/ATP 신타아제 또는 호흡 쇄 속의 기타 관련된 착물의 조절 역할을 할 수 있는 가능성이 존재한다. hsp는 또한 산화환원 조절된 열 쇽 단백질의 미코박테리아 변형을 나타낼 수 있다.
중심 에너지 대사에서의 OSA-매개 간섭의 결론은 에탄올과의 활성화의 잠재성에 의해 더욱 증가되었다. 미코박테리아가 탄소 공급원으로서 낮은 농도의 에탄올 및 다른 단쇄 알콜을 사용할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 에탄올은 알콜 탈수소효소에 의해 수반되는 NAD의 환원과 함께 아세트알데히드로 역으로 산화되는 호흡 기질이다. 아세트알데히드의 후속 산화반응은 아세트산을 수득하며, 이는 이 후 ATP 의존 반응에서 아세틸-CoA로 전환된다. 아세틸-CoA는 중심 대사에서 결정적인 분자이다. TCA를 통한 아세틸-CoA의 산화는 세포 에너지의 생성을 유도한다. 따라서, 에탄올 대사 및 호흡은 상호연관된다. 이전의 조사자들은 에탄올이 호흡 쇄를 통해 상승된 양자 유량을 야기시키는 NADH + H+의 증가된 생성의 결과로서 포유류 미토콘드리아 속의 ATP 합성 속도를 증가시킴을 나타내었다. ATP/O 비율은 다음의 에탄올의 첨가를 증가시키는데, 이는 호흡과 ATP 합성 사이의 증가된 에너지 전환을 나타낸다. 이러한 연구에서, 에탄올과 OSA가 동일한 목적을 공유할 것 같지 않다. 그러나, 에탄올 상승된 아세틸-CoA 및 NADH + H+는 ATP 합성 또는 호흡 쇄의 기타 성분들이 손상된 경우 세포에 유해할 것이다. 이러한 경우, OSA 및 에탄올의 잠재성은 가능할 것이다.
ATP 합성의 억제 및 세포 호흡의 방해는 다중 다운스트림 효과를 생성할 수 있다. 이들은 마이콜산과 같은 기타 거대분자의 에너지 의존성 합성에서의 감소를 포함한다. 이에 앞서, 본 발명자들은 OSA가 당해 생체합성 경로에서 중간체에 어떠한 명백한 영향을 미치지 않고 BCG에서 마이콜산 수준을 감소시킴을 보고하였다. 이러한 관찰은 공지된 지방산 신타아제 억제제인 티오락토마이신 및 세룰레닌으로 관찰된 마이콜레이트 억제의 패턴에 대해 명백히 대조적이다. 이러한 발견은 OSA 및 기타 ?-설포닐카복스아미드에 의한 마이콜산 합성의 억제가 지방산 신타아제 억제 이외에 또 다른 메카니즘을 포함할 수 있음을 나타낸다.
OSA 및 화학식 I 내지 Ⅷ의 화합물과 같이 선택적으로 ATP 수준을 감소시킬 수 있는 화합물의 사용은 현재 TB(MDR-TB를 포함함)를 겪고 있는 대상와, 면역 억제의 결과로서 활성이 될 수 있는 비활동 질환 또는 기타 전신 질환이 잠복해 있는 수백만 잠재적인 대상 모두를 치료하는데 도움이 될 것이다.
이러한 화합물은 엠. 아비움-인트라셀룰라레(M. avium-intracellulare), 엠. 레프라에(M. leprae), 엠. 파라투베르쿨로시스(M. paratuberculosis), 엠. 울세란스(M. ulcerans) 및 로도코쿠스(Rhodococcus)와 같은 다양한 기타 미생물에 대해 사용될 수도 있으며, 사람 및 동물(예: 말, 소, 양, 염소 및 기타 반추 동물) 모두에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 치료는 개체를 치료하기 위해, ATP 수준을 선택적으로 감소시키는 화합물을 미생물에 투여함을 포함한다. 이러한 화합물을 함유하는 약제학적 조성물은, 화합물, 약제학적 담체 또는 질환에 의해 필요에 따라, 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 복막내, 흉막내, 폐포내 또는 경막내), 국소, 경구, 직장, 비내 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다.
당해 화합물은 바람직하게는 당해 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물로 제형화된다. 활성제의 농도는 담체 내에서 이의 용해도에 좌우될 것이며, 당해 기술분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 것이다. 유사하게는, 특정 제형에 사용된 투여량은 사용될 특정 미생물에 의해 결정될 것이다. 약제학적 조성물은 활성 화합물의 유효성을 부정하지 않는 한, 기타 성분을 포함할 것이다. 약제학적 담체는 익히 공지되어 있으며, 당해 기술분야의 숙련가는 특정 투여 경로에 따라 올바른 경로(들)를 선택할 것이다.
투여량 및 치료 기간은 약물의 치료 지수, 질환의 유형, 대상의 연령, 대상의 체중 및 독성의 내성을 포함하는 다수의 인자들에 의해 좌우될 것이다. 투여량은 일반적으로 혈청 농도 수준을 약 1ng 내지 100㎍/ml, 통상적으로 0.1 내지 10㎍/ml로 성취하기 위해 선택될 것이다. 바람직하게는, 초기 투여량 수준은 시험관내 및 생체내 모델, 및 임상 실험에서 효과적이라고 밝혀진 주위 농도를 성취하기 위한 이들의 능력을 기준으로 하여 선택될 것이다. 대상 개체에 대한 특정 약물의 투여량 및 치료 기간은 상기 인자들의 관점에서 표준 약리학적 연구법을 사용하여 숙련된 임상의에 의해 결정될 것이다. 치료에 대한 반응은 활성 화합물의 혈액 또는 체액 수준, 당해 화합물의 활성 측정 또는 관련 조직에서 이의 수준을 분석하거나, 개체의 질환 상태 모니터링에 의해 모니터링될 것이다. 숙련된 임상의는 이러한 측정에 의해 나타난 치료에 대한 반응을 기본으로 하여 투여량 및 치료 기간을 조절할 것이다.
당해 화합물은 물론 개체를 사멸시킬 수 있는 수준 이하의 수준, 바람직하게는 생명 기능을 역행시킬 수 없게 손상시키는 수준 이하의 수준으로 투여될 것이다. 재생될 수 있는 대상의 세포(예: 자궁내막 세포)의 몇몇을 사멸시키는 수준에서의 투여는 제외되지 않는다.
실시예
다음 실시예는 예시하기 위해 제공되는 것이지, 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다.
미코박테리아 및 성장 조건: 미코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(H37Rv) 엠. 보비스(M. bovis) BCG(BCG, 파스퇴르 균주, ATCC 35734) 및 엠. 스메그마티스(M. smegmatis)(mc26 1-2c)가 이 연구에 사용되었다. 균주를 로벤스타인-젠센 한천 사면(Lowenstein-Jensen agar slant) 또는 미들브룩(Middlebrook) 7H10 한천 플레이트[미시간주 디트로이트 소재의 디프코(Difco) 제품]에 유지시켰다. 모든 분석을 위해, BCG 배양을 미드-로그 상(mid-log phase)(OD = A600 0.3-0.4)에 대해 회전 교반기에서 37℃에서 성장시켰다.
화합물: n-옥탄설포닐아세트아미드의 저장 및 작업 용액(메릴랜드주 볼티모어 존스 홉킨스 유니버시티, 타운젠드 크레이그 OSA), 디사이클로헥실카보디이미드, ATP 신타제-특이 억제제(DCCD, ICN, 캘리포니아주 코스타 메사 소재), 테노일트리플루오로아세톤, 호흡 착물 II 억제제(TTFA, ICN), 로테논, 호흡 착물 I 억제제(Rot, ICN) 및 세룰레닌, 지방산 합성 억제제[미주리주 세인트 루이스 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)]를 디메틸설폭사이드(DMSO, 시그마) 중에서 만들었다. 이소나이지드(INH)의 저장 용액, 스트렙토마이신(STR) 및 에탐부톨(EMB)(모두 시그마사 제품)을 멸균수에서 준비하였다. 리팜핀(시그마)의 초기 저장 용액은 멸균수에서 후속적인 희석액을 사용하여 메탄올 중에서 만들었다.
