KR20040045429A - 항인플루엔자 약제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암브록솔, 브롬헥신 또는 이들의 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 항인플루엔자 약제를 제공한다. 기도 분비액 중에 포함되는 항인플루엔자 바이러스 작용을 나타내는 생체내 인자의 분비촉진에 의해, 항인플루엔자 작용을 가짐을 특징으로 한다. 인플루엔자 바이러스의 감염을 유발시키는 기도내 프로테아제에 대한 저해물질의 분비촉진을 통해 기도에서의 인플루엔자 바이러스 증식을 억제함을 특징으로 한다. 또한, 점막면역물질인 IgA와 IgG의 분비촉진을 통해 기도에서의 인플루엔자 바이러스 증식을 억제함을 특징으로 한다. 또한 기도 중의 염증성 사이토킨 방출을 억제함을 특징으로 한다. 본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염의 치료제 또는 예방제를 제공한다.
Description
본 발명은 항인플루엔자 바이러스 제제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료제 또는 예방제에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 가장 통상적으로 나타나는 감염 병원체의 하나이며, 특히, 고령자나 소아, 특정한 만성질환을 가진 사람, 면역부전환자에 있어서는 상당한 유병률 및 사망율의 원인이 된다(문헌참조:1, 2).
인플루엔자 바이러스에는 A, B, C형의 3가지 형태가 보고되어 있으며, A형이 광범위하게 만연되어 있고 강한 병원성을 나타내지만, B, C형은 지역적으로 또는 한정되게 만연되어 있고 병원성이 약한 것으로 알려져 있다. 그러나, 감염 기작에 관해서는, 각각 공통의 기작이 존재하고 있다고 사료된다.
문헌참조:
1: Kim HW, Brandt CD, Arrobio JO, Murphy B, Chanock RM, Parrott RH. Influenza A and B virus infection in infants and young children during the years 1957-1976.Am J Epidemiol1979; 109: 464-479.
2: Barker WH, Mullooly JP. Impact of epidemic type A influenza in a defined adult population.Am J Epidemiol1980; 112: 798-813.
인플루엔자 바이러스의 병원성은, 개개의 바이러스 게놈의 다형성과, 주로 바이러스 엔벨로프 당단백질[적혈구 응집소(HA)]이 제한 절단됨으로써 인플루엔자 바이러스의 막 융합활성이 유발되어 바이러스막과 세포막의 융합을 야기시키며, 바이러스 게놈이 세포질 내에 도입되는 것을 허용하는 기도의 숙주세포가 분비하는 트립신형 프로테아제에 의해서 결정된다(문헌참조:3-5).
문헌참조:
3: Klenk HD, Garten W. Host cell proteases controlling virus pathogenicity.Trends Microbiol1980; 2: 39-43.
4: Klenk HD, Rott R. The molecular biology of influenza virus pathogenicity.Adv Virus Res1988; 34: 247-281.
5: Homma M, 0huchi M. Trypsin action on the growth of Sendai virus in tissue culture cells.J Virol1973; 12: 1457-1465.
바이러스 엔벨로프 당단백질의 프로테아제에 의한 절단은, 기도 상피세포의 막상 및/또는 기도강 중에서 일어난다(문헌참조:6, 7).
문헌참조:
6: Kido H, Yokogoshi Y, Sakai K, Tashiro M, Kishino Y, Fukutomi A, Kutunuma N. Isolation and characterization of a novel trypsin-like protease found in rat bronchiolar epithelial Clara cells.J Biol Chem1992; 267: 13573-13579.
7: Tashiro M, Yokogoshi Y, Tobita K, Seto JT, Rott R, Kido H. TryptaseClara, an activating protease for Sendai virus in rat lungs, is involved in pneumopathogenicity.J Virol1992; 66: 7211-7216.
바이러스 엔벨로프 당단백질을 절단하는 프로테아제의 활성은, 상부 기도에 있어서의 점액 프로테아제 억제제(MPI)(문헌참조:8), 및 하부 기도에 있어서의 폐 계면활성 화합물(PS)(문헌참조:9)과 같은 기도 분비액에 포함되는 상기 프로테아제의 내인성 저해성 화합물에 의해서 엄밀히 조절되고 있다. 폐의 PS에 포함되는 계면활성 단백질 A(SP-A)은, 시알산이 부가된 C형 렉틴에 속하며, 이 단백질은 직접 인플루엔자 바이러스 HA와 결합하여, 바이러스의 세포내 침입을 저해한다(문헌참조:10). 기도 분비액에 포함되는 이러한 화합물 외에, 점막 면역시스템이 바이러스의 세포내 침입을 방지하는 주요한 면역학적 방어시스템이고, 구체적으로는 면역글로블린의 IgA 및 IgG의 국소적 분비의 유발이 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어와 밀접하게 연관되어 있다(문헌참조:11-13). 이러한 결과는, 기도 분비액 중에 포함되는 이러한 항바이러스 생체방어물질의 농도가 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 개체의 감염 감수성을 결정하는 것임을 시사한다.
문헌참조:
8: Beppu Y, Imamura Y, Tashiro M, Towatari T, Ariga H, Kido H. Human Mucus protease inhibitor in airway fluids is a potential defensive compound against infection with influenza A and Sendai viruses.J Biochem1997; 121: 309-316.
9: Kido H, Sakai K, Kishino Y, Tashiro M. A pulmonary surfactant is apotential endogenous inhibitor of proteolytic activation of Sendai virus and influenza virus.FEBS Lett1993; 322: 115-119.
10: Benne CA, Kraaijeveld CA, van Strijp JAG, Brouwer E, Harmsen M, Verhoef J, van GoldLMG, van Iwaarden JF. Interactions of surfactant protein A with influenza A viruses: binding and neutralization.J Infect Dis1995; 171: 335-341.
11: Liew FY, Russell SM, Appleyard G, Brand CM, Beale J. Cross-protection in mice infected with influenza A virus by the respiratory route is correlated with local IgA rather thanserum antibody or cytotoxic T cell reactivity.Eur J Immunol1984; 14: 350-356.
12: Tamura S, Funato H, Hirabayash Y, et al. Functional role of respiratory tract haemagglutinin-specific IgA antibodies in protection against influenza.Vaccine1990; 8: 479-485.
13: Wright PF, Murphy BR, Kervina N, Lawrence EM, Phelan MA, Karzon DT. Secretory immunological response after intranasal inactivated influenza A virus vaccinations: evidence for immunoglobulin A memory.Infect Immun1983; 40: 1092-1095.
거담제 또는 객담 용해제로서 알려져 있는 수준(2-아미노-3,5-디브로모-N-[트랜스-4-하이드록시사이클로헥실]벤질아민)은, 만성기관지염 및 신생아 호흡궁박 증후군의 치료에 사용되어 왔다(문헌참조:14).
수준의 약리학적 작용은, 기도의 선(腺) 세포상에서의 점액조절로서, 또한 PS 생산을 증진시키는 약제로서 보고되어 있다(문헌참조:15).
또한, 수준은 항산화 작용(문헌참조:16)이나 기관지 폐포 마크로파지, 단구 및 과립구로부터의 염증성 사이토킨 방출의 감소(문헌참조:17, 18)를 동반하는 항염증 작용을 나타낸다. 그러나, 생체내에서의 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 수준의 작용은 지금까지 거의 알려져 있지 않다.
