MXPA03009468A - Hongos endofitos novedosos y metodos de utilizacion. - Google Patents

Abstract

Esta invencion proporciona un hongo endofito novedoso, Muscodor, que produce una mezcla de antibioticos volatiles con actividad sobre patogenos especificos de plantas, bacterias, nematodos e insectos. Tambien se proporciona un metodo para tratar o proteger plantas, suelo y semillas de infecciones microbianas que comprende aplicar una cantidad efectiva de un Muscodor sp. que produce antibioticos volatiles. La invencion se refiere tambien a composiciones funguicidas, bactericidas, insecticidas y nematicidas que comprenden este cepa de Muscodor novedosa y los antibioticos y metabolitos producidos por esta cepa ya sea solos o en combinacion con otros pesticidas quimicos y biologicos. Tambien se proporciona un metodo para identificar y aislar hongos relacionados que producen gas.

Description

H O NGOS EN DOFITOS NOVE DOSOS Y METO DOS DE UTI LIZACION REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivind ica el beneficio según 35 U . S. C. § 1 19(e) de las Solicitudes .Provisionales de E . U . , Nos. 60/283,902 y 60/363,072, presentadas respectivamente el 1 6 de abril del 2001 y el 1 1 de marzo del 2002. Los contenidos de estas solicitudes se incorporan aquí como referencia a la presente descripción .

CAMPO DE LA I NVENCI ON La presente solicitud se refiere al aislamiento de hongos novedosos que producen antibióticos volátiles. Los compuestos volátiles tienen actividad biológica contra hongos y bacterias patógenos de plantas y seres humanos, insectos y nemátodos.

ANTECEDENTES DE LA I NVE NCION A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varios artículos y libros citando el autor y la fecha. Las citas bibliográficas completas para cada publicación pueden encontrarse al final de la especificación, que preceden inmediatamente a las reivindicaciones.

Está bien reconocido que los hongos producen antibióticos que son útiles en el tratamiento de enfermedades, en aplicaciones industriales y como pesticidas, por ejemplo, penicilina, cefalosporinas, tetraciclina y ciclosporinas, ninguna de las cuales es volátil. Se conocen muchas especies de hongos que emiten bajas concentraciones de sustancias gaseosas, especialmente algunas que tienen olores repugnantes distintivos, y esto ha provocado análisis químicos de los volátiles fúngicos (Bjurman y colaboradores, 1992). Algunas de estas sustancias volátiles son comunes a muchos hongos, mientras que otras parecen ser únicas para una especie (Schnurer y colaboradores, 1999; Rapior y colaboradores, 2000). Dennis & Webster (1971) reportaron que ciertos Trichoderma spp. produjeron antibióticos volátiles que inhibieron el crecimiento de hongos de prueba tales como Rhizoctonia sotaní, Pythium ultimum y Fusarium oxysporum. Estos autores no reportaron efectos letales para ninguno de los hongos de prueba y no se realizó un análisis químico exhaustivo de los componentes volátiles de los cultivos fúngicos, aunque se sugirió el acetaldehído como uno de los volátiles. Por tanto, a pesar de cierta atención prestada a lo largo de los años a los compuestos volátiles de los cultivos fúngicos, no ha sido reportada una mezcla letal de antimicrobianos volátiles producidos por hongos. Es también bien conocido que varios microorganismos exhiben actividad biológica para ser útiles para el control de enfermedades de plantas. Aunque se han hecho progresos en el campo de la identificación y desarrollo de plaguicidas biológicos para controlar varias enfermedades de plantas de importancia en la agronomía y la horticultura, la mayoría de los plaguicidas en uso siguen siendo compuestos sintéticos. Muchos de estos fungicidas químicos son clasificados por la EPA como carcinógenos y son tóxicos para la fauna y flora silvestres y otras especies a las que no están dirigidos. Por ejemplo, el bromuro de metilo es ampliamente utilizado como un fumigante de suelos y para tratar infecciones microbianas posteriores a la cosecha. Debido a su alta toxicidad para humanos y animales y a su efecto nocivo para la atmósfera, el uso de bromuro de metilo va a ser eliminado pronto y existe la necesidad de encontrar sustitutos más seguros para este y otros plaguicidas sintéticos. Esta invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas también.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se proporcionan hongos endófitos novedosos, incluyendo a Muscodor albus y a Muscodor roseus, que producen una mezcla de antibióticos volátiles con actividad contra hongos, bacterias, insectos y nemátodos. En un aspecto, el Muscodor es identificado empleando la información suministrada en este documento, que incluye, pero no se limita a secuencias genómicas parcialés establecidas en los números de identificación de secuencias (SEQ ID NOs.): 1 a 4. Dos cepas novedosas fueron depositadas en el NRRL el 1o de febrero del 2002 conforme a lo establecido en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimiento de Patentes bajo los Nos. de Ingreso 30457 y 30458.

También se proporcionan composiciones que contienen los hongos y/o los compuestos volátiles . Las com posiciones son útiles para el tratamiento de suelos y para proteger plantas, sem illas, granos y frutas de hongos y bacterias patógenos. Las composiciones son también útiles para la protección de alimentos posterior a la cosecha contra infecciones de hongos y bacterias. Las com posiciones además son útiles para el tratamiento de desechos humanos o an imales y para el tratam iento y/o la prevenció n de la infestación del moho tóxico de ed ificaciones o materiales parfa construcción , tales como madera . También son proporcionados por esta invención los métodos para el tratamiento y la protección de suelos, plantas , sem illas, g ranos, productos de desecho, materiales de construcción y prod uctos alimenticios posterior a la cosecha contra infecciones bacterianas, por insectos, nemátodos y hongos.

BREVE DESCRI PCI O N DE LAS TABLAS La Tabla 1 m uestra los efectos de los compuestos volátiles de M. albus y de u na mezcla artificial de compuestos de M. albus en un g ru po de microbios de prueba . Después de la exposición a los gases de M. albus, el microbio de prueba fue evaluado para su viabilidad después de la remoción de los gases. La atmósfera artificial consistió de los compuestos identificados después del análisis de los gases de M. albus. El crecimiento microbiano en la atmósfera artificial fue medido después de la exposición a la mezcla artificial de compuestos a 3.2-90µ?/50?? con el fin de obtener valores de IC50. El % de crecimiento con respecto al control y la viabilidad fueron medidos después de exposición a 60pl/50cc. La viabilidad fue determinada a los 3 d ías después de la remoción de los compuestos. La Tabla 2 muestra el número promedio de brotes de brócoli por maceta, una semana después del plantado (medias ± desviación estándar) utilizando vermiculita. Las macetas fueron plantados inmediatamente sin un periodo de incubación . La Tabla 3 muestra los resultados de un experimento para determinar la capacidad de Muscodor albus para controlar el moho azul de las manzanas. La Tabla 4 muestra los resultados de los análisis del cromatógrafo de gases/espectro de masas de los compuestos volátiles producidos por M. albus. Varios picos menores y el pico de gran avance fueron omitidos del análisis global debido a que representan únicamente 1 % del área total. Los compuestos encontrados en la placa de agar de dextrosa de papas (PDA=potato dextrose agar) no se incluyen en esta tabla. La Tabla 5 muestra los resultados de un ensayo para determinar la influencia inhibitoria de cada clase de compuestos volátiles. Esto se expresa como el % de crecimiento del microbio de prueba en comparación con un control que no está en la presencia de los compuestos de prueba. Los compuestos fueron probados durante una exposición de 2 días a las concentraciones relativas en que ocurren en M. albus a la concentración óptima de prueba de 60pl/50cc de volumen de aire o 1.2pl/cc. La Tabla 6 muestra los volátiles de Muscodor albus utilizados para el tratamiento de semillas de cebada infestadas con tizón o añublo. Grupos de semillas no tratadas y no infestadas fueron empleadas como controles.

MANERAS DE LLEVAR A CABO LA INVENCION A lo largo de esta descripción, se hace referencia a varias publicaciones, patentes y especificaciones de patentes publicadas mediante una cita que las identifica. Las descripciones de estas publicaciones, patentes y especificaciones de patentes publicadas son incorporadas por la presente por referencia a la presente descripción para describir de una manera más completa el estado de la técnica con el que está relacionada esta invención. La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales están dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Estos métodos están descritos en las siguientes publicaciones. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2da edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel y colaboradores, editores (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); PCR: A PRACTICAL APPROACH (M. MacPherson y colaboradores, IRL Press en Oxford Universlty Press (1991)); y PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor, editores (1995)).

DEFINICIONES Las formas en singular "un", "una", "la" y "el" incluyen referencias en plural a menos de que el contexto claramente dicte otra cosa. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas. El término "incluyendo" tiene la intención de significar que las composiciones y métodos incluyen los elementos nombrados, pero no excluye a otros. "Que consiste esencialmente de" cuando se usa para definir composiciones y métodos, significará que excluye otros elementos de cualquier importancia esencial para la combinación. Así, una composición que consiste esencialmente de los elementos como se define aquí no va a excluir contaminantes como trazas del método de aislamiento y purificación y de vehículos aceptables agrícolamente. "Que consiste de" significará que se excluye más que elementos como traza de otros ingredientes y pasos sustanciales del método para aplicar la composición de esta invención. Las modalidades definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención. Como se usa aquí, "control biológico" se define como el control de un patógeno o de un insecto mediante el uso de un segundo organismo. Mecanismos conocidos de control biológico incluyen bacterias que controlan la descomposición de las raíces al desplazar por competencia a los hongos que se encuentran en la superficie de la raíz. Toxinas bacterianas, tales como antibióticos, han sido utilizadas para controlar patógenos. La toxina puede ser aislada y aplicada directamente a la planta o la especie bacteriana puede ser administrada de forma que produzca la toxina in situ. El término "hongo" u "hongos" incluye a una amplia variedad de organismos con núcleo, que presentan esporas y que carecen de clorofila. Ejemplos de hongos incluyen a las levaduras, los mohos, los mildeus, las royas y los champiñones. El término "bacteria" incluye a cualquier organismo procariótico que no tenga un núcleo distinto. "Plaguicida" significa la capacidad de una sustancia de aumentar la mortalidad o de inhibir la tasa de crecimiento de plagas de plantas. "Fungicida" significa la capacidad de una sustancia de aumentar la mortalidad o de inhibir la tasa de crecimiento de hongos. "Insecticida" significa la capacidad de una sustancia de aumentar la mortalidad o de inhibir la tasa de crecimiento de insectos o sus larvas. "Bactericida" significa la capacidad de una sustancia de aumentar la mortalidad o de inhibir la tasa de crecimiento de bacterias.

