MXPA04012334A - Identificacion de un nuevo receptor t2r76 para sabor amargo. - Google Patents

Abstract

Acidos nucleicos aislados que codifican polipeptidos T2R76, polipeptidos T2R76 recombinantemente expresados, sistemas de expresion heterologa para la expresion recombinante de polipeptidos T2R76, metodos de ensayo que los emplean, y metodos para alterar la percepcion del sabor a traves de la administracion de un modulador de T2R76. estos polipeptidos 722R76 pueden expresarse solos o expresarse conjuntamente con otro polipeptido T2R, preferentemente un polipeptido T2R humano diferente.

Description

IDENTIFICACIÓN DE UN NUEVO RECEPTOR DE SABOR AMARGO, T2R76 SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de los Estados Unidos con número de serie 60/398,727 presentada el 29 de julio de 2002, cuya solicitud se incorpora por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere en general a polipéptidos T2R76 y a la percepción del sabor mediada por éstos. Más particularmente, la presente invención provee ácidos nucleicos aislados que codifican los polipéptidos T2R76, polipéptidos aislados y funcionales T2R76, un sistema de expresión heteróloga para la expresión recombinante de polipéptidos T2R76, métodos para identificar los moduladores de la percepción del sabor, especialmente compuestos que tienen sabor amargo o que bloquean el sabor amargo y sus usos .

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA Una de las modalidades básicas del sabor que los seres humanos pueden reconocer es la del sabor amargo. Se cree que los compuestos amargos producen un sabor amargo al interactuar con los receptores de superficie celular. La activación de los receptores inicia cascadas de señalización intracelular que culminan en la liberación del neurotransmisor . Las fibras nerviosas aferentes de los ganglios nerviosos craneanos transmiten luego las señales a los centros del gusto corticales, en donde se procesa la información como percepción del sabor. Estos receptores pertenecen a la familia de siete receptores de dominio trans embranal que interactúan con las proteínas G intracelulares, también llamadas receptores acoplados a la proteina G (GPCR) . Véase Lindemann (2001) Nature 413(6852): 219-25. Se ha identificado una nueva familia de los GPCR, denominada T2R, en seres humanos y roedores (Adler et al, 2000; Chandrashekar et al, 2000; Matsunami, 2000; PCT publicaciones internacionales Nos WO 01/18050 y WO 01/77676) . Distintas lineas de evidencia sugirieron que los T2R pueden mediar la percepción de compuestos amargos.

Primero, los genes T2R se expresan específicamente en un subconjunto de células receptoras del sabor de la lengua y sabor de los epitelios de la lengua y el paladar. Segundo, los T2R están genéticamente unidos a locus asociados con la percepción del sabor en ratones y seres humanos (Conneally et al, 1976; Capeless et al, 1992; Reed et al, 1999; Adler et al, 2000) . En tercer lugar, los estudios in vitro han demostrado que los T2R pueden activar la gustducina, una proteína G específicamente expresada en células del gusto y unida a la transducción de estímulos del amargor (Wong et al., 1996), y que la activación de la gustducina por parte de los T2R tiene lugar selectivamente en respuesta a la aplicación de compuestos amargos (Chandrashekar et al., 2000) . En base a estos datos, se proponen las familias de receptores mT2R y hT2R para mediar la respuesta al sabor amargo en ratones y seres humanos, respectivamente. Los sabores amargos a menudos son poco deseables en alimentos, bebidas, enjuagues orales, dentífricos, productos cosméticos y productos farmacéuticos. Un sabor amargo puede enmascararse con la adición de compuestos dulces, como azúcar; no obstante, la adición de un edulcorante puede alterar inconvenientemente el sabor de un alimento y aumentar el aporte calórico. En el caso de productos farmacéuticos, se han desarrollado métodos de formulación elaborados y costosos (p. ej . , recubrimientos y cápsulas) a fin de reducir el sabor amargo al momento de la ingesta oral. Los métodos para bloquear directamente el sabor amargo mediante la inhibición de receptores gustativos no se han descrito. Por lo tanto, existe una gran necesidad en el campo técnico de identificar y caracterizar funcionalmente los receptores del sabor amargo como dianas para el desarrollo de inhibidores de la percepción del sabor amargo. Para satisfacer esta necesidad, la presente invención provee nuevos polipéptidos y ácidos nucleicos T2R76. La presente invención también provee métodos para identificar y usar moduladores de T2R76 a fin de alterar la percepción del sabor.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee ácidos nucleicos T2R76 aislados y polipéptidos T2R76 codificados por los mismos. Los polipéptidos y los ácidos nucleicos son útiles en los métodos de detección y ensayo revelados en la presente. Un ácido nucleico T2R76 puede comprender: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID N0:1; o (c) una molécula de ácido nucleico aislado sustancialmente similar a SEQ ID NO: 1. Un ácido nucleico TR76 también puede comprender: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID N0:1; (c) una molécula de ácido nucleico aislado que se híbrida a una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID N0:1 bajo condiciones de lavado rigurosas representadas por una solución de lavado que tiene menos de aproximadamente 200 mM de concentración de sal y una temperatura de lavado superior a aproximadamente 45°C y que codifica un polipéptido T2R76; o (d) una molécula de ácido nucleico aislado que difiere en por lo menos un codón equivalentemente funcional de la molécula de ácido nucleico aislado de uno de (a) , (b) y (c) ya mencionados en la secuencia de ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a), (b) y (c) ya mencionados. Preferentemente, un ácido nucleico T2R76 aislado comprende: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; o (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID N0:1. Un polipéptido T2R76 aislado puede comprender: (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustancialmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID N0:1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico sustancialmente idéntica a SEQ ID N0:1. Un polipéptido T2R76 también puede comprender un polipéptido codificado por un ácido nucleico aislado seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico asilado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID N0:1; (c) una molécula de ácido nucleico aislado que hibrida un ácido nucleico de SEQ ID N0:1 bajo condiciones muy rigurosas, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislado que difiere en por lo menos un codón funcionalmente equivalente del ácido nucleico aislado de uno de (a) , (b) , o (c) ya mencionados en la secuencia de ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 mediante el ácido nucleico aislado de (a), (b) o (c) ya mencionados. Preferentemente, un polipéptido T2R76 comprende SEQ ID NO: 2. La presente invención provee otros métodos para detectar un ácido nucleico T2R76, en donde el método comprende: (a) procurar una muestra biológica que tiene material de ácido nucleico; (b) hibridar una molécula de ácido nucleico T2R76 aislado bajo condiciones rigurosas de hibridación a la muestra biológica de (a) , formando así una estructura doble entre el ácido nucleico T2R76 aislado y un ácido nucleico dentro de la muestra biológica; y (c) detectar la estructura doble de (b) , por medio de la cual se detecta una molécula de ácido nucleico T2R76. La presente invención provee además anticuerpos que reconocen específicamente un polipéptido T2R76 y métodos para producirlo. Una modalidad representativa del método comprende: (a) producir recombinante o sintéticamente un polipéptido T2R76; (b) formular el polipéptido de (a) mediante el cual es un inmunógeno eficaz; (c) administrar la formulación a un animal de (b) para generar una respuesta inmune en el animal que comprende la producción de anticuerpos, en donde los anticuerpos están presentes en el suero sanguíneo del animal; y (d) recoger el suero sanguíneo del animal de (c) que comprende anticuerpos que reconocen específicamente un polipéptido T2R76. El método revelado comprende también preparar un anticuerpo monoclonal. También se proveen métodos para detectar un nivel de un polipéptido T2R76. En una modalidad representativa, el método comprende: (a) obtener una muestra biológica que tiene material peptídico; (b) detectar un polipéptido T2R76 en la muestra biológica de (a) por reacción inmunoquímica con el anticuerpo de la presente invención, mediante la cual se determina una cantidad de polipéptido T2R76 en una muestra . También se proveen sistemas para la expresión recombinante de un polipéptido T2R76. ün sistema de expresión recombinante puede comprender: (a) un polipéptido T2R76 representativo de la invención (p. ej . , una modalidad representativa expuesta como SEQ ID N0:2); y (b) una célula huésped heteróloga que expresa el polipéptido T2R76. Adicionalmente, el sistema de expresión recombinante puede comprender secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos T2R diferentes al T2R76. En particular, el sistema de expresión recombinante puede incluir cualquiera de las secuencias de ácido nucleico T2R reveladas en la patente estadounidense No. 6,558,910, emitida el 6 de mayo de 2003 para Zuker et al, la solicitud publicada US 20020094551, por Adler, John Elliot publicada el 18 de julio de 2002, y la solicitud publicada US 20030022278 por Zuker et al, publicada el 30 de enero de 2003, todas incorporadas por referencia en su totalidad. Se ha de observar que otro nombre para los polipéptidos T2R es polipéptidos SF o GR, tal como se revela en las solicitudes para Zuker incorporadas a la presente por referencia. El hT2R76 en cuestión se puede expresar con uno o más de otros polipéptidos T2R para producir un receptor del sabor heteromérico funcional. Los otros polipéptidos T2R pueden ser otros T2R o T2R humanos de otras especies, p. ej . , rata o ratón. Una célula huésped puede comprender cualquier célula adecuada. Una célula huésped preferida comprende una célula mamifera, más preferentemente una célula humana. Preferentemente también, una célula huésped comprende una subunidad alfa de proteina G capaz de acoplarse a un polipéptido T2R76, por ejemplo, una proteina G promiscua, tal como Gal5, gustducina o transducina. Al utilizar el sistema revelado para la expresión recombinante de un polipéptido T2R76, la presente invención comprende además un método para identificar moduladores de un polipéptido T2R76. En una modalidad preferida de la invención, el método comprende: (a) proveer un sistema de expresión recombinante por medio del cual se expresa un polipéptido T2R76 en una célula huésped heteróloga; (b) proveer una sustancia de prueba para el sistema de (a) ; (c) determinar el nivel o la calidad de la función del T2R76 en presencia de la sustancia de prueba; (d) comparar el nivel o la calidad de la función del T2R76 en presencia de la sustancia de prueba con un nivel o calidad de control de la función del T2R76; y (e) identificar una sustancia de prueba como un modulador de T2R76, determinando un nivel o calidad de la función del T2R76 en presencia de la sustancia de prueba como significativamente cambiada, al compararse con un nivel o calidad de control de la función del T2R76. El ensayo puede comprender determinar la cantidad una cantidad de unión- de GTPYS. En otra modalidad de la invención, un método para identificar un modulador de un polipéptido T2R76 comprende: (a) expresar un polipéptido T2R76 y expresar dicho polipéptido o combinaciones de polipéptidos solos o en combinación con uno o más de otros polipéptidos T2R a una o más sustancias de prueba; (b) determinar la unión de la sustancia de prueba al polipéptido T2R76 aislado o en combinación que contiene el polipéptido T2R76; y (c) seleccionar una sustancia candidata que demuestra unión especifica al polipéptido T2R76. También se proveen moduladores, incluyendo agonistas e inhibidores de un polipéptido T2R76, que se identifican mediante los métodos revelados. Un modulador puede comprender una proteína, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico, una molécula pequeña o sus combinaciones. Preferentemente, un modulador comprende también un modulador de la percepción del sabor amargo. La presente invención provee también métodos para modular la percepción del sabor amargo en un sujeto. Preferentemente, el sujeto es un mamífero y más preferentemente un ser humano. Preferentemente, la percepción del sabor amargo que se altera en un sujeto comprende la función del T2R76. En una modalidad de la presente invención, un método para modular la percepción del sabor amargo en un sujeto comprende: (a) preparar una composición que comprende un modulador de T2R76 que se identifica de acuerdo con los métodos revelados; y (b) administrar una dosis eficaz de la composición a un sujeto, mediante la cual se altera la percepción del sabor amargo en el sujeto. Por ejemplo, la presente invención provee métodos para. reducir la percepción del sabor amargo de un compuesto amargo, via la administración conjunta de un inhibidor de T2R76 y el compuesto amargo a un sujeto. La presente invención también provee métodos para mejorar la percepción del sabor amargo de un compuesto via la administración conjunta de un agonista de T2R76 y el compuesto. La administración conjunta puede comprender administrar una composición que comprende el inhibidor de T2R76 mezclado con el compuesto cuyo sabor se va a modular. En modalidades preferidas de la invención, la composición puede comprender un alimento, bebida, enjuague oral, dentífrico, producto cosmético o producto farmacéutico. La presente invención provee además métodos para mejorar la percepción del sabor amargo de un compuesto, vía la administración conjunta de un agonista de T2R76 y el compuesto cuyo sabor se va a modular. El agonista de T2R76 y el compuesto se pueden mezclar como una única composición . Por consiguiente, es un objeto de la . presente invención proveer ácidos nucleicos y polipéptidos T2R76 nuevos, métodos para detectar un ácido nucleico T2R76, sistemas de expresión heterologa mediante los cuales se expresa un polipéptido T2R76, métodos y ensayos que emplean un sistema de expresión heterologa de T2R76 y métodos para modular y detectar un polipéptido T2R76. Este objeto se logra en todo o en parte mediante la presente invención. Un objeto de la invención que se ha expresado anteriormente en la presente y otros objetos y ventajas de la presente invención serán obvios para aquellos con experiencia en el campo técnico después de un estudio de la siguiente descripción de la invención y de los Ejemplos no limitativos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS EN LA LISTA DE SECUENCIAS [SEQ ID No: 1 y 2 son secuencias humanas nucleótido y aminoácido T2R76, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Definiciones Si bien se cree que las personas con experiencia en el campo técnico comprenden bien los siguientes términos, las definiciones expuestas a continuación facilitan la explicación de la invención. Los términos "un/una" y el/la" se utilizan de acuerdo con la convención tradicional para referirse a uno o más . El término "aproximadamente", tal como se utiliza en la presente para referirse a un valor mesurable, como un porcentaje de identidad de la secuencia (p. e . , cuando se comparan secuencias de nucleótidos y aminoácidos, tal como se describe a continuación) , una longitud de proteína o nucleótido, una cantidad de unión, etc. tiene como fin abarcar variaciones de +20% o +10%, más preferentemente*** ±5%, incluso más preferentemente ±1% y aun más preferentemente +0.1% de la cantidad especificada, según dichas variaciones sean apropiadas para poner en práctica un método revelado o llevar a cabo la presente invención.

II. Ácidos nucleicos y polipéptidos T2R76 La presente invención provee nuevos ácidos nucleicos T2R76 y nuevos polipéptidos T2R76, incluyendo polipéptidos T2R76 funcionales. Un ácido nucleico T2R76 representativo de la presente invención se expone como SEQ ID N0:1, que codifica el polipéptido T2R76 expuesto como SEQ ID NO: 2. El término "T2R76" y los términos que incluyen "T2R76" (p. ej . , hT2R76) se refieren en general a los ácidos nucleicos T2R76 aislados, polipéptidos aislados codificados por los ácidos nucleicos T2R76 y sus actividades. Los ácidos nucleicos y polipéptidos T2R76 pueden derivar de cualquier organismo. Los términos "T2R76" y los términos que incluyen "T2R76" también se refieren a polipéptidos que comprenden receptores que son activados por compuestos amargos, y a ácidos nucleicos que los codifican. Un receptor T2R76 puede comprender otros polipéptidos T2R, y puede ser un receptor heteroménico . El término "aislado", tal como se utiliza en el contexto de un polipéptido de ácido nucleico, indica que el ácido nucleico o polipéptido existe separadamente de su entorno nativo y no es un producto natural. Un ácido nucleico o polipéptido aislado puede existir en forma purificada o puede existir en un entorno no nativo como célula huésped transgénica. Tal como se revela además a continuación, la presente invención también provee un sistema para la expresión funcional de un polipéptido T2R76. El sistema emplea un ácido nucleico T2R76 recombinante, que incluye SEQ ID N0:1, que se puede expresar en asociación con otro ácido nucleico T2R.