또한, 브롬헥신(2- 아미노-3,5-디브로모-N-사이클로헥실-N-메틸벤질아민)도 거담제로서 알려져 있으며, 만성기관지염의 치료에 사용되어 왔다. 그렇지만, 생체내에서의 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 브롬헥신의 작용은 지금까지 거의 알려져 있지 않다.
문헌참조:
14: Germouty J, Jirou-Najou J. Clinical efficacy of ambroxol in the treatment of bronchial stasis.Respiration1987; 51: 37-41.
15: Heath MF, Jacobson W. The inhibition of lysosomal phospholipase A from rabbit lung by ambroxol and its consequences for pulmonary surfactant.Lung1985; 163: 337-44
16: Gillissen A, Scharling B, Jaworska M, Bertling A, Rasche K, Schultze-Werninghaus G. Oxidant scavenger function of ambroxol in vitro: a comparison with N-acetylcysteine AC.Res Exp Med(Berl)1997; 196: 389-398.
17: Pfeifer S, Zissel G, Kienast K, Muller-Quernheim J. Reduction ofcytokine release from blood and bronchoalveolar mononucler cells by ambroxol.Eur J Med Res1997; 2: 129-132.
18: Gibbs BF, Schmutzler W, Vollrath IB, Brostharardt P, Braam U, Wolff HH, Zadlo-Klarwasser G. Ambroxol inhibits the release of histamine, leukotrienes and cytokines from human leukocytes and mast cel1s.Inflamm Res1999; 48: 86-93.
도 1은, 암브록솔이 인플루엔자 A 바이러스 감염 마우스의 생존율을 상승시키는 것을 도시하는 도면이다.
도 2는, BALF 중의 바이러스 증식에 대한 암브록솔의 억제작용(A), 및 감염후 4일째의 마우스에 있어서의 육안적 폐병변을 도시하는 도면이다.
도 3은, 비감염 마우스군(A) 및 인플루엔자 A 바이러스 감염 마우스군(B)의 BALF에서의 점막면역 IgA 농도에 대한 암브록솔의 자극작용을 도시하는 도면이다.
도 4는, 비감염 마우스군(A) 및 인플루엔자 A 바이러스 감염 마우스군(B)의 BALF에서의 점막면역 IgG 농도에 대한 암브록솔의 자극작용을 도시하는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 양태
본 발명에서 사용하는 암브록솔(2-아미노-3,5-디브로모-N-[트랜스-4-하이드록시사이클로헥실]벤질아민)에 관해서, 화학식 1의 암브록솔의 염산염〔일반명: 염산암브록솔(Ambroxol Hydrochloride), 화학명: 트랜스-4-[(2-아미노-3,5-디브로모벤질)아미노]사이클로헥산올 하이드로클로라이드〕은, 거담제 또는 객담 용해제로서 독일을 비롯한 세계 각국에서 널리 임상 응용되고 있는 약제이며, 상기한 바와 같이 만성기관지염 및 신생아 호흡궁박 증후군의 치료에 사용되어 왔다.
또한, 본 발명에서 사용하는 브롬헥신(2-아미노-3,5-디브로모-N-사이클로헥실-N-메틸벤질아민)에 관해서, 화학식 2의 브롬헥신의 염산염〔일반명: 염산브롬헥신(Bromhexin Hydrochloride), 화학명: 2-아미노-3,5-디브로모-N-사이클로헥실-N-메틸벤질아민 하이드로클로라이드〕은, 거담제로서 독일을 비롯한 세계 각국에서 널리 임상 응용되고 있는 약제이며, 상기한 바와 같이 만성기관지염의 치료에 사용되어 왔다.
본 발명의 예방제 및 치료제에 있어서의 바이러스 질환으로서는, 외막 당단백질을 갖는 바이러스에 의해 기도부에서 감염 발증(發症)하는 것이면 양호하며, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 레스피라토리 신시셜바이러스(Respiratory Syncytial Virus), 홍역 바이러스 또는 뭄프스(mumps) 바이러스를 원인으로 하는 질환을 들 수 있다.
본 발명의 항인플루엔자 바이러스 제제는, 통상의 약제학적 조성물과 같이 정제, 산제, 세립제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 트로키제, 츄어볼제 등의 경구고형제제 및 에릭실제, 시럽제(드라이 시럽도 포함한다) 등의 액제 등의 형태로 투여할 수 있다. 또한, 경구투여에 적합하지 않거나 국소투여를 선택함으로써 보다 조기에 보다 확실한 약효가 요구되는 경우에는, 종래에 사용되고 있는 액제주입, 미스트 분무나 네블라이저 주입법 및 스핀할러(spinhaler) 또는 디스크할러(diskhaler)를 사용한 분말흡입기(dry powder device; DPD)나 정량분무식흡입기(metered dose inhaler; MDI) 등의 방법으로 투여된다. 이러한 경우, 편리성, 확실성, 효율 등의 점을 고려하여 선택된다.
복용 및 투여 용량은 제제형태에 의해서 적절하게 조정할 수 있다.
정제 등의 경구고형제제, 경구액제 등으로서 1일 복용량을 1회 내지 수회로 나누어 복용할 수 있다. 또한, 예를 들어 시럽이나 트로키, 츄어볼정 등의 유아용으로서, 국소에서 작용시킴과 동시에 내복에 의한 전신성 작용도 발휘시키는 제제형태로서는 1일 복용량의 1/2 내지 1/10를 1회 양으로서 배합하여 복용하면 양호하며, 이 경우 전체 복용량이 1일 양을 만족시키지 않아도 양호하다. 반대로, 제제형태를 고려하여 무리한 복용 용량이 되지 않는다면 1일 복용량에 상당하는 양을 1회분으로서 배합할 수 있다. 또한, 국소적용을 목적으로 하는 액제주입제나 미스트 분무제, 네블라이저 주입법, 분말흡입법 등에 의한 경우는, 내복용 경구제 투여량의 1/10 내지 1/100로 조제하여 사용할 수 있다.
제제의 조제에 있어서는, 통상적으로 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 붕괴제, 표면활성제, 윤택제, 코팅제, 서방화제 등 희석제나 부형제를 사용할 수 있다. 기타, 필요에 따라서 용해보조제, 완충제, 보존제, 가용화제, 등장화제, 유화제, 현탁화제, 분산제, 증점제, 겔화제, 경화제, 흡수제, 점착제, 탄성제, 가소제, 흡착제, 향료, 착색제, 교미제, 항산화제, 보습제, 차광제, 광택제, 대전방지제 등을 사용할 수 있다.
