OM. PH. PL. PT. RO. RU. SD. SE. SG. SI. SK. SL. TJ. TM. ?? ( BF. BJ. CK. CG. Cl. CM. GA. GN. GQ. CAY MI
TN. TR. TT, TZ. UA, UG, US, UZ. VC, VN. YU. ZA. ZM NE. SN. TD. TG). ZW. (84) gSH l'fcW.): ARIPO íf Vt (GH. GM. KE. LS. MZ. SD, SL. SZ. TZ. UG, ZM. ZW). a- 7 (AM. AZ. BY. K.G. KZ, MD. RU. TJ. TM). 3 — n ffit lAT. BE. BG. CH. C . CZ. DE. DK, EE. ES. FI. FR. GB. GR, IE. IT. LU. MC, NL, PT. SE. SK. TR). OAPI <t#
FARMACOS CONTRA INFLUENZA
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un agente contra la influenza. Más específicamente, la presente invención se refiere a un agente para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas causadas por el virus de la influenza . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus de la influenza es un patógeno infeccioso muy comúnmente encontrado y se puede convertir en una causa de prevalencia considerablemente alta y tasa de mortalidad, principalmente en ancianos, niños, personas que sufren de enfermedades crónicas y personas que sufren de enfermedades que causan inmunodeficiencia (Ref. 1, 2). Se han reportado tres tipos de virus de la influenza, los tipos A, B y C. A este respecto, se sabe que el virus de la influenza tipo A prevalece ampliamente y muestra una fuerte patogenicidad, mientras que los virus de la influenza tipo B y C son más bien regionales o tienen prevalencia local y muestran una débil patogenicidad. Sin embargo, se puede reconocer que existe un mecanismo de infección común en las infecciones causadas por estos tres tipos de la influenza. Ref. 1: Kim HW, Brandt CD, Arrobio JO, Murphy B, REF: 156785 - 2 -
Chanock RM, Parrott RH, Influenza A y B virus infection in infants and young children during the years 1957-1976, Am. J. epidemiol., 1979, 109: 464-479. Ref . 2: Barker WH, Mullooly JP, Impact of epidemic type A influenza in a defined adult population, Am. J. Epidemiol., 1980, 112: 798-813. La patogenicidad del virus de la influenza está determinada por el polimorfismo del genoma viral individual y las proteasas de tipo tripsina secretadas por las células huésped de las vías respiratorias, las cuales permiten que el genoma del virus invada el citoplasma de las células huésped. La proteasa tipo tripsina es secretada como resultado de la inducción de actividad de fusión de la membrana del virus de la influenza, a causa del rompimiento limitativo de las principales glucoproteinas de la envoltura viral [hemaglutinina (HA) ] y la correspondiente fusión de la membrana viral con la membrana citoplasmática (Ref. 3-5). Ref. 3: Klenk HD, Garten W, Host cell proteases controlling virus pathogenicity, Trends Microbiol . , 1980, 2: 39-43. Ref. 4: Klenk HD, Rott R, The molecular biology of influenza virus pathogenicity, Adv. Virus Res., 1988, 34: 247-281. Ref. 5: Homma M, Ohuchi , Trypsin action on the growth of Sendai virus in tissue culture cells, J. Virol . , - 3 -
1973, 12: 1457-1465. El rompimiento de la glucoproteína de envoltura viral se lleva a cabo en la membrana de las células epiteliales de las vías respiratorios y/o de la cavidad respiratoria (Ref . S, 7) . Ref . 6: Kido H, Yokogoshi Y, Sakai K, Tashiro M, Kishino Y, Fukutomi A, Kutunuma N, Isolation and characterization of a novel trypsin-like protease found in rat bronchiolar epithelial Clara cells, J. Biol . Chem. , 1992, 267: 13573-135-79. Ref. 7: Tashiro M, Yokoshi Y, Tobita K, Seto JT, Rott R, Kido H, Tryptase Clara, an activating protease for Sendai virus in rat lungs, is involved in pneumopathogenicity, J. Virol . , 1992, 66: 7211-7216. La actividad de la proteasa capaz de romper la glucoproteína de la envoltura viral, es estrictamente controlada por compuestos inhibidores endógenos que inhiben a • dicha proteasa, incluyendo los fluidos secretados en el tracto respiratorio tales como el inhibidor de proteasa mucosal (IPM Ref. 8) en las vías respiratorias superiores y el tensoactivo pulmonar (TP; Ref. 9) . La proteína tensoactiva A (SP-A) incluida en el TP pulmonar, pertenece a las lectinas tipo C, a la cual se agrega ácido siálico y esta proteína se une directamente a la HA del virus de la influenza para inhibir de esta manera cualquier invasión de - 4 - virus en las células (Ref. 10). Además de estos compuestos incluidos en los fluidos secretados en las vías respiratorias, el sistema inmunitario mucosal sirve como un sistema defensivo inmunológico principal para prevenir cualquier invasión de virus a las células y más específicamente la inducción de secreción local de inmunoglobulinas IgA e IgG está estrechamente relacionada a la protección contra infecciones causadas por el virus de la influenza (Ref. 11-13). Estos resultados sugerirían que las concentraciones de estas sustancias antivirales bioprotectoras en los fluidos secretados por las vías respiratorias,- determinan la susceptibilidad de los individuos a la infección por el virus de la influenza. Ref. 8: Beppu Y, Imamura Y, Tashiro M, To atari T, Ariga H, Kido H, Human Mucus protease inhibítor in airway fluids is a potencial defensive compound against infection with influenza A and Sendai viruses, J. Biochem. , 1997, 121: 309-316. Ref. 9: Kido H, Sakai K, Kishino Y, Tashiro M, A pulmonary surfactant is a potential endogenous inhibitor of proteolytc activation of Sendai virus and influenza virus, FEBS Lett., 1993, 322: 115-119. Ref. 10: Benne CA, Kraaijeveld CA, van Strijp JAG, Brouwer E, Harmsen M, Verhoef J, van Gold LMG, van Iwaarden JF, Interactions of surfactant protein A with influenza A - 5 - viruses : binding and neutralization, J. Infect . Dis., 1995, 171: 335-341. Ref. 11: Liew FY, Russell SM, Appleyard G, Brand CM, Beale J, Cross-protection in mice infected with influenza A virus by the respiratory route is correlated with local IgA rather than serum antibody or cytotoxic T cell reactivity, Eur. J. Immunol . , 1984, 14: 350-356. Ref. 12: Tamura S, Funato H, Hirabayash Y, et al., Functional role of respiratory tract hemagglutinin-specific IgA antibodies in protection against influenza, Vaccine, 1990, 8: 479-485. Ref. 13: Wright PF, Murphy BR, Kervina M, Lawrence EM( Phelan MA Karzon DT, Secretory immunological response after intranasal inactivated influenza A virus vaccinations : evidence for immunoglobulin A memory, Infect . Iramun. , 1983, 40: 1092-1095. El ambroxol (2-amino~3 , 5-dibromo-N- [trans-4-hidroxiciclohexil] -bencilamina) conocido como expectorante o agente de disolución de septos, se ha utilizado para el tratamiento de la bronquitis crónica y el síndrome de dificultad respiratoria del neonato (Ref. 14). Se ha reportado que el ambroxol tiene funciones farmacológicas tales como el control del moco en los adenocitos de las vías respiratorias y la promoción de la producción de TP (Ref. 15) .