"Nematicida" significa la capacidad de una sustancia de aumentar la mortalidad o de inhibir la tasa de crecimiento de nemátodos. "Antibiótico" incluye cualquier sustancia que es capaz matar o inhibir a un microorganismo. Los antibióticos pueden ser producidos por un microorganismo, o por un proceso sintético o semisintético. Por consiguiente, el término, incluye a una sustancia que inhibe o mata hongos como, por ejemplo, cicloheximida o nistatina. El término "cultivar" se refiere a la propagación del organismo sobre o dentro de medios de varios tipos. "Cultivo de caldo entero" se refiere a un cultivo líquido que contiene tanto células como el medio. "Sobrenadante" se refiere al caldo líquido que queda cuando las células cultivadas en el caldo son removidas mediante centrifugación , filtración, sedimentación, u otros medios bien conocidos en la técnica. Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para producir los efectos benéficos o deseados. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. En términos de tratamiento y protección, una "cantidad efectiva" es la cantidad suficiente para mejorar, estabilizar, revertir, disminuir o retardar la progresión de los estados de la infección o enfermedad objetivo. "Control positivo" significa un compuesto conocido por tener actividad plaguicida. "Controles positivos" incluyen, pero no se limitan a, plaguicidas químicos comercialmente disponibles. El término "control negativo" significa un compuesto que no presenta una actividad plaguicida. Ejemplos de controles negativos son agua o acetato de etilo. El término "metabolito" o "volátil" se refiere a cualquier compuesto, sustancia o subproducto de una fermentación de un microorganismo que tiene la actividad biológica. Los volátiles en la mayoría de los casos se evaporan fácilmente a temperatura y presión ambientes. El término "mutante" se refiere a una variante de la cepa padre así como a los métodos para obtener un mutante o una variante en la que la actividad biológica deseada es similar a la expresada por la cepa padre. La "cepa padre" se define aquí como las cepas Muscodor originales antes de la mutagénesis. Las mutantes se presentan en la naturaleza sin la intervención humana. También son obtenibles por tratamiento con o por una variedad de métodos y composiciones conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, cepas padres pueden ser tratadas con una sustancia química tales como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, etilmetansulfona, o por irradiación usando rayos gama, rayos X, por irradiación UV o por otros medios bien conocidos por los conocedores de la técnica. Una "composición" pretende significar una combinación de agente activo y otro compuesto, vehículo o composición, inerte (por ejemplo, un agente o etiqueta o portador líquido que puede ser detectado) o activo, tal como un auxiliar. Más adelante se proporcionan ejemplos de vehículos para fines agrícolas. Los hongos también pueden ser formulados como una composición, con un vehículo o alternativamente, con por lo menos un plaguicida químico o biológico. Todos los valores numéricos, por ejemplo, el pH, la temperatura, el tiempo, la concentración y peso molecular, incluyendo los rangos, son aproximaciones que pueden ser variadas (+) o (-) con incrementos de 0.1. Debe entenderse que, aunque no siempre se indica explícitamente, que todos los valores numéricos están precedidos por el término "aproximadamente". Debe también entenderse que, aunque no siempre se indica explícitamente, que los reactivos descritos en este documento son meramente ejemplificativos y que son bien conocidos equivalentes de tales en la técnica. Con el fin de lograr una buena dispersión y adhesión de las composiciones de la presente invención, puede ser ventajoso formular el cultivo de caldo entero, el sobrenadante, y/o los volátiles con componentes que ayuden a la dispersión y adhesión. Formulaciones adecuadas serán bien conocidas por los expertos en la materia (polvos humectables, gránulos y similares, o pueden ser microencapsulados en un medio adecuado y los similares, líquidos tales como fluidos acuosos y suspensiones acuosas, composiciones de volátiles y concentrados emulsificables. Otras formulaciones adecuadas serán conocidas por los expertos en la materia.

Una "variante" es una cepa que tiene todas las características de identificación de las cepas de la esta invención y puede ser identificada como aquella que posee u n genoma que se h íbrida bajo condiciones de alta severidad al genoma del organismo, cuya secuencia parcial ha sido depositada en el depósito GenBank. "Hibridación" se refiere a una reacción en la que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que es estabilizado por medio de uniones de hidrógeno entre las bases de los residuos de nucleótido. Las uniones de hidrógeno pueden ocurrir por apareamiento de bases Watson-Crick, aglutinamiento de Hoogstein, o en otra manera específica para la secuencia. El complejo puede incluir dos hebras que forman una estructura doble, tres o más hebras que forman un complejo de hebras múltiples, una sola hebra que se autohibrida, o cualquier combinación de las éstas. Las reacciones de hibridación pueden llevarse a cabo en cond iciones de d iferente "severidad". En general , una reacción de hibridación de baja severidad se lleva a cabo a aproximadamente 40°C en una solución 10 X SSC o una solución de fuerza iónica y temperatura equivalentes. Una hibridación de severidad moderada es típicamente lograda a aproximadamente 50°C en 6 X SSC, y una reacción de hibridación de alta severidad es generalmente lograda a aproximadamente 60°C en 1 X SSC. Una variante también puede ser definida como una cepa que tiene una secuencia genómica que tiene una identidad de secuencia mayor que 85% , más preferiblemente mayor que 90%, o más preferiblemente mayor que 95% al genoma de M. roseus o M. albus. El que un polinucleótido o una región de polinuclétido (o un polipéptido o una región de polipéptido) tenga un cierto porcentaje (por ejemplo 80%, 85%, 90% o 95%) de "identidad de secuencia" con otra secuencia, significa que, cuando son alineadas, ese porcentaje de bases (o de aminoácidos) son iguales al comparar las dos secuencias. Este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden ser determinados utilizando programas de computadora conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel y colaboradores, editores, 1987) suplemento 30, sección 7.7.18, Tabla 7.7.1. Preferiblemente, se utilizan los parámetros por defecto para el alineamiento. Un programa preferido para el alineamiento es BLAST, empleando los parámetros por defecto. De forma particular, los programas preferidos son BLASTN y BLASTP, que utilizan los siguientes parámetros por defecto: código Genético = estándar; filtro = ninguno; hebra = ambas; corte = 60; esperado = 10; MATRIZ = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = HIGH SCORE; Bases de datos = traducciones non-redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS + SwissProtein + SPupdate + PIR. Detalles de estos programas pueden encontrarse en la siguiente dirección de Internet: www.ncbi.nlm.nih.gov/cqi-bin/BLAST. Los solicitantes aislaron y caracterizaron un hongo novedoso llamado Muscodor. Dos especies del novedoso Muscodor también fueron aisladas y caracterizadas, a saber, Muscodor albus y Muscodor roseus. Secuencias genómicas parciales para Muscodor albus son proporcionadas en SEQ ID NOS.: 1 y 2 y secuencias genómicas parciales para Muscodor roseus (designado A3-5) son proporcionadas en SEQ ID NOS. 3 y 4. Una secuencia genómica parcial para M. roseus (A10) fue también obtenida. Un cultivo aislado de Muscodor albus fue depositado en el NRRL bajo el número de orden 30457. Un cultivo aislado de Muscodor roseus designado A3-5 fue depositado en el NRRL bajo el número de Orden 30458. Por consiguiente, esta invención proporciona un hongo novedoso aislado designado Muscodor y dos especies del mismo, Muscodor albus y Muscodor roseus, y mutantes de las mismas. Esta invención también proporciona composición(es) gaseosa(s) ("volátiles") producida(s) por los cultivos de Muscodor aislados. En un aspecto, la composición volátil tiene los componentes nombrados en la Tabla 4. Las composiciones gaseosas pueden ser combinadas con un agente o un vehículo de dispersión adecuado. En otro aspecto, las composiciones pueden contener en forma opcional una cantidad efectiva de uno o más entre un fungicida, un insecticida, un nematicida, un antimicrobiano, un bactericida o un conservador alimenticio. Además los solicitantes identificaron los componentes de los subproductos volátiles y los sintetizaron a partir de materiales disponibles comercialmente. Los componentes del volátil sintético se nombran en la Tabla 4. Debe entenderse que, aunque no siempre se indica explícitamente, que la composición sintética puede ser usada en los métodos descritos aquí como una alternativa o como un sustituto de los subproductos gaseosos naturales producidos por hongos Muscodor. Los gases de Muscodor afectan a un número de otros microbios relacionados con asuntos de salud humana. Son letales para los principales fúngicos y bacterianos patógenos de humanos, incluyendo a C. albicans (Tabla 2) y A. fumigatus y Pseudomonas sp. Matan bacterias que contaminan alimentos tales como S. aureus y E. coli (Tabla 2). Se ha encontrado que son letales para Stachybotrys sp. (contaminante de casas y edificaciones públicas) y también de un número de hongos que destruyen la madera. Así, los hongos y los gases producidos por los hongos son útiles para inhibir el crecimiento de o matar un organismo seleccionado del grupo que consiste de un hongo, una bacteria, un microorganismo, un nematodo y un insecto. Empleando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, los hongos o sus subproductos volátiles son puestos en contacto con el organismo en una cantidad efectiva para matar o inhibir el crecimiento del organismo. De forma alternativa, los hongos y/o sus subproductos volátiles pueden ser empleados para el tratamiento de desechos humanos o animales, por ejemplo, como un componente de aguas de desecho o en manejo o tratamiento de sólidos. También son útiles para descontaminar desechos humanos y animales, por ejemplo, para disminuir o remover la contaminación bacteriana y fúngica. Adicionalmente, los hongos y/o sus subproductos volátiles pueden ser utilizados para el tratamiento y la prevención del moho tóxico en materiales de construcción y en edificaciones, poniendo en contacto a la edificación, a los materiales de construcción, o los espacios entre los materiales de edificación con una cantidad efectiva del subproducto volátil. Únicamente para propósitos de ilustración, una cantidad efectiva del subproducto volátil puede ser utilizada sola o en combinación con otros fumigantes en una habitación o en forma alternativa, durante fumigaciones de la edificación completa. Cuando es utilizada en aplicaciones agrícolas, la invención proporciona un método para el tratamiento o protección de frutas, semillas, plantas o suelos que rodean las plantas de una infestación por un organismo seleccionado del grupo que consiste de un hongo, una bacteria, un microorganismo y un insecto, poniendo en contacto el microorganismo con una cantidad efectiva de un cultivo aislado de Muscodor o de su subproducto volátil. Adicionalmente, esta invención proporciona un método para la identificación de hongos Muscodor novedosos, que comprende poner en contacto una cantidad efectiva de los hongos que van a ser evaluados con los volátiles de Muscodor albus o Muscodor roseus en condiciones de cultivó y la selección de los hongos que son resistentes a los volátiles de Muscodor albus o Muscodor roseus, identificando de esta forma a los hongos Muscodor novedosos. Adicionalmente, se proporcionan los hongos aislados Muscodor escogidos mediante este método. Ad icionalmente se proporciona un método para obtener u na composición volátil mediante el cultivo de Muscodor a islados de esta invención y la recolección de la composición volátil prod ucida por los Muscodor cultivados. Los siguientes ejemplos son proporcionados para ilustrar la invención . Estos ejemplos no deben ser interpretados como l imita ntes.