화학식 I, II, IV, VI 및 VIII의 화합물의 제조방법
이들 화합물 각각의 합성은 3-설포닐운데카노산을 사용하여 개시하였으며, 문헌[참조: J. Med. Chem. 2000 43(17) 3304]에 기재되어 있는 공정에 따라 제조되었다.
화학식 I의 화합물
불활성 대기하에 무수 메틸렌 클로라이드 3mL를 함유하는 화염 건조된 환저 플라스크에 3-설포닐운데카노산 IX(150mg, 0.6mmol) 및 1,1-카보닐디이미다졸(CDI)(102mg, 0.63mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 2-클로로에틸아민 하이드로클로라이드(73mg, 0.63mmol)를 첨가하고, 반응물을 추가의 3시간 동안 교반하였다. 조악한 아미드 X(145mg, 88%)에 수성 후처리를 하여 만족할 만한 수율을 제공한다. 아미드 X를 추가의 화학반응에 정제없이 사용하였다. 1H(CDC13, 300MHz) δ 6.86 (bs, 1H), 3.87 (s, 2H), 3.67-3.65 (M, 4H), 3.15 (t, J = 8.1Hz, 2H), 1.89-1.80 (m, 2H), 1.40-1.26 (M, 14H), 0.88 (t, J = 6.7Hz, 3H). 아미드 X(110mg, 0.33mmol)를 메탄올계 수산화칼륨(5% w/v) 1.5mL에 용해시켰다. 주위 온도에서 2시간 동안 교반시킨 후에, 혼합물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기층을 염수로 2회 세척하고, 건조시킨 다음, 진공하에 농축시켰다. 조악한 옥사졸린을 섬광 컬럼 크로마토그래피(1:1 Hex/EtOAc)로 정제하여 목적하는 생성물(I) 70mg을 73%의 수율로 수득하였다; 융점: 53 내지 55℃; 1H (CDCl3, 400MHz) δ 4.37 (t, J = 9.6Hz, 2H), 3.95 (s, 2H), 3.95 (t, J = 9.4Hz, 2H), 3.22 (t, J = 8.2Hz, 2H), 1.90-1.79 (M, 2H), 1.46-1.42 (M, 2H), 1.30-1.23 (M, 12H), 0. 87 (T, J = 6.0Hz, 3H).
화학식 II의 화합물
불활성 대기하에 무수 메틸렌 클로라이드 3mL를 함유하는 화염 건조된 환저 플라스크에 3-설포닐운데카노산 IX(150mg, 0.6mmol) 및 CDI(102mg, 0.63mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 이소니코틴산 하이드라지드(86mg, 0.63mmol)를 첨가하고, 반응물을 추가의 6.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공하에 농축시키고, 조악한 하이드라지드(II)를 섬광 크로마토그래피(98% EtOAc/2% 아세트산)로 정제하여 백색 고체 122g을 56%의 수율로 수득하였다. 1H (DMSO-d6, 400MHz) δ 10.98 (bs, 1H), 10.57 (bs, 1H), 8.77 (bs, 2H), 7.78 (d x d,J1 = 1.2Hz, J2 = 5.4Hz, 2H), 4.21 (s, 2H), 3.30 (t,J = 8Hz), 1.76-1.68 (m, 2H), 1.42-1.34 (M, 2H), 1.30-1.23 (m, 12H), 0.84 (t,J = 6.8Hz).
화합식 IV의 화합물
무수 메틸렌 클로라이드 3㎖가 함유된 화염 건조된 환저 플라스크에 3-설포닐운데칸산 158.4mg(0.6mmol)과 1,1-카보닐디이미다졸(CDI) 115.7mg(0.72mmol)을 불활성 분위기하에서 가하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 2-푸로익 하이드라진 90mg(0.72mmol)을 가하고, 반응물을 3시간 동안 추가로 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시킨 후에, 포화 중탄산나트륨 2회, 희석 HCl로 3회, 포화 NaCl로 1회 세척하였다. 당해 유기물을 황산마그네슘으로 건조시키고 감압하에서 농축시켰다. 조악한 생성물 IV를 EtOAc/Hex(3:1)으로부터 재결정시켜 옅은 갈색 분말(147mg, 66%)을 수득하였다; 융점: 130 내지 131℃; 1H (DMSO-d6, 400MHz) δ 10.53 (s, 1H), 10.38 (s, 1H), 7.90 (d x d,J1= 0.4Hz, J2 = 1.6Hz, 1H), 7.24 (d x d,J1 =0.6Hz, J2 = 3.4Hz), 6. 65 (d x d,J1 =1.6Hz, J2 = 3.6HZ), 4.17 (s, 1H), 3.28 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 1.75-1.67 (M, 2H), 1.42-1.33 (m, 2H), 1.30-1.23 (M, 12H), 0.84 (t, J = 6.8Hz, 3H).
화학식 VI의 화합물
무수 메틸렌 클로라이드 3㎖가 함유된 화염 건조시킨 환저 플라스크에 3-설포닐운데칸산(163mg, 0.62mmol)과 CDI(113.9mg, 0.74mmol)를 불활성 분위기하에서 가하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 트리에틸아민(TEA)(89㎕, 0.63mmol)과 4-클로로페닐하이드라진 하이드로클로라이드(115mg, 0.62mmol)를 가하고 반응물을 2시간 동안 추가로 교반하였다. 조악한 생성물 VI을 섬광 크로마토그래피(40% EtOAc/60% Hex)로 정제하였다(112mg, 수율 46%). 1H (DMSO-D6, 400MHz) δ 10.13 (d, J = 2.4Hz, 1H), 8.14 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.18-7.14 (m, 2H), 6.78-6.72 (M, 2H), 4.12 (s, 2H), 3.24 (t, J = 7.8Hz, 3H), 1.74-1.66Hz (m, 2H), 1.40-1.32 (m, 2H), 1.30-1.23 (m, 12H), 0.84 (t, J = 6.8Hz, 3H).
화합식 VIII의 화합물
무수 메틸렌 클로라이드 3㎖가 함유된 화염 건조시킨 환저 플라스크에 3-설포닐운데칸산(300mg, 1.1mmol)과 CDI(214mg, 1.3mmol)를 불활성 분위기하에서 가하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. TEA(154㎕, 1.1mmol)와 메틸 글리시네이트 하이드로클로라이드(138mg, 1.1mmol)를 가하고 반응물을 4시간 동안 추가로 교반하였다. 조악한 에스테르 VIII을 섬광 크로마토그래피(50 내지 100% EtOAc/Hex)로 정제하여 백색 고형물(202mg, 56%)을 수득하였다; 융점: 82 내지 84℃; 1H (CDCl3, 400MHz) δ 7.13 (bs, 1H), 4.07 (d, J = 6Hz, 2H), 3.93 (s, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.23 (t,J = 8Hz, 2H), 1.90-1.82 (2H, m) 1.46-1.40 (m, 2H), 1.30-1.25 (m, 12H), 0.87 (t,J = 6.8Hz, 3H); 13C (CDCl3, 100MHz).
화합식 Ⅲ의 화합물의 제조
화합식 Ⅲ의 화합물은 (±)-α-메틸렌-γ-부티로락톤-5-옥틸-4-카복실산(C75)으로부터 화학식 7의 화합물을 제조하는 2단계 합성으로 제조한다. C75는 미국 특허 제5,981,575호에 명시된 바와 같이 제조할 수 있다.