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Además, el ambroxol también muestra una función antioxidante ( ef . 16) y una función antiinflamatoria asociada con la reducción de las citocinas inflamatorias liberadas por los macrófagos, monocitos y granulocitos alveolares bronquiales (Refs. 17, 18) . Sin embargo, todavía no se conoce ninguna función del ambroxol sobre las infecciones por el virus de la influenza in vivo. La bromhexina (2-amino-3 , 5-dibromo-N-ciclohexil-N-metilbencilamina) conocida como expectorante, se ha utilizado para el tratamiento de la bronquitis crónica. Sin embargo, todavía no se conoce ninguna función de la bromhexina sobre la infección por el virus de la influenza in vivo. Ref. 14: Gemouty J, Jirou-Najou J, Clinical efficacy of ambroxol in the treatment of bronchial stasis, Respiration, 1987, 51: 37-41. Ref. 15: Heath MF, Jacobson , The inhibition of lysosomal phospholipase A from rabbit lung by ambroxol and its consequences for pulmona y surfactant, Lung, 1985, 163: 337-44. Ref. 16: Gillissen A, Scharling B, Jaworska M,
Bertling A, Rasche K, Schultze-Werninghaus G, Oxidant scavenger function of ambroxol in vi tro: a comparison with N-acetylcysteine AC, Res. Exp. Med. (Berl) , 1987, 196: 389-398. Ref. 17: Pfeifer S, Zissel G, Kienast K, uller- - 7 -
Quernheim J, Reduction of cytokine reléase from blood and bronchoalveol r mor.onuclear cells by ambroxol, Eur. J. Med. Res., 1997, 2: 129-132. Ref. 18: Gibbs- BF, Schmutzler , Vollrath IB, Brostharadt P, Braam U, olff HH, Zadlo-Klarwasser G, Ambroxol inhibits the reléase of histamine, leukotrienes and cytokines from human leukocytes and mast cells, Inflamm. Res., 1999, 48: 86-93. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente contra la influenza o un agente para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas causadas por el virus de la influenza, haciendo uso del efecto defensivo contra la infección por el virus de la influenza del ambroxol y/o la bromhexina, la cual tiene un efecto antioxidante y puede servir como agente de disolución de septos capaz de promover la liberación del TP. La esencia de la presente invención reside en un agente contra la influenza que comprende, como principio activo, ambroxol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo . El agente de la presente invención está caracterizado porque posee un efecto contra la influenza a través de la promoción de la secreción de un factor o factores biológicos in vivo (un grupo de sustancias bioprotectoras) , que muestran una función contra el virus de la influenza y están incluidos en el fluido secretado por las vías respiratorias. En otras palabras, la presente invención proporciona un agente contra la influenza caracterizado porque comprende como principio activo ambroxol, bromhexina o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos y posee un efecto contra la influenza mediante la promoción de la secreción de un factor o factores biológicos in vivo (un grupo de sustancias bioprotectoras) , mostrando una función contra el virus de la influenza y que están incluidos en el fluido secretado por las vías respiratorias . Además, el agente de la presente invención está caracterizado porque la proliferación del virus de la influenza en las vías respiratorias es controlada mediante la promoción de secreción de sustancias capaces de inhibir la proteasa presente en las vías respiratorias, la cual puede inducir la infectividad del virus de la influenza y las sustancias mucosales inmunitarias tales como la IgA e IgG y, más específicamente, la presente invención proporciona un agente contra la influenza caracterizado porque comprende, como principio activo, ambroxol, bromhexina o una sal f rmacéuticamente aceptable de los mismos y que la proliferación del virus de la influenza en las vías respiratorias es controlada al promover la secreción de - 9 - factores biológicos que muestran una función contra el virus de la influenza y que están incluidos en el fluido secretado por las vías respiratorias, tales como IPM y TP, y las sustancias inmunitarias mucosales tales como la IgA y la IgG. Adicionalmente, el agente de la presente invención está caracterizado porque puede inhibir la liberación de citocinas inflamatorias en las vías respiratorias y, más específicamente, la presente invención también proporciona un agente contra la influenza caracterizado porque comprende, como principio activo, ambroxol, bromhexina o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismo y puede inhibir la proliferación del virus de la influenza mediante la promoción de la secreción de factores contra el virus de la influenza incluidos en los fluidos secretados en las vías respiratorias, tales como IPM y/o TP, así como la secreción de sustancias inmunitarias mucosales como las IgA y/o IgG y puede inhibir la liberación de citocinas inflamatorias en las vías respiratorias. El agente contra la influenza de la presente invención sirve como agente para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas causadas por el virus de la influenza . La presente invención también proporciona el uso de ambroxol, bromhexina o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para la preparación del agente contra la - 10 - influenza. La presente invención además proporciona un método para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por el virus de la influenza, que comprende la administración de un agente contra la influenza que comprende ambroxol, bromhexina o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos como principio activo, a pacientes que sufren de las enfermedades . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Fig. 1 es un diagrama que muestra el hecho de que el ambroxol mejora el Indice de supervivencia de ratones infectados por el virus de la influenza A. Las Figs . 2A - 2B son diagramas para ilustrar el efecto del ambroxol para inhibir la proliferación viral en BALF (FIG. 2A) , o las lesiones pulmonares visualmente observadas en ratones después de 4 días de una infección por el virus (FIG. 2B) . Las Figs . 3A - 3B son diagramas para ilustrar el efecto del ambroxol para estimular la secreción de la inmunoglobulina IgA mucosal en BALF de un grupo de ratones no infectados (FIG. 3A) , o en un grupo de ratones infectados con el virus de la influenza A (FIG. 3B) . Las Figs . 4A - 4B son diagramas que ilustran el efecto del ambroxol para estimular la secreción de la inmunoglobulina IgG mucosal en BALF de un grupo de ratones no - 11 - infectados (FIG. 4A) , o un grupo infectados con el virus de la influenza A (FIG. 4 B) . MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Con respecto al ambroxol (2-amino-3, 5-dibromo-N-[trans-4-hídroxiciclohexil] -bencilamina) , el clorhidrato de esta sustancia representada por la siguiente Fórmula Química 1 (nombre general: clorhidrato de ambroxol; nombre químico: clorhidrato de trans-4- [ (2-amino-3, 5-dibromobencil) -amino] -ciclohexanol ) se ha utilizado ampliamente en el mundo, incluyendo Alemania, como expectorante o agente de disolución de septos y se ha utilizado para el tratamiento de la bronquitis crónica y el síndrome de dificultad respiratoria del neonato, como se describió anteriormente. [Fórmula Química 1]
Así mismo, con referencia a la bromhexina (2-amino-3 , 5-dibromo-N-ciclohexil-N-metilbencilamina) , el clorhidrato de esta sustancia está representado por la Fórmula Química 2 (nombre general: clorhidrato de bromhexina; nombre químico: clorhidrato de 2-amino-3, 5-dibromo-N-ciclohexil-N-metilbencilamina) se ha utilizado ampliamente en el mundo, incluyendo Alemania, como expectorante y se ha utilizado para - 12 - el tratamiento de la bronquitis crónica, como ya se describió anteriormente . [Fórmula Química 2]