보다 구체적으로는, 부형제로서, 유당, 옥수수녹말, 만니톨, D-솔비톨, 결정셀룰로스, 에리트리톨, 백당 등, 결합제로서는 하이드록시프로필셀룰로스(HPC-L),하이드록시프로필메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로스, α화 전분 등, 붕괴제에는 카르복시메틸셀룰로스칼슘, 크로스카르복시메틸셀룰로스나트륨, 가교화 폴리비닐피롤리돈 등, 윤택제로서는 스테아르산마그네슘, 활석 등이다. 또한, 향료로서는 1-멘톨, 바닐린, 레몬유, 계피유, 박하유 등의 플레이버나 방향유를 들 수 있으며, 흡착제에는 합성 규산알루미늄, 경질 무수 규산 등을 배합할 수 있다. 또한, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등 통상적으로 사용되는 코팅제로 코팅제제로 할 수도 있다. 또한, 필요한 경우, 특히 트로키제나 시럽제, 츄어볼제 등에 있어서는 감미제를 사용할 수 있다. 즉, 만니톨, 포도당, 맥아당, 물엿, 맥아 추출물, 말티톨, 솔비톨, 백당, 흑설탕, 과당, 유당, 벌꿀, 크실리톨, 감차, 사카린, 아스파틸페닐알라닌에스테르 등이나 기타 말토올리고당, 말토실슈크로스, 환원 이소말티로스, 라피노스등의 올리고당 등을 들 수 있다. 이들을 사용한 제제화는, 그 제제형태에 따라 해당 분야에서 공지되어 있는 방법, 관용적인 방법 및 통상적인 방법 중 어느 한 방법에 의해 실시할 수 있다.
산제, 세립제, 과립제 등의 분립체 제제(정량분무흡입기(MDI)나 분말흡입기(DPD) 등도 포함한다)에서는 비산성, 부착성 등의 성상을 고려하여 적절하게 목적으로 하는 제제를 조제할 수 있으며, 예를 들면, 분체의 부피, 비산성, 부착성, 흡습성, 대전성, 습윤성, 용해성 등의 물성, 입자의 입도(입자 직경), 표면적, 형상 등의 성질을 고려하여 제제를 이루는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 분말흡입법에서는 약품을 효율적으로 질환부에 도달시키기 위해서 약제성분의 입자직경에 주의해야 한다고 되어 있으며, 가장 적합한 입자직경은 0.5 내지 5.0㎛이라고 되어 있다. 또한, 취급의 편리함이나 흡습, 분해, 변질, 변색 등의 방지도 고려하여 조제하는 것이 바람직하다. 분말의 조제에는 분쇄방법으로서, 건식분쇄법, 습식분쇄법, 저온분쇄법, 제트분쇄법, 회분식분쇄법, 연속개회로분쇄법, 연속폐회로분쇄법, 등의 종래에 사용되고 있는 방법으로부터 적절하게 선택하거나, 그 목적에 따라서 이들을 조합하여 실시할 수 있다.
암브록솔 및 브롬헥신은, 기도 내의 항바이러스 인자의 분비촉진효과에 의해 기도에서의 인플루엔자 바이러스 증식을 억제하는 작용이 확인된다. 암브록솔 작용은, SP-A, MDI, IgA, IgG 등의 바이러스증식 저해물질의 기도내 농도의 상승, 또한 기도 분비액 중으로의 염증성 사이토킨 방출의 억제에 의해서 설명될 것이다.
본원 발명에 대한 상세한 것을 실시예로 설명한다. 본원 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 제한되지 않는다.
본 발명은, 항산화작용이 있으며, PS의 방출을 촉진시키는 객담 용해제인 수준 및/또는 브롬헥신의 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어효과를 사용하여 항인플루엔자 바이러스 제제, 즉, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료제 또는 예방제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 수준, 브롬헥신 또는 이들의 약리학적으로 허용될 수 있는 염을 유효성분으로 하는 항인플루엔자 약제를 요지로 하고 있다.
기도 분비액 중에 포함되는 항인플루엔자 바이러스 작용을 나타내는 생체내 인자(생체방어 물질군)의 분비촉진에 의해, 항인플루엔자 작용을 가짐을 특징으로 하고 있으며, 그 경우, 본 발명은 수준, 브롬헥신 또는 이들의 약리학적으로 허용될 수 있는 염을 유효성분으로 하며, 기도 분비액 중에 포함되는 항인플루엔자 바이러스 작용을 나타내는 생체내 인자의 분비촉진에 의해, 항인플루엔자 작용을 가짐을 특징으로 하는 항인플루엔자 약제를 요지로 하고 있다.
인플루엔자 바이러스의 감염성을 유발시키는 기도내 프로테아제에 대한 저해물질, 또한 점막면역물질의 IgA나 IgG의 분비촉진을 통해 기도에서의 인플루엔자 바이러스 증식을 억제하는 것을 특징으로 하고 있으며, 그 경우, 본 발명은 암브록솔, 브롬헥신 또는 이들의 약리학적으로 허용될 수 있는 염을 유효성분으로 하며, 기도 분비액 중에 포함되는 항인플루엔자 바이러스 작용을 나타내는 생체내 인자로서의 MPI나 PS, 또한 점막면역물질의 IgA나 IgG의 분비촉진에 의해 인플루엔자 바이러스 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 항인플루엔자 약제를 요지로 하고 있다.
또한 기도중의 염증성 사이토킨 방출을 억제하는 것을 특징으로 하며, 그 경우, 본 발명은 암브록솔, 브롬헥신 또는 이들의 약리학적으로 허용될 수 있는 염을 유효성분으로 하며, 기도 분비액 중에 포함되는 항인플루엔자 바이러스 인자로서의 MPI나 PS, 또한 점막면역물질의 IgA나 IgG의 분비촉진에 의해 인플루엔자 바이러스 증식을 억제하는 것, 또한 기도 중으로의 염증성 사이토킨 방출을 억제하는 것을 특징으로 하는 항인플루엔자 약제를 요지로 하고 있다.
본 발명의 항인플루엔자 약제는 인플루엔자 바이러스 감염의 치료제 또는 예방제이다.
본 발명은, 또한, 항인플루엔자 약제를 제조하기 위한 암브록솔, 브롬헥신 또는 이들의 약리학적으로 허용될 수 있는 염의 사용을 제공한다.
본 발명은, 또한, 인플루엔자 바이러스에 감염된 환자에게 암브록솔, 브롬헥신 또는 이들의 약리학적으로 허용될 수 있는 염을 유효성분으로 하는 항인플루엔자 약제를 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 치료방법을 제공한다.
≪개요≫
항산화 특성이 있으며, 또한 PS의 방출을 자극하는 해담 용해제인 암브록솔의 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어작용을 마우스에 있어서 연구하였다.
치사량의 인플루엔자 A/Aichi68(H3N2) 바이러스를 비강내에 감염시킨 다음에, 마우스에게 암브록솔 또는 부형제를 1일 2회 복강내 투여하고 생존율, BALF 중의 바이러스 역가, 사이토킨 및 BALF 중의 항바이러스 인자, 즉 점막면역 IgA 및 IgG 및 PS 및 MPI의 농도를 분석하였다.
암브록솔은 바이러스 증식을 유의적으로 억제하여 마우스의 생존율을 현저하게 개선시켰다. 생존율의 측정에 있어서, 암브록솔의 작용은 10mg/kg/일에서 최대에 도달하며, 그것보다 높은 용량에서는 효과는 작아졌다. 그러나, 높은 용량의 경우에도, 대조군으로서 사용한 생리식염수 투여군보다는 생존율이 개선되었다. 인플루엔자 바이러스 감염은 기도 분비액 중의 항바이러스 인자 및 염증성 사이토킨을 유발시키고, 암브록솔은 이러한 항바이러스 인자군의 방출을 더욱 촉진시키지만, 그것은 또한 바이러스 증식을 조장하는 트립신형 프로테아제의 방출도 촉진시켰다. 또한, 암브록솔은 일과성으로 사이토킨, 즉, 종양괴사 인자-α(TNF-α), 인터페론-γ(IFN-γ), 인터류킨-2(IL-2)의 기도액 중으로의 방출을 억제하였다.