CH3CN(0.9㎖) 중의 C75(30mg, 0.12mmol) 용액에 트리스(2-옥소-3-옥사졸리닐) 포스핀 옥사이드(91.7mg, 0.2mmol), 에탄올아민(7.8㎕, 0.13mmol) 및 NEt3(0.04㎖, 0.3mmol)를 가하고, 당해 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 NH4Cl(포화)/1N HCl(10㎖, 3:1) 용액 속에 적가하고, Et2O(3 ×15㎖)로 추출하였다. 합한 유기물을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 증발시키고, 크로마토그래피로 정제(35% EtOAc/헥산)하고, 섬광 크로마토그래피(50% EtOAC/헥산 - 100% EtOAc/2% CH3CO2H)로 정제한 후에 화학식 7의 화합물(32mg, 91%)을 수득하였다. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 0.86 (t, J= 6.9Hz, 3 H), 1.24 (s, 10H), 1.35-1.48 (m, 2H), 1.64-1.75 (m, 2H), 3.40-3.57 (m, 3H), 3.74 (t, J= 5Hz, 2H), 4.73-4.79 (dt, J= 5.7, 7Hz, 1H), 5.82 (d, J= 2Hz, 1H), 6.42 (d, J= 2Hz, 1H).
CH2Cl2(0.7㎖) 중의 화학식 7의 화합물(44.9mg, 0.15mmol)에 디메틸아미노피리딘(DMAP)(4mg, 0.03mmol)과 알릴 이소시아네이트(20㎕, 0.22mmol)를 가하고, 당해 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 NH4Cl(포화)(10㎖) 속에 적가하고, CH2Cl2(3 ×10㎖)로 추출하였다. 당해 유기물을 합하고 MgSO4로 건조시키고 증발시켜 조악한 화학식 15의 화합물를 수득하였다. 섬광 크로마토그래피(EtOAc)로 정제하여 순수한 화학식 15의 화합물(19mg, 33%)를 수득하였다. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 0.85 (t, J = 6Hz, 3H), 1.24 (m, 11H), 1.35-1.48 (M, 1H), 1.62-1.79 (m, 2H), 3.38-3.40 (m, 1H), 3.51-3.52 (m, 2H), 3.78 (t, J = 5.2Hz, 2H), 4.20-4.21 (m, 2H), 4.73-4.79 (m, 1H), 4.96 (bt, 1H), 5.09-5.20 (m, 2H), 5.75-5.86 (m, 1H), 5.79 (d, J = 2.3Hz, 1H), 6. 38 (d, J = 2.3Hz, 1H).
화학식 V의 화합물 및 화학식 Ⅶ의 화합물의 제조
당해 화합물을 몇개의 중간체로의 합성에 의해 제조하였다.
제1 단계에서 화학식 23의 화합물을 다음과 같이 제조하였다:
THF(9.7㎖) 중의 -78℃ LiHMDS(6.2㎖, 6.20mmol, THF 중의 1M 용액) 용액에 THF(9.60㎖) 중의 (±)-화학식 1의 화합물(1.00g, 5.75mmol)을 캐뉼러(cannula) 적하방식으로 가하고, 생성된 용액을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, -78℃에서 THF(4㎖) 중의 옥틸 트리플레이트(1.63g, 6.20mmol)를 캐뉼러를 통하여 가하였다. -78℃에서 2시간 동안 교반한 후에, 1N HCl(10㎖)을 가하고 당해 용액을 Et2O(3 ×15㎖)로 추출하였다. 합한 유기물을 MgSO4로 건조시키고 여과하고 증발시켰다. 섬광 크로마토그래피(2% EtOAc/헥산)로 정제하여 분리될 수 있는 부분입체이성질체들(1.33g, 81%)의 2:1 내지 6:1 혼합물로서의 순수한 화학식 23의 화합물을 수득하였다. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 0.86 (t, J = 6.5Hz, 3H), 0.99 (s, 9H), 1.24-1.26 (m, 12H), 1.54 (s, 3H), 1.72-1.84 (m, 2H), 5.13 (s, 1H) ; 13C NMR (75MHz, CDCl3) 8 13.9, 22.6, 24.9, 25.1, 25.9, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 35.2, 41.2, 55.3, 86.5, 177. 7. IR (NaCl) 3443, 2929, 1829, 1769 cm-1; Cl6H3O O2S에 대한 분석치: C, 67.0 ; H, 10.6; 실측치: C, 66.3; H, 10.5. HRMS (E1) C16H3002S+(M+)에 대한 m/z 계산치: 286.1967; 실측치: 286.1969.
이어서, 화학식 26의 화합물을 제조하였다:
EtOH(14.1㎖) 중의 화학식 23의 화합물(650mg, 2.27mmol)에 NaOEt(2.1M)(2.16㎖, 4.54mmol)[당해 제조 직전에, EtOH(4.0㎖) 중의 Na 금속(200mg, 8.3mmol)으로부터 제조됨]를 가하고, 당해 용액을 실온에서 교반하였다. 2시간 후에, 당해 용액을 NH4Cl(포화)/1N HCl(25㎖, 3:1) 속에 적가하고, 당해 혼합물을 Et2O(3 ×20㎖)로 추출하였다. 합한 유기물을 H20(3 ×25㎖)로 세척하고, MgSO 4 로 건조시키고, 여과하고 증발시켜 조악한 화학식 25의 화합물를 수득하였다. 0℃에서, CH2Cl2(26㎖)에 용해된 화학식 25의 화합물에 NEt3(0.5㎖, 3.49mmol)와 알키닐 클로라이드(0.3㎖, 3.49mmol)를 가하였다. 0℃에서 40분 후에, NH4Cl(포화)(30㎖)을 가하고 당해 용액을 CH2Cl2로 추출하였다. 합한 유기물을 MgSO4로 건조시키고 여과하고 증발시켰다. 섬광 크로마토그래피(5% EtOAc/헥산)로 정제하여 순수한 화학식 26의 화합물(542mg, 79%)을 수득하였다. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 0.87 (t, J = 6.9Hz, 3H), ; 1.22-1.27 (m, 15H), 1.61 (s, 3H), 1.75-1.84 (M, 2H), 2.26 (s, 3H), 4.18 (Q, J = 7.1Hz, 2H); 13C NMR (75MHz, CDCl3) 8 13.9, 14.1, 22.6, 23.4, 24.4, 29.1, 29.2, 29.6, 30.3, 31.8, 38.3, 55.8, 61.5, 173.1, 195.8. IR (NaCl) 3430, 1868, 1693, 1644; C15H28O4S에 대한 분석치 C, 62.5 ; H, 9.78 ; 실측치: C, 62.6 ; H, 9.83.
화학식 26의 화합물으로부터 화학식 32의 화합물를 제조하였다:
-78℃에서, 톨루엔(27㎖) 중의 화학식 26의 화합물(500mg, 1.7mmol)에 LiHMDS(4.3㎖, 4.3mmol, THF 중에서 1.0M)를 가하고, 당해 용액을 -5℃로 천천히 가온하였다. 당해 용액을 1N HCl(40㎖) 속에 적가하고, EtOAc(3 ×25㎖)로 추출하였다. 합한 유기물을 MgSO4로 건조시키고 여과하고 증발시켰다. 섬광 크로마토그래피(20% EtOAc/2% CH3CO2H/헥산)로 정제하여 화학식 32의 화합물(308mg, 73%)를 수득하였다. 1H NMR (300MHz, CDCl3) (케토-토토머) 8 0.86 (t, J = 6Hz, 3H), 1.19-1.24 (m, 10H), 1.48-1.53 (M, 2H), 1.65 (s, 3H), 1.77-1.85 (m, 1H), 1.94-2.01 (M, 1H), 3.36 (s, 2H) ; 1H NMR (300MHz, MeOD) (에놀 토토머) 0.87-0.89 (m, 3H), 1.29 (M, 10H), 3.29 (s, 3H), 1.81-1. 87 (m, 2H); 13C NMR (75 MHz, MeOD) (에놀 토토머) δ 14.7, 23.8, 26.4, 27.1, 30.5, 30.6, 30.8, 33.2, 39.8, 61.3, 103.1 (m), 189.8, 197.8. IR (NaCl) 3422,1593; C13H2202S에 대한 분석치 C, 64.4; H, 9.15 ; 실측치: C, 64.3 ; H, 9.10.