II.A. Ácidos nucleicos T2R76 Los términos "molécula de ácido nucleico" y "ácido nucleico", se refieren cada uno a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos monocatenarios, bicatenarios o en forma triplicada. A menos que se restrinja específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades similares al ácido nucleico natural de referencia. Los términos "molécula de ácido nucleico" o "ácido nucleico" también se pueden utilizar en lugar de "gen", "ADNc" , "ARNm" o "ARNc". Los ácidos nucleicos se pueden sintetizar o pueden derivar de cualquier fuente biológica, incluyendo cualquier organismo. Los métodos representativos para clonar un ADNc de T2R76 de longitud total, son tal como se describe en el Ej emplo 1. El término "T2R" o "SF" se refiere a ácidos nucleicos que codifican un miembro de una familia del receptor de la proteína G específica del sabor=célula . Estos ácidos nucleicos y los polipéptidos que codifican se denominan familia TAS2R, "T2R", "SF" o "GR" de los receptores del sabor óptico de la proteína G. Esta familia de neuril de GPCR incluye componentes de la transducción del gusto p . Para la familia , los miembros de esta familia están implicados en la detección de sabores amargos. Los miembros de la familia T2R o SF de los receptores del sabor se analizan en la patente estadounidense 6,558,910; en la solicitud de patente estadounidense publicada 20030022278 por Zura et al, publicada el 20 de enero de 2003; y en la solicitud de patente estadounidense publicada 20020094502 por Adler, Jon Elliot, publicada el 18 de julio de 2002. Los ejemplos de dichos T2R incluyen Grol (SF01) ; GR02 (SF02) ; GR02 (SF03) ; GR04 (SF04); GR05 (SF05); GR06 (SF06) ; GR07 (SF07); GR08 (SF08); (GR09 (SF09) ; GR10 (SF10) ; GRll (SFll) ; GR12 (SF12); GR13 (SF13) ; GR14 (SF14); GR15 (SF15) ; GR16 (SF16) ; GR17 (SF17); GR18 (SF18); GR19 (SF19); GR20 (SF20); GR21 (SF21); GR22 (SF23) ; GR24 (SF24); T2R51; T2R55; T2R33; T2R59; T2R61; T2R63; T2R64; T2R65; T2R75; GR25 (SF25) ; GR26 (SF26) ; GR27 (SF27); GR28 (SF28); GR29 (SF29) ; GR30 (SF30) ; GR31 (SF31) ; GR32 (SF32); GR(SF); GR33 (SF33) ; GR34(SF24); GR35 (SF35) ; GR36 (SF36) ; GR37 (SF37); GR38 (SF38); GR39 (SF39) ; GR40 (SF40) ; GR41 (SF41); GR42 (SF42) ; GR43 (SF43) ; GR44 (SF44); GR45 (SF45) ; GR46 (SF46); GR47 (SF47); GR48 (SF48); GR(SF) GR49 (SF49) ; GR50 (SF50); Estos T2R, SF, TAS2R, et al o GR, como se denominan alternativamente, pueden ser de diferentes especies, incluyendo humana, de ratón y de rata, y preferentemente humana. También se implican los T2R que son "sustancialmente idénticos" o que poseen una identidad de secuencia especifica, o que se hibridan específicamente a cualquiera de estas secuencias, tal como se define infra. Los términos "T2R76" y los términos que incluyen "T2R76" (p. ej . , hT2R76) se utilizan en la presente para referirse a ácidos nucleicos que codifican un polipéptido T2R76. Por lo tanto, el término "T2R76" se refiere a ácidos nucleicos aislados de la presente invención que comprenden: (a) una secuencia de nucleótido de SEQ ID N0:1; o (b) una secuencia de nucleótido sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 1. El término "sustancialmente idéntica", tal como se usa en la presente para describir un grado de similitud entre secuencias de nucleótidos, se refiere a dos o más secuencias que tienen por lo menos aproximadamente al menos 60%, preferentemente al menos aproximadamente 70%, más preferentemente al menos aproximadamente 80%, más preferentemente aproximadamente 90% a aproximadamente 99%, incluso más preferentemente aproximadamente 95% a aproximadamente 99%, y más preferentemente aproximadamente 99% identidad de nucleótido, al compararse y alinearse para correspondencia máxima, según lo medido utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por inspección visual. Preferentemente, la identidad sustancial existe en secuencias de nucleótidos de por lo menos aproximadamente 100 residuos, más preferentemente en secuencias de nucleótidos de por lo menos aproximadamente 150 residuos y más preferentemente en secuencias de nucleótidos que comprenden una secuencia de codificación de longitud total. El término "longitud total" se utiliza en la presente para referirse a un marco de lectura abierto completo que codifica un polipéptido T2R76 funcional, tal como se describe adicionalmente en la presente a continuación. Los métodos para determinar la identidad de porcentajes entre dos polipéptidos se definen a continuación bajo el titulo "Comparaciones de secuencias de nucleótidos y aminoácidos". En un aspecto, las secuencias sustancialmente idénticas pueden ser secuencias polimórficas . El término "polimórfica" se refiere a la aparición de dos o más secuencias alternativas genéticamente determinadas por alelos en una población. Una diferencia alélica puede ser de tan solo un par de base. En otro aspecto, las secuencias sustancialmente idénticas pueden comprender secuencias mutagenizadas, incluyendo secuencias que comprenden mutaciones silenciosas. Una mutación puede comprender uno o más cambios de residuos, una deleción de residuos o una inserción de residuos adicionales. Otra indicación de que dos secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan sustancialmente en la otra bajo condiciones rigurosas. En el contexto de la hibridación de ácido nucleico, dos secuencias de ácido nucleico que están siendo comparadas se pueden denominar "sonda" y "diana." Una "sonda" es una molécula de ácido nucleico de referencia y una "diana" es una molécula de ácido nucleico de prueba, a menudo hallada dentro de una población heterogénea de moléculas de ácido nucleico. Una "secuencia diana" es sinónimo de "secuencia de prueba". Una secuencia de nucleótido preferida empleada para estudios o ensayos de hibridación incluye secuencias sonda que son complementarias o imitan al menos aproximadamente 14 a 40 de la presente invención. Preferentemente, las sondas comprenden 14 a 20 nucleótidos o incluso más, si se desea, como 30, 40, 50, 60, 100, 200, 300 o 500 nucleótidos o hasta la longitud total de cualquier SEQ ID N0:1. Dichos fragmentos se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, mediante síntesis química del fragmento, por aplicación de la tecnología de ampliación del ácido nucleico o introduciendo secuencias seleccionadas a los vectores recombinantes para producción recombinante . La frase, "hibridar específicamente a" se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula solamente a una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones rigurosas cuando la secuencia está presente en una mezcla de ácido nucleico compleja (p. ej . , ADN o ARN celular total) . La frase "hibridar sustancialmente a" se refiere a hibridación complementaria entre una molécula de ácido nucleico sonda y una molécula de ácido nucleico diana y abarca desajustes menores que se pueden acomodar reduciendo la rigurosidad de los medios de hibridación para lograr la hibridación deseada. "Condiciones de hibridación rigurosas" y "condiciones de lavado de hibridación rigurosas" en el contexto de experimentos de hibridación de ácido nucleico, como análisis de transferencia Southern y Northern, son ambos dependientes de la secuencia y el entorno. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se halla en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I capítulo 2, Elsevier, Nueva York, Nueva York. En general, la hibridación y las condiciones de lavado muy rigurosas se seleccionan para ser de aproximadamente 50 °C inferiores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especifica en una resistencia iónica y pH definidos. Típicamente, bajo "condiciones rigurosas", una sonda se hibridará específicamente a su secuencia diana, pero a ninguna otra secuencia . Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica y pH) en la cual 50% de la secuencia diana se híbrida a una sonda perfectamente equiparada. Se seleccionan condiciones muy rigurosas para igualar la Tm para una sonda en particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para análisis de transferencia Southern o Northern de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de aproximadamente 100 residuos complementarios es una hibridación durante toda la noche en 50% de formamida con 1 mg de heparina a 42 °C. Un ejemplo de condiciones de lavado muy rigurosas es 15 minutos en 0.1 X SSC a 65 °C. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es 15 minutos en tampón 0.2X SSC a 65°C. Véase Sambrook et al, eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York para una descripción del tampón SSC. Con frecuencia, un lavado de gran rigurosidad es precedido por un lavado de poca rigurosidad para eliminar la señal de la sonda de fondo. Un ejemplo de las condiciones de lavado de rigurosidad media para un dúplex de más de aproximadamente 100 nucleótidos, es 15 minutos en SSC 1 X a 45°C. Un ejemplo de lavado de poca rigurosidad para un dúplex de más de aproximadamente 100 nucleótidos, es 15 minutos en 4X a 6X SSC a 40 °C. Para sondas cortas (p. ej . , aproximadamente 10 a 50 nucleótidos) , las condiciones rigurosas típicamente comprenden concentraciones de sal inferiores a aproximadamente ión de Na+, típicamente una concentración de ión de Ma+ de aproximadamente 0.01 a 1 M (u otras sales) a pH 7.0-8.3, y la temperatura es típicamente por lo menos aproximadamente 30 °C. Las condiciones rigurosas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido del doble (o más) que aquella observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación en particular indica la detección de una hibridación específica . Los siguientes son ejemplos de condiciones de hibridación y lavado que se pueden utilizar para identificar secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas para la referencia a secuencias de nucleótidos de la presente invención: una secuencia de nucleótido sonda preferentemente se híbrida a una secuencia de nucleótido diana en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS) , NaP04 0.5M , EDTA 1 mM a 50 °C con posterior lavado en SSC 2X, 0.1 % SDS a 50 °C más preferentemente, una secuencia sonda y diana se hibridan en 7% dodecilsulfato de sodio (SDS) , NaP04 0.5 , EDTA 1 mM a 50°C con posterior lavado en SSC IX, 0.1% SDS a 50 °C; más preferentemente, una secuencia sonda y diana se híbrida en 7% dodecilsulfato de sodio (SDS), NaP04 0.5M, EDTA 1 mM a 50°C con posterior lavado en SSC 0.5X, 0.1% SDS a 50 °C; más preferentemente, una secuencia sonda y diana se híbrida en 7% dodecilsulfato de sodio (SDS), NaP04 0.5M, EDTA 1 mM a 50°C con posterior lavado en SSC 0.1X, 0.1% SDS a 50°C; más preferentemente, una secuencia sonda y diana se híbrida en 7% dodecilsulfato de sodio (SDS), NaP04 0.5M, EDTA 1 mM a 50°C con posterior lavado en SSC 0.1 X, 0.1 % SDS a 65°C. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas, comparten una estructura tridimensional completa o son equivalentes biológicamente funcionales. Estos términos se definen más en el título "Polipéptidos T2R76" a continuación. Las moléculas de ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticas si las proteínas correspondientes son sustancialmente idénticas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando dos secuencias de nucleótidos comprenden variantes conservadamente sustituidas según lo permitido por el código genético. El término "variantes conservadamente sustituidas" se refiere a secuencias de ácido nucleico que tiene sustituciones de codones degeneradas, en donde la tercera posición de uno o más codones (o todos) seleccionados se sustituye con residuos de desoxi-inosina y/o base mixta. Véanse Batzer et al. (1991) Nucleic Acids Res 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J Biol Chem 260:2605-2608; y Rossolini et al. (1994) Mol Cell Probes 8:91-98. El término "T2R" también abarca ácidos nucleicos que comprenden subsecuencias y secuencias alargadas de un ácido nucleico T2R, preferentemente T2R76 que incluye ácidos nucleicos complementarios a ácido nucleico T2R, moléculas de ARN de T2R y ácidos nucleicos complementarios a ARN de T2R (ARNc) . El término "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una parte de una secuencia de ácido más larga. Una subsecuencia ilustrativa es una sonda, ya descrita en la presente, o un cebador. El término "cebador", tal como se usa en la presente, se refiere a una secuencia contigua que comprende aproximadamente 8 o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferentemente 10-20 nucleótidos y más preferentemente 20-30 nucleótidos de una molécula de ácido nucleico seleccionada. Los cebadores de la invención abarcan oligonucleotidos de longitud suficiente y secuencia apropiada como para proveer la iniciación de la polimerización en una molécula de ácido nucleico de la presente invención. El término "secuencia alargada" se refiere a una adición de nucleótidos (u otras moléculas análogas) incorporada al ácido nucleico. Por ejemplo, una polimerasa (p. ej . , polimerasa de ADN) puede agregar secuencias en la terminal 3' de la molécula de ácido nucleico. Además, la secuencia de nucleotido se puede combinar con secuencias de ADN, como promotores, regiones promotoras, intensificadores, señales de poliadenilación, secuencias intrónicas, sitios de enzima de restricción adicional, sitios de clonación múltiple y otros segmentos codificadores . El término "secuencias complementarias", tal como se usa en la presente, indica dos secuencias de nucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos antiparalelas capaces de aparearse entre si al momento de la formación de enlaces de hidrógeno entres los pares de base. Tal como se usa en la presente, el término "secuencias complementarias" significa secuencias de nucleotido sustancialmente complementarias, según lo determinado por los mismos métodos de comparación de nucleótidos que se indican a continuación, o lo definido como capaz de hibridarse al segmento de ácido nucleico en cuestión bajo condiciones relativamente rigurosas, tales como aquellas previamente descritas. Un ejemplo particular de un segmento de ácido nucleico complementario es un oligonucleotido antisentido. La presente invención también provee genes quiméricos que comprenden los ácidos nucleicos T2R76 y ácidos nucleicos T2R76 recombinantes revelados. Por lo tanto, también se incluyen construcciones y vectores que comprenden ácidos nucleicos T2R76, opcionalmente expresados en combinación con otros ácidos nucleicos T2R. El término "gen" se refiere en general a cualquier segmento de ADN asociado con una función biológica, ün gen abarca secuencias que incluyen, aunque sin limitare a ello, una secuencia codificadora, una región promotora, una secuencia reguladora de cis, un segmento de ADN no expresado que es una secuencia de reconocimiento especifica para proteínas regulatorias , un segmento de ADN no expresado que contribuye a la expresión génica, un segmento de ADN diseñado para tener parámetros deseados o sus combinaciones, ün gen se puede obtener mediante una variedad de métodos, incluyendo clonación de una muestra biológica, síntesis basada en información de secuencia conocida o pronosticada y derivación recombinante de una secuencia existente. El término "gen quimérico", tal como se usa en la presente, se refiere a una región promotora operativamente unida a una secuencia de T2R, p. ej . , un ADNc de T2R, un ácido nucleico T2R que codifica una molécula de ARN antisentido, un ácido nucleico T2R que codifica una molécula de ARN, que tiene estructura terciaria (p. e . , una estructura de horquilla) o a un ácido nucleico T2R que codifica una molécula de ARN bicatenaria. El término "gen quimérico" también se refiere a una región promotora de T2R operativamente unida a una secuencia heteróloga. La preparación de un gen quimérico de la presente invención se describe en el Ejemplo 2. Preferentemente, el T2R es T2R76. El término "operativamente unida", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una combinación funcional entre una región promotora y una secuencia de nucleótido, de modo tal que la transcripción de la secuencia de nucleótido es controlada y regulada por la región promotora. Las técnica para unir operativamente una región promotora a una secuencia de nucleótido se conocen en el campo técnico. El término "recombinante" en general se refiere a un ácido nucleico aislado que es replicable en un entorno no nativo. Por lo tanto, un ácido nucleico recombinante puede comprender un ácido nucleico no replicable en combinación con ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo, ácidos nucleicos de vectores, que permiten su replicación en una célula huésped. El término "vector", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene secuencias de nucleotidos que permiten su replicación en una célula huésped. Un vector también puede incluir secuencias de nucleotidos para permitir la ligación de las secuencias de nucleótido dentro del vector, en donde dichas secuencias de nucleotidos también se replican en una célula huésped. Los vectores representativos incluyen vectores plásmidos, cósmidos y virales. Un vector también puede mediar la producción recombinante de un polipéptido T2R76, como también se describe a continuación. El término "construcción", tal como se utiliza en la presente para describir a un tipo de construcción que comprende una construcción de expresión, se refiere a un vector que también comprende una secuencia de nucleótido operativamente insertada con el vector, de modo tal que la secuencia del nucleótido recombinantemente expresada. Los términos "recombinantemente expresada" o "recombinantemente producida" se utilizan intercambiablemente para referirse en general al procedimiento por el cual se produce un polipéptido codificado por un ácido nucleico recombinante. Por lo tanto, los ácidos nucleicos T2R preferentemente recombinantes, es decir, los ácidos nucleicos T2R76, comprenden ácidos nucleicos heterólogos. El término "ácidos nucleicos heterólogos" se refiere a una secuencia que se origina en una fuente extraña a una célula huésped intencionada o, si es de la misma fuente, se modifica su forma original. Un ácido nucleico heterologo en una célula huésped puede comprender un ácido nucleico que sea endógeno a la célula huésped en particular pero que haya sido modificado, por ejemplo por mutagénesis o aislamiento de las secuencias regulatorias de cis. Un ácido nucleico heterologo incluye también copias múltiples sintéticas de una secuencia de nucleótido nativo. Un ácido nucleico heterologo también puede comprender un ácido nucleico que se incorpora a los ácidos nucleicos de una célula huésped en una posición en donde dichos ácidos nucleicos no se encuentran comúnmente. Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden clonar, sintetizar, alterar, mutagenizar o sus combinaciones. El ADN recombinante y las técnicas de clonación molecular estándar utilizadas para aislar los ácidos nucleicos se conocen en el campo técnico. La mutagénesis específica de sitios para crear cambios, deleciones o pequeñas inserciones de pares de base, también se conocen en la técnica. Véanse, p. e . , Sambrook et al. (eds.) (1989) Molecular Cloning Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning: A Practical Approach, 2a edición, IRL Press en Oxford University Press, Oxford/Nueva York; Ausubel (ed. ) (1995). Short Protocols in Molecular Biology. 3era ed. Wiley, Nueva York.

III. B. Polipéptidos T2R76 La presente invención provee nuevos polipéptidos T2R76, una modalidad representativa que se expone como SEQ ID NOs:2. Preferentemente, un polipéptido T2R76 aislado de la presente invención comprende un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado. También es preferible que los polipéptidos T2R76 aislados comprendan polipéptidos T2R76 funcionales. Estos polipéptidos T2R76 se puede expresar en combinación con uno o más de otros polipéptidos T2R.