암브록솔에는 생체 내에서의 바이러스 증식에 관여하는 몇개의 부정적인 작용을 인정하지만, 전체적으로는 바이러스 증식을 억제하는 기도내 물질군의 수준을 현저히 상승시키고, 인플루엔자 바이러스 감염의 유효한 치료로서의 임상적용을 시사하고 있다.
치사량의 마우스 적응형 인플루엔자 바이러스 A/Aichi/68(H3N2)의 비강내 감염 후의 마우스에 대한 암브록솔의 작용을 시험하고, 생존율, 바이러스 역가 및 기도 분비액 중의 바이러스 증식과 트립신형 프로테아제, MPI, PS, IgA, IgG 및 사이토킨의 수준을 시험하였다.
≪대상과 방법≫
1) 동물 및 대상
특이 병원이 없는 수컷, 생후 3주간, 체중 8-10g의 oddY 마우스를 기관[JapanSLC Inc.(시즈오카, 일본)]으로부터 구입하였다. 마우스는 모두 도쿠시마대학의 동물실험 가이드 라인에 근거하여 실시하였다. 암브록솔은 베링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim)으로부터 공급되었다. 돼지 췌장 트립신을 시그마(Sigma)에서 구입하였다. 마우스 적응 인플루엔자 A/Aichi/68(H3N2) 바이러스(문헌참조:19)는 알 연령 10일의 유배란에 있어서 증식시킨 다음에 사용하였다.
문헌참조:
19: Ovcharenko AV, Zhirnov OP. Aprotinin aerosol treatment of influenza and paramyxovirus bronchopneumonia of mice.Antiviral Res.1994; 23: 107-118.
2) 바이러스 감염과 암브록솔의 투여방법
에테르 마취하에서, 마우스를 6.6×104플라크 형성단위(PFU)의 인플루엔자 A/Aichi/68(H3N2) 바이러스를 투여량 20㎕으로 비강내 감염시켰다. 감염 직후의 10 내지 15분 이내에, 10마리로 이루어지는 1군에게 복강내(i.p.)에 식염수에 섞은 암브록솔 200㎕을 각각 2, 5, 10, 15mg/kg 체중으로 투여하였다. 이후 동일한 투여를 1일 2회, 7-10일간 실시하였다. 기도 분비액 중의 여러 가지 화합물 및 소정의 병리학적 변화를 분석하기 위한 실험에서는, 0, 10, 30mg/kg/일의 암브록솔로 치료하는 3군의 동물을 선택하였다. 각 군에 80마리의 동물을 사용하였다. BALF 중의 바이러스 수준은, 보고한 바와 같이(문헌참조:20) 면역형광 세포계수법(immurofluorexant cell-counting method)에 의해서 측정하였다.
문헌참조:
20: Tashiro M, Homma M. Pneumotropism of Sendai virus in relationtion to proteasemediated activation in mouse lungs.Infect Immun1983; 39: 879-888.
3) BALF의 조정
1군 80마리의 마우스는 암브록솔로 치료한 군, 또는 치료하지 않은 군, 또는 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 군 또는 감염시키지 않은 군으로서, 1군 80마리의 마우스를 사용하였다. 각 군으로부터 매일 적어도 5마리의 마우스를 선택하여, 마우스로부터 BALF〔Singh 등의 방법(문헌참조:21)에 의해〕를 7일간 매일 채취하였다. BALF는 사용할 때까지 -80℃에서 보존하였다.
문헌참조:
21: Singh G, Katyal SL. An immunologic study of the secretory products of rat clara cells.J Histochem Cytochem1984; 32: 49-54
4) BALF 중의 SP-A, 사이토킨 및 면역 글로블린의 측정
마우스와 래트의 SP-A의 아미노산 배열에는 95%의 동일성이 있으며 (문헌참조:22, 23), 분리된 래트 SP-A에 대한 폴리클로날 항체가(문헌참조:6, 24) 마우스 SP-A에 반응하였다. 그래서, 마우스의 BALF 중의 SP-A 농도를 비 비오틴화와 비오틴화된 래트의 SP-A에 대한 특이항체를 사용한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 시스템을 작성하여, 마우스 SP-A를 표준검량선 물질로서 분석하였다. BALF 중의 사이토킨〔TNF-α, IL-2, IFN-γ, 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-4(IL-4)〕의 수준은 ELISA 키트(Bio-source Internaitonal, CA, USA)를 사용하며, 제조원의 프로토콜에 근거하여 측정하였다. BALF 중의 IgG 및 IgA의 수준도 ELISA 키트(Bethyl, TX, USA)를 사용하여 측정하였다. 490nm 또는 450nm에서의 흡광도를 면역 미니 NJ-2300 다중플레이트-판독기에 의해서 읽어냈다.
문헌참조:
21: Singh G, Katyal SL. An immunologic study of the secretory products of rat clara cells.J Histochem Cytochem1984; 32: 49-54.
22: Korfhagen TR, Bruno MD, Glasser SW, et al. Murine pulmonary surfactant SP-A: gene cloning, sequence, and transcripitional activity.Am J Physiol.1992; 263: L546-554.
23: Lacaze-Masmonteil T, Fraslon C, Bourban J, Raymondjean M, Kahn A. Characterization of the rat pulmonary surfactant protein A promoter.Eur J Biochem1992; 206: 613-623.
24: Sakai K, Kweon MN, Kohri T, Kishino Y. Effects of a pulmonary surfactant and surfactant protein A on phagocytosis of fractionated alveolar macrophages: relationship to starvation.Cell Mol Biol1992; 38: 123-130.
5) 효소 및 억제제 측정
트립신형 프로테아제 활성의 측정은 이미 서술한 바와 같이 (문헌참조: Kido H, Yokogoshi Y, Sakai K, Tashiro M, Kishino Y, Fukutomi A, Kutunuma N. Isolation and characterization of a novel trypsin-like protease found in rat bronchiola epithelial Clara cells. J Biol Chem 1992; 267: 13573-13579.), 인플루엔자 바이러스 HA의 절단부위 인식공통배열(consensus cleavage motif)과 유사한 N-3급-부톡시카보닐-Gln-Ala-Arg-4-메틸-쿠마릴-7-아미드를 기질로서 사용하여 분석하였다. BALF 중에서의 인플루엔자 바이러스의 HA 절단 프로테아제 저해물질의 90%를 나타내는 MPI(문헌참조:25,26)의 저해활성은, 아래와 같이 분석하였다. 산과 열에 안정적인 MPI의 성질을 이용하여, MPI를 5%(v/v) 과염소산으로 처리하여 대부분의 단백질을 원심제거한 BALF의 상등액을 채취하며, 또한 100℃에서 10분간 끓인다. 그 후 상등액을 1500xg에서 15분간 원심분리하고, 4M KOH로 pH 7.0으로 조정하여 상등액의 프로테아제 저해활성을 이미 서술한 바와 같이 분석했다(문헌참조: Beppu Y, Imamura Y, Tashiro M, Towatari T, Ariga H, Kido H. Human Mucusprotease inhibitor in airway fluids is a potential defensive compound against in fection with influenza A and Sendai viruses. J Biochem 1997; 121: 309-316.).