이어서, 화학식 50의 화합물을 제조하였다:
방법 H에 따라 화학식 32의 화합물(60mg, 0.25mmol)와 3급-부틸 브로모아세테이트(73㎕, 0.49mmol)로부터 제조하고, 섬광 크로마토그래피(15% EtOAC/헥산)로 정제하여 화학식 50의 화합물(62mg, 70%)을 수득하였다. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 0.86 (t, J = 7Hz, 3H), 1.24 (s, 12H), 1.49 (s, 9H), 1.68 (s, 3H), 1.83-1.86 (m, 2H), 4.43 (s, 2H), 5.19 (s, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) C 14.0, 22. 6, 25.2, 26.3, 28.1, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 38.9, 59.7, 68.5, 83.4, 102.1, 165.2, 185.5, 193.4. C19H3204S에 대한 분석치 C, 64.0 ; H, 9.05 ; 실측치: C, 64.1 ; H, 9.08.
이어서, 화학식 53의 화합물을 다음과 같이 제조하였다:
CH2C12(1.4㎖)에 용해된 화학식 50의 화합물(65mg, 0.18mmol)에 트리플루오로아세트산(TFA)(0.7㎖)을 가하고, 당해 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 조악한 물질을 크로마토그래피로 정제(20% EtOAc/2% CH3CO2H/헥산)하여 순수한 화학식 53의 화합물(48mg, 89%)을 수득하였다. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 0.86 (t,J = 6.9Hz, 3H), 1.24 (s, 11H), 1.47-1.48 (M, 1H), 1.68 (s, 3H), 1.84-1.88 (M, 2H), 4.62 (s, 2H), 5.31 (s, 1H); 13C NMR (75MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.6, 25.1, 26.1, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 38.9, 60.1, 67.7, 102.4, 169.8, 185.8, 195.4. IR (NaCl) 3442,1645; C15H24O4S에 대한 분석치 C, 59.9 ; H, 8.05 ; 실측치: C, 60.0 ; H, 8.09.
마지막으로, 화학식 53의 화합물으로부터 화학식 V의 화합물을 제조하였다.
CH2Cl2(1.61㎖) 중의 화학식 53의 화합물(100mg, 0.33mmol)의 냉각된 용액(0℃)에 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)(128mg, 0.43mmol), DMAP(6.0mg, 0.05mmol) 및 2-푸로익 하이드라진(54mg, 0.43mmol)을 가하였다. 당해 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 실온으로 가온시킨 후에 12시간 동안 교반하였다. 당해 용액을 NH4Cl(10㎖)(포화) 속에 적가하고 CH2Cl2(3 ×10㎖)로 추출하였다. 합한 유기물을 MgSO4로 건조시키고 여과하고 증발시켜 조악한 화학식 V의 화합물를 수득하였다. 섬광 크로마토그래피(10% EtOAc/Hex)로 정제하여 순수한 화학식 V의 화합물(91mg, 68%)를 수득하였다. 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 0.84 (t,J = 6.6Hz, 3H), 1.21 (m, 11H), 1.43-1.47 (m, 1H), 1.66 (s, 3H), 1.81-1.86 (m, 2H), 4.64 (s, 2H), 5.42 (s, 1H), 6.47 (dd.J = 1.6, 3.6Hz, 1H), 7.16 (d,J= 4Hz, 1H), 7.45 (m, 1H), 9.32 (d, J = 4Hz, 1H), 9.44 (d, J= 4Hz, 1H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 14.0, 22.6, 25.3, 26.0, 29.2, 29.3, 29.5, 31.7, 38.8, 59.7, 69.1, 103.0, 112.3, 116. 5, 145.1, 145.4, 156.4, 164.2, 184.8, 193.9.
또한, 다음과 같이 화학식 Ⅶ의 화합물을 화학식 53의 화합물로부터 제조하였다: 화학식 V의 화합물을 제조하기 위해 사용한 방법과 동일한 방법에 따라, 화학식 53의 화합물(100mg, 0.33mmol)과 4-클로로페닐하이드라진 하이드로클로라이드(76.8mg, 0.43mmol)를 사용하여 화합물을 제조하고, 이를 섬광 크로마토그래피(50% EtOAc/Hex)로 정제한 후에, 화학식 Ⅶ의 화합물(74mg, 53%)을 수득하였다. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 0.86 (t,J = 6Hz, 3H), 1.24 (m, 11H), 1.46-1.54 (m, 1H), 1.71 (s, 3H), 1.82-1.90 (m, 2H), 4.57 (s, 2H), 5.39 (s, 1H), 6.75 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.18 (d,J= 8.8Hz, 2H), 7.38 (s, 1H), 8.09 (s, 1H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.6, 25.3, 26.1, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 38.8, 59.7, 69.7, 103.2, 114.7, 126.4, 145.8, 129.2, 165.9, 184.3, 193.5. IR(NaCl) 2957, 1695, 1658, 1609cm-1.
단백질 검정: 미코박테리아 및 배양물. DMSO(희석제), OSA(6.25 및 100 ㎍/ml), 세룰레닌(24㎍/ml) 또는 이소니아지드(1.0㎍/ml)를 대조물 20ml에 가하고, 배양물을 각각 처리한다. 동일한 조건하에 24시간 동안 추가로 항온처리한 후, 세포 2ml 분취량을 원심분리에 의해 수집(30초 동안, 13,000 ×g)하고, 상청액을 제거한 다음, 당해 공정을 1X PBS를 사용하여 한번 더 반복한다. 각각의 튜브의 세포질 함량을 2 내지 3개의 에펜도르프(튜브당 약 3 내지 5개의 OD 단위)로 나누고, 3M 우레아(제조원: Sigma), 0.5% 트리톤 X-100(제조원: Sigma), 500mg 디티오트레이톨(DTT)[제조원: 미국 메릴랜드주 게티스버그에 소재하는 기브코 비알엘, 라이프 테크놀로지스(Gibco BRL, Life Technologies)] 및 500㎕ 파말라이트[제조원: 미국 뉴 저지주 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)]를 가한다. 후속적으로, 페닐메틸설포닐 플로우라이드(PMSF)(제조원: Sigma)(100㎍/ml) 및 류펩틴(2㎍/ml)(제조원: Sigma)도 가한다. 세포 및 용해 용액을 함유하는 혼합물은 200 내지 300㎛ 유리 비드를 사용하는 바이오스펙 미니-8 비드비터(제조원: Sigma)에서 최대 속도 60초 동안 비드비팅된다. 당해 공정은 교반 공정들 사이에 빙상에서 30초 간격으로 샘플당 2회 반복 수행한다. 각각의 튜브의 내용물을 최소 30초 동안 원심분리(13,000 ×g)하고, 단백질 함유 상청액을 제거한다. 단백질 농도는 표준화된 열량계 검정[미국 일리노이주 락포드 피어스 소재의 쿠마씨 플러스(Coomassie Plus) 및 BSA 표준(Pierce)을 사용하여 시마드주(Shimadzu) UC-1201 분광계에서 측정한다. 정량화된 샘플을 분취량으로 나누고 -70℃에서 동결시킨다.