Por lo tanto, los nuevos polipéptidos T2R76 útiles en los métodos de la presente invención comprenden: (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustancialmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico sustancialmente idéntica a SEQ ID N0:1. Un polipéptido T2R76 también puede comprender: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID N0:1; (c) una molécula de ácido nucleico aislado que se híbrida a una secuencia de ácido nucleico T2R76 bajo condiciones de lavado rigurosas representadas por una solución de lavado que tiene menos de aproximadamente 200 mM de concentración de sal y una temperatura de lavado mayor que aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislado que difiere en por lo menos un codón funcxonalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislado de uno de (a) , (b) y (c) ya mencionados en la secuencia del ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a) , (b) y (c) anteriores. El término "sustancialmente idéntica", tal como se utiliza en la presente para describir un nivel de similitud entre un T2R y una proteína sustancialmente idéntica, se refiere a una proteína que es por lo menos 35% idéntica. Por ejemplo, en el caso de T2R76 y una proteína sustancialmente idéntica a esta proteína T2R76, esto se refiere a la secuencia que es por lo menos aproximadamente 35% idéntica a SEQ ID NO: 2, al compararse con la longitud total de una proteína T2R76. Preferentemente, una proteína sustancialmente idéntica a una proteína T2R76 comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos aproximadamente 35% a aproximadamente 45% idéntica a SEQ ID NO: 2, más preferentemente por lo menos aproximadamente 45% a aproximadamente 55% idéntica a SEQ ID NO: 2, incluso más preferentemente, por lo menos aproximadamente 55% a aproximadamente 65% idéntica a SEQ ID NO: 2, incluso más preferentemente, aproximadamente 65% a aproximadamente 75% idéntica SEQ ID NO: 2, incluso más preferentemente, por lo menos aproximadamente 75% a aproximadamente 85% idéntica a SEQ ID NO: 2, incluso más preferentemente, por lo menos aproximadamente 85% a aproximadamente 95% idéntica a SEQ ID NO: 2 e incluso más preferentemente, por lo menos aproximadamente 95% a aproximadamente 99% idéntica a SEQ ID NO: 2 en comparación con la longitud total de un polipéptido T2R76. El término "longitud total" se refiere a un polipéptido T2R76 funcional, tal como se describe más a continuación. Los métodos para determinar la identidad del porcentaje entre dos polipéptidos también se definen a continuación bajo el titulo "Comparación de secuencias de nucleótidos y aminoácidos". El término "sustancialmente idénticos", cuando se utiliza para describir polipéptidos, también abarca dos o más polipéptidos que comparten una estructura tridimensional conservada. Se pueden utilizar métodos computacionales para comparar representaciones estructurales y se pueden generar modelos estructurales y afinarse fácilmente para identificar las similitudes en sitios activos importantes o sitios de unión de ligandos . Véanse Saqi et al, (1999) Bioinformatics 15:521-522; Barton (1998) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54:1139-1146; Henikoff et al, (2000) Electrophoresis 21:1700-1706; y Huang et al, (2000) Pac Symp Biocomput : 230-241.

Las proteínas sustancialmente idénticas incluyen también proteínas que comprenden aminoácidos que son funcionalmente equivalentes a los aminoácidos de SEQ ID NO: 2. El término "funcionalmente equivalente" en el contexto de aminoácidos se conoce en la técnica y se basa en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos. Véase Henikoff & Henikoff (2000) Adv Protein Chem 54:73-97. Los factores relevantes para consideración incluyen la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga y tamaño de la cadena lateral. Por ejemplo, arginina, lisina e histidina son todos residuos positivamente cargados; la alanina, glicina y serina son todas de tamaño similar; y la fenilalanina, el triptófano y la tirosina tienen todos en general la misma forma. Mediante el análisis descrito más detalladamente a continuación arginina, lisina e histidina; alanina, glicina y serina; y fenilalanina, triptófano y tirosina; se definen en la presente como equivalentes biológicamente funcionales. Al realizar sustituciones de aminoácidos equivalentes biológicamente funcionales, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a sus características de hidrofobicidad y carga, que son: isoleucina (+ 4.5); valina (+ 4.2); leucina (+ 3.8); fenilalanina (+ 2.8); cisterna (+ 2.5); metionina (+ 1.9); alanina (+ 1.8); glicina 0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9) y arginina (4.5) . La importancia del índice de aminoácido hidropático en conferir la función biológica interactiva a en una proteína en general se entiende en la técnica (Kyte et al, 1982) . Se sabe que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático o puntuación similar e incluso retienen una actividad biológica similar. Para hacer estos cambios al momento del índice hidropático, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +2 del valor original, particularmente se prefieren aquellos que están dentro de ±1 del valor original y se prefieren incluso más particularmente aquellos dentro de +0.5 del valor original. También se ha de entender en el campo técnico que la sustitución de aminoácidos similares se puede efectuar de manera eficaz en base a la patente estadounidense No. 4,554,101 de hidrofilicidad, que describe que la hidrofilicidad promedio local más grande de una proteina, según lo regido por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, p. ej . , con una propiedad biológica de la proteina. Se ha de entender que un aminoácido se puede sustituir con otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar e incluso obtener una proteina biológicamente equivalente . Tal como se detalla en la patente estadounidense No. 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a residuos de aminoácidos: arginina (+ 3.0); lisina (+ 3.0); aspartato (+ 3.0±1); glutamato (+ 3.0±1); serina (+ 0.3); asparagina (+ 0.2); glutamina (+ 0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.511); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteina (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4). En la realización de estos cambios en base a valores de hidrofilicidad similares, se prefiere la sustitución de los aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2 del valor original, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de +1 del valor original e incluso más particularmente aquellos dentro de +0.5 del valor original. El término "sustancialmente idéntico" también abarca polipéptidos que son equivalentes biológicamente funcionales de un polipéptido T2R, p. ej . , el polipéptido T2R76. El término "funcional" incluye una actividad de un polipéptido T2R76, por ejemplo la activación de vías de señales intracelulares (p. ej . , acoplamiento con gustducina) y la mediación de la percepción del sabor. Preferentemente, dicha activación muestra una magnitud y cinética que son sustancialmente similares a aquellas de un polipéptido T2R semejante, p. ej . , un polipéptido T2R76 in vivo. Los métodos representativos para determinar la actividad de T2R76 se describen a continuación. La presente invención también provee fragmentos funcionales de un polipéptido T2R76. Dicha porción funcional no necesita comprender toda o sustancialmente toda la secuencia del aminoácido de un producto génico T2R76 nativo.

La presente invención también incluye secuencias de polipéptidos funcionales que son secuencias más largas que un polipéptido T2R nativo, p. ej . , el polipéptido T2R76. Por ejemplo, se pueden agregar uno o más aminoácidos a la terminal N o a la terminal C de un polipéptido T2R, p. ej . , el polipéptido T2R76. Dichos aminoácidos adicionales se pueden emplear en una variedad de aplicaciones, incluyendo, aunque sin limitarse a ello, aplicaciones de purificación. Los métodos para preparar proteínas estiradas se conocen en el campo técnico.

II. C. Comparaciones de secuencias de nucleótidos y aminoácidos Los términos "idéntica" o "identidad de porcentaje" en el contexto de dos o más secuencias de nucleótidos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales, al compararse y alinearse para correspondencia máxima, según lo medido utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias revelados en la presente o mediante inspección visual.

El término "sustancialmente idéntica" con respecto a una secuencia de nucleótido o polipéptido significa que una secuencia particular varia de la secuencia de una secuencia que ocurre naturalmente por una o más deleciones, sustituciones o adiciones, cuyo efecto neto es retener la función biológica de un ácido nucleico o polipéptido T2R, p. ej . , un ácido nucleico T2R76 o un polipéptido T2R76. Para la comparación de dos o más secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia para la cual se comparan una o más secuencias de prueba. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se ingresan en un programa de computación, se designan coordenadas, si es necesario, y se seleccionan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula luego la identidad de secuencia de porcentaje para la secuencia o secuencias de prueba designadas en relación con la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa seleccionados. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman (1981) Adv Appl Math 2:482-489, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch (1970) J Mol Biol 48:443-453, mediante la búsqueda para el método de similitud de Pearson & Lipman (1988) Proc Nati Acad Sci, EE. UU. 85:2444-2448, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) , o mediante inspección visual. Véase en general, Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology. 3era Wiley, Nueva York. Un algoritmo preferido para determinar la identidad de secuencia de porcentaje y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, el cual se describe en Altschul et al, (1990) J Mol Biol 215:403-410. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través de National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo comprende primero identificar los pares de secuencias de alto puntaje (HSP) , identificando palabras breves de longitud W en la secuencia de consulta, que ya sea se equiparan o satisfacen algún puntaje T de umbral con valor positivo al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Se hace referencia a T como el umbral de puntaje de la palabra cercana. Estos resultados de palabras cercanas actúan como generadores para el inicio de búsquedas de HSP más largos que las contengan. Los resultados de palabras se extienden luego en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como se puede aumentar el puntaje de alineación acumulativo. Los puntajes acumulativos se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre que > 0) y N (puntaje de penalización para residuos no coincidentes; siempre que < 0) . Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntaje a fin de calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los resultados de palabras en cada dirección se detiene cuando el puntaje de alineación acumulativo disminuye por la cantidad X de su máximo valor obtenido, el puntaje acumulativo disminuye a cero o menos debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntaje negativo, o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad- de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra W=ll, una expectativa E=10, un corte de 100) M=5, N=-4) y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 and y la matriz de puntaje BLOSUM62. Véase Henikoff & Henikoff (11992) Proc Nati Acad Sci, EE. ÜU. 89:10915-10919. Además de calcular la identidad de la secuencia de porcentaje, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias. Véase, p. ej . , Karlin & Altschul (1993) Proc Nati Acad Sci, EE. UU. 90:5873-5877. Una medida de la similitud provista por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que provee una indicación de la probabilidad mediante la cual tendría lugar una coincidencia incidental entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de prueba se considera similar a la secuencia de referencia, si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación de la secuencia de ácido nucleico de prueba con la secuencia de ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0.1, más preferentemente inferior a aproximadamente 0.01 y más preferentemente inferior a aproximadamente 0.001.

III Métodos para detectar un ácido nucleico T2R76 En otro aspecto de la invención, se provee un método para detectar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido T2R76. Dichos métodos se pueden utilizar para detectar variantes de genes T2R76 o expresión génica alterada. Por ejemplo, la detección de un cambio en la secuencia o expresión de T2R76 se puede usar para el diagnóstico de diferencias relacionadas con T2R76 en la percepción del sabor. Preferentemente, un ácido nucleico utilizado para este método comprende la secuencia de SEQ ID NO:l. Las secuencias detectadas por los métodos de la invención se pueden detectar, subclonar, secuenciar y evaluar adicionalmente a través de cualquier medida conocida en el campo técnico, usando cualquier método usualmente aplicado a la detección de una secuencia de ADN especifica. Por lo tanto, los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden usar para clonar genes y ADN genómico que comprendan las secuencias reveladas. Alternativamente, los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden usar para clonar genes y ADN genómico de secuencias relacionadas. Para usar las secuencias de ácido nucleico reveladas en la presente, dichos métodos son conocidos por aquellas personas experimentadas en la técnica. Véase, p. ej . , Sambrook et al, eds (1989) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Los métodos representativos se revelan en los Ejemplos 1-4. En una modalidad de la invención, los niveles de una molécula de ácido nucleico de T2R76 se miden, por ejemplo, usando un ensayo RT-PCR. Véanse Chiang (1998) J Chromatogr A 806:209-218 y referencias allí citadas. En otra modalidad de la invención, los ensayos genéticos basados en moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar para detectar variantes genéticas, por ejemplo, por análisis de sonda de oligonucleótido específico de alelo (ASO) (Conner et al, 1983), ensayos de ligación (OLA) (Nickerson et al, 1990), análisis de polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) (Orita et al, 1989), análisis SSCP/heterodúplex, escisión por falta de coincidencia, análisis de secuencia directa de exones amplificados (Kestila et al, 1998; Yuan et al, 1999) , hibridación especifica de alelos (Stoneking et al, 1991) y análisis de restricción de ADN genómico amplificado que contiene la mutación especifica. Los métodos automatizados también se pueden aplicar para caracterización en gran escala de polimorfismos de nucleótido simple (Wang et al, 1998 ; . Brookes, 1999). Los métodos de detección preferidos son no electroforéticos, incluyendo por ejemplo el ensayo de discriminación alélica TAQMAN TM, PCR-OLA, balizas moleculares, sondas candado y fluorescencia de pocilios.' Véase Landegren et al, (1998) Genolne Res 8:769-776 y referencias allí citadas. IV. Sistema para expresión recombinante de un polipéptido T2R76 La presente invención provee también un sistema para expresión de un polipéptido recombinante T2R76 de la presente invención. Este polipéptido TR276 se puede expresar como uno o más de otros T2R que pueden ser T2R humanos o no humanos. Dicho sistema se puede utilizar para la purificación y/o "caracterización subsiguiente de un polipéptido T2R76. Por ejemplo, un polipeptido T2R76 purificado se puede utilizar como inmunógeno para la producción de un anticuerpo T2R76, descrito más detalladamente a continuación. También se puede usar un sistema para expresión recombinante de un polipéptido T2R76 para la identificación de moduladores de un polipéptido T2R76. Alternativamente, los polipéptidos T2R76 revelados se pueden usar como un polipéptido de control al ensayar la activación de otros polipéptidos de prueba. Dichos polipéptidos de prueba pueden incluir otros T2R que estén implicados en la percepción del sabor; por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos revelados en Adler et al (2000) Cell 100:693-702 y en Matsunami et al (2000) Nature 601-603. El término "sistema de expresión" se refiere a una célula huésped que comprende un ácido nucleico heterólogo y el polipéptido codificado por el ácido nucleico heterólogo. Por ejemplo, un sistema de expresión heterologa puede comprender una célula huésped transfectada con una construcción que comprende un ácido nucleico T2R76 recombinante, una célula huésped transfectada con ARNc T2R76 o una linea celular producida por la introducción de ácidos nucleicos heterólogos a un genoma de célula huésped. Como se observó, estos sistemas de expresión pueden incluir otros ácidos nucleicos T2R. Un sistema para expresión recombinante de un polipéptido T2R76 puede comprender: (a) un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado; y (b) una célula huésped que comprende el polipéptido T2R76 recombinantemente expresado. Por ejemplo, un ARNc T2R76 puede transcribirse in vitro y luego introducirse a una célula huésped, mediante la cual se expresa un polipéptido T2R76. El sistema también puede comprender uno o más polipéptidos T2R adicionales, con el fin de producir un receptor T2R heteroménico T2R que comprenda un polipéptido hT2R76 y otro T2R. Un sistema para expresión recombinante de un polipéptido T2R76 también puede comprender: (a) una construcción que comprenda un vector y una molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido T2R76 operativamente unido a un promotor heterólogo; y (b) una célula huésped que comprenda la construcción de (a) , mediante la cual la célula huésped exprese un polipéptido T2R76. El sistema también puede comprender construcciones que codifiquen uno o más polipéptidos T2R adicionales. Adicionalmente, una construcción simple en si misma puede codificar un polipéptido T2R76 y uno o más polipéptidos T2R adicionales . Los polipéptidos aislados y recombinantemente producidos se pueden purificar y caracterizar usando una variedad de técnicas estándar conocidas por las personas experimentadas en el campo técnico. Véanse, p. ej . , Schroder & Lübke (1965) The Peptides . Academic Press, Nueva York; Schneider & Eberle (1993) Peptides, 1992: Proceedings of the Twenty-Second European Peptide Symposium, Septiembre 13-19 Interlaken, Suiza. Escom, Leiden; Bodanzky (1993) Principies of Peptide Synthesis, 2a rev. ed. Springer-Verlag, Berlín/ Nueva York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biolog, 3era ed. Wiley, Nueva York. Preferentemente, un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado comprende un receptor de sabor funcional, más preferentemente un receptor de sabor amargo. Por lo tanto, un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado preferentemente exhibe activación en respuesta a compuestos amargos. También preferentemente, un polipéptido T2R76 recombinante muestra respuestas de activación similares a un polipéptido T2R76 nativo. Los métodos representativos para determinar la función del T2R76 se describen a continuación.

IV.A. Construcciones de expresión Una construcción para expresión de un polipéptido T2R76 incluye una secuencia de nucleótido T2R76 y un vector, en donde la secuencia de nucleótido T2R76 está operativamente unida a una secuencia promotora. Una construcción para la expresión de T2R76 recombinante también puede comprender señales de terminación de la transcripción y secuencias requeridas para una traducción apropiada de la secuencia de nucleótido. Las personas con experiencia en la técnica conocen la preparación de una construcción de expresión, incluyendo la adición de secuencias de señal de traducción y terminación. Se puede dirigir a la producción recombinante de un polipéptido T2R, p. ej . , un polipéptido T2R76, usando un promotor constitutivo o un promotor inducible. Los promotores representativos que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen promotor temprano de virus de simio 40, un promotor largo de repetición terminal del retrovirus, un promotor de actina, un choque de calor y una proteina de metalotieno. Los vectores adecuados que se pueden utilizar para expresar un polipéptido T2R76 incluyen, aunque sin limitarse a ello, virus tales como el virus o adenovirus vaccinia, vectores de baculovirus, vectores de levadura, vectores de bacteriófagos (p. ej . , fago lambda) , vectores de ADN plásmido y cósmido, vectores de transformación mediados por transposones y sus derivados. Las construcciones se introducen en una célula huésped usando un método de transfección compatible con el vector empleado. Los métodos de transfección estándar incluyen electroporación, transfección DEAE-Dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por liposomas, transformación mediada por transposones, infección usando un retrovirus, transferencia génica mediada por partículas, transferencia génica de hipervelocidad y sus combinaciones .

IV .B. Células huésped El término "célula huésped", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una célula en la cual, se puede introducir una molécula de ácido nucleico heteróloga. Se puede utilizar cualquier célula huésped adecuada incluyendo, aunque sin limitarse a ello, huéspedes eucarióticos tales como células mamiferas (p. ej . , células HEK-293, células HeLa, células CV-1, células COS) , células de anfibios (p. ej . , Xenopus oocytes) , células de insectos (p. ej . , células Sf9) , como asi también huéspedes procarióticos tales como E. coli y Bacillus subtilis. Las células huésped preferidas sustancialmente carecen de un polipéptido T2R76. Se puede seleccionar una cepa de célula huésped que module la expresión de la secuencia recombinante o que modifique y procese el producto génico en el modo especifico deseado. Por ejemplo, diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación traduccional y post-traduccional (p. ej . , glicosilación, fosforilación de proteínas) . Las líneas celulares o sistemas huésped apropiados se pueden elegir para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína extraña expresada.

Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano se puede utilizar para producir un producto de proteína de núcleo no glicosilado, y la expresión en levadura producirá un producto glicosilado. La presente invención también abarca la expresión recombinante de un polipéptido T2R76 en una línea celular estable. Los métodos para generar una linea celular estable después de la transformación de una construcción heteróloga en una célula huésped se conocen en el campo técnico. Véase, p. e . , Joyner: (1993) Gene Tarneting: A Practica! Approach. Oxford University Press, Oxford/Nueva York. Por lo tanto, se entiende que las células, tejidos u organismos no humanos transformados abarcan no solamente el producto final de un proceso de transformación, sino también sus formas propagadas o de progenie transgénica. La presente invención también abarca la criopreservación de células que expresan un polipéptido T2R76 recombinante, tal como se revela en la presente. Por lo tanto, las células transíectadas transitoriamente y las células de línea celular estable que expresan T2R76 se pueden congelar y almacenar para uso posterior. Las células congeladas se pueden transportar fácilmente para uso, en una ubicación remota. Los medios de criopreservación en general consisten en un medio base criopreservante y una fuente de proteina. El criopreservante y la proteina protegen las células de la tensión del proceso congelación-deshielo. Para medios que contienen suero, un medio de criopreservación típico se prepara como medio completo que contiene 10% glicerol; medio completo que contiene 10% DMSO (dimetilsulfóxido) o 5,0% medio condicionado por células con 50% medio nuevo con 10% glicerol o 10% DMSO. Para medios sin suero, las formulaciones de criopreservación típicas incluyen 50% medio sin suero condicionado por células con 50% medio nuevo sin suero que contiene 7,5% DMSO; o medio nuevo sin suero que contiene 7,5% DMSO y 10% DMSO de grado de cultivo celular. Preferentemente, una suspensión celular que comprende aproximadamente 106 a aproximadamente 107 células por mi se mezcla con el medio de criopreservación. Las células se combinan con el medio de criopreservación en un vial u otro recipiente adecuado para almacenamiento congelado, por ejemplo NUNC@ CRYOTÜBESTM (comercializado por Applied Scientific de South San Francisco, California) . Las células también se pueden prorratear a pocilios de una placa de pocilios múltiples, por ejemplo una placa de 96 pocilios diseñada para ensayos de gran rendimiento y congelarse en formato de placas. las células preferentemente se enfrian de temperatura ambiente hasta una temperatura de almacenamiento a una velocidad de aproximadamente -1°C por minuto. La velocidad de enfriamiento puede controlarse, por ejemplo, colocando los viales que contienen las células en un recipiente lleno de agua aislado que tenga una capacidad de aproximadamente 1 litro de liquido, y colocando dicho cubo en un refrigerador mecánico a -70°C. Alternativamente, la velocidad de enfriamiento de las células se puede controlar en aproximadamente -1°C por minuto, sumergiendo los viales en un volumen de refrigerante liquido, como un alcohol alifático, en donde el volumen de refrigerante liquido es superior a quince veces el volumen total del cultivo celular que se va a congelar, y colocando los viales de cultivo sumergido en un refrigerador convencional a una temperatura aproximadamente inferior a -70 °C. Los dispositivos comerciales para congelar células también están disponibles, por ejemplo, el Planer Mini-Freezer R202/20OR (Planer Products Ltd. de Gran Bretaña) y el BF-5 Biological Freezer (Union Carbide Corporation de Danbury, Connecticut, Estados Unidos de América) . Preferentemente, las células congeladas se almacenan a una temperatura igual o inferior a aproximadamente -70°C a aproximadamente -80°C, y más preferentemente igual o inferior a aproximadamente -130°C. Para obtener la mejor supervivencia celular posible, la descongelación de las células se debe llevar a cabo lo más rápido posible. Una vez que un vial u otro recipiente que contiene las células congeladas se retira del almacenamiento, debe colocarse directamente en una cuba de agua a 37 °C y agitarse suavemente hasta que se descongele completamente. Si las células son particularmente sensibles a los criopreservantes , éstas se centrifugan para eliminar el criopreservante antes de una mayor proliferación. Se pueden hallar métodos adicionales para preparar y manipular células congeladas en Freshney (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2 a ed. A.R. Liss, Nueva York y en las patentes estadounidenses Nos 6,176,089; 6,140,123; 5,629,145; y 4,455,842; entre otros sitios .

V. Animales transgénicos La presente invención también provee un animal transgénico que comprende una interrupción de la expresión génica de T2R76 y opcionalmente otro interruptor de T2R. La expresión génica alterada puede incluir un nivel alterado o variante imitada de un gen T2R76. La presente invención provee ácidos nucleicos que codifican el T2R76, los cuales se pueden usar para preparar construcciones para generar un animal transgénico. También se proveen datos de localización genómica, útiles para la preparación de construcciones direccionadas al locus de T2R76. En una modalidad de la presente invención, el animal transgénico puede comprender un ratón con modificación direccionada del locus de T2R76 del ratón y también puede comprender cepas de ratones con inactivación completa o parcial de los genes T2R76 en todas las células somáticas . En una modalidad alternativa, un animal transgénico de acuerdo con la presente invención se prepara utilizando construcciones de T2R76 antisentido o de ribosomas, conducidas por un promotor universal o especifico de tejidos, a fin de reducir los niveles de expresión del gen T2R76 en células somáticas, logrando asi un fenotipo desactivado ("knock-down"). La presente invención también provee la generación de cepas murinas con inactivación condicional o inducible de T2R76. Dichas cepas murinas también pueden comprender mutaciones sintéticas o naturales, por ejemplo, una mutación en cualquier otro gen T2R. La presente invención también provee cepas de ratones con modificaciones activadas ( "knocked-in" ) especificas en el gen T2R76, por ejemplo para crear una sobreexpresión o fenotipo negativo dominante. Por lo tanto, las modificaciones "knocked-in" incluyen la expresión de ambas formas naturales y mutadas de ácido nucleico que codifican un polipéptido T2R76. Las técnicas para la preparación de animales transgénicos se conocen en el campo técnico. Las técnicas ilustrativas se describen en la patente estadounidense No 5,489,742 (ratas transgénicas) ; patentes estadounidenses Nos 4,736,866, 5,550,316, 5,614,396, 5,625,125 y 5,648,061 (ratones transgénicos); patente estadounidense No 5,573,933 (cerdos transgénicos); 5,162,215 (especies avícolas transgénicas) y patente estadounidense No 5,741,957 (especies bovinas transgénicas ) , cuyos contenidos totales se incorporan a la presente por referencia. Por ejemplo, un animal transgénico de la presente invención puede comprender un ratón con una modificación direccionada del T2R76 del ratón. Las cepas del ratón con inactivación completa o parcial del gen T2R76 en todas las células somáticas se puede generar usando técnicas estándar de recombinación especifica de sitios en hemocitoblastos embrionarios murinos. Véanse Capecchi (1989) Science 244:1288-1292; Thomas & Capecchi (1990) Nature 346:847-850; y Delpire et al, (1999) Nat Genet 22:192195.

VI. Anticuerpos de T2 76 En otro aspecto de la invención, se provee un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido T2R76. De acuerdo con el método, se formula un polipéptido T2R76 recombinante de longitud total, de modo que se pueda utilizar como un inmunógeno eficaz y utilizarse para inmunizar a un animal como para generar una respuesta inmunológica en ese animal.

La respuesta inmunológica se caracteriza por la producción de anticuerpos que se pueden recoger del suero sanguíneo del animal. La presente invención también provee anticuerpos producidos por los métodos que emplean los nuevos polipéptidos T2R76 revelados en la presente, incluyendo SEQ ID NO: 2. El término "anticuerpo" se refiere a una proteina de inmunoglobulina o a una porción funcional de la misma, incluyendo un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo híbrido, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo mutagenizado, un anticuerpo humanizado y fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de unión a antigeno (p. ej . , fragmentos de anticuerpo Fab y Fv) . En una modalidad preferida de la invención, un anticuerpo de T2R76 comprende un anticuerpo monoclonal. Por lo tanto, la presente invención también abarca anticuerpos y líneas celulares que producen anticuerpos monoclonales , tal como se describe en la presente . El término "se une específicamente", cuando se utiliza para describir la unión de un anticuerpo a un polipéptido T2R76, se refiere a la unión a un polipéptido T2R76 en una mezcla heterogénea de otros polipéptidos. Las frases "que sustancialmente carece de unión" o "sustancialmente sin unión", tal como se utilizan en la presente para describir la unión de un anticuerpo a un polipéptido o muestra de control, se refiere a un nivel de unión que abarca unión no especifica o de fondo, pero que no incluye unión especifica. Las técnicas para preparar y caracterizar anticuerpos se conocen en el campo técnico. Véanse, p. ej . , Harlow & Lañe (1988) Antibodies: ? Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York y las patentes estadounidenses Nos 4,196,265; 4,946,778; 5,091,513; 5,132,405; 5,260,203; 5,677,427; 5,892,019; 5,985,279; y 6,054,561. Los anticuerpos de T2R76 preparados como se revela en la presente, se pueden utilizar en métodos conocidos en la técnica relacionados con la localización y actividad de los polipéptidos T2R76, p. ej . , para la clonación de los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido T2R76, inmunopurificación de un polipéptido T2R76, formación de imágenes de un polipéptido T2R76 en una muestra biológica y medición de niveles de un polipéptido T2R76 en muestras biológicas apropiadas. Para llevar a cabo dichos métodos, un anticuerpo de la presente invención también puede comprender un marcador detectable incluyendo, aunque sin limitarse a ello, un marcador radioactivo, un marcador fluorescente, un marcador de epitope y un marcador que se pueda detectar in vivo. Los métodos para la selección de un marcador adecuado para una técnica de detección particular y los métodos para conjuqar o asociar un marcador detectable con un anticuerpo son conocidos por aquellos con experiencia en la técnica.

VIII. Moduladores de T2R76 La presente invención describe además ensayos para identificar moduladores de la actividad de T2R76. ün ensayo puede emplear un sistema para la expresión de un polipéptido T2R76, tal como se revela en la presente, o un polipéptido T2R76 aislado en un sistema tal en el que dicho polipéptido T2R se puede expresar con otros polipéptidos T2R. La presente invención también provee moduladores de la actividad de T2R76 identificada usando los métodos revelados . El término "modular" significa un aumento, disminución u otra alteración de cualquiera de las actividades o propiedades químicas y biológicas de un polipéptido T2R76. Por lo tanto, el método para identificar los moduladores comprende ensayar un nivel o calidad de la función del T2R76. Un método para identificar un modulador de una función del T2R76 puede comprender: (a) proveer un sistema de expresión recombinante mediante el cual se exprese un polipéptido T2R76 en una célula huésped, y en el que el polipéptido T2R76 comprenda un polipéptido T2R76; (b) proveer una sustancia de prueba para el sistema de (a) ; (c) ensayar el nivel o calidad de la función de T2R76 en presencia de la sustancia de prueba; (d) comparar el nivel o la calidad de la función de T2R76 en presencia de la sustancia de prueba con un nivel o calidad de control de la función de T2R76; y (e) identificar una sustancia de prueba como un modulador de T2R76, determinando un nivel o calidad de la función de T2R76 en presencia de la sustancia de prueba como significativamente cambiado en comparación con un nivel o calidad de control de la función de T2R76. En algunas realizaciones, el sistema de expresión proveerá también T2R76 para expresarse conjuntamente con al menos un otro T2R. Un nivel o calidad de control de la actividad de T2R76 se refiere a un nivel o calidad de la actividad de T2R76 natural. Preferentemente, un sistema para expresión recombinante de un polipéptido T2R76 comprende la SEQ ID NO: 2. Al evaluar la capacidad de modulación de una sustancia de prueba, un nivel o calidad de control de la actividad de T2R76 comprende un nivel o calidad de la actividad en ausencia de una sustancia de prueba. El término "significativamente cambiado", tal como se usa en la presente para referirse a un nivel o actividad alterada de un polipéptido T2R, p. ej . , un polipéptido T2R76, se refiere a un cambio cuantificado en una calidad mensurable que es mayor que el margen de error inherente en la técnica de medición, preferentemente un aumento o disminución de aproximadamente 2 veces o más relativo a una medición de control, más preferentemente un aumento o disminución de aproximadamente 5 veces o más y más preferentemente un aumento o disminución de 10 veces o más . En una modalidad de la invención, ensayar la función de T2R76 comprende determinar un nivel de expresión génica de T2R76. En otra modalidad de la invención, ensayar la función de T2R76 comprende ensayar la actividad de unión de un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado. Por ejemplo, una actividad de T2R76 puede comprender una cantidad o fuerza de unión de un modulador a un polipéptido T2R76. Incluso en otra modalidad de la invención, ensayar la función de T2R76 puede comprender ensayar una conformación activa de un polipéptido T2R76. En una modalidad preferida de la invención, ensayar una función de T2R76 comprende ensayar la activación de los eventos de señalización intracelular en respuesta a la unión de un ligando o un modulador a un polipéptido T2R76. Por ejemplo, la estimulación mediada por ligandos de la actividad de intercambio de la proteina G se puede ensayar midiendo una cantidad de unión de [35S]GTPYS a un polipéptido T2R76, tal como se describe en más detalle a continuación y en el Ejemplo 3. Los moduladores identificados por los métodos revelados pueden comprender agonistas y antagonistas. Tal como se usa en la presente, el término "agonista" significa una sustancia que activa, sinergiza, o potencia la actividad biológica de un polipéptido T2R76. Tal como se usa en la presente, el término "antagonista" se refiere a una sustancia que bloquea o mitiga la actividad biológica de un polipéptido T2R76. Un modulador también puede comprender un ligando o una sustancia que se una específicamente a un polipéptido T2R76. Los ensayos de unión y actividad para la determinación de un modulador de T2R76 se pueden efectuar in vitro o in vivo. En una modalidad de la invención, dichos ensayos son útiles para la identificación de moduladores de T2R76 que se pueden desarrollar como aditivos para alterar el sabor de una composición para uso oral incluyendo, aunque sin limitarse a ello, alimentos, bebidas, enjuagues orales, dentífricos, productos cosméticos y productos farmacéuticos, tal como se describe más detalladamente bajo el título "Aplicaciones". Por ejemplo, se puede usar un inhibidor de T2R76 para reducir el sabor amargo. En otra modalidad de la invención, dichos ensayos son útiles para la identificación de moduladores de T2R76 que se pueden desarrollar como aditivos para alterar el sabor de un compuesto que es de posible pero inconveniente uso oral, por ejemplo limpiadores para el hogar, venenos, etc. Por lo tanto, se puede usar un agonista de T2R76 para introducir o aumentar el sabor amargo de una composición con el fin de desalentar asi su uso oral. En otra modalidad de la invención, los ensayos que usan un polipéptido T2R76 recombinante se pueden llevar a cabo con el fin de predetectar agentes bioactivos, en donde no se desea la interacción entre el agente y el T2R76. Por ejemplo, se puede probar la actividad moduladora de T2R76 que puede resultar en un sabor amargo indeseable de un fármaco de administración a un sujeto. Incluso en otra modalidad de la invención, un ensayo revelado en la presente se puede utilizar para caracterizar un polipéptido T2R76 mutante, por ejemplo un polipéptido mutante que está unido a diferencias en la percepción del sabor amargo. La expresión recombinante de los polipéptidos T2R76 mutados permitirá un mayor análisis de los polipéptidos T2R76 relacionados con trastornos. De acuerdo con la presente invención, se provee un método de detección de gran rendimiento que se basa en los métodos descritos en la presente. - Este método de detección comprende poner en contacto separadamente un polipéptido T2R76 con una pluralidad de sustancias de prueba. En dicho método de detección, la pluralidad de las sustancias diana preferentemente comprende más de aproximadamente 104 muestras, o más preferentemente comprende más de aproximadamente 105 muestras e incluso más preferentemente más de aproximadamente 106 muestras. Los ensayos in vitro y celulares de la invención pueden comprender ensayos solubles o pueden adicionalmente comprender un sustrato de fase sólida para inmovilizar uno o más componentes del ensayo. Por ejemplo, un polipéptido T2R76 o una célula que expresa un polipéptido T2R76 y opcionalmente otro polipéptido T2R se pueden unir directamente a un componente en estado sólido via un ligamiento covalente o no covalente. Además, opcionalmente, la unión puede incluir una marca o molécula ligadora que medie la unión indirecta de un polipéptido T2R76 a un sustrato. Los ligadores representativos incluyen pares de unión conocidos (p. e . , biotina y avidina) , anticuerpos que reconocen antigenos conocidos, polímeros sintéticos (p. ej . , poliuretanos , poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietileniminas, poliarilensulfuros, polisiloxanos , poliimidas y poliacetatos) , péptidos, éteres. Un ligador puede opcionalmente comprender un ligador flexible, por ejemplo ligadores de poli (etilenglicol) (comercializados por S earwater Polymers, Inc. de Huntsville, Alabama, Estados Unidos de América) . Opcionalmente, un ligador también puede comprender amida, sulfhidrilo o sitios de · unión heterofuncionales . Los ligadores pueden anexarse a un sustrato sólido usando cualquiera de una variedad de métodos corrientes, incluyendo derivatización de un sustrato mediante el cual reacciona con un ligador o enfoques no químicos que emplean entrecruzamiento ultravioleta o calor. Los protocolos representativos se pueden encontrar, por ejemplo, en Merrifield (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154 (que describe síntesis de fase sólida de, p. ej . , péptidos) ; Geysen et al, (11987) J Immun Meth 102:259-274 (que describe síntesis de componentes de fase sólida sobre ejes); Frank & boring (1988) Tetrahedron 44:60316040 (que describe síntesis de distintas secuencias de péptidos en discos de celulosa); Fodor et al. (1991) Science 251:767-777; y Kozal et al. (1996) Nat Med 2(7):753759 (que describe conjuntos de biopolímeros fijados a sustratos sólidos), Merrifield (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154 (que describe síntesis de fase sólida de, p. ej . , péptidos); Geysen et al. (1987) J Immun Meth 102:259-274 (que describe síntesis de componentes de fase sólida sobre ejes) ; Frank & Doring (1988) Tetrahedron 44:60316040 (que describe síntesis de distintas secuencias de péptidos sobre discos de celulosa); Fodor et al. (1991) Science 251:767-777; y Kozal et al. (1996) Nat Med 2(7): 753759 (que describe conjuntos de biopolímeros fijados a sustratos sólidos) , entre otros sitios.

