KR100951483B1 - 신규한 내생 진균 및 그의 사용방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특정 식물 병원체, 세균, 선충 및 곤충에 대하여 활성을 갖는 휘발성 항생물질의 혼합물을 생산하는 신규 내생 진균인 무스코도르(Muscodor)을 제공한다. 본 발명은 또한 유효량의 휘발성 항생물질-생산 무스코도르(Muscodor) 종을 투여하는 것을 포함하는 미생물 감염으로부터 식물, 토양 및 종자를 처리 또는 보호하는 방법도 제공한다. 본 발명은 또한 상기 신규 무스코도르(Muscodor) 균주 및 이러한 균주에 의해 생산된 항생물질 및 대사물질을 단독으로 또는 다른 화학적 및 생물학적 살충제와 조합하여 포함하는 살진균제, 살균제, 살곤충제 및 살선충제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 관련된 가스를 생산하는 진균을 동정하고 분리하는 방법도 제공한다.
무스코도르 알부스(Muscodor albus), 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus), 휘발성 항생물질, 내생균, 진균

Description

신규한 내생 진균 및 그의 사용방법{Novel endophytic fungi and methods of use}
본 발명은 휘발성 항생물질을 생산하는 신규 진균의 분리에 관한 것이다. 이러한 휘발성 화합물은 식물과 인간의 병원성 진균 및 세균, 곤충 및 선충에 대하여 생물학적 활성을 갖는다.
본 출원을 통하여, 다양한 논문과 책은 저자와 날짜에 의해 참고하기 쉽도록 정렬되어 있다. 각 문헌에 대한 전체 서지학적 예시는 본 명세서의 마지막, 청구범위 바로 앞에서 찾아 볼 수 있다.
진균이 공업적 용도에서 질병의 치료에 유용한 항생물질 및 페니실린, 세팔로스포린, 테트라사이클린 및 시클로스포린과 같은 살충제를 생산하는 것은 잘 알려져 있지만, 이들은 모두 휘발성이 아니다. 많은 진균 종이 저농도의 가스성 물질, 특히 분명한 불쾌한 향을 갖는 가스성 물질을 방출하는 것으로 알려져 있고, 이것은 진균성 휘발성 물질의 화학분석을 촉진시켰다(Bjurman 등, 1992). 이들 휘발성 물질의 일부는 많은 진균에서 공통되는 것이지만, 다른 것들은 한가지 종에 독특한 것으로 보인다(Schnurer 등, 1999; Rapior 등, 2000). 데니스 및 웹스 터(1971)는 특정 트리코데르마(Trichoderma) 종이 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 피튬 울티뭄(Phythium ultimum) 및 후사륨 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)과 같은 시험 진균의 성장을 억제시키는 휘발성 항생물질을 생성한다고 보고하였다. 상기 저자들에 의해서는 상기 시험 진균중 어떤 것에 대해서도 치명성이 보고되지 않았고 또 진균 배양물의 휘발성 성분의 종합적인 화학적 분석은 실시되지 않았지만, 알데히드가 휘발성 물질중의 하나로 제시되었다. 따라서, 수년간에 걸쳐 진균 배양액의 휘발성 화합물에 대해 주의를 경주하였지만, 진균에 의해 생산된 치명적인 휘발성 항균물질의 혼합물은 아직 보고되지 않았다.
다양한 미생물이 식물 질병을 유용하게 제어하도록 생물학적 활성을 나타내는 것은 잘 알려져 있다. 농업 및 원예학적으로 중요한 다양한 식물 질병을 제어하기 위한 생물학적 살충제를 확인하고 개발하는 분야에서 진보가 이루어 졌지만, 사용되고 있는 대부분의 살충제는 여전히 합성 화합물이다. 이들 화학적 살진균제의 다수는 EPA에 의해 발암물질로 분류되어 있으며 또 야생종 및 기타 비-표적 종에 대해서 독성을 갖는다. 예컨대, 브롬화 메틸은 토양 훈증제로서 수확후 미생물 감염을 처리하기 위해 널리 사용되고 있다. 인간 및 동물에 대한 높은 독성 및 대기에 대한 유해 영향으로 인하여, 브롬화메틸의 사용은 곧 고려되지 않게 되었고 따라서 상술한 합성 살충제 및 기타 합성 살충제를 대체할 수 있는 더 안전한 물질을 절실하게 필요로 하게 되었다.
본 발명은 상기 목적을 만족시키고 또한 관련된 이점을 제공하는 것이다.
다양한 미생물이 식물 질병을 유용하게 제어하도록 생물학적 활성을 나타내는 것은 잘 알려져 있다. 농업 및 원예학적으로 중요한 다양한 식물 질병을 제어하기 위한 생물학적 살충제를 확인하고 개발하는 분야에서 진보가 이루어 졌지만, 사용되고 있는 대부분의 살충제는 여전히 합성 화합물이다. 이들 화학적 살진균제의 다수는 EPA에 의해 발암물질로 분류되어 있으며 또 야생종 및 기타 비-표적 종에 대해서 독성을 갖는다. 예컨대, 브롬화 메틸은 토양 훈증제로서 수확후 미생물 감염을 처리하기 위해 널리 사용되고 있다. 인간 및 동물에 대한 높은 독성 및 대기에 대한 유해 영향으로 인하여, 브롬화메틸의 사용은 곧 고려되지 않게 되었고 따라서 상술한 합성 살충제 및 기타 합성 살충제를 대체할 수 있는 더 안전한 물질을 절실하게 필요로 하게 되었다.
본 발명은 상기 목적을 만족시키고 또한 관련된 이점을 제공하는 것이다.
진균, 세균, 곤충 및 선충에 대하여 활성을 갖는 휘발성 항생물질의 혼합물을 생산하는 무스코도르 알부스(Muscodor albus) 및 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus)를 비롯한 신규한 내생 진균이 제공된다. 일개 요지로서, 본 명세서에 제공된 정보를 이용하여 무스코도르(Muscodor)가 확인되며, 그의 일부 게놈 서열은 서열번호 1 내지 4에 개시되어 있지만, 여기에 한정되는 것은 아니다. 2개의 신규한 균주는 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약의 규정 하에 2002년 2월 1일 NRRL에 수탁번호 30547호 및 30548호로 기탁되었다.
진균 및/또는 휘발성 화합물을 함유하는 조성물도 제공된다. 상기 조성물은 토양을 처리하고 또 식물, 종자, 알곡 및 과일을 병원성 진균 및 세균으로부터 보호하는데 유용하다. 상기 조성물은 또한 세균 및 진균 감염으로부터 수확후 식량을 보호하는데 유용하다. 상기 조성물은 또한 인간 또는 동물 폐기물을 처리하는데 유용하며 또 건물 및 나무와 같은 건축재료의 독성 곰팡이 감염을 처리 및/또는 방지하는데 유용할 수 있다. 토양, 식물, 종자, 알곡, 폐기물, 건축 재료 및 수확후 식량제품을 세균, 곤충, 선충 및 진균 감염으로부터 처리하고 보호하는 방법도 또한 본 발명에 의해 제공된다.
표의 간단한 설명
표 1은 시험 미생물 그룹에 대한 엠. 알부스(M. albus) 화합물의 휘발성 화합물 및 엠. 알부스(M. albus) 화합물의 인공적 혼합물의 영향을 나타낸다. 엠. 알부스(M. albus) 가스에 노출시킨 후, 가스로부터 제거시킨 후의 시험 미생물의 생존율에 대해 평가하였다. 인공적 분위기는 엠. 알부스(M. albus) 가스의 분석 후 확인된 화합물로 구성된다. 화합물의 인공 혼합물에 3.2-90 ㎕/50 cc로 노출시킨 후 인공적 분위기중의 미생물 성장을 측정하여 IC50를 얻었다. 대조용과 비교한 % 성장 및 생존율은 60 ㎕/50 cc에 노출시킨 후 측정하였다. 생존율은 3일째에 화합물을 제거한 후 측정하였다.
표 2는 질석을 사용하여 심은 (평균 ± 표준 편차)지 1주후 포트당 브로콜리 묘목의 평균 개수를 나타낸다. 배양기간 없이 즉시 포트에 심었다.
표 3은 대조용인 사과의 푸른 곰팡이에 대한 무스코도르 알부스(Muscodor albus)의 능력을 측정하는 실험결과를 도시한다.
표 4는 엠. 알부스(M. albus)에 의해 생산된 휘발성 화합물의 GC/MS 분석결과를 나타낸다. 몇 개의 작은 피이크 및 아주 큰 피이크는 전체 면적의 1%만을 나타내므로 전체 분석으로부터 생략하였다. 대조용 PDA 플레이트에서 발견된 화합물은 상기 표에 포함되지 않는다.
표 5는 각 종류의 휘발성 화합물의 억제 효과를 결정하기 위한 에세이의 결과를 나타낸다. 이것은 시험 화합물이 존재하지 않는 대조용에 대한 시험 미생물의 성장%로서 나타낸다. 최적 시험 농도 60 ㎕/50 CC 공기량 또는 1.2 ㎕/cc로 엠. 알부스(M. albus)에서 생기는 상대 농도로 2일간 노출시킨 후 상기 화합물을 시험하였다.
표 6은 보리속깜부기병으로 감염된 보리 종자를 처리하기 위해 사용된 무스코도르 알부스(Muscodor albus) 휘발물질을 나타낸다. 미처리 및 미감염 종자 세트를 대조용으로 사용하였다.
본 발명은 식물과 인간의 병원성 진균 및 세균, 곤충 및 선충에 대하여 생물학적 활성을 갖는 휘발성 항생물질을 효과적으로 생산할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 태양
본 명세서를 통하여, 다양한 문헌, 특허 및 공개 특허명세서가 예시적 확인으로 인용되어 있다. 이들 문헌, 특허 및 공개 특허 명세서의 내용은 본 발명에 관련된 종래기술을 충분히 기재하기 위하여 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다.
본 발명의 실시는 특별히 언급하지 않는 한, 본 기술내에서 분자생물학(재조합수법 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적 수법을 이용한다. 이러한 수법은 문헌에 자세하게 설명되어 있다. 이들 방법은 다음 문헌에 기재되어 있다: 예컨대 Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제2편(1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 등 편찬 (1987)); the sereis METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); PCR: A PRACTICAL APPROACH (M. MacPherson 등, IRL Press at Oxford University Press (1991)); 및 PCR2: A PRACTICAL APPROACH (M. M. MacPherson, B. D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))) 참조.