문헌참조:
25: Stolk J, Rossie W, Dijkman JH. Apocynin improves the efficacy of a secretory leukocyte protease inhibitor in experimental emphysema.Am J Respir Crit Care Med1994; 150: 1628-1631.
26: 0hlsson K, Tegner H, Akesson U. Isolation and partial characterization of a low molecular weight acid stable protease inhibitor from human bronchial secretions. Hoppe Seylers Z Phusiol Chem 1977; 358: 583-589.
≪통계≫
모든 값은 평균치±SD로 나타내었다. 암브록솔로 치료한 군과 치료하지 않은 대조군과의 유의적인 차는, 쌍을 이룬 스튜던트 t-시험(paired Student'st-test)을 사용하여 평가하고,P<0.05의 값을 유의적이라고 간주하였다
≪결과≫
1) 암브록솔은 인플루엔자 바이러스 감염 마우스의 생존율을 현저하게 개선시켰다.
암브록솔이 인플루엔자 A/Aichi/68(H3N2) 바이러스 감염 마우스의 생존율을상승시키는 것을 도 1에 도시한다. 도 1중, 마우스는 6.6 × 104PFU의 인플루엔자 A/Aichi/68(H3N2) 바이러스로 감염시킨 다음 식염수(●), 암브록솔4(▲), 10(■), 20(△), 30(□)mg/kg/일을 복강내에 주입하였다. 각 군의 마우스(10마리)의 생존율을 10일간 분석하였다.
상기한 바와 같이 암브록솔은 폐 및 기관지로의 PS의 분비를 자극하고, 또한 항산화작용과 항염증 특성을 나타내는 것이 이미 보고되어 있다. 이러한 소견을 활용하여 감염력과 진행성이 강한 인플루엔자 A/Aichi/68(H3N2) 바이러스를 감염시킨 마우스에 대한 암브록솔의 작용을 분석하였다. 체중 8-10g의 마우스에게 치사량에 상당하는 인플루엔자 A 바이러스를 비강내 감염시켜, 다양한 용량의 암브록솔을 1일 2회 복강내에 주사하였다. 암브록솔 자체는 30mg/kg/일까지는 아무런 독성도 나타내지 않았다.
바이러스 감염후, 2일째부터 체중의 유의적인 감소가 확인되며, 암브록솔 치료를 실시하지 않은 전체 예(n=10)가 10일 이내에 사망하였다. 암브록솔 치료군에서는, 용량에 의존하여 감염 마우스의 생존율이 개선되며, 용량 10mg/kg/일에서 피크이지만, 그 이상의 용량에서는 생존율의 개선효과는 적었다(도 1). 마우스를 용량 10mg/kg/일의 암브록솔로 치료하면, 감염 마우스의 반수가 치사 감염임에도 불구하고 생존하였다.
2) 암브록솔 치료군에서는 바이러스의 증식이 억제되었다.
BALF 중의 바이러스 증식에 대한 암브록솔의 억제작용(A), 및 감염후 4일째의 마우스에 있어서의 육안적 폐병변을 도 2에 도시한다.
A: 각 군의 마우스(80마리)를 인플루엔자 A/Aichi/68(H3N2) 바이러스에 감염시키고, 그 후 도 1의 설명에 서술한 바와 같이, 식염수(●), 암브록솔 10(△) 및 30(▲)mg/kg/일로 치료하였다. 감염 및 치료후, 5마리의 생존 마우스의 BALF를 7일간 매일 채취하였다. BALF의 바이러스 역가를 상기의 면역형광 세포계수법(문헌참조:20)에 의해서 측정하고 세포감염단위(cell infecting unit, CIU)로 나타내었다. 데이터는 평균치±SD(n=5)로서 표현하였다. 스튜던트 t-시험에 의해, 식염수와 암브록솔로 치료한 마우스에 관한 값 사이에서의 유의차를 검정하였다. *P<0.01.
B: 비감염군 4일째에서의 마우스의 폐(n=5)(1), 인플루엔자 바이러스에 감염시키고 식염수로 치료한 군의 폐(2), 인플루엔자 바이러스에 감염시키고 암브록솔10(3), 30(4)mg/kg/일로 치료한 군에서의 마우스의 육안적 폐병변.
암브록솔에 의한 감염 마우스의 생존율 개선의 근저에 있는 기작을 분석하기 위해서, 면역형광 세포계수법에 의해서 BALF 중의 바이러스가(價)를 측정하였다.
마우스에게 인플루엔자 A 바이러스를 비강내에 감염시키고, 2일이 경과한 시점에서 BALF 중의 바이러스 역가는 증가하기 시작하여 5일째에서 최대에 도달, 6일째 이후 BALF 중의 바이러스 역가는 급속히 감소하여 7일째에서 감염 2일째에 상당하는 역가에까지 감소하였다. 이것은 필시 숙주의 면역학적 반응의 결과로 추정된다(도 2A). 용량 10mg/kg/일에서의 암브록솔 치료군에서는, 바이러스 증식을 유의적으로 억제시켰지만, 용량 30mg/kg/일의 처리군에서의 효과는 그것보다 작았다.감염후 4일째의 폐의 병리학적 변화, 육안적 폐병변을 분석했다(도 2B). 감염 마우스에서는 발적을 동반하는 폐에 중도(重度)의 광범위한 간장형 병변이 관찰되었다. 용량 10mg/kg/일의 암브록솔 치료군에서는 병리학적 변화는 현저하게 감소되고, 용량 30mg/kg/일에서의 병변억제효과는 그것보다도 작았다.
감염 마우스의 바이러스 증식은 7일째에서 거의 정지하며, 바이러스는 기도로부터 배제되었지만, 폐의 병리학적 변화는 그 다음에도 경도(輕度)의 진행을 동반하며 계속되어 동물은 10일 이내에 사망하였다. 감염 마우스의 생존율의 개선 및 바이러스증식 억제효과에서의 암브록솔의 작용기작을 해명하기 위해서, 인플루엔자 바이러스의 복제를 조절하는 BALF 중의 여러 가지 세포인자 및 염증성 사이토킨에 대한 암브록솔의 작용을 분석하였다.
3) 기도 분비액 중에서의 인플루엔자 바이러스 복제의 촉진인자와 억제인자의 농도에 대한 암브록솔의 작용.
트립타제 클라라(Tryptase Clara)와 같은 기도에 분비되는 트립신형 프로테아제는, 인플루엔자 바이러스의 HA를 HA1과 HA2로 절단하고, 그 결과, 바이러스막 융합활성 및 바이러스 복제를 촉진시킨다(문헌참조:6, 7). 이러한 프로테아제 활성은, MPI(문헌참조:8) 및 PS(문헌참조:9)와 같은 내인성 저해물질에 의해서 억제된다. 따라서, 이러한 저해물질의 BALF 중의 농도에 대한 암브록솔의 작용을 분석하여, 결과를 표 1(인플루엔자 A 바이러스 감염 마우스의 BALF에서의 트립신형 프로테아제 활성, PS 및 MPI에 대한 암브록솔의 작용)에 기재한다.