EJ EMP LOS Ejemplo 1 - Aislamiento de los hongos Muscodor albus Varias ramas pequeñas de un de un árbol de Cinnamomum zeylanicum maduro ubicado a 32 kilómetros al oeste de La Ceiba, Hondu ras, fueron removidas e inmediatamente transportadas a Montana State U n iversity para ser procesadas en el otoño de 1 997. Pequeños fragmentos de la corteza interna, la albu ra y de los tejidos del xilema externo de las ramas fueron removidos asépticamente y colocados en placas de Petri que contienen agar agua. Después de incubación por varios d ías , puntas de hifas de los hongos en desarrollo fueron removidas asépticamente y colocadas en agar de dextrosa de pa pas (PDA). Ad icional mente, después de 7 días, colon ias de hongos fueron transferidas a hojas (0.5 x 0.5 cm ) de clavel irrad iadas con rayos gamma para estimu lar la p roducción de esporas. De varios hongos que fueron aislados el de mayor interés, debido a su olor a moho, fue un aislado designado como "620", posteriormente identificado como Muscodor albus.

Muscodor roseus El hongo fue aislado de varias ramas pequeñas de un Helécho Frondoso Grevellia (Grevillea pteridifolia) 12° 59' 39" sur y 132° 28" 50" este obtenidas del Territorio Norte de Australia. Fragmentos pequeños de corteza interna, albura y tejidos externos del xilema de algunas ramas pequeñas (0.5 cm diámetro) fueron removidos asépticamente y colocados en placas de Petri que contienen agar agua (Strobel y colaboradores, 1996). Después de incubación por varios días, puntas de hifas de los hongos en desarrollo fueron removidas asépticamente y colocadas en agar de dextrosa de papa (PDA). Adicionalmente, después de 7 días, colonias de hongos fueron transferidas a hojas (0.5 x 0.5 cm) de clavel irradiadas con rayos gamma y a otros materiales vegetales, para estimular la producción de esporas. De varios hongos que fueron aislados, el de mayor interés, debido a su olor a moho, fue un aislado designado como "A3-5". Una cepa adicional de Muscodor fue obtenida de las ramas pequeñas del Palo de Hierro de Australia (Erythophelum chlorostachys) a 15° 29' 29" sur y 131° 23" 12" este. Este endófito fue aislado utilizando los volátiles de M. albus como herramienta de selección. El material vegetal, del cual los hongos endófitos iban a ser aislados, fue colocado en la misma placa con agar que un cultivo de M. albus de crecimiento rápido con dos semanas de edad. Como resultado, los únicos organismos que se desarrollaron a partir del material vegetal fueron los resistentes a M. albus, que son posiblemente otros productores de antibióticos volátiles o relacionados con M. albus en el grupo Xylariaceae (Strobel y colaboradores, 2001). Los endófitos más comúnmente aislados a partir de este árbol fueron Pestalotiopsis spp. y otro Xylarla spp. Fue designado internamente como "A-10".

Ejemplo 2- Cultivo y almacenamiento de los hongos. El hongo fue cultivado en un número de medios diferentes, incluyendo Agar de Caldo de Soya Tríptica (TSBA), Agar de Harina de Maíz (CMA), Agar de Malta (MA), Agar de Dextrosa de Papa (PDA), Difco, Laboratories, Detroit, Mich. El hongo también fue inoculado en placas de Petri que contenían agar agua con muestras individuales de virutas pequeñas de madera de pino blanco occidental (Pinus montícola), nogal negro (Juglans nigra), y arce (Acer saccharum), así como fragmentos de corteza de C. zeylanlcum con el fin de estimular la producción de esporas: Con el fin d.e determinar la mejor manera de almacenar el aislado 620, se probaron varias condiciones. El hongo fue cultivado en discos estériles de papel filtro Whatmann No. 1 que fueron colocados en la superficie del PDA en placas de Petri. El hongo fue inoculado como un tapón de agar en el medio del disco de papel filtro en la placa con PDA. La placa fue incubada por 14 días a 22°C. Después, el disco de papel fue removido y colocado en una campana de flujo laminar bajo condiciones estériles por 1 día, o hasta que el papel con su micelio fúngico estuviera seco. El disco de papel fue cortado entonces en muchos fragmentos y almacenado bajo diversas condiciones. También, tapones de agar que contenían el hongo fueron colocados en agua destilada estéril y almacenados a 4°C. En otro grupo de condiciones de prueba, fragmentos de micelio que estaban creciendo en agar fueron colocados en glicerol al 15% y almacenados a -70°C. En cada prueba, la viabilidad del hongo fue determinada colocando los fragmentos de micelio sobre una placa PDA y se examinó el crecimiento fúngico después de 3-4 días. Con el fin de determinar la mejor manera de almacenar los aislados de Muscodor roseus (designados internamente como A3-5 y A-10) se probaron varias condiciones. El hongo fue cultivado en discos estériles de papel filtro Whatmann No. 1 que fueron colocados en la superficie del PDA en placas de Petri. El hongo fue inoculado como un tapón de agar en el medio del disco de papel filtro en la placa con PDA. La placa fue incubada por 14 días a 22°C. El disco de papel fue removido entonces y colocado en una campana de flujo laminar bajo condiciones estériles por 1 día, o hasta que el papel con su micelio fúngico estuviera seco. El disco de papel fue cortado después en muchos fragmentos y almacenado a 23°C, 4°C, 0°C y -70°C. También, tapones de agar que contenían el hongo fueron colocados en agua destilada estéril y almacenados a 4°C. En otro grupo de condiciones de prueba, fragmentos de micelio que estaban creciendo en agar fueron colocados en giicerol al 15 % y almacenados a -70°C. En cada prueba, la viabilidad del hongo fue determinada colocando los fragmentos de micelio en una placa con PDA y se examinó el crecimiento fúngico después de 3-4 días.

Ejemplo 3- Aislamiento del ADN fúngico Para el asilamiento de ADN, todos los hongos fueron cultivados en caldo de dextrosa de papa (PDA) en 1.5 mi durante 18 a 24 h a 23°C. El micelio fue recolectado por centrifugación y lavado dos veces con H20 destilada y estéril. El ADN genómico total fue extraído mediante los métodos de Lee y Taylor (1990).

Ejemplo 4- Amplificación del ADN ribosomal 18S Fragmentos parciales de pares de bases de nucleótidos del gen 18S del ADN ribosomal de cada hongo fueron amplificados mediante la reacción en cadena con polimerasa (PCR) como un fragmento individual con el iniciador UK4F (5'CYGGTTGATCCTGCCRG) y UREV (5'GYTACCTTGACGAACTT). La PCR fue realizada en un vial de reacción de 50 pl que contenía 0.1 pg de ADN genómico, 0.4 µ? de cada iniciador, 0.16 mM de cuatro dNTPs y 5µ de polimerasa Taq (Promega) en un buffer de tris-HCI 10 mM (pH 9.0 a 25°C), KCI 50 mM, MgCI2 3 mM, 0.1% Tritón X-100. Se realizó la amplificación para 30 ciclos (45 s a 94.5°C, 45 s a 53.5°C, 90 a 72.5°C).

Ejemplo 5- Amplificación de las secuencias del espacio interno transcrito (ITS) y de rADN 5.8S. Las regiones ITS del hongo de prueba fueron amplificadas empleando PCR y los iniciadores ITS universales 1TS5 (5'GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) y ITS4 (5* TCCTCCGCTTATTGATATGC) (White y colaboradores, 1990). PCR fue realizado en una reacción de 50 pl que contenía 0.1 pg de ADN genómico, 0.4 µ? de cada iniciador, 0.16 mM de cuatro dNTPs y 5u de poiimerasa Taq (Promega) en un buffer de tris-HCI 10 mM (pH 9.0 a 25° C), KCI 50 mM, MgCI2 3 mM, y 0.1% Tritón X-100. Las condiciones de los ciclos del PCR consistieron de desnaturalización a 94°C por 1.5 min, recocido a 55°C por 2.5 min, y extensión a 72°C por 3 min en 40 ciclos, con una extensión final a 72°C por 10 min (Willits, 1999). Los productos del PCR fueron purificados mediante gel y desalados utilizando el equipo de purificación de PCR QuickStep (Edge Biosystems).