VII.A. Sustancias de prueba Un modulador potencial ensayado usando los métodos de la presente invención comprende una sustancia candidata. Tal como se usan en la presente, los términos "sustancia candidata" y "sustancia de prueba" se utilizan de modo intercambiable, y cada uno se refiere a una sustancia que se sospecha interactúa con un polipéptido T2R76, incluyendo cualquier producto o composición sintética, recombinante o natural. Una sustancia de prueba que se sospecha interactúa con un polipéptido, puede ser evaluada para dicha interacción, usando los métodos revelados en la presente.

Las sustancias de prueba representativas incluyen, aunque sin limitase a ello, péptidos, oligómeros, ácidos nucleicos (p. ej . , aptámeros) , pequeñas moléculas (p. ej . , compuestos químicos), sus anticuerpos o fragmentos, fusiones de proteina-ácido nucleico, cualquier otro agente de afinidad y sus combinaciones. Una sustancia de prueba puede adicionalmente comprender un carbohidrato, una vitamina o uno de sus derivados, una hormona, un neurotransmisor, un virus o su dominio de unión al receptor, una rodopsina u ops, un odorante, una feromona, una toxina, un factor de crecimiento, un factor de activación plaquetaria, un péptido neuroactivo o una neurohormona . Preferentemente, una sustancia candidata produce la percepción del sabor amargo. Una sustancia candidata a probar puede ser una molécula purificada, una muestra homogénea o una mezcla de moléculas o compuestos. El término "molécula pequeña", tal como se usa en la presente, se refiere a un compuesto, por ejemplo, un compuesto orgánico, con un peso molecular inferior a aproximadamente 1,000 daltons, más preferentemente inferior a aproximadamente 750 daltons, incluso más preferentemente inferior a aproximadamente 600 daltons e incluso más preferentemente inferior a aproximadamente 500 daltons. Una molécula pequeña también preferentemente tiene un coeficiente logarítmico de partición de octanol-agua calculado en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente +14, más preferentemente en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente +7.5. Las sustancias de prueba se pueden obtener o preparar como una biblioteca. Tal como se usa en la presente, el término "biblioteca" significa una colección de moléculas. Una biblioteca puede contener una cantidad pequeña o grande de moléculas diferentes, que varían entre aproximadamente diez moléculas a varios billones de moléculas o más . Una molécula puede comprender una molécula natural, una molécula recombinante o una molécula sintética. Se puede ensayar simultáneamente una pluralidad de sustancias de prueba en una biblioteca. Opcionalmente, las sustancias de prueba derivadas de diferentes bibliotecas se pueden mezclar para evaluación simultánea. Las bibliotecas representativas incluyen, aunque sin limitarse a ello, una biblioteca de péptidos (patentes estadounidenses Nos 6,156,511, 6,107,059, 5,922,545, y 5,223,409), una biblioteca de oligómeros (patentes estadounidenses Nos. 5,650,489 y 5,858,670), una biblioteca de aptámeros (patentes estadounidenses Nos 6,180,348 y 5,756,291), una biblioteca de moléculas pequeñas (patentes estadounidenses Nos 6,168,912 y 5,738,996), una biblioteca de anticuerpos o fraqmentos de anticuerpos (patentes estadounidenses Nos 6,174,708, 6,057,098, 5,922,254, 5,840,479, 5,780,225, 5,702,892 y 5,667,988), .una biblioteca de fusiones de ácido nucleico-proteina (patente estadounidense No 6,214,553) y una biblioteca de cualquier otro agente de afinidad que pueda unirse potencialmente a un polipéptido T2R76 (p. ej . , patentes estadounidenses Nos 5,948,635, 5,747,334 y 5,498,538). Una biblioteca puede comprender una colección aleatoria de moléculas. Alternativamente, una biblioteca puede comprender una colección de moléculas que tengan un error sistemático para una secuencia, estructura o conformación en particular. Véanse, p. ej . , las patentes estadounidenses Nos. 5,264,563 y 5,824,483. Los métodos para preparar bibliotecas que contengan poblaciones de diversas poblaciones de varios tipos de moléculas se conocen en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en las patentes estadounidenses ya citadas en la presente.

También se comercializan numerosas bibliotecas.

VII.B. Ensayos de unión En otra modalidad de la invención, un método para identificar un modulador de T2R76 comprende determinar la unión especifica de una sustancia de prueba a un polipéptido T2R76 o un receptor heteroménico, que comprende un polipéptido T2R76 y uno o más de otros polipéptidos T2R. El término "unión" se refiere a una afinidad entre dos moléculas. Preferentemente, la unión especifica también abarca una calidad o estado de acción mutua tal que una actividad de una proteina o compuesto sobre otra proteina es inhibitoria (en el caso de un inhibidor o antagonista) o intensificadora (en el caso de un activador o agonista) . La frase "que se une específicamente (o selectivamente)", cuando se hace referencia a la capacidad de unión de un modulador candidato, se refiere a una reacción de unión que es determinante en presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros materiales biológicos. La unión de un modulador a un polipéptido T2R76 se puede considerar específica si la afinidad de unión es de aproximadamente 1X104M_1 a aproximadamente 1?106?_1 o mayor. La frase "se une específicamente" también se refiere a una unión saturable. Para demostrar una unión saturable de una sustancia de prueba a un polipéptido T2R76, se puede llevar a cabo un análisis Scatchard tal como describen, por ejemplo, Mak et al (1989) J Biol Chem 264:21613-21618. Las frases "que sustancialmente carece de unión" o "sustancialmente sin unión", tal como se usan en la presente para describir la unión de un modulador a un polipéptido o muestra de control, se refieren a un nivel de de unión que abarca unión no específica o de fondo, pero no incluyen la unión específica. Se pueden usar varias técnicas para detectar interacciones entre un polipéptido T2R76 y una sustancia de prueba sin emplear un modulador competitivo conocido. Los métodos representativos incluyen, aunque sin limitarse a ello, Espectroscopia de Correlación de Fluorescencia, Desorción/Ionización Láser Intensificada por Superficie (Surface-Enhanced Láser Desorption/Ionization o SELDI) , Espectroscopia másica de dispersión y tecnología Biacore, en donde cada una de dichas técnicas se describe a continuación. Estos métodos son dóciles para detección automatizada de gran rendimiento. La Espectroscopia de Correlación de Fluorescencia (FCS) mide la proporción de difusión promedio de una molécula fluorescente dentro de un volumen de muestra pequeña (Tallgren, 1980) . El tamaño de la muestra puede ser de tan solo 103 moléculas fluorescentes y el volumen de la muestra de tan solo el citoplasma de una sola bacteria. La proporción de difusión es una función de la masa de la molécula y disminuye a medida que la masa aumenta. La FCS puede, por lo tanto, aplicarse a un análisis de interacción de polipéptido-ligando, midiendo el cambio en masa y en consecuencia en proporción de difusión de una molécula al momento de unión. En un experimento típico, la diana que se analizará (p. ej . , un polipéptido T2R76) se expresa como un polipéptido recombinante con una marca de secuencia, tal como una secuencia de poli-histidina, insertada en la terminal N o en la terminal C. La expresión se media en una célula huésped, como células mamiferas, E. coli, levadura o Xenopus oocytes . El polipéptido se purifica usando métodos cromatográficos . Por ejemplo, la marca de poli-histidina se puede usar para unir el polipéptido expresado a una columna de quelato de metal, como Ni2+ quelado en ácido iminodiacé ico agarosa. El polipéptido se marca luego con una marca fluorescente, tal como carboxitetrametilrodamina o reactivo BODIPYTm (comercializado por Molecular Probes de Eugene, Oregon) . El polipéptido se expone luego en solución al ligando potencial, y se determina su proporción de difusión por FCS, usando la instrumentación comercializada por Cari Zeiss, Inc. (Thornwood, Nueva York) . Al unión al ligando se determina por los cambios en la proporción de difusión del polipéptido. La SELDI fue desarrollada por Hutchens & Yip (1993) Rapid Commun Mass Spectrom 7:576-580. Al acoplarse a un espectrómetro másico de dispersión {time-of-flight mass spectrometer o TOF) , SELDI provee una técnica para analizar rápidamente las moléculas retenidas en una microplaqueta . Se puede aplicar a un análisis de interacción ligando-proteína, uniendo covalentemente la proteína diana o una porción de la misma en la microplaqueta, y analizando por espectrometría de masas las moléculas pequeñas que se unen a esta proteína (Worrall et al, 1998). En un experimento típico, un polipéptido diana (p. e . , un polipéptido T2R76) se expresa y purifica recombinantemente . El polipéptido diana se una a microplaqueta SELDI, ya sea utilizando una marca de poli-histidina o mediante otra interacción, tal como intercambio de iones o interacción hidrófoba. Una microplaqueta asi preparada se expone luego al ligando potencial vía, por ejemplo, un sistema de suministro capaz de pipetar los ligandos en un modo secuencial (automuest eado ) . La microplaqueta se lava luego en soluciones de rigurosidad aumentada, por ejemplo, una serie de lavados con soluciones tampón que contienen una resistencia iónica incrementada. Después de cada lavado, el material unido se analiza enviando la microplaqueta a SELDI-TOF. Los ligandos que unen específicamente un polipéptido diana se identifican por la rigurosidad del lavado necesaria para eluirlos. Biacore depende de los cambios del índice refractario en la capa de superficie al momento de la unión de un ligando a un polipéptido diana (p. ej . , un polipéptido T2R76) inmovilizado en la capa. En este sistema, se inyecta una colección de pequeños ligandos de manera secuencial en una célula de 2-5 microlitros, en donde el polipéptido diana se inmoviliza dentro de la célula. La unión es detectada por resonancia de plasmon superficial (SPR) , registrando luz láser refractada desde la superficie. En general, el cambio en el índice refractario para un cambio de concentración de masas determinado en la capa de la superficie es prácticamente el mismo para todas las proteínas y péptidos, permitiendo que se aplique un solo método para cualquier proteína (Liedberg et al., 1983. En un experimento típico, una proteína diana se expresa, purifica y une recombinantemente a una microplaqueta Biacore. La unión se puede facilitar utilizando una marca de poli-histidina o mediante otra interacción tal como intercambio de iones* o interacción hidrófoba. Una microplaqueta así preparada se expone luego a uno o más ligandos potenciales vía el sistema de suministro incorporado a los instrumentos comercializados por Biacore (üppsala, Suecia) para pipetar los ligandos en un modo secuencial (automuestreador) . Se registra la señal de SPR en la microplaqueta y los cambios en el índice refractario indican una interacción entre la diana inmovilizada y el ligando. El análisis de la cinética de la señal dentro de la proporción y fuera de la proporción hace posible la discriminación entre la interacción no específica y la específica. Véase también Homola et al. (1999) Sensors and Actuators 54:3-15 y las referencias allí citadas .

VII. C. Ensayo de conformación La presente invención también provee un método para identificar un modulador de T2R76 que se basa en un cambio de conformación de un polipéptido T2R76 expresado solo o en asociación con otro polipéptido T2R al unirse o interactuar con un modulador de T2R76. La aplicación de dicroismo circular a soluciones de macromoléculas revela los estados de conformación de estas macromoléculas. La técnica puede distinguir estados de conformación en espiral aleatoria, alfa-helicoidal y en cadena beta. Para identificar los moduladores de un polipéptido T2R76, se puede efectuar análisis de dicroismo circular, usando un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado. Un polipéptido T2R76 se purifica, por ejemplo, por intercambio de iones y cromatografía de exclusión de tamaño, y se mezcla con una sustancia de prueba. La mezcla se somete a dicroismo circular. La conformación de un polipéptido T2R76 en presencia de una sustancia de prueba se compara con una conformación de un polipéptido T2R76 en ausencia de una sustancia de prueba. Un cambio en el estado de la conformación de un polipéptido T2R76 en presencia de una sustancia de prueba puede, por lo tanto, usarse para identificar un modulador de T2R76. Los métodos representativos se describen en las patentes estadounidenses Nos. 5,776,859 y 5,780,242. El polipéptido T2R76 puede estar comprendido en un receptor heteroménico que comprende otro polipéptido T2R.

VII.D. Ensayos de activación del receptor En una modalidad preferida de la invención, un método para identificar un modulador de T2R76 emplea un polipéptido funcional T2R76. Los nuevos polipéptidos T2R76 revelados en la presente incluyen SEQ ID NO: 2. Los métodos representativos para determinar la función de T2R76 incluyen ensayar la activación mediada por ligandos de eventos de señalización intracelular, tal como se describe a continuación. El efecto de una sustancia de prueba en una función de T2R76 puede comprender ensayar cualquier cambio fisiológico producido por la actividad de T2R76 incluyendo, aunque sin limitarse a ello, fosforilación de un polipéptido T2R76, proteina G que se une al polipéptido T2R7G, flujo de iones en una célula que expresa un polipéptido T2R76, cambios en la transcripción génica, cambios en el metabolismo celular (p. ej . , proliferación celular) , cambios en los segundos mensajeros intracelulares (p. ej . , Ca2+, IP3, cGMP, cAMP) y cambios en la liberación de hormonas o el transmisor. La transducción de señal de GPCR y los métodos para ensayarla se describen en Methods in Enzymology, volúmenes 237 y 238 (1994) . Véase también Berridge & Irvine (1984) Nature 312:315-321; Bourne et al, (1991) Nature 10:349:117-27; Bourne et al. (1990) Nature 348:125-32; Felley-Bosco et al. (1994) Am J Resp Cell and Mol Biol 11:159-164; Mistili & Spector (1997) Nat Biotech 15:961-964; Offermanns & Simón (1995) J Biol Chem 270:15175-15180; Pitcher et al. (1998) TAnnu Rev Biochem 67:653-92; y en las patentes estadounidenses Nos. 4,115,538; 5,436,128; 6,004,808, 6,403,305 y 6,255,059. En una modalidad preferida de la invención, ensayar la función T2R76 comprende ensayar el acoplamiento de un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado solo o en asociación con otro polipéptido T2R a gustducina o una proteina de G promiscua, como Gq o transducina. Un nivel representativo de actividad de T2R76 puede, por lo tanto, comprender un intercambio de cantidad de GDP para GTPyS en gustducina, según se describe en el Ejemplo 3. Una calidad representativa de la actividad de T2R76 puede comprender, por ejemplo, la activación selectiva de la proteina G y subunidades . De acuerdo con el método, las células que expresan T2R76 se pueden proveer en la forma de un kit útil para efectuar un ensayo de la función de T2R76. Por lo tanto, las células se pueden congelar como se describió anteriormente, y transportarse mientras están congeladas para la realización de un ensayo. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, se provee un kit de prueba para detectar un modulador de T2R76, en donde el kit comprende: (a) células congeladas transfectadas con ADN que codifica un polipéptido T2R76 de longitud total; y (b) un medio para proliferar las células. Preferentemente, una célula utilizada en dicho ensayo comprende una célula que está sustancialmente desprovista de T2R76 nativo y polipéptidos similares a T2R76. Una célula preferida comprende una célula eucariótica, por ejemplo, una célula HEK-293.