Las enfermedades infecciosas virales capaces de ser tratadas y/o que se pueden prevenir con el agente de conformidad con la presente invención, puede ser cualquier enfermedad viral siempre y cuando sea causada a través de la infección de las vías respiratorias por virus que tengan glucoproteinas de membrana externa y algunos ejemplos específicos son enfermedades atribuibles a los virus de la influenza, virus de la parainfluenza, virus sincial respiratorio, virus del sarampión o virus de la parotiditis. El agente contra la influenza de la presente invención se puede administrar a un paciente en una variedad de formas farmacéuticas, tales como las composiciones farmacéuticas normales, tales como por ejemplo, se puede administrar por vía oral en preparaciones farmacéuticas sólidas tales como tabletas, polvos, gránulos finos, gránulos, cápsulas, suspensiones, trociscos y preparaciones masticables, y preparaciones líquidas como elíxires y jarabes (incluyendo jarabes deshidratados) . Alternativamente, si la - 13 - administración oral no es adecuada para un paciente o en casos en los que se desea asegurar una eficacia más rápida y confiable a través de la selección de la administración local, el agente contra la influenza de la presente invención se administra de conformidad . con los métodos convencionalmente utilizados, tales como inyecciones de preparaciones líquidas, rocíos con atomizadores, inyección con un nebulizador, administración con un dispositivos para polvos secos (DPS) utilizando un inhalador giratorio o de disco, o la administración con un inhalador de dosis medida (IDM) . A este respecto, estos métodos se seleccionan y utilizan teniendo en cuenta, por ejemplo, la facilidad, conflabilidad y efectividad. La dosis por ser administrada del agente contra la influenza de la presente invención, se puede controlar de manera apropiada dependiendo de las formas farmacéuticas de las preparaciones f rmacéuticas deseadas. El agente contra la influenza de la presente invención se puede administrar a un paciente en una dosis diaria en porciones una o varias veces al día, si está en una forma farmacéutica de una preparación sólida administrada por vía oral, tal como una tableta, o una preparación líquida de administración oral. En el caso de las formas farmacéuticas para niños, para tomarse a una dosis, tales como un jarabe, un trocisco y una tableta masticable, las cuales son - 14 - preparaciones farmacéuticas para disfrutas simultáneamente sus efectos locales y efectos sistémicos a través del uso interno de las mismas, es suficiente incorporar 1/2 a 1/10 veces la dosis diaria en el agente en las formas farmacéuticas anteriores, antes de utilizarlas. En este caso, la dosis total de las mismas puede ser menor que la dosis diaria. Contrariamente a esto, tal cantidad del principio activo como la que corresponde a la dosis diaria, se puede formular en una sola dosis, siempre y cuando no resulte poco razonable desde el punto de vista de la forma farmacéutica de la preparación farmacéutica. En adición, en caso de, por ejemplo, la administración de una preparación líquida inyectable, un agente administrado por un aparato de nebulización-rocío, la administración por un nebulizador o la administración por inhalación de polvo, los agentes se pueden preparar de tal manera que contengan el principio activo en una cantidad de 1/10 a 1/100 veces la dosis para el agente administrado por vía oral para uso interno. En la preparación de estos agentes, se puede emplear una variedad de aditivos normalmente utilizados, tales como rellenos, agentes espesantes, aglutinantes, desintegrantes, tensoactivos , lubricantes, revestimientos, agentes de liberación sostenida, diluyentes y/o excipientes. En adición a los anteriores, el agente de la presente invención, si es necesario, además puede comprender otros - 15 - aditivos tales como agentes solubilizantes, reguladores de pH, conservadores, agentes para ajustar la isotonicidad, emulsificantes, suspensores, dispersantes, espesantes, gelatinizantes , endurecedores , absorbentes, adhesivos, plastificantes , adsorbentes, perfumes, colorantes, correctivos, antioxidantes , humectantes, agentes para filtrar la luz, abrillantadores y/o agentes antiestáticos. Más específicamente, ejemplos de tales aditivos incluyen excipientes tales como lactosa, almidón de maíz, manitol, D-sorbitol, celulosa cristalina, eritritol y sacarosa; aglutinantes tales como hidroxipropilcelulosa (HPC-L) , hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, metilcelulosa y almidón gelatinizado; agentes desintegrantes tales como carboximetilcelulosa cálcica, carboximetilcelulosa sódica y polivinilpirrolidona reticulada; agentes lubricantes tales como estearato de magnesio y talco; perfumes, por ejemplo aceites saborizantes o aromáticos tales como 1-mentol, vainillina, aceite de limón, aceite de canela y aceite de menta; y/o agentes adsorbentes tales como silicato de aluminio sintético y ácido silícico anhidro. Además, también es posible preparar preparaciones farmacéuticas revestidas mediante el uso de un agente de revestimiento de uso normal, tales como hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa o polivinilpirrolidona. Si es necesario, también se puede usar un edulcorante, en - 16 - particular en los trociscos, jarabes y preparaciones masticables , entre otros. Ejemplos específicos de tales edulcorantes son manitol, glucosa, maltosa, jarabe de almidón, extracto de malta, maltitol, sorbitol, sacarosa, azúcar no refinada, fructosa, lactosa, miel, xilitol, te de hidrangea, sacarina, aspartilfenilalanin éster y otros malto-oligosacáridos y oligosacáridos tales como maltosilsacarosa, isomaltirosa de tipo reducido y rafinosa. Las preparaciones farmacéuticas que contienen estos aditivos se pueden preparar de conformidad con cualquier método conocido en este campo, actualmente utilizado o los ordinarios, dependiendo de las formas farmacéuticas de las preparaciones. Con respecto a las preparaciones en polvo y granulares, tales como los polvos, granulos finos y gránulos [incluyendo aquellos administrados por un inhalador de dosis medida (IDM) o un dispositivo de polvo seco (DPS)], se pueden preparar apropiadamente tomando en cuenta varias propiedades tales como la capacidad de formar polvo y la adhesividad. Por ejemplo, de preferencia se preparan tomando en cuenta propiedades físicas como el granel, la capacidad de formar polvo, la adhesividad, la higroscopicidad, la capacidad de formar cargas, la humectabilidad y la solubilidad de cada sustancia en polvo, así como otras propiedades tales como el tamaño de partícula (diámetro de partícula) , el área de superficie y la forma de las partículas. Específicamente, en - 17 - los polvos para inhalación, se debe poner atención especial al tamaño de partícula de los componentes medicamentosos con el fin de lograr que el fármaco llegue efectivamente al sitio afectado y, de conformidad con ello, el tamaño de partícula más adecuado debe variar entre 0.5 y 5.0 µt?. Además, también se prefiere preparar el agente tomando en cuenta, por ejemplo, el fácil manejo y la prevención de higroscopicidad, comportamientos de descomposición, desnaturalización y decoloración. El polvo se puede preparar de conformidad con cualquier método de pulverización conocido, tales como pulverización en seco, pulverización en húmedo, pulverización a baja temperatura, pulverización a chorro, pulverización por lotes, pulverización continua en un circuito abierto y pulverización continua en circuitos cerrados, los cuales se pueden utilizar por sí solos o en cualquier combinación, dependiendo de los propósitos. Se reconoce que el ambroxol y la bromhexina muestran un efecto de la promoción de la secreción de factores antivirales en las vías respiratorias y, a su vez, tienen un efecto de inhibición en la proliferación de los virus de la influenza en las vías respiratorias. El efecto del ambroxol se puede probar haciendo referencia a los hechos de que puede incrementar la concentración de sustancias que inhiben la proliferación viral tales como SP-A, IPM, IgA e IgG en las vías respiratorias y que puede inhibir la - 18 - liberación de citocinas inflamatorias en el fluido secretado en las vías respiratorias. EJEMPLOS La presente invención ahora se describirá más detalladamente con referencia a los siguientes Ejemplos, pero no se pretende restringir la presente invención a estos Ejemplos específicos. <Sumario El ambroxol sirve como un agente de disolución de septos, cuya acción antioxidante y la inducción de liberación de TP fue inesperada para el efecto de proteger a un sujeto de la infección por virus de la influenza, usando ratones. Después de infectar la cavidad nasal de ratones con una dosis letal de virus de la influenza A/Aichi68 (H3N2) , se administró por vía intraperitoneal ambroxol o un excipiente a estos ratones dos veces al día y después se analizó el índice de supervivencia, el título de virus en BALF, las citocinas y factores antivirales presentes en BALF o la concentración de las inmunoglobulinas mucosales IgA e