*정의
단수형태의 단어는 특별히 언급하지 않는 한 복수의 의미도 포함한다. 예컨대, 용어 "세포"는 그의 혼합물을 비롯한 복수의 세포를 포함한다.
용어 "포함하는"은 인용된 요소를 포함하는 조성물 및 방법을 포함하지만, 다른 것을 배제하는 것은 아니다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 "주로 구성되는"은 조합 필수성분 이외의 요소를 배제하는 것은 아니다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 요소로 주로 구성되는 조성물은 분리 및 정제 방법으로부터 얻은 미량 오염물질 및 농업적으로 허용되는 담체를 배제하지는 않을 것이다. "...로 구성되는"은 미량 요소 보다 많은 다른 성분 및 본 발명의 조성물을 적용하는 방법 단계는 배제하는 의미이다. 이들 변이 용어에 의해 정의된 실시예는 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서에서 이용된 "생물학적 대조용"은 제2 생물의 사용에 의한 병원체 또는 곤충의 대조용으로서 정의된다. 생물학적 대조용의 공지된 메카니즘은 뿌리의 표면상의 공간을 두고 경쟁하는 것에 의해 뿌리 썩음을 제어하는 장 세균을 포함한다. 병원체를 제어하기 위하여 항생물질과 같은 세균성 독소가 사용되어 왔다. 이러한 독소는 분리될 수 있고 또 직접적으로 식물에 적용될 수 있거나 또는 세균종은 그 자리에서 독소를 생산하도록 조정될 수 있다.
용어 "진균"은 클로로필을 갖지 않는 다양한 종류의 핵을 갖는 포자-보유 생물을 포함한다. 진균의 예는 효모, 곰팡이, 노균병균, 녹균 및 버섯을 포함한다.
용어 "세균"은 뚜렷한 핵을 갖지 않는 원핵생물을 포함한다.
"살충성"은 식물 해충을 치사시키거나 이들의 성장을 억제하는 물질의 능력을 의미한다.
"살진균성"은 진균을 치사시키거나 이들의 성장을 억제하는 물질의 능력을 의미한다.
"살곤충성"은 곤충 또는 이들의 유충을 치사시키거나 또는 이들의 성장을 억 제하는 물질의 능력을 의미한다.
"살균성"은 세균을 치사시키거나 이들의 성장을 억제하는 물질의 능력을 의미한다.
"살선충성"은 선충을 치사시키거나 이들의 성장을 억제하는 물질의 능력을 의미한다.
"항생물질"은 미생물을 치사시키거나 억제할 수 있는 물질을 포함한다. 항생물질은 미생물에 의해 또는 합성 방법 또는 반합성 방법에 의해 생산될 수 있다. 그러므로, 상기 용어는 예컨대 시클로헥시미드 또는 니스타틴과 같이 진균을 억제하거나 치사시키는 물질을 포함한다.
용어 "배양하는"은 다양한 종류의 배지상 또는 배지중에서 생물의 증식을 지칭한다. "전체 육즙 배양물"은 세포 및 배지를 함유하는 액체 배양액을 지칭한다. "상층액"은 육즙에서 성장한 세포를 원심분리, 여과, 침강 또는 당기술 분야에 공지된 기타 수단에 의해 제거할 때 잔류하는 액체 육즙을 지칭한다.
"유효량"은 유리하거나 바람직한 결과를 얻기에 충분한 양을 말한다. 유효량은 1회 이상의 투여에 의해 투여될 수 있다. 치료 및 보호의 측면에서, "유효량"은 표적 감염 또는 질병 상태의 진행을 완화시키고, 안정화시키며, 반전시키거나, 느리게하거나 지연시키기에 충분한 양이다.
"양성 대조"는 살충 활성을 갖는 것으로 공지된 화합물을 의미한다. "양성 대조"는 시판되는 화학 살충제를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 용어 "음성 대조"는 살충 활성을 갖지 않는 것으로 알려진 화합물을 의미한다. 음성 대 조의 예는 물 또는 아세트산에틸이다.
용어 "대사물질" 또는 "휘발성 물질"은 생물학적 활성을 갖는 화합물, 물질 또는 미생물의 발효 부산물을 지칭한다. 휘발성 물질은 대부분의 경우 주위 온도 및 압력에서 용이하게 증발된다.
용어 "돌연변이체"는 소망하는 생물학적 활성이 부모 균주에 의해 발현되는 생물학적 활성과 유사한 부모 균주의 변이체 뿐만 아니라 돌연변이체 또는 변이체를 얻기 위한 방법을 지칭한다. "부모 균주"는 돌연변이 전의 원래의 무스코도르(Muscodor) 균주로 정의된다. 돌연변이체는 사람이 개입하지 않더라도 자연적으로 생긴다. 돌연변이체는 또한 당분야에 공지된 다양한 방법 및 조성물을 이용한 처리에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 부모 균주는 N-메틸-N'-니트로소구아니딘, 에틸메탄술폰과 같은 화학제에 의해 처리되거나, 또는 감마, x-선 또는 자외선을 이용한 조사에 의해 또는 당업계에서 공지된 다른 수법에 의해 처리될 수 있다.
"조성물"은 활성물질 및 기타 화합물, 담체 또는 조성물, 불활성(예컨대, 검출제 또는 라벨 또는 액체 담체) 또는 활성 보조제의 조합물을 의미한다. 농업적 담체의 예는 이하에 제공되어 있다. 진균은 담체 또는 하나 이상의 화학적 또는 생물학적 살충제와 함께 조성물에 배합될 수 있다.
pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량과 같은 모든 수학적 표시는 0.1 정도로 (+) 또는 (-) 변화될 수 있다. 확실하게 표시된 것은 아니지만, 모든 수자 표시는 용어 "약"이 존재하는 것으로 이해해야한다. 또한 확실하게 표시된 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된 시약은 단지 예시를 위하여 언급한 것이고 그의 등가물이 당분 야에서 공지되어 있음을 이해해야한다.
본 발명내에서 조성물의 양호한 분산 및 접착을 이루기 위하여, 전체 육즙 배양물, 상층액 및/또는 휘발물질은 분산 및 접착을 보조하는 성분과 배합되는 것이 유리할 수 있다. 적합한 배합물은 당업자에게 공지(수화제, 과립제 등)되어 있거나, 또는 적합한 배지, 수성 유동제 및 수성 현탁제, 휘발성 조성물 및 유화성 농축물과 같은 액체에서 마이크로캡슐화될 수 있다. 다른 적합한 배합물은 당업자에게 공지되어 있다.
"변이체"는 본 발명의 균주의 모든 확인 특징을 갖고 또 생물의 게놈과 높은 스트린젠시의 조건하에서 하이브리드화되는 게놈을 갖는 것으로 확인될 수 있는 균주로서, 그 일부는 GenBank 수탁기관에 기탁되어있다. "하이브리드화"는 한 개 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 간의 수소 결합을 통하여 안정화되는 복합물을 형성하는 반응을 지칭한다. 상기 수소 결합은 왓슨-크릭 염기쌍, 후그슈타인 결합 또는 기타 서열-특이적 방식으로 생길 수 있다. 상기 복합물은 이중나선 구조를 형성하는 2개 가닥, 멀티-가닥 복합체를 형성하는 3 또는 그 이상의 가닥, 단일한 자가-하이브리드화 가닥, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 하이브리드화 반응은 상이한 "스트린젠시" 조건하에서 실시될 수 있다. 일반적으로, 낮은 스트린젠시 하이브리드화 반응은 약 40℃에서 10 X SSC중에서 또는 동일한 이온 강도/온도의 용액중에서 실시된다. 중간정도 스트린젠시 하이브리드화는 전형적으로 약 50℃에서 6 X SSC중에서 실시되고, 또 높은 스트린젠시 하이브리드화 반응은 일반적으로 약 60℃에서 1 X SSC중에서 실시된다.
변이체는 엠. 로제우스(M. roseus) 또는 엠. 알부스(M. albus)의 게놈에 대한 서열상동성이 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 또는 더욱 바람직하게는 95% 이상인 게놈 서열을 갖는 균주로 정의될 수 있다. 다른 서열에 대하여 특정 % (예컨대 80%, 85%, 90% 또는 95%)의 "서열 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은 정렬되면, 염기(또는 아미노산)의 %가 2개 서열을 비교할 때 동일하다는 것을 의미한다. 이러한 정렬 및 % 상동성 또는 서열 동일성은 예컨대 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel 등 편찬, 1987) Supplement 30, section 7.7.18, 표 7.7.1에 기재된 것과 같은 공지 소프트웨어 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 변수가 상기 정렬에 이용된다. 바람직한 정렬은 디폴트 변수를 이용하는 BLAST 이다. 특히 바람직한 프로그램은 하기 디폴트 변수를 이용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프 = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기재 = 50 서열; 하이 스코어에 의해 분류됨; 데이터베이스 = 비-반복적, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 것은 다음 인터넷 주소: www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원인은 무스코도르(Muscodor)로 명명된 신규 진균을 분리하고 특징화하였다. 2개 종의 신규 무스코도르(Muscodor), 즉 무스코도르 알부스(Muscodor albus) 및 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus)가 분리되고 확인되었다. 무스코도르 알부스(Muscodor albus)의 일부 게놈 서열은 서열번호 1 및 2에 제공되어 있 고 또 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus)의 일부 게놈 서열은 서열번호 3 및 4에 제공되어 있다. 엠. 로제우스(M. roseus)(A10)의 일부 게놈 서열도 또한 얻었다. 무스코도르 알부스(Muscodor albus)의 분리 배양액은 NRRL에 수탁번호 30547기탁되었다. A3-5로 표시된 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus)의 분리 배양액은 NRRL에 수탁번호 30548호로 기탁되었다. 따라서, 본 발명은 무스코도르(Muscodor)로 표시된 분리된 신규 진균 및 그의 2개 종, 무스코도르 알부스(Muscodor albus) 및 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus) 및 그의 돌연변이체도 제공한다.
본 발명에 의해서는 상기 분리된 무스코도르(Muscodor) 배양물에 의해 생산된 가스성 조성물(휘발물질)도 제공된다. 일개 요지로서, 상기 휘발물질 조성물은 표 4에 나타낸 조성을 갖는다. 상기 가스성 조성물은 적합한 분산제 또는 담체와 조합될 수 있다. 다른 요지로서, 상기 조성물은 경우에 따라 살진균제, 살곤충제, 살선충제, 항균제, 살균제 또는 식품 보존제중 한 개 이상을 유효량 함유한다.