트립신형 프로테아제는, 통상적으로 비감염 마우스 및 래트에 있어서 기도내의 프로테아제 저해물질보다도 많이 분비되고 있어 인플루엔자 바이러스는 항상 감염될 수 있는 상태에 있다(문헌참조:6, 9). 인플루엔자 바이러스를 감염시키면, 트립신형 프로테아제의 농도는, 6일째를 피크로 하여 약 6.4배 증대하였다. 용량 10mg/kg/일에서의 암브록솔 치료를 한 군에서는, 1일째부터 프로테아제의 분비증가가 유발되며, 5일째에서 피크에 도달하였다. 용량 30mg/kg/일의 암브록솔 투여군에서는 또한 이의 수준이 상승하였지만, 피크는 4일째로 빨라지며, 그 후 급속히 저하되는 경향을 나타내었다. 감염되지 않은 마우스에 있어서도, BALF 중의 트립신형 프로테아제는 암브록솔에 의한 분비촉진이 확인된다(표 2). 용량 10 및 30mg/kg/일의 암브록솔 투여군은 4일째를 피크로 하여, 각각 2.2배 및 2.4배 트립신형 프로테아제 수준을 상승시켰다.
SP-A 및 MPI의 수준에 대한 암브록솔의 작용을 분석하였다〔표 1 및 표 2(인플루엔자 바이러스 감염군, 및 감염이 없는 군에서의 마우스 BALF의 트립신형 프로테아제 활성, PS 및 MTI에 대한 암브록솔의 작용)〕.
인플루엔자 바이러스 감염은 이러한 항인플루엔자 활성을 갖는 생체방어물질의 SP-A, MPI의 분비를 6일째를 피크로 하여 각각 6배 및 4.4배 증대시켰다. 감염 마우스군에서의 암브록솔에 의한 치료는 MPI 및 SP-A의 농도를 투여한 후 1일째부터 급격하면서 현저하게 증가시키고, 피크치에서 각각 베이스 농도의 9-10배 및 8.4배까지 증가시켰다. 감염 마우스를 10mg/kg/일의 암브록솔에 의해 치료한 군에서는, MPI 및 SP-A의 수준은 1일째에 급격하게 증가된 후에도 농도는 서서히 상승하여 5일째를 피크로 하여 7일째까지 높은 농도로 유지되었다. 그러나, 마우스를암브록솔 30mg/kg/일로 치료한 결과, 1일째에 급격하게 증가된 다음, 4일째를 피크로 하여 그 후 급속히 소실되었다. 비감염 마우스군의 SP-A 및 MPI의 분비에 대해서도 암브록솔은 경도이지만 분비촉진작용이 관찰되었다.
4) 암브록솔은 점막면역 IgA 및 IgG의 분비를 촉진시킨다.
다음에, BALF 중의 점막면역 IgA 및 IgG의 분비에 대한 암브록솔의 작용을 분석하였다(도 3 및 도 4).
비감염 마우스군(A) 및 인플루엔자 A 바이러스 감염 마우스군(B)의 BALF에서의 점막면역 IgA 수준에 대한 암브록솔의 분비촉진작용을 도 3에 도시한다. 도면 중, 식염수(흰 막대), 암브록솔 10mg/kg/일(검은 막대), 30mg/kg/일(사선 막대)에 의해서 치료한 비감염군(A) 및 감염군(B) 마우스의 BALF에서의 IgA 수준을 7일간 측정하였다. 데이터는 평균치±SD(n=5)로서 나타내었다. 스튜던트 t-시험에 의해, 식염수와 암브록솔로 치료한 마우스에 관한 값 사이에서P<0.05, **P<0.01.
비감염 마우스군(A) 및 인플루엔자 A 바이러스 감염 마우스군(B)의 BALF에서의 점막면역 IgG 수준에 대한 암브록솔의 분비촉진작용을 도 4에 도시한다. 도면 중, 식염수(흰 막대), 암브록솔 10mg/kg/일(검은 막대), 30mg/kg/일(사선 막대)에 의해서 치료한 비감염군(A) 및 감염군(B) 마우스의 BALF에서의 IgG 수준을 7일간 측정하였다. 데이터는 평균치±SD(n=5)로 나타내었다. 스튜던트t-시험에 의해 식염수와 암브록솔로 치료한 마우스에 관한 값 사이에서 *P<0.05.
인플루엔자 바이러스의 비강내 접종은, 점막면역 IgA 및 IgG의 분비를 두드러지게 촉진시키고, 이러한 항체의 수준은 바이러스 증식억제의 정도와 상관관계가 있다고 생각되고 있다(문헌참조: Liew FY, Russell SM, Appleyard G, Brand CM, Beale J. Cross-protection in mice infected with influenza A virus by the respiratory route is correlated with local IgA rather than serum antibody or cytotoxic T cellreactivity. Eur J Immunol 1984; 14: 350-356., Tamura S,Funato H, Hirabayash Y, et al. Functional role of respiratory tract haemagglutinin-specific IgA antibodies in protection against influenza. Vaccine 1990; 8: 479-485.).
비감염 마우스군의 BALF 중의 IgA의 농도는 10.3±6.6ng/ml로 대단히 낮으며, 한편 필시 혈청으로부터 기도 분비액 중으로 확산되었기 때문이라고 생각되는 IgG의 농도는 460±26.2ng/ml로 비교적 높았다(도 3A 및 도 4A). 비감염 마우스군의 10 및 30mg/kg/일의 암브록솔에 의한 치료는, IgA의 분비를 촉진시켜 7일째 및 5일째에서의 농도를 각각 약 10배 상승시키고, IgG의 농도도 7일째와 6일째에서 약 1.2배로 약간 상승시켰다. 마우스를 인플루엔자 바이러스에 감염시키면, BALF 중의 IgA 및 IgG 농도는 1-2일 후부터 두드러지게 상승하여, 7일째에 IgA 수준은 약 400배, IgG는 6일째에 11배로 상승하여 피크에 도달하였다(도 3B 및 도 4B). 감염 마우스의 10 및 30mg/kg/일의 암브록솔에 의한 치료에 의해서, IgA의 수준은 각각 7일째에 베이스 농도의 약 600배, 5일째에 700배로 유의적으로 상승하였다. 10 및 30mg/kg/일의 암브록솔 치료는, 감염 마우스에 있어서의 IgG의 분비를 중도(中度)로 자극하여, 각각 6일째에 약 16배, 5일째에 15배에 촉진시켰다. 이러한 결과는, 감염에 의해서 유발된 점막면역 IgA 분비의 암브록솔에 의한 현저한 촉진과, IgG 분비의 중도 촉진이 이루어졌기 때문이라고 추정된다. 따라서, 이러한 면역 글로블린 수준의 상승도 기도에 있어서의 바이러스의 증식억제효과의 한가지 원인으로 추정되었다.