Ejemplo 6 - Búsqueda y comparación de las secuencias 18S de rADN e ITS1&2 Muscodor albus Las dos secuencias 18S rADN e ITS1-2 de Muscodor albus fueron enviadas al GenBank con números de serie AF324337 y AF324336, respectivamente. Estas secuencias fueron también sometidas a búsqueda o comparadas con otras secuencias fúngicas utilizando BLAST 2.1. y una búsqueda en el NCBI en el sitio web www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Se hicieron secuencias de comparación y alineamiento empleando Clustal W versión 1.7 (Thomson, J. y Gibson T., 1997), y posteriormente se alinearon manualmente. El método de secuencia de instrucciones iniciales de parsimonia máxima (Máximum parsimony bootstrap method, Felsenstein, 1985) con búsqueda heurística (heuristic search) y búsqueda heurística de consenso parsimonioso máximo fueron realizadas empleando PAUP* (Swofford, 1999). El análisis de secuencia de instrucciones iniciales fue establecido de la siguiente manera: 100 réplicas, intercambio de ramas por bisección-reconexión del árbol y adición aleatoria de secuencias. Todos los caracteres se pesaron de la misma forma. Los taxones de referencia fueron Taphrinales: Protomyces inouyei (GenBank número de serie D11377), Taphrina wiesneri (D12531), T. deformans (U00971) y T. pruni-subcordatae (AB000957).

Muscodor roseus Las dos secuencias 18S rADN e ITS1&2 de la recolección de cultivo "A3-5" fueron enviadas a GenBank con el número de serie AY034664 y AY034665, respectivamente. Mientras que al rADN 18S del aislado "A-10" se le asignó AY049023. Además, las dos secuencias rADN 18S y ITS1&2 de "A3-5" fueron también sometidas a búsqueda o comparadas con otras secuencias fúngicas utilizando BLAST 2.2.1 (Altschul y colaboradores, 1997), una búsqueda del NCBI en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Las secuencias de comparación y alineamiento fueron realizadas empleando CLUSTALW versión 1.7 (Thomson y Gibson, 1997), y posteriormente se alinearon manualmente. El análisis filogenético de los 1708 bp de las secuencias parciales de rADN 18S fue realizado empleando el análisis de parsimonia máxima del programa de Análisis de Parsimonia que Utiliza Filogenia (Phylogeny Using Parsimony Análisis) (PAUP*) versión 4.0b4a (Swofford, 1999). El número de caracteres informativos de parsimonia fue 190, y 1448 caracteres y son constantes. El análisis filogenético fue realizado para dieciocho taxones, incluyendo los taxones de referencia. Los taxones de referencia fueron Taphrinales: Taphrina wiesneri (GenBank número de orden D12531), Taphrina deformans (U00971) y Taphrina pruni-subcordatae (AB000957). Las quince especies restantes fueron Muscodor albus (AF324337), Muscodor roseus (AY034664), Xylaria carpophila (Z49785), X. curta (U32417), X. hypoxylon (U20378), X polymorpha (AB014043), Xylaria sp. (AB014042), Rosellinia necatrix (AB014044), Poronia punctata (AF064052), Daldinia concéntrica (U32402), Hypoxylon fragiforme (AB014046) e Hypoxylon atroroseus (U32411), Pestalosphaeria hansenii (AF242846), Discostroma tricellular (AF346546) y Amphisphaeria sp. (AF346545). El análisis de remuestreo (bootstrap) fue establecido de la siguiente manera: 100 réplicas, intercambio de ramas por bisección - reconexión del árbol, adición aleatoria de secuencias. Todos los caracteres se pesaron de la misma forma.

Ejemplo 7 - Análisis de volátiles producidos por Muscodor albus Se concibió un método para analizar los gases en el espacio aéreo sobre los micelios de M. albus cultivados en placas de Petri. Una "jeringa de micro extracción en fase sólida" fue empleada para atrapar los fúngicos volátiles. El material de la fibra (Supelco) fue de 50/30 de divinilbenceno/carburen en polidimetilsiloxano en una fibra estable flexible. La jeringa fue colocada a través de un pequeño agujero perforado en el costado de la placa de Petri y expuesta a la fase de vapor por 45 min. La jeringa fue posteriormente insertada en un cromatógrafo de gases (Hewlett Packard 5890 Series II Plus) equipado con un detector de masas selectivo. Una columna capilar ZB Wax (30 m x 0.25 mm D.l.) con un espesor de película de 0.50 mm fue utilizada para la separación de los volátiles. La columna se programó para temperatura como sigue: 25°C por 2 min pasando a 220°C a razón 5°C/min. El gas portador fue helio de ultra alta pureza (distribuidor local) y la presión inicial de cabeza de columna fue de 50 kPa. La presión de He fue incrementada gradualmente con la rampa de temperatura del horno para mantener una velocidad de flujo de gas portador constante durante el curso de la separación. Antes de atrapar los volátiles, la fibra fue acondicionada a 240°C por 20 minutos con flujo de gas helio. Una inyección de 30 segundos fue utilizada para introducir la fibra de muestra en el cromatógrafo. El cromatógrafo de gases fue colocó en interfase a un espectrómetro de masas de doble foco magnético VG 70E-HF operando a una resolución de masa de 1500. El espectro de masas fue barrido a una tasa de 0.50 segundos por décima de masa en el rango de masas entre 35-360 urna. La adquisición y procesamiento de los datos fue realizado en la interfase y paquete de cómputo VG SIOS/OPUS. La identificación inicial de los compuestos desconocidos producidos por M. albus fue realizado mediante la comparación con la biblioteca usando la base de datos NIST. Análisis comparables fueron conducidos en placas de Petri que contenían únicamente PDA, y los compuestos obtenidos de ellos, principalmente estireno, fueron eliminados de los análisis hechos en placas que contenían el hongo. La identificación final de 20 de 28 compuestos fue hecha en una base comparativa con estándares auténticos utilizando los métodos de GC/ S descritos aquí. Sin embargo, los otros 8 compuestos, que corresponden únicamente al 20% aproximadamente de los volátiles han sido identificados solamente de manera tentativa en base en la información de base de datos NIST y no fueron incluidos en ninguna de las pruebas de bioensayos que emplearon mezclas artificiales de compuestos de M. albus. Como una primera aproximación, el análisis cuantitativo para cada compuesto encontrado en los cu ltivos fúngicos se basa en su área relativa de pico obtenida después del análisis de GC/MS. Este número fue empleado para preparar atmósferas artificiales de los gases de M. albus en las proporciones relativas en las que ocurren en cultivo.

Ejemplo 8 - Fuentes de los componentes fúngicos volátiles La mayoría de los compuestos producidos por M. albus fueron obtenidos de Aldrich Chem Co. , sin embargo, el valenceno fue obtenido de Fluka Chem Co. , y el bulneseno sintético fue obtenido del Dr. Clayton Heathcock de U. C. Berkeley, Departamento de Química y puede ser sintetizado siguiendo los procedimientos de Heathcock y Ratcliffe (1971 ). Los otros ésteres que no estaban disponibles comercialmente fueron preparados sigu iendo algunos de los procedimientos de acilación, como se establece en Hoefle, G. Y colaboradores, (1978).

Ester de ácido propanoico, 2-metil, 3-metilbutilo. Cloruro de isobutirilo (2 mi 19.1 mmol) fue agregado lentamente a una solución a 0°C de alcohol isoam ílico (1 mi, 9.5 mmol), 4-dimetilaminopirid ina (583 mg , 4.8 mmol), y piridina (0.85 mi, 10.5 mmol) en d iclorometano. Un precipitado fue evidente 5 minutos después de que la adición se completó. Después de agitar por 12 h en argón, la reacción fue vertida en 20 mi de HCI 0.1 N . Las capas se separaron y la capa acuosa fue extraída con 20 mi de cloruro de metileno. Las capas orgánicas fueron combinadas y lavadas con 10 mi de cloruro de amonio acuoso saturado y luego con 10 mi de bicarbonato de sodio acuoso saturado. Las capas orgánicas fueron secadas sobre sulfato de magnesio, filtradas y concentradas al vacío. Purificadas por destilación con una columna Vigreaux de 14 mm (p e. 60-62 C, 25 mm). El aceite claro, incoloro resultante fue agitado sobre Amberlyst 15 para remover cualquier cloruro de isobutirilo restante. H RMN (250 MHz, CDCI3) 4.09 (t, 2H, J 6.7), 2.53 (m, 1H), 1.68 (m, 1H), 1.52 (q, 2H, J 6.5), 1.16 (d, 6H, J 7.0), 0.92 (d, 6H, J 6.5).

Ester de ácido propanoico, 2-metiletilo. Cloruro de isobutirilo (2 mi 19.1 mmol) fue agregado lentamente a una solución a 0°C de alcohol etílico (0.55 mi, 9.5 mmol), 4-dimetilaminopiridina (583 mg, 4.8 mmol), y piridina (0.85ml, 10.5 mmol) en diclorometano. Un precipitado fue evidente 5 minutos después de que la adición se completó. Después de agitar por 12 h en argón, la reacción fue vertida en 20 mi de HCI 0.1 N. Las capas se separaron y la capa acuosa fue extraída con 20 mi de cloruro de metileno. Las capas orgánicas fueron combinadas y lavadas con 10 mi de cloruro de amonio acuoso saturado y luego con 10 mi de bicarbonato de sodio acuoso saturado. Las capas orgánicas fueron secadas sobre sulfato de magnesio, filtradas y concentradas al vacío. Purificadas por destilación con una columna Vigreaux de 14 mm (p.e. 102°C). H (300 MHz, CDCI3) 4.12 (q, 2H, J 7.2), 2.52 (m, 1H), 1.25 (t, 3H, J 6.9), 1.16 (d, 6H, J 7.2).