본 출원인은 또한 휘발물질 부생성물의 성분을 확인하고 시판되는 물질로부터 그것을 합성하였다. 상기 합성 휘발물질의 성분은 표 4에 나타낸다. 분명히 예시한 것은 아니지만, 상기 합성 조성물은 무스코도르(Muscodor) 진균에 의해 생산된 천연의 가스성 부생성물의 교체물 또는 치환체로서 상기 기재된 방법에 사용될 수 있다.
무스코도르(Muscodor) 가스는 인간의 건강 문제에 관련된 다수의 다른 미생물에 영향을 준다. 씨. 알비칸 (C. albicans) (표 2) 및 에이. 후미가투스 (A. fumigatus) 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 종을 비롯한 인간의 주요 진균 및 세균성 병원체에 치명적이다. 이것은 에스.아우레우스(S. aureus) 및 이. 콜리(E. coli) (표 2)와 같은 식품을 오염시키는 세균을 치사시킨다. 스타키보트리스(Stachybotrys) 종(가정의 오염물질, 및 공중 건물의 오염물질) 및 다수의 나무 부패 진균에도 치명적인 것으로 밝혀졌다.
따라서, 상기 진균 및 상기 진균에 의해 생산된 가스는 진균, 세균, 미생물, 선충 및 곤충으로 구성된 군으로부터 선택된 생물의 성장을 억제시키거나 치사시키는데 유용하다. 당분야에 공지된 수법을 이용하여, 상기 진균 또는 그의 휘발성 부생성물을, 생물을 치사시키거나 생물의 성장을 억제시키는 유효량으로 생물과 접촉시킨다. 다르게는, 상기 진균 및/또는 그의 휘발성 부생성물은 폐수의 성분과 같은 인간 또는 동물의 폐기물을 처리하거나 또는 고형물 처리하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 또한 인간 및 동물의 폐기물의 정화, 예컨대 세균 및 진균 오염물을 감소시키거나 제거하는데 유용하다. 또한, 진균 및/또는 그의 휘발성 부생성물은 건물, 건축재료 또는 건축재료 간의 공간을 유효량의 휘발성 부생성물과 접촉시키는 것에 의해, 건축재료상 또는 건물내의 독성 곰팡이를 처리하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 예시를 위하여, 유효량의 휘발성 부생성물은 전체 건물을 훈증소독하는 동안 방안 또는 다른 곳에서 단독으로 또는 다른 훈증제와 조합되어 사용될 수 있다.
농업적 용도에 사용될 때, 본 발명은 진균, 세균, 미생물 및 곤충으로 구성된 군으로부터 선택된 생물을 유효량의 분리된 무스코도르(Muscodor) 배양물 또는 그의 휘발성 부생성물과 접촉시키는 것에 의해 과일, 종자, 식물 또는 식물을 둘러싸는 토양이 상기 미생물에 의해 감염되지 않도록 처리하거나 보호하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 스크리닝할 유효량의 진균을 배양 조건하에서 무스코도르 알부스(Muscodor albus) 및 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus)의 휘발물질과 접촉시키고 상기 무스코도르 알부스(Muscodor albus) 및 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus)의 휘발물질에 내성인 진균을 선택함으로써 신규한 무스코도르(Muscodor) 진균을 확인하는 것을 포함하는 신규 무스코도르(Muscodor) 진균을 확인하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의해 선택되어 분리된 무스코도르(Muscodor) 진균을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 분리된 무스코도르(Muscodor)를 배양하고 생장하는 무스코도르(Muscodor)에 의해 생산된 휘발성 조성물을 수집하는 것을 포함하는 휘발성 조성물을 얻는 방법을 제공한다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1 - 진균 분리
무스코도르 알부스( Muscodor albus )
1997년 가을, 혼두라스의 라 세이바의 서쪽 20 마일에 위치한 성숙한 신나모늄 제이라니쿰(Cinnamomum zeylanicum) 나무의 몇 개의 소형 엽편을 제거하고 그 즉시 가공처리하기 위해 몬나타 주립대학으로 수송하여 보냈다. 엽편의 내부 나무껍질, 백목질 및 외부 목질부 조직의 소형 조각을 무균적으로 제거하고 물 한천을 함유하는 페트리 접시위에 놓았다. 몇 일간 배양한 후, 진균을 생성하는 균사 선단을 무균적으로 제거하고 감자 덱스트로오스 한천(PDA)상에 놓았다. 또한, 7일 후, 진균 콜로니를 감마 조사된 카네이션 잎(0.5 x 0.5 cm)으로 전달하여 포자 생성을 유도하였다. 분리된 몇 개의 진균중에 곰팡이 냄새로 인하여 가장 중요한 것은 분리하여 "620"으로 표시하였고, 나중에 무스코도르 알부스(Muscodor albus)로 확인되었다.
무스코도르 로제우스( Muscodor roseus )
호주 남부 영역의 남쪽 12°59'39" 및 동쪽 132°28'50"에 있는 고사리 잎 그레벨리아 (그레빌레아 프테리디폴리아(Grevillea pteridifolia))의 몇 개의 소형 엽편으로부터 진균을 분리하였다. 일부 소형 엽편(0.5 cm 직경)의 내부 나무껍질, 백목질 및 외부 목질부 조직의 소형 조각을 무균적으로 제거하고 물 한천(Strobel 등, 1996)을 함유하는 페트리 접시위에 놓았다. 몇 일간 배양한 후, 진균을 생성하는 균사 선단을 무균적으로 제거하고 감자 덱스트로오스 한천(PDA)상에 놓았다. 또한, 7일 후, 진균 콜로니를 감마 조사된 카네이션 잎(0.5 x 0.5 cm) 및 다른 식물물질로 전달하여 포자 생성을 유도하였다. 분리된 몇 개의 진균중에 곰팡이 냄새로 인하여 가장 중요한 것은 분리하여 "A3-5"로 표시하였다.
호주의 15°29'29" 남쪽 및 131°23'12" 동쪽에 있는 호주 쇠나무(에리토펠룸 클로로스타키스(Erythophelum chlorostachys))의 소형 엽편으로부터 추가의 무 스코도르(Muscodor) 균주를 얻었다. 선택 도구로서 엠. 알부스(M. albus)의 휘발물질을 사용하여 내생균(endopyte)을 분리하였다. 내생균이 분리될 수 있는 식물물질을, 2주간 급속하게 성장하고 있는 엠. 알부스(M. albus)의 배양액과 동일한 한천 플레이트에 두었다. 이어, 상기 식물물질로부터 성장하는 유일한 생물은 엠. 알부스(M. albus)에 내성인 생물로서, 크실라리아세오우스(xylariaceous) 군( Strobel 등, 2001)에서 엠. 알부스(M. albus)의 다른 휘발성 항생물질 생산자 또는 동류이다. 상기 나무로부터 가장 흔히 분리된 내생균은 페스탈로티프시스(Pestalotipsis)종 및 다른 크실라리아(Xylaria) 종 이었다. 이것을 "A-10"으로 표시하였다.
실시예 2 - 진균 생장 및 저장
미시간 디트로이트시 소재의 디프코 라보라토리즈사가 제조한 Tryptic Soy Broth Agar(TSBA), Corn Meal Agar (CMA), Malt Agar (MA), Potato Dextrose Agar (PDA)를 비롯한 다수의 배지에서 진균을 생장시켰다. 웨스턴 백송(피누스 몬티콜라(Pinus monticola)), 흑색 월넛(주글란스 니그라(Juglans nigra)) 및 단풍나무(에이서 사카룸(Acer saccharum))의 작은 나무부서러기 샘플 뿐만 아니라 씨. 제이라니쿰(C.zeylanicum)의 나무껍질 샘플과 함께 물 한천을 함유하는 페트리 플레이트상에 상기 진균을 접종하여 포자 생성을 유도하였다.
분리물(620)을 어떻게해야 가장 잘 저장할 수 있는지 결정하기 위하여, 몇 개 조건하에서 시험하였다. 상기 진균은 페트리 플레이트내의 PDA 표면에 배치된 멸균 화트만 넘버 1 여과지 디스크에서 생장시켰다. PDA 플레이트상의 여과지 디 스크의 중간에 한천 플러그로서 진균을 접종하였다. 이 플레이트를 22℃에서 14일간 배양하였다. 상기 여과지 디스크를 제거하고 멸균 조건하의 박편 유동 후드에 1일 저장하거나, 또는 진균 균사체를 갖는 여과지를 건조시켰다. 상기 여과지 디스크를 다수 조각으로 절단한 다음 다양한 조건하에서 저장하였다. 또한 상기 진균을 함유하는 한천 플러그를 멸균 증류수에 넣어 4℃에서 저장하였다. 다른 시험 조건 세트에서, 한천상에서 생장하는 균사체 조각을 15% 글리세롤중에 넣어 -70℃에서 저장하였다. 각 시험에서, 균사체 단편을 PDA 플레이트에 놓고 3 내지 4일 후 진균생장을 조사하는 것에 의해 진균의 생존력을 결정하였다.
무스코도르 로제우스(Muscodor roseus) 분리물(A3-5 및 A-10으로 내부적으로 표시됨)을 어떻게해야 가장 잘 저장할 수 있는지 결정하기 위하여, 몇 개 조건을 시험하였다. 상기 진균은 페트리 플레이트내의 PDA 표면에 배치된 멸균 화트만 넘버 1 여과지 디스크에서 생장시켰다. PDA 플레이트상의 여과지 디스크의 중간에 한천 플러그로서 진균을 접종하였다. 이 플레이트를 22℃에서 14일간 배양하였다. 상기 여과지 디스크를 제거하고 멸균 조건하의 박편 유동 후드에 1일 저장하거나, 또는 진균 균사체를 갖는 여과지를 건조시켰다. 상기 여과지 디스크를 다수 조각으로 절단한 다음 23℃, 4℃, 0℃ 및 -70℃에서 저장하였다. 또한 진균을 함유하는 한천 플러그를 멸균 증류수에 넣어 4℃에서 저장하였다. 다른 시험 조건 세트에서, 한천상에서 생장하는 균사체 조각을 15% 글리세롤중에 넣어 -70℃에서 저장하였다. 각 시험에서, 균사체 단편을 PDA 플레이트에 놓고 3 내지 4일 후 진균생장을 조사하는 것에 의해 진균의 생존력을 결정하였다.