El término "sustancialmente desprovista de", tal como se usa en la presente para describir una célula huésped o una célula de control, se refiere a una calidad que tiene un nivel de T2R76 nativo, un nivel de un polipéptido sustancialmente similar a T2R76, o un nivel de su actividad, que comprende un nivel de fondo. El término "nivel de fondo" abarca mediciones no especificas de expresión o actividad que se detectan típicamente en una célula sin T2R76 y sin polipéptidos sustancialmente a un polipéptido T2R76. Las células utilizadas en los ensayos de la invención preferentemente comprenden una proteína G funcional capaz de acoplar un receptor de T2R76 a una vía de señalización intracelular. En una modalidad de la invención, la proteína funcional G puede comprender una proteína G que exhibe acoplamiento promiscuo, por ejemplo G l5 y Gal6. Véanse Wilkie et al. (1991) Proc Nad Acad Sci EE. üü. 88:10049-10053 y la patente estadounidense No 6,004,808. También preferentemente, todos los ensayos que emplean células que expresan T2R76 recombinante emplean adicionalmente células de control sustancialmente desprovistas de T2R76 nativo y polipéptidos sustancialmente similares a un polipéptido T2R76. Al utilizar células transfectadas transitoriamente, una célula de control puede comprender, por ejemplo, una ¦ célula huésped no transfectada . Al utilizar una línea celular estable que expresa un polipéptido T2R76, una célula de control puede comprender, por ejemplo, una línea celular principal usada para derivar la línea celular que expresa T2R76. Los ensayos de actividad de T2R76 que emplean células transfectadas transitoriamente, preferentemente incluyen un marcador que distingue las células transfectadas de las células no transfectadas . El término "marcador" se refiere a cualquier molécula detectable que se pueda utilizar para distinguir una célula que expresa recombinantemente T2R76, de una célula que no expresa recombinantemente un polipéptido T2R76. Preferentemente, un marcador se codifica o asocia con una construcción para la expresión de T2R76, de modo tal que las células se transfectan simultáneamente con una molécula de ácido nucleico que codifica T2R76 y el marcador. Las moléculas detectables representativas útiles como marcadores incluyen, aunque sin limitarse a ello, un ácido nucleico dd heterólogo, un polipéptido codificado por una construcción transfectada (p. ej . , una enzima o un polipéptido fluorescente) , una proteina de unión y un antigeno. Por ejemplo, un marcador puede comprender una marca con rodopson, que se puede detectar inmunológicamente, tal como se describe en el Ejemplo 2. Los ejemplos de enzimas que son útiles como marcadores incluyen fosfatasas (como fosfatasa ácida o alcalina) , ß-galactosidasa, ureasa, glucosa oxidasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, glucoamilasa, maleato deshidrogenasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, ß-glucosidasa, proteasas, piruvato descarboxilasa, esterasas, luciferasa, alcohol deshidrogenasa o peroxidases (como peroxidasa de rábano picante) . Un marcador que comprende una enzima se puede detectar en base a la actividad de la enzima. Por lo tanto, se añadirá un sustrato para catalizar una reacción, cuyo producto final sea detectable, por ejemplo, usando un espectrofotómetro, un luminómetro o un fluorímetro. Los sustratos para la reacción por las enzimas anteriormente mencionadas y aquellos que producen un producto de reacción detectable, se conocen en la técnica.

Un marcador preferido comprende un polipéptido codificado que puede detectarse en ausencia de un sustrato añadido. Los polipéptidos representativos que se pueden detectar directamente incluyen GFP y EGFP. Se han desarrollado equipos de investigación común para detección de fluorescencia de gran rendimiento, por ejemplo, fluorescencia de GFP o EGFP, incluyendo instrumentos de GSI Lumonics (Watertown, Massachussets, Estados Unidos de América) , Amersharn Pharmacia Biotech/Molecular Dynamics (Sunnyvale, California, Estados Unidos de América) , Applied Precisión Inc. (Issauah, Washington, Estados Unidos de América) y Genomic Solutions Inc. (Ann Arbor, Michigan, Estados Unidos de América) . La mayoría de los sistemas comerciales usan alguna forma de tecnología de exploración con detección de tubo fotomultiplicador.

VII . E . Diseño racional El conocimiento de la estructura de un polipéptido T2R76 nativo provee un enfoque del diseño racional de los moduladores y agentes de diagnóstico. En resumen, la estructura de un polipéptido T2R76 se puede determinar por cristalografía de rayos X y/o por algoritmos computacionales que generan representaciones tridimensionales. Véanse Saqi et al, (1999) Bioinformatics 15:521-522; Huang et al, (2000) Pac Symp Biocomput : 230-241 ; y la solicitud de patente internacional PCT No WO 99/26966. Alternativamente, un modelo de trabajo de un polipéptido T2R76 puede derivar por modelos de homología (Maalouf et al, 1998) . Los modelos de computación pueden además pronosticar la unión de una estructura de una proteína a distintas moléculas de sustrato que se pueden sintetizar y probar usando los ensayos previamente descritos. En las patentes estadounidenses Nos 5, 834,228 y 5,872,011 se describen técnicas de diseño de compuestos adicionales . En general, un polipéptido T2R76 es una proteína de membrana y se puede purificar en forma soluble usando detergentes u otras moléculas anfifílicas adecuadas. El polipéptido T2R76 resultante se encuentra en pureza y concentración para cristalización. El polipéptido T2R76 purificado preferentemente funciona como una banda simple, bajo electroforesis en gel de poliacrilamida reductora o no reductora (PAGE) . El polipéptido T2R76 purificado se puede cristalizar bajo diferentes condiciones de por lo menos uno de los siguientes: pH, tipo tampón, concentración de tampón, tipo sal, tipo polímero, concentración de polímero, otros ligandos precipitantes y concentración de T2R76 purificado. Los métodos para generar un polipéptido cristalino se conocen en la técnica y se pueden adaptar razonablemente para la determinación de un polipéptido T2R76, tal como se revela en la presente. Véase, p. ej . , Deisenhofer et al. (1984) J Mol Biol 180:385-398; Weiss et al. (1990) FEBS Lett 267:268-272; o los métodos provistos en un kit comercial, tal como el kit CRYSTAL SCREEN™ (comercializado por Hampton Research de Riverside, California, Estados Unidos de América) . Un polipéptido T2R76 cristalizado se puede probar para actividad funcional y los cristales de diferentes formas y tamaños también se prueban para adecuación en difracción de rayos X. En general, los cristales más grandes proveen mejor cristalografía que los cristales más pequeños, y los cristales más gruesos proveen mejor cristalografía que los cristales más finos. Preferentemente, los cristales T2R76 varían en tamaño de 0.1-1.5 mm. Estos cristales difractan rayos x hasta al menos una resolución 10 A, tal como 1.5-10.0 A o cualquier intervalo de valor allí comprendido, tal como 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 ó 3, prefiriéndose 3.5 A o menos para la resolución más alta.

VIII . Métodos para detectar un polipéptido La presente invención provee además, métodos para detectar un polipéptido T2R76. Los métodos revelados se pueden usar para determinar niveles alterados de expresión de T2R76 que se asocian con diferencias relacionadas con T2R76 en la percepción de sabor. En una modalidad de la invención, el método comprende efectuar una reacción inmunoquímica con un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido T2R76, en donde el anticuerpo se preparó de acuerdo con un método de la presente invención para producir dicho anticuerpo. Por lo tanto, el método comprende: (a) obtener una muestra biológica que comprende material peptídico; (b) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido T2R76 y que se produjo de acuerdo con los métodos revelados, en donde el anticuerpo comprende un marcador detectable; y (c) detectar el marcador detectable mediante el cual se detecta un polipéptido T2R76 en una muestra. Las técnicas para detectar dichos conjugados o complejos de anticuerpo-antigeno se conocen en el campo técnico e incluyen, aungue sin limitarse a ello, centrifugación, cromatografía de afinidad y otros métodos inmunoquímicos . Véanse, por ejemplo, Manson (1992) Immunochemical Protocols. Humana Press, Toto a, Nueva Jersey, Estados Unidos de América; Ishikawa (1999) ültrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassa .Elsevier, Amsterdam/Nueva York, Estados Unidos de América; Law (1996) Immunoassay: Practical Guide. Taylor & Francis, Londres/Bristol, Pennsylvania, Estados Unidos de América; Chan (1996) Immunoassay Automatlon : An Updated Guide to Systems. Academic Press, San Diego; Liddell & Weeks (1995) Antibody Technology. Bios Scientific Publishers, Oxford, Reino Unido; Masseyeff et al. (1993) Methods of Iitimunological Analysis . VCH Verlagsgesellschaft/VCH Publishers, Weinheim, República Federal de Alemania/Nueva York, Estados Unidos de América; Walker & Rapley (1993) Molecular and Antibody Probes in Diagnosis . Wiley, Chichester, Nueva York; Wyckoff et al. (1985) Diffraction Methods for Biological Macromolecules . Academic Press, Orlando, Florida, Estados Unidos de América; y referencias allí citadas. En otra modalidad de la invención, un modulador que muestra unión especifica a un polipéptido T2R76 se usa para detectar un polipéptido T2R76. Análogo a la detección de un polipéptido T2R76 que usa un anticuerpo, el método comprende: (a) obtener una muestra biológica que comprende material peptidico; (b) poner en contacto la muestra biológica con un modulador de un polipéptido T2R76, en donde el modulador comprende un marcador detectable; y (c) detectar el marcador detectable, mediante el cual se detecta un polipéptido T2R76 en una muestra. Se puede usar cualquier marcador detectable adecuado, por ejemplo un marcador de fluoróforo o epitope.

I . Aplicaciones La presente invención provee métodos para la identificación de moduladores de un polipéptido T2R76. Los moduladores de la invención son útiles para alterar la percepción del sabor amargo, por ejemplo para suprimir o mejorar la percepción del sabor amargo.

IX.A. Sujetos El término "sujeto", tal como se usa en la presente, incluye cualquier especie de vertebrado, preferentemente vertebrados de sangre caliente, como mamíferos y pájaros. Más particularmente, los métodos de la presente invención se contemplan para el tratamiento de tumores en mamíferos, tales como seres humanos, como así también aquellos mamíferos de importancia debido a que están en riesgo de extinción (como los tigres siberianos), de importancia económica (animales criados en granjas para el consumo por parte de seres humanos) y/o importancia social (animales como mascotas o de zoológicos) para los seres humanos, por ejemplo, carnívoros que no sean humanos (como perros y gatos) , cerdos (puercos y jabalíes) , rumiantes y ganado (como ganado vacuno, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes y camellos) y caballos. También se contempla el tratamiento de pájaros, incluyendo aquellas clases de pájaros que están en peligro de extinción o en zoológicos, como así también aves de corral, y más particularmente aves y aves de corral domesticadas, como pavos, pollos, patos, gansos, gallinas de Guinea y similares, ya que son también de importancia económica para seres humanos.

IX. B. Composiciones De acuerdo con los métodos de la presente invención, una composición que se administra para alterar la percepción de sabor en un sujeto comprende una cantidad eficaz de un modulador de T2R76. Un modulador de T2R76 puede comprender cualquiera de los tipos de sustancias de prueba previamente descritos. Los moduladores de T2R76 identificados que se revelan en la presente pueden usarse para preparar una composición para uso oral incluyendo, aunque sin limitarse a ello, alimentos, bebidas, enjuagues orales, dentífricos, productos cosméticos y productos farmacéuticos, por ejemplo, cualquier de aquellos compuestos mencionados a continuación. Los moduladores de T2R76 también se pueden usar como aditivos para alterar el sabor de un compuesto de posible pero inconveniente uso oral, por ejemplo limpiadores para el hogar, veneno, etc. Los alimentos representativos que tienen un sabor indeseable o amargo incluyen, aunque sin limitarse a ello, frutos cítricos tales como pomelo, naranja y limón; verduras tales como tomate, pimientos, apio, melón, zanahoria, papa y espárrago; materiales para condimento o saborizantes tales como aderezo, salsas, salsa de soja y pimiento rojo; alimentos derivados de porotos de soja; alimentos en emulsión tales como crema, aderezo, mayonesa y margarina; productos marinos procesados tales como carne de pescado, carne de pescado molida y huevos de pescado; nueces tales como cacahuete; alimentos fermentados tales como porotos de soja fermentados; carnes y carnes procesadas; pepinillos; fideos; sopas, incluyendo sopas en polvo; productos lácteos tales como queso; panes y pasteles; confituras tales como caramelos, goma de mascar y chocolate; y alimentos preparados específicamente para la salud . Los productos cosméticos representativos que producen sabor amargo (p. ej . , lociones para la piel, crema, paquetes faciales, lápices labiales, bases de maquillaje, preparaciones para afeitar, lociones para después de afeitar, espumas de limpieza y geles de limpieza) incluyen, aunque sin limitarse a ello, aquellas composiciones que incluyen tensoactivos tales como alquilsulfato de sodio y monoalquilfosfato de sodio; fragancias tales como mentol, linalol, alcohol de feniletilo, etilpropionato, geraniol, linalilacetato y bencilacetato; antimicrobianos tales como metilparabeno, propilparabeno y butilparabeno; humectantes tales como ácido láctico y lactato de sodio; agentes desnaturalizantes de alcohol tales como octaacetato de sacarosa y brucina; y astringentes tales como lactato de aluminio. Los productos farmacéuticos que tienen un sabor amargo incluyen acetaminofeno, terfenadina, guaifenesina, trimetoprim, prednisolona, ibuprofeno, fosfato de sodio de prednisolona, metacolina, neostigmina, epinefrina, albuterol, clorhidrato de seudoefedrina, difenidramina, maleato de clorofeniramina, fenotiazina, cloropromazina, iazepóxido, amitriptilina, barbituratos, difenilhidantoína, cafeína, morfina, demerol, codeina, lomotilo, lidocaína, ácido salicílico, sulfonamidas, cloroquina, una preparación de vitaminas, minerales y penicilinas. Los moduladores también se pueden administrar como parte de alimentos preparados, bebidas, enjuagues orales, dentífrico, cosméticos o fármacos. Para preparar una composición para administración a un sujeto, un modulador de T2R76 se puede mezclar con un compuesto cuyo sabor se vaya a modular en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0.001 % y aproximadamente 10% en peso, preferentemente entre aproximadamente 0.01% y aproximadamente 8% en peso, más preferentemente entre aproximadamente 0.1 % y aproximadamente 5% en peso, y más preferentemente entre aproximadamente 0.5% y aproximadamente 2% en peso. Las formulaciones adecuadas incluyen soluciones, extractos, elixires, bebidas alcohólicas, jarabes, suspensiones, polvos, gránulos, cápsulas, pildoras, comprimidos y aerosoles. Opcionalmente, una formulación puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable, un agente de suspensión, un solubilizante, un agente espesante, un estabilizador, un conservante, un sabor, un colorante, un edulcorante, un perfume o una combinación de éstos. Las composiciones y los moduladores de T2R76 se pueden presentar en dosis unitarias o dosis múltiples, o en envases sellados de dosis múltiples, como ampollas y viales .

IX. C . Adminis ración Los moduladores de T2R76 se pueden administrar directamente a un sujeto para modulación de la percepción de sabor. Preferentemente, un modulador de la invención se administra oral o nasalmente. De acuerdo con los métodos de la presente invención, se administra una cantidad eficaz de modulador de T2R76 a un sujeto. El término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una composición suficiente para modular la activación de T2R76 y/o para modular la percepción del sabor amargo. Una cantidad eficaz se puede variar como para administrar una cantidad de un modulador de T2R76 que sea eficaz para lograr la percepción del sabor deseada. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del modulador de T2R76, la formulación, la combinación con otras composiciones (p. ej . , alimentos, fármacos, etc.), el uso que se tenga como fin (p. e . , como aditivo para alimentos, dentífrico, etc.) y la condición física y la historia clínica del sujeto que esté siendo tratado. Una cantidad o dosis eficaz se puede determinar fácilmente, usando ensayos in vivo de percepción de sabor, tal como se conoce en la técnica. Los métodos representativos para ensayar la percepción de sabor se describen en el Ejemplo 4.

Ejemplos Los siguientes Ejemplos se han incluido para ilustrar modos de la invención. Ciertos aspectos de los siguientes Ejemplos se describen en términos de técnicas y procedimientos descubiertos o contemplados por los coinventores de la presente invención para funcionar bien en la práctica de la invención. Estos Ejemplos ilustran las prácticas de laboratorio estándar de los co-inventores . En vista de la presente revelación y el nivel general de experiencia en la técnica, aquellos experimentados apreciarán que los siguientes Ejemplos tienen como fin ser únicamente ilustrativos y que se pueden emplear numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin desviarse del alcance de la invención. Ejemplo 1. Clonación de T2R76 humano. Se identificó un nuevo gen que codifica un receptor del sabor amargo humano, en las bases de datos de la secuencia del genoma humano. El nuevo miembro de hT2R, hT2R76, se ubica en el cromosoma humano 7. La ubicación cromosómica de la secuencia de ADN de T2R76 se determinó estudiando el sitio web Genomics de la Universidad de California (Santa Cruz, California) . Este análisis demostró que el T2R76 se ubica en el cromosoma 7, en la región 144062692-144063648. El sabor amargo de determinados compuestos, como feniltiocarbamato, ha sido asociado genéticamente a los cromosomas 5 y 7. (Guo et al, (2001) Ann Hum Biol 28:111-42). Por lo tanto, se predice que el T2R76 está implicado en la unión y el reconocimiento de determinados sabores amargos. El T2R76 humano se identificó inicialmente por búsqueda de secuencia reiterada de base de datos de secuencias de ADN con secuencias de hT2R previamente descritas. Un marco de lectura abierto de longitud total que codifica el hT2R76 se aisló luego por ampliación PCR del ADN genómico. La secuencia de aminoácidos de hT2R76 fue derivada por traducción conceptual del marco de lectura abierto correspondiente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos hT2R76 se exponen como SEQ ID NO:l y SEQ ID NO: 2, respectivamente. El marco de lectura abierto sin intrones de hT2R76 codifica una proteina del receptor putativo de 318 aminoácidos de longitud. Una comparación de la secuencia de proteina hT2R76 con todas las proteínas conocidas en las bases de datos de secuencias públicas , usando el algoritmo BLASTP, reveló su fuerte homología a los miembros de la familia del receptor amargo de mamíferos . Ejemplo 2. Construcción de rhod-hT2R76 Se utilizó una técnica de extensión por PCR de traslape de puente para generar quimeras rhod-hT2R76, que contienen los primeros 38 aminoácidos de rodopsina bovina en marcos con secuencias codificadoras de T2R76 humano, tal como se describe en Chandrashekar et al, (2000) Cell 100:703-711. El gen quimérico rhod-hT2R76 se clonó luego en el vector pFastBac-1 vector, y se produjeron baculovirus que contenían hT2R76 marcado con rodopsina, usando el sistema Bac-to-Bac (Invitrogen Corporation de Carlsbad, California, Estados Unidos de América) . La expresión de hT2R76 se confirmó por inmunotransferencia, usando anticuerpos de con marca anti-rodopsina (136-30) . Las células Sf9 infectadas con baculovirus que codifica hT2R76, produjeron una proteína del peso molecular esperado (-35 kDa) . Ejemplo 3. Acoplamiento de proteína G in Vítro de T2R76. Se prepara un rhod-hT2R76 que codifica bácmido infeccioso, tal como se describe en el Ejemplo 2. Se infectan células larvales de insectos durante 60 horas con bácmido recombinante y las membranas se preparan como lo describen Ryba & Trindelli (1995) J Biol Chem 270:6757-6767. Se eliminan las proteínas periféricas por tratamiento con urea 5M y se vuelven a suspender las membranas en 1 OmM HEPES pH 7.5, EDTA 1 inM E y DTT 1 m . La expresión de rhod-hT2R76 se puede determinar por transferencia Western, usando el anticuerpo monoclonal B6-30. Se aislan proteínas G, por ejemplo, tal como lo describen Hoon et al, (1995) Cell 96 629-636 y Ryba & Trindelli (1995) J Biol Chem 270 : 6757-6767. Se mide el intercambio catalizado por el receptor de GDP para GTPyS en gustducina en presencia de rhod-hT2R76 ????, GDP 100 t y GfilyQ 20µ?. El intercambio de GDP-GTpyS en proteínas G promiscuas (p. ej . , G 5 o transducina) se lleva a cabo tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense de serie No. 60/372089. Las mediciones efectuadas en puntos de tiempo de aproximadamente 15-60 minutos reflejan la proporción inicial de unión de GTpyS.