Acetato de 3-metil-1 -butilo. En una atmósfera de argón, cloruro de acetilo (6.5 ml, 91-8 mmol) fue añadido gota a gota a una solución a 0 °C de alcohol isoamílico (5 ml, 45.9 mmol), N,N-dimetilpiridina (2.8 g, 23 mmol), y piridina anhidra (4.1 ml, 50.5 mol) en diclorometano (92 ml). La mezcla de reacción fue vertida en 100 ml de HCI 0.1 N, y las capas resultantes fueron separadas. La capa orgánica fue lavada con 50 ml cloruro de amonio acuoso saturado y luego secada sobre sulfato de magnesio. La capa orgánica fue filtrada y concentrada al vacío hasta un aceite transparente. El aceite resultante fue purificado por destilación (p.e 134-136°C) para dar acetato de isoamilo. 1H RMN (300 MHz, CDCI3) 4.08 (t, 2H, J 6.9), 2.03 (s, 3H), 1.68 (m, 1H), 1.51 (q, 2H, J 6.9), 0.92 (d, 6H, J 6.6).

Ejemplo 9 - Inhibición de patógenos fúngicos y humanos por volátiles en ensayos in vitro en placas de Petri. Una tira de agar fue removida del centro de las placas de PDA, creando dos secciones aproximadamente iguales y separadas donde los microorganismos pudieron crecer, como es descrito por Strobel y colaboradores, 2001. Un tapón de agar del cultivo de M. albus fue colocado en una sección y cultivado por 10 días con las placas encerradas en una bolsa de plástico. Después de diez días, la otra sección fue inoculada con varios patógenos fúngicos, con placas seccionadas sin M. albus sirviendo como control. Se emplearon tres placas para cada tratamiento. Peniclllium expansum, Monilinia fructicola, Candida albicans y las bacterias fueron aplicados como una suspensión de esporas/células, mientras que los otros patógenos fueron aplicados como un solo tapón de micelio de 3 o 6 mm en cada placa. El crecimiento de los patógenos, medido por el diámetro de la colonia, fue evaluado después de 3 días. El reaislamiento de los patógenos, para evaluar su viabilidad, fue intentado al final de los experimentos levantando el agar en el área inoculada y transfiriéndolos a placas de PDA frescas. La capacidad relativa de los compuestos volátiles autenticados de M. albus para inhibir y matar los organismos de prueba es mostrada también en la Tabla 1. Se prepararon soluciones de prueba colocando compuestos en viales en las proporciones relativas en las que ocurren en la fase gaseosa de los cultivos de M. albus. La mezcla de prueba fue colocada en una microcápsula previamente esterilizada (4x6 mm) colocada en el centro de una placa de Petri que contiene PDA. Cuando no estaba siendo utilizada, la mezcla fue almacenada a 0°C. Los organismos de prueba, cultivados recientemente y seccionados en bloques de 3 mm3 de agar (al menos 3 bloques de agar por hongo de prueba), fueron colocados a 2-3 cm de la microcápsula y la placa fue envuelta con dos capas de parafilm. Se realizaron mediciones del crecimiento de los micelios desde el borde de los bloques de agar, después de un periodo de tiempo dado. Sin embargo, en el caso de las bacterias y de Candida albicans fueron rayados en el lado de prueba de la placa PDA y se verificó si presentaban nuevo crecimiento visible y viabilidad por un nuevo rayado desde el área original de la placa de agar que había sido inoculada. Se establecieron también controles apropiados en los q ue no se colocó solución de prueba en la microcápsula. Pruebas con 3.2-90 pl de la mezcla artificial por 50 ce de espacio aéreo sobre la placa PDA fueron hechos en 3 réplicas con el fin de obtener los datos IC5o para cada organismo de prueba, separadas También se evaluaron clases individuales de compuestos en las cantidades relativas en las que ocurren a la concentración óptima de la mezcla completa, que corresponde a 60µ? de la mezcla de prueba por 50 ce de espacio aéreo sobre el cultivo en una placa de Petri estándar. Por ejemplo, los ésteres representan el 44% de la mezcla de los volátiles identificados y se evaluaron a 26.4 µ?/50 ce de espacio aéreo y se empleó el mismo procedimiento para cada una de las otras clases de compuestos que se identificaron . Finalmente, cada compuesto individual, especialmente entre los ésteres, fue evaluado a la concentración o porcentaje relativo en el que ocurre en 60µ?. La viabilidad de los microbios de prueba se midió removiendo asépticamente el pequeño bloque de agar y colocándolo en una placa de PDA y observando el crecimiento después de 1 -3 d ías. Ningu no de los patógenos, a excepción de F. solani y F. oxysporum lycopersici, crecieron en la presencia de M. albus (Tabla 1 ) y su crecimiento fue inhibido. Los dos patógenos sobrevivieron en la presencia de M. albus, cuando fueron transferidos a placas frescas tres días después. Además, los volátiles de M. albus no mataron al mismo M. albus o a su cercanamente relacionada Xylaria sp., aunque inhibieron el crecimiento de Xylaria sp. (Tabla 1).

Ejemplo 10 Pruebas de clases de compuestos volátiles y componentes volátiles individuales en ensayos in vitro Las clases individuales de compuestos en los volátiles naturales de M. albus fueron evaluadas con el fin de determinar la actividad biológica relativa de cada una. Cada clase de compuestos, en las proporciones relativas en las que ocurren, fue probada al nivel de porcentajes en que ocurren en el total de 60µ?/50 ce (1.2 µ?/cc) (Tabla 5). Esto se hizo con un grupo selecto de 7 hongos de prueba. Cada grupo de compuestos presentó algo de actividad inhibitoria contra los organismos de prueba (Tabla 5). Sin embargo, en una base comparativa los ésteres tuvieron más actividad inhibitoria que cualquier otro grupo de compuestos (Tabla 5). Cada compuesto en la clase de ésteres fue individualmente evaluado. Cuando una prueba comparable para cada éster se realizó en condiciones similares a las de la Tabla 5, el acetato de 3-metil-1 -butilo prácticamente reprodujo los resultados de todos los ésteres, como en la Tabla 5. Representó el 62% de todos los ésteres identificados combinados y por lo tanto se evaluó al nivel de 0.32 µ?/cc. Adicionalmente, una bioactividad inhibitoria mínima fue exhibida por el 2-metilpropanoato de 3-metil-1 -butilo y actividad nula o muy baja se notó por parte de los otros ésteres. Aunque los ésteres, y el acetato de 3-metil-1 -butilo presentaron actividad inhibitoria en los bioensayos de prueba, bajo ninguna condición en n inguno de los ensayos se observó la muerte de ningún hongo de prueba después del periodo estándar de exposición de 3 días (Tabla 5) . Esta es una observación significativa, debido a que la muerte de los organismos de prueba se observó tanto en la atmósfera completamente artificial como en la atmósfera natural de la placa de Petri con M. albus. Este resultado sugiere fuertemente que se presenta un mecanismo sinérgico o aditivo en el caso de los volátiles de M. albus. Por consiguiente, mientras que cada clase de compuestos presenta más o menos actividad inhibitoria, una mezcla completa de los ingredientes es requerida para matar por completo los hongos y bacterias de prueba (Tabla 1 ). Basándose en el hecho q ue los volátiles de M. albus pueden inhibir y matar E. coli (Tabla 1 ) se hicieron experimentos con M. albus para determinar si los gases pueden inhibir y matar la microflora presente en desechos humanos y animales, tal como E. coli y otros microbios fecales. Estos microbios comúnmente son la causa de la disentería y otras enfermedades d urante tiempos de crisis mayores que incluyen a los desastres naturales y las guerras. Existe la posibilidad que M. albus pueda ser desarrollado y utilizado para aplicaciones de campo de descontaminación de desechos humanos y animales. Así, de acuerdo con nuestros procedimientos, se preparó una colonia de dos semanas de edad de M. albus cultivadas en una mitad de una placa de Petri que contiene PDA. Luego, la otra mitad de la placa separada se rayó (empleando métodos microbiológicos estándares) desechos humanos sólidos. Se montó una placa de control en la que no estaba presente ninguna colonia de M. albus. Después de dos días, de incubación a 23°C, había significativamente más colonias fúngicas y bacterianas creciendo en la placa con M. albus. En un experimento comparable, se incubó M. albus únicamente en desechos humanos líquidos (orina) y se excluyó el crecimiento bacteriano total, en contraste con un control (sin M. albus) en el que se presentó crecimiento bacteriano.

Ejemplo 11 - Actividad de Muscodor albus contra el patógeno de suelos Rhizoctonia solani in vivo Para estos experimentos, el medio de crecimiento fue infestado inicialmente con R. solani añadiendo un cultivo en una placa PDA a 1 L de medio de crecimiento (vermiculita). Esta proporción permite un 100 % de mortalidad en los brotes con baja variabilidad entre macetas. Muscodor albus es agregado entonces en varias formas al medio de crecimiento, que es entonces colocado en macetas de plástico de 7.62 centímetros. Las macetas son plantadas con aproximadamente 70 semillas de brócoli, colocadas en una bandeja y surtidas con agua desde el fondo. Los brotes fueron contados después de aproximadamente una semana . Los controles consistieron de R. solani solamente, Muscodor albus solamente y medio de crecimiento solo. Dependiendo del experimento, hay 3 o 4 macetas por tratam iento, acomodadas en un d iseño completamente aleatorio. U n cu ltivo líq uido de 1 0 días de edad de PDB fue homogen izado por algunos segu ndos en una licuadora e incorporado en una proporción de 50 o 200 mi por litro de vermiculita . El tratamiento del cultivo en agar sólido se realizó como se describió anteriormente, con 2 placas de cultivo de 2 semanas de edad por l itro. Las macetas fueron sembradas inmed iatamente después de ser llenadas. El efecto de sellar los volátiles en las macetas tam bién fue investigado: para cada tratamiento, un bolsa de plástico se selló sobre de 3 macetas con u na banda de hu le , mientras que otras 3 macetas se dejaron sin cubierta . Las bolsas fueron removidas después de 3 días. Los resu ltad os m ostraron que el cultivo líquido aplicado en mayor proporción (200 ml/L of vermiculita) fue tan efectivo para preven ir la destrucción de las sem illas por los hongos, como los cultivos sólidos de Muscodor en PDA (Tabla 2) . El efecto de la apl icación de Muscodor parece ser inmed iato, debido a que las tasas de brote obten idas con estos tratamientos fueron normales, a pesar d e que no se realizó un periodo de incubación antes del plantado . La menor proporción de cultivo líq u ido causó cierta reducción en la destrucción de las semillas por los hongos, pero no fue tan efectiva.