실시예 3 - 진균 DNA 분리
DNA 분리의 경우, 감자 덱스트로오스 육즙(PDA)에서 1.5 ml로 23℃에서 18 내지 24시간 동안 모든 진균을 생장시켰다. 원심분리에 의해 균사체를 수집하고 멸균 ddH2O를 사용하여 2회 세척하였다. 전체 게놈 DNA는 Lee 및 Taylor (1990)의 방법으로 추출하였다.
실시예 4 - 18S 리보솜 DNA의 증폭
각 진균으로부터 얻은 18S rDNA 유전자의 부분적 뉴클레오티드 염기쌍 단편은 프라이머 UK4F
Figure 112008077292874-pat00001
및 UREV
Figure 112008077292874-pat00002
를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 증폭시켰다. PCR은 10 mM 트리스-HCl (pH 9.0, 25℃), 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100의 완충액중에 0.1 ㎍의 게놈 DNA, 0.4 μM의 각 프라이머, 0.16 mM의 4개의 dNTP 및 5 μ의 Taq 중합효소(프로메가 제조)를 함유하는 50 ㎕ 반응 바이얼에서 실시하였다. 증폭은 30주기(94.5℃에서 45초, 53.5℃에서 45초, 72.5℃에서 90초) 동안 실시하였다.
실시예 5 - 내부 전사된 공간 서열(ITS) 및 5.8S rDNA의 증폭
시험 진균의 ITS 영역은 PCR 및 유니버살 ITS 프라이머 ITS5
Figure 112008077292874-pat00003
및
ITS4
Figure 112008077292874-pat00004
를 사용하여 증폭하였다 (화이트 등, 1990). PCR은 10 mM 트리스-HCl (pH 9.0, 25℃), 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100의 완충액중에 0.1 ㎍의 게놈 DNA, 0.4 μM의 각 프라이머, 0.16 mM의 4개의 dNTP 및 5 μ의 Taq 중합효소(프로메가 제조)를 함유하는 50 ㎕ 반응 바이얼에서 실시하였다. PCR 주기 조건은 94℃에서 1.5분간 변성, 55℃에서 2.5분간 어닐링, 및 72℃에서 3분간 연장시키는 것을 40주기 실시한 다음 72℃에서 10분간 마지막 연장시키는 것으로 구성된다(윌리츠, 1999). 상기 PCT 산물은 QuickStep PCR 정제 키트(에지 바이오시스템 제조)를 이용하여 겔 정제시키고 탈염시켰다.
실시예 6 - 18S rDNA 및 ITS1 및 2 서열의 검색 및 비교
무스코도르 알부스( Muscodor albus )
무스코도르 알부스(Muscodor albus)의 18S rDNA 및 ITS1-2 서열을 GenBank에 제출하여 일련번호 AF324337 및 AF324336호를 부여받았다. 이들 서열을 또한 검색하거나 BLAST2.1 및 웹사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 NCBI의 서치하에 제공되는 다른 진균 서열과 대조하였다. 대조 및 정렬 서열은 Clustal W version 1.7 (톰슨, 제이 및 깁슨 티, 1997)를 이용하여 실시하였고 그후 손으로 정렬시켰다.
휴리스틱 탐색(heuristic search) 및 최대절약 콘센서스 휴리스틱 탐색을 이용한 최대절약 부트스트랩 방식(Felsenstein, 1985)을 PAUP* (Swofford, 1999)를 이용하여 실시하였다. 상기 부트스트랩 분석은 다음과 같이 설정하였다: 100개 반복시험, 계통수 해부-재연결 가지 교환 및 랜덤 서열 부가. 모든 특징들은 동일하게 조작되었다. 기준 분류는 타프리날레스(Taphrinales: 외자엽균목)이다: 프로토마이세스 이노우에이 (GenBank 시리얼 번호 D11377), 타프리나 비에스네리 (Taphrina wiesneri) (D12531), 티.데포르만스 (T. deformans) (U00971) 및 티.프루니-수브코 르다타애(T.pruni-subcordatae) (AB000957).
무스코도르 로제우스( Muscodor roseus )
배양액 "A3-5"의 18S rDNA 및 ITS1-2 서열을 GenBank에 제출하여 일련번호 AY034664 및 AY034665호를 부여받았다. 분리물 "A-10"의 18S rDNA는 AY049023으로 나타내었다. 또한 "A3-5"의 18S rDNA 및 ITS1&2 서열을 검색하거나 BLAST2.1 및 웹사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 NCBI의 서치하에 제공되는 다른 진균 서열과 대조하였다. 대조 및 정렬 서열은 CLUSTALW version 1.7 (톰슨, 제이 및 깁슨 티, 1997)를 이용하여 실시하였고 그후 손으로 정렬시켰다.
부분적 18S rDNA 서열의 정렬된 1708 bp의 계통발생학적 분석은 PAUP(Phylogeny Using Parsimony Analysis) 프로그램 버전 4.0b4a(Swofford, 1999)의 최대절약 분석법을 이용하여 실시하였다. 절약-정보 형질의 개수는 190이며 1448개 형질은 일정하다. 계통발생적 분석은 기준 분류군을 비롯하여 18개 분류군에 대하여 실시하였다. 기준 분류군은 트라피날레스(Traphinales)이다: 타프리나 비에스네리(Taphrina Wiesneri)(GenBAnk 수탁번호 D12531), 타프리나 데포르만스 (Taphrina deformans) (U00971) 및 타프리나 프루니-서브코르다타애(Taphrina pruni-subcordatae) (AB000957). 나머지 15개 종은 무스코도르 알부스(Muscodor albus) (AF324337), 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus) (AY034664), 크실라리아 카르포필라 (Xylaria carpophila) (Z49785), 엑스. 쿠르타 (X. curta) (U32417), 엑스. 히폭실론 (X. hypoxylon) (U20378), 엑스. 폴리모르파 (X. polymorpha) (AB014043), 크실라리아 종(Xylaria sp.) (AB014042), 로셀리니아 넥 타트릭스 (Rosellinia nectatrix) (AB014044), 포로니아 푼크타타 (Poronia punctata) (AF064052), 달디니아 콘센트리카 (Daldinia concentrica) (U32402), 히폭실론 프라기포르메 (Hypoxylon fragiforme) (AB014046) 및 히폭실론 아트로로제우스(Hypoxylon atroroseus) (U32411), 페스탈로스파에리아 한세니 (Pestalophaeria hanesnii) (AF242846), 디스코스트로마 트리셀룰라 (Discostroma tricellular) (AF346546) 및 암피스파에리아 (Amphisphaeria) 종 (AF346545)이다. 부트스트랩 분석은 다음과 같이 설계하였다: 100회 반복, 계통수 분할-재연결 가지 교환, 랜덤 서열 부가. 모든 특징은 동일하게 가해진다.
실시예 7 - 무스코도르 알부스( Muscodor albus )에 의해 생산된 항생물질성 휘발물질의 분석
페트리 플레이트에서 생장하는 엠. 알부스(M. albus) 균사체 위의 공기량에 있는 가스를 분석하기 위해 방법을 설계하였다. 진균 휘발물질을 포획하기 위하여 "고상 마이크로 추출" 주사기를 사용하였다. 섬유물질(Supelco)은 안정한 플렉스 섬유상의 폴리디메틸실옥산상의 50/30 디비닐벤젠/카르부렌 이었다. 주사기를 페트리 플레이트의 측면에 천공된 소형 중공을 통하여 배치되며 증기상에 45분간 노출시켰다. 이 주사기를 중량-선택적 검출기를 구비한 가스 크로마토그래피(휴렛 펙커드 5890 시리즈 II Plus)에 삽입하였다. 휘발물질의 분리에는 30 m x 0.25 mm I.D. ZB 왁스 모세관 칼럼(막 두께 0.50 mm)를 사용하였다. 상기 칼럼의 온도는 다음과 같이 프로그래밍된다: 25℃에서 2분간, 이어 220℃에서 5분간. 캐리어 가스는 헬륨 울트라 하이 퓨리티(국지적 분포기)이며 초기 칼럼 헤드 압력은 50 kPa 이었다. He 압력은 분리하는 동안 캐리어 가스 유동 속도를 일정하게 유지시키기 위하여 오븐의 온도 경사에 맞게 경사진다. 휘발물질을 포획하기 전에, 섬유를 헬률 가스 유동하, 240℃에서 20분간 처리하였다. 30초간의 주입 시간을 이용하여 샘플 섬유를 GC에 도입하였다. 가스 크로마토그래프는 질량분해능 1500에서 동작하는 VG 70E-HF 이중 포커싱(double focusing) 자기질량 분광계에 접촉시켰다. 질량 범위 35-360 amu에 걸쳐 질량 분해당 0.5초 비율로 MS를 스캔하였다. 데이터 습득 및 데이터 처리는 VG SIOS/OPUS 인터페이스 및 소프트웨어 팩케이지를 이용하여 실시하였다. 엠. 알부스(M. albus)에 의해 생산된 공지되지 않은 물질의 초기 동정은 NIST 데이터베이스를 이용한 라이브러리 대조를 통하여 실시하였다.
PDA만을 함유하는 페트리 플레이트상에 대조분석을 실시하고 그로부터 얻은 화합물, 대부분 스티렌은, 진균을 함유하는 플레이트상에서 실시된 분석으로부터 공제하였다. 20/28 화합물의 마지막 동정은 본 명세서에 기재한 GC/MS 방법을 이용한 진짜 표준에 대한 대조 베이스를 기준하여 실시하였다. 그러나, 약 20%의 휘발물질만을 포함하는 8개의 다른 화합물은 NIST 데이터베이스 정보를 기초로하여 일시적으로 동정되었으며 엠. 알부스(M. albus) 화합물의 인공 혼합물을 적용한 바이오에세이 시험에 포함되지 않았다.
첫 추산으로서, 진균 배양물에서 발견된 각 화합물의 정량분석은 GC-MS 분석한 후 얻은 상대적 피이크 면적을 기본으로 한다. 이것을 이용하여 배양물에서 생긴 상대적 비율에서 엠. 알부스(M. albus) 가스의 인공적 분위기를 제조하는데 이용하였다.