Ejemplo 4. Estudio de sabor Se efectúa un estudio de aceptación de sabor, usando una composición que comprende un modulador de T2R76, identificado tal como se revela en la presente. También se utiliza una composición de control que carece del modulador de T2R76, pero que es sustancialmente similar o idéntica a la composición de prueba. El estudio emplea un diseño cruzado en dos direcciones, en el que todos los sujetos evalúan ambas composiciones, las cuales se administran en una o más de las mismas cantidades o dosis. Las composiciones de prueba y control se evalúan en un único dia de estudio. La secuencia para administrar las composiciones de prueba y control se aleatoriza entre los suj etos . Todos los sujetos inscritos completan todos los aspectos del protocolo del estudio. Los sujetos responden a cada composición de prueba y control, usando calificaciones ordinales para el sabor (p. ej . , l=muy amargo, 2=amargo, 3=indistinto, 4=no tan amargo, 5=no amargo en absoluto) . Se registran los eventos adversos. La eficacia de un modulador de T2R76 se determina midiendo una diferencia significativa en palatabilidad de la composición de prueba, en comparación con la composición de control. Ejemplo 5. Respuesta de hT2R76 a los compuestos amargos Se efectúa un ensayo de unión de GTPyS , usando una línea celular de mamífero (HEK293) que expresa hT2R76, como así también una línea celular de control que expresa un hT2R diferente (hT2R64) . Estas líneas celulares se ponen en contacto con los compuestos amargos que incluyen 6-n-propiltiouracilo (PROP) , octaacetato de sacarosa, rafinosa undacaacetato, (RUA) , glicinato de cobre, denatonio y quinina en diferentes concentraciones en el intervalo de 0.5 a 2mm. Los resultados de este ensayo se utilizan para confirmar que hT2R76 es un receptor del sabor amargo que se activa específicamente mediante estímulos conocidos del sabor amargo. En este ensayo de unión de GTPyS, la actividad se determina ya sea en presencia o en ausencia de concentraciones específicas de compuestos amargos conocidos . Ejemplo 6. Ensayo de detección de gran rendimiento Usando el ensayo de unión de GTPyS, se detecta una biblioteca de más de 15,000 compuestos para identificar otros compuestos que activan específicamente el hT2R76. La estructura de los compuestos específicos que activan el hT276 en este ensayo, se compara en orden para predecir compuestos que tienen estructura similar que potencialmente activarán el hT2R76. Las bibliotecas de compuestos que tienen estructuras similares se evalúan luego en diferentes concentraciones en el mismo ensayo de unión de GTPyS para identificar otros compuestos que activan el hT2R76. Ejemplo 7. Prueba de sabor en seres humanos Los compuestos que activan el hT2R76 en ensayos de unión de GTPyS se evalúan en pruebas del sabor en seres humanos. Estas pruebas de sabor en seres humanos humano se llevan a cabo en adultos que dan su consentimiento, a los que se les administra oralmente el compuesto identificado en la concentración en la cual activan el hT2R76 in vitro. En estas pruebas de sabor, un compuesto identificado (que activa el hT2R76) se disuelve en agua para lograr una concentración del compuesto que activa el hT2R76 en el ensayo de unión de GTPyS in vitro. En esta prueba de sabor, una muestra de por lo menos 5 personas prueba una serie de soluciones acuosas que contienen un compuesto amargo. (En el ejemplo preferido, el compuesto amargo es un agonista de T2R76) . Cada una de las personas califica el grado de amargor en una escala de magnitud marcada entre 0 y 100 (0 es "apenas detectable" y 100 es "el más fuerte imaginable"). Luego, cada persona prueba una serie de soluciones acuosas que contienen el compuesto amargo y el inhibidor de T2R76 y califica el grado de amargor para cada muestra. La eficacia del inhibidor de T2R76 se mide por la reducción en el grado de amargor. Como medio de comparación, un compuesto amargo conocido (sulfato de quinina) también es probado y evaluado por cada sujeto. Los resultados de las pruebas de sabor se representan como la calificación promedio en todos los suj etos . Ejemplo 8. Respuesta de hT2R76 a compuestos amargos conocidos Los resultados de este ensayo se utilizan para identificar compuestos amargos que activan el hT2R76. En base a eso, se pueden desarrollar ensayos que identifiquen compuestos que bloquean la activación de hT2R76 mediante dichos compuestos amargos.

CONCLUSIÓN Los resultados de estos ensayos proveerán una demostración de que el ensayo de unión de GTPyS se puede utilizar para identificar compuestos amargos y funciones de hT2R761 como receptor de sabor amargo humano. Los compuestos identificados se pueden utilizar para proveer amargor a alimentos y bebidas. Alternativamente, estos compuestos se pueden emplear como agonistas en ensayos para la identificación de bloqueadores y moduladores de amargor y otros compuestos amargos.

Referencias Las referencias mencionadas a continuación, como asi también las referencias citadas en la memoria, se incorporan a la presente por referencia al grado que complementan, explican, proveen un antecedente o describen una metodología, técnicas y/o composiciones empleadas en la presente . Adler E, Hoon MA, Mueller KL, Chandrashekar J, Ryba NJ, Zuker CS (2000) A novel family of mammalian taste receptors. Cell 100(6): 693-702. Altschul SF, Gish W, iller W, yers EW & Lipman DJ (1990) Basic Local Alignment Search Tool. J Mol Biol 215: 403-410. Ausubel F, ed (1995) Short Protocols in Molecular Biolog, 3rd ed. Wiley, Nueva York. Barton GJ (1998) Protein Sequence Alignment Techniques . Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54:1139-1146. Bateman A, Birney E, Durbin R, Eddy SR, Howe KL & Sonnhammer EL (2000) The PFAM Protein Families Datábase. Nucleic Acids Res 28:263-266. Batzer MA, Carlton JE & Deininger PL (1991) Enhanced Evolutionary PCR Using Oligonucleotides with Inosine at the 3'- Terminus . Nucleic Acids Res 19:5081. Berridge & Irvine (1984) Inositol trisphosphate, a novel second messenger in cellular signal transduction . Nature 312:315-321. Bodanszky M (1993) Principies of Peptide Synthesis, 2nd rev. ed. Springer-Verlag, Berlín / Nueva York. Bourne HR, Sanders DA & McCormick F (1990) The GTPase superfamil : a conserved switch for diverse cell functions. Nature 348:125-132.

Bourne HR, Sanders DA & cCormick F (1991) Nature The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism. 349:117-127. Brookes AJ (1999) The Essence of SNPs. Gene 234:177-186. Burge C & Karlin S (1997) Prediction of Complete Gene Structures in Human Genomic DNA. J Mol Biol 268:78-94. Burge CB & Karlin S (1998) Finding the Genes in Genomic DNA. Curr Opin Struct Biol 8:346-354. Capecchi MR (1989a) Altering the Genome by Homologous Recombination. Science 244:1288-1292. Capecchi MR (1989b) Altering the Genome by Homologous Recombination. Science 244:1288-1292. Chan D (1996) Immunoassay Automation: An üpdated Guide to Systems . Academic Press, San Diego, California, Estados Unidos de América. Chandrashekar J, Mueller KL, Hoon MA, Adler E, Feng L, Guo W, Zuker CS, Ryba NJ (2000) T2Rs function as bitter taste receptors. Cell 100 (6) : 703-711. Chiang LW (1998) Detection of Gene Expression in Single Neurons by Patch-Clamp and Single-Cell Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction. J Chromatogr A 806:209-218. Conner BJ, Reyes AA, Morin C, Itakura K, Teplitz RL & Wallace RB (1983) Detection of Sickle Cell Beta S-Globin Alíele by Hybridization with Synthetic Oligonucleotides. Proc Nati Acad Sci, EE. UU. 80:278-282. Costanzi E, Beccari T, Stinchi S, Bibi L, Hop ood JJ & Orlacchio A (2000) Gene Encoding t e Mouse Sulphamidase : cDNA Cloning, Structure, and Chromosomal Mapping. Mamm Genome 11:436-439. Delsenhofer J, Epp 0. Miki K, Huber R & Michel H (1984) X-Ray Structure Analysis of a Membrane Protein Complex. Electron Density Map at 3 a Resolution and a Model of the Chromophores of the Photosynthetic Reaction Center from Rhodopseudomonas Viridis. J Mol Biol 180:385-398. Felley-Bosco E, Ambs S, Lowenstein CJr Keefer LK & Harris CC (1994) Constitutive expression of inducible nitric oxide synthase in human bronchial epithelial cells induces c-fos and stimulates the cGMP pathway. Am J Resp Cell and Mol Biol 11:159-164. Fewell JG, MacLaughlin F, Mehta V, Gondo M, Nicol F, Wilson E & Smith LC (2001) Gene Therapy for the Treatment of Hemophilia B Using PINC Formulated Plasmid Delivered to Muscle with Electroporation. Mol Ther 3:574-583. Frank & Doring (1988) Simultaneous Múltiple Peptide Synthesis Under Continuous Flow Conditions On Cellulose Paper Discs As Segmental Solid Supports. Tetrahedron 44:60316040. Freshney RI (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2a ed. A.R. Liss, Nueva York. Geysen HM, Rodda SJ, Masón TJ, Tribbick G & Schoofs PG (1987) Strategies for epitope analysis using peptide synthesis. J Immun Meth 102:259-274. Glover DM & Hames BD (1995) DNA Cloning : A Practical Approach, 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford / Nueva York. Guo SW & Reed DR (2001) The genetics of phenylthiocarbamide perception. Ann Hum Biol 28:111-142. Harlow E & Lañe D (1988) Antibodies: A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, Estados Unidos de América. Henikoff JG, Pietrokovski S, McCallum CM & Henikoff S (2000) Blocks-Based Methods for Detecting Protein Homology. Electrophoresis 21:1700-1706.

Henikoff S & Henikoff JG (1992) Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks. Proc Natl Acad Sci, EE. UU. 89:10915-10919. Henikoff S & Henikoff JG (2000) Amino Acid Substitution Matrices. Adv Protein Chem 54:73-97. Homola J, Yee S & Gauglitz G (1999) Surface Plasmone Resonance Sensors: Review. Sensors and Actuators B 54:3-15. Hoon MA, Adler E, Lindemeier J, Battey JF, Ryba NJP & Zuker CS (1995) "Functional expression of the taste specific G protein, alpha-gustducin . " Cell 96629-636. Huang CC, Novak WR, Babbitt PC, Jewett Al, Ferrin TE & Klein TE (2000) Integrated Tools for Structural and Sequence Alignment and Analysis. Pac Symp Biocomput : 230-241. Hutchens & Yip (1993) New Desorption Strategies for the Mass Spectrometric Analysis of Macromolecules . Rapid Communications in Mass Spectroscopy 7:576-580. Ishikawa E (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassa. Elsevier, Amsterdam / Nueva York. Jayaraman S, Teitler L, Skalski B & Verkman AS (1999) Long-Wavelength Iodide-Sensitive Fluorescent Indicators for Measurement of Functional CFTR Expression in Cells. Am J Physiol 277 :C1 008-1018. Joyner AL (1993) Gene Targeting: A Practlcal Approac . Oxford University Press, Oxford / Nueva York. Karlin S & Altschul SF (1993) Applications and Statistics for Múltiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences. Proc Nati Acad Sci, USA 90:5873.5877. Kozal MJ, Shah N, Shen N, Yang R, Fucini R, Merigan TC, Richnian DD, Morris D, Hubbell E, Chee M & Gingeras TR (1996) Extensive polymorphisms observed in HIV-1 clade B protease gene using high-density oligonucleotide arrays. Nat Med 2 (7 ): 753-759. yte J & Doolittle RF (1982) A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein. J Mol Biol 157:105-132. Landegren U, Nilsson M & Kwok PY (1998) Reading Bits of Genetic Information: Methods for Single-Nucleotide Polymorphism Analysis. Genome Res 8:769-776. Law (1996) Immunoassay: A Practical Guide. Taylor & Francis, Londres/Bristol, Pennsylvania, Estados Unidos de América . Lindemann B. (2001) Receptors and transduction in taste. Nature 413 ( 6852 ): 219-225. Maalouf GJ, Xu W, Smith TF & Mohr SC (1998) Homology Model for the Ligand-Binding Domain of t e Human Estrogen Receptor. J Biomol Struct Dyn 15:841-851. Mak P, McDonnell DP, Weigel NL, Schrader WT & O'Malley BW (1989) Expression of Functional Chicken Oviduct Progesterone Receptors in Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) . J Biol Chem 264:21613-21618. anson MM (1992) I munochemical Protocols. Humana Press, Totowa, New Jersey, Estados Unidos de América asseyeff RF, Albert WHW & Staines N (1993) Methods of Immunological Analysis. VCH Verlagsgesellschaft; VCH Publishers, Weinheim (República Federal de Alemania) / Nueva York, Nueva York (Estados Unidos de América) . Matsunami H, ontmpyeur JP, Buck LB (2000) A family of candidate taste receptors in human and mouse. Nature 404 ( 6778 ): 601-604. Merrifield (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154. Mistili & Spector (1997) Nat Biotech 15:961-964. Needleman SB & Wunsch CD (1970) A General Method Applicable to the Search for Similarities in the Amino Acid Sequence of Two Proteins. J Mol Biol 48:443453. Nickerson DA, Kaiser R, Lappin S, Stewart J, Hood L & Landegren Ü (1990) Automated DNA Diagnostics Using an ELISA-Based Oligonucleotide Ligation Assay. Proc Natl . Acad Sci, USA 87:8923-8927. Offermanns S & Simón MI (1995) G alpha 15 and G alp a 16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C. J Biol Chem 270:15175-15180. Ohtsuka E, Matsuki S, Ikehara M, Taka ashi Y & Matsubara K (1985) An Alternative Approach to Deoxyoligonucleotides as Hybridization Probes by Insertion of Deoxyinosine at Ambiguous Codon Positions. J Biol Chem 260:2605-2608. Orita Mr Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K & Sekiya T (1989) Detection of Polymorphisms of Human DNA by Gel Electrophoresis as Single-Strand Conformation Polymorphisms. Proc Natl Acad Sci, EE. UU. 86:2766-2770. Publicación internacional PCT No WO 99/26966 Publicación internacional PCT No WO 01/18050 Publicación internacional PCT No WO 01/77676 Pitcher A Freedman NJ & Lefkowitz RJ (1998) G protein-coupled receptor kinases. Annu Rev Biochem 67:653-92. Quandt K, Frech K, Karas H, Wíngender E & Werner T (1995) Matind and Matinspector: New Fast and Versatlle Tools for Detection of Consensus Matches in Nucleotide Sequence Data. Nucleic Acids Res 23:4878-4884. Roberts L (1991) GRAIL Seeks out Genes Buried in DNA Sequence. Science 254:805. Rossolini GM, Cresti S, Ingianni A, Cattani P, Riccio ML & Satta G (1994) Use of Deoxyinosine-Containing Primers Vs Degenerate Primers for Polymerase Chain Reaction Based on Ambiguous Sequence Information. Mol Cell Probes 8 : 91-98. Ryba NJP & Trindelli R (1995) "A novel GTP-binding protein gamma-subunit, G gamma 8, is expressed during neurogenesis in the olfactory and vorneronasal neuroepithelia. " J Biol Chem 270:6757-6767 Sambrook J, Sambrook EF & Maniatis F (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, Estados Unidos de América. Saqi MA, Wild DL & Hartshorn MJ (1999) Protein Analys —a Distributed Object Environment for Protein Sequence and Structure Analysis. Bioinformatics 15:521-522. Schneider CH & Eberle AN (1993) Peptides, 1992: Proceedings of the T enty-Second European Peptide Symposium, septiembre 13-19, 1992, Jnterlaken, Suiza. Escom, Leiden. Schroder E & Lübke K (1965) The Peptides. Academic Press, Nueva York. Silhavy TJ, Berman ML, Enquist LW & Cold Spring Harbor Laboratory. (1984) Experiments ith Gene Fusions: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, Estados Unidos de América. Smith TF & aterman M (1981) Comparison of Biosequences . Adv Appl Math 2:482-489. Stoneking M, Hedgecock D, Higuchi RG, Vigilant L & Erlich HA (1991) Population Variation of Human mtDNA Control Región Sequences. Detected by Enzymatic Amplification and Sequence-Specific Oligonucleotide Probes. Am J Hum Genet 48:370-382. Taylor G, Vimr E, Garman E & Laver G (1992) Purification, Crystallization and Preliminary Crystallographic Study of Neuraminidase from Vibrio Cholerae and Salrnonella Typhimurfum Lt2. J Mol Biol 226:1287-1290. Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acld Probes. Elsevier, Nueva York. Patente estadounidense No 4,115,538 Patente estadounidense No 4,196,265 Patente estadounidense No 4,455,842 Patente estadounidense No 4,554,101 Patente estadounidense No 4,736,866 Patente estadounidense No 4,946,778 Patente estadounidense No 5,091,513 Patente estadounidense No 5,132,405 Patente estadounidense No 5,162,215 Patente estadounidense No 5,223,409 Patente estadounidense No 5,260,203 Patente estadounidense No 5,264,563 Patente estadounidense No 5,436,128 Patente estadounidense No 5,489,742 Patente estadounidense No 5,498,538 Patente estadounidense No 5,550,316 Patente estadounidense No 5,573,933 Patente estadounidense No 5,629,145 Patente estadounidense No 5,614,396 Patente estadounidense No 5,625,125 Patente estadounidense No 5,648,061 Patente estadounidense No 5,650,489 Patente estadounidense No 5,667,988 Patente estadounidense No 5,677,427 Patente estadounidense No 5,702,892 Patente estadounidense No 5,741,957 Patente estadounidense No 5,738,996 Patente estadounidense No 5,747,334 Patente estadounidense No 5,756,291 Patente estadounidense No 5,776,859 Patente estadounidense No 5,780,225 Patente estadounidense No 5,780,242 Patente estadounidense No 5,824,483 Patente estadounidense No 5,834,228 Patente estadounidense No 5,840,479 Patente estadounidense No 5,858,670 Patente estadounidense No 5,872,011 Patente estadounidense No 5,892,019 Patente estadounidense No 5,922,254 Patente estadounidense No 5,948,635 Patente estadounidense No 6, 004, 808 Patente estadounidense No 6, 057, 098 Patente estadounidense No 6, 107, 059 Patente estadounidense No 6, 140, 123 Patente estadounidense No 6,156,511 Patente estadounidense No 6, 168, 912 Patente estadounidense No 6, 174, 708 Patente estadounidense No 6, 176,089 Patente estadounidense No 6, 180, 348 Patente estadounidense No 6, 190, 700 Patente estadounidense No 6, 214,553 Patente estadounidense No 6, 255, 059 Patente estadounidense No 6, 403,305 Walker MR & Rapley R (1993) Molecular and Antibody Probes in Diagnosis, iley, Chichester I Nueva York. Wang DG, Fan JB, Siao CJ, Berno A, Young P, Sapolsky R, Ghandour G, Perkins N, Winchester E, Spencer J, Kruglyak L, Stein , Hsie L, Topaloglou T, Hubbell E, Robinson E, Mittmann M, Morris MS, Shen N, Kilburn D, Rioux J, Nusbaum C, Rozen S, Hudson TJ, Lander ES & et al. (1998) Large-Scale Identification, Mapping, and Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms in the Human Genome . Science 280:1077-1082. Weiss MS, Wacker T, Weckesser J, Welte W & Schulz GE (1990) The Three-Dimensional Structure of Porin from Rhodobacter Capsulatus at 3 a Resolution. FEBS Lett 267:268-272. Wilkie TM, Scherle PA, Strathmann MP, Slepak VZ & Simón MI (1991) Characterization of G-protein alpha subunits in the Gq class: expression in murine tissues and in stromal and hematopoietic cell lines. Proc Natl Acad Sci, EE. UU. 88:10049-10053. Wong GT, Gannon KS, Margolskee RF (1996) Transduction of bitter and sweet taste by gustducin. Nature 381 (6585) : 796-800. Worrall TA, Cotter RJ & Woods AS (1998) Purification of Contaminated Peptides and Proteins on Synthetic Membrane Surfaces for Matrix-Assisted Láser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem 70:750-756. yckoff HW, Hirs CHW & Timasheff SN (1985) Diffraction Methods for Biological Macromolecules. Academic Press, Orlando, Florida, Estados Unidos de América.