단백질 검정: 시간 경과 과정. 스톡 BCG(500ml) 분취량으로 분할하고, DMSO 또는 OSA(100㎍/ml)를 각각의 대조물에 가하고, 배양물을 처리한 다음, 37℃에서 1시간 동안 항온처리 및 포기처리한다. 화합물을 첨가한지 처음 4시간 동안은 매시간 간격으로, 그 이후에는 16시간, 24시간 및 48시간의 시점에서 각각의 배양물로부터 분취량(20ml)를 제거한다. 세포를 저속 원심분리에 의해 수집하고, 멸균 증류수에서 1회 세척하고, -70℃에서 동결시킨다.
단백질 검정: 2-D 겔 및 잠정적 표적의 서열화. 각각의 단백질 샘플 약 250㎍을 8M 우레아, 0.5% 트리톤 X-100, 파말라이트 3-10, DTT 및 소수의 그레인의 브로모페놀 블루(제조원: Sigma)(240㎕ 총 용적/샘플)를 함유하는 용액과 혼합한다. 당해 혼합물을 사용하여 상업적으로 제조된 아크릴아미드 pH 스트립(구배 4 내지 7)을 제조업자의 표준 프로토콜(Pharmacia Biotech)을 사용하여 실온에서 밤새 재수화시킨다. 후속적으로, 완전히 재수화된 스트립을 표준 프로토콜(Pharmacia Biotech)에 따라 2차원 단백질 겔 시스템에 적용시킨다[제1 차원 - 20℃에서 16시간, 트리스-HCl(pH 6.8), 우레아(8M), 글리세롤(30%)(제조원: Sigma) 및 SDS(1mg/ml)(제조원: Sigma)와 함께 각각 DTT 또는 요오도아세트아미드(제조원: Sigma)를 함유하는 용액에서 각각의 겔 스트립을 평형화한다]. 평형화 이후, 스트립을 상업적으로 제조된 아크릴아미드 겔(245 ×110 ×0.5mm, 구배 8 내지 18%, Pharmacia)에 적용시키고, 제조업자의 표준 프로토콜(Pharmacia)에 따라 2시간 동안 15℃에서 수행한다. 분자량 표준물(크기 범위: 14 내지 200kD)을 기브코 비알엘, 라이프 테크놀로지스로부터 구입하고, 겔당 10㎕를 적하한다. 겔을 쿠마씨 블루(제조원: Sigma)로 밤새 착색처리함으로써 단백질을 가시화시킨다. 추가의 착색물은 메탄올:물:아세트산(9:9:2, 제조원: Sigma)로 2 내지 3회 세척하여 제거한다. 4개의 겔로부터 관심 대상인 단백질을 풀링하고, 절개된 겔 분획을 50% 아세토니트릴로 2회 세척한다. 후속적인 단백질 서열화는 하바드 마이크로케미스트리(Harvard Microchemistry; 미국 매사츄세츠주 캠브릿지 소재)에 의해 수행된다.
RNA 추출. 전체 RNA를 DMSO(희석제) 또는 OSA로 밤새 처리된 BCG 배양물 15ml로부터 트리졸 시약[제조원: 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)] 1ml로 추출한다. 후속적으로, 박테리아성 세포를 30초 동안 미니-비드비터 속에서 균질화하고(2회), 당해 박테리아성 용해물에 클로로포름을 가한다. 이소프로판올을 사용하여 전체 RNA를 침전시키고, 에탄올로 세척한 다음, 증류수(DNAse, RNAse 비함유, 제조원: Invitrogen) 속에서 재현탁시킨다. 전체 RNA를 DNAse I[제조원: 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아겐(Qiagen)]로 용해시키고, RNeasy 미니-키트(제조원: Qiagen)로 정제한다. cDNA로의 역전사는 2㎍의 RNA 및 슈퍼 스크립트 II, RNAse H-역전사효소(제조원: Invitrogen)를 사용하여 수행한다.
PCR 프로토콜. PCR 증폭은 퍼킨 엘머 2400 더말 사이클러(Perkin Elmer 2400 thermal cycler)에서 수행한다. 각각의 PCR 반응은 2㎕의 cDNA, 2.5mM MgCl, 0.2mM dNTP(제조원: Introgen) 및 2.5단위의 타크 폴리머라제(제조원: Invitrogen)를 함유한다. 증폭 파라미터는 95℃에서 1분, 60℃에서 1.5분 및 72℃에서 2분의 30주기를 수반한다. 연장은 72℃에서 10분 동안 수행된다. 후속적으로, 당해 온도는 4℃로 설정되었다. 반응 생성물은 아가로즈 겔 전기영동에 의해 평가한다.
서던 하이브리드화. PCT 생성물을 20X SSC의 서던 블롯팅에 의해 나일론 멤브레인 위에 전사한다[미국 인디애너주 인디애나폴리스 소재의 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)]. 후속적으로, 개별 멤브레인을 유전자 특이적 디곡시게님(Digoxigenin) 11- dUTP 표지된 PCR 분획을 사용하여 42℃에서 밤새 하이브리드화한다. 이어서, 탐침을 제거하고, 멤브레인을 엄격성이 낮은 완충제(2X SSC, 0.1% SDS)와 엄격성이 높은 완충제(0.5% SSC, 0.1% SDS)에서 실온에서와 68℃에서 각각 15분 동안(2회) 세척한다. 디그 표지된 핵산은 시판 중인 화학적 발광 키트(제조원: Roche)를 사용하여 검측한다.
ATP 검정. 희석제 또는 OSA를 BCG 배양물 120ml에 가한다(100㎍/ml 또는 16X, 배양된 MIC). 추가의 항미코박테리아제가 또한 OSA(16X, 이들 각각의 MIC)에 대해 사용된 바에 필적하는 농도에서 시험된다. 이들은 화합물 I 내지 VIII 각각, 이소니아지드(1NH, 1.6㎍/ml), 리팜핀(RIF, 32㎍/ml), 스트렙토마이신(STR, 32㎍/ml), 에탐부톨(EMB, 32㎍/ml), 및 두 가지 농도(1.5㎍/ml 및 24㎍/ml)의 세룰레닌을 포함한다. 시험되는 공지된 호흡 연쇄 억제제는 DCCD(100㎍/ml), ATP 신타제-특이적 억제제, TTFA (100㎍/ml) 호흡 컴플렉스 II-특이적 억제제, Rot(25㎍/ml) 호흡 컴플렉스 I-특이적 억제제, 및 디쿠마롤(DC, 7㎍/ml) 대안적 탈수소화제 억제제를 포함한다.
초기 단일 시점 및 다중 시점 검정이, 배양물 분취량(30ml)을 1시간, 3시간 및 24시간의 시점에서 제거하고, 바로 얼음위에 놓음으로써 수행된다. 모든 후속적인 조작은 4℃에서 수행된다. 추가의 시간 경과 과정은 동일한 과정을 사용하여 5분, 30분 및 180분의 시점에서 수행된다. 세포는 원심분리에 의해 수집하고, ATP 추출 완충액(100 mM 트리스, 4mM EDTA, pH 7.5)에서 최대 속도로 총 2분 동안 200 내지 300㎛ 유리 비드를 사용하여 비드비팅함으로써 파괴된다. 세포 단편은 원심분리(13,000 ×g, 15분 동안)에 의해 제거하고, ATP 함유 상청액을 깨끗한 튜브에 전달한다. 시판 중인 ATP 생물학적 발광 검정(Roche Diagnostics)을 사용하여, 처리된 샘플과 대조용 샘플에서의 ATP 수준을 측정한다. 상대 광원 단위를 월락 빅터(Wallac Victor)2 TM 루미노미터에서 측정한다. M7H10-ADC 한천에 분취량을 적층시키고 37℃에서 5% CO2 속에서 3주 동안 항온처리함으로써 각각의 배양물에 대해 콜로니 계수(CFU/ml)를 측정한다. ATP 농도[M]는 처리된 그룹과 처리되지 않은 그룹의 CFU에 대해 계산되고, 이후 상대 [M]ATP가 대조용에 대해 처리된 수치를 표준화시킴으로써 계산된다. 통계적 유의성은 2-테일드 스튜던츠의 t-시험을 사용하여 계산된다.