실시예 8 - 진균의 휘발물질 화합물의 공급원
엠. 알부스(M. albus)에 의해 생산된 화합물의 다수는 알드리히 케미컬 컴패니사로부터 구입하였지만, valencene은 플루카 케미컬 컴패니로부터 구입하였고 합성 불네센(bulnesene)은 UC 버클리 화학과의 닥터 클레이톤 히쓰콕으로부터 구입하였으며 또 이것은 히쓰콕 및 래트클리프(1971)의 방법에 따라 합성할 수 있다.
시판되고 있지 않는 다른 에스테르는 Hoefle, G 등(1978)에 기재된 아실화 방법을 따라 제조하였다.
프로판산, 2-메틸, 3-메틸부틸 에스테르. 염화 이소부티릴 (2 ml 19.1 밀리몰)을 디클로로메탄중의 이소아밀 알코올 (1 ml, 9.5 밀리몰), 4-디메틸아미노피리딘 (583 mg, 4.8 밀리몰) 및 피리딘(0.85 ml, 10.5 밀리몰)의 0℃ 용액에 부가하였다. 부가 완료 5분후에 석출이 분명하게 나타났다. 아르곤하에서 12시간 동안 교반한 후, 반응을 20 ml의 0.1N HCl에 부었다. 층들을 분리하고 수성 층은 20 ml의 염화 메틸렌을 사용하여 추출하였다. 유기 층은 모아서 10 ml의 포화 수성 염화암모늄으로 세척한 다음 10 ml의 포화 수성 중탄산나트륨으로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘상에서 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축시켰다. 14 Vireaux 칼럼(비점 60-62℃, 25 mm)을 통하여 증류함으로써 정제시켰다. 생성한 투명한 무색 오일을 Amberlyst 15 상에서 교반하여 잔류하는 염화이소부티릴을 제거하였다.
Figure 112008077292874-pat00005
프로판산, 2-메틸-에틸 에스테르. 염화 이소부티릴 (2 ml 19.1 밀리몰)을 디클로로메탄중의 에틸 알코올 (0.55 ml, 9.5 밀리몰), 4-디메틸아미노피리딘 (583 mg, 4.8 밀리몰) 및 피리딘(0.85 ml, 10.5 밀리몰)의 0℃ 용액에 부가하였다. 부가 완료 5분후에 석출이 분명하게 나타났다. 아르곤하에서 12시간 동안 교반한 후, 반응을 20 ml의 0.1N HCl에 부었다. 층들을 분리하고 수성 층은 20 ml의 염화 메틸렌을 사용하여 추출하였다. 유기 층은 모아서 10 ml의 포화 수성 염화암모늄으로 세척한 다음 10 ml의 포화 수성 중탄산나트륨으로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘상에서 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축시켰다. 14 Vireaux 칼럼(비점 102℃)를 통하여 증류함으로써 정제시켰다.
Figure 112008077292874-pat00006
1-부탄올, 3-메틸, 아세테이트. 아르곤 분위기하에, 염화아세틸(6.5 ml, 91.8 밀리몰)을 디클로로메탄(92 ml)중의 이소아밀 알코올 (5 ml, 45.9 밀리몰), N,N-디메틸피리딘 (2.8 g, 23 밀리몰) 및 무수 피리딘 (4.1 ml, 50.5 밀리몰)의 0℃ 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 100 ml의 0.1N HCl에 붓고, 생성한 층을 분리하였다. 유기 층을 50 ml의 포화 수성 염화암모늄으로 세척한 다음 황산마그네슘상에서 건조시켰다. 유기 층을 여과하고 진공에서 농축시켜 투명 오일을 얻었다. 생성한 오일을 증류(비점 134-136℃)에 의해 정제시켜 이소아밀 아세테이트를 얻었다.
Figure 112008077292874-pat00007
실시예 9 - 시험관내 페트리 플레이트 에세이에서 휘발물질에 의한 진균 및 인간 병원체의 억제
PDA 플레이트의 중간으로부터 한천 스트립을 제거하여 2개의 거의 동일한 별도의 부분을 생성하며, 여기에는 Strobel 등(2001)에 의해 기재된 바와 같이 미생물이 성장할 수 있다. 한 개 부분에 엠. 알부스(M. albus) 배양물의 1개 한천 플러그를 놓고 플라스틱 백으로 밀폐된 플레이트에서 10일간 성장시켰다. 10일 후, 다른 부분에는 다양한 진균 병원체를 감염시켰고, 엠. 알부스(M. albus)를 갖지 않는 부분의 플레이트를 대조용으로 이용하였다. 각 처리당 3개의 플레이트를 사용하였다. 페니실리움 엑스판숨(Penicillium expansum), 모닐리니아 프럭티콜라(Monilinia fructicola), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 세균을 포자/세포 현탁액으로 투여한 반면, 다른 병원체는 3 내지 6 mm 균사체 플러그로 각 플레이트에 투여하였다. 콜로니 직경으로 측정한 병원체 생장은 3일 후에 평가하였다. 생존율을 평가하기 위하여 병원체를 재분리하는 것은 실험의 마지막에 배양면적에서 한천을 들어올려서 새로운 PDA 플레이트로 전달하는 것에 의해 실시하였다.
진짜로 확인된 휘발물질성 엠. 알부스(M. albus) 화합물의 시험 생물을 억제하고 치사시키는 상대적 능력은 표 1에 나타내었다. 시험 용액은 엠. 알부스(M. albus) 배양액의 가스상에서 생긴 상대적 부분에 바이얼중의 화합물을 배치하는 것에 의해 제조하였다. 시험 혼합물은 PDA를 함유하는 페트리 플레이트의 중심에 배치된 예비멸균된 마이크로컵(4x 6 mm)에 배치시켰다. 사용되지 않을 때, 상기 혼합물은 0℃에서 저장되었다. 3 mm3 한천 블럭(시험 진균당 3개 이상의 한천 블록) 상에서 새롭게 생장하여 절개된 시험 생물을 마이크로컵으로부터 2-3 cm 배치하고 그 플레이트를 2층의 파라필름으로 포장하였다. 주어진 시간 후 상기 한천 블록의 에지로부터 균사체 생장이 있는지를 측정하였다. 그러나, 세균 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 경우, PDA 플레이트의 시험측상에 스트리크(streak)하고 또 접종된 한천 플레이트의 원래 면적으로부터 다시 스트리킹함으로써 새로운 가시적 생장과 생존능에 대해 조사하였다. 적합한 대조용은 시험 용액을 함유하지 않는 것을 마이크로컵에 놓는 것에 의해 설계하였다. 각 시험 생물에 대하여 IC50 데이터를 얻기 위하여, PDA 플레이트상의 50 CC 공기량당 인공 혼합물 3.2-90 ㎕를 이용한 시험을 3회 반복하였다. 개별 종류의 화합물을 대조적인 양으로 시험하였으며, 이는 표준 페트리 플레이트중의 배양액 위의 공기량 50 CC 당 시험 혼합물 60 ㎕인 전체 혼합물의 최적 농도에서 실시되었다. 예컨대, 에스테르는 동정된 휘발물질의 혼합물 44%를 나타내며 또 26.4 ㎕/50CC 공기량으로 시험하였으며 동정된 화합물의 다른 종류의 각각에 대하여 동일한 과정을 이용하였다. 마지막으로, 특히 에스테르중의 각 개별 화합물을 60 ㎕중에서 생기는 상대적 % 또는 농도에서 시험하였다. 시험 미생물의 생존율은 작은 한천 블록을 무균적으로 제거해서 그것을 PDA 플레이트에 놓고 1 내지 3일간 생장을 관찰함으로써 측정하였다.
에프.솔라니 (F. solani) 및 에프. 옥시스포룸 리코페르시씨 (F. oxysporum lycopersici)를 제외한 병원체의 어떤 것도 엠. 알부스 (M. albus)의 존재하에서 생장하지 않았으며(표 1) 또 이들의 생장은 억제되었다. 이들 양쪽 병원체는, 3일 후 신선한 플레이트로 전달될 때 엠. 알부스 (M. albus) 존재하에서 생존하였다. 엠. 알부스 (M. albus)의 휘발물질은 엠. 알부스 (M. albus) 자체 또는 그의 밀접한 크실라리아 (Xylaria) 종은 치사시키지 않지만, 크실라리아 (Xylaria) 종의 생장은 억제시켰다(표 1).
실시예 10
시험관내 에세이에서 휘발물질 화합물 및 개별 휘발물질 성분의 종류의 시험
엠. 알부스 (M. albus)의 천연 휘발물질에 있는 각 종류의 화합물을, 각각의 상대 생물학적 활성을 결정하기 위해 평가하였다. 생겨난 상대적 비율의 각 화합물 종류는 전체 60 ㎕/50 CC (1.2 ㎕/CC)에서 생기는 % 수준에서 시험하였다(표 5). 이것을 7개 시험 진균의 선택된 그룹에 대하여 실시하였다. 각 그룹의 화합물은 시험 생물에 대한 억제 활성을 갖고 있었다(표 5). 그러나, 대조를 기본으로 할 때 상기 에스테르는 다른 화합물 그룹에 비하여 더 우수한 억제 활성을 갖고 있었다(표 5).
에스테르 종류에서 각 화합물은 개별적으로 평가하였다. 각 에스테르에 대한 대조 시험을 표 5에서와 같이 모든 에스테르의 결과를 완전히 모방하여 표 5의 조건당, 1-부탄올, 3-메틸, 아세테이트에 대하여 실시하였다. 모든 확인된 에스테르 조합의 62%는 0.32 ㎕/CC 수준에서 시험하였다. 부가적으로, 프로피온산, 2-메틸, 3-메틸부틸 에스테르에 의해 최소 억제 생활성이 나타났고 또 다른 에스테르 부분에 대해서는 아무런 활성이 나타나지 않았다. 에스테르 및 1-부탄올, 3-메틸-아세테이트는 바이오에세이 시험에서 억제 활성을 갖고 있었지만, 어떤 시험 조건 하에서도 표준 3일간의 노출 기간동안 시험 진균의 치사는 발견되지 않았다(표 5). 이것은 중요한 관찰로서, 시험 생물의 치사는 엠. 알부스 (M. albus)의 인공 분위기 및 천연 페트리 플레이트 분위기 모두에서 나타났기 때문이다. 이러한 결과는 엠. 알부스 (M. albus) 휘발물질의 경우 부가적 또는 상승작용적 메카니즘이 작용하고 있음을 강하게 암시한다. 따라서, 각 종류의 화합물이 다소간의 억제 활성을 갖고 있긴 하지만, 시험 진균 및 세균의 치사를 유발하기 위해서는 성분의 완전한 혼합물이 필요하다 (표 1).