IgG, así como la concentración de TP y IPM. Como resultado, se encontró que el ambroxol inhibía significativamente la proliferación del virus y mejoraba considerablemente el índice de supervivencia de los ratones infectados. Con respecto a la determinación del índice de supervivencia, el efecto del ambroxol alcanzó el nivel máximo - 19 - a una dosis de 10 mg/kg día y se redujo a dosis más altas que las especificadas aquí. En el caso de tales dosis altas, sin embargo, el índice de supervivencia de los ratones mejoró en comparación con aquellos observados en el grupo en el que se administró solución salina fisiológica, utilizado como control. La infección por el virus de la influenza indujo la liberación de factores antivirales y citocinas inflamatorias en el fluido secretado por las vías respiratorias y el ambroxol además promovió la liberación de estos factores antivirales. Sin embargo, también promovió la liberación de una proteasa de tipo tripsina, la cual promovería la proliferación viral. Además, el ambroxol inhibió temporalmente la liberación de citocinas o factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) , interferón-? (IFN-?) e interleucina 2 (IL-2) en el fluido secretado en las vías respiratorias. Se ha reconocido que el ambroxol tiene varios efectos negativos involucrados en la proliferación viral in vivo, pero como un todo, puede incrementar significativamente el nivel de un grupo de sustancias en las vías respiratorias, las cuales pueden controlar la proliferación viral y esto claramente sugiere que se puede aplicar clínicamente como un agente efectivo para el tratamiento de un paciente infectado por el virus de la influenza. Después de infectar la cavidad nasal de ratones con una dosis letal de virus de la influenza tipo A/Aichi68 (H3N2) adaptado - 20 - a ratones, se administró ambroxol a dichos ratones y después se analizó el índice de supervivencia, el título del virus y la proliferación viral y las concentraciones de una proteasa de tipo tripsina, IPM, TP, IgA, IgG y citocinas en el fluido secretado en las vías respiratorias. <Sujetos y Métodos> 1) Animales y Sujetos Se compraron ratones hembra oddY de tres semanas de edad, que tenían un peso corporal que variaba entre 8 y 10 g y libres de cualquier patógeno específico, en Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japón) . Todos los ratones fueron tratados con base en las normas- para experimentos en animales de la Universidad de Tokushima. Boehringer Ingelheim les proporcionó ambroxol a los inventores. Se compró tripsina de bazo de cerdo en Sigma Company. El virus de la influenza tipo A/Aichi68 (H3N2) adaptado a ratones (Ref . 19) se utilizó después de la proliferación de los mismos en huevos de pollos que contenían embriones de 10 días de edad. Ref. 19: Ovcharenko AV, Zhirnov OP, Aprotinin aerosol treatment of influenza and paramyxovirus bronchopneumonia of mice, Antiviral. Res., 1994, 23: 107-118. 2) Infección con el Virus y Método de Administración del Ambroxol La cavidad nasal de los ratones se infectó con el - 21 - virus de la influenza A/Aichi/68 (H3N2) con 6.6 x 104 unidades formadoras de placa (UFP) , a una dosis de 20 µ?_, bajo anestesia con éter. Dentro de un periodo de 10 a 15 minutos inmediatamente después de la infección con el virus, se administraron por vía intraperitoneal 200 µL de ambroxol mezclado con una solución acuosa de sal común a cada grupo de animales (10 animales en cada uno), a una dosis de 2, 5, 10 ó 15 mg/kg de peso corporal. En lo sucesivo, se administró ambroxol a estos grupos de animales, de conformidad con los mismos procedimientos anteriormente utilizados, dos veces al día por un periodo de 7 a 10 días. En experimentos para determinar o analizar una variedad de compuestos presentes en el fluido secretado en las vías respiratorias y una variedad de cambios patológicos, se seleccionaron tres grupos de animales para tratarlos con ambroxol a dosis de 0, 10 y 30 mg/kg, /día, respectivamente. Cada grupo comprendía 80 animales . El nivel de virus presentes en BALF se determinó de conformidad con el método de cuenta de células inmunofluorescentes , previamente reportado (Ref. 20). Ref. 20: Tashiro M, Homma M, Pneumotropism of
Sendai virus in relation to protease-mediated activation in mouse lungs, Infect. Immun., 1983, 39: 879-888. 3) Preparación de BALF Los animales utilizados en esta prueba se dividieron en los siguientes grupos (cada uno incluyendo 80 - 22 - animales) : un grupo tratado con ambroxol, un grupo libre de cualquier tratamiento, un grupo infectado con el virus de la influenza y un grupo libre de infección por el virus de la influenza. Se seleccionaron cuando menos 5 animales de cada grupo de prueba todos los días para colectar BALF (de conformidad con el método de Singh et al. (Ref. 21)) durante 7 días. Las muestras de BALF se almacenaron a -80°C hasta que fueran utilizadas. Ref. 21: Singh G, Katyal SL, An immunologic study of the secretory products of rat clara cells, J. Histochem. Cytochem. , 1984, 32: 49-54. 4) Determinación del Nivel de SP-A, Citocinas e Inmunoglobulinas en BALF Hay una homología del 95% entre las secuencias de aminoácidos de SP-A de ratones y ratas (Refs. 22, 23) y el anticuerpo policlonal aislado para SP-A de rata (Refs. 6, 24) reaccionó con el SP-A de ratón. Así pues, se construyó un sistema de ensayo inmunosorbente de enzima ligada (ELISA) utilizando anticuerpos específicos para SP-A de rata biotinado y no biotinado, y se analizó la concentración de SP-A en BALF de ratón utilizando SP-A de ratón como referencia para preparar una curva de calibración. Los niveles de citocinas [TNF-ct, IL-2, IFN-?, i terleucina-6 (IL-6), interleucina-4 (IL-4)] presentes en BALF se determinaron utilizando paquetes de ELISA (disponibles en Bio-Source - 23 -
International, CA, EUA) , de conformidad con el protocolo del fabricante . De manera similar se determinaron los niveles de
IgA e IgG presentes en BALF, utilizando paquetes de ELISA
(disponibles en Bethyl Company, X, EUA) . En esta conexión, se leyeron las absorbancias observadas a 490 y 450 nm con un aparato Immuno MiniKan NJ-2300 Multi-plate-Reader. Ref. 21: Sing G, Katyal SL, An immunologic study of the secretory products of rat clara cells, J. Histochem.
Cytochem. , 1984, 32: 49-54. Ref. 22: Korfhagen TR, Bruno MD, Glasser SW, et al., Murine pulmonary surfactant SP-A: gene cloning, sequence, and transcriptional activity, Am. J. Physiol . ,
1992, 263: L546-554. Ref. 23: Lacaze-Masmonteil T, Fraslon C, Bourban J, Raymondjean M, Kahn A, Characterization of the rat pulmonary surfactant protein A promoter, Eur. J. Biochem. ,
1992, 206: 613-623. Ref. 24: Sakai K, Kweon MN, Kohri T, Kishino Y,
Effects of a pulmonary surfactant and surfactant protein A on phagocytosis of fractionated alveolar macrophages : relationship to starvation, Cell. Mol. Biol . , 1992, 38: 123- 130. 5) Determinación de Enzimas e Inhibidores Como se describió anteriormente (Kido H, Yokogoshi Y, Sakai K, Tashiro M, Kishino Y, Fudutomi A, Kutunuma N, - 24 -
Isolation and characterization of a novel trypsin-lik protease found in rat bronchiolar epithelial Clara cells, J. Biol. Chem. , 1992, 267: 13573-13579), la proteasa de tipo tripsina se determinó utilizando una secuencia: N-tert-butoxicarbonil-Gln-Ala-Arg-4-metilcumaril-7-amida similar al sitio de rompimiento consensual de la HA del virus de la influenza. La actividad inhibitoria de IPM, que corresponde al 90% de las sustancias que inhiben las proteasas de rompimiento de HA del virus de la influenza presentes en BALF (Refs . 25, 26), se determinó de la siguiente manera: se trató IPM con una solución al 5% (v/v) de ácido perclórico, aprovechando la estabilidad del IPM a los ácidos y al calor, la mezcla se centrifugó para remover la mayoría de las proteínas presentes y colectar el sobrenadante del BALF, y después este sobrenadante se sometió a ebullición a 100 °C durante 10 minutos. Posteriormente el sobrenadante resultante se centrifugó a 1500 x g durante 15 minutos, seguido por un ajuste del pH a 7.0 con KOH 4 M y la determinación de la actividad inhibitoria de proteasa del sobrenadante, de conformidad con el método previamente propuesto (Beppu Y, Imamura Y, Tashiro M, Towatari T, Ariga H, Kido H, Human Mucus protease inhibitor in airway fluids is a potential defensive compound against infection with influenza A and Sendai viruses, J. Biochem. , 1997, 121: 309-316) .