에탄올의 존재하에서의 OSA의 활성
호흡 기질인 에탄올의 존재하에서의 OSA의 시험관내 활성은 표준 BACTEC 방사법 성장 과정(44)을 변형시킨 방법을 사용하여 측정하였다. 요약하면, 접종물을 유리 비드 및 시판 희석 유액[제조원: 미국 메릴랜드주 스팍스에 소재하는 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)]을 사용하여 로웬스타인-젠센 한천 슬랜트(Lowenstein-Jensen slant)[제조원: 미국 미시건주 디트로이트에 소재하는 디프코(Difco)]에 유지시킨 미코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 배양액으로부터 제조하였다. 미코박테리아 현탁액을 유리 비드로 볼텍스하여 30분 동안 침강시켰다. 상청액을 1.0 맥파랜드(McFarland) 표준액으로 조절하여 각각의 BACTEC 12B 병에 접종하였다(0.1㎖). OSA를 최종 농도가 1.5㎍/㎖, 3.0㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖ 및 25.0㎍/㎖로 되도록 각 병에 가하였다. 배합 시험에 사용되는 최종 에탄올 농도는 0.05%였다. OSA에 대해 관찰되는 상승 효과가 화학물-특이적인 것인지 또 다른 항미코박테리아성 약제에서 일반적인 것인지를 결정하기 위해, 스트렙토마이신(0.5㎍/㎖, 1.0㎍/㎖ 및 2.0㎍/㎖)과 에탄올과의 배합물도 시험하였다. 모든 병을 37℃에서 항온처리하여 각 병의 성장 지수(GI)를 매일 기록하였다.
OSA 및 기타의 호흡 연쇄 억제제(respiratory chain inhibitor)를 사용한 BCG의 처리 및 14C-아세테이트 지질 펄스-라벨링
BCG(50㎖)를 초기 log기(OD=A600 0.2)로 되도록 M7H9-ACD-트윈(제조원: 디프코) 속에서 37℃에서 호기 상태로 성장시켰다. 이때, [1,2 14C]아세트산[제조원: 미국 일리노이주 앨링턴 하이츠에 소재하는 아머샴(Amersham)] 1μCi/㎖와, 희석제(DMSO), OSA(100㎍/㎖), DCCD(100㎍/㎖) 또는 TTFA(100㎍/㎖) 중의 어느 하나를 각각의 배양액에 가하여 동일 조건하에서 10분 동안 항온처리하였다. 배양액을 즉시 얼음위에 놓고 4℃에서 3,000xg에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 수거하였다.
마이콜산의 제조 및 분석
마이콜산 추출을 문헌[참조; Dobson, G., et al.,"Systematic analysis of complex mycobacterial lipids," in Chemical Methods in Bacterial Systematics, p. 237-265. M. Goodfellow and D. Minnikin (eds.), Academic Press, London (1985), and Minnikin, D., et al., "Extraction of mycobacterial mycolic acids and other long-chain compounds by an alkaline methanolysis procedure," Journal of Microbiological Methods, 2:243-249(1984)]에 이미 기재되어 있는 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 상기 참고문헌으로부터 확립된 프로토콜에 따라 동일 용적의 세포(60mg 습윤 중량)로부터 추출 가능한 극성 및 비극성 지질을 제거하였다. 이렇게 하여 수득된 결합된 마이콜산을 함유하는 탈지 세포를 75℃에서 밤새 메탄올(1㎖), 30% KOH(1㎖) 및 톨루엔(0.1㎖) 속에서 알칼리 가수분해시킨 다음 실온으로 냉각시켰다. 이어서, 혼합물을 3.6% HCl을 사용하여 pH 1로 산성화시키고 디에틸 에테르로 3회 추출하였다. 합한 추출물을 N2하에서 건조시켰다. 디클로로메탄(1㎖), 촉매 용액(1㎖)(26) 및 요오도메탄(25㎖)을 30분 동안 혼합하고 원심분리한 다음 상층을 버림으로써 마이콜산의 지방산 메틸 에스테르를 제조하였다. 하층을 N2하에서 건조시켰다. 14C-아세트산의 마이콜산으로의 도입을 신틸레이션 계수법[벡크만(Beckaman) LS6500 다목적 신틸레이션 계수기]으로 측정하여 값을 비처리 대조군의 %로서 표현하였다. BCG의 초기 log기 배양액에 10분간 노출시킨 후 OSA(100㎍/㎖), DCCD(100㎍/㎖) 및 TTFA(㎍/㎖)가 마이콜산 합성에 미치는 효과를 비교한 결과가 도 7에 도시되어 있다.
결과
초기에는, BCG에서 OSA에 24시간 노출시킨 후 2차원 겔 전기영동 프로필을 실험함으로써 OSA-특이적 단백질 표적의 정량적 및 정성적 동정을 시도하였다. 선행 연구자들은 문헌[참조; Mdluli D., et al., "Inhibition of a Mycobacterium tuberculosis β-ketoacyl ACP synthase by isoniazid," Science, 280: 1607-1610 (1998)]에 기재된 바와 같이 미코박테리움 투베르쿨로시스 중의 이소니아지드의 효소적 표적을 동정하는 데 유사한 방법을 성공적으로 사용하였다. 도 2(오른쪽)에 도시되어 있는 바와 같이, OSA로 처리시 분자량이 대략 17 내지 18kD인 두 개의 비교적 작은 단백질이 상당히 과발현되었다. 두 개의 단백질 모두는 상응하는 비처리 대조군에서는 검지되지 않았다(도 2, 왼쪽). 과발현은 OSA의 MIC(6.25㎍/㎖) 및 용량 의존적 방식으로 MIC(100㎍/㎖)의 16배(16X) 이하의 농도 둘 다에서 발생하였다. 35S-메티오닌 펄스-라벨링을 사용한 별도의 시간 경과 실험(time-course experiment)에서, 두 개의 단백질 모두 OSA 노출후 적어도 3.5시간내에 과발현되는 것으로 입증되었다. 비교용에서, BCG를 강력한 항미코박테리아 억제제인 세룰레닌 또는 이소니아지드 중의 어느 하나로 처리한 결과 MIC의 16X 이하의 농도에서 단백질이 과발현되지 않았다. 또한, 어느 단백질도 OSA 처리된 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)(이는 당해 화합물에 고유 내성을 갖는다)에서 과발현되지 않았다.
두 개의 단백질 각각을 함유하는 2차원 겔 단편을 서열화한 결과, 보다 주요한 종은 등전점(pI)이 5.0인 17,786dalton의 작은 열충격 단백질(hsp, Rv 0251c)인 것으로 입증되었다. 제2 단백질은 분자량이 18,325dalton이고 pI가 4.9인 atpF 유전자(Rv1306)에 의해 암호화된 ATP 합성 효소의 b-아단위로서 동정되었다. 두 가지 단백질 모두의 과발현은 RT-PCR에 의해 확인되었다(도 3 참조).
b-아단위와의 상호 작용을 통해 ATP 합성 효소에 결합될 수 있다고 제안한 단백질 데이타를 기초로 하여, 공지된 ATP 합성 효소 억제제인 DCCD와 비교하여 BCG에서 ATP 수준에 미치는 OSA(㎍/㎖)의 효과를 실험하기 위해 24시간에 걸친 시간 경과 연구를 수행하였다. 도 4에 도시되어 있는 바와 같이, ATP[M] 수준은 노출시킨지 1시간 후 비처리 대조군에 비해 OSA 처리된 BCG에서 상당히 감소하였다(46%). 이러한 경향은 24시간 동안 지속되었으며, 각각 ATP[M]가 54% 및 85% 감소하였다. 이러한 차이는 각 시점에서 통계학적으로 유의하였다(p < 0.02). ATP 합성 효소의 억제제인 DCCD도 ATP[M] 수준을 현저하게 저하시키며, 모든 시점에서 95% 감소를 나타내었다(p=0.003).