El sellado de los volátiles en la maceta con una bolsa de plástico no mejoró la eficacia (Tabla 2).

Ejemplo 12 - Actividad de Muscodor albus como tratamiento post-cosecha de fruta infestada Se hicieron heridas individuales con un clavo en el ecuador de manzanas, cv Gala, que fueron colocadas en platos de plástico, con la herida hacia arriba, en cajas plásticas de 3.8 L. Se colocaron nueve manzanas en cada caja y se utilizaron tres cajas por tratamiento. Las frutas fueron inoculadas con el moho azul, Penicillium expansum pipeteando 20 µ? de suspensión conidial (104/ml) en cada herida ya sea 24 horas antes (pre-inoculación) o inmediatamente antes del experimento. Para el tratamiento de fumigación con Muscodor, 140 gramos de granos de centeno colonizados fueron colocados en los contenedores que fueron posteriormente sellados. El control contenía únicamente frutas inoculadas en cajas selladas. Se incubaron a temperatura ambiente (19-22°C). La enfermedad se evaluó como el porcentaje de frutas infectadas después de 7,14 y 21 días (Tabla 3). El tratamiento que fue pre-inoculado no mostró infección en la manzanas, mientras que se observó una muy baja tasa de infección, de solamente 7% a los 21 días, para las frutas inoculadas inmediatamente antes de la exposición de la fruta a Muscodor.

Ejemplo 13 - Actividad de Muscodor albus contra insectos y nemátodos Nemátodo (Caenorhabditis elegans) Placas empleando el sistema de foso (Worapong y colaboradores, 2001) fueron inoculadas en un lado con M. albus, y en el lado opuesto con E. coli, o nemátodos vivos libres con E. coli. Se montaron placas idénticas sin el Muscodor. Después de cinco dfas la placa sin el Muscodor desarrolló una gran población de nemátodos reproduciéndose las cuales cruzaron el foso y estaban empezando a poblar el lado opuesto del plato de Petri. La E. coli creció presentando la morfología normal de la colonia en la otra placa compañera. La placa tratada con Muscodor desarrolló una colonia substancial que estaba enviando micelios a través de la superficie de PDA. Los nemátodos que estaban presentes estaban lentos, aunque aun móviles. Después de 7 días, el Muscodor alcanzó el borde del PDA y estaba enviando micelios hacia el foso de la placa con E. coli, y a la placa con los gusanos redondos. Únicamente un pequeño número de nemátodos adultos vivos estaban presentes en el agar, y su movilidad era limitada.

Gusano de la remolacha (Spodoptera exigua) Tres vasos de precipitado de plástico pequeños que contenían aproximadamente 150 gramos de semillas de centeno sometidas a autoclave colonizadas con M. albus fueron colocados en una caja de plástico (aproximadamente 1613 cm2). Se montó otra caja a temperatura ambiente sin los tres vasos de precipitados con hongo.

Las dos cajas contenían una placa de Petri de PDA con un tapón pequeño de Rhizoctonia solani en el centro, como u n ind icador para el bioensayo . Placas de m icrotítulo de 96-pozos q ue contenían h uevos de gusano de la remolacha que habían sido expuestas a u na d ieta artificial fueron introducidas en cada caja. Después de dos d ías , los huevos en la caja sin el Muscodor empezaron a eclosionar, y el R. solani desarrolló n uevos micelios. Los huevos de g usano no eclosionaron en la caja que contenía el cu ltivo en centeno de M. albus. Además, se suprimió el crecim iento de R. solani. Después de 5 días , los gusanos en la caja sin tratam iento hab ían alcanzado el segundo y tercer estad io. Pares de placas de m icrotítulo fueron introducidas en las cajas con las larvas de gusano que habían estado creciendo d urante tres d ías con una dieta artificial. La placa en la caja con Muscodor interrumpieron la alimentación y permanecieron atrofiados en com paración con los controles sin tratamiento. Después de 5 días, los gusanos en la placa con tratam iento estaba n muertos.

Escarabajos del gusano de raíz del maíz, Diabrotica undecimpunctata Pares de placas de m icrotítu lo fueron introducidas en las cajas con huevos de g usano de raíz del maíz que habían sid o expuestos a u na d ieta artificial. Cuando los huevos acababan de empezar a eclosionar las placas fueron introducidas en las cajas de prueba. Aproximadamente la mitad de los huevos eclosionaron en la caja con Muscodor. Los restantes no eclosionaron, y todos los neonatos estaban muertos a los dos días. La placa de microtítulo en la caja de control sin tratamiento desarrolló una infestación normal que progresó con 3-6 larvas de tercer estadio por pozo, después de una semana.

Ejemplo 14 - Tratamiento de semillas de cebada infestadas con tizón empleando Muscodor albus En experimentos controlados, reproducidos, 25 semillas de cebada infestadas con Ustilago hordei (tizón cubierto, Tabla 6) fueron colocadas en cada una de dos placas de agar con los gases de M. albus por cuatro días y posteriormente sembradas en tiestos de prueba en un invernadero. Después de 15 semanas las plantas fueron recolectadas y se evaluó la presencia, de tizón en las. cabezas de semillas. Hubo un 100% de control para esta enfermedad en dos grupos de plantas que habían sido expuestas a los gases de M. albus y ningún signo de inhibición o daño a las plantas provocado por el tratamiento con gases. Un número idéntico de plantas de control (sin tratamiento y de semillas infestadas con U. hordei) presentaron respectivamente 50% y 41%, de cabezas de semillas infestadas en este experimento. También, como se esperaba, las semillas no infectadas generaron plantas que no tienen granos con la enfermedad.

RESULTADOS Y DISCUSION Muscodor albus, gen. et sp. nov., es una especie endófita deuteromycetes (mycelial sterilia) que está relacionada a nivel molecular con el grupo Xylaria ascomicetos. El hongo está relacionado con Xylariaceae en virtud de su homología entre 96-98% de sus rADN 18S (2089 bp) con miembros representativos de este grupo. Adicionalmente, las secuencias ITS1, 5.8S, e ITS2 (652 bp) de M. albus mostraron una relación cercana con varios Xylaria spp. incluyendo X. arbuscula, X. longipes, y X. malí en el nivel entre 89-92%. Tanto la secuencia 18S rADN como la ITS 1&2 5.8 S rADN son únicas, y por consiguiente, Muscodor es considerado un género y especie taxonómicamente diferente. (Worapong y colaboradores, 2001). Los volátiles de M. albus fueron también probados contra plantas inoculadas con hongos patógenos. Los volátiles no presentaron, por ellos mismos, efectos perjudiciales en plantas superiores que se probaron. Sin embargo, fue posible demostrar un 100% de control de tizón cubierto de cebada empleando los volátiles para el tratamiento de semillas inoculadas con Ustilago hordei. Por consiguiente, a causa de la importancia práctica potencial de los hongos productores de antibióticos volátiles fue muy importante determinar si existen en la naturaleza otros organismos de este grupo. Empleando técnicas estándar para el aislamiento de hongos endófitos, así como la utilización de los volátiles de M. albus como una herramienta de selección en cultivo, se aislaron por lo menos dos endófitos productores de antibióticos volátiles. Estos organismos fueron obtenidos de dos especies diferentes de árboles nativos de Australia. Estos dos cultivos fúngicos comparten similitudes con M. albus porque no producen cuerpos fructíferos en el cultivo, no producen esporas, presentan un olor a moho y producen inhibición o son letales para muchos microorganismos. Sin embargo, del mismo modo, estos organismos presentan características de cultivo, químicas y en su biología molecular que los diferencian de M. albus. Ha sido claramente demostrado que las características moleculares de un organismo son únicas para éste y pueden ser utilizadas para ayudar en la clasificación especialmente cuando están ausentes estructuras críticas (producción de esporas) u otras características. Por lo tanto, el método de mapeo de caracteres filogenéticos combinado con datos morfológicos puede ser útil en la identificación de hongos. Comúnmente, los genes de rADN son escogidos para propósitos taxonómicos porque presentan un alto grado de conservación. (Bruns y colaboradores, 1991; Guarro y colaboradores, 1999 y Mitchell y colaboradores, 1995). Además de su 18S rADN, las secuencias ITS 1&2 también se conservan también. Después de buscar secuencias 18S rADN parciales de M. roseus "A3-5" (2055 bp) con datos en GenBank utilizando BLASTN 2.2.1, los resultados mostraron un 100 % de similitudes con 2089 bp de Muscodor albus (AF324337) desde el sitio 1-981,1319-2048, y 98% de similitudes con 982 bp de Xylaria polymorpha- (AB014043) e Hypoxylon fragiforme (ABO14046), y un 97% de similitudes con 982 bp de Roselllnia necatrix (AB014044). Además, el aislado "A-10" presenta un 99% de similitud de secuencia en su 18S r ADN (2051 bp) en comparación con el aislado "A3-5." Por otra parte, análisis comparativos de las secuencias ITS 1&2 y 5.8S rADN de M. roseus "A3-5" coincidió con ITS 1&2 de Muscodor albus (AF324337), X. arbuscula CBS 452.63 (AF163029) y CBS 454.63 (AF163028), X. enteroleuca CBS 148, (AF163033), X. longipes CBS 148.73 (AF163038), X malí CBS 385.35 (AF163040), X cornu-damae CBS 724.69 (AF163031), en un 99,.91, 91, 91, 90 y 89% de similitudes, respectivamente. No se encontraron identidades totales ya sea de secuencias parciales 18S rADN o de secuencias ITS 1&2 y 5.8S rADN. Análisis filogenéticos basados en las secuencias 18S mostraron que M. roseus es un grupo hermano de Muscodor albus (AF324337) con confianza de secuencia de cebado de 100 % a partir de 100 réplicas. Además, el análisis de parsimonia máxima mostró que tanto M. albus como M. roseus están más cercanamente relacionados con los Xylariaceae, por ejemplo Xylaria spp., Rosellinia necatrix (AB014044) y Poronia punctata (AF064052) que con tres géneros representativos de Amphishaeriaceae: Pestalosphaeria hansenii (AF242846), Discostroma tricellular (AF346546) y Amphisphaeria sp. (AF346545) con confianza de secuencia de cebado del 68 % a partir de 100 réplicas (Felsenstein, 1985). Este resultado fue también apoyado por un árbol filogenético de búsqueda heurística de estricto consenso de 30 cladogramas del ADNr 18S igualmente más parsimoniosos. Por consiguiente, M. roseus debe ser colocado en la familia Xylariaceae, Xylariales. Además, los resultados de ia comparación tanto de la 18S rADN como de la ITS 1&2 y 5.8S rADN de M. roseus "A3-5" presentan grandes similitudes con M. albus (Worapong y colaboradores, 2001). También, los datos biológico moleculares (18S rADN) sugieren que ambos aislados "A3-5" y "A- 10" de M. roseus deben ser considerados como altamente relacionados, y organismos virtualmente idénticos. Adicionalmente, los datos biológico moleculares proporcionan cierto apoyo al concepto para la división de M. albus, previamente descrita, a partir de esta nueva especie fúngica propuesta: M. roseus. Mientras que la biología molecular de M. roseus muestra que este organismo tiene el mejor ajuste en el grupo Xylariaceae, también demuestra una relación estrecha de 18S rADN con a M. albus. Sin embargo, debido a que hay tal relación a nivel molecular limitado del rADN, podría argumentarse que los dos hongos son idénticos. A pesar de esto, otras características químicas tanto en M. albus como en M. roseus fueron examinadas y se descubrió que son diferentes. Por lo tanto, aunque ambos M. albus y M. roseus comparten la capacidad bioquímica de producir un olor a moho, que se demostró que tiene propiedades antibióticas poderosas, muchos de los volátiles producidos por estos dos organismos resultaron idénticos, según mediciones por GC/MS. Se ha notado frecuentemente que los hongos producen una variedad de sustancias olorosas, pero las propiedades antibióticas impresionantes de Muscodor spp. parecen ser únicas (Bjurman y colaboradores, 1992; Rapoir y colaboradores, 2000 y Schnurer y colaboradores, 1999) . Sin embargo, los volátiles de estos dos hongos también contenían compuestos diferentes (Strobel y colaboradores, 2001 ). Como un ejemplo, M. albus produce 2-nonanona, cariofileno, y éster de ácido acético 2-feniletilo, aunque estos compuestos no fueron detectados en ningún aislado de M. roseus. Por otra parte, los dos aislados de M. roseus producen compuestos no detectados en volátiles de M. albus, tal como éster etílico de ácido 2-butenoico; ,2,4-trimetilbenceno y 2,3 nonadieno. Este resultado aporta cierto apoyo químico a la asignación realizada en este informe que sugiere que M. albus es taxonómicamente diferente de M. roseus. Otras características más clásicas de M. roseus (aislados "A3-5" y"A-10") fueron también examinadas y comparadas con M. albus. Estos aislados de M. roseus produjeron un micelio de crecimiento lento, denso y de color rosa ligero en todos los medios probados. Estas contrasta con M. albus que produce u n micelio blancuzco en todos los medios comparables probados. (Worapong y colaboradores, 2001 ). No se formaron esporas en ningún medio, incluyendo aquellos que contenían el material de la planta hospedera u hojas de clavel . Las hifas variaron en diámetro (0.8-3.6 pm) y estaban frecuentemente entretejidas para producir estructuras más complejas e incluso espirales de hifas. Estas hifas fueron generalmente mayores que las de M. albus. El micelio de . roseus generalmente forma, en el cultivo, estructuras entretejidas más complejas en comparación con M. albus. De hecho, la aparición de espirales de hifas de hongos en cultivos no es común, según nuestra experiencia, y estas estructuras aparecieron con frecuencia en cultivos de M. roseus. Finalmente, debe notarse que para M. roseus, la mejor condición de almacenamiento fue después de secarlo en papel filtro y colocarlo a -70°C. Bajo estas condiciones el hongo permanece viable por más de 1.5 años. Además, este hongo podría ser almacenado a 4°C en agua estéril, pero con menos certeza de recuperar un organismo viable después de 6 meses. Además, el almacenamiento en glicerol al 15% a -70CC preservó efectivamente la viabilidad del organismo. La discusión y ejemplos precedentes tienen meramente la intención de ilustrar la técnica. Como es aparente para un experto en la técnica, se pueden hacer varias modificaciones a lo anterior sin apartarse del espíritu y alcance de esta invención.