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Ref. 25: Stolk J, Rossie W, Dijkman JH, Apocynin iraproves the efficacy of a secretory leucocyte protease inhibitor in experimental emphysema, Am. J. Respir. Crit . Care Med., 1994, 150: 1628-1631. Ref. 26: Ohlsson K, Tegner H, Akesson U, Isolation and partial characterization of a low molecular wieght acid stable protease inhibitor from human bronchial secretions, Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. , 1977, 358: 583-589. «cTratamiento Estadístico> Todos los resultados obtenidos se expresan en términos del promedio + desviación estándar. La diferencia significativa entre el grupo tratado con ambroxol y el grupo sin tratamiento o el grupo control, se evaluó utilizando la Prueba de t de Student apareada y se consideró el valor de P <0.05 como significativo. <Resultados> 1) El ambroxol mejoró sustancialmente el índice de supervivencia de los ratones infectados por el virus de la influenza. Los resultados que se grafican en la Fig. 1 indican claramente que el ambroxol incrementa el índice de supervivencia de los ratones infectados por el virus de la influenza A/Aichi/68 (H3N2) . Con respecto a los resultados graficados en la Fig. 1, los ratones se infectaron con 6.6 x 104 UFP del virus de la influenza A/Aichi/68 (H3N2) y después - 26 - los ratones se infectaron con una solución acuosa de sal común (·) , 4 mg/kg/día (A) , 10 mg/kg/dia (¦) , 20 mg/kg/dxa
(?) y 30 mg/kg/dia (?) de ambroxol, por vía intraperitoneal . De esta manera el índice de cada grupo de animales de prueba
(cada grupo consistía de 10 animales) fue analizado o supervisado en un periodo de 10 días. Como se describió anteriormente, se ha reportado que el ambroxol estimula los pulmones y el bronguio principal para secretar TP y que tiene un efecto antioxidante y características antiinflamatorias. El efecto del ambroxol en ratones infectados con el virus de la influenza A/Aichi/68 (N3N2) , que muestra una alta infectividad y un fuerte progreso, se analizó o evaluó a la luz de los anteriores conocimientos. Ratones con un peso corporal que variaba de 8 a 10 g se infectaron por vía intranasal con el virus de la influenza A en una cantidad que correspondía a la dosis letal y se inyectó intraperitonealmente ambroxol a estos animales en una variedad de dosis, dos veces al día. El ambroxol per se no fue tóxico hasta una dosis de 30/mg/kg/día. Se observó una disminución significativa del peso corporal de cada animal después de dos días de infección con el virus y todos los animales de prueba (n = 10) , que no habían sido tratados con ambroxol, fueron sacrificados en un periodo de 10 días. En los grupos tratados con ambroxol, el índice de supervivencia de los ratones infectados mejoró - 27 - dependiendo de la dosis de ambroxol. Más específicamente, el índice de supervivencia alcanzó un valor pico a una dosis de 10 mg/kg/día, pero el efecto de mejorar el índice de supervivencia del ambroxol se redujo a una dosis mayor que ésta (véase la Fig. 1) . Cuando se trataron ratones con ambroxol a una dosis de 10 mg/kg/día, la mitad de los ratones infectados sobrevivió, aunque estuvieran infectados con la dosis letal del virus. 2) En los grupos de animales de. prueba tratados con ambroxol, se inhibió cualquier proliferación viral. La Fig. 2 muestra el efecto del ambroxol para inhibir cualquier proliferación viral el BALF (A) y las lesiones visualmente observadas en los ratones después de 4 días de infección por el virus de la influenza (B) . A: Se infectaron ratones de cada grupo (80 animales) con el virus de la influenza A/Aichi/68 (H3N2) y después se trataron con una solución acuosa de sal común (·) y con 10 mg/kg/día (?) y 30 mg/kg/día ( A) de ambroxol, de la manera que se describe en la explicación de la Fig. 1. Después de la infección y el tratamiento, se tomó BALF de 5 ratones supervivientes cada tercer día por un periodo de 7 días. Se determinó el título de virus en BALF de conformidad con el método de cuenta de células inmunofluorescentes anteriormente descrito (Ref. 20) y los resultados obtenidos se expresaron en unidades infectivas de célula (UIC) . Estos - 28 - datos se expresaron como promedio + desviación estándar (n = 5) . Las diferencias significativas entre los' valores observados para los ratones tratados con una solución acuosa de sal común y con ambroxol, se determinó mediante la Prueba de t de Student . *P < 0.01. B: Lesiones pulmonares de ratones visualmente observadas en los pulmones de los animales que pertenecían al grupo no infectado después de 4 días (n = 5) (1) , los pulmones de animales que pertenecían al grupo infectado con virus de la influenza y tratados con la solución acuosa de sal común (2) y los pulmones de animales que pertenecían a los grupos infectados con virus de la influenza y tratados con 10 mg/kg/día (3) y 30 mg/kg/día de ambroxol. El título de virus en BALF se determinó de conformidad con el método de cuenta de células inmunoflúorescentes anteriormente descrito, con el fin de dilucidar el mecanismo básico del ambroxol para mejorar el índice de supervivencia de los ratones infectados. Después de 2 días de la infección intranasal de ratones con el virus de la influenza A, el título viral en BALF empezó a incrementarse, alcanzó el valor máximo después de 5 días de infección, el título viral se redujo rápidamente y después del 6to. día y el título observado en el 7mo. día fue casi idéntico al observado después de dos días de infección. Se podría suponer que éste es un resultado de la - 29 - reacción inmunológica en el huésped (véase la Fig. 2A) . En el grupo tratado con ambroxol a una dosis de 10 mg/kg/día, la proliferación viral se inhibió significativamente, pero el efecto inhibitorio de la proliferación viral observado para el grupo tratado con ambroxol a una dosis de 30/mg/kg/día, fue inferior al anteriormente descrito. Los animales de prueba se inspeccionaron en busca de cambios patológicos en los pulmones o la visualizacion de lesiones pulmonares en el cuarto día de infección viral (véase la Fig. 2B) . Se observaron en los ratones infectados lesiones hepáticas ampliamente diseminadas y graves al igual que en los pulmones, junto con rubefacción. Por otro lado, en el grupo tratado con ambroxol a una dosis de 10 mg/kg/día, los cambios patológicos se redujeron distintivamente y el efecto inhibidor de lesiones del ambroxol a una dosis de 30 mg/kg/día fue más bajo que el anteriormente especificado. La proliferación viral en los ratones infectados casi cesó y los virus se eliminaron de las vías respiratorias en el séptimo día, pero los cambios patológicos en los pulmones se mantuvieron incluso después de haber cesado la proliferación viral, con un ligero progreso y los animales fueron sacrificados a los 10 días. Con el fin de dilucidar el mecanismo de la participación en el índice de supervivencia de los ratones infectados y la contribución del ambroxol al efecto inhibitorio de la proliferación viral, los - 30 - presentes inventores investigaron el efecto del ambroxol en una variedad de factores celulares y citocinas inflamatorias presentes en BALF y controlaron la replicacion de virus de la influenza. 