화합물 I 내지 VIII 각각에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다.
OSA가 ATP[M] 농도에 미치는 효과가 얼마나 빨리 나타나는지를 측정하기 위해 후속 실험을 수행하였다. 도 5(패널 A)에 도시되어 있는 바와 같이, OSA는 적어도 5분내에 비처리 BCG에 비해 처리군에서 ATP 수준을 상당히 감소시켰다. 이러한 차이는 통계학적으로 유의하였다(p=0.004). 특이적 ATP 합성 효소 억제제인 DCCD에서도 통계학적으로 유의적인 감소(p=0.001)가 나타났다. 호흡 복합체 II 억제제(인 TTFA로 처리하면 상응하는 시점에서 ATP가 단지 적당히 감소하였다.
OSA가 ATP 수준에 미치는 효과가 BCG에서의 일반화된 스트레스 반응의 결과인지를 측정하기 위해, INH, RIF, EMB 및 STR과 같은 추가의 항미코박테리아제를 OSA에 대해 사용된 농도에 필적하는 농도에서 시험하였다(이들의 각각의 MIC의 16X, INH 1.6㎍/㎖, RIF 32㎍/㎖, STR 32㎍/㎖, EMB 32㎍/㎖ 및 세룰레닌 24㎍/㎖). 도 5(패널 B)에 도시되어 있는 바와 같이, BCG를 표준 항미코박테리아 약제(이들 각각의 MIC의 16X)로 처리하면 노출한지 5분 동안의 상응하는 시점에서 비처리 대조군에 비해 ATP 수준에 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다. 추가의 시험 화합물에는 또 다른 탈수소 효소 억제제인 디쿠마롤, NADH 탈수소 효소(호흡 복합체 I)에 특이적인 로테논(Rot) 및 지방산 합성 효소 억제제인 세룰레닌이 포함된다. 이러한 화합물 그룹에서는 ATP 수준의 뚜렷한 감소가 나타나지 않았다(도 5, 패널 C 참조).
ATP 합성 효소 및 호흡 연쇄의 다른 성분의 가능한 관련성으로 인해, 에탄올(0.05%)의 존재하에서의 OSA에 대한 연구를 수행하였다. 에탄올은 호흡 기질이며, 예를 들면, 문헌[참조; Beauvieux, M. P., et al., "Ethanol perfusion increases the yield of oxidative phosphorylation in isolated liver of fed rats," Biochim. Biophys. Acta, 570: 135-140 (2002)]에서 보여지는 바와 같이 세포 호흡을 연구하기 위해 여러 연구자들이 사용해왔다. 도 6에 도시되어 있는 바와 같이, 0.05% 에탄올은 OSA가 성장 억제에 미치는 효과를 강력하게 하여 미코박테리움 투베르쿨로시스 H37Rv에서 MIC를 6.25㎍/㎖에서 1.5㎍/㎖ 미만으로 감소시켰다. 에탄올과 스트렙토마이신 사이에는 활성 강화가 관찰되지 않았다. 이전에, 본 발명자들은 BCG를 OSA로 처리하면 마이콜산이 감소하지만 이러한 경로에서 중간체에는 뚜렷한 효과를 미치지 않는다고 보고하였다. ATP 수준의 상당한 감소는 잠재적으로, 세포벽의 마이콜산을 포함한 기타 거대 분자의 생합성에 직접 또는 간접적으로 해로운 영향을 미칠 수 있다. 마이콜산 제조에 있어서의 ATP 합성 및 호흡의 역할을 조사하기 위해, ATP 합성 효소의 억제제(DCCD) 및 호흡 복합체 II의 억제제(TTFA)를 평가하여 BCG에서 OSA 및 비처리 대조군과 비교하였다. 마이콜레이트 합성 억제가 세포사(cell death)로 인한 것이 아님을 확인하기 위해, 노출후 10분의 짧은 시간 간격을 선택하였다. 도 6에 도시되어 있는 바와 같이, 총 마이콜산 수준은, 비처리 대조군에 비해, DCCD(100㎍/㎖)의 경우 79%, TTFA(100㎍/㎖)의 경우 46%, OSA(100㎍/㎖)의 경우 43% 감소하였다. 도 6의 패널 A는 에탄올 부재하에서의 표준 BACTEC 방사법 매질 속에서의 OSA의 활성을 보여주고(농도 : ㎍/㎖), 반면에 패널 B는 동일한 농도 및 0.5% 에탄올로 보충된 매질을 사용한 OSA의 활성을 보여준다. NC는 비처리 대조군의 결과를 나타낸다.

Claims (27)

  1. 미생물 중의 ATP 수준을 동일한 기간 동안 포유동물 세포를 사멸시키지 않으면서 시험관내 시험에서 24시간 후에 대조군과 비교하여 10% 이상 감소시킬 수 있으며, ATP 수준의 감소가,
    세포를 시험 위치로부터 제거하여 얼음 위에 놓는 단계(1),
    세포를 원심분리에 의해 4℃에서 수거하여 ATP 추출 완충액에서 비드 타격에 의해 분쇄하는 단계(2),
    세포 단편을 4℃에서의 원심분리로 제거하여 ATP 함유 상청액을 수득하는 단계(3) 및
    4℃에서 생물발광 분석으로 상청액에 존재하는 ATP의 양을 측정하는 단계(4)에 의해 측정되는, 화학식 R-SOn-Z-CO-Y의 화합물[여기서, n은 1 또는 2이고, R은 탄소수 6 내지 20의 탄화수소 그룹이고, Z는 헤테로원자를 포함할 수 있는 탄화수소 결합 잔기이고, Y는 -NH, -O-CH2-C6H5, -CO-CO-O-CH3 및 -O-CH3로부터 선택된다]이 아닌 화합물 유효량을 미생물 감염의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여함을 포함하는, 미생물 감염 대상의 치료방법.
  2. 제1항에 있어서, 대상이 사람인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 대상이 동물인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 대상이 말, 소, 염소 및 양으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 화합물이 화학식 I, II, III, IV, V, VI, VII 및 VIII의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
    화학식 I
    화학식 II
    화학식 III
    화학식 IV
    화학식 V
    화학식 VI
    화학식 VII
    화학식 VIII
  6. 제5항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  10. 제5항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  11. 제5항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  12. 제5항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  13. 제5항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 대상이 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 엠. 아비움-인트라셀룰라레(M. avium-intracellulare), 엠. 레프라에(M. leprae), 엠. 파라투베르쿨로시스(M. paratuberculosis), 엠. 울세란스(M. ulcerans) 및 로도코쿠스(Rhodococcus)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 미생물에 의해 감염되는 방법.
  15. ATP 신타제의 b-아단위를 과발현시키고, 추가로 화학식 R-SOn-Z-CO-Y의 화합물[여기서, n은 1 또는 2이고, R은 탄소수 6 내지 20의 탄화수소 그룹이고, Z는 헤테로원자를 포함할 수 있는 탄화수소 결합 잔기이고, Y는 -NH, -O-CH2-C6H5, -CO-CO-O-CH3 및 -O-CH3로부터 선택된다]이 아닌 화합물을 미생물 감염의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여함을 포함하는, 미생물 감염 대상의 치료방법.