Referencias 1. Altschul, S. F., y colaboradores. (1997). Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. 2. Bacon C. W. y White JR. J. F. Microbial Endophytes. Marcel Dekker Inc., New York. 3. Bjurman J. y Kristensson, J. (1992) Mycopathologia 118: 173. 4. Bruns, T. D., y colaboradores. (1991). Annu. Rev. Ecol. Syst. 22: 525-564. 5. Dennis, C&Webster, J.(1971 ) Trans. Br. Mycol. Soc.57: 41-48 6. Felsenstein, J. (1985). Evolution 39: 783-791. 7. Guarro, J., y colaboradores. (1999). Clinical Microbiology Reviews, 12.: 454-500. 8. Hawksworth, D. C. y Rossman, A. Y. (1987) Phytopath. 87: 888. 9. Heathcock, R. y Ratcliffe, R. (1971). J. Am. Chem. Soc. 93: 1746. 10. Hoefle, G. y colaboradores, (1978) Vorbrueggen, Agnew. Chem., Int. Ed. Engl. 17: 569. 1 . Lee, S. B. y Taylor, J. W. (1990). En PCR Protocole A. Guide to Methods and Applications. Editado por Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky J. J., White, T. J. Academic Press, Inc., California: pp.282-287. 12. Li, J. Y. y colaboradores, (2000), Org. Lett.2: 767. 13. Li, J. Y. y colaboradores, (2001), Phytochem.56: 463. 14. Mitchell, J. I., y colaboradores. ( 995). Mycologist 9: 67-75. 15. Nelson, P. V. (1998) Greenhouse Operation and Management 5ta ed. Prentice-Hall. 16. Rapior, S., y colaboradores. (1995). Mycologia 92: 305-308. 17. Rapior, S. (2000), Mycologia 92 : 305. 18. Schniirer, J., y colaboradores. (1999). Fungal Genetics and Biology 27: 209-217. 19. Schnurer, J. y colaboradores, (1999), Fungal Genetics and Biology 27: 209. 20. Stierle, A. y colaboradores, (1993), Science 260: 214. 21. Strobel, G. A. y colaboradores, (2001), Microbiol. 147: 2943-2950. 22. Strobel, G. A., y colaboradores. (1996). Microbiology 142: 435-440. 23. Strobel, G. A., y colaboradores. (2000). Mycotaxon. 76: 257-266. 24. Swofford, D. L. (1999). Phylogenetic Analysis Using parsimony (*and Other Methods). Versión 4.0d64. Sunderland, MA: Sinauer Associates. 25. Thomson, J. y Gibson T. (1997). Clustal V. Múltiple Sequence Alignments. En: Documentation (Installation and Usage) European Molecular Biology Laboratory Postfach Germany: 1-37. 26. White, T. J., y colaboradores. (1990). Amplificación y secuenciado directo de genes de ARN ribosomal fúngico para filogenética. En PCR Protocole: A guide to Methods and Applications. Editado por Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky J. J., White, T. J. Academic Press, Inc., California: 315-324. 27. Willits, D. A. y Sherwood, J. E. (1999). Phytopath. 89 : 212-217. 28. Worapong, J. y colaboradores. (2001). Mycotaxon. 79 : 67-69. 29. Yang, X. y colaboradores, (1994), Plant Science 102: 1.

Tabla 1 . Los efectos de l os comp uestos volátiles de M. albus y de u na mezcla artificial de com puestos de M. albus en un grupo de microorgan ismos de prueba. % de Viabilidad IC50 en % de Viabilidad Microbio de crecimiento después de 3 atmósfera crecimiento después de prueba sobre control días de artificial por (mm) sobre 3 días de después de exposición a 2 días el control exposición exposición por cultivo de M. (µ?/CC) en a la 2 días a M. albus atmósfera atmósfera albus artificial artificial Pythium ultimum 0 Muerto 0.48±0.01 0 Muerto Phytophthora 0 Muerto 0.29+0.06 0 Muerto cinnamoni Penicillium 0 Muerto # # # expansum Rhlzoctonia 0 Muerto 0.08+0.02 0 Muerto solani Ustilago hordei 0 Muerto 0. 31±0.09 0 Muerto Stagnospora 0 Muerto 0.15+0 0 Muerto nodorum Sclerotinia 0 Muerto 0.17+0.05 0 Vivo sclerotiorum Scerotinia minor 0 Muerto # # # Aspergillus 0 Muerto 0.41 ±0.05 0 Vivo fumigatus Monilinia 0 Muerto # # # fructicola Fusarium solani 19.4+0.284 Vivo 1.13±0.07 42.0+2 Vivo Fusarium 4 Vivo # # # oxysporum Verticillum dahliae 0 Muerto 0.3+0 0 Muerto Cercospora 17.5 ±3.5 Vivo 0.12±0.15 8±2 Vivo beticola Tapesia yallundae 0 Muerto 0.64±0 0 Muerto Xylaría sp 25±0 Vivo 0.41+0.03 0 Vivo Muscodor albus 100+0 Vivo 0.6+0 17.5±7.5 Vivo Escheríchia coli 0 Muerto # 0 Muerto Staphlococcus 0 Muerto 0 Muerto aureus Microbio de prueba % crecimiento Viabilidad IC50 en la % Viabilidad sobre control después de atmósfera crecimiento después de después de exposición artificial por (mm) sobre exposición exposición por 3 días a 2 días control en por 3 días a por 2 días a cultivo M. (pl/CC) atmósfera la atmósfera M. albus albus artificial artificial Micrococcus luteus 0 Muerto # 0 Muerto Candida albicans 0 Muerto # Trazas Vivo Bacillus subtilus 0 Vivo # 0 Vivo Leyenda : *La cantidad de cada compuesto identificado positivamente , empleada en la mezcla artificial se obtuvo aplicando la sección transversal de ionización electrón ica (% del área total) de com puesto obtenido en el análisis de GC/MS. Las mezclas artificiales fueron probadas subsig uientemente colocándolas en una microcápsula pre-esteril izada (4x6 mm) u bicada en el centro de una p laca de Petri conteniendo PDA. Tapones de agar que conten ían microbios de prueba recién cu ltivados (o microbios rayados) fueron u bicados aproxi madamente a 2-3 cm del centro de la microcápsula. Posteriormente la placa fue envu elta con dos capas de parafilm e incubada por dos o más d ías a 23° C . Las med iciones del crecimiento lineal de los micelios fue hecha desde el borde del tapón de agar inoculado hasta el borde de la colonia d e micelios. # no med idos en este d iseño experimental.