엠. 알부스 (M. albus)의 휘발물질이 대장균(E. coli)을 억제 및 치사시킬 수 있다(표 10)는 사실을 기초로 하여, 엠. 알부스 (M. albus)의 가스가 대장균 및 기타 대소변 미생물과 같은 인간과 동물의 폐기물에서 발견되는 미생물총 (microflora)을 억제하고 치사시킬 수 있는지 결정하기 위해 엠. 알부스 (M. albus)를 사용하여 실험을 실시하였다. 이들 미생물은 이질 및 기타 천재지변 및 전쟁을 비롯한 주요 위기기간 동안 다른 질병을 유발할 수 있다. 아마도, 엠. 알부스 (M. albus)는 인간 및 동물의 폐기물을 해독하기 위한 분야에서 개발되어 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명자의 실험에 따르면, PDA를 함유하는 페트리 플레이트의 반쪽에서 생장하는 2주된 엠. 알부스 (M. albus) 콜로니를 준비하였다. 이어 별도의 다른 반쪽 플레이트상에 (표준 미생물학적 방법을 이용) 고상의 인간 폐기물을 스트리크하였다. 대조용 플레이트는 엠. 알부스 (M. albus)의 콜로니가 존재하지 않는 것으로 설계하였다. 23℃에서 2일간 배양한 후, 엠. 알부스 (M. albus)를 갖는 프레이트에서 보다 대조용 플레이트에서 현저히 더 많은 세균 및 진 균 콜로니가 생장하고 있었다. 대조 실험에서, 엠. 알부스 (M. albus)만을 인간의 액체 폐기물(뇨)에서 배양하고 전체 세균생장을 방해시켜 세균 생장이 풍만한 대조용(엠. 알부스 (M. albus) 없음)과 대조시켰다.
실시예 11 - 생체내에서 토양 병원체 리족토니아 솔라니( Rhizoctonia solani)에 대한 무스코도르 알부스(Muscodor albus)의 활성
이들 실험의 경우, PDA 플레이트위의 1개 배양물을 1리터의 생장배지(질석)에 부가하는 것에 의해 생장배지에 알. 솔라니(R. solani)를 감염시켰다. 포트별 변화를 적게하여도 100%에 가까운 묘목 치사율을 나타내었다. 다양한 형태의 엠. 알부스(M. albus)를 성장 배지에 부가한 다음 3인치 플라스틱 포트에 넣었다. 이 포트에 약 70개 브로컬리 종자를 심고, 트레이에 놓고 아래에서부터 물을 주었다. 약 1주후 묘목의 수를 세었다. 대조용은 알. 솔라니 (R. solani) 단독, 엠. 알부스(M. albus) 단독 및 보통의 생장배지로 구성된다. 실험에 따라서는, 처리당 3 내지 4개 포트를 사용하며, 완전히 랜덤한 디자인으로 배열하였다.
PDB의 10일된 액체 배양물을 블렌더에서 수초간 균질화시킨 다음 질석 리터당 50 또는 200 ml 비율로 혼입시켰다. 고체 한천 배양 처리는, 상술한 바와 같이, 리터당 2주된 배양물의 2개 플레이트를 사용하여 실시하였다. 충전시킨 후 포트에 즉시 파종하였다. 포트에서 휘발물질을 밀봉하는 효과도 조사하였다: 각 처리의 경우, 고무 밴드를 사용하여 3개 포트상에 플라스틱 백을 밀봉시킨 반면에 3개의 다른 포트는 씌우지 않고 그대로 두었다. 3일 후 백을 제거하였다. 결과는 높은 비율(200 ml/리터 질석)로 투여된 액체 배양물은 PDA상의 고체 무스코도르 (Muscodor) 배양물에서처럼 감소를 방지하는데 효과적임을 나타낸다 (표 2). 무스코도르(Muscodor) 투여의 효과는 중간정도로 나타나며, 심기 전에 배양기간이 없더라도 이들 처리에서 정상 출현비율을 얻었다. 액체 배양물의 낮은 비율은 감소효과의 감소를 유발하지만, 효과적이지는 않았다. 포트중의 휘발물질을 플라스틱 백으로 밀폐하는 것은 효능을 향상시키지 않았다 (표 2).
실시예 12 - 감염된 과일의 수확후 처리로서 무스코도르 알부스 ( Muscodor albus)의 활성
갈라(Gala) 품종의 사과 중간 부분에 손톱으로 상처 하나를 내고, 플라스틱 플레이트에 놓고 3.8 리터의 플라스틱 박스내에서 상처난 사이드를 위로 하여 보관하였다. 각 박스당 9개 사과를 놓고 처리당 3개 박스를 이용하였다. 20 ㎕의 분생자 현탁액 (104/ml)를 피펫으로 각 상처난 부분에 옮기는 것에 의해 상기 과일에 푸른 곰팡이, 페니실리움 엑스판숨(Penicillium expansum)을, 실험을 실시하기 24시간 전(예비접종) 또는 실험 직후에 접종시켰다. 무스코도르(Muscodor) 훈증 처리를 위하여, 140 g의 이식된 호밀 알곡을 용기에 놓은 다음 밀봉시켰다. 대조용은 접종된 과일만을 밀봉 박스내에 함유하고 있었다. 이들을 실온(19-22℃)에서 배양하였다. 7, 14 및 21일 후 감염된 과일의 %로서 질병을 평가하였다 (표 3). 예비접종된 처리는 사과에 대하여 아무런 감염을 나타내지 않았지만, 과일을 무스코도르(Muscodor)에 노출시키기 바로 전에 접종된 과일의 경우 21일에서 7%만의 아주 적은 감염율을 나타내었다.
실시예 13 - 곤충 및 선충에 대한 무스코도르 알부스( Muscodor albus )의 활성
선충 (카에노타브디티스 엘레간스( Caenorhabditis elegans ))
해자 계(Worapong 등, 2001)를 이용하여 플레이트를 엠. 알부스(M. albus)로 한쪽 면에 접종시키고, 반대면에는 대장균 또는 대장균을 갖는 자유생활 선충으로 접종시켰다. 무스코도르(Muscodor)를 사용하지 않고 동일한 플레이트를 설계하였다. 5일 후, 무스코도르(Muscodor)를 갖지 않는 플레이트를 해자를 거친 대형 선충 번식집단을 만들고 페트리 접시의 반면 측에 심기 시작했다. 대장균은 동료 플레이트상에서 정상적인 콜로니 형태로 생장하였다. 무스코도르(Muscodor)로 처리된 플레이트는 실질적인 콜로니를 생성하며 이것은 PDA의 표면을 거쳐 균사체를 보낸다. 존재하던 선충은 부진하지만 운동성은 있었다. 7일째, 무스코도르(Muscodor)는 PDA의 에지에 도달하였고 균사체를 대장균을 갖는 플레이트의 해자로 보내며 이 플레이트는 원형 벌레를 갖고 있었다. 단지 적은 수의 성충 선충이 한천에 존재하며 이들의 이동성은 제한되었다.
사탕무 거염벌레 (스포도프테라 엑시구아( Spodoptera exigua ))
엠. 알부스(M. albus)가 살고 있는 약 150 g의 오토클레이브 처리된 호밀 종자를 함유하는 3개의 소형 플라스틱 비이커를 플라스틱 박스(약 250 in2)에 두었다. 대조용 박스는 진균의 3개 비이커없이 실온에서 설계하였다. 상기 박스는 중앙부에 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)의 소형 플러그를 갖는 PDA의 페트리 플레 이트를 바이오에세이 지시제로서 함유하였다. 인공 사료로 과산란된 사탕무 거염벌레 알을 함유하는 96개 웰 마이크로티터 플레이트를 각 박스에 도입하였다. 2일 후, 무스코도르(Muscodor)를 갖지 않는 박스중의 알은 부화되기 시작하였고, 알. 솔라니(R. solani)는 신규 균사체를 생성하였다. 사탕무 거염벌레 알은 엠. 알부스(M. albus)의 호밀 배양액을 함유하는 박스에서 부화되지 않았다. 또한, 알. 솔라니(R. solani)의 생장은 억제되었다. 5일 후, 미처리 박스에 있는 거염벌레는 제2/3령(instar)에 도달하였다.
쌍을 이룬 마이크로티터 플레이트를, 인공 사료에서 3일간 생장한 거염벌레 유충을 갖는 박스에 도입하였다. 무스코도르(Muscodor) 박스중에 있는 플레이트는 섭식이 중지되었고 미처리 대조군과 비교하여 발육저해되어 유지되었다. 5일 후, 처리된 플레이트에 있는 거염벌레는 치사되었다.
옥수수 뿌리벌레 갑충, 디아브로티카 운데심푼크타타( Diabrotica undecimpunctata)
쌍을 이룬 마이크로티터 플레이트를, 인공 사료상에서 과산란된 옥수수 뿌리벌레 알을 갖는 박스에 도입하였다. 이 알은, 상기 플레이트가 시험 박스에 도입될 때 부화되기 시작하였다. 상기 알의 약 1/2이 무스코도르(Muscodor) 박스에서 부화되었다. 나머지는 부화되지 않았으며, 또 모든 새로 태아난 벌레는 2일내에 죽었다. 미처리 대조군 박스에 있는 마이크로티터 플레이트는 1주후, 웰당 3 내지 6개의 제3령 땅벌레로 진행된 정상적인 감염을 생성하였다.
실시예 14 - 무스코도르 알부스( Muscodor albus )를 사용한 깜부기 감염된 보 리 종자의 처리
제어되고 반복된 실험에서, 우스틸라고 호르데이(Ustilago hordei) (보리속 깜부기병, 표 6)로 감염된 25개의 보리 종자를, 엠. 알부스(M. albus)의 가스를 갖는 2개의 한천 플레이트에 넣은 다음 온실중의 시험 포트에 심었다. 15주후, 식물을 수확하고 종자 상부에서 깜부기가 존재하는지 평가하였다. 엠. 알부스(M. albus) 가스에 노출된 2개 그룹의 식물에서 상기 질병이 100% 제어가 되었고 가스 처리에 의해 유발된 식물에 대한 어떠한 억제나 손상의 징후도 보이지 않았다. 동일한 개수의 대조용 식물(미처리 및 유. 호르데이(U. hordei) 감염된 종자)은 상기 실험에서 50% 및 41%의 감염 종자 상부를 가졌다. 또한, 예상한 바와 같이, 미감염 종자는 병든 알곡을 갖지 않는 식물을 얻었다.