  16. 제15항에 있어서, 대상이 사람인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 대상이 동물인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 대상이 말, 소 및 양으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  19. 제15항에 있어서, 화합물이 화학식 I, II, III, IV, V, VI, VII 및 VIII의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
    화학식 I
    화학식 II
    화학식 III
    화학식 IV
    화학식 V
    화학식 VI
    화학식 VII
    화학식 VIII
  20. 제19항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  24. 제19항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  25. 제19항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  26. 제19항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
  27. 제19항에 있어서, 화합물이 화학식 의 화합물인 방법.
KR1020057000353A 2002-07-09 2003-07-09 사람 및 동물에서의 미생물 감염의 치료방법 KR20050047519A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39457302P 2002-07-09 2002-07-09
US60/394,573 2002-07-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20050047519A true KR20050047519A (ko) 2005-05-20

Family

ID=30115736

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057000353A KR20050047519A (ko) 2002-07-09 2003-07-09 사람 및 동물에서의 미생물 감염의 치료방법

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20060135568A1 (ko)
EP (1) EP1539147A4 (ko)
JP (1) JP4493494B2 (ko)
KR (1) KR20050047519A (ko)
CN (2) CN101721412A (ko)
AU (1) AU2003248896B2 (ko)
BR (1) BRPI0312654A2 (ko)
CA (1) CA2491573A1 (ko)
EA (1) EA200500177A1 (ko)
IL (1) IL166122A0 (ko)
MX (1) MXPA05000361A (ko)
SG (1) SG149701A1 (ko)
WO (1) WO2004004712A1 (ko)
ZA (1) ZA200500166B (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2767092C (en) 2002-07-09 2013-10-15 Fasgen, Inc. Novel compounds, pharmaceutical compositions containing same and methods of use for same
EP2155705A4 (en) 2007-06-08 2012-02-15 Univ Georgia State Res Found COMPOSITIONS FOR REGULATING OR MODULATING QUORUM DETECTION IN BACTERIA, METHODS OF USING THE SAME, AND METHODS OF REGULATING AND MODULATING QUORUM DETECTION IN BACTERIUM

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2101223A1 (en) * 1970-08-04 1972-03-31 Nasa Bacteria determination in urine - by bioluminescence reaction of bacterial atp
US5908751A (en) * 1996-04-26 1999-06-01 Toyo Ink Mfg. Co., Ltd. Method for detecting and/or determining ATP from microorganism cells in a sample
HU230190B1 (hu) * 1998-12-23 2015-09-28 Theravance, Inc Glikopeptidszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati kompozíciók
US6448472B1 (en) * 1999-02-05 2002-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Genetic and epigenetic manipulation of ABC transporters and ectophosphatases for the conference of hormone and herbicide resistance
EP1185623A4 (en) * 1999-03-03 2005-03-23 Regents Board Of GENETIC AND EPIGENETIC HANDLING OF ABC TRANSPORTERS AND EXTRACELLULAR PHOSPHATASES FOR THE CONFERENCE / DELETION OF DRUG RESISTANCE IN BIOLOGICAL SYSTEMS, AND METHODS FOR DETECTION OF INHIBITORS OF EXTRACELLULAR PHOSPHATASES
HN2000000051A (es) * 1999-05-19 2001-02-02 Pfizer Prod Inc Derivados heterociclicos utiles como agentes anticancerosos
US6376682B1 (en) * 2000-02-01 2002-04-23 Takama System, Ltd. Compound with α-glucosidase inhibiting action and method for producing the same
US6248790B1 (en) * 2000-06-29 2001-06-19 Parker Hughes Institute Treatment of inflammation with 2,4,6-trihydroxy-alpha-rho-methoxyphenylacetophenone, or its pharmaceutically acceptable derivatives
BRPI0312413A2 (pt) * 2002-07-01 2016-08-02 Fasgen Llc compostos, composições farmacêuticas contendo os mesmos, e método de utilização para os mesmos
CA2767092C (en) * 2002-07-09 2013-10-15 Fasgen, Inc. Novel compounds, pharmaceutical compositions containing same and methods of use for same

Also Published As

Publication number Publication date
US20060135568A1 (en) 2006-06-22
SG149701A1 (en) 2009-02-27
CN1671384A (zh) 2005-09-21
WO2004004712A1 (en) 2004-01-15
CA2491573A1 (en) 2004-01-15
BRPI0312654A2 (pt) 2017-05-02
ZA200500166B (en) 2007-08-29
AU2003248896A1 (en) 2004-01-23
JP2005533834A (ja) 2005-11-10
IL166122A0 (en) 2006-01-15
EP1539147A4 (en) 2007-04-25
EP1539147A1 (en) 2005-06-15
JP4493494B2 (ja) 2010-06-30
EA200500177A1 (ru) 2005-12-29
MXPA05000361A (es) 2005-09-20
CN101721412A (zh) 2010-06-09
AU2003248896B2 (en) 2010-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Barry III et al. Use of genomics and combinatorial chemistry in the development of new antimycobacterial drugs
Kumar et al. Synthesis of novel 1, 2, 3-triazole derivatives of isoniazid and their in vitro and in vivo antimycobacterial activity evaluation
Njire et al. Pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis: Review and update
Zhang et al. Tuberculosis drug targets
Scherman et al. Screening a library of 1600 adamantyl ureas for anti-Mycobacterium tuberculosis activity in vitro and for better physical chemical properties for bioavailability
Kratky et al. Advances in mycobacterial isocitrate lyase targeting and inhibitors
Asif A review of antimycobacterial drugs in development
da Silva et al. Synthesis and in vitro antimycobacterial activity of 3-substituted 5-hydroxy-5-trifluoro [chloro] methyl-4, 5-dihydro-1H-1-(isonicotinoyl) pyrazoles
Asif Study of clinically used and recently developed antimycobacterial agents
Rodrigues-Junior et al. IQG-607 abrogates the synthesis of mycolic acids and displays intracellular activity against Mycobacterium tuberculosis in infected macrophages
Sundararajan et al. Latent tuberculosis: interaction of virulence factors in Mycobacterium tuberculosis
Kamal et al. Efforts towards the development of new antitubercular agents: potential for thiolactomycin based compounds
Alcaraz et al. Designing quinoline-isoniazid hybrids as potent anti-tubercular agents inhibiting mycolic acid biosynthesis
Liang et al. Microarray analysis of the chelerythrine-induced transcriptome of Mycobacterium tuberculosis
Verma et al. Tuberculosis: The success tale of less explored dormant Mycobacterium tuberculosis
Khan et al. Molecular diagnostics and potential therapeutic options for Mycobacterium tuberculosis: Where we stand
Gutti et al. Latent tuberculosis infection (LTBI) and its potential targets: an investigation into dormant phase pathogens
WO2018067769A1 (en) Compounds, compositions, and methods for inhibiting bacterial growth
KR20050047519A (ko) 사람 및 동물에서의 미생물 감염의 치료방법
Sreelatha et al. Protein targets in Mycobacterium tuberculosis and their inhibitors for therapeutic implications: A narrative review
Pattanashetty et al. Discovery of new drugs and computational studies of coumarin-carprofen scaffolds as a novel class of anti-tubercular, anti-inflammatory and anti-bacterial agents
WO2015009883A1 (en) Activators of nad-dependent protein deacteylases and uses thereof
Zhang et al. Mechanisms of drug action, drug resistance and drug tolerance in Mycobacterium tuberculosis: expected phenotypes from evolutionary pressures from a highly successful pathogen
WO2019126613A1 (en) Chemical inhibitors of mycobacterium tuberculosis dosrst signaling and persistence
Shulgina Mechanisms of Mycobacterium tuberculosis Drug Resistance

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application