3) Efectos del ambroxol sobre la concentración de factores promotores e inhibidores de la replicacion del virus de la influenza presentes en el fluido secretado en las vías respiratorias . La proteasa tipo tripsina secretada en las vías respiratorias, tal como la triptasa clara, degrada la HA del virus de la influenza en HA1 y HA2 y como resultado, la proteasa puede activar la capacidad viral de fusión a la membrana celular y promover la replicacion viral (Ref . 6, 7) . Sustancias inhibitorias endógenas tales como el IPM (Ref. 8) y el TP (Ref. 9) inhiben esta actividad de proteasa. Por esta razón, los inventores investigaron el efecto del ambroxol sobre la concentración de estas sustancias inhibitorias en BALF. Los resultados obtenidos de esta manera se resumen en la siguiente Tabla 1 (efecto del ambroxol sobre la actividad de proteasa similar a la tripsina TP y IPM en BALF originado de ratones infectados con el virus de la influenza A) . La proteasa tipo tripsina en general es secretada en ratones y ratas no infectados en una cantidad mayor que aquella de las sustancias inhibitorias de proteasa en las - 31 - vías respiratorias y, por lo tanto, las vías respiratorias siempre están listas para infecciones causadas por virus de la influenza (Ref. 6, 9). Cuando estos animales fueron infectados con virus de la influenza, la concentración de la proteasa tipo tripsina alcanzó un valor pico, después de 6 días de infección, del orden de 6.4 veces mayor que aquel observado en animales no infectados . En el grupo tratado con ambroxol a una dosis de 10 mg/kg/día, la secreción de la proteasa ya estaba acelerada en el primer día y el nivel de proteasa alcanzó el valor pico al 5to. día después del inicio del tratamiento. En el grupo en el que se administró ambroxol a una dosis de 30 mg/kg/día, el nivel de la proteasa se incrementó adicionalmente , pero alcanzó el nivel pico dentro de un periodo más corto o en el 4to. día y posteriormente se observó que la tendencia rápidamente se reducía. Incluso en ratones no infectados, se reconoció que la secreción de la proteasa tipo tripsina en BALP era promovida por la acción del ambroxol (véanse los datos listados en la Tabla 2) . En los grupos de los animales de prueba a los que se administró ambroxol a dosis de 10 y 30 mg/kg/día, los niveles de proteasa tipo tripsina alcanzaron sus valores pico en el 4to. día o hasta 2.2 veces y 2.4 veces mayores que los observados en los animales no infectados . Los inventores además investigaron el efecto del ambroxol sobre los niveles de SP-A y IPM [véanse los datos - 32 - listados en las siguientes Tablas 1 y 2 (efecto del ambroxol sobre la actividad de la proteasa tipo tripsina, TP y MTI en BALF de ratones del grupo infectado con virus de la influenza y en el grupo no infectado) ] . La infección por virus de la influenza incrementó los niveles de sustancias bioprotectoras o SP-A y IPM, cada una de las cuales tiene una actividad contra la influenza. Más específicamente, los niveles de estas sustancias alcanzaron sus valores pico en el 6to. día, los cuales fueron del orden de 6 veces y 4.4 veces mayores que los observados en los animales no infectados. El tratamiento del grupo de animales infectados con ambroxol permitió un rápido y significativo incremento de la concentración de IPM y SP-A después de un día de administración de ambroxol y alcanzaron sus valores pico del orden de 9 a 10 veces y '8.4 veces mayores que los observados en animales no infectados. En el grupo en que los ratones infectados fueron tratados con ambroxol a una dosis de 10 mg/kg/día, los niveles de IPM y SP-A se incrementaron rápidamente en el 1er. día, después gradualmente se incrementaron, alcanzaron los valores pico en el 5to . día y posteriormente se mantuvieron en altos niveles hasta el 7mo . día. Sin embargo, cuando los ratones fueron tratados con 30 mg/kg/día de ambroxol, los niveles de IPM y SP-A se incrementaron rápidamente en el 1er. día, alcanzaron su valor máximo en el 4to. día y después el IPM y el SP-A - 33 - desaparecieron rápidamente. También se observó que incluso la secreción de SP-A y IPM en el grupo de ratones no infectados, se promovió ligeramente por la administración de ambroxol . Tabla 1
Tabla 1 (continuación)
Los datos en esta tabla se expresan en términos del promedio + la desviación estándar. n = 5 para cada dato. La - 34 - diferencia significativa entre el grupo tratado con ambroxol y el grupo libre de tratamiento, para cada dia, se evaluó por la Prueba de t de Student. *P < 0.05. Tabla 2
Tabla 2 (continuación)
Los datos en esta tabla se expresan en términos del promedio ± la desviación estándar. n = 5 para cada dato. La - 35 - diferencia significativa entre el grupo tratado con ambroxol y el grupo libre de tratamiento, para cada día, se evaluó por la Prueba de t de Student . *P < 0.05. Después se investigó el efecto del ambroxol sobre la secreción de inmunoglobulinas mucosales IgA e IgG en BALF (véanse las Figs . 3 y 4) . La Fig. 3 muestra el efecto promotor de secreción del ambroxol sobre el nivel de inmunoglobulina IgA mucosal en BALF de: (A) un grupo de ratones no infectados y: (B) un grupo de ratones infectados con el virus de la influenza A. Con respecto a los datos mostrados en esta figura, los niveles de IgA presentes en BALF de ratones que pertenecen al grupo no infectado (A) y al grupo infectado (B) tratados con una solución acuosa de sal común (barras blancas) y con 10 mg/kg/día (barras negras) y 30 mg/kg/día (barras sombreadas) de ambroxol, se supervisaron durante 7 días. Estos datos se expresaron en términos del promedio ± desviación estándar (n = 5) . De conformidad - con la Prueba de t de Student, las diferencias significativas entre los ratones tratados con la solución acuosa de sal común y el ambroxol, se encontraron en *P < 0.05 y **P < 0.01. La Fig. 4 muestra el efecto promotor de secreción del ambroxol sobre el nivel de inmunoglobulina IgG mucosal en BALF de (A) un grupo de ratones no infectados y (B) un grupo de ratones infectados con el virus de la influenza (A) . Con - 36 - respecto a los datos mostrados en esta figura, los niveles de IgA presentes en BALF de ratones que pertenecían al grupo no infectado (A) y al grupo infectado (B) tratados con una solución acuosa de sal común (barras blancas) y 10 mg/kg/día (barras negras) y 30 mg/kg/día (barras sombreadas) de ambroxol, se supervisaron durante 7 días. Estos datos se expresan en términos del promedio ± desviación estándar (n = 5) . De conformidad con la Prueba de t de Student, la diferencia significativa entre los ratones tratados con la solución acuosa de sal común y el ambroxol, se encontró n *P< 0.05. La inoculación intranasal de virus de la influenza pudo promover considerablemente la secreción de inmunoglobulinas IgA e IgG mucosales . Los niveles de estos anticuerpos se ha reconocido que están correlacionados con el grado de inhibición de la proliferación viral (Lie FY, Russell SM, Appleyard G, Brand CM, Beale J, Cross-protection in mice infected with influenza A virus by the respiratory route is correlated with local IgA rather than serum antibody or cytotoxic T cell reactivity, Eur. J. Immunol . , 1984, 14: 350-356; Tamura S, Funato H, Hirabayash Y, et al., Functional role of respiratory tract haemagglutinin-specific IgA antibodies in protection against influenza, Vaccine, 1990, 8: 479-485) . La concentración de IgA en BALF derivado del grupo de - 37 - ratones no infectados es muy baja, del orden de 10.3 ± 6.6 ng/mL, mientras que la concentración de IgG es relativamente alta, del orden de 460 ± 26.2 ng/mL. Este nivel relativamente alto de IgG se puede deber a la di-fusión del mismo del suero hacia el fluido secretado en las vías respiratorias (véanse las Figs . 