5) 사이토킨 방출에 대한 암브록솔의 작용
암브록솔이 시험관내에서 TNF-α, IL-2, IL-1, IL-4, IL-13 및 IFN-γ 등의 염증성 사이토킨의 방출을 억제하는 것이 보고되어 있다(문헌참조: Pfeifer S, Zissel G, Kienast K, Muller-Quernheim J. Reduction of cytokine release from blood and bronchoalveolar mononuclear cells by ambroxol. Eur J Med Res 1997; 2: 129-132., Gibbs BF, Schmutzler W, Vollrath IB, Brostharardt P, Braam U, Wolff HH, Zadlo-Klarwasser G. Ambroxol ihibits the release of histamine, leukotrienes and cytokines from human leukocytes and mast cells. Inflamm Res 1999; 48: 86-93.). 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스에서의 암브록솔의 항염증작용을 측정하기 위해서, 발명자들은 염증성 사이토킨의 TNF-α, IL-4 및 IFN-γ, IL-6와 IL-12와 같은 점막면역을 조장하는 사이토킨(문헌참조: Boyaka PN, Marinaro M, Jackson R, Menon S, Kiyono H, Jirillo E, McGhee JR. IL-12 is an effective adjuvant for induction of mucosal immunity. J Immunol 1999; 162: 122-128.)의 수준을 분석하여, 그 결과를 표 3(인플루엔자 A/Aichi/68(H3N2) 바이러스 감염 마우스의 BALF에서의 사이토킨의 TNF-α, IL-12, IFN-γ, IL-6에 대한 암브록솔의 작용)에 기재하였다.
비감염 마우스의 BALF 중의 사이토킨은, 모두 검출 한계를 하회하고 있었다. 인플루엔자 바이러스를 감염시키면, 시간 경과의 패턴은 다르지만, IL-4을 제외한 모든 시험한 사이토킨의 BALF 중으로의 분비를 유의적으로 유발시켰다. 구체적으로는, 인플루엔자 바이러스를 감염시키면, TNF-α이 처음에 상승하여, 1일째에서 피크에 도달, 그 후 급속히 저하되어 6일째에 제2의 작은 피크에 도달하였다. IL-6의 수준도 감염후 1일째에서 급속히 상승하여 그 수준은 높은 채로 유지되며, 5일째에 피크가 되지만, 그 후 7일째에 급속히 저하되기 시작하였다. IL-12 및 IFN-γ의 농도는 암브록솔 투여후 서서히 상승하여, 각각 4일째와 6일째에 피크가 되었다. 그러나, 감염 마우스의 BALF 중의 IL-4는 감염되어 있는 7일 동안에도 검출되지 않았다(데이터 미표시). 감염 마우스의 암브록솔에 의한 치료에는, 3-5일째에서의 TNF-α, 1일째에서의 IFN-γ, 4일째에서의 IL-12의 방출에 대한 억제효과를 확인하였지만, 암브록솔로 치료하고 있는 동안에는 이의 억제효과는 항상 확인된 것은 아니었다. 이에 반해, 암브록솔에 의한 치료에서는, 감염 마우스의 BALF에서의 IL-6의 수준은 4일째와 6일째에서 상승하였다.
≪고찰≫
본 연구에 있어서, 암브록솔은 기도에 있어서의 인플루엔자 바이러스의 증식을 유의적으로 억제하여, 치사량의 인플루엔자 A/Aichi/68(H3N2) 바이러스에 의해서 감염된 마우스의 생존율을 개선하는 것으로 확인되었다. 인플루엔자 바이러스는 기도에 대한 장기 특이성을 나타내며, 이의 병원성 및 복제는 기도에서의 다양한 숙주세포 유래의 인자군 및 T-세포 및 B-세포의 면역응답에 의해서 결정되고 있다.
동물의 기도에 있어서, 트립타제 클라라 등의 트립신형 프로테아제가 인플루엔자 바이러스 복제를 촉진시키는 세포인자(문헌참조: Kido H, Yokogoshi Y, Sakai K, Tashiro M, Kishino Y, Fukutomi A, Kutunuma N. Isolation and characterization of a novel trypsin-like protease found in rat bronchiolar epithelial Clara cells. J Biol Chem 1992; 267: 13573-13579., Tashiro M, Yokogoshi Y, Tobita K, Seto JT, Rott R, Kido H. Tryptase Clara, an activating Protease for Sendai virus in rat lungs, is involved in pneumopathogenicity. J Virol 1992; 66: 7211-7216.)이고, 반대로 프로테아제의 억제제인 MPI(문헌참조: Beppu Y, Imamura Y, Tashiro M, Towatari T, Ariga H, Kido H. Human Mucus protease inhibitor in airway fluids is a potential defensive compound against infection with influenza A and Sendai viruses. J Biochem 1997; 121: 309-316.)이나 프로테아제를 흡착하여 이의 활성을 저해하는 PS(문헌참조: Kido H, Sakai K, Kishino Y, Tashiro M. A pulmonary surfactant is a potential endogenous inhibitor of proteolytic activation of Sendai virus and influenza virus. FEBS Lett 1993; 322: 115-119.)가 바이러스의 증식을 억제하는 인자로서 보고되어 있다. 통상의 기도 환경내에서의 트립신형 프로테아제의 농도는, 인플루엔자 바이러스의 감염 및 증식을 가능하게 하는 농도로 유지되고 있으며, 억제제의 농도보다도 높다. 폐포상피를 뒤덮는 PS는 tryptase Clara와 결합하여 이의 프로테아제 활성을 저해한다(문헌참조: Kido H, Sakai K, Kishino Y, Tashiro M. A pulmonary surfactant is a potential endogenous inhibitor of proteolytic activation of Sendai virus and influenza virus. FEBS Lett 1993; 322: 115-119., Kido H, Murakami M, Oba K, Chem Y, Towatari T. Cellular proteinases trigger the infectivity of the influenza A and Sendai viruses. Mol Cells 1999; 9: 235-244.). 인플루엔자 바이러스를 감염시킴으로써, 바이러스의 증식에 필요한 트립신형 프로테아제의 분비와 이의 억제제의 분비가 모두 촉진되었다. 또한 감염 마우스를 암브록솔로 치료하자 각각의 분비량이 더욱 현저하게 촉진되었지만, 이의 효과는 프로테아제와 억제제의 균형을 변화시켰다. 감염에 의해서 유발된 프로테아제의 농도는 암브록솔에 의해서 다시 1.3-1.4배 상승하고, 한편 SP-A 및 MPI의 수준은 암브록솔에 의해서 각각 1.5-1.7배 및 1.9배 상승하였다. 이러한 결과는 암브록솔의 치료에 의해서 감염 마우스의 기도 분비액 중에서의 바이러스증식 저해작용을 나타내는 물질군의 비율을 상승시켜 기도내 환경을 미치료와 비교하여 바이러스증식 억제경향을 강화하는 방향으로 변화시킨 것을 나타낸다.