Yuan B, Thomas JP, von Kodolitsch Y & Pyeritz RE (1999) Comparison of Heteroduplex Analysis, Direct Sequencing, and Enzyme Mismatch Cleavage for Detecting Mutations in a Large Gene, FBN1. Hum Mutat 14:440-446. Se ha de entender que los distintos detalles de la invención se pueden cambiar sin desviarse del alcance de la invención. Además, la descripción anterior tiene propósitos ilustrativos únicamente, y no limitativos y la invención se define mediante las reivindicaciones anexas a la presente.

Claims (67)

REIVINDICACIONES :

1. Una molécula de ácido nucleico T2R76 aislado, que comprende: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID N0:1; o (c) una molécula de ácido nucleico aislado sustancialmente similar a SEQ ID NO:l.

2. La molécula de ácido nucleico T2R76 aislado según la reivindicación 1, seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID N0:1; (c) una molécula de ácido nucleico aislado que se híbrida a una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 bajo condiciones de lavado rigurosas representadas por una solución de lavado que tiene menos de aproximadamente 200 mM de concentración de sal y una temperatura de lavado superior a aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislado que difiere en por lo menos un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislado de uno de (a) , (b) y (c) anteriores en secuencia de ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a), (b) y (c) anteriores.

3. La molécula de ácido nucleico T2R76 aislado según la reivindicación 1, que comprende: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; o (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID N0:1.

4. ün método para detectar una molécula de ácido nucleico T2R76 aislado, en donde el método comprende: (a) procurar una muestra biológica que tiene material de ácido nucleico; (b) hibridar una molécula de ácido nucleico T2R76 aislado bajo condiciones de hibridación rigurosas a la muestra biológica de (a) , formando asi una estructura dúplex entre el ácido nucleico T2R76 aislado y un ácido nucleico dentro de la muestra biológica; y (c) detectar la estructura dúplex de (b) , mediante la cual se detecta una molécula de ácido nucleico T2R76 en la muestra biológica.

5. ün polipéptido T2R76 aislado que comprende: (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustancialmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID N0:1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico sustancialmente idéntica a SEQ ID N0:1.

6. El polipéptido T2R76 aislado según la reivindicación 5, que además comprende un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID NO: 1; (c) una molécula de ácido nucleico aislado que se híbrida a una secuencia de ácido nucleico T2R76 bajo condiciones de lavado rigurosas representadas por una solución de lavado que tiene menos de aproximadamente 200 M de concentración de sal y una temperatura de lavado superior a aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislado que difiere en al menos un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislado de uno de (a) , (b) y (c) anteriores en secuencia de ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a), (b) y (c) anteriores.

7. El polipéptido T2R76 aislado según la reivindicación 5, que comprende SEQ ID NO: 2.

8. Un polipéptido T2R aislado según la reivindicación 5, que está asociado con al menos otro polipéptido T2R.

9. EL polipéptido T2R aislado según la reivindicación 8, en donde dicho otro polipéptido T2R es otro T2R humano.

10. El polipéptido T2R aislado según la reivindicación 9, en donde dicho otro T2R humano se selecciona entre el grupo que consiste en T2R51, T2R54, T2R55, T2461, T2R63, T2R64, T2R65, T2R67, T2R71, T2R75, T2R59 y T2R33 humanos.

11. Un método para producir un anticuerpo que reconoce específicamente el ácido nucleico T2R76 aislado de uno de (a), (b) y (c) anteriores.

12. El método según la reivindicación 10, en donde el polipéptido T2R76 aislado comprende SEQ ID NO: 2.

13. El método según la reivindicación 8, que además comprende preparar un anticuerpo monoclonal.

14. Un anticuerpo producido por el método de la reivindicación 11.

15. Un método para detectar un nivel de un polipéptido T2R76, en donde el método comprende (a) obtener una muestra biológica que tiene material peptidico; (b) detectar un polipéptido T2R76 en la muestra biológica de (a) por reacción inmunoquimica con el anticuerpo de la reivindicación 14, mediante la cual se determina una cantidad de polipéptido T2R76 en una muestra.

16. Un sistema para expresión heteróloga de un polipéptido T2R76, que comprende: (a) un polipéptido T2R76; y (b) una célula huésped heterologa que expresa el polipéptido T2R76.

17. El sistema según la reivindicación 16, en el que el polipéptido T2R76 comprende: (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustancialmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID N0:1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico sustancialmente idéntica a SEQ ID N0:1.

18. El sistema según la reivindicación 17, en el que el polipéptido T2R76 comprende además un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID NO:l; (c) una molécula de ácido nucleico aislado que se híbrida a una secuencia de ácido nucleico T2R76 bajo condiciones de lavado rigurosas representadas por una solución de lavado que tiene menos de aproximadamente 200 mM de concentración de sal y una temperatura de lavado superior a aproximadamente 45 °C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislado que difiere en al menos un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislado de uno de (a) , (b) y (c) anteriores en secuencia de ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético, y en donde el gen codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a), (b) y (c) anteriores.

19. El sistema según la reivindicación 18, en donde el polipéptido T2R76 aislado comprende SEQ ID NO: 2.

20. El sistema según la reivindicación 18, que además comprende un ácido nucleico que codifica otro T2R.

21. El sistema según la reivindicación 16, en donde la célula huésped comprende una célula mamífera.

22. El sistema según la reivindicación 21, en donde la célula mamífera comprende una célula humana.

23. El sistema según la reivindicación 16, en donde la célula huésped comprende además una subunidad alfa de proteina G capaz de acoplarse a un polipéptido T2R76.

24. El sistema según la reivindicación 23, en donde la subunidad alfa de proteína G comprende una proteína G promiscua.

25. El sistema según la reivindicación 24, en donde la proteína G promiscua comprende Go¡15.

26. El sistema según la reivindicación 24, en donde la proteína G promiscua comprende una transducina o gustducina.

27. Un método para identificar un modulador del polipéptido T2R76, en donde el método comprende: (a) proveer un sistema de expresión recombinante, mediante el cual se expresa un polipéptido T2R76 en una célula huésped heteróloga sola o en combinación con al menos un otro polipéptido T2R, (b) proveer una sustancia de prueba al sistema de (a) ; (c) ensayar un nivel o calidad de la función de T2R76 en presencia de la sustancia de prueba; (d) comparar el nivel o calidad de la función T2R76 en presencia de la sustancia de prueba con un nivel o calidad de control de la función de T2R76; y (e) identificar una sustancia de prueba como un modulador de T2R76, determinando un nivel o calidad de la función T2R76 en presencia de la sustancia de prueba como significativamente cambiado al compararse con un nivel o calidad de control de la función de T2R76.

28. El método según la reivindicación 27, en donde el polipéptido T2R76 comprende: (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustancialmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID N0:1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico sustancialmente idéntica a SEQ ID N0:1.

29. El método según la reivindicación 28, en donde el polipéptido T2R76 comprende además un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID N0:1; (c) una molécula de ácido nucleico aislado que se híbrida a una secuencia de ácido nucleico T2R76 bajo condiciones de lavado rigurosas representadas por una solución de lavado que tiene menos de aproximadamente 200 mM de concentración de sal y una temperatura de lavado superior a aproximadamente 45 °C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislado que difiere en por lo menos un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislado de uno de (a) , (b) y (c) anteriores en secuencia de ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a), (b) y (c) anteriores.

30. El método según la reivindicación 29, en donde el polipéptido T2R76 aislado comprende SEQ ID NO: 2.

31. El método según la reivindicación 27, en donde la célula huésped comprende una célula mamífera.

32. El método según la reivindicación 31, en donde la célula mamífera comprende una célula humana.

33. El método según la reivindicación 27, en donde la célula huésped comprende además una subunidad alfa de proteina G capaz de acoplarse a un polipéptido T2R76.

34. El método según la reivindicación 33, en donde la subunidad alfa de proteina G comprende una proteina G promiscua.

35. El método según la reivindicación 34, en donde la proteina G promiscua comprende Gal5.

36. El método según la reivindicación 34, en donde la proteina G promiscua comprende transducina.

37. El método según la reivindicación 27, en donde ensayar comprende determinar una cantidad de unión de GTPyS .

38. Un modulador de T2R76 identificado por el método de la reivindicación 27.

39. El modulador de T2R76 según la reivindicación 38, que además comprende un modulador seleccionado entre el grupo que consiste en una proteina, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico y una molécula pequeña .

40. Un método para modular la percepción del sabor amargo en un sujeto, en donde el método comprende: (a) preparar una composición que comprende un modulador según la reivindicación 38; (b) administrar una dosis eficaz de la composición a un sujeto, mediante la cual se altera la percepción del sabor amargo en un sujeto.

41. El método según la reivindicación 40, en donde la composición comprende además un alimento, una bebida, un enjuague oral, un dentífrico, un cosmético o un producto farmacéutico.

42. El método según la reivindicación 40, que además comprende administrar conjuntamente la composición que comprende un modulador y una composición seleccionada entre el grupo que consiste en un alimento, una bebida, un enjuague oral, un dentífrico, un cosmético y un producto farmacéutico .

43. El método según la reivindicación 40, en donde el sujeto es un mamífero.

44. El método según la reivindicación 43, en donde el mamífero es un ser humano.

45. ün método para identificar un modulador de un polipéptido T2R76, en donde el método comprende: (a) exponer un polipéptido T2R76 solo, o un polipéptido T2R76 expresado en asociación con al menos otro polipéptido T2R, a una o más sustancias de prueba; (b) ensayar la unión de una sustancia de prueba al polipéptido T2R76 aislado o a una combinación del polipéptido T2R76; y (c) seleccionar una sustancia candidata que demuestre unión especifica al polipéptido T2R76.

46. El método según la reivindicación 45, en donde el polipéptido T2R76 comprende: (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustancialmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID N0:1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico sustancialmente idéntica a SEQ ID N0:1.

47. El método según la reivindicación 46, en donde el polipéptido T2R76 comprende además un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislado de SEQ ID N0:1; (c) una molécula de ácido nucleico aislado que se híbrida a una secuencia de ácido nucleico T2R76 bajo condiciones de lavado rigurosas representadas por una solución de lavado que tiene menos de aproximadamente 200 mM de concentración de sal y una temperatura de lavado superior a aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislado que difiere en por lo menos un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislado de uno de (a) , (b) y (c) anteriores en secuencia de ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a), (b) y (c) anteriores.

48. El método según la reivindicación 47, en donde el polipéptido T2R76 aislado comprende SEQ ID NO: 2.

49. Un modulador de T2R76 identificado por el método según la reivindicación 48.

50. El modulador de T2R76 según la reivindicación 49, que además comprende un modulador seleccionado entre el grupo que consiste en una proteína, un péptido, una anticuerpo, un ácido nucleico y una molécula pequeña.

51. Un método para modular la percepción del sabor amargo en un sujeto, en donde el método comprende: (a) preparar una composición que comprende un modulador según la reivindicación 49; (b) administrar una dosis eficaz de la composición a un sujeto, mediante la cual se altera la percepción del sabor amargo en un sujeto.

52. El método según la reivindicación 51, en donde la composición comprende también un alimento, una bebida, un enjuague oral, un dentífrico, un cosmético o un producto farmacéutico.

53. El método según la reivindicación 51, que además comprende administrar conjuntamente la composición que comprende un modulador y una composición seleccionada entre el grupo que consiste en un alimento, una bebida, un enjuague oral, un dentífrico, un cosmético y un producto farmacéutico .

54. El método según la reivindicación 51, en donde el modulador de T2R76 se selecciona entre el grupo que consiste en una proteína, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico y una molécula pequeña.

55. El método según la reivindicación 51, en donde el sujeto es un mamífero.

56. El método según la reivindicación 55, en donde el mamífero es un ser humano.

57. Un método para reducir la percepción del sabor amargo de un compuesto amargo, en donde el método comprende administrar conjuntamente un inhibidor de T2R76 y el compuesto amargo a un sujeto.

58. El método según la reivindicación 57, en donde la administración conjunta comprende administrar una composición que comprende el inhibidor de T2R76 mezclado con el compuesto amargo.

59. El método según la reivindicación 57, en donde el inhibidor de T2R76 comprende además un modulador seleccionado entre el grupo que consiste en una proteína, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico y una molécula pequeña .

60. El método según la reivindicación 57, en donde el compuesto amargo comprende un alimento, una bebida, un enjuague oral, un dentífrico, un cosmético o un producto farmacéutico.

61. El método según la reivindicación 57, en donde el sujeto es un mamífero.

62. El método según la reivindicación 61, en donde el mamífero es un ser humano.

63. ün método para intensificar la percepción del sabor amargo de un compuesto, en donde el método comprende administrar con untamente un agonista de T2R76 y el compuesto a un sujeto.

64. El método según la reivindicación 63, en donde administrar conjuntamente comprende administrar una composición que comprende el agonista de T2R76 mezclado con el compuesto.

65. El método según la reivindicación 63, en donde el agonista de T2R76 también comprende un modulador seleccionado entre el grupo que consiste en una proteína, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico y una molécula pequeña .

66. El método según la reivindicación 63, en donde el sujeto es un mamífero.

67. El método según la reivindicación 66, en donde el mamífero es un ser humano.