Tabla 2. Número promedio de brotes de brócoli por maceta, una semana después del plantado (medias ± desviación estándar) utilizando vermiculita.

Tabla 3. Porcentaje de manzanas infectadas con moho azul {Penicillium expansum) después de 7, 14 y 21 días, comparando la pre-inoculación con moho azul a la inoculación inmediatamente antes de la exposición a Muscodor. Los controles sin tratamiento no fueron expuestos a Muscodor. a: las desviaciones estándar son altas debido al número pequeño de frutas.

Tabla 4. Anál isis por GC/MS de los com puestos voláti les producidos por M. albus.

TR Área total (%) /z Compuesto posible MW 3:45 0.33 114 Octano 114 4:19 0.93 58 Acetona 58 4:37 0.68 74 Acetato de metilo 74 5:56 7.63 88 Acetato de etilo 88 6:51 0.31 102 2-metilpropanoato de metilo 102 7:16 6.24 * Etanol 46 8:03 2.07 116 2-metilpropanoato de etilo 116 11 :45 0.58 * 2-metilpropanoato de 2-metilpropilo 144 12:05 2.06 74 Isobutanol 74 12:50 22.24 * Acetato de 3-met¡l-1-butilo 130 14:57 1.53 * 2-metilpropanoato de 3-metilbutilo 158 15:28 22.99 * 3-metil-1-butanol 88 16:08 0.29 138 #Furano, 2-penül- 138 18:53 0.29 142 #4-nonanona 142 20:38 0.41 142 2-nonanona 142 21:07 0.30 204 # Naftaleno, 204 decahidro-4a-metil-1 -metilen-7-(1 - metiletiliden)-, (4aR-trans)- 22:54 1.51 204 # Azuleno, 204 1,2,3,4,5,6,7,8-octahidro-1,4-dimetil-7-(1- metiletenil)-,[1S-(1.alfa.,4.alfa.,7.alfa.)] 23:16 0.94 204 # Ciclohexeno, 204 4-(1 ,5-dimetil-1 ,4-hexadienil)-1-metil- 25:20 3.63 204 # 1 H-3a,7-metanoazuleno, 204 2,3,4,7,8,8a-hexahidro-3,6,8,8 tetrametil- ,[3R- (3.alfa.,3a.beta.,7-beta.,8a.alfa.)] 25:30 6.08 88 Ácido 2-metilpropanoico 88 * No se observó pico de ión molecu lar ni en el espectro del compuesto estándar ni del com puesto q ue sufre el análisis. # Denota que un espectro y tiempo de retención de este componente fue observado y que la sustancia coincide con el compuesto más p robable en la base de datos N IST, pero los datos no ha n sido confirmados mediante la utilización de un compuesto estándar idéntico apropiado med iante ya sea el tiempo de retención o el espectro de masas. Estos compuestos no fueron colocados en la mezcla artificial en la prueba de bioensayo.

Tabla 5. La Influencia inhibitoria de cada clase de compuestos volátiles es expresada como el % de crecimiento del microbio de prueba, en comparación con u n control que no está en presencia de los compuestos de prueba.

*Todas las mediciones del crecimiento del micelio comparado con el control no tratado se hicieron como se describe en la Tabla 1. # N inguno de los microbios murió después de tres días de exposición a cualquiera de las mezclas artificiales de prueba mostradas en esta tabla.

Tabla 6. Número de semillas de cebada infectadas con Ustilago hordei con y sin pre-tratamiento con Muscodor albus.

Tratamiento Relación plantas enfermas a sanas Exp. 1 Exp. 2 Sin tratamiento 16/32 13/31 Volátiles de M. albus 0/33 0/42 Control no infestado 0/41 0/39

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un cultivo aislado de Muscodor albus y mutantes del mismo. 5

2. Un cultivo aislado de Muscodor roseus y mutantes del mismo.

3. Una composición volátil producida por el cultivo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

4. Una composición que comprende el cultivo aislado de las 10 reivindicaciones 1 o 2 y un vehículo.

5. La composición de la reivindicación 3, en donde el vehículo es un vehículo aceptable para fines agrícolas.

6. La composición de la reivindicación 3, que comprende además una cantidad efectiva para fines agrícolas de una 15 composición agrícola seleccionada del grupo que consiste de un funguicida, un insecticida, un antimicrobiano, un bactericida, un nematicida y un conservador alimenticio.

7. La composición volátil de la reivindicación 3, que comprende además una cantidad efectiva para fines agrícolas de un 20 compuesto agrícola volátil, seleccionado del grupo que consiste de un funguicida, un insecticida, un antimicrobiano, un bactericida, un nematicida y un conservador alimenticio.

8. Un método para inhibir el crecimiento de un organismo seleccionado del grupo que consiste de un hongo, una bacteria, un 25 microorganismo, un nematodo y un insecto, que comprende poner en contacto el organismo con una cantidad efectiva del cultivo de las reivindicaciones 1 o 2.

9. Un método para inhibir el crecimiento de un organismo seleccionado del grupo que consiste de un hongo, una bacteria, un microorganismo, un nematodo y un insecto, que comprende poner en contacto al organismo con una cantidad efectiva de la composición volátil de la reivindicación 3.

10. Un método para tratar o proteger frutas, plantas, semillas, granos o el suelo que rodea las plantas de una infestación por un organismo seleccionado del grupo que consiste de un hongo, una bacteria, un microorganismo, un nematodo y un insecto, que comprende poner en contacto al organismo con una cantidad efectiva del cultivo de las reivindicaciones 1 o 2.

11. Un método para tratar o proteger frutas, plantas, semillas, granos o el suelo que rodea las plantas de una infestación por un organismo seleccionado del grupo que consiste de un hongo, una bacteria, un microorganismo, un nematodo y un insecto, que comprende poner en contacto al organismo con una cantidad efectiva de la composición volátil de la reivindicación 3.

12. Un método para tratar productos de desecho humanos o animales que comprende poner en contacto los productos con una cantidad efectiva del cultivo de las reivindicaciones 1 o 2.

13. Un método para tratar productos de desecho humanos o animales que comprende poner en contacto al organismo con una cantidad efectiva de la composición volátil de la reivindicación 3.

14. Un método para tratar o proteger material de construcción de infestaciones con moho tóxico que comprende poner en contacto el material con una cantidad efectiva del cultivo de las reivindicaciones 1 o 2.

15. Un método tratar o proteger material de construcción de infestaciones con moho tóxico, que comprende poner en contacto al organismo con una cantidad efectiva de la composición volátil de la reivindicación 3.

16. Una composición que comprende los componentes nombrados en la Tabla 4.

17. El método de la reivindicación 10, que comprende además poner en contacto las frutas, plantas, semillas, granos o suelo que rodea las plantas con una cantidad efectiva de una composición agrícola seleccionada del grupo que consiste de un funguicida, un insecticida, un antimicrobiano, un bactericida, un nematicida y un conservador alimenticio.

18. El método de la reivindicación 11, que comprende además poner en contacto las frutas, plantas, semillas, granos o suelo que rodea las plantas con una cantidad efectiva de una composición agrícola seleccionada del grupo que consiste de un funguicida, un insecticida, un antimicrobiano, un bactericida, un nematicida y un conservador alimenticio.

19. Un método para inhibir el crecimiento de un organismo seleccionado del grupo que consiste de un hongo, una bacteria, un microorganismo, un nematodo y un insecto, que comprende poner en contacto al organismo con u n a cantidad efectiva de la composición de cualq u iera de las reivind icaciones 12 a 1 5.

20. Un método para tratar o proteger frutas, plantas, semillas, granos o suelo que rodea las plantas de una infestación por un organismo seleccionado del grupo que consiste de u n hongo, u na bacteria , un microorganismo, un nematodo y u n insecto, que comprende poner en contacto al organ ismo con u na cantidad efectiva de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19.

21 . Un método para identificar hongos Muscodor novedosos, que comprende poner en contacto u na cantidad efectiva de los hongos a ser clasificad os con los volátiles de Muscodor albus o Mucodor roseus bajo condiciones de cultivo y seleccionar los hongos q ue sean resistentes a los volátiles del Muscodor albus o Muscodor roseus para identificar de esta forma a los hongos Muscodor novedosos.

22. Un hongo Muscodor aisl ado seleccionado mediante el método de reivind icación 21 .

23. Un método para obtener una composición volátil que comprende cultivar el Muscodor aislado de las reivindicaciones 1 o 2 y recolectar la composición volátil producida por el Muscodor cultivado.

24. U n hongo Muscodor aislado. RESU M EN Esta invención proporciona un hongo endófito novedoso, Muscodor, que produce una mezcla de antib ióticos volátiles con actividad sobre patógenos específicos de plantas, bacterias, nematodos e insectos. También se proporciona un método para tratar o proteger plantas, suelo y sem il las de infecciones microbianas que comprende aplicar una cantidad efectiva de un Muscodor sp . q ue prod uce antibióticos volátiles . La invención se refiere también a composiciones fungu icidas, bactericidas, i nsecticidas y nematicidas que com prenden este cepa de Muscodor novedosa y los antibióticos y metabol itos producidos por esta cepa ya sea solos o en combinación con otros pesticidas q uím icos y b iológicos. También se proporciona un método para identificar y aislar hongos relacionados q ue producen gas.