결과 및 토론
무스코도르 알부스(Muscodor albus), gen. et sp. nov.,는 자낭성 군-크실라리아(Xylaria: 콩꼬투리버섯)에 관련된 무성균사강(mycelial sterilia) 내생 종분자이다. 상기 진균은 상기 군의 대표적인 멤버에 대하여 18S rDNA (2089 bp)의 96-98% 상동성으로 인하여 크실라리아세아애(Xylariaceae)에 관련된다. 또한, 엠. 알부스(M. albus)의 ITS1, 5.8S 및 ITS2 서열(652 bp)은 엑스. 아르부스쿨라(X. arbuscula), 엑스. 롱기페스(X. longipes) 및 엑스. 말리(X. mali)를 포함한 몇 개의 크실라리아(Xylaria: 콩꼬투리버섯) 종에 관하여 89-92% 수준의 밀접한 관계를 나타내었다. 18S rDNA 및 ITS 1&2 5.8 S rDNA는 독특하므로, 무스코도르(Muscodor)는 분류학적으로 뚜렷한 속과 종으로 간주된다 (Worapong 등, 2001).
엠. 알부스(M. albus)의 휘발물질을 병원체 진균으로 접종된 식물에 대해서도 시험하였다. 이 휘발물질 자체는 시험된 고도 식물에 대하여 치명적인 영향을 갖지 않았다. 그러나, 우스틸라고 호르데이(Ustilago hordei)로 접종된 종자를 처리하기 위한 휘발물질을 사용하여 보리의 보리속깜부기병을 100% 제어를 나타낼 수 있었다. 따라서, 휘발성 항생물질 생성 진균의 실제적 중요성으로 인하여, 상기 군에 있는 다른 생물이 자연적으로 존재하는지 결정하는 것이 중요하게 되었다.
내생 진균을 분리하기 위한 표준 수법 뿐만 아니라 배지중의 선택 수단인 엠. 알부스(M. albus)의 휘발물질을 사용하여, 2개 이상의 휘발성 항생물질 생산 내생균을 분리하였다. 이들 생물은 호주에 자생하는 2개의 별도의 나무 종으로부터 얻었다. 이들 2개 진균 배양액은 배양액에서 열매를 형성 구조를 만들지 않고, 포자를 생산하지 않으며, 곰팡이 냄새를 나게하며 많은 미생물에 대하여 억제성 또는 치명적이라는 점에서 엠. 알부스(M. albus)와 유사성을 갖는다. 그러나, 마찬가지로, 이들 생물은 엠. 알부스(M. albus)와는 상이한 배양, 화학적 및 분자생물학적 특징을 가지고 있었다.
생물의 분자 특징이 독특하면 이것은 결정적 구조(포자 생산) 또는 다른 특징이 결여되어 있을 때 분류에 도움을 줄 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 형태학적 데이터를 조합한 계통학적 특징 맵핑 방법은 진균 동정에 도움을 줄 것이다. 일반적으로, rDNA 유전자는 고도로 보존되기 때문에 분류학적 목적에 적합하다(Bruns 등, 1991; Guarro 등, 1999 및 Mitchell 등, 1995). 18S rDNA 이외에, ITS1&2 서열도 또한 보존된다. 엠. 로제우스(M. roseus) "A3-5"(2055 bp)의 부 분적 18S rDNA 서열을, BLSTIN 2.2.1하의 GenBank에 있는 데이터를 이용하여 탐색한 후, 결과는 1-981, 13119-2048에 이르는 엠. 알부스(M. albus) (AF324337)의 2089 bp와 100% 유사성을, 크실라리아 폴리모르파 (Xylaria polymorpha) (AB014043) 및 히폭실론 프라길포르메 (Hypoxylon fragilforme) (ABO14046)의 982 bp와 98% 유사성을, 그리고 로셀리니아 네카트릭스 (Rosellinia necatrix) (AB014044)의 982 bp와는 97% 유사성을 나타내었다. 또한 분리물 "A-10"는 분리물 "A3-5"에 대하여 그의 18S rDNA (2051 bp)의 99% 서열 유사성을 갖고 있었다.
한편, 엠. 로제우스(M. roseus) "A3-5"의 ITS 1&2 및 5.8S rDNA 서열을 비교분석하면, 무스코도르 알부스(Muscodor albus)의 ITS 1&2, 엑스.아르부스쿨라 (X. arbuscula) CBS 452.63 (AF163029) 및 CBS 454.63 (AF163028), 엑스. 엔테로로이카 (X. enteroleuca) CBS 148 (AF163033), 엑스. 롱기페스 (X. longipes) CBS 148.73 (AF163038), 엑스. 말리 (X. mali) CBS 385.35 (AF163040), 엑스. 코르누-다마애(X. cornu-damae) CBS 724.69 (AF163031)과 각각 99, 91, 91, 91, 90 및 89% 유사성을 나타내었다. 부분적 18S rDNA 또는 ITS 1&2 및 5.8S rDNA 서열의 완전한 동일성은 발견되지 않았다.
18S 서열을 기본한 계통학적 분석에 의하면, 엠. 로제우스(M. roseus)는 엠. 알부스(M. albus) (AF324337)에 대한 자매 그룹으로서 100개 레플리케이트로부터 측정된 부트스트랩 정확도가 100%임을 나타내었다. 또한 최대절약분석은 엠. 알부스(M. albus) 및 엠. 로제우스(M. roseus)는 암피스파에리아세아애(Amphisphaeriaceae) 의 3가지 대표적인 속: 페스탈로스파에리아 한세니 (Pestalosphaeria hansenii) (AF24846), 디스코스트로마 트리셀룰라 (Discostroma tricellular) (AF346546) 및 암피스파애리아 (Amphisphaeria) 종 (AF346545) 보다는 크실라리아세아애(Xylariaceae), 즉 크실라리아 (Xylaria) 종, 로셀니아 네카트릭스 (Rosellinia necatrix) (AB014044) 및 포로니아 푼크타타 (Poronia punctata) (AF064052)와 더욱 밀접한 관계에 있으며, 100개 레플리케이트로부터 부트스트랩 정확도는 68%로 측정되었다(Felsenstein, 1985). 이 결과는 또한 30개의 거의 동일한 절약적 18s rDNA 계통적 수상도를 엄격한 콘센서스(consensus) 휴리스틱(Heuristic) 탐색 계통수에 의해 지지되었다. 따라서, 엠. 로제우스(M. roseus)는 크실라리아세아애 (Xylariaceae) 과, 크실라리알레스(Xylariales)에 위치해야한다. 또한, 엠. 로제우스(M. roseus) "A3-5"의 18S rDNA 및 ITS 1&2 및 5.8S rDNA를 대조한 결과는 엠. 알부스(M. albus)에 대하여 높은 유사성을 가지고 있다 (Worapong 등, 2001). 또한, 분자생물학적 데이터(18S rDNA)는 엠. 로제우스(M. roseus)의 양쪽 분리물 "A3-5" 및 "A-10"은 밀접하게 관련되어 있어야하고 또 실질적으로 동일한 생물이어야함을 제시한다. 또한, 분자생물학적 데이터는 앞서 기재한 바와 같은 엠. 알부스(M. albus)의 분리 개념을 지지해주며, 그로부터 새로운 진균종-엠. 로제우스(M. roseus)가 제안되었다.
엠. 로제우스(M. roseus)의 분자생물학은 이 생물이 크실라리아세아애(Xylariacease) 군에 가장 잘 적합하지만, 엠. 알부스(M. albus)와 밀접한 18S rDNA 관련성을 나타내었다. 그러나, 제한된 r-DNA 분자 수준에서 그러한 관련성이 있기 때문에, 2개의 진균은 동일하다고 말할 수도 있을 것이다. 그럼에도 불구 하고, 엠. 알부스(M. albus)와 엠. 로제우스(M. roseus) 사이의 다른 화학적 형질이 조사되어 다른 것으로 밝혀졌다. 따라서, 엠. 알부스(M. albus)와 엠. 로제우스(M. roseus)는 강력한 항생물질 특성을 갖는 것으로 밝혀진 곰팡이 냄새를 생산하는 생화학적 능력을 공유하고 있는 반면에, 이들 2개 생물에 의해 생산된 다수의 휘발물질은 GC/MS에 의해 측정된 바와 같이 동일하였다. 진균은 다수의 악취나는 물질을 생산하지만, 무스코도르(Muscodor) 종의 특징적 항생물질 특성은 독특한 것으로 보인다(Bjurman 등, 1992; Rapoir 등, 2000; 및 Schnurer 등, 1999). 그러나, 이들 2개 진균의 휘발물질은 또한 상이한 화합물을 함유하고 있었다(Strobel 등, 2001). 예컨대, 엠. 알부스(M. albus)는 2-노나논, 카리오필렌 및 아세트산 2-페닐에틸 에스테르를 생산한 반면, 이들 화합물은 엠. 로제우스(M. roseus)의 분리물에서는 검출되지 않았다. 반면에, 엠. 로제우스(M. roseus)의 분리물은 2-부테논산, 에틸 에스테르; 1,2,4-트리메틸 벤젠 및 2,3-노나디엔과 같은 엠. 알부스(M. albus) 휘발물질에서는 검출되지 않은 화합물을 제조하였다. 이러한 결과는 엠. 알부스(M. albus)는 엠. 로제우스(M. roseus)와 분류학적으로 구별되는 것임을 나타내는 본 보고에 주어진 과제에 화학적 지지를 부여한다.
엠. 로제우스(M. roseus) (분리물 "A3-5" 및 "A-10")의 다른 보다 전통적인 특징도 조사하여 엠. 알부스(M. albus)와 비교하였다. 엠. 로제우스(M. roseus)의 이들 분리물은 모든 시험 배지에서 느리게 생장하고, 조밀하며 약간 장밋빛을 갖는 균사체를 생산하였다. 이것은 모든 비교 시험배지에서 백색 균사체를 생산(Worapong 등, 2001)하는 엠. 알부스(M. albus)와는 대조된다. 숙주 식물물질 또는 카네이션 잎을 함유하는 배지를 비롯한 모든 배지에서 포자는 형성되지 않았다. 균사는 직경(0.8-3.6 ㎛)이 다양하였고 또 흔히 더욱 복잡한 구조, 균사코일을 형성하도록 꼬여서 합쳐진다. 이들 균사는 일반적으로 엠. 알부스(M. albus)의 균사보다 더 크다. 엠. 로제우스(M. roseus)의 균사체는 일반적으로 엠. 알부스(M. albus)보다 배양액에서 더욱 복잡하게 꼬여서 합쳐진다. 실제로, 배양액중의 진균의 균사 코일의 생성은 우리의 경험상 일반적인 것이 아니며, 이들 구조는 엠. 로제우스(M. roseus) 배양액에서만 나타났다.