3A y 4A) . El tratamiento del grupo de ratones no infectados con 10 y 30 mg/kg/día de ambroxol, promovió la secreción de IgA. Más específicamente, el tratamiento incrementó la concentración de ésta a un nivel de aproximadamente 10 veces mayor que el observado en el grupo libre de tratamiento en el 7mo. y 5to. día, respectivamente, después de iniciado el tratamiento y dicho tratamiento incrementó ligeramente, la concentración de IgG hasta un nivel de aproximadamente 1.2 veces mayor que el observado en el grupo libre de tratamiento en el 7mo. y 6to. día después de iniciado dicho tratamiento. En ratones infectados con el virus de la influenza, la concentración de IgA e IgG en BALF se incrementó sustancialmente después de 1 a 2 días de infección, sus niveles alcanzaron sus picos o el nivel de IgA en el 7mo. día se encontró que era de aproximadamente 400 veces mayor y el nivel de IgG en el 6to. días se encontró que era aproximadamente 11 veces mayor que aquellos observados en el grupo libre de tratamiento (Figs. 3B y 4B) . El tratamiento de los ratones infectados con 10 y 30 mg/kg/día de ambroxol, incrementó significativamente los niveles de IgA en el 7mo. y 5to. día, a - 38 - aproximadamente 600 y 700 veces mayor, respectivamente, que el observado como concentración basal de IgA. Por otro lado, el tratamiento de los ratones infectados con 10 y 30 mg/kg/día de ambroxol, estimuló medianamente la secreción de IgG en los ratones infectados o las concentraciones de esta sustancia en el 6to. y 5to. día se encontró que eran de aproximadamente 16 y 15 veces mayores que la concentración basal de IgG. Estos resultados se pudieron obtener debido a la considerable promoción de la secreción de inmunoglobulina IgA mucosal y a la mediana promoción de la secreción de IgG, las cuales fueron inducidas por la infección, a través del tratamiento con ambroxol. Por lo tanto, se podría reconocer que estos incrementos de los niveles de inmunoglobulinas fueron el resultado del efecto inhibidor de la proliferación viral del ambroxol en las vías respiratorias . 5) Efecto del ambroxol sobre la liberación de citocinas. Se ha reportado que el ambroxol inhibe, in vitro, cualquier liberación de citocinas inflamatorias tales como TNF-oc, IL-2,
IL-1, IL-4, IL-13 e IFN-? (Pfeifer S, Zissel G, Kienast K, Muller-Quernheim J, Reduction of citokyne reléase from blood and bronchoalveolar mononuclear cells by ambroxol, Eur. J. Med. Res., 1997, 2: 129-132; Gibbs BF, Schmutzler W, Vollrath IB, Brostharardt P, Braam U, Wolff HH, Zadlo-Klarwasser G. , Ambroxol inhibits t e reléase of histamine, leukotrienes and cytokines from human leukocytes and mast cells, Inflamm. Res.
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1999; 48: 86-93). Para determinar el efecto antiinflamatorio del ambroxol en los ratones infectados con el virus de la influenza, los inventores investigaron o analizaron los niveles de citocinas mucosales promotoras de inmunidad, por ejemplo, citocinas inflamatorias tales como TNF-a, IL-4 e lFN-?, IL-6 e IL-12 (Boyaka PN, Marinaro , Jackson R, Menon S, . Kiyono H, Jirillo E, McGhee JR, IL-12 is an effective adjuvant for induction of mucosal immunity, J. Immunol . , 1999, 162: 122-128) . Los resultados obtenidos de esta manera se listan en la siguiente Tabla 3 (efecto del ambroxol sobre citocinas tales como el TNF-a, IL-12, IFN-? e IL-6 en BALF derivado de ratones infectados con virus de la influenza A/Aichi/68 (H3N2) . Los niveles de las citocinas presentes en BALF derivado de ratones no infectados, fueron más bajos que los límites de detección. La infección por el virus de la influenza indujo significativamente la secreción de todas las citocinas examinadas, excepto la IL-4 en BALF, aunque los patrones de estas como función del tiempo transcurrido fueron diferentes entre sí. De manera más significativa, cuando los animales se infectaron con el virus de la influenza, el nivel de TNF-a inicialmente se incrementó o alcanzó el nivel pico en el 1er. día, después de ello se redujo rápidamente y alcanzó un pico pequeño secundario en el 6to. día. El nivel de IL-6 también se incrementó rápidamente en el primer día después de la infección, este nivel se mantuvo alto y alcanzó su valor - 40 - pico en el 5to. día, pero empezó a sufrir una rápida reducción en el 7mo. día después de la infección. Las concentráciones de
IL-12 e IFN-? se incrementaron gradualmente después de la administración de ambroxol y alcanzaron sus respectivos valores pico en el 4to. y 6to. día después de la administración de dicha sustancia. Sin embargo, la IL-4 no fue detectable en BALF derivado de ratones infectados en los 7 días que se examinaron (datos no mostrados) . Cuando los ratones infectados fueron tratados con ambroxol, se observaron los efectos inhibidores de secreción de TNF- , IFN-? e IL-12 en el 3er. a 5to. día, en el 1er. dia y en el 4to. dia, respectivamente, después de iniciado el tratamiento con ambroxol, pero el efecto inhibitorio no siempre se observó durante el tratamiento con ambroxol. Por otro lado, el nivel de IL-6 en BALF derivado de ratones infectados, se incrementó en el 4to. y 6to. días después de •iniciado el tratamiento con ambroxol. Tabla 3
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Tabla 3 (continuación)
Los datos en esta tabla se expresan en términos del promedio ± la desviación estándar. n = 5 para cada dato. La diferencia significativa entre el grupo tratado con ambroxol y el grupo libre de tratamiento, para cada día, se evaluó por la Prueba de t de Student . *P < 0.05. <Consideración> En este estudio se concluyó que el ambroxol inhibe significativamente la proliferación del virus de la influenza en las vías respiratorias y, de manera similar, mejora el índice de supervivencia de ratones infectados con la dosis letal del virus de la influenza A/Aichi/68 (H3N2) . El virus de la influenza muestra especificidad de órgano en las vías respiratorias y la patogenicidad y replicación del mismo se determinan por una variedad de factores derivados de la célula huésped y las respuestas inmunitarias de células T y B.