또한, 암브록솔의 작용은 도 3에 도시하는 바와 같이, 비감염 마우스 및 감염 마우스의 점막면역 IgA와 IgG의 방출을 증대시키는 것이었다. 이러한 약제는 IgG의 분비촉진에 대해서도 중도로 촉진시킨다(도 4). 비감염 마우스군에 있어서도, 암브록솔은 IgA의 방출을 촉진시키고, 베이스 농도의 약 10배, IgG의 농도는 베이스 농도의 1.2배가 되었다. 바이러스 감염후, BALF 중의 IgA 및 IgG의 농도는 두드러지게 상승하였지만, 감염 마우스의 암브록솔 치료에 의해서, 감염에 의해서 유발된 IgA 및 IgG의 최대농도는 각각 또한 약 1.5-1.8배, 1.45배 상승하여, 암브록솔에 기인하는 IgA 및 IgG의 농도의 상승이 감염 마우스의 생존율의 개선에 중요한 역활을 하는 것을 나타내고 있다.
IgA 및 IgG, SP-A, MPI 및 트립신형 프로테아제와 같은 다양한 인자의 분비가 암브록솔에 의해서 촉진되는 기작은 이해되고 있지 않지만, 이러한 소견은 암브록솔이 상부 기도 및 하부 기도의 복수의 표적 세포를 자극하는 것임을 시사하는 것이다. 마우스를 10mg/kg/일의 최적용량의 암브록솔로 치료하면, 기도액 중의 바이러스 증식의 저해물질과 면역 글로블린의 농도를, 감염후 시간과 함께 서서히 상승시키고, 이의 농도는 바이러스 복제가 종료되는 7일째까지 높은 상태였다. 그러나, 보다 높은 용량의 암브록솔에 의한 치료는 이러한 농도를 급속히 상승시켜 피크는 보다 빨리 4-5일째에서 도달하지만, 이의 수준을 감염중 지속하는 것은 불가능하였다. 이것이 30mg/kg/일의 암브록솔의 바이러스증식 억제효과가 낮은 원인일지도 모른다. 이러한 결과는, 기도 분비액 중의 저해물질이나 트립신형 프로테아제의 합성을 암브록솔이 촉진시키는 것 보다는, 오히려 암브록솔의 분비를 촉진시키는 것을 나타내고 있다. 또한, 이러한 바이러스증식 저해물질을 7일간 높은 수준으로 유지하는 것이 감염 마우스의 생존율 개선에 요구된다고 생각되었다.
바이러스 증식은 7일째에 종료하였지만(도 2), 폐의 염증은 경도의 진행을동반하며 계속되었다. 최근, 다수의 연구에 의해서, 암브록솔에 항염증 작용이 있으며(문헌참조: Gillissen A, Scharling B, Jaworska M, Bertling A, Rasche K, Schultze-Wernimghaus G. Oxidant scavenger function of ambroxol in vitro: a comparison with N-acetylcysteine AC. Res Exp Med(Berl) 1997; 196: 389-398.), 염증성 사이토킨의 생산을 감소시키는(문헌참조: Pfeifer S, Zissel G, Kienast K, Muller-Quernheim J. Reduction of cytokine release from blood and bronchoalveolar mononuclear cells by ambroxol. Eur J Med Res 1997; 2: 129-132., Gibbs BF, Sckmutzler W, Vollrath IB, Brostharardt P, Braam U, Wolff HH, Zadlo-Klarwasser G. Ambroxol inhibits the release of histamine, leukotrienes and cytokines from human leukocytes and mast cells. Inflamm Res 1999; 48: 86-93.)것으로 밝혀졌다. 본 연구에서는, 감염 마우스의 기도 분비액 중의 염증성 사이토킨의 TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 암브록솔이 억제하는 것으로 확인되었지만, 이의 작용은 감염중 항상 확인된 것은 아니다. 또한 IL-6 및 IL-12 모두 점막면역의 촉진효과가 보고되어 있으며, 특히 IL-12가 점막면역 IgA의 생산촉진효과가 있다고 보고되어 있다(문헌참조: Boyaka PN, Marinaro N, Jackson R, Menon S, Kiyono H, Jirillo E, McGhee JR. IL-12 is an effective adjuvant for induction of mucosal immunity. J Immunol 1999; 162: 122-128.). 감염 마우스의 암브록솔에 의한 치료는, 4일째 및 6일째에서의 BALF 중의 IL-6 수준을 상승시키고 4일째에서의 IL-12의 수준을 일과성으로 억제하였다.
암브록솔에는, 트립신형 프로테아제 수준의 상승이나 IL-12의 방출의 일과성의 억제와 같이, 인플루엔자 바이러스에 대한 생체방어 시스템에 있어서 불리하다고 추정되는 작용도 일부 확인되지만, 암브록솔 치료는 전체적으로는 기도 분비액 중의 바이러스증식 억제효과를 나타내는 생체내 인자군의 농도를 현저하게 증가시키고, 그 결과 기도내 바이러스 증식을 억제하여 마우스의 생존율을 유의적으로 개선시켰다. 이 중 인플루엔자 바이러스의 증식억제에 관여하는 암브록솔 작용은, SP-A, MPI, IgA, IgG 등의 기도내 농도의 상승, 또한 기도 중의 염증성 사이토킨 방출의 억제에 의해서 설명될 것이다. 이러한 결과는, 암브록솔을 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료 또는 예방으로서 임상 사용할 수 있을 것이란 것을 시사하고 있다.
인플루엔자는, 일반적으로 만연하는 경향이 있으며, 그 만연에 관해서는 보도되는 경우가 많다. 따라서, 본 발명의 항인플루엔자 약제는, 보도후에 있어서는 신속하게 사용하는 것으로, 발증후에도 그 질환의 치료제로서 이용할 수 있다. 특히, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염의 치료제 또는 예방제는, 원인 바이러스가 외막 당단백질을 갖는 바이러스이고 기도부에 감염하여 증식하는 것, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스에 의해서 발증하는 바이러스 질환에 효과적으로 적용할 수 있다.
Claims (9)
- 암브록솔, 브롬헥신 또는 이들의 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 항인플루엔자 약제.
- 암브록솔 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 항인플루엔자 약제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 기도 분비액 중에 포함되는 항인플루엔자 바이러스 작용을 나타내는 생체내 인자의 분비촉진에 의해, 항인플루엔자 작용을 가짐을 특징으로 하는 항인플루엔자 약제.
- 제3항에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 감염성을 유발시키는 기도내 프로테아제에 대한 저해물질의 분비촉진을 통해 기도에 있어서의 인플루엔자 바이러스 증식을 억제함을 특징으로 하는 항인플루엔자 약제.
- 제4항에 있어서, 점막면역물질 IgA와 IgG의 분비촉진을 통해 기도에서의 인플루엔자 바이러스 증식을 억제함을 특징으로 하는 항인플루엔자 약제.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 기도중의 염증성 사이토킨 방출을 억제함을 특징으로 하는 항인플루엔자 약제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료제 또는 예방제인 항인플루엔자 약제.
- 항인플루엔자 약제를 제조하기 위한 암브록솔, 브롬헥신 또는 이들의 약리학적으로 허용되는 염의 용도.
- 인플루엔자 바이러스에 감염된 환자에게, 암브록솔, 브롬헥신 또는 이들의 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 항인플루엔자 약제를 투여함을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료방법.
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Legal Events
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| AMND | Amendment | ||
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| B601 | Maintenance of original decision after re-examination before a trial | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20090316 Effective date: 20101230 |