마지막으로 엠. 로제우스(M. roseus)의 경우, 최적 저장 조건은 여과지상에서 건조시킨 후 -70℃에 보관하는 것이다. 이들 조건하에서, 진균은 1.5년 이상 생육성으로 존재하였다. 또한, 상기 진균은 멸균수중, 4℃에서 저장될 수 있지만, 6개월 후 생존 생물을 회수할 확률이 적었다. 또한 15% 글리세롤중, -70℃에서 저장은 생물의 생존율을 효과적으로 보존하였다.
상술한 논의와 실시예는 당해 기술을 예시하기 위한 것이다. 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 사람이라면 본 발명의 정신과 범위를 벗어남 없이 상기 내용에 다양한 변화를 가할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.
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범례: * 인공 혼합물에 사용된 양성으로 확인된 화합물의 양은 수득한 화합물의 전자 이온화 단면(전체 면적의 %)을 GC/MS 분석에 적용함으로써 얻었다. 인공 혼합물을 이어 미리-멸균된 마이크로컵(4x6mm)에 넣어 PDA를 함유하는 시험 페트리 플레이트의 중심에 배치시켰다. 새롭게 생장하는 시험 미생물(또는 스트리크된 미생물)을 함유하는 한천 플러그를 2층의 파라필름으로 둘러싸고 23℃에서 2일 이상 동안 배양하였다. 선형 균사체 생장의 측정은 접종 한천 플러그의 에지에서부터 균사체 콜로니의 에지까지 실시하였다. # 이 실험 설계에서는 측정되지 않음.
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* 비 분자-이온 피크는 표준 화합물 또는 분석실시중인 화합물의 스펙트럼에서 관찰되었다.
# 상기 성분의 스펙트럼 및 체류 시간이 확인되었고 또 물질은 NIST 데이터 베이스에 있는 가장 유사할 것으로 보이는 화합물에 매치되지만, 그 데이터는 체류시간 또는 MS에 의해 실질적으로 동일한 표준 화합물의 사용에 의해 확인되지 않았음을 나타낸다. 이들 화합물은 바이오에세이 시험에서 인공 화합물에 존재하지 않았다.
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<110> STROBEL, Gary, A. <120> NOVEL ENDOPHYTIC FUNGI AND METHODS OF USE <150> US 60/283,902 <151> 2001-04-16 <150> US 60/363,072 <151> 2002-03-11 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2089 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Muscodor albus <400> 1 ccggttgatc ctgccagtag tcatatgctt gtctcaaaga ttaagccatg catgtctaag 60 tataagcaat tatacagcga aactgcgaat ggctcattaa atcagttatc gtttatttga 120 tagtacctta ctacttggat aaccgtggta attctagagc taatacatgc taaaaatccc 180 gactcacgga gggatgtatt tattagatta aaaaccaatg cccctcgggg ctttctggtg 240 attcataata acttcacgaa tcgcatggcc ttgcgccggc gatggttcat tcaaatttct 300 gccctatcaa ctttcgatgg cagggtcttg gcctgccatg gttacaacgg gtaacggagg 360 gttagggctc gaccccggag aaggagcctg agaaacggct actacatcca aggaaggcag 420 caggcgcgca aattacccaa tcccgacacg gggaggtagt gacaataaat actgatacag 480 ggctcttttg ggtcttgtaa ttggaatgag tacaatttaa atcccttaac gaggaacaat 540 tggagggcaa gtctggtgcc agcagccgcg gtaattccag ctccaatagc gtatattaaa 600 gttgttgcag ttaaaaagct cgtagttgaa 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Claims (21)

  1. 포자 생산을 하지 않고, 곰팡이 냄새(musty odor)가 있으며, 서열번호 2와 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 ITS 1&2 및 5.8S rDNA 서열을 가짐을 동정 특성으로 가지는 무스코도르(Muscodor) 진균.
  2. 제1항에 있어서, 상기 무스코도르 진균이 무스코도르 알부스(Muscodor albus)인 진균.
  3. 제2항에 있어서, 상기 무스코도르 진균이 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus)인 진균.
  4. 무스코도르 알부스(Muscodor albus)를 배양하는 단계; 및
    상기 성장하는 무스코도르 알부스의 휘발성 부산물을 수집하는 단계
    를 포함하는, 제2항에 따른 진균으로부터 휘발성 물질의 조성물을 수득하는 방법.
  5. 제4항의 방법에 의해 생산된 휘발성 부산물을 포함하는 조성물.
  6. 진균, 세균, 미생물, 선충 및 곤충으로 구성된 군으로부터 선택된 유기체를 유효량의 제3항의 진균 또는 제5항의 조성물에 노출시키는 것을 포함하는, 상기 유기체의 성장을 억제시키는 방법.
  7. 진균, 세균, 미생물, 선충 및 곤충으로 구성된 군으로부터 선택된 유기체를 유효량의 제3항의 진균 또는 제5항의 조성물에 노출시키는 것을 포함하는, 상기 유기체에 의한 감염으로부터 과일, 식물, 종자, 알곡 또는 상기 식물 주위의 토양을 처리 또는 보호하는 방법.
  8. 건축재료를 유효량의 제3항의 진균 또는 제5항의 조성물에 노출시키는 것을 포함하는, 독성 곰팡이 감염으로부터 건축재료를 처리 또는 보호하는 방법.
  9. 스크리닝(screening)할 유효량의 진균을 배양 조건하에서 무스코도르 알부스(Muscodor albus) 또는 무스코도르 로제우스(Muscodor roseus)의 휘발성 물질과 접촉시키는 단계;
    상기 무스코도르 알부스 또는 무스코도르 로제우스의 휘발성 물질에 내성인 진균을 선별하는 단계; 및
    상기 선별된 진균의 분자적 특성(molecular characteristics)을 분석하는 단계
    를 포함하는, 무스코도르 진균을 동정하는 방법.
  10. 제9항에 정의된 방법에 의해 수득가능한 단리된 무스코도르 진균.
  11. 제10항에 있어서, 상기 진균이 무스코도르 알부스, 무스코도르 로제우스 및 이들의 돌연변이체로부터 선택된 것인 단리된 무스코도르 진균.
  12. 제10항에 따른 단리된 무스코도르 진균을 포함하는 조성물.
  13. 옥탄, 아세톤, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 2-메틸 프로판산 메틸 에스테르, 에탄올, 2-메틸 프로판산 에틸 에스테르, 2-메틸 프로판산 2-메틸프로필 에스테르, 이소부틸 알코올, 1-부탄올-3-메틸-아세테이트, 2-메틸 프로판산 3-메틸부틸 에스테르, 1-부탄올-3-메틸, 2-펜틸 푸란, 4-노나논, 2-노나논, (4aR-트랜스)-데카하이드로-4a-메틸-1-메틸렌-7-(1-메틸에틸리덴)-나프탈렌, 1,2,3,4,5,6,7,8-옥타하이드로-1,4-디메틸-7-(1-메틸에테닐)-[1S-(1.알파, 4.알파, 7.알파)]-아줄렌, 4-(1,5-디메틸-1,4-헥사디에닐)-1-메틸-사이클로헥센, 2,3,4,7,8,8a-헥사하이드로-3,6,8,8-테트라메틸-[3R-(3.알파, 3a.베타, 7.베타, 8a.알파)]-1H-3a,7-메타노아줄렌, 2-메틸 프로판산, 카리오필렌, 1,2,4a,5,6,8a-헥사하이드로-4,7-디메틸-1-(1-메틸에틸)-[1R-(1.알파, 4a.알파, 8a.알파)]-나프탈렌, 3,7,7-트리메틸-11-메틸렌-스피로[5.5]운데크-2-엔, 1,2,3,5,6,7,8,8a-옥타하이드로-1,4-디메틸-7-(1-메틸에테닐)-[1S-(1.알파, 7.알파, 8a.베타)]-아줄렌, 1,2,3,5,6,7,8,8a-옥타하이드로-1,8a-디메틸-7-(1-메틸에테닐)-[1R-(1.알파, 7.베타, 8a.알파)]-나프탈렌, 아세트산 2-페닐에틸 에스테르, 또는 페닐에틸 알코올을 포함하는 단리된 무스코도르(Muscodor) 진균에 의해 생산되는 모든 휘발성 물질을 포함하는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 담체가 농학적으로 허용가능한 담체인 조성물.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 살진균제, 살충제, 항미생물제, 살균제, 살선충제 및 식품 보존제로 구성된 군으로부터 선택된 농학적 유효량의 조성물을 추가로 포함하는 조성물.
  17. 진균, 세균, 미생물, 선충 및 곤충으로 구성된 군으로부터 선택된 유기체를 유효량의 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 조성물에 노출시키는 것을 포함하는, 상기 유기체의 성장을 억제시키는 비-치료적 방법.
  18. 제17항에 있어서, 진균, 세균, 미생물, 선충 및 곤충으로 구성된 군으로부터 선택된 유기체에 의한 감염으로부터 과일, 식물, 종자, 알곡 또는 상기 식물 주위의 토양을 처리 또는 보호하기 위한 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 독성 곰팡이 감염으로부터 건축재료를 처리 또는 보호하기 위한 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 과일, 식물, 종자, 알곡 또는 상기 식물 주위의 토양을 살진균제, 살충제, 항미생물제, 살균제, 살선충제 및 식품 보존제로 구성된 군으로부터 선택된 유효량의 농학적 조성물에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 단리된 무스코도르(Muscodor) 진균을 배양하는 단계; 및
    상기 성장하는 진균에 의해 생산되는 휘발성 물질의 조성물을 수집하는 단계
    를 포함하는, 제13항에 따른 휘발성 물질의 조성물을 수득하는 방법.
KR1020087027389A 2001-04-16 2002-04-11 신규한 내생 진균 및 그의 사용방법 KR100951483B1 (ko)

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