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Se ha reportado que en las vías respiratorias de animales, las proteasas de tipo tripsina tales como la triptasa clara sirven como factor celular, que promueve la replicación del virus de la influenza (Kido H, Yokogoshi Y, Sakai K, Tashiro M, ishino Y, Fukutomi A, Kutunuma N. , Isolation and characterization of a novel trypsin-like protease found in rat bronchiolar epithelial Clara cells, J. Biol. Chem., 1992; 267: 13573-13579; Tashiro M, Yokogoshi Y, Tobita K, Seto JT, Rott R, Kido H. Tryptase Clara, an activating protease for Sendai virus in rat lungs, is involved in pneumopathogenicity, J. Virol . , 1992, 66: 7211-7216) y que por otro lado, hay factores capaces de inhibir la proliferación viral como el IPM, que es un inhibidor de proteasas (Beppu Y, Imamura Y, Tashiro M, Towatari T, Ariga H, Kido H., Human Mucus protease inhibitor in airway fluids is a potencial defensive compound against infection with influenza A and Sendai viruses, J. Biochem. , 1997, 121: 309-316) y el TP, que adsorbe proteasas para así inhibir la actividad de las mismas (Kido H, Sakai K, Kishino Y, Tashiro M. , A pulmonary surfactant is a potential endogenous inhibitor of proteolytic activation of Sendai virus and influenza virus, FEBS Lett . , 1993, 322: 115-119). La concentración de la proteasa tipo tripsina en el ambiente normal de las vías respiratorias, se mantiene a un nivel que permite la infección y proliferación del virus de la - 43 - influenza y es mayor que aquella de los inhibidores presentes . El TP que cubre el epitelio alveolar pulmonar está ligado a la triptasa clara para inhibir a actividad de la proteasa (Kido H, Sakai K, Kishino Y, Tashiro M. , A pulmonary surfactant is a potential endogenous inhibitor of proteolytic activation of Sendai virus and influenza virus, FEBS Lett . , 1993, 322: 115-119; Kido H, Murakarai M, Oba K, Chen Y, Towatari T., Cellular proteinases trigger the infectivity of the influenza A and Sendai viruses. Mol. Cells, 1999, 9: 235-244) . La infección por el virus de la influenza promovió la secreción de la proteasa tipo tripsina requerida para la proliferación del virus y el inhibidor de la misma. Además, cuando los ratones infectados se trataron con ambroxol , la secreción de las sustancias anteriores se promovió significativamente, pero el efecto cambió el balance entre la proteasa y el inhibidor. La concentración de la proteasa inducida por la infección viral se incrementó adicionalmente hasta un nivel de 1.3 a 1.4 veces, mientras que aquella del SP-A y el IP se incrementaron a un nivel de 1.5 a 1.7 veces y 1.9 veces, respectivamente, por el tratamiento con ambroxol. Estos resultados indican claramente que el tratamiento con ambroxol permite el índice de las sustancias que muestran efectos inhibitorios de la proliferación viral y que están presentes en el fluido secretario en las vías - 44 - respiratorias de los ratones infectados y que el tratamiento mejora el ambiente en las vías respiratorias de tal manera tienen una alta tendencia inhibitoria de la proliferación viral, en comparación con el ambiente que hay en las vías respiratorias de los ratones infectados no tratados. Además, el ambroxol tuvo un efecto de promover o incrementar la liberación de inmunoglobulinas IgA e IgG mucosales en los ratones infectados y no infectados, como se muestra en la Fig. 3. Este fármaco también promovió medianamente la secreción de IgG (Pig. 4) . De manera similar, el ambroxol promovió la liberación de IgA incluso en los ratones no infectados. Más específicamente, la concentración de IgA se incrementó en aproximadamente 10 veces con respecto a la concentración básica de la misma y la concentración de IgG se incrementó en 1.2 veces con respecto a la concentración básica. Después de la infección viral, las concentraciones IgA e IgG en BALF se incrementaron considerablemente, pero el tratamiento de los ratones infectados con ambroxol pudo incrementar las concentraciones de IgA e IgG hasta niveles de 1.5-1.8 veces y 1.45, respectivamente, con respecto a la concentración máxima inducida por la infección viral . Esto indica claramente que el incremento de la concentración de IgA e IgG debido al tratamiento con ambroxol , desempeña una función importante en la mejoría del índice de supervivencia de los ratones - 45 - infectados . El mecanismo preciso del ambroxol para promover la secreción de una variedad de factores tales como IgA e IgG, SP-A, IPM y proteasas de tipo tripsina, todavía no se ha dilucidado claramente, pero los hechos anteriores sugieren que el ambroxol estimula una pluralidad de células blanco de las vías respiratorias superiores e inferiores . Cuando los ratones fueron tratados con ambroxol a la dosis óptima de 10 mg/kg/día, la concentración de sustancias inhibitorias de la proliferación viral y la concentración de inmunoglobulinas en las vías respiratorias, se incrementaron gradualmente con el paso del tiempo y se mantenían en niveles altos en el 7mo. día, cuando la replicación viral había cesado. Sin embargo, el tratamiento con una dosis más alta de ambroxol incrementó rápidamente la concentración de estas sustancias y posteriormente alcanzó rápido los niveles pico en el 4to. a 5to. día, pero tales altos niveles no se pudieron mantener durante toda la infección viral . Ésta sería una causa de un bajo efecto inhibidor de la proliferación viral del ambroxol a una dosis de 30 mg/kg/día. Estos resultados indican que el ambroxol promueve la secreción de sustancias inhibitorias y proteasas de tipo tripsina, más que promover la síntesis de estas sustancias en el fluido de las vías respiratorias . Además, se podría reconocer que estas sustancias inhibitorias de la proliferación celular se deberían mantener a niveles - 46 - altos durante 7 días para mejorar el índice de supervivencia de los ratones infectados . La proliferación viral cesó en el 7mo. día (véase la Fig. 2) , pero la inflamación pulmonar se mantuvo e incluso presentó un lento progreso. Recientemente se realizaron una variedad de estudios, los cuales aclararon que el ambroxol posee un efecto antiinflamatorio (Gillissen A, Scharling B, Jaworska M, Bertling A, Rasche K, Schultze-Werninghaus G. , Oxidant scavenger function of ambroxol in vi tro: a comparison with N-acetylcysteine AC, Res. Exp. Med. (Berl . ) , 1997), 196: 389-398) y permite la reducción de la capacidad de producir citocinas inflamatorias (Pfeifer S, Zissel G, ienast K, Muller-Quernheim J., Reduction of cytokine reléase from blood and bronchoalveolar mononuclear cells by ambroxol, Eur.J. Med. Res., 1997, 2: 129-132; Ibbs BF, Schmutzler W, Vollrath IB, Brostharardt P, Braam U, Wolff HH, Zadlo-Klarwasser G., Ambroxol inhibits the reléase of histamine, leukotrienes and cytokines from human leukocytes and mast cells, Inflamm. Res., 1999, 48: 86-93). En este estudio, se reconoció que el ambroxol inhibe los niveles de citocinas inflamatorias o THF-a e IFN-? en el fluido secretado en las vías respiratorias de los ratones infectados, pero el efecto no siempre se observó durante toda la infección viral. Además, se ha reportado que la IL-6 y la IL-12 poseen un efecto de promover el moco inmunitario y en particular se ha - 47 - reportado que la IL-12 tiene un efecto de promover la producción de inmunoglobulina IgA mucosal (Boyaka PN, Marinaro M, Jackson R, Menon ?, Kiyono H, Jirillo E, McGhee JR., IL-12 is an effective adjuvant for induction of mucosal immunity, J. Immunol . , 1999, 162: 122-128). El tratamiento de los ratones infectados con ambroxol incrementó los niveles de IL-6 en BALF en el 4to. y 6to. día e inhibió temporalmente el nivel de IL-12 en el 4to. día. Por otro lado, el ambroxol mostró efectos que son desfavorables para el sistema biodefensivo contra el virus de la influenza, tales como un efecto de incrementar el nivel de las proteasas tipo tripsina y un efecto de inhibición temporal de la liberación de IL-12, pero el tratamiento con ambroxol, en su conjunto, incrementó considerablemente la concentración de factores biológicos que muestran un efecto inhibitorio de la proliferación viral en el fluido secretado en las vías respiratorias y, como resultado, pudo inhibir la proliferación viral en las vías respiratorias para de este modo mejorar significativamente el índice de supervivencia de los ratones infectados por el virus de la influenza. Entre estos, el efecto del ambroxol involucrado en la inhibición de la proliferación del virus de la influenza sería comprobado por el incremento en la concentración de, por ejemplo, SP-A, IPM, IgA e IgG en las vías respiratorias y la inhibición de cualquier liberación de citocinas inflamatorias en las vías - 48 - respiratorias. Estos resultados sugieren que el ambroxol se puede utilizar clínicamente para el tratamiento de sujetos infectados por el virus de la influenza A o para la prevención de infecciones por el virus de la influenza A. En general, existe una tendencia de prevalencia de la influenza y esta prevalencia, en la mayoría de los casos, produce noticias. Por lo tanto, el agente contra la influenza de la presente invención se puede utilizar como agente terapéutico inmediatamente después de informada la prevalencia y también incluso después de la infección. En particular, el agente para el tratamiento de sujetos infectados por el virus de la influenza o la prevención de la infección, de conformidad con la presente invención, se puede aplicar efectivamente al tratamiento o prevención de enfermedades causadas por virus que tienen glucoproteínas de membrana externa e infectan las vías respiratorias, para así sufrir una proliferación, tales como los virus de la influenza . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.